KR102049161B1 - 치료적 단백질을 조건부로 발현하는 벡터，상기 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 이의 용도 - Google Patents

치료적 단백질을 조건부로 발현하는 벡터，상기 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 이의 용도 Download PDF

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제레미아 에프. 로에쓰
챨스 씨. 리드
브랜든 커쓰벌슨
수닐 채다
윌리암 이. 포글러
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Abstract

본 발명은 치료학 분야에 관한 것이다. 가장 구체적으로, 본 발명은 활성화 리간드의 존재하에 유전자 발현 조절 시스템의 조절하에 하나 이상의 면역조절자를 조건부로 발현하기 위한 벡터를 생산하는 방법 및 동물에서 치료적 목적을 위한 용도를 제공한다. 이들 벡터는 직접 주사되거나 수지상 세포와 같은 시험관내 조작된 세포를 통하여, 다양한 장애 예를 들어, 신생 장애를 치료하기 위해 제공될 수 있다.

Description

치료적 단백질을 조건부로 발현하는 벡터，상기 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 이의 용도{Vectors Conditionally Expressing Therapeutic Proteins, Host Cells Comprising the Vectors, and Uses Thereof}
본 발명은 질환 및 장애, 예를 들어 암, 리소좀 축적 장애, 안 질환, 간 질환, 또는 전염성 질환의 치료를 위한 유전자 요법 분야에 관한 것이다. 일 실시 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)를 발현하기 위한 면역 세포 또는 치료법 지원 세포(TSC)의 조작 및 치료제로서의 상기 세포의 사용을 제공한다. 다른 실시 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자), 예를 들어 IL-12, TNF-알파의 조건부 발현을 위한 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 및 그런 벡터를 사용하는 방법을 포함한다.
인터루킨-12(IL-12)는 다수의 생물학적 과정에 기여하는 것에 연루된 제I형 사이토카인 패밀리의 구성원으로서, 상기 생물학적 과정은 보호 면역 반응 및 종양생성의 억제를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다(Abdi et al., 2006; Adorini, 1999; Adorini, 2001; Adorini et al., 2002; Adorini et al., 1996; Akhtaret al., 2004; Akiyama et al., 2000; Al-Mohanna et al.,, 2002; Aliberti et al., 1996; Allavena et al., 1994; Alli 및 Khar, 2004; Alzona et al., 1996; Amemiya et al., 2006; Araujo et al., 2001; Arulanandam et al.,, 1999; Athie et al., 2000; Athie-Morales et al., 2004; Bertagnolli et al., 1992; Bhardwaj et al., 1996; Biedermann et al., 2006; Brunda and Gately, 1994; Buchanan et al., 1995; Romani et al., 1997; Rothe et al., 1996; Satoskar et al., 2000; Schopf et al., 1999; Thomas et al., 2000; Tsung et al., 1997; Wolf et al., 1994; Yuminamochi et al., 2007). 점점 많아지고 있는 일련의 증거는 IL-12가 인간 질환(예를 들어, 암)을 제어하기 위한 전도 유망한 표적이 될 수도 있음을 시사한다.
IL-12가 제1형 항-종양 NK 세포, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에 대한 그의 강력한 지원 활성에 기반한 암 치료제로서 여전히 전도 유망하다는 사실에도 불구하고(Trinchieri, 2003), 환자에서의 재조합 인간 IL-12(rhIL-12)의 보고된 독성(Atkins et al., 1997)은 임상 적용을 위한 GMP-등급 rhIL-12의 한정된 공급원과 함께, 성공적인 IL-12-기반의 치료적 접근을 방지하였다. 따라서, 유전자 치료법 접근법은 더욱 안전하고 더욱 옹호가능한 치료에 대한 선택 사항들을 대표할 수 있음이 합리적인 것으로 보인다. 실제, 재조합 바이러스-기반(Sangro et al., 2004; Triozzi et al., 2005) 또는 플라스미드-기반 IL-12 cDNA(Heinzerling et al., 2005), 또는 IL-12 유전자 변경 자가유래 섬유아세포(Kang et al., 2001)의 종양내 또는 종양 주위 전달을 구현하는 I기 임상 실험은 안전하고 잘 허용되는 것으로 밝혀졌다.
그러나, 이들 유전자 치료법을 받고 있는, 흑색종 또는 다양한 범위의 암종을 갖는 환자에서의 객관적 임상 반응은 희귀하고 가변적이며 일시적이었고, 주로 처리 부위에 집중되었다(Heinzerling et al., 2005; Kang et al., 2001; Sangro et al., 2004; Triozzi et al., 2005). 질환 분해(disease resolution)가 부분적이거나 완전한 경우, 이들 환자에서의 항원-특이적 T 세포의 개선된 교차-프라이밍(cross-priming)과 일관되게, 증가된 빈도의 종양 침윤 림프구(Heinzerling et al., 2005; Sangro et al., 2004) 및 상승된 수준의 종양-특이적 순환 CD8+ T 세포(Heinzerling et al, 2005)가 주목되었다.
특이적 T 세포의 교차-프라이밍은 IL-12의 천연적이지만 조절된 공급원으로서 작용하는 수지상 세포(수지상 세포; DC)에 의해 최상으로 성취되기 때문에(Berard et al., 2000), DC-기반 IL-12 유전자 치료법의 탁월한 전임상 효능에 대한 최근의 보고는 매우 흥미로운 것이었다(Satoh et al., 2002; Tatsumi et al., 2003; Yamanaka et al., 2002). 예를 들어,(재조합 아데노바이러스 감염을 통하여) IL-12p70을 생산하도록 조작된 DC의 종양내(intratumoral; i.t.) 주사는 쥐과 모델에서 종양 거부와 함께 광범위-반응성의 종양-특이적 CD8+ T 세포 레퍼토리(repertoire)의 교차-프라이밍을 극적으로 개선시키는 것으로 밝혀졌다(Tatsumi et al., 2003). CMV-기반 프로모터 하의 mIL-12를 인코딩하는 재조합 아데노바이러스 [rAd.cIL12,(Tatsumi et al., 2003)]의 이전의 사용을 가정하면, 조작된 DC의 IL-12 생산은 구성적이었으며, 따라서 종양 병변 내에서의 초기의, 그리고 종양 배출 림프절(tumor-draining lymph node) 내의 후기의 이 사이토카인의 면역학적 영향은 치료 결과와 관련하여 해결될 수 없었다. 따라서, 트랜스유전자(transgene) 발현 수준 및 트랜스유전자 활성화 타이밍 둘 모두를 조절하기 위한 IL-12의 조건부 발현을 위하여 조작된 DC에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명은 그러한 세포의 사용에 있어서 전도 유망한 치료 결과를 제공한다.
전-임상 또는 임상 시험에서 현재 조사중인 다수의 치료적 단백질은 환자의 숙주 세포 또는 적절한 생리적 배경에서 핵산 서열의 발현 이전에 환자에 존재할 경우 유해한 부작용을 나타내지 않는다. 그러나, 종양 괴사 인자(TNF)와 같은 일부 단백질은 정상 생리적 조직 또는 배경 밖에서(예를 들어, 비-표적 조직에 노출된) 발현될 경우 이상 반응을 일으킨다. 이 단백질의 전신 또는 국부 투여 조차도 많은 비-종양 세포 타입에 대해 극도로 독성이며, 아나필락시스 및 커켁시아를 가능케한다. 추가로, TNF-알파에의 장기적인 노출은 급성 자극에 비해 완전히 다른 세포 반응을 산출할 수 있다. 이런 이유로 인해, 암에 대한 안전하고 효과적인 TNF-알파 요법은 어려운 것으로 남아있다.
관심 있는 핵산 서열에 의해 인코딩된 단백질을 함유하는 벡터 조성물을 통한 유전자의 유전자 발현과 관련된 문제 때문에, 직접적 주사 또는 세포 기반 요법에 사용하기 위한 개선된 전이 벡터 조성물에 대한 요구가 남아 있다.
리소좀 축적 질환(LSD)은 효소 보충 요법의 형태로, 현재 단백질 치료법으로만 치료될 수 있는 유전된 유전적 장애의 부류를 나타낸다.
LSD는 하나 이상의 리소좀 효소 리소좀 내부에 소화되지 않은 고분자의 축적을 일으키는 하나 이상의 리소좀 효소의 결핍에 의해 특성화되는 49개 부류의 유전적으로 유전된 장애이다. 이들 불필요한 생성물의 축적은 세포 내에 리소좀을 확장시키며, 이는 세포 손상 및 변성에 이르게 된다. 기관 및 조직에서 축적된 손상은 신체적 및/또는 정신적 상태에서 진행형의 황폐를 초래하고, 결국 죽음에 이르게 된다. 진단은 전형적으로 유아기에 이루어진다. 개개의 질환의 중증도는 다양하며 결함이 있는 유전자에 의해 생성된 잔여의 효소 활성의 양과 연관이 있다.
LSD의 발생 정도는 약 5000명 중 1명(전세계 130,000개 사례)이다. 중증도는 다양하며 결함이 있는 유전자에 의해 생성된 잔여의 효소 활성의 양과 관련이 있다. 심각하게 병을 앓는 환자는 그들의 10대까지 살 수 있으며, 반면 다소 심각하지 않게 병을 않는 환자는 성인기까지 생존할 수 있다.
효소 보충 요법은 LSD를 치료하는데 이용가능한 유일한 방법이다. 요법은 리소좀을 표적하는 활성 단백질의 전신 투여 및 불필요한 분자의 축적을 분해하는 것으로 구성된다. LSD 단백질 치료제의 예로는 파브리병에 대한 파브라자임(젠자임), MPSII에 대한 엘라프라제(샤이어), 및 폼페병에 대한 마이오좀(젠자임), 및 고셰병에 대한 세레자임주(젠자임)가 포함된다.
효소 보충 요법은 번역-후 단백질 변경과 같은 특정한 결함이 수반되고, 보충 효소는 생체 내에서 짧은 반감기를 나타내며, 환자는 보충 효소에 대한 면역 반응을 발달시킨다. 그러므로, 리소좀 축적 질환을 치료하는데 효소 보충 요법에 대한 대안에 대한 요구가 당해 기술 분야에 남아있다.
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Figure 112017107941059-pat00001
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본 발명은 하나 이상의 프로모터의 제어 하에, 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능(들)을 갖는 단백질(들)을 인코딩(encoding)하는 재조합 벡터를 제공한다. 일 실시 양태에서, 상기 하나 이상의 프로모터는 조건부(conditional)이다. 다른 실시 양태에서, 상기 하나 이상의 프로모터는 구성적(constitutive)이다. 다른 실시 양태에서, 벡터는 용해성 소분자 리간드, 예를 들어 다이아실하이드라진(예를 들어, RG-115819, RG-115830 또는 RG-115932)의 제공에 의해 조건부로 활성화될 수 있는 프로모터에 의해 구동되는 단백질(들)을 인코딩하는 아데노바이러스 벡터이다. 이 벡터는 면역 세포, TSC로부터의 그리고 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)을 포함하는 벡터의 직접적 주사로부터의 단백질(들)의 발현의 제어를 가능하게 한다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 유전자 스위치(gene switch)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능(들)을 갖는 단백질(들)을 조건부로 발현하기 위한 벡터를 제공하며, 여기서 유전자 스위치를 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열 - 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 인코딩함 - 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 실시 양태에서, 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)이 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10R DN 또는 이의 서브유닛(subunit), IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-알파, IFN-감마, IFN-알파 1, IFN 알파 2, IL-15-R-알파, CCL3(MIP-1a), CCL5(RANTES), CCL7(MCP3), XCL1(림포탁틴), CXCL1(MGSA-알파), CCR7, CCL19(MIP-3b), CXCL9(MIG), CXCL10(IP-10), CXCL12(SDF-1), CCL21(6Ckine), OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-디펜신(Defensin), HMGB1, Flt3L, IFN-베타, TNF-알파, dnFADD, , TGF-알파, PD-L1 RNAi, PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드, TGFbRII DN, ICOS-L, S100, CD40L, p53, 서바이빈, p53-서바이빈 융합, MAGE3, PSA 및 PSMA로부터 선택된다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자) 및 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 발현하기 위한 벡터이며, 여기서, 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열 - 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 인코딩함 - (2) 상기 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능(들)을 갖는 상기 단백질(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (3) IL-12의 기능을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, (2) 및 (3) 중 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결되는 벡터를 제공한다.
일부 실시 양태에서, 본 발명의 벡터는 조건부로 TNF-알파를 발현한다. 소정의 실시 양태에서, 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자), 예를 들어 TNF-알파의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 조건부 발현하는, 벡터 예를 들어, 아데노바이러스 벡터는 시그널 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 시그널 펩티드는 코돈-최적화될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 벡터는 5' 비번역 영역(UTR), 3' 조절 영역, 또는 둘 모두를 추가로 포함하며 단백질 발현 및/또는 전체 수율을 개선시킨다.
추가로 본 발명은 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질(들)을 발현하는 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 집단을 생성하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 세포를 상기 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능(들)을 갖는 단백질(들)을 조건부로 발현하는 재조합 벡터로 변경(예를 들어, 형질감염(transfection), 전기천공 등)시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 벡터는 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열 - 이때 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 인코딩함 - 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자) 조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능(들)을 갖는 단백질 및 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 발현하는 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 집단을 생성하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 세포를 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 변경시키는 단계를 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열 - 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 코딩함 - (2) 상기 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능(들)을 갖는 상기 단백질(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (3) IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, (2) 및 (3) 중 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된다.
일부 실시 양태에서, 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자), 예를 들어, TNF-알파의 발현, mRNA 발현, 또는 단백질 발현을 증가시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질 및 하나 이상의 조절 서열을 조건부 발현하는 벡터를 생성하는 것을 포함하며, 여기서 상기 하나 이상의 조절 서열은 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자), 예를 들어, TNF-알파의 발현을 개선시킨다.
추가로 본 발명은 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능(들)을 갖는 단백질(들)을 조건부로 발현하는 재조합 벡터로 변경된(예를 들어 형질감염, 전기천공 등), 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질(들)을 발현하는 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 집단을 제공하며, 여기서 상기 벡터는 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열 - 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 인코딩함 - 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자) 조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 변경된, 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질 및 IL-2의 기능을 갖는 단백질을 발현하는 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 집단을 제공하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열 - 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 인코딩함 - (2) 상기 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능(들)을 갖는 상기 단백질(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (3) IL-12의 기능을 갖는 단백질(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, (2) 및 (3) 중 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 본 발명의 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 둘 이상의 집단을 함유하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물 중 세포의 각각의 집단은 상기 조성물 중 세포의 다른 집단(들)에서 발현되는 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)와는 상이한 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)를 발현한다. 일 실시 양태에서, 본 조성물은 세포의 두 집단을 함유한다. 다른 실시 양태에서, 본 조성물은 세포의 둘 초과의 집단을 함유한다. 다른 실시 양태에서, 본 조성물은 세포의 세 집단을 함유한다. 다른 실시 양태에서, 본 조성물은 세포의 네 집단을 함유한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, 시험관 내에서 조작된 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC를 제공하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열 - 이때 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 인코딩함 - 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 본 발명은 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, 시험관 내에서 조작된 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC를 제공하며, 여기서, 상기 폴리뉴클레오티드는(1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열 - 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 인코딩함 - (2) 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (3) IL-12의 기능을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, (2) 및 (3) 중 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 본 발명의 시험관 내 조작 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 둘 이상의 집단을 함유하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 조성물 중 시험관 내 조작 세포의 집단 각각은 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열 - 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 인코딩함 - 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 조성물 중 시험관 내 조작 세포의 각각의 집단은 상기 조성물 중 시험관 내 조작 세포의 다른 집단(들)에서 발현되는 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)과는 상이한 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)을 발현한다. 일 실시 양태에서, 본 발명은 각각의 집단이 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 시험관 내 조작 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 둘 이상의 집단을 함유하는 조성물을 제공하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열 - 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 인코딩함 - (2) 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (3) IL-12의 기능을 갖는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, (2) 및 (3) 중 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드는 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 연결된다. 일 실시 양태에서, 본 조성물은 시험관 내에서 조작된 세포의 두 집단을 함유한다. 다른 실시 양태에서, 본 조성물은 시험관 내에서 조작된 세포의 둘 초과의 집단을 함유한다. 다른 실시 양태에서, 본 조성물은 시험관 내에서 조작된 세포의 세 집단을 함유한다. 다른 실시 양태에서, 본 조성물은 시험관 내에서 조작된 세포의 네 집단을 함유한다.
또한 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 집단을 포함하는 약학 조성물 또는 세포 집단의 부재에서 발현 벡터의 직접 주사에 적합한, 즉 직접적으로 주사되는 조성물을 제공한다.
일 실시 양태에서, 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 유전자 스위치의 프로모터의 제어하에 있으며, IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 구성적 프로모터의 제어하에 있다. 다른 실시 양태에서, 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 둘 모두는 유전자 스위치의 다중 시스트론(multicistronic) 프로모터의 제어하에 있다. 다른 실시 양태에서, 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 유전자 스위치의 프로모터의 제어하에 있으며 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 유전자 스위치 프로모터와는 상이한 조건부 프로모터의 제어하에 있다. 추가의 실시 양태에서, 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질(들)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 위한 유전자 조절 시스템 및 IL-12의 기능을 갖는 폴리뉴클레오티드를 위한 유전자 조절 시스템은 직교성(orthogonal)을 갖는다. 추가의 실시 양태에서, 각각의 단백질을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오티드를 위한 유전자 조절 시스템은 직교성을 갖는다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 암, 예를 들어 제한되지 않지만 흑색종 종양, 신경교종 종양, 신장암, 및 전립선암은 물론 본 명세서에 표 1에 열거된 암들의 치료법을 또한 제공한다. IL-12 유전자 치료법은 재조합 cDNA 벡터로서 적용될 때 동물 모델 연구에서 항-종양 효능을 입증하였지만(Faure et al., 1998; Sangro et al., 2005), 유전자-변경 DC와 관련하여 적용될 때에는 더욱 더 그러하다(Satoh et al., 2002; Svane et al., 1999; Tatsumi et al., 2003; Yamanaka et al., 2002). 그러나, 현재까지 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 구현하는 IL-12 유전자 치료법의 인간 I상 임상 시험에서는 암 세팅에서 영속적이고 객관적인 임상 반응이 달성되지 못하였다(Heinzerling et al., 2005; Kang et al., 2001; Sangro et al., 2004; Triozzi et al., 2005). 본 명세서에 개시된 유전자 치료법은 전도 유망한 치료 양식을 제공한다.
일 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 조건부로 발현하도록 시험관 내 조작된, 본 발명의 면역 세포, TSC 또는 벡터의 집단(또는 이의 조합)을 종양 주위의 장소에서, 종양 미세환경에 종양 내로, 또는 전신적으로 투여하는 단계; 및
(b) 치료적 유효량의 활성화 리간드를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하여, 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 종양을 치료하는, 포유동물에서 상기 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
일 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 조건부로 발현하도록 시험관 내 조작된, 면역 세포, TSC의 집단을 종양 미세환경에 종양내 투여하는 단계; 및
(b) 치료적 유효량의 활성화 리간드를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하여; 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 상기 종양을 치료하는, 포유동물에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 조건부로 발현하도록 시험관 내 조작된, 면역 세포 또는 TSC의 둘 이상의 집단을 종양 미세환경에 종양내 투여하는 단계 - 여기서 면역 세포 또는 TSC의 각각의 집단은 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 상이한 세트를 발현함 -; 및
(b) 치료적 유효량의 하나 이상의 활성화 리간드를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하여; 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 종양을 치료하는, 포유동물에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질 및 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 조건부로 발현하도록 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC의 집단을 종양 미세환경에 종양내 투여하는 단계 - 여기서, 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자) 또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질들 중 적어도 하나는 리간드에 의해 활성화되는 조건부 프로모터의 제어하에 있음 - ; 및
(b) 치료적 유효량의 활성화 리간드를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하여; 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질 및/또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 종양을 치료하는, 포유동물에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질 및 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 조건부로 발현하도록 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC의 둘 이상의 집단을 종양 미세환경에 종양내 투여하는 단계 - 여기서, 면역 세포 또는 TSC의 각각의 집단은 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질의 상이한 세트를 발현하며, 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자) 또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질들 중 적어도 하나는 리간드에 의해 활성화되는 조건부 프로모터의 제어하에 있음 -; 및
(b) 치료적 유효량의 하나 이상의 활성화 리간드를 포유동물에 투여하는 단계를 포함하여; 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자) 및/또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 종양을 치료하는, 포유동물에서 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 조건부로 발현하도록 변경된 변경 세포의 집단을 포유동물에 투여하는 단계; 및
(b) 치료적 유효량의 활성화 리간드를 상기 포유동물에 투여하는 단계를 포함하여; 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 질환 또는 장애를 치료하는, 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 조건부로 발현하도록 변경된 변경 세포의 둘 이상의 집단을 포유동물에 투여하는 단계이며, 여기서, 변경 세포의 각각의 집단은 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 상이한 세트를 발현함; 및
(b) 치료적 유효량의 하나 이상의 활성화 리간드를 상기 포유동물에 투여하는 단계를 포함하여; 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 질환 또는 장애를 치료하는, 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질 및 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 조건부로 발현하도록 변경된 변경 세포의 집단을 포유동물에 투여하는 단계이며, 여기서, 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자) 또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질들 중 적어도 하나는 리간드에 의해 활성화되는 조건부 프로모터의 제어하에 있음; 및
(b) 치료적 유효량의 활성화 리간드를 상기 포유동물에 투여하는 단계를 포함하여; 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)자의 기능을 갖는 단백질 및/또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 질환 또는 장애를 치료하는, 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은
(a) 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질 및 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 조건부로 발현하도록 변경된 변경 세포의 둘 이상의 집단을 포유동물에 투여하는 단계이며, 여기서, 변경 세포의 각각의 집단은 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질의 상이한 세트를 발현하며, 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자) 또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질들 중 적어도 하나는 리간드에 의해 활성화되는 조건부 프로모터의 제어하에 있음; 및
(b) 치료적 유효량의 하나 이상의 활성화 리간드를 상기 포유동물에 투여하는 단계를 포함하여; 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자) 및/또는 IL-12 의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 상기 질환 또는 장애를 치료하는, 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 치료법의 시작 전에 환자에서 IFN-감마의 발현 또는 활성의 수준을 측정하며 그에 의해 대조 수준을 생성하고 이어서 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질 및 선택적으로 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 발현하도록 조작된 세포를 투여하는 단계, 유효량의 활성화 리간드를 투여하는 단계, 및 그 후 IFN-감마의 발현 수준을 측정하여 시험 수준을 생성하는 단계와, 대조 수준을 시험 수준과 비교하여 당해 치료 요법(therapeutic regime)이 유효한지를 결정하는 단계에 의해 조작된 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC를 기반으로 하는 치료법의 효능을 결정하는 방법을 제공한다
추가로 (a) 포유동물에서 적어도 하나의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자), 예를 들어, IL-12, TNF-알파를 조건부로 발현하는 벡터의 치료적 유효량을 투여하는 단계, (b) 치료적 유효량의 하나 이상의 활성화 리간드를 상기 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 포유동물에서 종양의 치료, 종양 크기의 감소, 또는 종양 형성을 방지하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 활성화 리간드는 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질의 발현을 활성화하며, 이에 따라 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여, 상기 종양을 치료한다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 시험관 내에서 조작된 세포, 예를 들어 면역 세포- 또는 TSC-를 기반으로 하는 치료 요법의 효능을 환자에서 결정하는 방법을 제공한다:
(a) 이를 필요로 하는 상기 환자로부터 얻은 제1 생물 샘플 중 인터페론-감마(IFN-감마)의 발현 수준 또는 활성 수준 또는 이들 둘 모두를 시험관 내 조작 세포의 투여 전에 측정하고 그에 의해 대조 수준을 생성하는 단계;
(b) 이를 필요로 하는 환자에게 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질 및 선택적으로 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 조건부로 발현하도록 조작된 시험관 내 조작 세포를 투여하는 단계;
(c) 이를 필요로 하는 상기 환자에게 유효량의 활성화 리간드를 투여하는 단계;
(d) 시험관 내에서 조작된 면역 세포 및 활성화 리간드의 투여 이후에 이를필요로 하는 상기 환자로부터 얻은 제2 생물 샘플 중 IFN-감마의 발현 수준 또는 활성 수준 또는 이들 둘 모두를 측정하고 그에 의해 시험 수준을 생성하는 단계; 및
(e) IFN-감마의 대조 수준을 그의 시험 수준과 비교하는 단계이며,
여기서, IFN-감마의 발현, 활성 또는 이들 둘 모두의 시험 수준이 대조 수준에 비하여 증가하는 것은 당해 치료 요법이 이를 필요로 하는 상기 환자에서 유효함을 나타낸다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 포유동물에서 종양을 치료, 종양 크기를 감소, 또는 종양 형성을 방지하는 방법을 제공한다:
(a) 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능(들)을 갖는 단백질(들)을 조건부 발현하기 위해 벡터를 종양 미세환경에 종양내 투여하는 단계로서, 여기서 벡터는 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열 - 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 인코딩함 - 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 하나 이상의 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10R DN 또는 이의 서브유닛, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-알파, IFN-감마, IFN-알파 1, IFN 알파 2, IL-15-R-알파, CCL3(MIP-1a), CCL5(RANTES), CCL7(MCP3), XCL1(림포탁틴), CXCL1(MGSA-알파), CCR7, CCL19(MIP-3b), CXCL9(MIG), CXCL10(IP-10), CXCL12(SDF-1), CCL21(6Ckine), OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-디펜신(defensin), HMGB1, Flt3L, IFN-베타, TNF-알파, dnFADD, BCG, TGF-알파, PD-L1 RNAi, PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드, TGFbRII DN, ICOS-L, S100, CD40L, OX40L, p53, 서바이빈, p53-서바이빈 융합, MAGE3, PSA 및 PSMA로부터 선택되는 것이며, 여기서 상기 벡터는 세포 내에 함유되지 않으며; (b) 치료적 유효량의 하나 이상의 활성화 리간드를 포유동물에 투여하는 하는 단계로써, 치료적 단백질(예를 들어, 면역조절자)의 기능을 갖는 단백질의 발현을 유도하여 종양을 치료하는 단계.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 포유동물에서 질환을 치료하는 방법을 또한 제공한다:
(a) 상기 포유동물에 단백질을 조건부로 발현하는 벡터를 투여하는 단계이며, 상기 벡터는 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열 - 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 인코딩함 - 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 상기 벡터가 세포 내에 함유되지 않으며; (b) 치료적 유효량의 하나 이상의 활성화 리간드를 상기 비-인간 동물에 투여하는 단계로써, 하나 이상의 단백질의 발현을 유도하여 상기 질환을 치료하는 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 포유동물에서 리소좀 축적 장애를 치료하는 방법을 또한 제공한다:
(a) 상기 포유동물에 단백질을 조건부로 발현하는 벡터를 투여하는 단계이며, 상기 벡터는 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열 - 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 인코딩함 - 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 상기 벡터가 생체 내 투여 전에 세포 내에 함유되지 않으며; (b) 치료적 유효량의 하나 이상의 활성화 리간드를 상기 포유동물에 투여하는 단계로써, 하나 이상의 단백질의 발현을 유도하여 상기 리소좀 축적 질환을 치료하는 단계.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 포유동물에서 간질환을 치료하는 방법을 또한 제공한다:
(a) 상기 포유동물에 단백질을 조건부로 발현하는 벡터를 투여하는 단계이며, 상기 벡터는 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열 - 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 인코딩함 - 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 상기 벡터가 생체 내 투여 전에 세포 내에 함유되지 않으며; (b) 치료적 유효량의 하나 이상의 활성화 리간드를 상기 비-인간 동물에 투여하는 단계로써, 하나 이상의 단백질의 발현을 유도하여 상기 간 질환을 치료하는 단계.
서열의 상세한 설명
치료용 단백질
사이토카인류
감염에 대한 염증 반응에 중요한 사이토카인인 인터루킨 1(IL-1)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 M28983(인간 IL-1α); M15330(인간 IL-1β); AF201830(인간 IL-1δ); AF201831(인간 IL-1ε); AF201832(인간 L-1ζ); AF201833(인간 IL-1η); NM_010554(마우스 IL-1α); NM_008361(마우스 IL-1β); NM_019451(마우스 L-1δ) NM_019450(마우스 IL-lf6); NM_027163(마우스 IL-lf8); NM_153511(마우스 IL-lf9); NM_204524(닭 IL-1β); NM_017019(랫트 IL-1α); 및 NM_031512(랫트 IL-1β)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 1(IL-1)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAA59134(인간 IL-1α); AAA59135(인간 IL-1β); AAF25210(인간 IL-1δ); AAF25211(인간 IL-1ε); AAF25212(인간 IL-1ζ); AAF25213(인간 IL-1η); NP_034684(마우스 IL-1α); NP_032387(마우스 IL-1β); NP_062324(마우스 L-1δ); NP_062323(마우스 IL-lf6); NP_081439(마우스 IL-lf8); NP_705731(마우스 IL-lf9), NP_989855(닭 IL-1β); NP_058715(랫트 IL-1α); 및 NP_113700(랫트 IL-1β)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다. [Laurent et al., Psychiatr. Genet. 7: 103(1997)]에는 인간 인터루킨-1 베타 유전자에서의 다형성 돌연변이(polymorphic mutation)가 확인되었다.
IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, 및 IL-21을 포함하는 사이토카인 패밀리에 속하는 인터루킨 2(IL-2)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 U25676(인간); NM_008366(마우스); NM_204153(닭); 및 NM_053836(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 2(IL-2)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAA70092(인간); NP_032392(마우스); NP_989484(닭); 및 NP_446288(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
[Liu et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 133: 11(2006)]에서는 돌연변이 인간 IL-2가 생성되었으며, [Lorberboum et al., J. Biol. Chem. 265: 16311(1990)]에는 키메라 IL-2의 생성이 기술되어 있다.
나이브(naive) 헬퍼(helper) T 세포의 Th2 세포로의 분화를 유도하는 사이토카인인 인터루킨 4(IL-4)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 M23442(인간); NM_021283(마우스); NM_001007079(닭); 및 NM_201270(랫트)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 4(IL-4)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAA59150(인간); NP_067258(마우스); NP_001007080(닭); 및 NP_958427(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
[Kawashima et al., J. Med. Genet. 35: 502(1998)]에는 아토피성 피부염과 관련된, IL-4 유전자의 다형성이 기술되어 있다.
인터루킨 7(IL-7)은 B 및 T 세포 발생에 중요한 사이토카인이다. IL-7의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 J04156(인간); NM_008371(마우스); NM_001037833(닭); 및 NM_013110(랫트)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 7(IL-7)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAA59156(인간); NP_032397(마우스); NP_001032922(닭); 및 NP_037242(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
[Feng et al., Genetics 775:545(2007)]에서는 기능 결핍으로 이어지는 IL-7의 점 돌연변이가 확인되었다.
인터루킨 9(IL-9)는 T 세포에 의해 생성되는 사이토카인으로서 조혈 세포의 조절자이다. IL-9의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_000590(인간); NM_008373(마우스); NM_001037825(닭); 및 NM_0O1105747(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 9(IL-9)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_000581(인간); NP_032399(마우스); NP_OO1032914(닭); 및 NP_001099217(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
IL-12는 활성화된 T 및 NK 세포에 있어서 성장 인자로서 작용하며 NK/림포카인-활성화 살해 세포(Killer cell)의 용해 활성(lytic activity)을 향상시키며 휴면 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에 의한 IFN-감마의 생성을 촉진할 수 있는 사이토카인이다. IL-12의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_000882(인간 IL12A); NM_002187(인간 IL12B); NM_008351(마우스 IL12a); NM_008352(마우스 IL12b); NM_213588(닭 IL12A); NM_213571(닭 IL12B); NM_053390(랫트 IL12a); 및 NM_022611(랫트 IL12b)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 12(IL-12)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_000873(인간 IL12A); NP_002178(인간 IL12B); NP_032377(마우스 IL12a); NP_032378(마우스 IL12b); NP_998753(닭 IL12A); NP_998736(닭 IL12B); NP_445842(랫트 IL12a); 및 NP_072133(랫트 IL12b)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 15(IL-15)는 T 세포 및 자연 살해 세포의 활성화 및 증식을 조절하는 사이토카인이다. IL-15의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 U14407(인간); NM_008357(마우스); EU334509(닭); 및 AF015719(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 15(IL-15)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAA21551(인간); NP_032383(마우스); ABY55312(닭); 및 AAB94536(랫트)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 12와 함께 대식세포에 의해 생성되는 사이토카인인 인터루킨 18(IL-18)은 미생물 제품에 의한 감염 이후의 세포-매개 면역성을 유도한다. IL-18의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 U90434(인간); NM_008360(마우스); EU747333(닭); 및 AY258448(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 18(IL-18)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAB50010(인간); NP_032386(마우스); ACE79188(닭); 및 AAP14669(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
세포 증식을 유도함으로써 자연 살해 세포 및 세포독성 T 세포를 비롯한 면역계 세포에 강력한 조절적 영향을 미치는 사이토카인인 인터루킨 21(IL-21)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AF254069(인간); NM_021782(마우스); NM_001024835(닭); 및 NM_001108943(랫트)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 21(IL-21)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAG29348(인간); NP_068554(마우스); NP_001020006(닭); 및 NP_0O1102413(랫트)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨 27(IL-27)은 B 및 T 림프구의 활성을 조절하는데 있어서 중요한 기능을 하는 사이토카인이다. IL-27의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AY099296(인간); NM_145636(마우스); 및 XM_344962(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
특정 세포 표면 수용체(IFNAR)에 결합하는 인터페론 단백질 군의 구성원이며 대식세포 및 자연 살해(natural killer, NK) 세포 둘 모두를 자극하여 항-바이러스 반응을 초래하는 인터페론 베타 1(IFNB1)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_002176(인간); NM_010510(마우스); NM_001024836(닭); 및 NM_019127(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터페론 베타 1(IFNB1)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_002167(인간); NP_034640(마우스); NP_001020007(닭); 및 NP_062000(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터페론 감마(IFN-감마)는 유일한 제II형 인터페론인 용해성 사이토카인으로서 항바이러스, 면역조절 및 항종양 활성을 갖는다. IFN-감마의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_000619(인간); NM_008337(마우스); 및 NM_138880(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터페론 감마(IFN-감마)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_000610(인간); NP_032363(마우스); 및 NP_620235(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
지질 대사, 응고, 인슐린 허용성 및 내피세포 기능에 영향을 미치는, 주로 단구/대식세포에 의해 분비되는 다기능성 전염증성 사이토카인인 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor)(TNF-알파)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 X02910(인간); NM_013693(마우스); 및 BC107671(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
TNF-알파의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 CAA26669(인간); NP_038721(마우스); 및 AAI07672(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인간 TNF-알파(hTNF-알파로서 본 명세서에 약기됨 또는 간단히 hTNF)는 17 kD의 용해성 형태(sTNF-알파)와 26 kD의 막 연관 형태(tmTNF-알파)로서 존재하는 인간 사이토카인이며, 이의 생물학적 활성 형태는 비공유적으로 결합된 17 kD 분자의 삼량체로 구성된다. hTNF-알파의 구조는 예를 들어, [Pennica, D., et al.(1984) Nature 312:724-729; Davis, J. M., et al.(1987) Biochemistry 26:1322-1326; 및 Jones, E. Y., et al.(1989) Nature 338:225-228]에 기술되어 있다. TNF-알파는 TNF-수용체 1형(TNFR-1) 또는 TNF-수용체 2형(TNFR-2)에 결합할 수 있으며 아폽토시스 또는 염증을 유도하는 면역 세포를 조절하거나, 종양형성 또는 바이러스 복제를 억제하는 것과 관련된다. TNF/TNFR 결합에 의해 생성된 세포 시그널링 연쇄반응은 예를 들어, [Wajant, H., et al.(2003) Cell Death Differ. 10(1): 45-65 또는 Chen, G., et al.(2002) Science 296: 1634-5]에 기술되어 있다.
전체-길이 인간 TNF-알파 폴리펩티드는 세포질 도메인, 막관통 도메인 및 세포외 도메인으로 구성된다. 233aa의 폴리펩티드 서열은 인간 TNF-알파 폴리펩티드 서열로서 보고되었으며 서열 번호 37의 아미노산 1-35의 세포질 도메인, 서열 번호 37의 아미노산 36-56의 막관통 도메인, 및 서열 번호 37의 아미노산 57-233의 세포외 도메인을 갖는 서열 번호 37로서 표기된다. 서열 번호 37은 서열 번호 35 또는 36을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 인간 TNF-알파의 변이체는 하나 이상의 하기의 돌연변이를 가진 폴리펩티드를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다: L105S, R108W, L112F, A160V, S162F, V167A, E222K, F63S, PSD84-86VNR, 또는 E183R.
케모카인류
케모카인[C 모티프(motif)] 리간드 1(XCL1, 림포탁틴으로도 공지됨)은 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대해서는 주화성을 갖지만 단구에 대해서는 주화성을 갖지 않으며, 말초 혈액 림프구 중 세포내 칼슘의 상승을 유도한다. XCL1의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_002995(인간); NM_OO851O(마우스); 및 NM_134361(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
XCL1의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_002986(인간); NP_032536(마우스); 및 NP_599188(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다. 미국 특허 제6,022,534호에는 림포탁틴과, 세포독성 T 세포 및/또는 NK 세포를 유인하고/하거나 증식 또는 상주 세포(resident cell)를 유도하는 용도가 개시되어 있다. XCL1 융합 단백질 및 항-림포탁틴 항체의 단리 및 사용 방법이 또한 개시되어 있다.
다형핵 백혈구의 모집 및 활성화에 있어서 급성 염증 상태에 연루된, 소위 모노카인(주로 단구 및 대식세포에 의해 생성되는 소정 유형의 사이토카인)이며 대식세포 염증 단백질-1(macrophage 염증성 protein-1, MIP-1)로도 공지된 CC 케모카인 리간드 3(CC chemokine 리간드 3, CCL3)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_002983(인간); NM_011337(마우스); 및 NM_013025(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CCL3의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_002974(인간); NP_035467(마우스); 및 NP_037157(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
염증 및 천식에 연루된 전염증성 사이토카인인 CCL5(RANTES)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AF043341(인간); NM_013653(마우스); 및 NM_031116(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CCL5의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAC03541(인간); NP_038681(마우스); 및 NP_112378(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
염증 및 암 침범 동안 대식세포 모집에 연루된 케모카인인 CC 케모카인 리간드 7(CCL7)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_006273(인간); NM_013654(마우스); 및 NM_001007612(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CCL7의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_006264(인간); NP_038682(마우스); 및 NP_001007613(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
케모카인(CXC 모티프) 리간드 9(CXCL9, MIG로도 공지됨)는 감마 인터페론에 의해 유도가능한 T-세포 화학 유인 물질(chemoattractant)이다. CXCL9의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_002416(인간); NM_O108599(마우스); 및 NM_145672(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CXCL9의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_002407(인간); NP_032625(마우스); 및 NP_663705(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 10(CXCL1O)은 면역계에서의 세포에 대한 화학유인, 내피 세포에의 T 세포의 유착, 항-종양 활성 및 혈관신생에서의 역할을 갖는 작은 사이토카인이다. CXCL1O의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 X02530(인간); NM_021274(마우스); 및 BC058444(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 10(CXCL1O)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 CAA26370(인간); NP_067249(마우스); 및 AAH58444(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
기질 세포 유래 인자 1(stromal cell-derived factor 1, SDF-1)로도 공지된 케모카인(C-X-C 모티프) 리간드 12(CXCL12)는 인터크라인 패밀리(intercrine family)에 속하는 작은 사이토카인인데, 상기 패밀리의 구성원은 백혈구를 활성화시키며 LPS, TNF 또는 IL1과 같은 전염증성 자극에 의해 흔히 유도된다. CXCL12의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_000609(인간); NM_001012477(마우스); NM_204510(닭); 및 NM_001033883(랫트)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CXCL12의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_00O6OO(인간); NP_001012495(마우스); NP_989841(닭); 및 NP_001029055(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
[Hansson et al., Microbes 및 Infection 8:841(2006)]에서는 케모카인(C-C 모티프) 수용체 7(CCR7)과 케모카인(C-C 모티프) 리간드 19(CCL19, MIP-3β로도 공지됨) 사이의 상호작용이 일차 면역 반응의 생성에 결정적임이 논의되어 있다. CCR7의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_001838(인간); 및 NM_007719(마우스)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CCR7의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_001829(인간); 및 NP_031745(마우스)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CCL19의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_006274(인간); 및 NM_011888(마우스)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CCL19의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_006265(인간); 및 NP_036018(마우스)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CD4+ T 세포가 그의 정상 상태인 '기준점(set point)'에 도달하는데에는 필요하지만 CD8+ T 세포의 경우에는 필요하지 않은 CCR7의 잘 확립된 리간드인 CC 케모카인 리간드 21(CCL21) - CCL21의 발현에서의 동요(perturbation)는 자가면역에 대한 감수성을 변경시킬 수 있음 - 의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AB002409(인간); NM_011335(마우스 CCL21a); NM_011124(마우스 CCL21b); 및 NM_023052(마우스 CCL21c)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CCL21의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 BAA21817(인간); NP_035465(마우스 CCL21a); NP_035254(마우스 CCL21b); 및 NP_075539(마우스 CCL21c)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인터루킨-8(IL-8)은 호중구-활성화 펩티드-1 또는 SCYB8로도 불리우는 케모카인이며 염증성 자극에 반응하여 몇몇 유형의 세포에 의해 분비되는 조직-유래 펩티드이다. 미국 특허 제6,133,426호 및 미국 특허 제6,177,980호에는 인간화 항-IL-8 항체의 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열이 개시되어 있다. 인간 IL-8의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_000584로서 입수가능하며, 상기 서열은 본 명세서에 참고로 포함된다.
인간 IL-8의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_000575로서 입수가능하며, 상기 서열은 본 명세서에 참고로 포함된다.
성장 인자류
과립구/대식세포 콜로니-자극 인자(granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)는 백혈구 세포 성장 인자로서의 기능을 하며 줄기 세포를 자극하여 과립구(호중구, 호산구 및 호염기구) 및 단구가 생성되게 하는 사이토카인이다. GM-CSF의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 M11734(인간); NM_009969(마우스); EU520303(닭); NM_001037660(랫트 Csf2ra); 및 NM_133555(랫트 Csf2rb)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
과립구/대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAA52122(인간); NP_034099(마우스); ACB11534(닭); NP_001032749(랫트 Csf2ra); 및 NP_598239(Csf2rb)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
조혈 줄기 세포 또는 전구 세포 또는 이들 둘 모두 상에서 성장 인자 수용체로서의 기능을 할 수 있는 FMS-관련 타이로신 키나아제 리간드(FLT3/FLK2 리간드, Flt3L)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 U04806(인간); 및 NM_013520(마우스)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
FLT3/FLK2 리간드(Flt3L)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAA17999(인간); 및 NP_038548(마우스)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
일부 인간 암에서 상향조절되고 배양 세포에 형질전환된 표현형을 가역적으로 부여할 수 있는 형질전환 성장 인자(transforming growth factor), 알파(TGF-알파)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_001099691(인간); NM_031199(마우스); NM_001001614(닭); 및 NM_012671(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
TGF-알파의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_001093161(인간); NP_112476(마우스); NP_001001614(닭); 및 NP_036803(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
아쥬반트류(Adjuvants)
베타-디펜신은 많은 그람(Gram)-음성 및 그람-양성 박테리아, 진균류 및 바이러스에 대한 선천성 면역 반응에 연루된 항미생물 펩티드이다. 베타-디펜신의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 X92744(인간 hBD-1); AJ000152(인간 hBD-2); AF217245(인간 베타 디펜신-3); AJ314835(인간 베타 디펜신-4); AB089180(인간 hBD- 5); AY122466(인간 디펜신 베타 106, DEFB106); AF540979(인간 베타 디펜신 107, DEFB 107); AF529416(인간 베타 디펜신, DEFB 108); DQO12014(인간 베타 디펜신 110, DEFB11O); DQO12015(인간 베타 디펜신 111, DEFB111); DQO12016(인간 베타 디펜신 112, DEFB112); DQ012017(인간 베타 디펜신 113, DEFB113); DQ012018(인간 베타 디펜신 114, DEFB114); DQ012019(인간 베타 디펜신 115, DEFB115); DQO12020(인간 베타 디펜신 116, DEFB116); DQO 12021(인간 베타 디펜신 117, DEFB117); NM_007843(마우스 디펜신 베타 1); NM_010030(마우스 디펜신 베타 2, Defb2); NM_013756(마우스 디펜신 베타 3, Defb3); NM_019728(마우스 디펜신 베타 4, Defb4); NM_030734(마우스 디펜신 베타 5, Defb5); NM_054074(마우스 디펜신 베타 6, Defb6); NM_139220(마우스 디펜신 베타 7); NM_153108(마우스 디펜신 베타 8, Defb8); NM_139219(마우스 디펜신 베타 9, Defb9); 및 NM_139225(마우스 디펜신 베타 10, DefblO)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
베타-디펜신의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 CAA63405(인간 hBD-1); CAB65126(인간 hBD-2); AAF73853(인간 베타 디펜신-3); CAC85520(인간 베타 디펜신-4); BAC10630(인간 hBD- 5); AAM93908(인간 디펜신 베타 106, DEFB106); AAN33115(인간 베타 디펜신 107, DEFB 107); AAQ09525(인간 베타 디펜신, DEFB 108); AAY59750(인간 베타 디펜신 110, DEFB110); AAY59751(인간 베타 디펜신 111, DEFB111); AAY59752(인간 베타 디펜신 112, DEFB112); AAY59753(인간 베타 디펜신 113, DEFB113); AAY59754(인간 베타 디펜신 114, DEFB114); AAY59755(인간 베타 디펜신 115, DEFB115); AAY59756(인간 베타 디펜신 116, DEFB116); AAY59757(인간 베타 디펜신 117, DEFB117); NP_031869(마우스 디펜신 베타 1); NP_034160(마우스 디펜신 베타 2, Defb2); NP_038784(마우스 디펜신 베타 3, Defb3); NP_062702(마우스 디펜신 베타 4, Defb4); NP_109659(마우스 디펜신 베타 5, Defb5); NP_473415(마우스 디펜신 베타 6, Defb6); NP_631966(마우스 디펜신 베타 7, Defb7); NP_694748(마우스 디펜신 베타 8, Defb8); NP_631965(마우스 디펜신 베타 9, Defb9); 및 NP_631971(마우스 디펜신 베타 10, DefblO)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다. 추가의 인간 및 랫트 디펜신 펩티드 서열에 대해서는 미국 특허 제5,242,902호를 또한 참조하라.
고-이동성 그룹 박스-1(high-mobility 그룹 box-1, HMGB1) 단백질은 비히스톤(nonhistone) 염색체 단백질로서 이는 사이토카인으로서의 기능을 하여 괴사성 세포 사멸 및 암, 병원체에 의한 침범, 외상, 및 패혈증에 대한 국소 반응 및 전신 반응을 매개한다. HMGB1 단백질의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_002128(인간); NM_010439(마우스); NM_204902(닭); 및 NM_012963(랫트)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
고-이동성 그룹 박스-1(HMGB1)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_002119(인간); NP_034569(마우스); NP_990233(닭); 및 NP_037095(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
식세포 S1OO 단백질은 염증 반응을 매개하여 염증 세포를 조직 손상 부위로 모집하며, 선천성 면역에 중요한 손상-관련 분자 패턴(Damage-associated molecular pattern, DAMP) 분자의 구성원이다. [Foell et al., J. Leukocyte Biol. 81:1(2006)]을 참조하라. S1OO 단백질의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 BCO14392(인간 S1OO A1); BC002829(인간 S1OO A2); BC012893(인간 S1OO A3); BC016300(인간 S1OO A4); Z18954(인간 S1OOD); BCOO1431(인간 S1OO A6); BC034687(인간 S1OO A7); BC005928(인간 S1OO A8); BC047681(인간 S1OO A9); BCO15973(인간 S1OO A1O); D38583(인간 클라기자린(clagizzarin)); NM_011309(마우스 S1OOa1); NM_009115(마우스 S1OOb); NM_013650(마우스 S100a8); NM_009114(마우스 S100a9); NM_011310(마우스 S100a3); NM_011311(마우스 S100a4); 및 NM_011312(마우스 S100a5)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
S1OO 단백질의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAH14392(인간 S1OO A1); AAH02829(인간 S1OO A2); AAH12893(인간 S1OO A3); AAH16300(인간 S1OO A4); CAA79479(인간 S1OOD); AAHO1431(인간 S1OO A6); AAH34687(인간 S1OO A7); AAH05928(인간 S1OO A8); AAH47681(인간 S1OO A9); AAH15973(인간 S1OO A1O); BAA07597(인간 클라기자린); NP_035439(마우스 S1OOa1); NP_033141(마우스 S1OOb); NP_038678(마우스 S100a8); NP_033140(마우스 S100a9); NP_035440(마우스 S100a3); NP_035441(마우스 S100a4); 및 NP_035442(마우스 S100a5)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
당 만노스의 중합체인 식물 다당류, 만난(mannan)은 면역 반응의 생성에 유용하다. 미국 특허 제5,807,559호에는 종양-관련 탄수화물 구조체에 대하여 또는 감염제(infectious agent) 및/또는 감염된 숙주 세포 상에서 발현되는 탄수화물 구조체에 대하여 T 세포 면역성을 생성하는데 유용할 수 있는 만난의 면역원성 콘쥬게이트(conjugate)가 개시되어 있다. 미국 특허 제5,773,425호에는 바이러스성 질환의 치유 및/또는 증상의 완화를 위하여 그리고 면역 반응의 증강을 위하여 만난을 사용하는 것이 개시되어 있다.
약화된 생 마이코박테리움(Mycobacterium) 종인 바실레 칼메테-구에린(Bacille Calmette - Guerin, BCG)이 중증의 치명적 결핵의 예방에 대한 백신으로서 사용된다. 미국 특허 제7,393,541호에는 포유동물 대상에서 마이코박테리움에 대한 생체 내 T-세포 매개 면역 반응을 생성하기 위한 아쥬반트 백신(adjuvant vaccine)의 생성이 개시되어 있다.[Hubbard 및 Collins, Infect. Immun. 59(2) : 570]을 또한 참조하라. 미국 특허 제5,292,513호에는 증강된 살균 및 항바이러스 활성을 필요로 하는 환자에 있어서 생체 내에서 대식세포를 가열 살균한 BCG로 프라이밍하는(priming) 방법이 개시되어 있다. BCG의 완전 게놈 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NC_008769로서 입수가능하다(엠. 보비스 비씨지 균주 파스퇴르(M. bovis BCG str. Pasteur) 1173P2, 완전 게놈).
박테리아 리포다당류(lipopolysaccharides, LPS)는 그람-음성 박테리아에 의한 감염시 강한 면역 반응을 유도하는 내독소이다. 미국 특허 제4,148,877호에는 박테리아 배양물로부터 LPS를 분획화하는 것 및 이 분획물을 약물로 사용하여 박테리아 감염에 대한 허용성을 유도하는 것이 개시되어 있다. 미국 특허 제5,292,513호에는 증강된 살균 및 항바이러스 활성을 필요로 하는 환자에 있어서 생체 내에서 대식세포를 LPS로 프라이밍하는 방법이 개시되어 있다.
공동 자극(co-stimulatory) 분자(양성)
OX40 리간드(OX40L)는 종양 괴사 인자(리간드) 수퍼패밀리 멤버 4(tumor necrosis factor superfamily member 4, Tnfsf4)에 속하며, 수지상 세포 상에서 발현되며 Th2 세포 분화를 촉진한다. OX40 리간드의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 X79929(인간); U12763(마우스); 및 AF037067(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
OX40 리간드(OX40L)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 CAA56284(인간); AAA21871(마우스); 및 AAC67236(랫트)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
4-1BB 리간드(4-1BBL)는 종양 괴사 인자(리간드) 수퍼패밀리 멤버 9(Tnfsf9)에 속하는데, 이는 제2형 막관통 당단백질이며 활성화된 T 림프구 상에서 발현된다. 4-1BBL의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_003811(인간); NM_009404(마우스); 및 AY332409(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
4-1BB 리간드(4-1BBL)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_003802(인간); NP_033430(마우스); 및 AAQO1228(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CD40 단백질은 종양 괴사 인자 수용체 수퍼패밀리 멤버 5에 속하며, T 세포-의존성 면역글로불린 클래스 스위칭, 기억-B 세포 발생 및 배 중심(germinal center) 형성을 포함하는 매우 다양한 면역 및 염증 반응의 매개에서 필수적이다. CD40 단백질의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 X60592(인간); NM_170701(마우스); NM_204665(닭); 및 NM_134360(랫트)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CD40 단백질의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 CAA43045(인간); NP_733802(마우스); NP_989996(닭); 및 NP_599187(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CD40L(CD40 리간드, 또는 CD154)는 활성화된 T 세포 상에서 주로 발현되며 TNF 수퍼패밀리 분자의 멤버이다. 이는 항원-제시 세포 상의 CD40에 결합한다. CD40L는 공자극 분자의 역할을 하며 항원-제시 세포 상의 자기 MHC 분자와 T 세포 수용체 자극과 연관하여 항원-제시 세포에서 활성을 유도한다. CD40L는 세가지 결합 파트너를 가진다: CD40, α5β1 인테그린 및 αIIbβ3. CD40L 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_000074 및 MP_000065(인간) 및 NM_011616 및 NP_035746(마우스)로서 입수 가능하다.
글루코코르티코이드-유도성 종양 괴사 인자 수용체 패밀리-관련 단백질(GITR)은 T 세포 자극을 통하여 효과적인 종양 면역성을 야기할 수 있다. 항-GITR 단클론 항체(mAb)의 투여는 강력한 종양-특이적 면역성을 유발할 수 있으며, 확립된 종양을 명시적인 자가면역 질환의 초래 없이 퇴치하였다.[Ko et al., J. Exp. Med 7: 885(2005)]을 참조하라. 미국 특허 제6,503,184 B1호에는 항-GITR 항체가 개시되어 있다.
GITR 리간드(GITRL)의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AY358868(인간); 및 AY359852(마우스)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
GITR 리간드(GITRL)의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 AAQ89227(인간); 및 AAQ55265(마우스)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
p30 또는 LIGHT로도 지칭되는 헤르페스 바이러스 진입 매개자(Herpes virus entry mediator, HVEM) 결합 리간드(HSVgD)는 T-세포의 공동 자극(co-stimulation)에 연루된 TNF 패밀리 구성원이다. LIGHT는 2개의 수용체, 헤르페스 바이러스 진입 매개자(HVEM) 및 림포톡신(lymphotoxin)-β 수용체(LT-βR)를 갖는다. HVEM에 대한 리간드이기 때문에 HSVgD는 T 세포에 대한 공동 자극 인자로서 작용함으로써 T 세포를 활성화시키고 이는 T 세포의 증식 및 사이토카인 분비로 이어진다. LIGHT의 폴리뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대해서는 미국 특허 제7,118,742호를 참조하라. 미국 특허 제5,654,174호에는 카르복시 말단 잔기가 결실된 gD 단백질 변이체가 개시되어 있다.
CD70은 CD27에 결합하는 사이토카인이다. 이것은 T-세포 활성화에서 그 역할을 한다. 이것은 공동 자극된 T-세포의 증식을 유도하며 세포용해성 T-세포의 생성을 증강시킨다. CD70의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_001252(인간); NM_011617(마우스); 및 NM_001106878(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
CD70의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_001243(인간); NP_035747(마우스); 및 NP_001100348(랫트)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
ICOS-L은 T-세포-특이적 세포 표면 수용체 ICOS에 대한 리간드이며 T-세포 증식 및 사이토카인 분비에 있어서 공동 자극 시그널(signal)로서 작용한다. ICOS-L은 또한 플라즈마 세포(형질 세포)로의 B 세포의 증식 및 분화를 유도한다. ICOS-L은 기억 T-세포 기능을 공동 자극함으로써 2차 면역 반응을 조정하는데 있어서뿐만 아니라 염증 상태에 대한 국소적 조직 반응을 매개하는데 있어서도 중요한 역할을 할 수 있다. ICOS-L의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_015259(인간); 및 NM_015790(마우스)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
ICOS-L의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_056074(인간); 및 NP_056605(마우스)로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
PD-L1(CD274로도 공지됨) 단백질은 활성화된 단구, T 및 B 세포에서 발현된다. PD-L1은 IFN-감마로 처리시 단구에서 상향조절되며 IFN-감마를 다른 활성자와 함께 이용하여 처리시 수지상 세포 및 각질 세포에서 상향조절된다. PD-L1 단백질의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NM_014143(인간); 및 NM_021893(마우스)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
PD-L1 단백질의 아미노산 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁번호 NP_054862(인간); 및 NP_068693(마우스)으로서 입수가능하며, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다.
공동 자극 분자(음성)
세포독성 T 림프구-관련 4(cytotoxic T lymphocyte-associated 4, CTLA4)는 면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원이며, 활성화된 T 세포에서 발현되는 공동 자극 분자이다. 미국 특허 제7,034,121호 및 미국 특허 제6,984,720호에는 CTLA4에 대한 항체의 제조 및 사용 방법이 개시되어 있다. 또한 미국 특허 제6,984,720호에는 항-CTLA4 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이 개시되어 있다.
PD-1 분자는 면역글로불린 유전자 수퍼패밀리의 구성원인데, 이는 PD-1 리간드(PD-L1)에 결합한다. PD-L1에 의한 T-세포 상의 PD-1 수용체의 결합은 공동 자극 시그널을 상기 세포에 전달하며, 이는 상기 세포가 세포 주기를 통하여 진행하는 것을 방지하고, T 세포 증식을 증가시킨다. 항-PD-L1 항체를 이용하여 PD-L1과 T 세포 상의 수용체 사이의 상호작용을 억제하면 면역 세포 에너지로서 칭해지는 면역 반응이 하향 조절된다. 미국 특허 제7,029,674호에는 항-PD-L1 항체의 제조 방법 및 서열이 개시되어 있다.
주로 PD-L2는 PD-1(또는 인간 상동체 PDCD1)에 대한 리간드로 공지되어 있다. 그러나, PD-12는 PDCD1-독립적 방식으로 T 림프구 증식 및 INF-감마 생성에 있어서 필수적인 공동 자극 시그널에 연루된 것으로 보고되었었다. PDCD1과의 상호작용은 사이토카인 생성, 및 세포 주기 진행의 차단에 의해 T-세포 증식을 억제한다. [Yamazaki et al., J. of Immunol. 169: 5538(2002)] 및 [Ansari et al., J. Exp. Med. 198: 63(2003)]에는 항-PD-L2 단클론 항체의 제조가 기술되어 있다.
역면역 억제제(Counter Immune Suppressant)(허용성 억제제(Tolerance Inhibitor))
형질전환 성장 인자-베타(TGF-β)는 2가지 막관통 세린/트레오닌 키나아제 수용체, 즉 제I형 및 제II형 중 하나와 상호작용함으로써 세포 증식 및 분화를 조절하는 다기능성 단백질이다. [Chen et al., Science 28: 1335(1993)]을 참조하라. 제II형 TGF 수용체(TGFR2)는 제I형 수용체를 인산화시켜서 활성화시키는데, 상기 제I형 수용체는 자가인산화 되고, 그 후 SMAD 전사 조절자에 결합하여 상기 조절자를 활성화시킨다. [Lynch MA et al., Cancer Res. 58: 4227(1998)]에는 형질전환 성장 인자 β 제II형 수용체 유전자(TGFBR2)에서의 돌연변이가 기술되어 있는데, 상기 돌연변이는 인간 난소암종과 관련되어 있다. [Brand et al., J. Biol. Chem. 268:11500-11503(1993)]에는 예측된 세린/트레오닌 키나아제 세포질 도메인(공개 데이터베이스로부터 수탁 번호 M85079로서 입수가능한 TGFβR2 cDNA H2-3FF의 뉴클레오티드 1172-2036, 그리고 수탁 번호 AAA61164로서 입수가능한 아미노산 서열)의 결실이 모든 3가지 TGF-β(1,2 및 3) 의존성 유전자 발현을 손상시킨다는 것이 기술되어 있다. TGF-β는 대부분의 인간 종양에서 생성되며 종양 항원-특이적 세포 면역성을 억제한다. [Foster et al., J. Immunother. 31:500(2008)]에는 세포독성 T 림프구에서의 우성 음성 TGFβR2의 발현이 TGF-β의 억제 효과에 대한 허용성에 이르게 될 수 있음이 기술되어 있다.
TGFβ는 형질전환의 유도에서 TGFα와 함께 상승 작용식으로 작용한다. 이것은 또한 음성 자가분비 성장 인자로서 작용한다. TGFβ 활성화 및 시그널링의 이상조절(dysregulation)은 아폽토시스(apoptosis)로 이어질 수 있다. [Ziyadeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 8015(2000)]에는 현성 신증(overt nephropathy)이 발병된 제II형 당뇨병의 모델인 db/db 마우스에서 항-TGFβ 항체의 투여가 신부전증 및 사구체 경화를 방지할 수 있음이 기술되어 있다. TGFβ 단클론 항체의 제조 및 사용 방법이 미국 특허 제6,419,928호에 기술되어 있다. [Barcellos-Hoff et al., Am J. Pathol. 147:5(1995)]에는 TGFβ 항체의 생성 방법이 또한 기술되어 있다. TGFβ 융합 단백질 작제물의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열이 미국 특허 제6,756,215호에 기술되어 있다.
IL-10은 활성화된 Th2 세포, B 세포, 각질 세포, 단구, 및 대식세포에 의해 생성되는 사이토카인이다. IL-10은 활성화된 대식세포에 의해 그리고 헬퍼 T-세포에 의해 생성되는 IFN-감마, IL-2, IL-3, TNF 및 GM-CSF를 포함하는 다수의 사이토카인의 합성을 억제한다. IL-10은 활성화된 인간 B 세포의 성장 및 분화의 촉진, Th1 반응을 억제하여 이식 거부 및 T-세포 매개 자가면역 질환을 방지하는데 유용하다. [O'Farrell et al., EMBO J. 17:1006(1998)]; [Kanbayashi et al., Cell Immunol. 171:153(1996)]; [Fukushima et al., Br. J. Ophthalmol. 90:1535(2006)]; 및 [van Lent et al., Ann. Rheum. Dis. 66:334(2007)]에는 항-IL-10 항체의 제조가 기술되어 있다. 미국 특허 제7,326,567호에는 IL-10 항체의 폴리뉴클레오티드 서열이 개시되어 있다. 미국 특허 제5,837,232호에는 B-세포 매개 자가면역 장애를 항-IL-10 항체로 치료하는 방법이 개시되어 있다.
사이토카인 시그널링 억제자(suppressor of cytokine signaling, SOCS) 패밀리의 단백질은 사이토카인 신호 전달을 조절하는 고전적인 음성 피드백(feedback) 시스템의 일부분을 형성한다. [Alexander et al., Cell 98: 597(1999)]에는 사이토카인 시그널링 억제자 1(suppressor of cytokine signaling 1, SOCS1)이 인터페론-감마 시그널링의 결정적인 억제자이며 이 사이토카인의 잠재적으로 치명적인 신생아에 대한 작용을 방지한다는 것이 기술되어 있다. [Hilton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:114(1999)]에는 JAK/STAT3 경로를 통하여 시그널링되는 사이토카인의 음성 조절에 SOCS1이 연루되어 있음이 논의되어 있다. [Ohya et al J. Biol. Chem. 272: 27178(1997)]에는 SOCS단백질이 인터루킨 6(IL-6) 및 백혈병 억제 인자(LIF)에 의한 시그널링의 주요 조절자인 것으로 보인다는 것이 기술되어 있다. 미국 특허 제6,534,277호에는 항-SOCS1 항체의 제조 및 사용 방법이 개시되어 있으며, 여기서, SOCS1 항체를 코딩하는 핵산 서열은 세포 내로 도입되어 상기 항체가 상기 세포 또는 그의 자손에 의해 발현되게 하며, 그 후 재조합 세포는 치료 효과를 위하여 생체 내에 투여된다. 미국 특허 제6,323,317호 및 미국 특허 제7,049,418호에도 항-SOCS1 항체가 개시되어 있다.
TGF-α는 EGF 수용체에 결합하여 TGF-β와 함께 상승적으로 작용하여 연성 한천에서 고정-독립적 세포 증식을 촉진할 수 있는 유사분열 촉진(mitogenic) 폴리펩티드이다. [Ellis et al., N. Engl. J. Med. 317:158(1987)]에는 TGF-α가 흑색종의 소정의 부종양성 발현에서 그 역할을 한다는 것이 기술되어 있다. 미국 특허 제4,742,003호 및 [Xian et al., The J. of Histochem. & Cytochem. 47:949(1999)]에는 항-TGF-α 항체의 제조 방법이 기술되어 있다.
종양 괴사 인자 수용체(TNFR1) 및 Fas 둘 모두는 사멸 도메인을 갖는 세포질 Fas-관련 단백질(cytoplasmic Fas-associated protein with death domain(FADD))을 포함하는데, 상기 FADD는 세포 예정사(아폽토시스) 및 수용체 올리고머화를 위한 Fas 및 TNF-유도된 시그널링에 필수적이다. Fas 수용체의 세포질 영역 또는 도메인에 결합하는 능력을 가지며 FAS 매개 아폽토시스를 억제하는 FADD로 표기되는 포유동물 단백질이 동정되었다. FADD의 폴리뉴클레오티드 서열은 공개 데이터베이스로부터 수탁 번호 U24231로서 입수가능하며, 그 아미노산 서열은 수탁 번호 AAA86517로서 입수가능하고, 상기 서열들은 본 명세서에 참고로 포함된다. FADD 단편 또는 그를 코딩하는 핵산 - 이는 기능적으로 온전한 천연 FADD의 우성 음성 억제자(dominant negative inhibitor)임 - 이 미국 특허 제6,562,797 B1호에 기술되어 있다.
p53(단백질 53 또는 종양 단백질 53으로도 공지됨)은 종양 억제자 단백질로서 인간에서 TP53 유전자에 의해 인코딩된다. p53은 다세포 유기체에서 중요하며, 다세포 유기체에서 p53은 세포 주기를 조절하고 따라서 암을 방지하는 것과 관련된 종양 억제자로서 작용한다. p53에 대한 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열은 수탁번호NM_00546 및 NP_000537(인간) 및 NM_011640 및 NP_035770(마우스)로서 입수 가능하다.
서바이빈은 아폽토시스 패밀리의 억제제의 멤버이다. 서바이빈 단백질은 카스파제 활성화를 억제하도록 기능하며, 이에따라 아폽토시스 또는 세포 예정사의 음성 조절에 이르게 된다. 이는 서바이빈 유도 경로의 파괴에 의한 아폽토시스 증가 및 종양 성장 감소 야기에 의해 나타난다. 서바이빈 단백질은 대부분의 인간 종양 및 태아 조직에서 고도로 발현되지만, 최종적으로 분화된 세포에서는 완전히 부재한다. 그러므로 이런 사실은 암 세포는 표적되는 반면 정상 세포는 홀로 남겨지기 때문에 서바이빈을 암 치료법에 대한 이상적인 표적으로 만든다. 서바이빈 발현은 또한 세포 주기에 의해 고도로 조절되며 단지 G2-M 상(phase)에서 발현된다. 서바이빈이 유사분열 동안 튜불린과 상호작용함으로써 유사분열방추에 국소화되며 유사분열을 조절하는 역할에 기여할 수 있다는 것은 공지되어 있다. 서바이빈의 조절은 p53 단백질에 연결되는 것으로 보인다. p53에 대한 아미노산 및 폴리뉴클레오티드 서열은 수탁번호 NM_001012270 및 NP_001012270(인간) 및 NM_001012273 및 NP_001012273(마우스)로서 입수 가능하다.
흑색종-관련 항원-3(MAGE3) 아미노산 서열은 수탁번호 P43357-1(UniParc)로서 입수 가능하다.
전립선-특이적 항원(PSA)은 전립선 샘의 세포에 의해 생성된 단백질이다. PSA는 건강한 전립선을 가진 남성의 혈청에서는 적은 양으로 존재하지만, 종종 전립선 암 및 다른 전립선 암이 존재하는 곳에서 증가된다.
전립선 특이적 막 항원(PSMA)은 전립선 조직 및 일부의 다른 조직에서 발견되는 제2형 통합 막 당단백질이다. 이는 전립선 암에 대한 가능성 있는 치료 표적이다.
서열 목록의 설명
서열 번호 1은 mIL-12 및 m-IL21을 코딩하는 작제물의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 2는 hIL-12 및 hIL-21을 코딩하는 작제물의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 3은 mIL-21 및 mIL-15를 코딩하는 작제물의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 4는 mIL-12를 코딩하는 작제물의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 5는 hIL-21 및 hIL-15를 코딩하는 작제물의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 6은 hIL-21을 코딩하는 작제물의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 7은 mIL-21을 코딩하는 작제물의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 8은 hIL-21을 코딩하는 작제물의 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 9는 mIL-21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 10은 mIL-21의 아미노산 서열이다.
서열 번호 11은 mIL-15를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 12는 mIL-15의 아미노산 서열이다.
서열 번호 13은 mIL-12의 mp40을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 14는 mIL-12의 mp40의 아미노산 서열이다.
서열 번호 15는 mIL-12의 mp35를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 16은 mIL-12의 mp35의 아미노산 서열이다.
서열 번호 17은 hIL-21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 18은 hIL-21의 아미노산 서열이다.
서열 번호 19는 hIL-15를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 20은 hIL-15의 아미노산 서열이다.
서열 번호 21은 hIL-12의 p40을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 22는 hIL-12의 p40의 아미노산 서열이다.
서열 번호 23은 hIL-12의 p35를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 24는 hIL-12의 p35의 아미노산 서열이다.
서열 번호 25는 초파리(Drosophila)에서 발견되는 엑디손 반응 요소(ecdysone response element)의 핵산 서열이다.
서열 번호 26은 드로소필라 멜라노가스터 ( Drosophila melanogaster )에서 발견되는 엑디손 반응 요소의 핵산 서열이다.
서열 번호 27은 드로소필라 멜라노가스터에서 발견되는 엑디손 반응 요소의 핵산 서열이다.
서열 번호 28은 호밍 엔도뉴클레아제(homing endonuclease, HE) 효소의 제한효소 부위(I-SceI)이다.
서열 번호 29는 인간 IL-12 코딩 서열을 포함하는 아데노바이러스 벡터, Ad-RTS-hIL-12(SP1-RheoIL-12)의 DNA 서열이다.
서열 번호 30은 인간 TNF 야생형 5'UTR의 핵산 서열이다.
서열 번호 31은 5U2 5'UTR의 핵산 서열이다.
서열 번호 32는 IL-2 시그널 펩티드를 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열이다.
서열 번호 33은 인간 TNF-알파 시그널 펩티드를 인코딩하는 야생형 핵산 서열이다.
서열 번호 34는 인간 TNF-알파 시그널 펩티드를 인코딩하는 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 35은 인간 TNF-알파를 인코딩하는 야생형 핵산 서열이다.
서열 번호 36은 인간 TNF-알파를 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열이다.
서열 번호 37은 인간 TNF-알파의 아미노산 서열이다.
서열 번호 38은 SV40 폴리아데닐화 시그널을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 3' 조절 영역의 핵산 서열이다.
서열 번호 39은 인간 성장 호르몬 폴리아데닐화 시그널을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 3' 조절 영역의 핵산 서열이다.
서열 번호 40은 야생형 인간TNF-알파 3'UTR을 포함하는 핵산 서열이다.
서열 번호 41은 인간 TNF-알파 3' UTR AtoC 돌연변이체의 핵산 서열이다.
서열 번호 42는 인간 GAST 3'UTR의 핵산 서열이다.
서열 번호 43은 합성 3' 조절 영역의 핵산 서열이다.
*서열 번호 44는 인간 GAPDH 5'UTR의 핵산 서열이다.
서열 번호 45는 인슐린 SP의 야생형 핵산 서열이다.
서열 번호 46은 인간 FGF-19 시그널 펩티드를 인코딩하는 야생형 핵산 서열이다.
서열 번호 47은 벡터 43318의 핵산 서열이다.
*서열 번호 48은 벡터 43319의 핵산 서열이다.
서열 번호 49는 벡터 43320의 핵산 서열이다.
서열 번호 50은 벡터 43321의 핵산 서열이다.
서열 번호 51은 벡터 43322의 핵산 서열이다.
서열 번호 52는 벡터 43323의 핵산 서열이다.
서열 번호 53은 벡터 43324의 핵산 서열이다.
서열 번호 54는 벡터 43325의 핵산 서열이다.
서열 번호 55는 벡터 43326의 핵산 서열이다.
서열 번호 56은 벡터 43327의 핵산 서열이다.
서열 번호 57은 벡터 43328의 핵산 서열이다.
서열 번호 58은 벡터 43329의 핵산 서열이다.
서열 번호 59는 벡터 43533의 핵산 서열이다.
서열 번호 60은 벡터 43534의 핵산 서열이다.
서열 번호 61은 벡터 VVN2823(Ad-RTS-hIL-12)의 핵산 서열이다.
서열 번호 62는 벡터 VVN2539(Ad-RTS-mIL-12)의 핵산 서열이다.
정의
달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술용어, 표기 및 기타 과학적 용어 또는 전문 술어는 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부의 경우, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어가 명료함을 위하여 및/또는 간편한 참고 및 이해를 위하여 본 명세서에서 정의되며, 본 명세서에서의 그러한 정의의 포함은 당업계에서 일반적으로 이해되는 것에 비하여 반드시 상당한 차이를 의미하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 일반적으로 이해되는 분자 생물학의 용어의 정의 및/또는 방법 및/또는 프로토콜을 [Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical 및 Molecular, 5th edition, Springer-Ver lag: New York, 1991]; [Lewin, Genes V, Oxford University Press: New York, 1994]; [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(3d ed. 2001)] 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(1994)]에서 찾아볼 수 있다. 필요에 따라, 구매가능한 키트 및/또는 시약의 사용을 포함하는 절차는 달리 나타내지 않으면 제조업자의 지도 및/또는 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라 일반적으로 실시된다.
본 발명의 목적상 "단리된(isolated)"이라는 용어는 생물학적 물질(세포, 핵산 또는 단백질)이 그의 원래 환경(그가 자연적으로 존재하는 환경)으로부터 제거된 것임을 나타낸다. 예를 들어, 식물 또는 동물 중에 자연 상태로 존재하는 폴리뉴클레오티드는 단리된 것이 아니지만, 내부에 그가 자연적으로 존재하는 인접한 핵산류로부터 분리된 동일 폴리뉴클레오티드는 "단리된" 것으로 간주된다.
생물 물질에 적용될 때 "정제된"이라는 용어는 당해 물질이 다른 화합물의 존재가 제외된, 절대 순도를 나타내는 형태로 존재할 것을 요구하는 것은 아니다. 이것은 오히려 상대적인 정의이다.
"핵산", "핵산 분자", "올리고뉴클레오티드", "뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 서로 바꾸어서 사용될 수 있으며, 단일 가닥 형태 또는 이중 가닥 나선 중 어느 하나의 형태의, 리보뉴클레오시드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오시드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자")의 포스페이트 에스테르 중합체 형태, 또는 그의 임의의 포스포에스테르 유사체, 예를 들어 포스포로티오에이트 및 티오에스테르를 나타낸다. 이중 가닥 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선이 가능하다. 핵산 분자, 특히 DNA 또는 RNA 분자라는 용어는 이 분자의 1차 및 2차 구조만을 나타내며, 이것을 임의의 특정 3차 형태에 한정하는 것은 아니다. 따라서, 이 용어는 특히 선형 또는 원형 DNA 분자(예를 들어, 제한효소 단편), 플라스미드, 수퍼코일형(supercoiled) DNA 및 염색체에서 발견되는 이중 가닥 DNA를 포함한다. 특정 이중 가닥 DNA 분자의 구조의 논의에 있어서, 서열은 DNA의 비-전사 가닥(즉, mRNA에 상동성인 서열을 갖는 가닥)을 따라서 5'으로부터 3' 방향으로의 서열만을 제공하는 통상적인 협정에 따라 본 명세서에서 기술될 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 겪은 DNA 분자이다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 합성 DNA, 및 반합성 DNA를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
폴리뉴클레오티드 서열에 적용될 때 "단편"이라는 용어는 기준 핵산(reference nucleic acid)에 비하여 길이가 감소된 뉴클레오티드 서열을 말하며, 이는 공통 부분에 걸쳐 기준 핵산과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 그러한 핵산 단편은 적절할 경우 이것이 구성 요소인 더욱 큰 폴리뉴클레오티드 내에 포함될 수도 있다. 그러한 단편은 길이가 본 발명에 따른 핵산의 적어도 6개, 8개, 9개, 10개, 12개, 15개, 18개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개, 39개, 40개, 42개, 45개, 48개, 50개, 51개, 54개, 57개, 60개, 63개, 66개, 70개, 75개, 78개, 80개, 90개, 100개, 105개, 120개, 135개, 150개, 200개, 300개, 500개, 720개, 900개, 1000개, 1500개, 2000개, 3000개, 4000개, 5000개 또는 그 이상의 범위인 연속 뉴클레오티로부터의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, 대안적으로는 그로 구성되어 있다.
본 명세서에서 사용될 때, "단리된 핵산 단편"은 단일 가닥 또는 이중 가닥의, 선택적으로 합성, 비-천연 또는 변경 뉴클레오티드 염기를 포함하는 RNA 또는 DNA의 중합체를 나타낸다. DNA의 중합체의 형태의 단리된 핵산 단편은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 절편으로 이루어질 수 있다.
"유전자"는 전사에 의해서만 생성되는(예를 들어, 생활성(bioactive) RNA 종), 또는 전사 및 번역에 의해 생성되는(예를 들어, 폴리펩티드) 기능성 분자를 비롯한 기능성 분자를 코딩하는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. "유전자"라는 용어는 cDNA 및 게놈 DNA 핵산을 포함한다. 또한 "유전자"는 코딩 서열 이전의 조절 서열(5' 비-코딩 서열) 및 그 이후의 조절 서열(3' 비-코딩 서열)을 포함하여 특정 RNA, 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하는 핵산 단편을 나타낸다. "천연 유전자"는 자연에서 그 자신의 조절 서열과 함께 발견되는 유전자를 나타낸다. "키메라 유전자"는 자연에서 함께 발견되지 않는 조절 및/또는 코딩 서열을 포함하는, 천연 유전자가 아닌 임의의 유전자를 나타낸다. 따라서, 키메라 유전자는 상이한 공급원들로부터 유래되는 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되지만 자연에서 발견되는 것과는 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. 키메라 유전자는 상이한 공급원들로부터 유래되는 코딩 서열 및/또는 상이한 공급원들로부터 유래되는 조절 서열을 포함할 수 있다. "내인성 유전자"는 유기체의 게놈 내의 그의 자연적인 위치의 천연 유전자를 나타낸다. "외래(foreign)" 유전자 또는 "이종(heterologous)" 유전자는 숙주 유기체에서 보통은 발견되지 않지만 유전자 전달에 의해 숙주 유기체 내로 도입된 유전자를 나타낸다. 외래 유전자는 비-천연 유기체 내로 삽입된 천연 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. "트랜스유전자(transgene)"은 형질전환 절차에 의해 게놈 내로 도입된 유전자이다. 예를 들어, 인터루킨-12(IL-12) 유전자는 IL-12 단백질을 코딩한다. IL-12는 완전한 기능성의 IL-12p70을 만들도록 다이설파이드 결합을 통하여 연결된 35-kD 서브유닛(subunit)(p35) 및 40-kD 서브유닛(p40)의 헤테로이량체(heterodimer)이다. IL-12 유전자는 p35 서브유닛 및 p40 서브유닛 둘 모두를 코딩한다.
"이종 DNA"는 세포 내에 또는 세포의 염색체 부위 내에 자연적으로는 위치하지 않는 DNA를 나타낸다. 이종 DNA는 세포에 대하여 외래성인 유전자를 포함할 수 있다.
"게놈"이라는 용어는 염색체, 및 미토콘드리아, 엽록체 및 바이러스 DNA 또는 RNA를 포함한다.
핵산 분자는 적절한 온도 조건 및 용액 이온 강도 조건 하에서 단일 가닥 형태의 핵산 분자가 다른 핵산 분자에 어닐링될 수 있을 때 cDNA, 게놈 DNA, 또는 RNA와 같은 그 다른 핵산 분자에 "혼성화가능"하다. 혼성화 및 세척 조건은 잘 공지되어 있으며 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor(1989)], 특히 그 안의 제11장 및 표 11.1에 예시되어 있다. 온도 및 이온 강도 조건은 혼성화의 "엄격도"를 결정한다.
엄격도 조건은 원연(distantly 관련) 유기체 유래의 상동 서열과 같은 중간 정도로 유사한 단편 내지 근연(closely 관련) 유기체 유래의 기능성 효소를 복제하는 유전자와 같은 고도로 유사한 단편에 대하여 스크리닝하도록 조정될 수 있다. 상동 핵산에 대한 예비 스크리닝에 있어서, 55°의 Tm에 상응하는 낮은 엄격도(stringency)의 혼성화 조건, 예를 들어 5X SSC, 0.1% SDS, 0.25% 밀크(milk), 및 포름아미드가 없거나 30% 포름아미드가 있음, 5X SSC, 0.5% SDS가 이용될 수 있다. 중간 정도의 엄격도의 혼성화 조건은 더욱 높은 Tm, 예를 들어 40% 포름아미드 - 5X 또는 6X SSC를 이용함 - 에 상응한다. 높은 엄격도의 혼성화 조건은 최고 Tm, 예를 들어 50% 포름아미드, 5X 또는 6X SSC에 상응한다.
혼성화는, 혼성화의 엄격도에 따라 염기들 사이의 미스매치(mismatch)가 가능하지만, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 함유할 것을 요구한다. "상보적"이라는 용어는 서로에게 혼성화될 수 있는 뉴클레오티드 염기들 사이의 관계를 기술하기 위하여 사용된다. 예를 들어, DNA와 관련하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에서 개시되거나 사용된 완전 서열에 상보적인 단리된 핵산뿐만 아니라 실질적으로 유사한 핵산 서열도 또한 포함한다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm에서의 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 이용함으로써, 그리고 상기에 나타낸 조건들을 이용함으로써 검출된다. 다른 실시 양태에서, 상기 Tm은 60℃, 63℃, 또는 65℃이다.
혼성화 후 세척이 엄격도 조건을 또한 결정한다. 한 세트의 조건에서는 실온에서 15분(min) 동안 6X SSC, 0.5% SDS로 시작하고 그 후 45℃에서 30분 동안 2X SSC, 0.5% SDS로 반복하고, 그 후 50℃에서 30분 동안 0.2X SSC, 0.5% SDS로 2회 반복하는 일련의 세척이 이용된다. 엄격한 조건의 바람직한 세트에서는 더욱 높은 온도가 이용되며, 여기서, 0.2X SSC, 0.5% SDS에서의 최종 2회의 30분 세척의 온도를 60℃로 증가시키는 것을 제외하고는 세척이 상기의 것과 동일하다. 고도로 엄격한 조건의 다른 바람직한 세트에서는 65℃에서의 0.1X SSC, 0.1% SDS에서의 2회의 최종 세척이 이용된다.
핵산의 혼성화에 적절한 엄격도는 당업계에 잘 알려진 변수들인 핵산의 길이 및 상보성 정도에 따라 달라진다. 두 뉴클레오티드 서열들 사이의 유사성 또는 상동성 정도가 커질수록 그러한 서열을 갖는 핵산의 하이브리드(hybrid)에 있어서의 Tm 값이 더욱 커진다. 핵산 혼성화의 상대적인 안정성(더욱 높은 Tm에 상응함)은 하기의 순서대로 감소한다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 길이가 100개의 뉴클레오티드 초과인 하이브리드에 있어서, Tm을 계산하는 방정식이 유도되었었다(Sambrook et al., supra, 9.50-0.51 참조). 더 짧은 핵산, 즉, 올리고뉴클레오티드를 이용한 혼성화에 있어서, 미스매치 위치는 더욱 중요하며, 올리고뉴클레오티드의 길이는 그의 특이성을 결정한다(Sambrook et al., supra, 11.7-11.8).
본 발명의 일 실시 양태에서, 500 mM 미만의 염 및 적어도 37℃에서의 혼성화 단계 및 적어도 63℃의 온도에서의 2X SSPE에서의 세척 단계를 포함하는 혼성화 조건을 이용함으로써 폴리뉴클레오티드를 검출한다. 또 다른 실시 양태에서, 혼성화 조건은 혼성화 단계에 있어서 200 mM 미만의 염 및 적어도 37℃를 포함한다. 추가의 실시 양태에서, 혼성화 조건은 혼성화 단계 및 세척 단계 둘 모두에 있어서 2X SSPE 및 63 ℃를 포함한다.
다른 실시 양태에 있어서, 혼성화 가능한 핵산의 길이는 적어도 약 10개의 뉴클레오티드이다. 바람직하게는 혼성화 가능한 핵산의 최소 길이는 적어도 약 15개의 뉴클레오티드; 예를 들어 적어도 약 20개의 뉴클레오티드; 예를 들어 적어도 30개의 뉴클레오티드이다. 더욱이, 당업자라면 온도 및 세척 용액 염 농도가 프로브의 길이와 같은 인자에 따라 필요에 따라 조정될 수 있음을 인식할 것이다.
"프로브"라는 용어는 상보적 단일 가닥 표적 핵산과 염기 쌍을 형성하여 이중 가닥 분자를 형성할 수 있는 단일 가닥 핵산 분자를 나타낸다.
본 명세서에서 사용될 때, "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 게놈 DNA 분자, cDNA 분자, 플라스미드 DNA 또는 mRNA 분자에 혼성화 가능한 짧은 핵산을 나타낸다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 32P-뉴클레오티드, 또는 바이오틴과 같은 표지체가 공유 결합에 의해 콘쥬게이션된 뉴클레오티드로 표지될 수 있다. 표지된 올리고뉴클레오티드는 프로브로서 사용되어 핵산의 존재를 탐지할 수 있다. 올리고뉴클레오티드들(이들 중 하나 또는 이들 둘 모두는 표지될 수 있음)은 전장 핵산 또는 핵산의 단편을 클로닝하기 위하여, DNA 서열 결정을 위하여, 또는 핵산의 존재의 탐지를 위하여 PCR 프라이머로서 사용될 수 있다. 또한 올리고뉴클레오티드는 DNA 분자와 삼중 나선을 형성하도록 사용될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 핵산 합성기에서 합성에 의해 제조된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 티오에스테르 결합 등과 같은, 자연 비-발생 포스포에스테르 유사 결합에 의해 제조될 수 있다.
"프라이머"는 적합한 조건 하에서 DNA 합성을 위한 개시점으로서의 역할을 할 수 있는 이중 가닥 핵산 영역을 생성하도록 표적 핵산 서열에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 그러한 프라이머는 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction)에서 또는 DNA 서열 결정에 사용될 수 있다.
"폴리머라아제 연쇄 반응"은 PCR로 약기되며 특정 핵산 서열을 효소에 의해 증폭시키는 시험관 내 방법을 나타낸다. PCR은 반복되는 일련의 온도 사이클을 포함하며, 이때 각각의 사이클은 하기의 세 단계를 포함한다: 표적 분자의 가닥들을 분리하기 위한 주형 핵산의 변성, 단일 가닥 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머의 주형 핵산에의 어닐링, 및 어닐링된 프라이머(들)의 DNA 폴리머라아제에 의한 연장, PCR은 표적 분자의 존재를 탐지하는 수단, 및 정량적 또는 반정량적 조건 하에서 핵산의 출발 풀 내의 상기 표적 분자의 상대적인 양을 결정하는 수단을 제공한다.
"역전사효소 연쇄 반응(Reverse transcription-polymerase chain reaction)"은 RT-PCR로 약기되며, RNA 분자 또는 분자들로부터 표적 cDNA 분자 또는 분자들을 효소에 의해 생성하고 이어서 표적 cDNA 분자 또는 분자들 내의 특정 핵산 서열 또는 서열들을 효소에 의해 증폭시키는 - 이는 상기에 기술된 바와 같음 - 시험관 내 방법을 나타낸다. 또한 RT-PCR은 표적 분자의 존재를 탐지하는 수단, 및 정량적 또는 반정량적 조건 하에서 핵산의 출발 풀 내의 상기 표적 분자의 상대적인 양을 결정하는 수단을 제공한다.
DNA "코딩 서열" 또는 "코딩 영역"은 폴리펩티드를 코딩하고 적합한 조절 서열의 제어 하에 두어질 때 생체 외에서, 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포에서 폴리펩티드로 전사 및 번역될 수 있는 이중 가닥 DNA 서열을 나타낸다. "적합한 조절 서열"은 코딩 서열의 상류(5' 비-코딩 서열), 코딩 서열 내, 또는 코딩 서열의 하류(3' 비-코딩 서열)에 위치하며 관련된 코딩 서열의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 주는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더(leader) 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 프로세싱 부위, 이펙터(이펙터) 결합 부위 및 스템-루프(stem-loop) 구조를 포함할 수 있다. 코딩 서열의 경계부는 5'(아미노) 말단의 시작 코돈 및 3'(카르복실) 말단의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 원핵생물 서열, mRNA 유래의 cDNA, 게놈 DNA 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 코딩 서열이 진핵 세포에서의 발현용으로 의도될 경우, 폴리아데닐화 시그널 및 전사 종결 서열이 코딩 서열의 3'에 일반적으로 위치할 것이다.
"오픈 리딩 프레임(Open reading frame)"은 ORF로 약기되며, ATG 또는 AUG와 같은 번역 시작 시그널 또는 개시 코돈 및 종결 코돈을 포함하는 그리고 폴리펩티드 서열로 잠재적으로 번역될 수 있는 소정 길이의 핵산 서열, DNA, cDNA 또는 RNA를 나타낸다.
본 명세서에서 "헤드-투-헤드(head-to-head)"라는 용어는 두 폴리뉴클레오티드 서열의 배향을 서로에 관련시켜 기술하기 위하여 사용된다. 두 폴리뉴클레오티드는 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 가닥의 5' 말단이 다른 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 가닥의 5' 말단에 인접하고 그로써 각각의 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 다른 폴리뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 멀어지도록 진행될 때 헤드-헤드 배향으로 위치하는 것이다. "헤드-투-헤드"라는 용어는(5')-투-(5')((5')-to-(5'))으로 약기될 수 있으며, 기호(← →) 또는(3'←5'5'→3')로 또한 나타내어질 수 있다.
본 명세서에서 "테일-투-테일(tail-to-tail)"이라는 용어는 두 폴리뉴클레오티드 서열의 배향을 서로에 관련시켜 기술하기 위하여 사용된다. 두 폴리뉴클레오티드는 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 가닥의 3' 말단이 다른 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 가닥의 3' 말단에 인접하고 그로써 각각의 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 다른 폴리뉴클레오티드를 향하여 진행될 때 테일-테일 배향으로 위치하는 것이다. "테일-투-테일"이라는 용어는(3')-투-(3')((3')- to-(3'))으로 약기될 수 있으며, 기호(→ ←) 또는(5'→3'3'←5')로 또한 나타내어질 수 있다.
본 명세서에서 "헤드-투-테일(head-to-tail)"이라는 용어는 두 폴리뉴클레오티드 서열의 배향을 서로에 관련시켜 기술하기 위하여 사용된다. 두 폴리뉴클레오티드는 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 가닥의 5' 말단이 다른 하나의 폴리뉴클레오티드의 코딩 가닥의 3' 말단에 인접하고 그로써 각각의 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 다른 폴리뉴클레오티드의 전사 방향과 동일한 방향으로 진행될 때 헤드-테일 배향으로 위치하는 것이다. "헤드-투-테일"이라는 용어는(5')-투-(3')((5')- to-(3'))으로 약기될 수 있으며, 기호(→ →) 또는(5'→3'5'→3')로 또한 나타내어질 수 있다.
"하류"라는 용어는 기준 뉴클레오티드 서열에 대하여 3'에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 특히, 하류 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 전사 시작점 이후의 서열을 나타낸다. 예를 들어, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사 시작 부위의 하류에 위치한다.
"상류"라는 용어는 기준 뉴클레오티드 서열에 대하여 5'에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 특히, 상류 뉴클레오티드 서열은 일반적으로 코딩 서열 또는 전사 시작점의 5' 측에 위치하는 서열에 관련된다. 예를 들어, 대부분의 프로모터는 전사 시작 부위의 상류에 위치한다.
"제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소"라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 이중 가닥 DNA 내의 특정 뉴클레오티드 서열 내에 결합하여 절단하는 효소를 나타낸다.
"상동 재조합"은 다른 DNA 분자 내로의 외래 DNA 서열의 삽입, 예를 들어 염색체 내로의 벡터의 삽입을 나타낸다. 바람직하게는, 벡터는 상동 재조합을 위한 특정 염색체 부위를 표적으로 한다. 특정 상동 재조합에 있어서, 벡터는 염색체의 서열에 대하여 상동성인 충분히 긴 영역을 함유하여서 이 벡터의 염색체 내로의 혼입 및 상보적 결합을 허용한다. 더욱 긴 상동성 영역, 및 더욱 큰 서열 유사성 정도는 상동 재조합의 효율을 증가시킬 수 있다.
당업계에 공지된 몇몇 방법을 이용하여 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 증식시킬 수 있다. 일단 적합한 숙주 시스템 및 성장 조건이 확립되면, 재조합 발현 벡터가 다량으로 증식 및 제조될 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 사용될 수 있는 발현 벡터는 몇 가지 예를 들자면 하기 벡터 또는 그 유도체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다: 몇 가지 예를 들자면, 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 또는 아데노바이러스(아데노바이러스)와 같은 인간 또는 동물 바이러스; 바큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스; 효모 벡터; 박테리오파지 벡터(예를 들어, 람다), 및 플라스미드 및 코스미드 DNA 벡터.
"벡터"는 숙주 세포 내로의 핵산의 전달 및/또는 핵산의 클로닝을 위한 임의의 비히클(vehicle)을 나타낸다. 벡터는 또 다른 DNA 절편이 부착되어서 그 부착된 절편의 복제가 야기되도록 하는 레플리콘(replicon)일 수 있다. "레플리콘"은 생체 내에서의 자율적 DNA 복제 단위로서의 기능을 하는, 즉, 그 자신의 제어 하에 복제가 가능한 임의의 유전 요소(예를 들어, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 나타낸다. "벡터"라는 용어는 시험관 내에서, 생체 외에서, 또는 생체 내에서 세포 내로 핵산을 도입하기 위한 바이러스 비히클 및 비바이러스(nonviral) 비히클 둘 모두를 포함한다. 핵산의 조작, 반응 요소(response element) 및 프로모터의 유전자 내로의 혼입 등을 위하여 당업계에 공지된 다수의 벡터가 사용될 수 있다. 가능한 벡터는 예를 들어 박테리오파지, 예컨대 람다 유도체, 또는 플라스미드, 예컨대 pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체, 또는 블루스크립트(Bluescript) 벡터를 비롯한 플라스미드 또는 변경 바이러스를 포함한다. 본 발명에서 유용한 벡터의 또 다른 예로는 국제 특허 공개 WO 2007/038276호에 기술된 바와 같이 울트라벡터(Ultra벡터)™ 프로덕션 시스템(Production System)(미국 버지니아주 블랙스버그 소재의 인트렉손 코포레이션(Intrexon Corp.)이 있다. 예를 들어, 로모터 및 반응 요소에 상응하는 DNA 단편의 적합한 벡터 내로의 삽입은 적절한 DNA 단편을 상보적 코헤시브(cohesive) 말단을 갖는 선택된 벡터 내에 라이게이션시킴으로써 성취될 수 있다. 대안적으로, DNA 분자의 말단은 효소에 의해 변경될 수 있거나 임의의 부위가 뉴클레오티드 서열(링커)의 DNA 말단 내로의 라이게이션에 의해 생성될 수 있다. 그러한 벡터는 선발가능한 마커가 세포 게놈 내로 혼입된 세포의 선발을 제공하는 선발가능한 마커 유전자를 포함하도록 조작될 수 있다. 그러한 마커는 인코딩된 단백질을 포함 및 발현하는 숙주 세포를 마커에 의해 동정 및/또는 선발하는 것을 허용한다.
바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터가 살아있는 동물 대상뿐만 아니라 세포에서도 매우 다양한 유전자 전달 응용에서 사용되어 왔다. 사용될 수 있는 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus) 벡터, 폭스(pox) 벡터, 바큘로바이러스 벡터, 백시니아 벡터, 헤르페스 심플렉스(herpes simplex) 벡터, 엡스타인 바(Epstein-Barr) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 제미니바이러스(geminivirus) 벡터, 및 칼리모바이러스(caulimovirus) 벡터를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 비-바이러스 벡터는 플라스미드, 리소좀, 전기적으로 하전된 지질(사이토펙틴), DNA-단백질 복합체, 및 생중합체를 포함한다. 핵산에 더하여, 벡터는 하나 이상의 조절 영역 및/또는 선발가능한 마커 - 선발, 측정, 및 핵산 전달 결과(어느 조직으로 전달되는지, 발현 지속 기간 등)에 유용함 - 를 또한 포함할 수 있다.
"플라스미드"라는 용어는 세포의 중추적 대사의 일부분이 아닌 그리고 일반적으로 원형 이중 가닥 DNA 분자의 형태인 유전자를 흔히 지니는 염색체외 요소(extra-chromosomal element)를 나타낸다. 그러한 요소는 임의의 공급원으로부터 유래되는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의, 선형, 원형 또는 수퍼코일형의 자가 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 여기서, 다수의 뉴클레오티드 서열들은 프로모터 단편 및 선발 유전자 생성물을 위한 DNA 서열을 적절한 3' 비번역 서열과 함께 세포 내로 도입할 수 있는 독특한 작제물 내로 연결되었거나 재조합되었다.
"클로닝 벡터"는 또 다른 핵산 절편이 부착되어 부착된 절편의 복제를 야기할 수도 있는 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 연속적으로 복제되는 그리고 복제 기점을 포함하는 소정 단위 길이의 핵산, 바람직하게는 DNA인 "레플리콘"을 나타낸다. 클로닝 벡터는 하나의 세포 유형에서의 복제 및 또 다른 것에서의 발현이 가능할 수 있다("셔틀 벡터"). 클로닝 벡터는 벡터를 포함하는 세포의 선발에 사용될 수 있는 하나 이상의 서열 및/또는 관심있는 서열의 삽입을 위한 하나 이상의 다중 클로닝 부위를 포함할 수 있다.
"발현 벡터"라는 용어는 숙주 내로의 형질전환 이후 삽입된 핵산 서열의 발현을 가능하게 하도록 디자인된 벡터, 플라스미드 또는 비히클을 나타낸다. 클로닝된 유전자, 즉 삽입된 핵산 서열은 일반적으로 프로모터, 최소 프로모터, 인핸서 등과 같은 조절 요소의 제어 하에 두어진다. 원하는 숙주 세포에서 핵산이 발현되게 하는데 유용한 개시 제어 영역 또는 프로모터는 많이 있으며 이는 당업자에게 친숙하다. 이들 유전자가 발현되게 할 수 있는 사실상 임의의 프로모터가 발현 벡터에서 사용될 수 있으며, 이는 하기를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다: 바이러스 프로모터, 박테리아 프로모터, 동물 프로모터, 포유동물 프로모터, 합성 프로모터, 구성적 프로모터(constitutive promoter), 조직 특이적 프로모터, 발병 또는 질환 관련 프로모터, 발생 특이적 프로모터(developmental specific promoter), 유도성 프로모터, 광 조절 프로모터; CYC1, HIS3, GAL1, GAL4, GAL1O, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, 알칼리 포스파타아제 프로모터(사카로마이세스(Saccharomyces)에서의 발현에 유용함); AOX1 프로모터(피키아(Pichia)에서의 발현에 유용함); β-락타마아제, lac, ara, tet, trp, lPL, lPR, T7, tac, 및 trc 프로모터(에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서의 발현에 유용함); 광 조절 프로모터, 종자 특이적 프로모터, 화분 특이적 프로모터, 난소 특이적 프로모터, 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터, CMV 35S 최소 프로모터, 카사바 베인 모자이크 바이러스(cassava vein mosaic virus, CsVMV) 프로모터, 엽록소 a/b 결합 단백질 프로모터, 리불로스 1,5-비스포스페이트 카르복실라아제 프로모터, 발아체(shoot)-특이적 프로모터, 뿌리 특이적 프로모터, 키티나아제 프로모터, 스트레스 유도성 프로모터, 벼 튠그로간상 바이러스(rice tungro bacilliform virus) 프로모터, 식물 수퍼-프로모터(plant super-promoter) 프로모터, 감자 류신 아미노펩티다아제 프로모터, 니트레이트 리덕타아제 프로모터, 만노핀 신타아제 프로모터, 노팔린 신타아제 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 제인 단백질 프로모터, 및 안토시아닌 프로모터(식물 세포에서의 발현에 유용함); 하기를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌, 당업계에 공지된 동물 및 포유동물 프로모터: SV40 초기(SV40e) 프로모터 영역, 라우스 사코마 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV))의 3'의 긴 말단 반복체(long terminal repeat, LTR)에 포함된 프로모터, 아데노바이러스(Ad)의 E1A 또는 주요 후기 프로모터(major late 프로모터, MLP) 유전자의 프로모터, 사이토케갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 티미딘 키나아제(TK) 프로모터, 바큘로바이러스 IE1 프로모터, 신장 인자 1 알파(EF1) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 유비퀴틴(Ubc) 프로모터, 알부민 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-L 프로모터의 조절 서열 및 전사 제어 영역, 전신발현 프로모터(ubiquitous promoter)(HPRT, 비멘틴, α-액틴, 튜뷸린 등), 중간 필라멘트(데스민, 신경필라멘트, 케라틴, GFAP 등)의 프로모터,(MDR, CFTR 또는 제VIII형 인자 등의) 치료 유전자의 프로모터, 발병 또는 질환 관련 프로모터, 및 조직 특이성을 나타내며, 트랜스제닉(transgenic) 동물에서 이용되어 왔던 프로모터, 예를 들어 췌장 선방 세포에서 활성을 갖는 엘라스타아제 I 유전자 제어 영역; 췌장 베타 세포에서 활성을 갖는 인슐린 유전자 제어 영역, 림프구양 세포에서 활성을 갖는 면역글로불린 유전자 제어 영역, 고환 세포, 유방 세포, 림프구양 세포 및 비만 세포에서 활성을 갖는 마우스 유선 종양 바이러스 제어 영역, 간에서 활성을 갖는 Apo AI 및 Apo AII 제어 영역, 간에서 활성을 갖는 알파-태아 단백질 유전자 제어 영역, 간에서 활성을 갖는 알파 1-항트립신 유전자 제어 영역, 골수양 세포에서 활성을 갖는 베타-글로빈 유전자 제어 영역, 뇌의 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte) 세포에서 활성을 갖는 마이엘린 염기성 단백질 유전자 젱 영역, 골격근에서 활성을 갖는 마이오신 경쇄-2 유전자 제어 영역, 및 시상하부에서 활성을 갖는 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(gonadotropic releasing hormone) 유전자 제어 영역, 피루베이트 키나아제 프로모터, 빌린 프로모터, 지방산 결합 장 단백질의 프로모터, 평활근 세포 α-액틴의 프로모터 등. 추가로, 이들 발현 서열은 인핸서 또는 조절 서열 등의 추가에 의해 변이될 수 있다.
벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 형질감염(transfection), 전기천공, 미세주입, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전, 리포펙션(lipofection)(리소좀 융합), 유전자 건(gene gun)의 사용, 또는 DNA 벡터 트랜스포터(transporter)에 의해 원하는 숙주 세포 내로 도입될 수 있다(예를 들어, [Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963(1992)]; [Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621(1988)]; 및 [Hartmut et al., Canadian Patent Application No. 2,012,311] 참조).
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 리포펙션에 의해 생체 내에 또한 도입될 수 있다. 지난 십 년간, 시험관 내에서의 핵산의 캡슐화 및 형질감염에 있어서의 리소좀의 사용이 증가해 왔다. 리소좀 매개 형질감염에서 직면하는 어려움 및 위험을 제한하도록 디자인된 합성 양이온성 지질을 사용하여 마커를 코딩하는 유전자의 생체 내 형질감염을 위한 리소좀을 제조할 수 있다(Feigner et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 84:7413(1987); Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027(1988); 및 Ulmer et al., Science 259:1745(1993)). 양이온성 지질의 사용은 음으로 하전된 핵산의 캡슐화를 촉진할 수 있으며, 또한 음으로 하전된 세포 막과의 융합을 촉진할 수 있다(Feigner et al., Science 337:387(1989)). 핵산의 전달에 있어서 특히 유용한 지질 화합물 및 조성물이 국제 특허 공개 WO95/18863호, 국제 특허 공개 WO96/17823호 및 미국 특허 제5,459,127호에 기술되어 있다. 생체 내에서 특정 기관 내로 외인성 유전자를 도입하기 위하여 리포펙션을 사용하는 것은 소정의 실제적인 이점을 갖는다. 특정 세포에 대한 리소좀의 분자적 표적화는 한 가지의 유익한 분야를 나타낸다. 특정 세포 유형이 형질감염되게 하는 것은 췌장, 간, 신장 및 뇌와 같이 세포 이질성을 갖는 조직에서 특히 바람직함이 명백하다. 지질은 표적화를 위하여 다른 분자에 화학적으로 커플링될 수 있다(Mackey et al. 1988). 표적화된 펩티드, 예를 들어 호르몬 또는 신경 전달 물질(neurotransmitter) 및 단백질, 예를 들어 항체, 또는 비-펩티드 분자가 리소좀에 화학적으로 커플링될 수 있다.
기타 분자, 예를 들어 양이온성 올리고펩티드(예를 들어, 국제 특허 공개 WO95/21931호), DNA 결합 단백질로부터 유래되는 펩티드(예를 들어, 국제 특허 공개 WO96/25508호), 또는 양이온성 중합체(예를 들어, 국제 특허 공개 WO95/21931호)가 생체 내에서의 핵산의 형질감염을 용이하게 하는데 또한 유용하다.
생체 내에서 벡터를 네이키드(naked) DNA 플라스미드로서 도입하는 것이 또한 가능하다(미국 특허 제5,693,622호, 미국 특허 제5,589,466호 및 미국 특허 제5,580,859호 참조). 수용체-매개 DNA 전달 접근법이 또한 이용될 수 있다(Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147(1992); 및 Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429(1987)).
"형질감염"이라는 용어는 세포에 의한 외인성 또는 이종 RNA 또는 DNA의 흡수를 나타낸다. 세포는 외인성 또는 이종 RNA 또는 DNA가 세포 내로 도입되었을 때 그러한 RNA 또는 DNA로 "형질감염"되었다는 것이다. 세포는 형질감염된 RNA 또는 DNA가 표현형 변화를 초래할 때 외인성 또는 이종 RNA 또는 DNA로 "형질전환"되었다는 것이다. 형질전환 RNA 또는 DNA는 염색체 DNA 내로 통합되어(공유 결합되어) 세포의 게놈을 구성할 수 있다.
"형질전환"은 숙주 유기체의 게놈 내로 핵산 단편이 전달되어 유전적으로 안정한 유전으로 이어짐을 나타낸다. 형질전환되는 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉" 또는 "재조합" 또는 "형질전환" 유기체로 지칭된다.
게다가, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 증폭 또는 발현이 추구되는 세포 숙주에서의 복제를 위한 하나 이상의 기점, 마커 또는 선발가능한 마커를 포함할 수 있다.
"선발가능한 마커"라는 용어는 마커 유전자의 효과를 기반으로 하여, 즉, 항생제에 대한 내성, 제초제에 대한 내성, 비색 분석 마커, 효소, 형광 마커 등에 대하여 선발될 수 있는, 확인 인자, 일반적으로 항생제 또는 화학물질 내성 유전자를 나타내며, 여기서, 상기 효과는 관심있는 핵산의 유전의 추적을 위하여 및/또는 관심있는 핵산이 유전된 세포 또는 유기체의 동정을 위하여 사용된다. 당업계에서 사용되는 그리고 공지된 선발가능한 마커 유전자의 예는 하기를 포함한다: 암피실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 비알라포스 제초제, 술폰아미드 등에 대한 허용성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로서 사용되는 유전자, 즉, 안토시아닌 조절 유전자, 아이소펜타닐 트랜스퍼라아제 유전자 등.
"리포터 유전자"라는 용어는 리포터 유전자의 효과를 기반으로 하여 동정될 수 있는 확인 인자를 코딩하는 핵산을 나타내며, 여기서, 상기 효과는 관심있는 핵산의 유전을 추적하기 위하여, 관심 있는 핵산이 유전된 세포 또는 유기체를 동정하기 위하여 및/또는 유전자 발현 유도 또는 전사를 측정하기 위하여 사용된다. 당업계에서 사용되는 그리고 공지된 리포터 유전자의 예는 하기를 포함한다: 루시퍼라아제(Luc), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyltransferase, CAT), β-갈락토시다아제(LacZ), β-글루큐로니다아제(Gus) 등. 선발가능한 마커 유전자는 리포터 유전자로도 간주될 수 있다.
"프로모터" 및 "프로모터 서열"은 서로 바꾸어서 사용될 수 있으며, 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 나타낸다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열의 3'에 위치한다. 프로모터는 천연 유전자로부터 그 전체가 유래될 수 있거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터들로부터 유래되는 상이한 요소들로 구성될 수 있거나, 또는 심지어 합성 DNA 절편을 포함할 수 있다. 상이한 프로모터들이 상이한 조직 또는 세포 유형에서 유전자의 발현을 지시할 수 있거나, 상이한 발생 단계에서 그러할 수 있거나, 상이한 환경 또는 물리적 조건에 반응하여 그러할 수 있음이 당업자에 의해 이해된다. 대부분의 시점에서 대부분의 세포 유형에서 유전자 발현을 야기하는 프로모터는 일반적으로 "구성적 프로모터"로 지칭된다. 특정 세포 유형에서 유전자 발현을 야기하는 프로모터는 일반적으로 "세포-특이적 프로모터" 또는 "조직-특이적 프로모터"로 지칭된다. 발생 또는 세포 분화의 특정 단계에서 유전자 발현을 야기하는 프로모터는 일반적으로 "발생-특이적 프로모터" 또는 "세포 분화-특이적 프로모터"로 지칭된다. 프로모터를 유도하는 제제(agent), 생물 분자, 화학물질, 리간드, 광 등으로 세포를 처리하거나 세포를 그에 노출시킨 이후 유전자 발현을 유도 및 야기하는 프로모터는 일반적으로 "유도성 프로모터" 또는 "조절성 프로모터"로 지칭된다. 대부분에 경우 조절 서열의 정확한 경계는 완전히 정의된 것은 아니기 때문에 상이한 길이의 DNA 단편은 동일한 프로모터 활성을 가질 수도 있음이 또한 인식된다.
본 발명의 벡터들 중 임의의 것에서, 벡터는 본 명세서에 개시된 프로모터를 선택적으로 포함한다. 일 실시 양태에서, 프로모터는 본 명세서의 표 1에 열거된 프로모터이다.
본 발명의 벡터들 중 임의의 것에서, 벡터는 조직-특이적 프로모터를 선택적으로 포함한다. 일 실시 양태에서, 조직-특이적 프로모터는 본 명세서에 개시된 조직 특이적 프로모터이다. 또 다른 실시 양태에서, 조직-특이적 프로모터는 본 명세서의 표 2에 열거된 조직 특이적 프로모터이다.
전형적으로 프로모터 서열은 그의 3' 말단에서 전사 개시 부위에 의해 경계가 정해지며 배경보다 큰 검출가능한 수준으로 전사를 개시하는데 필요한 최소 개수의 염기 또는 요소를 포함하도록 상류로(5' 방향으로) 연장된다. 프로모터 서열 내에서 전사 개시 부위(예를 들어 뉴클레아제 S1에 의한 맵핑(mapping)에 의해 편리하게 정의됨)뿐만 아니라 RNA 폴리머라아제의 결합에 책임이 있는 단백질 결합 도메인(콘센서스(consensus) 서열)도 발견된다.
"치료적 스위치 프로모터(therapeutic switch promoter, TSP)"는 유전자 스위치 구성요소의 발현을 제어하는 프로모터를 나타낸다. 유전자 스위치 및 그의 다양한 구성요소는 본 명세서의 다른 곳에서 상세하게 기술되어 있다. 소정의 실시 양태에서, TSP는 구성적이며, 즉, 계속 활성을 갖는다. 구성적 TSP는 구성적-편재적이거나(즉, 일반적으로 임의의 조직 또는 세포에서 추가의 인자 또는 조절자를 필요로 하지 않고서 기능을 함) 또는 구성적-조직 또는 세포 특이적일 수 있다(즉, 일반적으로 특정 조직 유형 또는 세포 유형에서 추가의 인자 또는 조절자를 필요로 하지 않고서 기능을 함). 소정의 실시 양태에서, 본 발명의 TSP는 질환, 장애 또는 질병과 관련된 조건 하에서 활성화된다. 2가지 이상의 TSP가 연루된 본 발명의 ㅗ정의 실시양태에서 프로모터는 구성적 프로모터와 활성화가능한 프로모터의 조합일 수 있다. 본 명세서에서 사용될 때, "질환, 장애 또는 질병과 관련된 조건 하에서 활성화되는 프로모터"는 한정됨이 없이 질환-특이적 프로모터, 특정한 생리학적 조건, 발생 조건, 분화 조건 또는 병리학적 조건에 반응하는 프로모터, 특정한 생물 분자에 반응하는 프로모터, 및 질환, 장애 또는 질병과 관련된 특정 조직 또는 세포 유형, 예를 들어 종양 조직 또는 악성 세포에 특이적인 프로모터를 포함한다. TSP는 자연 발생 프로모터의 서열, 자연 발생 프로모터로부터 유래되는 변경 서열, 또는 합성 서열(예를 들어, 반응 요소를 최소 프로모터 서열 내로 삽입하여 프로모터의 반응성을 변경시킴)을 포함할 수 있다.
코딩 서열은 RNA 폴리머라아제가 코딩 서열을 mRNA로 전사하고 그 후 이것이 트랜스-RNA 스플라이싱되고(코딩 서열이 인트론을 포함할 경우) 코딩 서열에 의해 인코딩되는 단백질로 번역될 때 세포에서 전사 및 번역 제어 서열의 "제어 하에" 있다.
"전사 및 번역 제어 서열"은 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 제공하는, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 종결서열(terminator) 등과 같은 DNA 조절 서열을 나타낸다. 진핵 세포에서, 폴리아데닐화 시그널은 제어 서열이다.
"반응 요소"라는 용어는 전사 인자의 DNA-결합 도메인과의 상호작용을 통하여 매개되는 반응성을 프로모터에 부여하는 하나 이상의 시스-작용(cis-acting) DNA 요소를 나타낸다. 이 DNA 요소는 그의 서열이 팔린드롬(palindromic) 서열(완전한 또는 불완전한 팔린드롬)이거나 가변적인 개수의 뉴클레오티드에 의해 분리된 서열 모티프 또는 하프 사이트(half site)로 구성될 수 있다. 하프 사이트는 유사하거나 동일할 수 있으며 직접적 반복체 또는 역위 반복체로서 또는 단일 하프 사이트 또는 일렬로 있는 인접 하프 사이트들의 멀티머(multimer)로서 배열될 수 있다. 반응 요소는 반응 요소가 혼입되는 세포 또는 유기체의 성질에 따라 상이한 유기체들로부터 단리된 최소 프로모터를 포함할 수 있다. 전사 인자의 DNA 결합 도메인은 리간드의 존재 또는 부재 하에서 반응 요소의 당해 DNA 서열에 결합하여 이 반응 요소의 조절 하에서 하류 유전자(들)의 전사를 개시 또는 억제한다. 천연 엑디손 수용체의 반응 요소의 DNA 서열의 예는 하기를 포함한다: RRGG/TTCANTGAC/ACYY(서열 번호 25)(Cherbas et. al, Genes Dev. 5:120(1991) 참조); AGGTCAN(n)AGGTCA(여기서, N(n)은 하나 이상의 스페이서 뉴클레오티드(서열 번호 26)일 수 있음)(D'Avino et al., MoI. Cell. Endocrinol. 113:1(1995) 참조); 및 GGGTTGAATGAATTT(서열 번호 27)(Antoniewski et al., Mol. Cell Biol. 14:4465(1994) 참조).
"작동가능하게 연결된"이라는 용어는 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열들이 회합되어 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받게 되는 것을 나타낸다. 예를 들어, 프로모터는 이것이 코딩 서열의 발현에 영향을 줄 수 있을 때(즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사적 제어하에 있음) 코딩 서열과 작동가능하게 연결되어 있다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때 "발현"이라는 용어는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드로부터 유래되는 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 나타낸다. 또한 발현은 단백질 또는 폴리펩티드로의 mRNA의 번역을 나타낼 수 있다.
"카세트", "발현 카세트" 및 "유전자 발현 카세트"라는 용어는 특정 제한효소 부위의 핵산 도는 폴리뉴클레오티드 내로 삽입되거나 상동 재조합에 의해 삽입될 수 있는 DNA 절편을 나타낸다. DNA의 절편은 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 카세트 및 제한효소 부위는 전사 및 전사에 있어서 적당한 리딩 프레임으로 카세트가 삽입되는 것을 보장하도록 디자인된다. "형질전환 카세트"는 관심있는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며 상기 폴리뉴클레오티드에 더하여 특정 숙주 세포의 형질전환을 용이하게 하는 요소를 갖는 특정 벡터를 나타낸다. 또한 본 발명의 카세트, 발현 카세트, 유전자 발현 카세트 및 형질전환 카세트는 숙주 세포에서 관심 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 증강된 발현을 허용하는 요소를 포함할 수 있다. 이들 요소는 프로모터, 최소 프로모터, 인핸서, 반응 요소, 종결 서열, 폴리아데닐화 서열 등을 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 목적상, "유전자 스위치"라는 용어는 프로모터와 관련된 반응 요소 및 프로모터가 혼입된 유전자의 발현을 하나 이상의 리간드의 존재 하에서 조정하는 리간드-의존성 전사 인자-기반 시스템과 상기 반응 요소의 조합을 나타낸다. "유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드"라는 용어는 프로모터와 관련된 반응 요소 및 프로모터가 혼입된 유전자의 발현을 하나 이상의 리간드의 존재 하에서 조정하는 리간드-의존성 전사 인자-기반 시스템과 상기 반응 요소의 조합을 나타낸다.
본 발명의 치료적 스위치 프로모터는 특정 질환, 장애 또는 질병의 치료, 개선 또는 예방에 유용한 임의의 프로모터일 수 있다. 예는 한정됨이 없이 특정 질환, 장애 또는 질병 동안에만 증가된 발현을 나타내는 유전자의 프로모터, 및 특정 세포 상태(예를 들어, 증식, 아폽토시스, pH 변화, 산화 상태, 산소 수준) 하에서 증가된 발현을 나타내는 유전자의 프로모터를 포함한다. 유전자 스위치가 하나 초과의 전사 인자 서열을 포함하는 일부 실시 양태에서, 치료 방법의 특이성은 질환-특이적 또는 질병-특이적 프로모터를 조직-특이적 또는 세포 유형-특이적 프로모터와 조합하여 치료적 생성물이 발현되는 조직을 한정함으로써 증가될 수 있다. 따라서, 조직-특이적 또는 세포 유형-특이적 프로모터는 치료적 스위치 프로모터의 정의 내에 포함된다.
질환-특이적 프로모터의 일례로서, 암 치료에 유용한 프로모터는 발암 유전자(oncogene)의 프로모터를 포함한다. 발암 유전자 부류의 예는 성장 인자, 성장 인자 수용체, 단백질 키나아제, 세포 예정사 조절자 및 전사 인자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 발암 유전자의 구체예는 sis, erb B, erb B-2, ras, abl, myc 및 bcl-2 및 TERT를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 기타 암-관련 유전자의 예는 종양 관련 항원 유전자 및 신생 세포에서 과발현되는 기타 유전자(예를 들어, MAGE-1, 암배아 항원, 티로시나아제, 전립선 특이 항원, 전립선 특이적 막 항원, p53, MUC-1, MUC-2, MUC-4, HER-2/neu, T/Tn, MART-1, gp1OO, GM2, Tn, sTn, 및 톰슨-프리덴라이히 항원(Thompson-Friedenreich antigen, TF))를 포함한다.
당업계에 공지된 그리고 본 발명에서 치료적 스위치 프로모터로서 유용한 프로모터 서열 및 기타 조절 요소(예를 들어, 인핸서)의 예가 각각의 프로모터와 관련된 질환/장애(표 1a, 표 1b) 또는 조직 특이성(표 2a, 표 2b)과 함께 표 1a 내지표 1b 및 표 2a 내지 표 2b에 열거된 참고 문헌에 개시되어 있다. 이들 참고 문헌에 개시된 프로모터 서열은 본 명세서에 그의 전체 내용이 참고로 포함된다.
표 1a 내지 표 1b에 열거된 임의의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 치료적 프로모터가 아닌 프로모터를 가진 본 발명의 벡터를 사용해 또한 발현될 수 있다.
[표 1a]
Figure 112017107941059-pat00002
[표 1b]
Figure 112017107941059-pat00003
[표 2a]
Figure 112017107941059-pat00004
[표 2b]
Figure 112017107941059-pat00005
특정 질환 또는 장애 동안 발현 수준 변화를 나타내며 따라서 본 발명에서 유용한 프로모터를 제공할 수 있는 다른 유전자는 한정됨이 없이 표 3a 내지 표 3g에 열거된 유전자(관련된 질환/장애와 함께임)를 포함한다.
[표 3a]
Figure 112017107941059-pat00006
[표 3b]
Figure 112017107941059-pat00007
[표 3c]
Figure 112017107941059-pat00008
[표 3d]
Figure 112017107941059-pat00009
[표 3e]
Figure 112017107941059-pat00010
[표 3f]
Figure 112017107941059-pat00011
[표 3g]
Figure 112017107941059-pat00012
일단 질환, 장애 또는 질병 동안 조정되는 발현 패턴을 갖는 유전자가 동정되면, 이 유전자의 프로모터는 본 발명의 유전자 스위치에서 사용될 수 있다. 프로모터 영역을 포함하는 많은 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 공개 데이터베이스, 예를 들어 젠뱅크(GenBank)에서 입수가능하다. 따라서, 일단 적절한 유전자가 동정되면 당해 프로모터 서열은 쉽게 확인되어 얻어질 수 있다. 본 발명의 또 다른 태양은 적합한 유전자를 동정하는 것에 관한 것인데, 상기 유전자의 프로모터는 단리되어 유전자 스위치 내에 두어질 수 있다. 따라서, 프로모터가 단리되어 후속 세팅 또는 환경에서 사용될 수 있다면 유전자의 아이덴티티(identity)는 본 발명의 특정 실시 양태에 결정적이지 않을 수도 있다. 따라서 본 발명은 아직 동정되어야 할 유전자 유래의 프로모터의 사용을 포함한다. 일단 적합한 유전자가 동정되면, 프로모터 기능에 필요한 유전자 서열을 결정하는 것은 일상적인 기술 또는 실험의 문제이다. 실제, 관심있는 유전자의 프로모터 영역의 결정에 도움을 주기 위하여 몇몇 상업적 프로토콜이 존재한다. 예로서, 최근에 Ding, 등은 인간 Sprouty4 유전자의 5'-측면(flanking) 서열을 점진적으로 결실시킴으로써 신규한 Sprouty4 유전자의 프로모터 서열을 밝혀내었다(Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol 287: L52(2004), 이는 참고로 포함됨). 간략하게는, 일단 전사 개시 부위가 결정되었으면, 일방향 방식으로 5'-측면 절편의 절편들을 클로닝하기 위하여 공통 PCR 프라이머를 사용하여 PCR 단편들을 생성하였다. 생성된 절편들을 루시퍼라아제 리포터 벡터 내에 클로닝하고, 루시퍼라아제 활성을 측정하여 인간 Sprouty4 유전자의 프로모터 영역을 결정하였다.
유전자 프로모터를 획득 및 확인하는 프로토콜의 또 다른 예는 하기 단계들을 포함한다:(1) 유사한/동일한 조직 유형의 질환에 걸린 그리고 질환에 걸리지 않은 세포/조직 샘플을 획득하는 단계;(2) 샘플로부터 전체 RNA 또는 mRNA를 단리하는 단계;(3) 질환에 걸린 그리고 질환에 걸리지 않은 RNA의 차별적 마이크로어레이 분석(differential microarray analysis)을 수행하는 단계;(4) 질환-특이적 후보 전사체를 동정하는 단계;(5) 질환-특이적 전사체와 관련된 게놈 서열을 동정하는 단계;(6) 질환-특이적 전사체의 예측 전사 시작 부위의 상류 및 하류의 DNA 서열을 획득 또는 합성하는 단계;(7) 상이한 길이의 단계 6으로부터의 DNA를 사용하여 프로모터 리포터 벡터를 디자인 및 생성하는 단계; 및(8) 질환에 걸린 그리고 질환에 걸리지 않은 세포/조직에서뿐만 아니라 관련이 없는 세포/조직에서도 프로모터 리포터 벡터를 시험하는 단계.
유전자 스위치 내로 삽입되는 프로모터의 공급원은 천연 또는 합성 공급원일 수 있으며, 프로모터 공급원은 본 명세서에 기술된 본 발명의 범주를 한정하지 않아야 한다. 환언하면, 프로모터는 세포로부터 직접적으로 클로닝될 수 있거나, 프로모터는 상이한 공급원으로부터 이전에 클로닝되었을 수 있거나, 프로모터는 합성되었을 수 있다.
유전자 스위치 시스템
유전자 스위치는 특정 리간드의 첨가 또는 제거에 의해 유전자 발현을 조절하는 임의의 유전자 스위치일 수 있다. 일 실시 양태에서, 유전자 스위치는 유전자 발현 수준이 존재하는 리간드 수준에 의존적인 것이다. 본 발명의 유전자 스위치에서 사용될 수 있는 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 예는 한정됨이 없이, 각각의 리간드(예를 들어, 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 프로게스틴, 레티노이드, 엑디손, 및 그의 유사체 및 모방체)에 의해 활성화되는 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원 및 테트라사이클린에 의해 활성화되는 rTTA를 포함한다. 본 발명의 일 태양에서, 유전자 스위치는 EcR-기반 유전자 스위치이다. 그러한 시스템의 예는 한정됨이 없이, 미국 특허 제6,258,603호, 미국 특허 제7,045,315호, 미국 특허 출원 공개 제2006/0014711호, 미국 특허 출원 공개 제2007/0161086호 및 국제 특허 공개 WO01/70816호에 기술되어 있는 시스템을 포함한다. 키메라 엑디손 수용체 시스템의 예는 미국 특허 제7,091,038호, 미국 특허 출원 공개 제2002/0110861호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0033600호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0096942호, 미국 특허 출원 공개 제2005/0266457호, 및 미국 특허 출원 공개 제2006/0100416호와, 국제 특허 공개 WO01/70816호, 국제 특허 공개 WO02/066612호, 국제 특허 공개 WO02/066613호, 국제 특허 공개 WO02/066614호, 국제 특허 공개 WO02/066615호, 국제 특허 공개 WO02/29075호 및 국제 특허 공개 WO2005/108617호에 기술되어 있는데, 이들 각각은 전체적으로 참고로 포함된다. 비-스테로이드계 엑디손 작동제-조절 시스템의 일례로는 레오스위치®(등록상표) 포유동물 유도성 발현 시스템(미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)이 있다. 본 발명의 또 다른 태양에서, 유전자 스위치는 FK506 결합 단백질(FKBP)과 FKBP 라파마이신 관련 단백질(FKBP rapamycin associated protein, FRAP)과의 헤테로이량체화를 기반으로 하며 라파마이신 또는 그의 비-면역억제성 유사체를 통하여 조절된다. 그러한 시스템의 예는 한정됨이 없이 아르젠트(ARGENT)™ 트랜스크립셔널 테크놀로지(Transcriptional Technology)(미국 매사추세츠주 캠브리지 소재의 에이알아이에이디 파마슈티칼스(ARIAD Pharmaceuticals))와 미국 특허 제6,015,709호, 미국 특허 제6,117,680호, 미국 특허 제6,479,653호, 미국 특허 제6,187,757호, 및 미국 특허 제6,649,595호에 기술된 시스템을 포함한다.
일 실시 양태에서, 유전자 스위치는 치료적 스위치 프로모터의 제어 하에, 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 코딩하는 단일 전사 인자 서열을 포함한다. 상기 전사 인자 서열은 자연 발생적이거나 인공적인 리간드-의존성 전사 인자 복합체인 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 코딩할 수 있다. 인공 전사 인자는 전사 인자의 천연 서열이 예를 들어 이 서열의 돌연변이에 의해 또는 상이한 전사 인자들 유래의 도메인들의 조합에 의해 변경된 것이다. 일 실시 양태에서, 상기 전사 인자는 그룹 H(그룹 H) 핵 수용체 리간드 결합 도메인을 포함한다. 일 실시 양태에서, 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체, 유비쿼터스 수용체(ubiquitous receptor, UR), 희귀 수용체 1(orphan receptor 1, OR-1), 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1(NER-1), 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15(retinoid X receptor interacting protein-15, RIP- 15), 간 X 수용체 β(liver X receptor β, LXRβ), 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질(RLD-1), 간 X 수용체(liver X receptor, LXR), 간 X 수용체 α(LXRα), 파르네소이드 X 수용체(farnesoid X receptor, FXR), 수용체 상호작용 단백질 14(receptor interacting protein 14, RIP-14), 또는 파르네솔 수용체(farnesol receptor, HRR-1) 유래의 것이다. 또 다른 실시 양태에서, 그룹 H 핵 수용체 LBD는 엑디손 수용체 유래의 것이다.
A. 엑디손-기반 유전자 스위치
EcR 및 기타 그룹 H 핵 수용체는 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원이며, 여기서, 일반적으로 모든 구성원은 아미노-말단 트랜스활성화(transactivation) 도메인(AD, "TA" 또는 "TD"로서도 상호교환가능하게 지칭됨) - 이는 선택적으로 헤테로이량체화 파트너(heterodimerization partner, HP)에 융합되어 공동활성화 단백질(coactivation protein, CAP)을 형성함 - , DNA 결합 도메인(DNA binding domain, DBD), 및 경첩 영역을 통하여 DBD에 융합되어 리간드-의존성 전사 인자(LTF)를 형성하는 LBD의 존재를 특징으로 한다. 본 명세서에서 사용될 때, "DNA 결합 도메인"이라는 용어는 DNA 결합 도메인이 특정 반응 요소와 회합하는 기능을 하는 한, DNA 결합 단백질의 최소 폴리펩티드 서열에서 전체 길이의 DNA 결합 단백질까지를 포함한다. 또한 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원은 하기 4개 또는 5개의 도메인의 존재를 특징으로 한다: A/B, C, D, E, 및 일부의 구성원에서 F(미국 특허 제4,981,784호 및 Evans, Science 240:889(1988)). "A/B" 도메인은 트랜스활성화 도메인에 상응하며, "C"는 DNA 결합 도메인에 상응하며, "D"는 경첩 영역에 상응하며, "E"는 리간드 결합 도메인에 상응한다. 상기 패밀리의 일부 구성원은 "F"에 상응하는 LBD의 카르복시-말단측 상의 또 다른 트랜스활성화 도메인을 또한 가질 수 있다.
하기 폴리펩티드 서열은 엑디손 수용체(엑디스테로이드 수용체)(20-히드록시-엑디손 수용체)(20E 수용체)(EcRH)(핵 수용체 수퍼패밀리 1 그룹 H 구성원 1)의 폴리펩티드 서열로서 보고되었으며, 젠뱅크 수탁 번호 P34021을 갖는다.
드로소필라 멜라노가스터(광대 파리(Fruit fly)) 유래의 엑디손 수용체(878개의 아미노산)(서열 번호 5)
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DBD는 반응 요소에 대한 특이성을 부여하는, 2개의 아미노산 모티프인 P-박스 및 D-박스 사이에 2개의 시스테인 징크 핑거(zinc finger)가 존재하는 것을 특징으로 한다. 이들 도메인은 천연이거나, 변경되거나, 이종성 수용체 단백질의 상이한 도메인들의 키메라일 수 있다. EcR, 예를 들어 핵 수용체 패밀리의 하위세트는 헤테로이량체화 특성에 책임이 있는 덜 충분히 규정된 영역을 또한 보유한다. 핵 수용체의 도메인이 사실상 모듈 형태이기 때문에 LBD, DBD, 및 AD는 상호교환될 수 있다.
다른 실시 양태에서, 전사 인자는 AD, 치료 단백질 또는 치료 폴리뉴클레오티드 - 그의 발현은 조정됨 - 와 관련된 반응 요소를 인식하는 DBD, 및 그룹 H 핵 수용체 LBD를 포함한다. 소정의 실시 양태에서, 그룹 H 핵 수용체 LBD는 치환 돌연변이를 포함한다.
다른 실시 양태에서, 유전자 스위치는 제1 치료적 스위치 프로모터(TSP-1)의 제어 하에 제1 전사 인자 서열, 예를 들어 CAP, 및 제2 치료적 스위치 프로모터(TSP-2)의 제어 하에 제2 전사 인자 서열, 예를 들어 LTF를 포함하며, 여기서, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질들은 단백질 복합체(LDTFC)를 형성하도록 상호작용하며, 즉, "이중 스위치(dual switch)"-기반 또는 "2-하이브리드(two-hybrid)"-기반 유전자 스위치이다. 제1 및 제2 TSP는 동일하거나 상이할 수 있다. 이 실시 양태에서, 치료 분자 발현에 필요한 유전자 스위치에서 2개의 상이한 TSP가 존재한다는 것은 치료 방법의 특이성을 증강시킨다(도 2). 또한 도 2는 단순히 적절한 TSP를 삽입함으로써 임의의 질환, 장애 또는 질병을 치료하기 위하여 치료적 유전자 스위치를 변경시키는 능력을 보여 준다.
추가의 실시 양태에서, 제1 전사 인자 서열 및 제2 전사 인자 서열 둘 모두, 예를 들어 CAP 또는 LTF는 단일한 치료적 스위치 프로모터(예를 들어, 도 1의 TSP-1)의 제어하에 있다. 이 프로모터의 활성화는 단일 오픈 리딩 프레임을 갖는 CAP 및 LTF 둘 모두를 생성할 것이다. 이는 전사 링커, 예를 들어 IRES(내부 리보좀 진입 부위(internal ribosomal entry site))의 사용에 의해 달성될 수 있다. 이 실시 양태에서, 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 둘 모두의 부분은 TSP-1의 활성화시에 합성된다. TSP-1은 구성적 프로모터이거나 질환, 장애 또는 질병과 관련된 상태 하에서만 활성화되는 프로모터일 수 있다.
추가의 실시 양태에서, 하나의 전사 인자 서열, 예를 들어 LTF는 단지 질환, 장애 또는 질병과 관련된 상태 하에서 활성화되는 치료적 스위치 프로모터(예를 들어, 도 4에서 TSP-2 또는 TSP-3)의 제어하에 있으며, 다른 하나의 전사 인자 서열, 예를 들어 CAP는 구성적 치료적 스위치 프로모터(예를 들어, 도 4에서 TSP-1)의 제어하에 있다. 이 실시 양태에서, 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 한 부분은 구성적으로 존재하는 반면, 제2 부분은 질환, 장애 또는 질병과 관련된 상태 하에서만 합성될 것이다.
또 다른 실시 양태에서, 하나의 전사 인자 서열, 예를 들어, CAP는 제1 TSP(예를 들어, 도 3에서 TSP-1)의 제어하에 있으며, 2가지 이상의 상이한 제2 전사 인자 서열, 예를 들어 LTF-1 및 LTF-2는 상이한 TSP(예를 들어, 도 3에서 TSP-2 및 TSP-3)의 제어하에 있다. 이 실시 양태에서, LTF 각각은 상이한 인자-조절 프로모터 서열을 인식하는 상이한 DBD를 가질 수 있다(예를 들어, DBD-A는 인자-조절 프로모터-1(factor-regulated promoter-1, FRP-1)과 관련된 반응 요소에 결합하며, DBD-B는 인자-조절 프로모터-2(FRP-2)와 관련된 반응 요소에 결합함). 인자-조절 프로모터 각각은 상이한 치료 유전자에 작동가능하게 결합될 수 있다. 이러한 방식으로, 다중 치료가 동시에 제공될 수 있다.
일 실시 양태에서, 제1 전사 인자 서열은 AD와, 발현이 조정되는 치료적 생성물 서열과 관련된 반응 요소를 인식하는 DBD와, 그룹 H 핵 수용체 LBD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하며, 제2 전사 인자 서열은 척추동물 레티노이드 X 수용체(retinoid X receptor, RXR), 무척추동물 RXR, 울트라스피라클 단백질(ultraspiracle protein, USP), 또는 척추동물 RXR, 무척추동물 RXR, 및 USP로부터 선택되는 적어도 2개의 상이한 핵 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드 단편을 포함하는 키메라 핵 수용체로부터 선택되는 핵 수용체 LBD를 포함하는 전사 인자를 코딩한다(국제 특허 공개 WO01/70816 A2호 및 미국 특허 제2004/0096942 A1호). "파트너" 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 절단 돌연변이(truncation mutation), 결실 돌연변이, 치환 돌연변이 또는 또 다른 변경을 추가로 포함할 수 있다.
다른 실시 양태에서, 유전자 스위치는 핵 수용체 LBD와, 발현이 조정되는 치료적 생성물 서열과 관련된 반응 요소를 인식하는 DBD를 포함하는 제1 폴리펩티드를 포함하는 제1 전사 인자 서열, 및 AD 및 핵 수용체 LBD를 포함하는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 여기서, 핵 수용체 LBD들 중 하나는 그룹 H 핵 수용체 LBD이다. 일 실시 양태에서, 제1 폴리펩티드에는 실질적으로 AD가 없으며, 제2 폴리펩티드에는 실질적으로 DBD가 없다. 본 발명의 목적상, "실질적으로 없는"은 당해 단백질이 활성화 또는 결합 활성을 제공하기에 충분한 당해 도메인 서열을 포함하지 않음을 의미한다.
본 발명의 다른 태양에서, 제1 전사 인자 서열은 헤테로이량체화 파트너 및 AD("CAP")를 포함하는 단백질을 코딩하며, 제2 전사 인자 서열은 DBD 및 LBD("LTF")를 포함하는 단백질을 코딩한다.
단지 하나의 핵 수용체 LBD가 그룹 H LBD일 때, 다른 하나의 핵 수용체 LBD는 그룹 H LBD와 이량체를 형성하는 임의의 다른 핵 수용체 유래의 것일 수 있다. 예를 들어, 그룹 H 핵 수용체 LBD가 EcR LBD일 때, 다른 핵 수용체 LBD "파트너"는 EcR, 척추동물 RXR, 무척추동물 RXR, 울트라스피라클 단백질(USP), 또는 척추동물 RXR, 무척추동물 RXR, 또는 USP로부터 선택되는 적어도 2개의 상이한 핵 수용체 LBD 폴리펩티드 단편을 포함하는 키메라 핵 수용체 유래의 것일 수 있다(본 명세서에 전체 내용이 참고로 포함된 국제 특허 공개 WO01/70816 A2호, 국제 특허 출원 PCT/US02/05235호 및 미국 특허 제2004/0096942 A1호). "파트너" 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 절단 돌연변이, 결실 돌연변이, 치환 돌연변이 또는 또 다른 변경을 추가로 포함할 수 있다.
일 실시 양태에서, 척추동물 RXR LBD는 인간 호모 사피엔스(Homo sapiens), 마우스 무스 무스쿨루스(Mus musculus), 랫트 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus), 닭 갈루스 갈루스(Gallus gallus), 돼지 수스 스크로파 도메스티카(Sus scrofa domestica), 개구리 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis), 제브라피시(zebrafish) 다니오 레리오(Danio rerio), 피낭동물(tunicate) 폴리안드로카르파 미사키엔시스(Polyandrocarpa misakiensis), 또는 해파리 트리페달리아 시소포라(Tripedalia cysophora) RXR 유래의 것이다.
일 실시 양태에서, 무척추동물 RXR 리간드 결합 도메인은 메뚜기 로쿠스타 미그라토리아(Locusta migratoria) 울트라스피라클 폴리펩티드("LmUSP"), 참진드기(ixodid tick) 암블리오마 아메리카눔(Amblyomma americanum) RXR 상동체 1("AmaRXRl"), 참진드기 암블리오마 아메리카눔 RXR 상동체 2("AmaRXR2"), 농게(fiddler crab) 셀루카 푸길라토르(Celuca pugilator) RXR 상동체("CpRXR"), 딱정벌레 테네브리오 몰리토르(Tenebrio molitor) RXR 상동체("TmRXR"), 꿀벌 아피스 멜리페라(Apis mellifera) RXR 상동체("AmRXR"), 진딧물 마이주스 페르시카에(Myzus persicae) RXR 상동체("MpRXR"), 또는 비-쌍시류(non-Dipteran)/비-인시류(non-Repidopteran) RXR 상동체 유래의 것이다.
일 실시 양태에서, 키메라 RXR LBD는 척추동물 종 RXR 폴리펩티드 단편, 무척추동물 종 RXR 폴리펩티드 단편, 또는 비-쌍시류/비-인시류 무척추동물 종 RXR 상동체 폴리펩티드 단편로부터 선택되는 적어도 2개의 폴리펩티드 단편을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 2가지의 상이한 종의 RXR 폴리펩티드 단편을 포함할 수 있거나, 또는 상기 종들이 동일할 때 2가지 이상의 폴리펩티드 단편은 상기 종들의 RXR 폴리펩티드 단편의 2가지 이상의 상이한 아이소폼(isoform) 유래의 것일 수 있다. 이러한 키메라 RXR LBD는 예를 들어, 국제 특허 출원 제WO 2002/066614호에 기재된다.
일 실시 양태에서, 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 하나의 척추동물 종 RXR 폴리펩티드 단편 및 하나의 무척추동물 종의 RXR 폴리펩티드 단편을 포함한다.
다른 실시 양태에서, 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 하나의 척추동물 종 RTR 폴리펩티드 단편 및 하나의 비-쌍시류/비-인시류 무척추동물 종 RTX 상동성 폴리펩티드 단편을 포함한다.
리간드는 핵 수용체(들)의 LBD와 조합될 때 - 이는 다시 치료적 생성물 서열과 관련된 FRP의 반응 요소에 결합됨 - 치료적 생성물 서열의 발현의 외부의 일시적 조절을 제공한다. 본 발명의 다양한 구성요소가 서로에게 결합되는 결합 기작 또는 그 순서, 즉, 예를 들어 LBD에의 리간드의 결합, 반응 요소에의 DBD의 결합, 프로모터에의 AD의 결합 등의 결합 기작 또는 그 순서는 결정적이지 않다.
특정 실시예에서, 그룹 H 핵 수용체 및 그의 핵 수용체 LBD 파트너의 LBD에 리간드가 결합하는 것은 치료적 생성물 서열의 발현을 가능하게 한다. 이 기작은 그룹 H 핵 수용체(GHNR) 또는 그의 파트너에 리간드가 결합하고 그 결과 활성 호모이량체 복합체(예를 들어, GHNR + GHNR 또는 파트너 + 파트너)가 형성될 가능성을 배제하는 것은 아니다. 바람직하게는 당해 수용체 도메인들 중 하나 이상은 다양하여서 하이브리드 유전자 스위치를 생성한다. 전형적으로, 3가지 도메인, DBD, LBD, 및 AD 중 하나 이상은 다른 도메인의 공급원과는 상이한 공급원으로부터 선택될 수 있어서 하이브리드 유전자 및 생성된 하이브리드 단백질은 트랜스활성화(transactivating) 활성, 리간드의 상보적 결합 및 특정 반응 요소의 인식을 위한 선택된 숙주 세포 또는 유기체에서 최적화되게 된다. 게다가, 반응 요소 그 자체는 다른 DNA 결합 단백질 도메인, 예를 들어 효모 유래의 GAL-4 단백질[Sadowski et al., Nature 335:563(1988)] 또는 에스케리키아 콜라이 유래의 LexA 단백질[Brent et al., Cell 43:729(1985)]에 대한 반응 요소, 또는 하이브리드 수용체를 수용하도록 특정 상호작용을 위하여 디자인되고, 변경되고, 선택된 단백질과의 표적화된 상호작용에 특이적인 합성 반응 요소(예를 들어, Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:3616(1997))로 변경 또는 치환될 수 있다. 2하이브리드(two-hybrid) 시스템의 또 다른 이점은 이 시스템이 원하는 최종 결과에 따라 유전자가 발현되게 하는데 사용되는 프로모터의 선택을 허용한다는 것이다. 그러한 이중 제어는 특히 세포독성 단백질이 생성될 때 유전자 치료 분야에서 특히 중요할 수 있으며, 그 이유는 발현 타이밍과, 발현이 일어나는 세포 둘 모두가 제어될 수 있기 때문이다. 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자가 대상의 세포 내에 도입될 때, 외인성 유전자의 발현은 본 발명의 시스템의 존재에 의해 제어된다. 프로모터는 구성적으로 또는 유도가능하게 조절될 수 있거나, 또는 조직-특이적이거나(즉, 특정 세포 유형에서만 발현됨) 유기체의 소정의 발생 단계에 특이적일 수 있다.
제 1 하이브리드 단백질의 DNA 결합 도메인은 리간드의 존재 또는 부재 하에 반응 요소의 DNA 서열에 결합하여 이 반응 요소의 조절 하에 하류 유전자(들)의 전사를 개시하거나 억제한다.
기능성 LDTFC, 예를 들어 EcR 복합체는 이뮤노필린(immunophilin)과 같은 추가의 단백질(들)을 또한 포함할 수 있다. 전사 인자로 공지된 단백질의 핵 수용체 패밀리의 추가의 구성원(예를 들어 DHR38 또는 베타FTZ-1)은 또한 EcR, USP, 및/또는 RXR에 대한 리간드 의존적 또는 리간드 독립적 파트너일 수 있다. 추가로, 다른 보조인자, 예를 들어 일반적으로 보조활성자(coactivator)(어댑터(adapter) 또는 매개자(mediator)로도 지칭됨)로 공지된 단백질이 필요할 수 있다. 이들 단백질은 DNA에 서열 특이적으로 결합하지 않으며, 기본 전사에 연루되어 있지 않다. 상기 단백질들은 활성자의 DNA 결합의 촉진을 포함하는 다양한 기작을 통하여, 염색질 구조에 영향을 줌으로써 또는 활성자-개시 복합체 상호작용을 매개함으로써 전사 활성에 대한 그의 영향을 발휘할 수 있다. 그러한 보조활성자의 예는 RIP140, TIF1, RAP46/Bag-1, ARA70, SRC-1/NCoA-1, TIF2/GRIP/NCoA-2, ACTR/AIB1/RAC3/pCIP, 및 기타 보조활성자 C 반응 요소 B 결합 단백질, CBP/p300을 포함한다(검토를 위해서, Glass et al., Curr. Opin. Cell Biol. 9:222(1997)). 또한, 일반적으로 보조억제자(corepressor)로 공지된 단백질 보조인자(억제자, 사일런서(silencer), 또는 사일런싱(silencing) 매개자로도 공지됨)는 리간드의 부재 하에 전사 활성화를 효과적으로 억제하기 위하여 요구될 수 있다. 이들 보조억제자는 리간드 미결합(unliganded) EcR과 상호작용하여 당해 반응 요소에서의 활성을 사일런싱시킬 수 있다. 현재의 증거는 리간드의 결합이 수용체의 형상(conformation)을 변화시키며, 이는 보조억제자를 방출시키고 상기에 기술된 보조활성자를 모집하고 그에 의해 이들의 사일런싱 활성을 없앤다는 것을 시사하고 있다. 보조억제자의 예는 N-CoR 및 SMRT를 포함한다(검토를 위해서, Horwitz et al., Mol Endocrinol. 10:1167(1996)). 이들 보조인자는 세포 또는 유기체 내에서 내인성일 수 있거나, 또는 조절되는 방식으로 또는 조절되지 않는 방식으로 발현될 트랜스유전자으로서 외부에서 첨가될 수 있다.
B. 라파마이신 기반의 유전자 스위치
본 발명은 리간드-의존성 전사 인자 복합체로서 FK506 결합 단백질을 이용하고 리간드로서 라파마이신을 이용하는 유전자 스위치 시스템을 추가로 제공한다. 일 실시 양태에서, 이 유전자 스위치를 코딩하는 작제물은 라파마이신 또는 그의 유사체에 결합하며 적어도 하나의 FK506-결합 단백질(FKBP) 도메인 및 그에 대하여 이종성인 적어도 하나의 단백질 도메인을 포함하는 제1 키메라 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드(여기서, FKBP 도메인은
(a)(1) 자연 발생 FKBP,
(2) 최대 10개의 아미노산 잔기가 결실되거나, 삽입되거나, 치환 아미노산으로 대체된 자연 발생 FKBP의 변이체, 및
(3)(1) 또는(2)의 FKBP를 코딩하는 DNA 서열에 선택적으로 혼성화되는 DNA 서열에 의해 코딩되는 FKBP로부터 선택되는 펩티드 서열을 포함함)와;
(b)(a) 라파마이신 또는 라파마이신 유사체 및(b) 제1 키메라 단백질 둘 모두와 복합체를 형성하며 적어도 하나의 FKBP:라파마이신 결합(FRB) 도메인 및 그에 대하여 이종성인 적어도 하나의 단백질 도메인을 포함하는 제2 키메라 단백질을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드(여기서, FRB 도메인은
(4) 자연 발생 FRB 도메인,
(5) 최대 10개의 아미노산 잔기가 결실되거나, 삽입되거나, 치환 아미노산으로 대체된 자연 발생 FRP 도메인의 변이체, 및
(6)(4) 또는(5)의 FRB를 코딩하는 DNA 서열에 선택적으로 혼성화되는 DNA 서열에 의해 코딩되는 FRB
로부터 선택되는 펩티드 서열을 포함함)를 포함한다.
이 유전자 스위치 시스템에서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드 각각은 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 하나 이상의 치료적 스위치 프로모터의 제어하에 있다. 더욱이, 소정의 실시 양태에서, 제1 키메라 단백질 및 제2 키메라 단백질 중의 FKBP 및/또는 FRB 도메인에 대하여 이종성인 적어도 하나의 단백질 도메인은 하나 이상의 "작용(action)" 또는 "이펙터(이펙터) 도메인일 수 있다. 이펙터 도메인은 DNA 결합 도메인, 전사 활성화 도메인, 세포 국지화 도메인 및 시그널링 도메인(즉, 클러스터링(clustering) 또는 멀티머화(multimerization)시에 세포의 성장, 증식, 분화, 아폽토시스, 유전자 전사 등이 가능한 도메인)을 포함하는 매우 다양한 단백질 도메인으로부터 선택될 수 있다.
소정의 실시양태에서, 하나의 융합 단백질은 적어도 하나의 DNA 결합 도메인(예를 들어, GAL4 또는 ZFHD1 DNA-결합 도메인)을 포함하며, 또 다른 융합 단백질은 적어도 하나의 전사 활성화 도메인(예를 들어, VP16 또는 p65 전사 활성화 도메인)을 포함한다. 융합 단백질들의 리간드-매개 회합은 전사 인자 복합체의 형성을 나타내며 융합 단백질들 중 하나 상의 DNA-결합 도메인에 의해 인식되는(즉, 상기 DNA-결합 도메인과의 결합이 가능한) DNA 서열에 연결된 표적 유전자의 전사가 개시되게 한다. 유전자 발현 시스템, 및 리간드에 관한 정보는 미국 특허 제6,187,757 B1호, 미국 특허 제6,649,595 B1호, 미국 특허 제6,509,152 B1호, 미국 특허 제6,479,653 B1호, 및 미국 특허 제6,117,680 B1호에 개시되어 있다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 리간드의 부재 하에 자가 응집되는 두 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 스위치 시스템을 제공하며, 여기서,(a) 제1 융합 단백질은 선택된 리간드에 결합하는 조건부 응집 도메인과, 전사 활성화 도메인을 포함하며,(b) 선택된 리간드에 결합되는 조건부 응집 도메인과, DNA 결합 도메인을 포함하고,(c) 리간드의 부재 하에서 세포는 상기 DNA 결합 도메인이 결합되는 조절 DNA에 작동가능하게 연결된 유전자를 발현한다. 유전자 스위치 시스템을 포함하는 변경된 세포는 리간드의 존재 하에 유전자의 억압에 충분한 양으로 확장된다. 리간드 제거는 세포 사멸을 야기하는 코딩 단백질의 발현을 유도한다. 상기 두 융합 단백질을 코딩하는 핵산은 적어도 하나의 조건부 프로모터의 제어 하에 있다. 조건부 응집 도메인을 이용하는 유전자 발현 시스템은 미국 특허 출원 공개 제2002/0048792호에 개시되어 있다.
C. 원핵생물 리프레서(Repressor)/ 오퍼레이터(Operator) 기반의 유전자 스위치 시스템
일 실시 양태에서, 본 발명은(a) 원핵생물 테트라사이클린("tet") 리프레서 및 진핵생물 전사 활성자 단백질 도메인을 포함하는 트랜스활성자(transactivator) 융합 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및(b) 치료 단백질 또는 치료 폴리펩티드를 코딩하며 최소 프로모터 및 적어도 하나의 tet 오퍼레이터 서열에 작동가능하게 연결된 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 스위치 시스템을 제공한다. 트랜스활성자 융합 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드는 본 명세서의 다른 곳에 기술된 바와 같이 치료적 스위치 프로모터를 포함할 수 있다. 치명적 단백질의 발현은 테트라사이클린의 부재 하에서는 상향조절된다(예를 들어, Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 5547-5551]; [Gossen et al. (1993) TIBS 18 : 471-475; Furth et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 9302-9306; 및 Shockett et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 6522-6526). TetO 발현 시스템은 미국 특허 제5,464,758 B1호에 개시되어 있다.
또 다른 실시 양태에서, 유전자 스위치 시스템은 박테리아인 에스케리키아 콜라이 유래의 락토스("Lac") 리프레서-오퍼레이터 시스템을 포함한다. 본 발명의 유전자 스위치 시스템은(a) 원핵생물 lac I 리프레서 및 진핵생물 전사 활성자 단백질 도메인을 포함하는 트랜스활성자 융합 단백질을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및(b) 치료 단백질 또는 치료 폴리펩티드를 코딩하며 치료적 스위치 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2 폴리뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있다. Lac 시스템에서, lac 오페론은 락토스, 또는 아이소프로필-b-D-티오갈락토사이드와 같은 합성 유사체의 부재 하에서 불활성화된다.
추가의 유전자 스위치 시스템은 하기에 기술된 것을 포함한다: 미국 특허 제7,091,038호; 국제 특허 공개 WO2004078924호; 유럽 특허 제1266015호; 미국 특허 출원 공개 제20010044151호; 미국 특허 출원 공개 제20020110861호; 미국 특허 출원 공개 제20020119521호; 미국 특허 출원 공개 제20040033600호; 미국 특허 출원 공개 제20040197861호; 미국 특허 출원 공개 제20040235097호; 미국 특허 출원 공개 제20060020146호; 미국 특허 출원 공개 제20040049437호; 미국 특허 출원 공개 제20040096942호; 미국 특허 출원 공개 제20050228016호; 미국 특허 출원 공개 제20050266457호; 미국 특허 출원 공개 제20060100416호; 국제 특허 공개 제WO 2001/70816호; 국제 특허 공개 WO2002/29075호; 국제 특허 공개 WO2002/066612호; 국제 특허 공개 WO2002/066613호; 국제 특허 공개 WO2002/066614호; 국제 특허 공개 WO2002/066615호; 국제 특허 공개 WO2005/108617호; 미국 특허 제6,258,603호; 미국 특허 출원 공개 제20050209283호; 미국 특허 출원 공개 제20050228016호; 미국 특허 출원 공개 제20060020146호; 유럽 특허 제0965644호; 미국 특허 제7,304,162호; 미국 특허 제7,304,161호; 멕시코 특허 제234742호; 한국 특허 제10-0563143호; 오스트레일리아 특허 제765306호; 오스트레일리아 특허 출원 제2002-248500호; 및 오스트레일리아 특허 출원 제2002-306550호.
D. 유전자 스위치 시스템들의 조합
본 발명은 유효량의 하나 이상의 리간드에 의해 활성화되는 상이한 리간드-의존성 전사 인자 복합체들을 포함하는 2가지 이상의 유전자 스위치 시스템을 포함하는 핵산 조성물, 변경된 세포, 및 생물반응기를 제공하며, 여기서, 상기 2가지 이상의 유전자 스위치 시스템은 제1 유전자 스위치 및 제2 유전자 스위치를 포함하고, 상기 둘 모두의 유전자 스위치는 하나 이상의 리간드에의 결합시에 하나 이상의 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드의 발현을 선택적으로 유도한다. 임의의 개수의 유전자 스위치 시스템 및/또는 그의 조합이 본 발명의 범주 내에 있다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 하기 a 및 b를 함유하는 핵산 조성물을 제공한다.
a. 하기 i, ii 및 iii을 포함하는 제1 유전자 스위치 시스템:
*i. 하기 1 및 2를 포함하는 제1 하이브리드 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 유전자 발현 카세트:
1. 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 관련된 인자-조절 프로모터를 활성화시키는 트랜스활성화 도메인, 및
2. 헤테로이량체 파트너 도메인;
ii. 하기 1 및 2를 포함하는 제2 하이브리드 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 유전자 발현 카세트:
1. 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 관련된 인자-조절 프로모터를 인식하는 DNA-결합 도메인, 및
2. 리간드 결합 도메인; 및
iii.하기 1 및 2를 포함하는 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 유전자 발현 카세트
1. 제2 하이브리드 폴리펩티드의 트랜스활성화 도메인에 의해 활성화되는 인자-조절 프로모터, 및
2. 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드; 및
b. 하기 i, ii 및 iii을 포함하는 제2 유전자 발현 시스템:
i. 하기 1 및 2를 포함하는 제1 하이브리드 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 유전자 발현 카세트:
1. 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 관련된 인자-조절 프로모터를 활성화시키는 트랜스활성화 도메인, 및
2. 헤테로이량체 파트너 도메인;
ii. 하기 1 및 2를 포함하는 제2 하이브리드 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 포함하는 제2 유전자 발현 카세트:
1. 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 관련된 인자-조절 프로모터를 인식하는 DNA-결합 도메인, 및
2. 리간드 결합 도메인; 및
iii. 하기 1 및 2를 포함하는 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 유전자 발현 카세트:
1. 제2 하이브리드 폴리펩티드의 트랜스활성화 도메인에 의해 활성화되는 인자-조절 프로모터, 및
2. 치료학적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 치료학적 폴리뉴클레오티드.
다수의 유도가능한 유전자 발현 시스템은 상이한 질환, 장애 또는 질병과 관련된 상태 하에서의 주어진 치료 폴리뉴클레오티드 또는 치료 폴리펩티드의 발현, 또는 동일한 질환, 장애 또는 질병과 관련된 동일한 상태 하에서의 또는 상이한 질환, 장애 또는 질병과 관련된 상이한 상태 하에서의 다수의 치료학적 폴리펩티드 또는 치료적 폴리뉴클레오티드의 발현을 제공한다.
소정의 실시 양태에서, 2가지 이상의 유전자 스위치 시스템의 조합은(1) 이중-스위치 엑디손 수용체 기반 유전자 발현 시스템 및(2) 단일-스위치 엑디손 수용체 기반 유전자 스위치일 수 있다. 다른 실시 양태에서, 상기 조합은(1) 단일- 또는 이중-스위치 엑디손 수용체 기반 유전자 스위치 및(2) 라파마이신 기반 유전자 스위치일 수 있다. 대안적으로, 유전자 스위치 시스템들의 조합은 상기에 개시된 2가지의 동일한 라파마이신 기반 유전자 스위치 시스템일 수 있다. 유전자 스위치 시스템들의 임의의 가능한 조합이 본 발명의 범위 이내에 있다. 이중-스위치 엑디손 시스템의 예는 예를 들어, 국제 특허 공개 WO2002/29075호 및 미국 특허 출원 공개 제US 2002/0110861호에서 찾을 수 있다.
리간드
본 명세서에서 사용될 때, "리간드"라는 용어는 LDTFC-기반 유전자 스위치. 예를 들어 EcD 복합체 기반 유전자 스위치에 적용될 경우 유전자 스위치를 활성화시켜 그 안에 코딩된 폴리펩티드의 발현을 촉진하는 능력을 갖는 작은 용해성 분자를 설명하는 것이다. 본 발명의 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 리간드는 리간드 결합 도메인, 헤테로이량체 파트너 도메인, DNA 결합 도메인 및 트랜스활성화 도메인 중 하나 이상을 포함하는 단백질 복합체에 결합한다. 리간드-의존성 전사 인자 복합체를 활성화시키기 위한 리간드의 선택은 이용되는 유전자 스위치의 유형에 따라 달라진다.
리간드의 예는 한정됨이 없이 엑디스테로이드, 예를 들어 엑디손, 20-하이드록시엑디손, 포나스테론 A, 뮤리스테론 A 등, 9-시스-레틴산, 레틴산의 합성 유사체, N,N'-다이아실하이드라진, 예를 들어 미국 특허 제6,013,836호; 미국 특허 제5,117,057호; 미국 특허 제5,530,028호; 및 미국 특허 제5,378,726호와 미국 특허 출원 공개 제2005/0209283호 및 미국 특허 출원 공개 제2006/0020146호에 개시된 것; 미국 특허 출원 공개 제2004/0171651호에 개시되어 있는 옥사다이아졸린; 다이벤조일알킬 시아노하이드라진, 예를 들어 유럽 특허 출원 제461,809호에 개시된 것; N-알킬-N,N'-다이아로일하이드라진, 예를 들어 미국 특허 제5,225,443호에 개시된 것; N-아실-N-알킬카르보닐하이드라진, 예를 들어 유럽 특허 출원 제234,994호에 개시된 것; N-아로일-N-알킬-N'-아로일하이드라진, 예를 들어 미국 특허 제4,985,461호에 개시된 것; 아미도케톤, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 제2004/0049037호에 개시된 것 - 상기 특허 또는 특허 출원 각각은 본 명세서에 참고로 포함됨 - , 및 3,5-다이-터트-부틸-4-하이드록시-N-아이소부틸-벤즈아미드, 8-O-아세틸하르파기드, 옥시스테롤, 22(R) 하이드록시콜레스테롤, 24(S) 하이드록시콜레스테롤, 25-에폭시콜레스테롤, T0901317, 5-알파- 6-알파-에폭시콜레스테롤-3-설페이트(ECHS), 7-케토콜레스테롤-3-설페이트, 파메솔, 담즙산, 1,1-바이포스포네이트 에스테르, 유약 호르몬 III 등을 포함하는 기타 유사 물질을 포함한다. 본 발명에서 유용한 다이아실하이드라진 리간드의 예는 RG-115819(3,5-다이메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-다이메틸-프로필)-N'-(2-메틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드), RG-115932((R)-3,5-다이메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)- N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드), 및 RG-115830(3,5-다이메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드)을 포함한다. 예를 들어 미국 특허 출원 제12/155,111호 및 국제 특허 출원 PCT/US2008/006757호를 참조하는데, 이들 둘 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
예를 들어, 엑디손 수용체 기반 유전자 스위치를 위한 리간드는 임의의 적합한 리간드로부터 선택될 수 있다. 자연 발생 엑디손 또는 엑디손 유사체(예를 들어, 20-하이드록시엑디손, 뮤리스테론 A, 포나스테론 A, 포나스테론 B, 포나스테론 C, 26-요오도포나스테론 A, 이노코스테론 또는 26-메실이노코스테론) 및 비-스테로이드계 유도제 둘 모두가 본 발명의 유전자 스위치를 위한 리간드로서 사용될 수 있다. 미국 특허 제6,379,945 B1호에는 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens)로부터 단리된 곤충 스테로이드 수용체("HEcR")가 기술되어 있으며, 이는 예를 들어 더욱 낮은 제조 비용, 대사 안정성, 곤충, 식물 또는 포유동물에는 없다는 것, 및 환경적 용인성을 포함하는 다수의 이유 때문에 스테로이드계 유도제 및 소정의 비-스테로이드계 유도제 둘 모두에 대하여 반응성인 이 시스템 및 많은 기타 시스템에서 스테로이드에 비하여 독특한 이점을 갖는다. 미국 특허 제6,379,945 B1호에는 엑디손-기반 유전자 스위치를 위한 리간드로서 2가지 다이벤조일하이드라진류, 1,2-다이벤조일-1-터트-부틸-하이드라진 및 테부페노지드(N-(4- 에틸벤조일)-N'-(3,5-다이메틸벤조일)-N'-터트-부틸-하이드라진)의 유용성이 기술되어 있다. 또한 리간드로서 본 발명에 포함되는 것은 다른 다이벤조일하이드라진, 예를 들어 미국 특허 제5,117,057 B1호에 개시된 것이 있다. 드로소필라 멜라노가스터 유래의 엑디손 수용체를 위한 화학적 리간드로서 테부페노지드를 사용하는 것이 미국 특허 제6,147,282호에 또한 개시되어 있다. 엑디손 리간드의 추가적인 비제한적 예로는 3,5-다이-터트-부틸-4-하이드록시-N-아이소부틸-벤즈아미드, 8-O-아세틸하르파기드, 1,2-다이아실 하이드라진, N'-치환-N,N'-2치환 하이드라진, 다이벤조일알킬 시아노하이드라진, N-치환-N-알킬-N,N-다이아로일 하이드라진, N-치환-N-아실-N-알킬, 카르보닐 하이드라진 또는 N-아로일-N'-알킬-N'-아로일 하이드라진이 있다. (미국 특허 제6,723,531호).
일 실시 양태에서, 엑디손 기반 유전자 스위치 시스템을 위한 리간드로는 다이아실하이드라진 리간드 또는 키랄 다이아실하이드라진 리간드가 있다. 본 유전자 스위치 시스템에서 사용되는 리간드는 하기 화학식 I의 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정형 또는 무정형일 수 있다:
[화학식 I]
Figure 112017107941059-pat00014
상기 식에서,
A는 알콕시, 아릴알킬옥시 또는 아릴옥시이며;
B는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이며;
R1 및 R2는 독립적으로 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이다.
또 다른 실시 양태에서, 리간드는 거울상 이성질체가 풍부한 하기 화학식 II의 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정형 또는 무정형일 수 있다:
[화학식 II]
Figure 112017107941059-pat00015
상기 식에서,
A는 알콕시, 아릴알킬옥시, 아릴옥시, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이며;
B는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이며;
R1 및 R2는 독립적으로 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이되;
단, R1은 R2와 같지 않으며;
R1 및 R2를 갖는 비대칭 탄소 원자에서의 절대 배열은 주로 S이다.
소정의 실시 양태에서, 리간드는 거울상 이성질체가 풍부한 하기 화학식 III의 화합물, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정형 또는 무정형일 수 있다:
[화학식 III]
Figure 112017107941059-pat00016
상기 식에서,
A는 알콕시, 아릴알킬옥시, 아릴옥시, 아릴알킬, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이며;
B는 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이며;
R1 및 R2는 독립적으로 선택적으로 치환된 알킬, 아릴알킬, 하이드록시알킬, 할로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로, 선택적으로 치환된 아릴 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이되;
단, R1은 R2와 같지 않으며;
R1 및 R2를 갖는 비대칭 탄소 원자에서의 절대 배열은 주로 R이다.
일 실시 양태에서, 리간드는 거울상 이성질체 과잉율(enantiomeric excess)이 95% 이상인(R)-3,5-다이메틸-벤조산 N-(1-터트-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 결정형 또는 무정형일 수 있다.
화학식 I의 다이아실하이드라진 리간드 및 화학식 II 또는 화학식 III의 키랄 다이아실하이드라진 리간드는, 엑디손-기반 유전자 스위치 시스템과 함께 사용될 때, 본 발명의 치료적 폴리펩티드 또는 치료적 폴리뉴클레오티드의 발현의 외부의 일시적 조절 수단을 제공한다. 2008년 5월 29일자로 출원되고 본 명세서에 참고로 전적으로 포함된 미국 특허 출원 제12/155,111호를 참조하라.
본 발명에서 사용되는 리간드는 염을 형성할 수 있다. 본 명세서에서 사용될 때 "염(들)"이라는 용어는 무기 및/또는 유기 산 및 염기에 의해 형성되는 산성 및/또는 염기성 염을 나타낸다. 게다가, 화학식 I, 화학식 II 또는 화학식 III의 화합물이 염기성 잔기 및 산성 잔기 둘 모두를 포함할 때 쯔비터이온("내부 염")이 형성될 수 있으며 이는 본 명세서에서 사용되는 "염(들)"이라는 용어 내에 포함된다. 예를 들어 제조 동안 이용될 수 있는 단리 또는 정제 단계에서 약학적으로 허용가능한(즉, 비독성이며 생리학적으로 허용가능한) 염이 사용되지만, 기타 염이 또한 유용하다. 화학식 I, 화학식 II 또는 화학식 III의 화합물의 염은 화합물을 예를 들어 염이 침전되는 것과 같은 매질에서 또는 수성 매질에서 당량과 같은 소정 양의 산 또는 염기와 반응시키고 이어서 동결건조시킴으로써 형성될 수 있다.
염기성 잔기를 함유하는 리간드는 다양한 유기 및 무기 산과 염을 형성할 수 있다. 예시적인 산 부가염은 아세테이트(예를 들어 아세트산 또는 트라이할로아세트산, 예를 들어 트라이플루오로아세트산에 의해 형성되는 것), 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 다이글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트(hemisulfate), 헵타노에이트, 헥사노에이트, 염산염(염산에 의해 형성됨), 브롬화수소산염(브롬화수소에 의해 형성됨), 요오드화수소산염, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레에이트(말레산에 의해 형성됨), 메탄설포네이트(메탄설폰산에 의해 형성됨), 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 석시네이트, 설페이트(예를 들어, 황산에 의해 형성되는 것), 설포네이트(예를 들어 본 명세서에 언급된 것), 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 예를 들어 토실레이트, 운데카노에이트 등을 포함한다.
산성 잔기를 함유하는 리간드는 다양한 유기 및 무기 염기와 염을 형성할 수 있다. 예시적인 염기성 염은 암모늄 염, 알칼리 금속 염, 예를 들어 나트륨, 리튬 및 칼륨 염, 알칼리 토금속 염, 예를 들어 칼슘 및 마그네슘 염, 유기 염기(예를 들어 유기 아민)와의 염, 예를 들어 벤자틴, 다이사이클로헥실아민, 하이드라바민(N,N-비스(데하이드로아비에틸)에틸렌다이아민), N-메틸-D-글루카민, N-메틸-D-글루카미드, t-부틸 아민, 및 아미노산, 예를 들어 아르기닌, 라이신과 같은 아미노산과의 염 등을 포함한다.
FK506 결합 도메인을 이용하는 유도가능한 유전자 발현 시스템을 위한 리간드의 비제한적 예로는 FK506, 사이클로스포린 A 또는 라파마이신이 있다. FK506, 라파마이신 및 이들의 유사체는 미국 특허 제6,649,595 B2호 및 미국 특허 제6,187,757호에 개시되어 있다. 미국 특허 제7,276,498호 및 미국 특허 제7,273,874호를 또한 참조하라.
본 명세서에 기술된 리간드는 단독으로 투여될 수 있거나 약학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약학 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 일 실시 양태에서, 약학 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 연고, 엘릭시르(elixir), 또는 주사가능한 조성물의 형태이다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 벡터 및 방법은 사이토카인, 면역조절자, 응고 인자, 항체 또는 항체의 단편, 에르타네르셉트(Ertanercept)와 같은 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), 에리스로포이에틴, 알파-1 안티트립신, 인터페론(IFN), 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론-베타-1a, 인터페론-베타-1b, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 안티트롬빈 III, B형 간염 바이러스 단백질, 호르몬, 예를 들어, 성장 호르몬(GH), 인간 성장 호르몬(hGH), 파라티로이드 호르몬(PH), 티로이드 자극 호르몬(TSH), GCSF 또는 그의 단편, GM-CSF 또는 그의 단편을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아닌 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있다.
일 실시 양태에서, 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 모노클로날 항체를 인코딩한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명의 벡터 및 방법은 백신으로서 핵산을 발현하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 벡터 또는 발현 시스템을 포함하는 백신 조성물을 제공하다. 다른 실시 양태에서, 백신 조성물은 아쥬반트를 포함한다.
유전자 스위치와 관련하여 "엑디손 수용체-기반"이라는 용어는 자연 발생 또는 합성 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인의 적어도 기능성 부분을 포함하며 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인에 결합하는 리간드에 반응하여 유전자 발현을 조절하는 유전자 스위치를 나타낸다. 엑디손-반응성 시스템의 예가 미국 특허 제7,091,038호 및 미국 특허 제6,258,603호에 기술되어 있다. 일 실시 양태에서, 이 시스템은 레오스위치®(등록상표) 테라퓨틱 시스템(RTS)인데, 이는 2가지 융합 단백질, 돌연변이 유발된 엑디손 수용체(EcR)의 DEF 도메인이 Gal4 DNA 결합 도메인과 융합된 것, 및 키메라 RXR의 EF 도메인이 VP16 전사 활성화 도메인과 융합된 것을 포함하는데, 이는 도 1에 도시된 바와 같이 구성적 프로모터 하에서 발현된다.
"조정하는" 및 "조정하다"라는 용어는 핵산 또는 유전자의 발현을 유도, 감소 또는 억제하여 단백질 또는 폴리펩티드 생성을 각각 유도, 감소 또는 억제함을 의미한다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 숙주 세포에서 유전자가 발현되게 하기에 적합한 적어도 하나의 프로모터를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 실시 양태에서 사용될 수 있는 인핸서는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 인핸서, 신장 인자 1(elongation factor 1, EF1) 인핸서, 효모 인핸서, 바이러스 유전자 인핸서 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
종결 제어 영역, 즉, 종결서열 또는 폴리아데닐화 서열이 바람직한 숙주에 대하여 천연인 다양한 유전자로부터 또한 유래될 수 있다. 선택적으로, 종결 부위는 불필요할 수 있지만, 포함될 경우가 가장 바람직하다. 본 발명의 일 실시 양태에서, 종결 제어 영역이 포함될 수 있거나, 이는 합성 서열, 합성 폴리아데닐화 시그널, SV40 후기 폴리아데닐화 시그널, SV40 폴리아데닐화 시그널, 소과 성장 호르몬(소과 성장 호르몬, BGH) 폴리아데닐화 시그널, 바이러스 터미네이터 서열 등으로부터 유래될 수 있다.
"3' 비-코딩 서열" 또는 "3' 비번역 영역(untranslated 영역, UTR)"이라는 용어는 코딩 서열의 하류(3')에 위치하는 DNA 서열을 나타내며, 폴리아데닐화[폴리(A)] 인식 서열과, mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 조절 시그널을 코딩하는 기타 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로 폴리아데닐화 시그널은 폴리아데닐산 트랙트(tract)가 mRNA 전구체의 3' 말단에 부가되는 것에 영향을 주는 것을 특징으로 한다.
"조절 영역"은 제2 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 나타낸다. 조절 영역은 특정 핵산(동질적 영역)의 발현에 자연적으로 책임이 있는 서열을 포함할 수 있거나, 상이한 단백질들 또는 심지어 합성 단백질들(이질적 영역)의 발현에 책임이 있는 상이한 기원의 서열을 포함할 수 있다. 특히, 상기 서열은 특이적 방식 또는 비특이적 방식으로 그리고 유도가능한 방식 또는 유도 불가능한 방식으로 유전자의 전사를 촉진 또는 억압하는 유도된 서열일 수 있다. 조절 영역은 복제 기원, RNA 스플라이스 부위, 프로모터, 인핸서, 전사 종결 서열, 및 폴리펩티드를 표적 세포의 분비 통로 내로 인도하는 시그널 서열을 포함한다.
"이종 공급원" 유래의 조절 영역은 발현되는 핵산과 자연적으로는 관련되지 않는 조절 서열을 나타낸다. 이종 조절 영역 중에 포함되는 것으로는 상이한 종들 유래의 조절 영역, 상이한 유전자 유래의 조절 영역, 하이브리드 조절 서열, 및 자연에서는 나타나지 않지만 당업자에 의해 디자인된 조절 서열이 있다.
"RNA 전사체"는 DNA 서열의 RNA 폴리머라아제-촉매된 전사로부터 생겨난 생성물을 말한다. RNA 전사체가 DNA 서열의 완전한 상보적 카피일 경우, 이것은 일차 전사체로 불리거나, 또는 이것은 일차 전사체의 전사후 프로세싱으로부터 유도된 RNA 서열일 수 있으며 성숙 RNA로 불린다. "메신저 RNA(mRNA)"는 인트론이 없는 RNA를 말하며 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있다. "cDNA"는 mRNA에 상보적이며 mRNA로부터 유도되는 이중-가닥 DNA를 말한다. "센스" RNA는 mRNA를 포함하며 따라서 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA 전사체를 말한다. "안티센스 RNA"는 표적 일차 전사체 또는 mRNA의 전부 또는 일부에 상보적이며 표적 유전자의 발현을 차단하는 RNA 전사체를 말한다. 안티센스 RNA의 상보성은 특정 유전자 전사체의 임의의 부분, 즉, 5' 비-코딩 서열, 3' 비-코딩 서열, 또는 코딩 서열에서의 것일 수 있다. "기능성 RNA"는 안티센스 RNA, 리보자임 RNA, 또는 번역되지 않지만 세포 과정에 대해 영향을 미치는 기타 RNA를 말한다.
"폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용될 수 있으며 공유 결합된 아미노산 잔기로 이루어진 중합체성 화합물을 말한다.
"단리된 폴리펩티드", "단리된 펩티드" 또는 "단리된 단백질"은 그것의 자연 상태에서 그들과 정상적으로 연합되는 화합물들(예를 들어, 다른 단백질 또는 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질)이 실질적으로 없는 폴리펩티드 또는 단백질을 말한다. "단리된"은 다른 화합물과의 인공적 또는 합성 혼합물을 배제하는 것을 의미하지 않거나, 또는 생물학적 활성을 방해하지 않으며 예를 들어, 불완전한 정제, 안정제의 첨가 또는 약학적으로 허용가능한 제제로의 배합으로 인한 것일 수 있는 불순물의 존재를 배제하는 것을 의미하지 않는다.
"치환 돌연변이 폴리펩티드" 또는 "치환 돌연변이"는 야생형 또는 자연 발생 폴리펩티드에 대하여 상이한 아미노산으로 적어도 하나의 야생형 또는 자연 발생 아미노산이 치환된 것을 포함하는 돌연변이 폴리펩티드를 의미하는 것으로 이해될 것이다. 치환 돌연변이 폴리펩티드는 단지 하나의 야생형 또는 자연 발생 아미노산 치환을 포함할 수 있으며 "점 돌연변이" 또는 "단일 점 돌연변이" 폴리펩티드로 불릴 수 있다. 대안적으로, 치환 돌연변이 폴리펩티드는 야생형 또는 자연 발생 폴리펩티드에 대하여 둘 이상의 아미노산으로 둘 이상의 야생형 또는 자연 발생 아미노산이 치환된 것을 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드는 야생형 또는 자연 발생 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드에 대하여 상이한 아미노산으로 적어도 하나의 야생형 또는 자연 발생 아미노산이 치환된 것을 포함한다.
치환 돌연변이 폴리펩티드가 둘 이상의 야생형 또는 자연 발생 아미노산의 치환을 포함할 경우, 이 치환은 치환을 위해 결실된 야생형 또는 자연 발생 아미노산의 등가의 개수, 즉, 2개의 비-야생형 또는 비-자연 발생 아미노산으로 대체된 2개의 야생형 또는 자연 발생 아미노산을 포함하거나, 또는 치환을 위해 결실된 야생형 아미노산의 비-등가의 개수, 즉, 1개의 비-야생형 아미노산으로 대체된 2개의 야생형 아미노산(치환+결실 돌연변이) 또는 3개의 비-야생형 아미노산으로 대체된 2개의 야생형 아미노산(치환+삽입 돌연변이)을 포함할 수 있다.
치환 돌연변이는 기준 폴리펩티드 서열 내의 대체된 아미노산 잔기와 번호 및 새로운 치환된 아미노산 잔기를 나타내기 위하여 약칭된 명명법 시스템을 이용하여 개시될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 20번째((20th) 아미노산 잔기가 치환된 치환 돌연변이는 "x20z"로 약칭될 수 있으며, 여기서, "x"는 대체될 아미노산이며, "20"은 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기 위치 또는 번호이며, "z"는 새로운 치환된 아미노산이다. 따라서, "E20A" 또는 "Glu20Ala"로 상호교환적으로 약칭되는 치환 돌연변이는 돌연변이가 폴리펩티드의 위치 20에서 글루탐산(보통 당업계에서 "E" 또는 "Glu"로 약칭됨) 대신 알라닌 잔기(보통 당업계에서 "A" 또는 "Ala"로 약칭됨)를 포함함을 나타낸다.
치환 돌연변이는 당업계에 알려진 돌연변이유발을 위한 임의의 기술에 의해 제조될 수 있으며, 시험관 내에서 부위-지시 돌연변이유발(Hutchinson et al., J.Biol.Chem. 253:6551(1978); Zoller et al., DNA 3:479(1984); Oliphant et al., Gene 44:177(1986); Hutchinson et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:710(1986)), TAB®(등록상표) 링커(파마시아(Pharmacia))의 이용, 제한 엔도뉴클레아제 분해, 단편 결실 및 치환, PCR-매개/올리고뉴클레오티드-지시 돌연변이유발, 및 기타를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. PCR-기반 기술이 부위-지시 돌연변이유발에 바람직하다(Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology: Principles 및 Applications for DNA Amplification, H.Erlich, ed.,Stockton Press, Chapter 6, pp.61-70).
폴리펩티드에 적용될 때, 용어 "단편"은 그 아미노산 서열이 기준 폴리펩티드의 서열보다 짧으며 이들 기준 폴리펩티드의 전체 부분에 걸쳐, 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 그러한 단편은 적절할 경우, 그들이 일부가 되는 더 큰 폴리펩티드 내에 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드의 그러한 단편은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 25, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 240, 또는 300개 이상의 아미노산의 길이를 가질 수 있다.
폴리펩티드 또는 단백질의 "변이체"는 폴리펩티드 또는 단백질로부터 유도되며 폴리펩티드 또는 단백질의 적어도 하나의 생물학적 특성을 보유한 임의의 유사체, 단편, 유도체, 또는 돌연변이를 말한다. 폴리펩티드 또는 단백질의 상이한 변이체가 자연에 존재할 수 있다. 이들 변이체는 단백질을 코딩하는 구조 유전자의 뉴클레오티드 서열에서의 차이를 특징으로 하는 대립유전자 변이체이거나, 또는 차등 스플라이싱 또는 번역후 변경에 관련될 수 있다. 당업자는 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 결실, 부가, 또는 대체를 갖는 변이체를 생성할 수 있다. 이들 변이체는 특히,(a) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적 또는 비-보존적 아미노산으로 치환되는 변이체,(b) 하나 이상의 아미노산이 폴리펩티드 또는 단백질에 부가되는 변이체,(c) 아미노산 중 하나 이상이 치환기를 포함하는 변이체, 및(d) 폴리펩티드 또는 단백질이 혈청 알부민과 같은 다른 폴리펩티드와 융합되는 변이체를 포함할 수 있다. 유전적(억제, 결실, 돌연변이 등), 화학적, 및 효소적 기술을 비롯한 이들 변이체를 얻기 위한 기술이 당업자에게 알려져 있다. 일 실시 양태에서, 변이체 폴리펩티드는 적어도 약 14개의 아미노산을 포함한다.
용어 "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 두 개의 폴리펩티드 부분 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 한 부분으로부터의 서열과 다른 서열 사이의 일치성은 당업계에 알려진 기술에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, 상동성은 서열 정보를 정렬하고 쉽게 입수가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리펩티드 분자 사이의 서열 정보를 직접 비교함으로써 결정될 수 있다. 대안적으로, 상동성은 상동성 영역 사이에 안정한 듀플렉스를 형성하는 조건 하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화시키고, 이어서 단일-가닥-특이적 뉴클레아제(들)로 분해하고 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용될 때, 모든 그 문법적 형태와 철자 변경의 용어 "상동성"은 수퍼패밀리(예를 들어, 면역글로불린 수퍼패밀리)로부터의 단백질 및 상이한 종으로부터의 상동성 단백질(예를 들어, 미오신 경쇄 등)을 비롯한, "공통 진화 기원"을 보유하는 단백질 사이의 관계를 말한다(Reeck et al., Cell 50:667(1987)). 그러한 단백질(및 그들의 코딩 유전자)은 그들의 높은 서열 유사도에 의해 반영되는 것처럼, 서열 상동성을 가진다. 하지만, 일반 용법에서 그리고 본 출원에서, 용어 "상동성"은 "매우"와 같은 부사로 수식될 경우, 서열 유사성을 가리키며 공통 진화 기원을 나타내지는 않을 수 있다.
따라서, 모든 그 문법적 형태의 용어 "서열 유사성"은 공통 진화 기원을 공유하거나 공유하지 않을 수 있는 단백질의 핵산 또는 아미노산 서열 간의 동일성 또는 일치성의 정도를 말한다(Reeck et al., Cell 50:667(1987)). 일 실시 양태에서, 두 개의 DNA 서열은 뉴클레오티드의 적어도 약 50%(예를 들어, 적어도 약 75%, 90%, 또는 95%)가 DNA 서열의 한정된 길이에 걸쳐 매칭될 때 "실질적으로 상동성"이거나 "실질적으로 유사"하다. 실질적으로 상동성인 서열은 서열 데이터 은행에서 입수가능한 표준 소프트웨어를 이용하여 서열을 비교하거나, 또는 예를 들어, 그 특정 시스템을 위해 정의된 엄격한 조건 하에서의 서던(Southern) 혼성화 실험에서 확인될 수 있다. 적절한 혼성화 조건의 정의는 당업자의 수준 내이다(예를 들어, Sambrook et al., 1989).
본 명세서에 사용될 때, "실질적으로 유사한"은 하나 이상의 뉴클레오티드 염기에서의 변화가 하나 이상의 아미노산의 치환을 야기하지만, DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질의 기능적 특성에 영향을 주지 않는 핵산 단편을 말한다. "실질적으로 유사한"은 또한 하나 이상의 뉴클레오티드 염기에서의 변화가 핵산 단편이 안티센스 또는 공동억제 기술에 의해 유전자 발현의 변경을 매개하는 능력에 영향을 주지 않는 핵산 단편을 말한다. "실질적으로 유사한"은 또한 생성된 전사체의 기능적 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 결실 또는 삽입과 같은 본 발명의 핵산 단편의 변경을 말한다. 따라서 본 발명은 특정 예시 서열보다 많은 것을 포괄함이 이해된다. 제안된 변경의 각각은 당업계의 일상적 기술 내이며, 코딩된 생성물의 생물학적 활성의 보유의 결정도 그러하다.
더욱이, 당업자는 본 발명에 의해 포괄되는 실질적으로 유사한 서열이 또한 엄격한 조건(0.1X SSC, 0.1% SDS, 65℃ 및 2X SSC, 0.1% SDS로 세척되고 이어서 0.1X SSC, 0.1% SDS로 세척됨) 하에서, 본 명세서에서 예시된 서열과 혼성화하는 그들의 능력에 의해 정의됨을 인식한다. 본 발명의 실질적으로 유사한 핵산 단편은 DNA 서열이 본 명세서에서 보고된 핵산 단편의 DNA 서열에 적어도 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 동일한 핵산 단편이다.
두 개의 아미노산 서열은 아미노산의 약 40% 초과가 동일하거나, 또는 60% 초과가 유사(기능적으로 동일)할 때 "실질적으로 상동성"이거나 또는 "실질적으로 유사"하다. 바람직하게는, 유사하거나 상동성인 서열은 예를 들어, GCG(제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer 그룹), GCG 패키지용 프로그램 매뉴얼, 버전 7, 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 파일업 프로그램을 이용한 정렬에 의해 확인된다.
용어 "상응하는"은 정확한 위치가 유사성 또는 상동성이 측정되는 분자와 동일하든지 상이하든지 간에, 유사하거나 상동성인 서열을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 핵산 또는 아미노산 서열 정렬은 공간을 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "상응하는"은 서열 유사성을 지칭하며, 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 염기의 넘버링을 지칭하지 않는다.
아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 "상당 부분"은 당업자에 의한 서열의 수동 평가에 의해, 또는 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., J.Mol.Biol. 215:403(1993)); ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 입수가능함)와 같은 알고리즘을 이용한 컴퓨터-자동화 서열 비교 및 확인에 의해, 그 폴리펩티드 또는 유전자를 추정적으로 확인하기 위해 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 유전자의 뉴클레오티드 서열의 충분한 부분을 포함한다. 일반적으로, 공지의 단백질 또는 유전자에 상동성인 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 추정적으로 확인하기 위하여, 10개 이상의 연속적 아미노산 또는 30개 이상의 뉴클레오티드의 서열이 필요하다. 더욱이, 뉴클레오티드 서열과 관련하여, 20-30개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브가 유전자 확인(예를 들어, 서던 혼성화) 및 분리(예를 들어, 박테리아 콜로니 또는 박테리오파아지 플라크의 원위치 혼성화)의 서열-의존적 방법에 사용될 수 있다. 또한, 12-15개 염기의 짧은 올리고뉴클레오티드는 프라이머를 포함하는 특정 핵산 단편을 얻기 위하여 PCR에서 증폭 프라이머로 사용될 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열의 "상당 부분"은 그 서열을 포함하는 핵산 단편을 특이적으로 확인 및/또는 단리하기 위해 충분한 서열을 포함한다.
당업계에 알려진 바와 같이, 용어 "퍼센트 동일성"은 서열을 비교하여 결정되는, 둘 이상의 폴리펩티드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 당업계에서, "동일성"은 또한 그러한 서열의 스트링 사이의 매치에 의해 결정할 때, 경우에 따라, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련도를 의미한다. "동일성"과 "유사성"은 Computational Molecular Biology(Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York(1988); Biocomputing: Informatics 및 게놈 Projects(Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York(1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I(Griffin, A. M., 및 Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey(1994); Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje, G., ed.) Academic Press(1987); 및 Sequence Analysis Primer(Gribskov, M. 및 Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York(1991)에서 개시된 것들을 포함하지만 이로 한정되지 않는 공지 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험되는 서열 간의 최상의 매치를 제공하도록 디자인된다. 동일성과 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램으로 성문화된다. 서열 정렬 및 퍼센트 동일성 계산은 레이저진(LASERGENE) 생물정보 컴퓨터 계산 세트(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 디엔에이스타, 인크(DNASTAR, Inc.))의 메가라인(Megalign) 프로그램과 같은 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 실행될 수 있다. 서열의 다중 정렬은 디폴트 파라미터(갭 페널티 =10, 갭 길이 페널티=10)를 이용하여 클러스탈 정렬법(Clustal method of alignment)(Higgins et al, CABIOS. 5:151(1989))을 이용하여 실시될 수 있다. 클러스탈법을 이용한 쌍방식 정렬을 위한 디폴트 파라미터는 선택될 수 있다: KTUPLE 1, 갭 페널티=3, 윈도우=5 및 DIAGONALS SAVED=5).
용어 "서열 분석 소프트웨어"는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 분석에 유용한 임의의 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 말한다. "서열 분석 소프트웨어"는 구매가능하거나 독립적으로 개발될 수 있다. 전형적인 서열 분석 소프트웨어는 GCG 프로그램 세트(위스콘신 패키지 버전 9.0, 제네틱스 컴퓨터 그룹(GCG), 미국 위스콘신주 매디슨 소재), BLASTP, BLASTN, BLASTX(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403(1990)), 및 디엔에이스타(디엔에이스타, 인크., 미국 위스콘신주 53715 매디슨 파크 스트리트 1228 에스 소재)를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 본 출원의 맥락에서, 서열 분석 소프트웨어가 분석을 위해 사용될 경우, 분석의 결과는 달리 특정되지 않으면 기준이 된 프로그램의 "디폴트 값"에 기반할 것임이 이해될 것이다. 본 명세서에 사용될 때 "디폴트 값"은 처음에 동기화될 때 소프트웨어에 원래 로딩되는 값 또는 파라미터의 임의의 세트를 의미할 것이다.
DNA의 서열에 관련될 때 "화학적으로 합성된"은 구성요소 뉴클레오티드가 시험관 내에서 조립되었음을 의미한다. DNA의 수동 화학 합성은 잘 확립된 절차를 이용하여 이루어질 수 있거나, 또는 자동 화학 합성이 많은 구매가능한 기계 중 하나를 이용하여 실시될 수 있다. 따라서, 유전자는 숙주 세포의 코돈 편향성(코돈 편향)을 반영하기 위한 뉴클레오티드 서열의 최적화에 기반하여 최적 유전자 발현을 위해 맞추어질 수 있다. 당업자는 코돈 사용이 숙주에 의해 선호되는 코돈에 대해 편향되면 성공적인 유전자 발현이 가능함을 이해한다. 바람직한 코돈의 결정은 서열 정보가 입수가능한 숙주 세포로부터 유래된 유전자의 조사에 기반할 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 둘 이상의 개별 작동가능한 유전자 조절 시스템은 a) 선택된 농도에서, 그 각각의 리간드에 의한 주어진 시스템 각각의 조절이 그 시스템의 유전자의 발현의 양의 측정가능한 변화를 야기할 때, 그리고 b) 변화가 실제 조절의 동시성 또는 순차성에 관계없이, 세포, 조직 또는 유기체에서 동시에 작동가능한 모든 다른 시스템의 발현에서의 변화와 통계적으로 유의하게 상이할 때, "직교"라고 말해진다. 바람직하게는, 각각의 개별적으로 작동가능한 유전자 조절 시스템의 조절은 세포, 조직 또는 유기체 내의 모든 다른 작동가능한 시스템보다 적어도 2배 큰, 예를 들어, 적어도 5배, 10배, 100배, 또는 500배 큰 유전자 발현 변화를 일으킨다. 이상적으로는, 선택된 농도에서 그 각각의 리간드에 의한 주어진 시스템 각각의 조절은 그 시스템의 유전자의 발현 양의 측정가능한 변화를 일으키며 세포, 조직, 또는 유기체에서 작동가능한 모든 다른 시스템의 발현에서 측정가능한 변화를 야기하지 않는다. 그러한 경우에, 다수의 유도성 유전자 조절 시스템은 "완전히 직교"라고 말해진다. 유용한 직교 리간드 및 직교 수용체-기반 유전자 발현 시스템은 미국 특허 출원 공개 2002/0110861 Al호에 개시된다.
용어 "외인성 유전자"는 개체에 외래성인 유전자, 즉, 형질전환 과정을 통해 개체에 도입된 유전자, 내인성 돌연변이 유전자의 비돌연변이 버전 또는 내인성 비돌연변이 유전자의 돌연변이 버전을 의미한다. 형질전환 방법은 본 발명에 중요하지 않으며 당업자에게 알려진 개체에 적합한 임의의 방법일 수 있다. 외인성 유전자는 DNA 형태 또는 역전사효소에 의해서와 같이 DNA 중간체를 통해 기능할 수 있는 RNA 형태로 개체 내로 도입되는 자연 또는 합성 유전자일 수 있다. 그러한 유전자는 표적 세포 내로 도입되거나, 개체 내로 직접 도입되거나, 또는 형질전환된 세포를 개체 내로 옮김으로써 간접적으로 도입될 수 있다.
용어 "치료 생성물"은 그러한 생성물이 발현되는 숙주 세포에 유익한 기능을 부여하는 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드를 말한다. 치료 폴리펩티드는 길이가 3개 아미노산만큼 작은 펩티드, 단일- 또는 다중-쇄 단백질, 및 융합 단백질을 한정됨이 없이 포함할 수 있다. 치료 폴리뉴클레오티드는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA, 리보자임, 및 RNA 외부 가이드 서열(external guide sequences)을 한정됨이 없이 포함할 수 있다. 치료 생성물은 자연 발생 서열, 합성 서열 또는 자연 및 합성 서열의 조합을 포함할 수 있다.
용어 "리간드-의존성 전사 인자 복합체" 또는 "LDTFC"는 하나 이상의 단백질 서브유닛을 포함하는 전사 인자를 말하며, 이 복합체는 본 명세서에 정의되는 바와 같이 "인자-조절된 프로모터"에 의해 구동되는 유전자 발현을 조절할 수 있다. 모델 LDTFC는 "엑디손 수용체 복합체"이며 일반적으로 핵 수용체 패밀리의 적어도 두 구성원, 엑디손 수용체("EcR") 및 울트라스피라클("USP") 단백질을 가진 헤테로이량체성 단백질 복합체를 말한다[Yao et al, Nature 366:476(1993); Yao et al, Cell 71:63(1992)]. EcR 복합체와 같은 기능적 LDTFC는 또한 이뮤노필린(immunophilin)과 같은 추가의 단백질(들)을 포함할 수 있다. 전사 인자로 알려진, 단백질의 핵 수용체 패밀리의 추가 구성원(예를 들어, DHR38, betaFTZ -1 또는 기타 곤충 상동체)은 또한 EcR 및/또는 USP를 위한 리간드 의존성 또는 독립적 파트너일 수 있다. EcR 복합체와 같은 LDTFC는 또한 EcR 단백질과 울트라스피라클 단백질, 레틴산-X-수용체("RXR") 단백질 또는 USP와 RXR의 키메라의 척추동물 상동체의 헤테로이량체일 수 있다. 용어 "LDTFC" 및 "EcR 복합체"는 또한 EcR 단백질 또는 USP의 호모이량체 복합체, 및 단일 폴리펩티드 또는 동일한 기능을 수행하는 삼량체, 사량체 및 다른 다량체를 포함한다.
EcR 복합체와 같은 LDTFC는 EcR을 포함하지만 복합체의 다른 단백질을 배제하지 않는 복합체의 단백질 중 하나에 결합된 활성 엑디스테로이드 또는 비-스테로이드성 리간드에 의해 활성화될 수 있다. EcR 복합체와 같은 LDTFC는 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원인 단백질을 포함하며 여기서, 모든 구성원은 아미노-말단 전사촉진 도메인("AD", "TD", 또는 "TA", 본 명세서에서 상호교환적으로 사용됨), DNA 결합 도메인("DBD"), 및 리간드 결합 도메인("LBD")을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 서브유닛의 존재를 특징으로 한다. AD는 "헤테로이량체화 파트너" 또는 "HP"와의 융합으로 존재할 수 있다. 본 발명의 AD와 HP를 포함하는 융합 단백질은 본 명세서에서 "공동활성화 단백질" 또는 "CAP"로 불린다. DBD와 LBD는 본 명세서에서 "리간드-유도성 전사 인자"("LTF")로 불리는 융합 단백질로 발현될 수 있다.융합 파트너는 링커, 예를 들어, 경첩 영역에 의해 분리될 수 있다. LTF 패밀리의 일부 구성원은 또한 LBD의 카르복시-말단 측에 다른 전사촉진 도메인을 가질 수 있다. DBD는 두 개의 시스테인-징크 핑거의 존재를 특징으로 하며 그 사이에 두 개의 아미노산 모티프인 P-박스와 D-박스가 있으며, 이는 엑디손 반응 요소에 대한 특이성을 부여한다. 이들 도메인은 천연이거나, 변경되거나, 또는 이종성 수용체 단백질의 상이한 도메인들의 키메라일 수 있다.
외인성 유전자, 반응 요소, 및 LDTFC, 예를 들어, EcR 복합체를 구성하는 DNA 서열은 고세균, 원핵 세포, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 또는 다른 장내균, 또는 진핵 세포, 예를 들어, 식물 또는 동물 세포 내로 통합될 수 있다. 하지만, 유전자에 의해 발현된 다수의 단백질은 세균에서 부정확하게 프로세싱되므로, 진핵 세포가 바람직하다. 세포는 단일 세포 또는 다세포 유기체 형태일 수 있다. 외인성 유전자, 반응 요소, 및 수용체 복합체를 위한 뉴클레오티드 서열은 또한, 바람직하게는 담배 모자이크 바이러스와 같은 기능성 바이러스 RNA 형태로, RNA 분자로서 통합될 수 있다. 진핵 세포 중에서, 척추동물 세포가 바람직하며 그 이유는 그들은 EcR을 위한 본 발명의 리간드에 대한 반응을 부여하는 분자가 자연적으로 결핍되기 때문이다. 그 결과, 그들은 본 발명의 리간드에 "실질적으로 불감성"이다. 따라서, 본 발명에 유용한 리간드는 형질전환된 세포, 또는 전체 유기체에 대해 무시할만한 생리학적 또는 기타 효과를 가질 것이다. 따라서, 리간드 자체의 존재에 의해 실질적으로 영향을 받지 않고, 세포가 성장하고 원하는 생성물을 발현할 수 있다.
용어 "엑디손 수용체 복합체"는 일반적으로 핵 수용체 패밀리의 적어도 두 구성원인 엑디손 수용체("EcR")와 울트라스피라클("USP") 단백질을 가진 헤테로이량체성 단백질 복합체를 말한다[Yao et al, Nature 366:476(1993); Yao et al., Cell 71:63(1992)]. 기능성 EcR 복합체는 또한 이뮤노필린과 같은 추가 단백질(들)을 포함할 수 있다. 전사 인자로 알려진, 단백질의 핵 수용체 패밀리의 추가 구성원(예를 들어, DHR38, betaFTZ -1 또는 기타 곤충 상동체)은 또한 EcR 및/또는 USP를 위한 리간드 의존성 또는 독립적 파트너일 수 있다. EcR 복합체는 또한 EcR 단백질과 울트라스피라클 단백질, 레틴산-X-수용체("RXR") 단백질 또는 USP와 RXR의 키메라의 척추동물 상동체의 헤테로이량체일 수 있다. 용어 EcR 복합체는 또한 EcR 단백질 또는 USP의 호모이량체 복합체를 포함한다.
EcR 복합체는 EcR을 포함하지만 복합체의 다른 단백질을 배제하지 않는, 복합체의 단백질 중 하나에 결합된 활성 엑디스테로이드 또는 비-스테로이드성 리간드에 의해 활성화될 수 있다. 본 명세서에 사용될 때, 용어 "리간드"는 EcR-기반 유전자 스위치에 적용될 때, 그안에 코딩된 폴리펩티드의 발현을 자극하기 위해 유전자 스위치를 활성화하는 능력을 가진 작고 용해성인 분자를 설명한다. 리간드의 예는 엑디스테로이드, 예를 들어, 엑디손, 20-하이드록시엑디손, 포나스테론 A, 뮤리스테론 A, 등, 9-시스-레틴산, 레틴산의 합성 유사체, 미국 특허 제6,013,836호; 미국 특허 제5,117,057호; 미국 특허 제5,530,028호; 및 미국 특허 제5,378,726호 및 미국 특허 출원 공개 제2005/0209283호 및 미국 특허 출원 공개 제2006/0020146호에 개시된 것과 같은 N,N'-다이아실하이드라진; 미국 특허 출원 공개 제2004/0171651호에 개시된 옥사다이아졸린; 유럽 출원 제461,809호에 개시된 것과 같은 다이벤조일알킬 시아노하이드라진; 미국 특허 제5,225,443호에 개시된 것과 같은 N-알킬-N,N'-다이아로일하이드라진; 유럽 출원 제234,994호에 개시된 것과 같은 N-아실-N-알킬카르보닐하이드라진; 미국 특허 제4,985,461호에 개시된 것과 같은 N-아로일-N-알킬-N'-아로일하이드라진; 미국 특허 출원 공개 제 2004/0049037호에 개시된 것과 같은 아미도케톤; 및 3,5-다이-tert-부틸-4-하이드록시-N-아이소부틸-벤즈아미드, 8-O-아세틸할파기드, 옥시스테롤, 22(R) 하이드록시콜레스테롤, 24(S) 하이드록시콜레스테롤, 25-에폭시콜레스테롤, T0901317, 5-알파-6-알파-에폭시콜레스테롤-3-설페이트(ECHS), 7-케토콜레스테롤-3-설페이트, 파메솔, 담즙산, 1,1-바이포스포네이트 에스테르, 유충 호르몬 III 등을 비롯한 기타 유사 물질을 한정됨이 없이 포함한다. 본 발명에서 유용한 다이아실하이드라진 리간드의 예는 RG-115819(3,5-다이메틸-벤조산N-(1-에틸-2,2-다이메틸-프로필)-N'-(2-메틸-3-메톡시-벤조일)-히드라지드), RG-115932((R)-3,5-다이메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라지드), 및 RG-115830(3,5-다이메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라지드)를 포함한다. 본 발명의 실시에 유용한 추가의 다이아실하이드라진에 대해서는, 2008년 5월 29일자로 출원된 미국 특허 출원 제12/155,111호, 및 2008년 5월 29일자로 출원된 국제 특허 출원 제PCT/US2008/006757호를 참고한다.
EcR 복합체는 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원인 단백질을 포함하며 여기서, 모든 구성원은 아미노-말단 전사촉진 도메인("TA"), DNA 결합 도메인("DBD"), 및 경첩 영역에 의해 분리된 리간드 결합 도메인("LBD")의 존재를 특징으로 한다. 이 패밀리의 일부 구성원은 또한 LBD의 카르복시-말단 측에 다른 전사촉진 도메인을 가질 수 있다. DBD는 두 개의 시스테인 징크 핑거의 존재를 특징으로 하며, 그 사이에는 두 개의 아미노산 모티프인 P-박스와 D-박스가 있으며, 이들은 엑디손 반응 요소에 대한 특이성을 부여한다. 이들 도메인은 천연, 변경, 또는 이종성 수용체 단백질의 상이한 도메인의 키메라일 수 있다.
외인성 유전자, 반응 요소, 및 EcR 복합체를 구성하는 DNA 서열은 고세균, 원핵 세포, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 또는 다른 장내균, 또는 진핵 세포, 예를 들어, 식물 또는 동물 세포 내로 통합될 수 있다. 하지만, 유전자에 의해 발현된 다수의 단백질은 세균에서 부정확하게 프로세싱되므로, 진핵 세포가 바람직하다. 세포는 단일 세포 또는 다세포 유기체 형태일 수 있다. 외인성 유전자, 반응 요소, 및 수용체 복합체를 위한 뉴클레오티드 서열은 또한, 바람직하게는 담배 모자이크 바이러스와 같은 기능적 바이러스 RNA 형태로, RNA 분자로서 통합될 수 있다. 진핵 세포 중에서, 척추동물 세포가 바람직하며 그 이유는 그들은 EcR을 위한 본 발명의 리간드에 대한 반응을 부여하는 분자가 자연적으로 결핍되기 때문이다. 그 결과, 그들은 본 발명의 리간드에 "실질적으로 불감성"이다. 따라서, 본 발명에 유용한 리간드는 형질전환된 세포, 또는 전체 유기체에 대해 무시할만한 생리학적 또는 기타 효과를 가질 것이다. 따라서, 리간드 자체의 존재에 의해 실질적으로 영향을 받지 않고, 세포가 성장하고 원하는 생성물을 발현할 수 있다.
외인성 유전자(예를 들어, IL-12)에 연결된 반응 요소에 결합되는 EcR 복합체와 사용될 경우, EcR 리간드는 외인성 유전자의 발현의 외부적 시간적 조절을 위한 수단을 제공한다. 다양한 구성요소가 서로, 즉, 수용체 복합체에 리간드가 그리고 반응 요소에 수용체 복합체가, 결합하는 순서는 중요하지 않다. 전형적으로, 외인성 유전자의 발현 조절은 특정 조절, 또는 제어, DNA 요소에의 EcR 복합체의 결합에 대한 반응이다. 핵 수용체 패밀리의 다른 구성원처럼, EcR 단백질은 적어도 3개의 도메인, 전사촉진 도메인, DNA 결합 도메인, 및 리간드 결합 도메인을 보유한다. USP 또는 RXR 단백질과의 헤테로이량체화 후, EcR 단백질의 리간드 결합 도메인에의 리간드의 결합은 헤테로이량체성 단백질의 DNA 결합 도메인이 활성화된 형태의 반응 요소에 결합하도록 하여, 외인성 유전자의 발현 또는 억제를 야기한다. 이 기작은 EcR 또는 USP에의 리간드 결합의 가능성, 및 활성 호모이량체 복합체(예를 들어, EcR+EcR 또는 USP+USP)의 결과적인 형성을 배제하지 않는다. 일 실시 양태에서, 수용체 도메인 중 하나 이상이 변화되어 키메라 유전자 스위치를 생성할 수 있다. 전형적으로, 세 개의 도메인 중 하나 이상은 다른 도메인의 공급원과 상이한 공급원으로부터 선택되어, 키메라 수용체가 전사촉진 활성, 리간드의 상보적 결합, 및 특정 반응 요소의 인식을 위해 선택된 숙주 세포 또는 유기체에서 최적화되도록 할 수 있다. 또한, 반응 요소 자체는 키메라 EcR 복합체를 수용하기 위하여 효모로부터의 GAL-4 단백질 [Sadowski et al, Nature 335:563(1988)] 또는 이. 콜라이로부터의 LexA 단백질 [Brent et al, Cell 43:729(1985)]과 같은 다른 DNA 결합 단백질 도메인을 위한 반응 요소로 변경되거나 치환될 수 있다. 키메라 시스템의 다른 장점은 그들이 원하는 최종 결과에 따라 외인성 유전자를 구동하기 위해 사용되는 프로모터의 선택을 허용한다는 것이다. 그러한 이중 조절은 유전자 치료법 분야에서 특히 중요할 수 있으며, 특히 세포독성 단백질이 생산될 때 특히 중요할 수 있으며, 그 이유는 발현의 타이밍과 발현이 일어나는 세포 둘 모두가 조절될 수 있기 때문이다. 적합한 프로모터에 작동적으로 연결된 외인성 유전자가 개체의 세포 내로 도입될 경우, 외인성 유전자의 발현은 본 발명의 리간드의 존재에 의해 조절된다. 프로모터는 구성적으로 또는 유도적으로 조절될 수 있거나 또는 조직-특이적이거나(즉, 특정 유형의 세포에서만 발현됨) 유기체의 소정 발달 단계에 특이적일 수 있다.
소정의 실시 양태에서, 본 방법에서 개시된 치료적 스위치 프로모터는 구성적이다. 소정의 실시 양태에서, 치료적 스위치 프로모터는 질환, 장애 또는 병태와 관련된 조건 하에서 활성화되며, 예를 들어, 프로모터는 질환에 대한 반응으로, 특정 생리학적, 발생학적, 분화, 또는 병리학적 상태에 대한 반응으로, 및/또는 하나 이상의 특정 생물학적 분자에 대한 반응으로 활성화되고/되거나 프로모터는 특정 조직 또는 세포 유형에서 활성화된다. 소정의 실시 양태에서, 질환, 장애 또는 병태는 치료 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대해 반응성이다. 예를 들어, 소정의 비제한적 실시 양태에서 치료 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 치료, 예방, 완화, 증상을 감소하거나, 진행을 방지하거나, 질환, 장애 또는 병태를 치유하는데 유용하지만, 이들 중 어느 하나 또는 전부를 이룰 필요는 없다. 소정의 실시 양태에서, 질환, 장애 또는 병태와 관련된 조건 하에서 리간드-의존성 전사 인자 복합체의 발현을 허용하기 위하여 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드가 도입된다. 일 실시 양태에서, 치료 방법은 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드가 발현되고 상기 질환, 장애 또는 병태를 치료, 완화 또는 예방하기에 충분한 수준으로 개체에 보급되도록 수행된다. 본 명세서에 사용될 때, "보급되는(disseminated)"은 폴리펩티드가 개체에서 효과 또는 활성을 갖기에 충분하게 변경된 세포로부터 발현되고 방출됨을 의미한다. 보급은 전신성, 국소적 또는 그 사이의 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드는 혈류 또는 림프계를 통해 전신적으로 보급될 수 있다. 대안적으로, 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드는 치료될 조직 또는 기관에서 국소적으로 보급될 수 있다.
전사 인자 및 리포터 단백질과 같은, 다양한 폴리펩티드를 코딩하는 많은 게놈 및 cDNA 핵산 서열이 당업계에 잘 알려져 있다. 당업자는 사실상 모든 공지 유전자에 대한 핵산 서열 정보에 대해 접근가능하며, 서열을 공개한 기관인 공중 기탁기관으로부터 직접 핵산 분자를 입수하거나, 또는 일상적 방법을 이용하여 분자를 제조할 수 있다. 예를 들어, 하기의 서열 수탁 번호의 설명을 참고한다.
유전자 스위치는 특정 리간드의 첨가 또는 제거에 의해 유전자 발현을 조절하는 임의의 유전자 스위치 시스템일 수 있다. 일 실시 양태에서, 유전자 스위치는 유전자 발현의 수준이 존재하는 리간드의 수준에 의존하는 것이다. 본 발명의 유전자 스위치에서 사용될 수 있는 리간드-의존성 전사 인자의 예는 그들의 각 리간드에 의해 활성화된 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원(예를 들어, 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 프로게스틴, 레티노이드, 엑디손, 및 그 유사체와 모방체) 및 테트라사이클린에 의해 활성화된 rTTA를 한정됨이 없이 포함한다. 본 발명의 일 태양에서, 유전자 스위치는 EcR-기반 유전자 스위치이다. 그러한 시스템의 예는 미국 특허 제6.258.603호, 미국 특허 제7,045,315호, 미국 특허 출원 공개 제2006/0014711호, 미국 특허 출원 공개 제07/0161086호, 및 국제 특허 공개 WO 01/70816호에 개시된 시스템을 한정됨이 없이 포함한다. 키메라 엑디손 수용체 시스템의 예는 미국 특허 제7,091,038호, 미국 특허 출원 공개 제2002/0110861호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0033600호, 미국 특허 출원 공개 제2004/0096942호, 미국 특허 출원 공개 제2005/0266457호, 및 미국 특허 출원 공개 제2006/0100416호, 및 국제 특허 공개 WO01/70816호, 국제 특허 공개 WO02/066612호, 국제 특허 공개 WO02/066613호, 국제 특허 공개 WO02/066614호, 국제 특허 공개 WO02/066615호, 국제 특허 공개 WO02/29075호, 및 국제 특허 공개 WO 2005/108617호에 개시된다. 비-스테로이드성 엑디손 작동제-조절 시스템의 예는 레오스위치®(RheoSwitch)(등록상표) 포유동물 유도성 발현 시스템(미국 매사추세츠주 입스위치 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))이다.
일 실시 양태에서, 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터의 조절하에서 리간드-의존성 전사 인자를 코딩하는 단일 전사 인자 서열을 포함한다. 전사 인자 서열은 자연 발생 또는 인공적 전사 인자인 리간드-의존성 전사 인자를 코딩할 수 있다. 인공적 전사 인자는 전사 인자의 자연 서열이 예를 들어, 서열의 돌연변이에 의해 또는 상이한 전사 인자들로부터의 도메인의 조합에 의해 변경된 것이다. 일 실시 양태에서, 전사 인자는 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인(LBD)을 포함한다. 일 실시 양태에서, 그룹 H 핵 수용체 LBD는 EcR, 편재 수용체, 고아 수용체 1, NER-1, 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1, 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15, 간 X 수용체 β, 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질, 간 X 수용체, 간 X 수용체 α, 파르네소이드 X 수용체, 수용체 상호작용 단백질 14, 또는 파르네솔 수용체로부터 온다. 다른 실시 양태에서, 그룹 H 핵 수용체 LBD는 엑디손 수용체로부터 온다.
EcR 및 다른 그룹 H 핵 수용체는 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원이며 여기서, 모든 구성원은 일반적으로 아미노-말단 전사촉진 도메인(TD), DNA 결합 도메인(DBD), 및 경첩 영역에 의해 DBD로부터 분리된 LBD의 존재를 특징으로 한다. 본 명세서에 사용될 때, 용어 "DNA 결합 도메인"은 DNA 결합 도메인이 특정 반응 요소와 연합하기 위해 기능하는 한, DNA 결합 단백질의 최소 폴리펩티드 서열에서 최대 DNA 결합 단백질의 전체 길이까지를 포함한다. 핵 수용체 수퍼패밀리의 구성원은 또한 4개 또는 5개 도메인, A/B, C, D, E, 그리고 일부 구성원에서는 F의 존재를 특징으로 한다 [미국 특허 제4,981,784호 및 Evans, Science 240:889(1988)]. "A/B" 도메인은 전사촉진 도메인에 상응하며, "C"는 DNA 결합 도메인에 상응하며, "D"는 경첩 영역에 상응하며, "E"는 리간드 결합 도메인에 상응한다. 패밀리의 일부 구성원은 또한 "F"에 상응하는 LBD의 카르복시-말단 측 상에 다른 전사촉진 도메인을 가질 수 있다.
DBD는 두 개의 시스테인 징크 핑거의 존재를 특징으로 하며, 그 사이에는 두 개의 아미노산 모티프인 P-박스와 D-박스가 있으며, 이들은 반응 요소에 대한 특이성을 부여한다. 이들 도메인은 천연, 변경, 또는 이종성 수용체 단백질의 상이한 도메인의 키메라일 수 있다. 핵 수용체 패밀리의 서브세트처럼, EcR은 또한 헤테로이량체화 특성을 책임지는 잘 정의되지 않은 영역을 보유한다. 핵 수용체의 도메인은 특성이 모듈성이므로, LBD, DBD, 및 TD는 상호교환될 수 있다.
다른 실시 양태에서, 전사 인자는 TD, 그 발현이 조절될 외인성 유전자와 연합된 반응 요소를 인식하는 DBD, 및 그룹 H 핵 수용체 LBD를 포함한다. 소정의 실시 양태에서, 그룹 H 핵 수용체 LBD는 치환 돌연변이를 포함한다.
다른 실시 양태에서, 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제1 프로모터의 조절하의 제1 전사 인자 서열 및 제2 프로모터의 조절하의 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 여기서, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질은 상호작용하여 리간드-의존성 전사 인자, 즉, "이중 스위치"- 또는 "2-하이브리드"-기반 유전자 스위치로 기능하는 단백질 복합체를 형성한다. 제1 및 제2 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다.
소정의 실시 양태에서, 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터의 조절하에 제1 전사 인자 서열과 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 여기서 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제 2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질은 상호작용하여 리간드-의존성 전사 인자, 즉 "단일 유전자 스위치"로서 기능하는 단백질 복합체를 형성한다. 제1 전사 인자 서열과 제2 전사 인자 서열은 내부 리보좀 진입 부위(IRES)에 의해 연결될 수 있다. IRES는 EMCV IRES일 수 있다.
일 실시 양태에서, 제1 전사 인자 서열은 TD, 그 발현이 조절될 외인성 유전자와 연합된 반응 요소를 인식하는 DBD, 및 그룹 H 핵 수용체 LBD를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하며, 제2 전사 인자 서열은 척추동물 RXR LBD, 무척추동물 RXR LBD, 울트라스피라클 단백질 LBD, 및 두 개의 폴리펩티드 단편을 포함하는 키메라 LBD로부터 선택된 핵 수용체 LBD를 포함하는 전사 인자를 코딩하며, 여기서 제1 폴리펩티드 단편은 척추동물 RXR LBD, 무척추동물 RXR LBD, 또는 울트라스피라클 단백질 LBD로부터 오며, 제2 폴리펩티드 단편은 상이한 척추동물 RXR LBD, 무척추동물 RXR LBD, 또는 울트라스피라클 단백질 LBD로부터 온다.
다른 실시 양태에서, 유전자 스위치는 핵 수용체 LBD 및 그 발현이 조절될 외인성 유전자와 연합된 반응 요소를 인식하는 DBD를 포함하는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 전사 인자 서열, 및 TD와 핵 수용체 LBD를 포함하는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 여기서, 핵 수용체 LBD 중 하나는 그룹 H 핵 수용체 LBD이다. 바람직한 실시 양태에서, 제1 폴리펩티드는 실질적으로 TD가 없으며 제2 폴리펩티드는 DBD가 실질적으로 없다. 본 발명의 목적을 위하여, "실질적으로 없는"은 문제의 단백질이 활성화 또는 결합 활성을 제공하기 위해 문제의 도메인의 충분한 서열을 함유하지 않음을 의미한다.
본 발명의 다른 태양에서, 제1 전사 인자 서열은 헤테로이량체 파트너 및 TD를 포함하는 단백질을 코딩하며 제2 전사 인자 서열은 DBD와 LBD를 포함하는 단백질을 코딩한다.
단지 하나의 핵 수용체 LBD가 그룹 H LBD일 경우, 다른 핵 수용체 LBD는 그룹 H LBD와 이량체를 형성하는 임의의 다른 핵 수용체로부터 올 수 있다. 예를 들어, 그룹 H 핵 수용체 LBD가 EcR LBD일 경우, 다른 핵 수용체 LBD "파트너"는 EcR, 척추동물 RXR, 무척추동물 RXR, 울트라스피라클 단백질(USP), 또는 척추동물 RXR, 무척추동물 RXR, 및 USP로부터 선택된 적어도 2개의 상이한 핵 수용체 LBD 폴리펩티드 단편을 포함하는 키메라 핵 수용체로부터 올 수 있다(국제 특허 공개 WO01/70816 A2호, 국제 특허 출원 PCT/US02/05235호 및 미국 특허 출원 공개 2004/0096942 Al호). "파트너" 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 추가로 절단 돌연변이, 결실 돌연변이, 치환 돌연변이, 또는 다른 변경을 포함할 수 있다.
일 실시 양태에서, 척추동물 RXR LBD는 인간 호모 사피엔스(Homo sapiens), 마우스 무스 무스큘러스 ( Mus musculus ), 랫트 래터스 노르베지쿠스 ( Rattus norvegicus), 닭 갈루스 갈루스 ( Gallus gallus ), 돼지 수스 스크로파 도메스티카 (Sus scrofa domestica ), 개구리 제노푸스 래비스 ( Xenopus laevis ), 제브라피쉬 다니오 레리오 ( Danio rerio ), 멍게 폴리안드로카르파 미사키엔시스 ( Polyandrocarpa misakiensis ), 또는 해파리 트리페달리아 시소포라 ( Tripedalia cysophora) RXR로부터 온다.
일 실시 양태에서, 무척추동물 RXR 리간드 결합 도메인은 메뚜기 로쿠스타 미그라토리아(Locusta migratoria) 울트라스피라클 폴리펩티드("LmUSP"), 참진드기 앰블리옴마 아메리카눔 ( Amblyomma americanum ) RXR 상동체 1("AmaRXRl"), 참진드기 앰블리옴마 아메리카눔 RXR 상동체 2("AmaRXR2"), 농게 세루카 푸지레이터 ( Celuca pugilator) RXR 상동체("CpRXR"), 딱정벌레 테네브리오 모리토르 ( Tenebrio molitor) RXR 상동체("TmRXR"), 꿀벌 아피스 멜리페라 ( Apis mellifera ) RXR 상동체("AmRXR"), 진딧물 미주스 페르시케 ( Myzus persicae ) RXR 상동체("MpRXR"), 또는 비-쌍시류/비-인시류(non-Dipteran/non-Lepidopteran) RXR 상동체로부터 온다.
일 실시 양태에서, 키메라 RXR LBD는 척추동물 종(vertebrate species) RXR 폴리펩티드 단편, 무척추동물 종(invertebrate species) RXR 폴리펩티드 단편, 및 비-쌍시류/비-인시류 무척추동물 종 RXR 상동체 폴리펩티드 단편으로부터 선택된 적어도 2개의 폴리펩티드 단편을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 2개의 상이한 종 RXR 폴리펩티드 단편을 포함할 수 있거나, 종이 동일할 경우, 둘 이상의 폴리펩티드 단편은 그 종 RXR 폴리펩티드 단편의 둘 이상의 상이한 아이소형태로부터 올 수 있다.
일 실시 양태에서, 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 하나의 척추동물 종 RXR 폴리펩티드 단편과 하나의 무척추동물 종 RXR 폴리펩티드 단편을 포함한다.
다른 실시 양태에서, 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 하나의 척추동물 종 RXR 폴리펩티드 단편과 하나의 비-쌍시류/비-인시류 무척추동물 종 RXR 상동체 폴리펩티드 단편을 포함한다.
외인성 유전자에 연결된 반응 요소에 결합되는 핵 수용체(들)의 LBD와 조합될 경우, 리간드는 외인성 유전자의 발현의 외부적 시간적 조절을 제공한다. 본 발명의 다양한 구성요소가 서로, 즉, 예를 들어, LBD에 리간드가, 반응 요소에 DBD가, 프로모터에 TD가 결합하는 결합 기작 또는 순서는 중요하지 않다.
구체적 예에서, 그룹 H 핵 수용체의 LBD와 그 핵 수용체 LBD 파트너에의 리간드의 결합은 외인성 유전자의 발현을 가능하게 한다. 이 기작은 그룹 H 핵 수용체(GHNR) 또는 그 파트너에의 리간드 결합, 및 활성 호모이량체 복합체(예를 들어, GHNR + GHNR 또는 파트너 + 파트너)의 결과적인 형성에 대한 가능성을 배제하지 않는다. 바람직하게는, 수용체 도메인 중 하나 이상이 변화되어 하이브리드 유전자 스위치를 생성한다. 전형적으로, 세 가지 도메인 DBD, LBD 및 TD 중 하나 이상이 다른 도메인의 공급원과 상이한 공급원으로부터 선택되어, 하이브리드 유전자 및 생성되는 하이브리드 단백질이 전사촉진 활성, 리간드의 상보적 결합, 및 특정 반응 요소의 인식에 대해 선택된 숙주 세포 또는 유기체에서 최적화될 수 있다. 또한, 반응 요소 자체는 하이브리드 수용체를 수용하기 위하여 변경되거나, 효모로부터의 GAL-4 단백질[Sadowski et al, Nature 335:563(1988)] 또는 이. 콜라이로부터의 LexA 단백질[Brent et al, Cell 43:729(1985)], 또는 그러한 특이적 상호작용을 위해 디자인되고, 변경되고 선택된 단백질과의 표적화된 상호작용에 대해 특이적인 합성 반응 요소[예를 들어, Kim et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 94:3616(1997)]와 같은 다른 DNA 결합 단백질 도메인을 위한 반응 요소로 치환될 수 있다.
기능적 EcR 복합체는 또한 이뮤노필린과 같은 추가 단백질(들)을 포함할 수 있다. 전사 인자로 알려진, 단백질의 핵 수용체 패밀리의 추가 구성원(예를 들어, DHR38, 또는 betaFTZ - 1)은 또한 EcR, USP 및/또는 RXR을 위한 리간드 의존성 또는 독립적 파트너일 수 있다. 부가적으로, 일반적으로 보조활성화인자(어댑터 또는 매개자로도 불림)로 알려진 단백질과 같은 다른 보조인자가 요구될 수 있다. 이들 단백질은 DNA에 서열-특이적으로 결합하지 않으며 기본 전사에 관여하지 않는다. 그들은 활성화인자의 DNA-결합의 자극, 크로마틴 구조에 영향을 줌으로써, 또는 활성화인자-개시 복합체 상호작용의 매개에 의해서를 비롯한 다양한 기작을 통해 전사 활성화에 그들의 효과를 나타낼 수 있다. 그러한 보조활성화인자의 예는 RIP140, TIF1, RAP46/Bag-1, ARA70, SRC-1/NCoA-1, TIF2/GRIP/NCoA-2, ACTR/AIB1/RAC3/pCIP 및 불규칙 보조활성화인자 C 반응 요소 B 결합 단백질, CBP/p300 [검토를 위해서, Glass et al, Curr. Opin. Cell Biol 9:222(1997)를 참고]를 포함한다. 또한, 보조억제인자로 일반적으로 알려진 단백질 보조인자(억제인자, 사일런서(silencer), 또는 침묵 매개자로도 알려짐)는 리간드의 부재하에서 전사 활성화를 효과적으로 억제하기 위해 요구될 수 있다. 이들 보조억제인자는 반응 요소에서 활성을 침묵시키기 위해 리간드화되지 않은 EcR과 상호작용할 수 있다. 현재의 증거는 리간드의 결합이 수용체의 형태를 변화시켜, 보조억제인자의 방출 및 상기 개시된 보조활성화인자의 보충을 야기하여, 그들의 침묵화 활성을 파기함을 제안한다. 보조억제인자의 예는 N-CoR 및 SMRT를 포함한다[검토를 위해서, Horwitz et al. , Mol Endocrinol. 10:1167(1996)를 참고]. 이들 보조인자는 세포 또는 유기체 내에서 내인성일 수 있으며, 또는 조절 또는 비조절 방식으로 발현될 트랜스유전자로서 외인성으로 첨가될 수 있다.
외인성 유전자는 유전자 스위치에 의해 코딩되는 리간드-의존성 전사 인자의 DBD에 의해 인식되는 적어도 하나의 반응 요소를 포함하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일 실시 양태에서, 프로모터는 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 또는 그 이상 카피의 반응 요소를 포함한다. 원하는 반응 요소를 포함하는 프로모터는 자연 발생 프로모터 또는 당업계에 알려진 기술을 이용하여 생성된 인공적 프로모터, 예를 들어, 최소 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 반응 요소일 수 있다.
면역조절자 예를 들어, IL-12, TNF-알파, 시그널 펩티드, 또는 본 명세서에 임의의 전사 인자를 인코딩하는 유전자는 또한 코돈-최적화될 수 있다. 일 실시 양태에서, 면역 조절자 예를 들어, IL-12, TNF-알파, 시그널 펩티드, 또는 전사 인자의 코딩 영역은 인간에서 발현하도록 코돈-최적화된다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 다양한 핵산 코딩 영역은 유전 코드의 중복성에 기인하여 동일한 폴리펩티드를 인코딩할 것이다. 임의의 폴리펩티드 쇄의 아미노산을 인코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오티드 서열에서 편차는 유전자를 코딩하는 서열에서 변이를 허용한다. 각각의 코돈이 세 개의 뉴클레오티드로 구성되기 때문에, 그리고 DNA를 구성하는 뉴클레오티드가 네 개의 특정 염기로 제한되기 때문에, 64개의 가능한 뉴클레오티드의 조합이 있으며, 그 중 61개가 아미노산을 인코딩한다(나머지 세 개의 코돈은 번역을 종결하는 시그널을 인코딩함). 어느 코돈이 어느 아미노산을 인코딩하는지 보여주는 "유전 코드"는 표 4에서와 같이 본 명세서에서 재생성한다. 결과로서, 수많은 아미노산이 하나 보다 많은 코돈으로서 표기된다. 예를 들어, 아미노산 알라닌 및 프롤린은 네 개의 트리플렛에 의해, 세린 및 아르기닌은 여섯 개의 트리플렛에 의해 코딩되며, 반면 트립토판 및 메티오닌은 단지 한 개의 트리플렛에 의해 코딩된다. 이런 축퇴성은 DNA 염기 조성이 DNA에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시키지 않고 폭넓은 범위로 다양화하도록 허용한다.
[표 4] 표준 유전 코드
Figure 112017107941059-pat00017
본 발명에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드는 사용되는 코돈에 관계없이 본 발명의 범위에 속하는 것으로 이해될 것이다.
수많은 유기체는 특정 코돈의 사용을 위한 편향성을 나타내며 커지는 폴리펩티드 쇄에서 특정 아미노산을 삽입하도록 코딩한다. 유기체 사이에 코돈 선호 또는 코돈 편향, 코돈 사용법에서 상이성은 유전적 코드의 축퇴에 의해 제공되며 수 많은 유기체들 사이에 널리 기록되어 있다. 코돈 편향은 종종 그 중에서 결과적으로 번역되는 코돈의 특성 및 특정 전이 RNA(tRNA) 분자의 효용성에 연관이 있다고 여겨지는 메신저 RNA(mRNA)의 번역의 효율과 관련이 있다. 세포에서 선별된 tRNA의 우위는 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 흔히 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기반한 주어진 유기체에서 최적 유전자 발현을 위해 조작될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 주어진 종의 유전자에서 사용하기 위해 바람직한 DNA 서열로 코돈을 통합함으로써 제조될 수 있다.
동물, 식물 및 미생물 종의 넓은 다양성에 대해 입수가능한 유전자 서열의 큰 수를 고려할 때, 코돈 용법의 상대적인 빈도를 계산하는 것이 가능하다. 코돈 용법 표는 예를 들어, http://www.kazusa.or.jp/codon/(2006년 5월 30일에 접속함)에서 입수가능한 "코돈 용법 데이터베이스"에서 용이하게 입수 가능하며, 이들 표는 다양한 방법으로 적용할 수 있다.[Nakamura, Y., et al., Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000 Nucl . Acids Res. 28:292(2000)]를 참고하라. 젠뱅크 릴리즈 151.0로부터 계산된 인간에 대한 코돈 용법 표는, 표 5(상기 http://www.kazusa.or.jp/codon/으로부터)와 같이 하기 재생산되어 있다. 이들 표는 mRNA 명명법을 사용하며, 따라서 DNA에서 발견되는 티민(T)대신에, 표는 RNA에서 발견되는 우라실(U)을 사용한다. 표는 조정되어 빈도는 모든 64개 코돈에 대해서 보다는, 각각의 아미노산에 대해 계산된다.
[표 5] 인간 유전자(호모 사피엔스)에 대한 코돈 용법 표
Figure 112017107941059-pat00018
Figure 112017107941059-pat00019
이들 또는 유사한 표를 활용함으로써, 당업자는 임의의 주어진 폴리펩티드 서열에 빈도를 적용할 수 있으며, 폴리펩티드를 인코딩하나, 주어진 종에 대해 코돈 최적화를 사용하는, 코돈-최적화된 코딩 영역의 핵산 단편을 생성할 수 있다.
당업자에게 잘 알려진 표준 및 규칙적인 분자 생물학적 조작을 사용하는, 다수의 옵션이 상기 기술된 임의의 방법에 의해 고안된 코돈-최적화된 코딩 영역을 합성하는데 이용가능하다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 벡터에서 면역조절자 예를 들어, TNF-알파를 인코딩하는 코딩 영역이 코돈-최적화된다. 다른 실시 양태에서, 코딩 영역은 인간에서 발현을 위해 코돈-최적화된다. 특정 실시 양태에서, 본 발명에 TNF-알파는 코돈-최적화된 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
생체 내 또는 생체 외에서 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위하여, 벡터를 사용할 수 있다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드 벡터 또는 단일- 또는 이중-가닥 RNA 또는 DNA 바이러스 벡터일 수 있다. 그러한 벡터는 그를 필요로 하는 개체, 예를 들어 포유 동물의 세포 내로 DNA 및 RNA를 도입하기 위해 잘 알려진 기술에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 바이러스 벡터는 복제 가능하거나 복제 결함성일 수 있다. 후자의 경우에는, 바이러스 증식은 일반적으로 보완성 숙주 세포에서만 일어날 것이다. 본 명세서에 사용될 때, 용어 "숙주 세포" 또는 "숙주"는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 하나 이상을 보유한 본 발명의 세포를 의미하기 위해 사용된다.
따라서, 최소한, 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함해야 한다. 벡터의 다른 구성요소는 선발가능한 마커, 크로마틴 변경 도메인, 벡터에 또한 존재할 수 있는 다른 폴리펩티드(예를 들어, 치사(lethal) 폴리펩티드)의 발현을 구동시키는 추가의 프로모터, 게놈 통합 부위, 재조합 부위, 및 분자 삽입 중심점을 포함할 수 있지만 이로 한정되는 것은 아니다. 벡터는 폴리뉴클레오티드 내에 또는 폴리뉴클레오티드 바깥에 이들 추가 요소를 임의의 수로 포함하여, 벡터가 원하는 치료 방법의 특정 목표에 맞춰질 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 세포 내로 도입되는 벡터는 추가로 "선발가능한 마커 유전자"를 포함하며, 이것은 발현될 경우, 본 발명의 유전자 스위치 구조체가 숙주 세포의 게놈 내로 통합되었음을 나타낸다. 이러한 방식에서, 선택자 유전자는 게놈 통합에 대한 긍정적 마커일 수 있다. 본 발명의 방법에 중요하지 않지만, 선발가능한 마커 유전자의 존재는 벡터 구조체가 세포의 게놈 내로 통합된 살아있는 세포의 집단을 실무자가 선발하도록 한다. 따라서, 본 발명의 소정의 실시 양태는 벡터가 성공적으로 통합된 세포를 선발하는 것을 포함한다. 본 명세서에 사용될 때, 용어 "선발하다" 또는 그 변형은, 세포와 함께 사용될 경우, 특정 유전적 구성 또는 표현형을 가진 세포를 선발하기 위한 표준 공지 방법을 의미하고자 한다. 전형적인 방법은 G418, 네오마이신 및 암피실린과 같은 항생제의 존재 하에서 세포를 배양하는 것을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다. 선발가능한 마커 유전자의 다른 예는 다이하이드로폴레이트 리덕타아제, 하이그로마이신 또는 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 다른 선발 방법은 티미딘 키나아제, 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 또는 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제를 선발제로 사용하도록 하는 선발가능한 마커 유전자를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 항생제 내성 유전자 또는 유전자들을 포함하는 벡터 구조체를 포함하는 세포는 이어서 배양에서 항생제를 견딜 수 있을 것이다. 유사하게, 항생제 허용성 유전자 또는 유전자들을 포함하는 벡터 구조체를 포함하지 않는 세포는 배양에서 항생제를 견디지 못할 것이다.
본 명세서에 사용될 때, "크로마틴 변경 도메인"(CMD)은 DNA 인슐레이터(insulator)와 같은, 그러나 이로 한정되지 않는, 크로마틴 구조를 유지 및/또는 변경하는 것과 관련된 다양한 단백질과 상호작용하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. [Ciavatta et al, Proc. Nat'l Acad. ScL U.S.A ., 103:9958(2006) 참고]. CMD의 예는 닭 β-글로불린 인슐레이터 및 닭 과민성 부위 4(cHS4)를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 하나 이상의 유전자 프로그램(즉, 프로모터, 코딩 서열, 및 3' 조절 영역) 사이에서 상이한 CMD 서열의 사용은 예를 들어, 존재하는 다유전자적 및 단일유전자적 셔틀 벡터 사이에서 유전자 프로그램을 "교환(swap)"하기 위해 다양한 미생물 또는 시험관 내 리컴비니어링(recombineering) 기술과 조합하여 "미니 상동성 암(arm)"으로서 차등적 CMD DNA 서열의 사용을 촉진할 수 있다. 크로마틴 변경 도메인의 다른 예는 당업계에 알려져 있거나 쉽게 확인될 수 있다.
본 발명의 벡터에서 폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은 면역조절자 예를들어, TNF-알파의 분비를 지시하는, 분비성 또는 시그널 펩티드를 인코딩하는 추가적인 코딩 영역과 관련될 수 있다. 시그널 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은 거친 세포질세망을 거쳐 성장 단백질 쇄의 배출이 개시되면 성숙한 단백질로부터 절단되는 시그널 펩티드 또는 분비성 리더 서열을 가진다. 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드는 일반적으로 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙한" 형태를 생성하기 위해 완전 또는 "전체-길이" 폴리펩티드로부터 절단되는, 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 시그널 펩티드를 가진다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 벡터는 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된 적어도 하나의 전사 인자 서열 - 이때 상기 적어도 하나의 전사 인자 서열은 리간드-의존성 전사 인자를 인코딩함 - 및 (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 작동가능하게 연결된 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 면역조절자의 기능을 갖는 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드가 추가로 시그널 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 시그널 펩티드는 면역조절자의 천연 시그널 펩티드 유전자, 예를 들어 TNF-알파 야생형 시그널 펩티드 유전자를 포함하는 벡터와 비교할 때, 벡터에 의해 인코딩된 면역조절자 예를 들어, TNF-알파의 분비를 증가시킨다. 특히, 본 발명에서 사용된 시그널 펩티드는 코돈-최적화될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 시그널 펩티드는 IL-2 야생형 시그널 펩티드 유전자에 의해 인코딩된다. 추가의 특정 실시 양태에서, 시그널 펩티드는 코돈-최적화된 IL-2 시그널 펩티드 유전자에 의해 인코딩된다.
본 발명의 벡터는 다양한 조절 영역, 예를 들어 5' 비번역된 영역(5' UTR), 3'UTR, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 다양한 조절 영역을 사용해 개선된 분비, 단백질 번역, 번역-후, mRNA 전사, 또는 전사-후 공정을 유도하는 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 유전자의 "5' 비번역된 영역" 또는 "5'UTR"은 프라이머리 RNA 전사체(pre-mRNA)로 전사되는 유전자의 부분이며 그 부분은 코딩 서열의 상류에 위치하는 것으로 이해된다. 프라이머리 RNA 전사체는 DNA 전사에 의해 생성된, 인트론 및 엑손을 함유하는 초기 RNA 생성물이다. 수많은 프라이머리 전사체는 반드시 RNA 프로세싱을 거쳐 생물학적으로 활성인 RNA 종을 형성한다. 성숙한 mRNA로의 프로세싱은 말단의 손질, 인트론의 제거, 그들의 전구 RNA로부터의 각각의 rRNA 분자의 캡핑 및/또는 컷팅 아웃을 포함한다. mRNA의 5'UTR은 따라서 단백질로 번역되지 않은 mRNA의 부분이며 코딩 서열의 상류에 위치한다. 게놈 서열에서, 5' UTR은 전형적으로 전사 개시 부위와 시작 코돈 사이에 영역으로서 정의된다. 척추동물 mRNA의 5' 비번역된 영역(5' UTR)은 길이가 수십 개의 염기 내지 수 백개의 염기일 수 있다(Crowe et al., 2006 BMC Genomics 7:16). 본 명세서에 사용된 5'UTR은 자연적으로 발생하거나 변경되어 자연에서 인접하지 않는 하나 이상의 핵산을 함유할 수 있고/있거나, 치환, 삽입, 및 결실 및 그의 조합을 포함할 수 있다. 일 실시 양태에서, 5'UTR 서열은 야생형 TNF-알파 서열 또는 5U2 서열로부터 유래된다. 다른 실시 양태에서, 5'UTR 서열은 5U2의 5'UTR이다. 일부 실시 양태에서, 5' UTR은 개선된 단백질 발현, 예를 들어 mRNA 전사, 전사-전, 또는 전사-후를 유도한다.
본 발명에 사용된 3' 비번역된 영역(UTR)은 코딩 서열의 하류에 위치된 DNA 서열(3')을 나타내며 폴리아데닐화[폴리(A)] 인식 서열 및 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 시그널을 인코딩하는 다른 서열을 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 시그널은 일반적으로 mRNA 전구체의 3' 말단에 폴리아데닐산 트랙트(tract)의 첨가에 영향을 미치는 것에 의해 특성화된다. 임의의 적합한 폴리아데닐화 서열이 사용될 수 있는데, 합성된 최적화된 서열 뿐만아니라 BGH(소과 성장 호르몬), 폴리오마 바이러스, TK(티미딘 키나아제), EBV(엡스타인 바 바이러스), 및 인간 파필로마바이러스 및 BPV(소과 파필로마 바이러스)를 포함하는 파필로마바이러스의 폴리아데닐화 서열이 포함된다. 특정 실시 양태에서, 3' 조절 영역은 SV40e(인간 사르코마 바이러스-40) 폴리아데닐화 서열이다. 다른 특정한 실시 양태에서, 3' 조절 영역은 인간 성장 호르몬의 폴리아데닐화 서열이다.
소정의 실시 양태에서, 시그널 펩티드 및/또는 조절 영역 단독 또는 조합은 시그널 펩티드 및/또는 조절 영역을 함유하지 않는 대조군과 비교할 때, 단백질 분비, 전사, 또는 번역이 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10 배, 50 배, 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 또는 500 배 개선될 수 있다. 단백질 예를 들어, TNF-알파의 분비 수준은 야생형 유전자를 갖는 벡터에 의해 인코딩된 단백질 발현으로 정상화될 수 있다. 본 발명의 다른 소정의 실시 양태에서, 시그널 펩티드 및/또는 조절 영역 단독 또는 조합은 면역조절자 예를 들어, TNF-알파의 생산성을 약 5% 내지 약 10%, 약 11% 내지 약 20%, 약 21 % 내지 약 30%, 약 31 % 내지 약 40%, 약 41 % 내지 약 50%, 약 51 % 내지 약 60%, 약 61 % 내지 약 70%, 약 71 % 내지 약 80%, 약 81 % 내지 약 90%, 약 91% 내지 약 100%, 약 101% 내지 약 149%, 약 150% 내지 약 199%, 약 200% 내지 약 299%, 약 300% 내지 약 499%, 또는 약 500% 내지 약 1000% 향상시킨다. 소정의 실시 양태에서, 본 발명은 면역조절자 예를 들어, TNF-알파를 조건부로 발현하는 벡터를 포함하며, 여기서 상기 벡터는 5U2의 5' UTR, IL-2 시그널 펩티드를 인코딩하는 코돈-최적화된 핵산 서열, 면역조절자 예를 들어, TNF-알파를 인코딩하는 코돈-최적화된 코돈 영역, 및 SV40e 또는 인간 성장 호르몬의 폴리아데닐화 시그널을 포함한다.
추가의 실시 양태에서, 본 발명의 벡터는 서열 번호 47(벡터 43318), 서열 번호 48(벡터 43319), 서열 번호 49(벡터 43320), 서열 번호 50(벡터 43321), 서열 번호 51(벡터 43322), 서열 번호 52(벡터 43323), 서열 번호 53(벡터 43324), 서열 번호 54(벡터 43325), 서열 번호 55(벡터 43326), 서열 번호 56(벡터 43327), 서열 번호 57(벡터 43328), 및 서열 번호 58(벡터 43329)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 소정의 실시 양태에서, 벡터는 서열 번호 52(벡터 43323) 또는 서열 번호 58(벡터 43329)의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명에서 사용하기 위한 구체적 벡터는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 발현 벡터이다. 일반적으로, 그러한 벡터는 발현될 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된, 숙주에서의 발현을 위해 효과적인 시스 (cis)-작용성 조절 영역을 포함한다. 적절한 트랜스(trans)-작용 인자는 숙주에 의해 공급되거나, 보완적 벡터에 의해 공급되거나 숙주 내로의 도입시에 벡터 자체에 의해 공급된다.
단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위해 매우 다양한 발현 벡터가 사용될 수 있다. 그러한 벡터는 염색체, 에피좀 및 바이러스-유래 벡터, 예를 들어, 세균 플라스미드로부터, 박테리오파아지로부터, 효모 에피좀으로부터, 효모 염색체 요소로부터, 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스, 바큘로바이러스, 파포바 바이러스, 예를 들어, SV40, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 가성광견병 바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 벡터, 및 그 조합으로부터 유래된 벡터, 예를 들어, 플라스미드와 박테리오파아지 유전 요소로부터 유래된 것, 예를 들어, 코스미드 및 파지미드를 포함한다. 모두가 본 발명의 이 태양에 따라 발현을 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 숙주에서 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 유지, 증식 또는 발현하기에 적합한 임의의 벡터가 이와 관련하여 발현을 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 바이러스 벡터는 아데노바이러스-기반 벡터, 레트로바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)-기반 벡터, 파르보바이러스-관련 벡터, 예를 들어 아데노-연관 바이러스(AVV)-기반 벡터, 및 AVV-아데노바이러스 키메라 벡터를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 바이러스 벡터는, 예를 들어 [Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989), 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates 및 John Wiley & Sons, New York, N.Y.(1994)]에 기술된 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 아데노바이러스(Ad)는 생체 내에서 다양한 상이한 표적 세포 타입에 DNA를 효과적으로 전달하는 36 kb 이중-가닥 DNA 바이러스이다. 아데노바이러스 벡터는 높은 역가로 생성될 수 있으며 복제하는 및 비-복제 세포에 DNA를 효과적으로 전달할 수 있다. 아데노바이러스 벡터 게놈은 벡터 DNA의 근원으로서 임의의 종, 균주, 서브타입, 종들의 혼합, 균주들, 또는 서브타입들, 또는 키메라 아데노바이러스를 사용하여 제조될 수 있다. 아데노바이러스의 근원으로서 적용될 수 있는 아데노바이러스 스톡은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, Manassas, Va.)로부터, 또는 임의의 다른 근원으로부터의 입수가능한 아데노바이러스의 임의의 다른 혈청형으로부터 현재 입수가능하다. 예를 들어, 아데노바이러스는 서브그룹 A(예를 들어, 혈청형 12, 18, 및 31), 서브그룹 B(예를 들어, 혈청형 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 및 35), 서브그룹 C(예를 들어, 혈청형 1, 2, 5, 및 6), 서브그룹 D(예를 들어, 혈청형 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39, 및 42-47), 서브그룹 E(세로타입 4), 서브그룹 F(혈청형 40 및 41), 또는 임의의 다른 아데노바이러스 혈청형의 것일 수 있다. 인간 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 게놈이 완전한 시퀀싱이 주어지는 경우, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 Ad5 혈청형에 대하여 본 명세서에 기술된다. 아데노바이러스 벡터는 세포에서 성장할 수 있는 임의의 아데노바이러스 벡터일 수 있으며, 아데노바이러스의 게놈으로부터 유래되거나 이에 기반한 일부 중요한 부분(필수적으로 실질적이지 않더라도)에 있다. 아데노바이러스 벡터는 임의의 적합한 야생형 아데노바이러스에 기반될 수 있다. 소정의 실시 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 그룹 C의 야생형 아데노바이러스의 게놈, 특히 혈청형 2 또는 5로부터 유래된 것이다. 아데노바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 출원 제5,559,099호, 제5,712,136호, 제5,731,190호, 제5,837,511호, 제5,846,782호, 제5,851,806호, 제5,962,311호, 제5,965,541호, 제5,981,225호, 제5,994,106호, 제6,020,191호, 및 제6,113,913호, 국제 특허 공개 WO 95/34671, WO 97/21826, 및 WO 00/00628, 및 [Thomas Shenk, "Adenoviridae 및 their Replication," 및 M. S. Horwitz, "Adenoviruses," Chapters 67 및 68, respectively, in Virology, B. N. Fields et al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York(1996)]에 기술되어 있다.
다른 실시 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 복제-결핍성이다. 본 명세서에 사용된 용어 "복제-결핍성"은 아데노바이러스 벡터가 적어도 하나의 복제-필수적 유전자 기능이 결핍된 게놈을 포함하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 유전자, 유전자 기능, 또는 유전자 또는 게놈 영역에서 결핍은 유전자의 핵산 서열이 전체 또는 일부분이 결실되어 유전자의 기능이 폐기 또는 손상되도록 하는 바이러스 게놈의 충분한 유전적 정보의 결실로서 정의된다. 복제-필수적 유전자 기능은 복제-결핍성 아데노바이러스 벡터의 복제(즉, 증식)에 필요한 이들 유전자 기능이다. 복제-필수적인 유전자 기능은 예를 들어, 아데노바이러스 초기 영역(예를 들어, E1, E2, 및 E4 영역), 후기 영역(예를 들어, L1-L5 영역), 바이러스 패키징(예를 들어, IVa2 유전자)과 관련된 유전자, 및 바이러스-관련 RNA(예를 들어, VA-RNA I 및/또는 VA-RNA II)에 의해 인코딩된다. 또 다른 실시 양태에서, 복제-결핍성 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 하나 이상의 영역의 적어도 하나의 복제-필수적인 유전자 기능이 결핍된 아데노바이러스 게놈(예를 들어, 아데노바이러스 게놈의 둘 이상의 영역이 복제-결핍성 아데노바이러스 벡터를 증식시키도록 하는)을 포함한다. 아데노바이러스 게놈의 하나 이상의 영역은 E1, E2, 및 E4 영역으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 복제-결핍성 아데노바이러스 벡터 E1 영역(E1-결핍 아데노바이러스 벡터로 나타냄)의 적어도 하나의 복제-필수적인 유전자 기능의 결핍, 특히 아데노바이러스 E1A 영역 및 아데노바이러스 E1B 영역 각각의 복제-필수적인 유전자 기능의 결핍을 포함한다. E1 영역의 이러한 결핍에 추가로, 재조합 아데노바이러스는 또한 국제 특허 출원 WO 00/00628에서 논의된 바와 같이, 주요 후기 프로모터(MLP)에서 돌연변이를 가진다. 특정 실시 양태에서, 벡터는 E1 영역의 적어도 하나의 복제-필수적인 유전자 기능 및 비필수적 E3 영역의 적어도 부분이 결핍된다(예를 들어, E3 영역의 Xba I 결실)(E1/E3-결핍 아데노바이러스 벡터로 나타냄).
소정의 실시 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 "다중 결핍이다,"는 아데노바이러스 벡터가 아데노바이러스 게놈의 둘 이상의 영역 각각에서 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 유전자 기능이 결핍됨을 의미한다. 예를 들어, 전술된 E1-결핍 또는 E1/E3-결핍 아데노바이러스 벡터는 E4 영역의 적어도 하나의 복제-필수적인 유전자 기능이 추가로 결핍될 수 있다(E1/E4-결핍 아데노바이러스 벡터로 나타냄). 전체 E4 영역이 결실된 아데노바이러스 벡터는 더 낮은 숙주 면역 반응을 유도할 수 있다.
대안적으로, 아데노바이러스 벡터는 E1 영역의 모두 또는 일부분 및 E2 영역의 모두 또는 일부분에서 복제-필수적인 유전자 기능이 결핍된다(E1/E2-결핍 아데노바이러스 벡터로 나타냄). E1 영역의 모두 또는 일부분, E2 영역의 모두 또는 일부분, 및 E3 영역의 모두 또는 일부분에서 복제-필수적인 유전자 기능이 결핍된 아데노바이러스 벡터가 또한 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터가 E2A 영역의 복제-필수적인 유전자 기능이 결핍된 경우, 벡터는 길이가 약 230 염기 쌍 미만인, E2A 영역의 완전한 결실을 포함하지 않는다. 일반적으로, 아데노바이러스의 E2A 영역은 DBP(DNA 결합 단백질), DNA 복제에 필요한 폴리펩티드를 코딩한다. DBP는 바이러스 혈청형에 따라 473 내지 529개 아미노산으로 구성된다. DBP는 확장된 Nt 도메인을 가진 구형의 Ct로 구성되는 편장형 타원면(prolate ellipsoid)으로서 존재하는 비대칭적인 단백질로 여겨진다. 연구들은 Ct 도메인이 핵산에 결합하기 위한, 아연에 결합하기 위한 DBP의 능력 및 DNA 쇄 신장의 수준에서 DNA 합성의 기능에 역할을 하는 것을 나타낸다. 그러나, 전사 및 전사-후 수준 모두에서 후기 유전자 발현에 기능을 하는 것으로 여겨지는 Nt 도메인은 단백질의 효과적인 핵 국소화에 역할을 하고, 또한 그 자신의 발현에 연관될 수 있는 것으로 여겨진다. 아미노산 2 내지 38 사이에 Nt 도메인의 결실은 이들 영역이 DBP 기능에 대해 중요함을 나타내고 있다(Brough et al., Virology, 196, 269-281(1993)). DBP의 Ct 영역에 대해 코딩하는 E2A 영역에서 결실은 바이러스 복제에 대해 어떠한 효과도 없는 반면에, DBP의 Nt 도메인의 아미노산 2 내지 38에 대해 코딩하는 E2A 영역에서 결실은 바이러스 복제를 손상시킨다. 일 실시 양태에서, 다중 복제-결핍성 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스의 E2A 영역의 이런 부분을 포함한다. 특히, 예를 들어, 보유될 바람직한 E2A 영역의 부분은 E2A 영역의 5' 말단에 의해 정의된 아데노바이러스 게놈의 E2A 영역의 부분 구체적으로 혈청형 아데노바이러스 게놈의 E2A 영역의 위치 Ad5(23816) 내지 Ad5(24032)이다.
아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 초기 영역만, 아데노바이러스 게놈의 후기 영역만, 및 아데노바이러스 게놈의 초기 및 후기 영역 모두의 복제-필수적인 유전자 기능이 결핍될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 전체 아데노바이러스 게놈이 필수적으로 제거될 수 있는데, 이 경우 적어도 바이러스 역 말단 반복(Inverted Terminal Repeat)(ITR) 및 하나 이상의 프로모터 또는 바이러스 ITRs 및 패키징 시그널이 온전히 남겨진다(즉, 아데노바이러스 엠플리콘). 바이러스 게놈이 제거되는 영역이 클수록, 더 큰 조각의 외인성 핵산 서열이 게놈으로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 게놈이 36 kb로 주어지면, 바이러스 ITR 및 하나 이상의 프로모터가 온전히 남겨짐으로써, 아데노바이러스의 외인성 삽입 능력이 대략 35 kb이다. 대안적으로, 단지 ITR 및 패키징 시그널만을 함유하는 다중 결핍 아데노바이러스 벡터는 약 37-38 kb의 외인성 핵산 서열의 삽입을 효과적으로 가능케한다. 물론, 임의의 또는 모든 결핍 아데노바이러스 영역에서 스페이서 요소의 혼입은 큰 삽입체에 대한 아데노바이러스 벡터의 능력을 감소시킬 것이다. 다중 결핍 아데노바이러스 벡터를 포함하는, 복제-결핍성 아데노바이러스 벡터는 미국 특허 제5,851,806호 및 제5,994,106호 및 국제 특허 공개 WO 95/34671 및 WO 97/21826에 개시되어 있다. 일 실시 양태에서, 본 발명에서 사용을 위한 벡터는 국제 특허 출원 PCT/US01/20536에 개시된 것이다.
아데노바이러스 벡터의 상이한 영역의 결실은 포유동물의 면역 반응을 변경시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있을 것이다. 특히, 상이한 영역의 결실은 아데노바이러스 벡터에 의해 생성된 염증 반응을 감소시킬 있다. 게다가, 아데노바이러스 벡터의 외피 단백질은 국제 특허 공개 WO 98/40509에 기술된 바와 같이, 야생형 외피 단백질에 대해 지시된 항체를 중성화함으로써 인식되는 아데노바이러스 벡터의 능력 또는 비능력을 감소시키도록 변경될 수 있다.
아데노바이러스 벡터는, 특히 E1 및 E4 영역의 복제-필수적인 유전자 기능에서, 다중 복제-결핍성의 경우, 단일 복제 결핍 아데노바이러스 벡터 특히 E1 영역에서 결핍을 포함하는 아데노바이러스 벡터에 의해 얻어진 것과 유사한 보완성 세포주에서 바이러스 성장을 제공하기 위한 스페이서 요소를 포함할 수 있다. 스페이서 요소는 임의의 서열 또는 바라는 길이의 서열을 함유할 수 있다. 스페이서 요소 서열은 아데노바이러스 게놈에 따라 코딩 또는 비-코딩 및 천연 또는 비-천연일 수 있으나, 결핍 영역에 대해 복제-필수적인 기능을 복구하지 않는다. 스페이서의 부재에서, 섬유 단백질의 생성 및/또는 다중 복제-결핍성 아데노바이러스 벡터의 바이러스 성장은 단일 복제-결핍성 아데노바이러스 벡터의 것과 비교하여 감소된다. 그러나, 적어도 하나의 결핍 아데노바이러스 영역 바람직하게는 E4 영역에서 스페이서의 혼입은, 섬유 단백질 생성 및 바이러스 성장에서 이 감소에 대응할 수 있다. 아데노바이러스 벡터에서 스페이서의 사용은 미국 특허 제5,851,806호에서 기술되어 있다.
아데노바이러스 벡터의 작제는 당업계에 잘 알려져 있다. 아데노바이러스 벡터는, 예를 들어, 미국 특허 제5,965,358호 및 국제 특허 공개 WO 98/56937, WO 99/15686, 및 WO 99/54441에 제시된 방법을 사용해 작제 및/또는 정제될 수 있다. 아데노바이러스 유전자의 생성은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 [Sambrook et al., supra, Watson et al., supra, Ausubel et al., supra,] 및 본 명세서에 언급된 다른 다수의 참조에서 기술된 것과 같은 표준 분자 생물학적 기술을 사용하는 것을 수반한다.
*복제-결핍성 아데노바이러스 벡터는 전형적으로 높은 역가의 바이러스 벡터 스톡을 만들어내기 위해 적절한 수준에서, 복제-결핍성 아데노바이러스 벡터에 존재하지 않지만 바이러스 증식을 위해 필요한, 유전자 기능을 제공하는 보완성 세포주에서 생성된다. 일 실시 양태에서, 세포주는 복제-결핍성 아데노바이러스에 존재하지 않는 적어도 하나 및/또는 모든 복제-필수적인 유전자 기능에 대하여 보완한다. 보완성 세포주는 모든 아데노바이러스 기능을 포함하는(예를 들어, 단지 역 말단 반복(ITR) 및 패키징 시그널 또는 단지 ITR 및 아데노바이러스 프로모터와 같은, 최소한의 아데노바이러스 서열을 포함하는, 아데노바이러스 앰플리콘의 증식이 가능하도록), 초기 영역, 후기 영역, 바이러스 패키징 영역, 바이러스-관련 RNA 영역, 또는 그의 조합에 의해 인코딩된 적어도 하나의 복제-필수적인 유전자 기능의 결핍에 대해 보완할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 보완성 세포주는 아데노바이러스 게놈의 E1 영역의 적어도 하나의 복제-필수적인 유전자 기능(예를 들어, 둘 이상의 복제-필수적인 유전자 기능)의 결핍 특히 E1A 및 E1B 영역 각각의 복제-필수적인 유전자 기능이 결핍에 대해 보완할 수 있다. 추가로, 보완성 세포주는 E2의 적어도 하나의 복제-필수적인 유전자 기능(특히 아데노바이러스 DNA 폴리머라제 및 말단 단백질에 대한) 및/또는 아데노바이러스 게놈의 E4 영역의 결핍에 대해 보완할 수 있다. 바람직하게, E4 영역에서 결핍에 대해 보완하는 세포는 E4-ORF6 유전자 서열을 포함하고 E4-ORF6 단백질을 생성한다. 그러한 세포는 바람직하게 아데노바이러스 게놈의 E4 영역의 적어도 ORF6 및 어떠한 다른 ORF를 포함한다. 세포주는 아데노바이러스 벡터와 비-중첩 방식으로 보완성 유전자를 함유하여, 세포 DNA와 벡터 게놈의 재조합 가능성을 최소화, 및 실질적으로 제거하는 것을 추가로 특징으로 하는 것이 바람직하다. 따라서, 복제 적격 아데노바이러스(RCA)의 존재는 벡터 스톡에서 방지되지 않는 경우 최소화되므로, 소정의 치료 목적, 특히 유전자 치료 목적을 위해 적합하다. 벡터에서 RCA의 부재는 비-보완성 세포에서 아데노바이러스 벡터의 복제를 방지한다. 보완성 세포주의 작제는 [Sambrook et al., supra, 및 Ausubel et al., supra]에서 기술된 것들과 같은, 표준 분자 생물학 및 세포 배양 기술과 관련된다. 유전자 전이 벡터(예를 들어,아데노바이러스 벡터)를 생산하기 위한 보완성 세포주는 293 세포(예를 들어, Graham et al., J. Gen. Virol., 36, 59-72(1977)에 기술됨), PER.C6 세포(예를 들어, 국제 특허 공개 WO 97/00326, 및 미국 특허 제5,994,128호 및 제6,033,908호에 기술됨), 및 293-ORF6 세포(예를 들어, 국제 특허 공개 WO 95/34671 및 Brough et al., J. Virol., 71, 9206-9213(1997)에 기술됨)를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 아데노바이러스 게놈(예를 들어, 아데노바이러스 게놈의 E1 영역)으로 핵산 서열의 삽입은 공지된 방법 예를 들어, 아데노바이러스 게놈의 주어진 위치에서 고유의 제한 부위의 도입에 의해서 촉진될 수 있다.
레트로바이러스는 숙주 세포의 넓고 다양한 감염이 가능한 RNA 바이러스이다. 감염시, 레트로바이러스 게놈은 그의 숙주 세포의 게놈으로 통합되고 숙주 세포 DNA와 함께 복제됨으로써, 레트로바이러스 게놈으로 통합되는 바이러스 RNA 및 임의의 핵산 서열을 끊임없이 생산한다. 이와 마찬가지로, 치료적 인자(들)의 장기간 발현은 레트로바이러스를 사용하는 경우 성취가능하다. 유전자 치료에서 고려되는 레트로바이러스는 병원성 레트로바이러스가 존재한다 하더라도, 상대적으로 비-병원성이다. 병원성 레트로 바이러스, 예를 들어 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 또는 인간 T-세포 림프영양성 바이러스(HTLV)가 사용될 경우, 숙주세포로의 독성을 감소시키기 위하여 바이러스 게놈을 변경시키는 것에 주의해야만 한다. 레트로바이러스 벡터는 추가적으로 바이러스 복제-결핍성이 되도록 조작될 수 있다. 이와 같이, 레트로바이러스 벡터는 생체 내에서 안정한 유전자 전이를 위해 특히 유용한 것으로 고려된다. HIV-기반의 벡터와 같은 렌티바이러스 벡터는 유전자 전달을 위해 사용되는 레트로바이러스 벡터의 예이다. 다른 레트로바이러스와 달리, HIV-기반 벡터는 그들의 일과성 유전자를 비-분화 세포로 통합하고, 따라서 질환의 지속 형태의 치료를 위해 사용될 수 있음이 공지되어있다.
HSV-기반 바이러스 벡터는 유전자 전이 벡터로서 사용하기에 적합하여 수많은 세포 형태로 핵산을 도입한다. 성숙한 HSV 비리온은 152 kb의 선상 이중-가닥 DNA 분자로 구성된 바이러스 게놈을 가진 외피보유 20면체 캡시드로 구성된다. 대부분의 복제-결핍성 HSV 벡터는 복제를 방지하기 위한 하나 이상의 중간-기초 유전자를 제거하기 위한 결실을 함유한다. HSV 벡터의 장점은 장기간 DNA 발현을 초래할 수 있는 잠복 단계로의 진입하기 위한 그의 능력 및 25 kb까지의 외인성 DNA 삽입체를 수용할 수 있는 그의 큰 바이러스 DNA 게놈이다. 물론, 외인성 단백질의 장기간 생산을 촉진하기 위한 HSV의 능력은 단기간 치료 레지멘(regimen)의 관점에서는 잠재적으로 단점이 있다. 그러나, 당업자는 특정 상황에 적절한 벡터를 결정하기 위해 필요한 이해를 하게 된다. HSV-기반 벡터는 예를 들어, 미국 특허 제5,837,532호, 제5,846,782호, 제5,849,572호, 및 제5,804,413호, 및 국제 특허 공개 WO 91/02788, WO 96/04394, WO 98/15637, 및 WO 99/06583에 기술되어 있다.
AAV 벡터는 유전자 치료 프로토콜에서 사용을 위해 특히 관심이 있는 바이러스 벡터이다. AAV는 인간에게 질환을 야기하지 않는 것으로 공지된 DNA 바이러스이다. AAV 게놈은 DNA 복제 및 바이러스의 패키징을 위한 인식 시그널을 함유하는, 역 말단 반복(ITR)에 의해 인접된, rep 및 cap의 두 개의 유전자로 구성된다. AAV 는 효과적인 복제를 위하여 헬퍼 바이러스(즉, 아데노바이러스 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스)와 함께 공동-감염, 또는 헬퍼 유전자의 발현이 필요하다. AAV는 사용되는 헬퍼 바이러스에 따라서, 인간, 원숭이, 및 설치류 세포를 포함하는 숙주세포의 넓은 어레이에서 번식될 수 있다. 핵산의 투여에 사용하기 위한 AAV 벡터는 전형적으로 모계 게놈의 대략 96%가 결실되어, 단지 ITR 영역만이 남는다. 바람직한 경우, AAV rep 단백질은 AAV 벡터로 공-투여되어 숙주 세포 게놈으로의 AAV 벡터의 통합을 가능하게 할 수 있다. 통합된 AAV 게놈을 포함하는 숙주 세포는 세포 성장 또는 형태학에서 어떠한 변화도 보이지 않는다(예를 들어, 미국 특허 제4,797,368호). 이와 같이, AAV 벡터로부터의 치료적 인자의 장기적인 발현은 지속적이고 만성인 질환을 치료하는데 유용할 수 있다.
발현 벡터에서 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들어, mRNA 전사를 지시하는 프로모터를 비롯한 적절한 발현 조절 서열(들)에 작동가능하게 연결된다. 추가적 프로모터의 대표는 구성적 프로모터 및 조직 특이적 또는 유도성 프로모터를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 구성적 진핵 프로모터의 예는 마우스 메탈로티오네인 I 유전자의 프로모터(Hamer et αl ., J. MoI. Appl. Gen. 1:273(1982)); 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터(McKnight, Cell 31:355(1982)); SV40 초기 프로모터(Benoist et αl ., Nature 290:304(1981)]); 및 백시니아 바이러스 프로모터를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 구동하기 위해 사용될 수 있는 프로모터의 추가적 예는 조직-특이적 프로모터 및 특정 단백질을 위한 다른 내인성 프로모터, 예를 들어, 알부민 프로모터(간세포), 프로인슐린 프로모터(췌장 베타 세포) 등을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, 발현 구조체는 전사, 개시 및 종결을 위한 부위 및 전사된 영역 내에, 번역을 위한 리보좀 결합 부위를 함유할 것이다. 구조체에 의해 발현된 성숙 전사체의 코딩 부분은 시작에서 번역 개시 AUG 및 번역될 폴리펩티드의 말단에 적절하게 위치한 종결 코돈(UAA, UGA 또는 UAG)을 포함할 수 있다.
또한, 구조체는 발현이 되게 할 뿐만 아니라 조절하는 조절 영역을 함유할 수 있다. 일반적으로, 그러한 영역은 다른 것 중에서도, 억제자 결합 부위 및 인핸서와 같이, 전사를 조절함으로써 작동할 것이다.
진핵 벡터의 예는 스트라타진(Stratagene)으로부터 입수가능한 pW-LNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG ; 아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech)로부터 입수가능한 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL ; 및 클론테크(Clontech)로부터 입수가능한 pCMVDsRed2-express, pIRES2-DsRed2, pDsRed2-Mito, 및 pCMV-EGFP를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 많은 다른 벡터가 알려져 있으며 구매가능하다.
유전자 프로그램의 요소의 신속한 삽입 및 제거를 위한 분자 삽입 중심점을 포함하는 특히 유용한 벡터가 미국 특허 출원 공개 제2004/0185556호, 미국 특허 출원 제11/233,246호 및 국제 특허 공개 WO 2005/040336호 및 국제 특허 공개 WO 2005/116231호에 개시된다. 그러한 벡터의 예는 국제 특허 공개 WO 2007/038276호에 개시된 바와 같이, 울트라벡터(Ultra벡터)TM 생산 시스템(미국 버지니아주 블랙스버그 소재의 인트렉손 코포레이션(Intrexon Corp.))이다. 본 명세서에 사용될 때, "유전자 프로그램"은 프로모터(P), 발현 서열(E) 및 3' 조절 서열(3)을 포함하는 유전 요소의 조합이어서, "PE3"는 유전자 프로그램이다. 유전자 프로그램 내의 요소들은 유전자 프로그램의 요소들의 각각에 인접하는 분자 중심점 사이에서 쉽게 교환될 수 있다. 본 명세서에 사용될 때, 분자 중심점은 선형 방식으로 정렬된 적어도 2개의 비-가변성 희귀 또는 비보편적 제한효소 부위를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 정의된다. 일 실시 양태에서, 분자 중심점 선형 방식으로 정렬된 적어도 3개의 비-가변성 희귀 또는 비보편적 제한효소 부위를 포함한다. 전형적으로 임의의 하나의 분자 중심점 동일한 유전자 프로그램 내의 임의의 다른 분자 중심점의 희귀 또는 비보편적 제한효소 부위를 포함하지 않을 것이다. 주어진 제한 효소가 작용하는 6개 초과의 뉴클레오티드의 동족 서열은 "희귀" 제한효소 부위로 불린다. 하지만, 통계적으로 예측되는 것보다 더 드물게 발생하는 6 bp의 제한효소 부위가 있으며, 이들 부위 및 그들을 절단하는 엔도뉴클레아제는 "비보편적" 제한효소 부위로 불린다. 희귀 또는 비보편적 제한 효소의 예는 AsiS I, Pac I, Sbf I, Fse I, Asc I, Mlu I, SnaB I, Not I, Sal I, Swa I, Rsr II, BSiW I, Sfo I, Sgr AI, Afl III, Pvu I, Ngo MIV, Ase I, Flp I, Pme I, Sda I, Sgf I, Srf I, Nru I, Acl I, Cla I, Csp45 I, Age I, Bst1107 I, BstB I, Hpa I, Aat II, EcoR V, Nhe I, Spe I, Avi II, Avr II, Mfe I, Afe I, Fsp I, Kpn I, Sca I, BspE I, Nde I, Bfr I, Xho I, Pml I, ApaL I, Kas I, Xma I, BsrB I, Nsi I, Sac II, Sac I, Blp I, PspoM I, Pci I, Stu I, Sph I, BamH I, Bsu36 I, Xba I, BbvC I, Bgl II, Nco I, Hind III, EcoR I, BsrG I 및 Sse8781 I을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
벡터는 또한 호밍(homing) 엔도뉴클레아제(HE) 효소로 불리는 두번째 부류의 제한 효소를 위한 제한효소 부위를 포함할 수 있다. HE 효소는 큰, 비대칭 제한효소 부위(12-40 염기쌍)를 가지며, 그들의 제한효소 부위는 자연에서 드물다. 예를 들어, I-SceI으로 알려진 HE는 18 bp 제한효소 부위(5'TAGGGATAACAGGGTAAT3'(서열 번호 28))를 가지며, 임의 서열의 7 x 1010 개 염기쌍마다 단 한번 발생하는 것으로 예상된다. 이러한 발생률은 포유동물 게놈의 크기의 20배인 게놈에서 단지 한 부위에 해당한다. HE 부위의 희귀 특성은, HE 부위가 클로닝 벡터 플라스미드 내의 적절한 위치에 포함된다면, 유전공학자가 유전자 프로그램의 일체성을 파괴하지 않고 유전자 프로그램을 절단할 수 있는 가능성을 크게 증가시킨다.
숙주 세포에서의 발현을 위한 적절한 벡터와 프로모터의 선택은 잘 알려진 절차이며, 벡터 제작 및 숙주 내로의 도입, 및 숙주에서의 그 발현을 위해 요구되는 기술은 당업계에서 일상적인 기술이다.
세포 내로의 폴리뉴클레오티드의 도입은 일시적 형질감염, 안정한 형질감염이거나, 또는 벡터의 유전자좌-특이적 삽입일 수 있다. 숙주 세포 내로의 벡터의 일시적 및 안정한 형질감염은 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질-매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염, 또는 기타 방법에 의해 이루어질 수 있다. 그러한 방법은 [Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology(1986); Keown et al, 1990, Methods Enzymol. 185: 527-37; Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y.]와 같은 많은 표준 실험 매뉴얼에서 개시된다. 이들 안정한 형질감염 방법은 세포의 게놈 내로 벡터가 무작위 삽입되도록 한다. 추가로, 벡터의 카피수와 배향이 또한 일반적으로 말해서 무작위이다.
본 발명의 일 실시 양태에서, 벡터는 게놈 내의 생물-중성(bio-neutral) 부위 내로 삽입된다. 생물-중성 부위는 폴리뉴클레오티드의 삽입이, 있다 하더라도, 세포의 정상 기능을 거의 방해하지 않는 게놈 내의 부위이다. 생물-중성 부위는 입수가능한 생물정보학을 이용하여 분석될 수 있다. 많은 생물-중성 부위가 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, ROSA-등가 좌이다. 다른 생물-중성 부위는 당업계에 공지된 일상적 기술을 이용하여 확인할 수 있다. 게놈 삽입 부위(들)의 특성화는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행된다. 세포 내로 벡터를 도입할 때 폴리뉴클레오티드의 위치, 카피수 및/또는 배향을 조절하기 위하여, 유전자좌-특이적 삽입 방법이 이용될 수 있다. 유전자좌-특이적 삽입 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 상동성 재조합 및 리콤비나아제-매개 게놈 삽입을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 물론, 만일 유전자좌-특이적 삽입 방법이 본 발명의 방법에 사용되려면, 벡터는 상동성 재조합과 같은, 그러나 이로 한정되지 않는, 이러한 유전자좌-특이적 삽입을 돕는 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 1,2,3,4, 또는 그 이상의 게놈 통합 부위(GIS)를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용될 때, "게놈 통합 부위"는 뉴클레오티드 서열이 게놈 내에 벡터의 삽입을 허용하는 세포내의 게놈의 부분과 동일하거나 거의 동일한 벡터 서열의 부분으로 정의된다. 특히, 벡터는 적어도 폴리뉴클레오티드에 인접하는 2개의 게놈 삽입 부위를 포함할 수 있다. 물론, GIS는 추가 요소, 또는 심지어 벡터 상에 존재하는 모든 요소에 인접할 수 있다.
다른 실시 양태에서, 유전자좌-특이적 삽입은 리콤비나아제-부위 특이적 유전자 삽입에 의해 실시될 수 있다. 요약하면, PhiC31 인테그라아제(integrase)와 같은, 그러나 이로 한정되지 않는 세균 리콤비나아제 효소는 인간 게놈 내의 "허위(pseudo)" 재조합 부위에 작용할 수 있다. 이들 허위 재조합 부위는 리콤비나아제를 이용한 유전자좌-특이적 삽입을 위한 표적일 수 있다. 리콤비나아제-부위 특이적 유전자 삽입은 Thyagarajan et al, MoI. Cell Biol. 21:3926(2001)에 개시된다. 리콤비나아제-부위 특이적 유전자 삽입을 위해 사용될 수 있는 리콤비나아제와 그들의 각 부위의 다른 예는 R4 및 TP901-1과 같은 세린 리콤비나아제 및 WO 2006/083253호에 개시된 리콤비나아제를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
추가 실시 양태에서, 벡터는 화학-내성(chemo-resistance) 유전자, 예를 들어, 다중약물 허용성 유전자 mdr1, 다이하이드로폴레이트 리덕타아제, 또는 O6-알킬구아닌-DNA 알킬트랜스퍼라제를 포함할 수 있다. 화학-내성 유전자는 구성적(예를 들어, CMV) 또는 유도성(예를 들어, 레오스위치®(등록상표)) 프로모터의 조절하에 있을 수 있다. 이 실시 양태에서, 만일 개체 내에서 변경된 세포를 유지하면서 개체에서 질환을 치료하는 것이 바람직하다면, 적합한 화학-내성 유전자의 발현으로 인하여 에이전트로부터 변경된 세포가 보호되고 질환 또는 장애의 치료, 완화 또는 예방을 위해 계속 사용될 수 있는 한편, 임상의는 질환 세포를 파괴하기 위해 화학요법제를 적용할 수 있다. 유도성 프로모터 하에 화학-내성 유전자를 배치함으로써, 화학-내성 유전자의 불필요한 발현이 피해질 수 있으나, 계속된 치료가 필요한 경우 여전히 이용가능할 것이다. 만일 변경된 세포 자체가 질병을 갖게 되면, 그들은 후술하는 바처럼 치사 폴리펩티드의 발현을 유도함으로써 파괴될 수 있을 것이다.
본 발명의 방법은 개체의 세포 내로 유전자 스위치 및 외인성 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 실시된다. 상기한 것과 같은, 당업계에 알려진 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위해 알려진 임의의 방법이 이용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드가 생체 외에서 세포 내로 도입될 경우, 세포는 생검, 스크래핑(scraping), 및 외과적 조직 제거를 포함하지만 이로 한정되지 않는, 당업계에 알려진 임의의 기술에 의해 개체로부터 얻어질 수 있다. 단리된 세포는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기에 충분한 양의 시간 동안, 예를 들어, 2,4,6,8,10,12,18,24,36,48 시간 또는 그 이상 동안 배양될 수 있다. 짧은 기간 동안 일차 세포를 배양하는 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 세포는 부착되거나 현탁액으로서 플레이트에서(예를 들어, 마이크로웰 플레이트에서) 배양될 수 있다.
생체 외 치료 방법의 경우, 세포는 개체로부터 단리되어 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기에 적합한 조건 하에서 배양된다. 일단 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입되면, 세포는 리간드-의존성 전사 인자가 발현되기에 충분한 기간, 예를 들어, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 18, 또는 24시간 또는 그 이상동안 인큐베이션된다. 세포 내로 폴리뉴클레오티드의 도입 후 일부 시점에서(상당 수준의 리간드-의존성 전사 인자가 발현되기 전 또는 후), 세포는 다시 개체 내로 도입된다. 재도입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들어, 정맥내 투입 또는 조직 또는 공동 내로의 직접 주사에 의해 실시될 수 있다. 일 실시 양태에서, 세포 내에 폴리뉴클레오티드의 존재는 세포를 개체 내로 다시 도입하기 전에 결정된다. 다른 실시 양태에서, 폴리뉴클레오티드를 함유한 세포가 선택되고(예를 들어, 폴리뉴클레오티드에서 선발가능한 마커의 존재에 기초함) 폴리뉴클레오티드를 함유한 세포만이 개체 내로 재도입된다. 세포가 개체에 재도입된 후, 리간드는 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하기 위해 개체에 투여된다. 대안적 실시 양태에서, 리간드는 세포가 개체에 재도입되기 전에 세포에 첨가되어, 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드가 세포의 재도입 전에 발현되도록 할 수 있다. 리간드는 전신성으로(예를 들어, 경구로, 정맥내로) 또는 국소적으로(예를 들어, 복강내로, 척추강내로, 뇌실내로, 세포가 재도입되는 조직 또는 기관 내로 직접 주사), 임의의 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 리간드 투여의 최적 타이밍은 일상적 기술만을 이용하여 각 세포 유형과 질병 또는 질환에 대해 결정될 수 있다.
본 발명의 생체 내 치료 방법은 개체의 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 직접 생체 내 도입하는 것에 관련된다. 폴리뉴클레오티드는 전신성으로 또는 국소적으로(예를 들어, 질병 또는 질환의 부위에서) 개체 내로 도입될 수 있다. 일단 폴리뉴클레오티드가 개체에 도입되면, 리간드는 치료 폴리펩티드 또는 치료 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도하기 위해 투여될 수 있다. 리간드는 전신성으로(예를 들어, 경구로, 정맥내로) 또는 국소적으로(예를 들어, 복강내로, 척추강내로, 뇌실내로, 질병 또는 질환이 발생중인 조직 또는 기관 내로 직접 주사), 임의의 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 리간드 투여의 최적 타이밍은 일상적 기술만을 이용하여 각 세포 유형과 질병 또는 질환에 대해 결정될 수 있다.
생체 내 사용을 위해, 본 명세서에 개시된 리간드는 예를 들어, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 연고, 엘릭시르, 및 주사용 조성물과 같은 약학적으로 허용가능한 담체에 취해질 수 있다. 약학 조성물은 0.01 중량% 내지 99 중량%의 리간드를 함유할 수 있다. 조성물은 단일 또는 다중 투여량 형태일 수 있다. 임의의 특정 약학 조성물 내의 리간드의 양은 유효 투여량, 즉, 원하는 유전자 발현 또는 억제를 유발하는데 필요한 투여량에 의존할 것이다.
약학적 조제(preparations)를 투여하기 위한 적합한 경로는 경구, 직장, 국소(피부, 볼 및 설하 포함), 질, 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 종양내, 피내, 척추강내 및 경막외 포함), 안내 및 식도-위장관(naso-gastric)에 의한 것을 포함한다. 바람직한 투여 경로가 치료되는 상태에 의존할 것이며 수용체
본 명세서에 사용될 때, 용어 "rAD.RheoIL12"는 레오스위치®(등록상표) 치료 시스템(RTS)의 유전자 스위치의 조절하에 IL-12 유전자를 보유한 아데노바이러스 폴리뉴클레오티드 벡터를 말하며, 활성화 리간드의 존재 하에서 IL-12 단백질을 생산할 수 있다. 본 명세서에 사용될 때, 용어 "rAd.cIL12"는 구성적 프로모터의 조절하에 IL-12 유전자를 함유한 아데노바이러스 폴리뉴클레오티드 조절 벡터를 말한다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "IL-12p70"은 p40과 p35로 일반적으로 불리는 2개의 서브유닛을 자연적으로 가진 IL-12 단백질을 말한다. 용어 IL-12p70은 IL-12의 두 서브유닛(p40과 p35)을 포함하는 융합 단백질을 포괄하며, 여기서, 융합 단백질은 서브유닛 사이의 링커 아미노산을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "면역조절자의 기능을 가진 단백질"은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL- 5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10R 또는 그 서브유닛 DN, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-알파, IFN-감마, CCL3(MIP-1a), CCL5(RANTES), CCL7(MCP3), XCL1(림포탁틴), CXCL1(MGSA-알파), CCR7, CCL19(MIP-3b), CXCL9(MIG), CXCLlO(IP-10), CXCL12(SDF-1), CCL21(6Ckine), OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-디펜신, HMGB1, Flt3L, IFN-베타, TNF-알파, dnFADD, BCG, TGF-알파, PD-L1, TGFbRII DN, ICOS-L 및 SlOO으로부터 선택된 면역조절자의 임의의 생물활성의 적어도 20%(예를 들어, 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%)를 갖는 단백질을 말한다. 이와 유사하게, 용어 "IL-12의 기능을 가진 단백질"은 인간 IL-12의 임의의 생물활성의 적어도 20%(예를 들어, 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%)를 갖는 단백질을 말한다. 그러한 면역조절자의 생물활성은 잘 알려져 있다. 하기 표를 참고한다.
[표 6a] 면역조절자 및 그들의 기능
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[표 6b]
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[표 6c]
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[표 6d]
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[표 6e]
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[표 6f]
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[표 6g]
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IL-12의 생물활성은 잘 알려져 있으며, 천연 T 세포의 Th1 세포로의 분화, T 세포의 성장 및 기능 자극, T 및 천연 살해(NK) 세포로부터 인터페론-감마(IFN-감마) 및 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)의 생산, INF-감마의 IL-4 매개 억제의 감소, NK 세포와 CD8+ 세포독성 T 림프구의 세포독성 활성의 향상, IL-12R-β1 및 IL-12R-β2의 발현 자극, MHC I 및 II 분자의 상향조절을 통한 종양 항원의 제시의 촉진, 및 항-혈관신생 활성을 한정됨이 없이 포함한다. 용어 "IL-12의 기능을 가진 단백질"은 야생형 서열이 아미노산의 추가, 결실, 또는 치환 중 하나 이상에 의해 변경된 야생형 IL-12 서열의 돌연변이 및 IL-12의 생물활성 중 하나 이상을 모방하는 비-IL-12 단백질을 포괄한다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "활성화하는" 또는 "활성화하다"는 관심 유전자(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IOR 또는 그 서브유닛 DN, IL- 15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-알파, IFN-감마, CCL3(MIP-1a), CCL5(RANTES), CCL7(MCP3), XCLl(림포탁틴), CXCLl(MGSA-알파), CCR7, CCL19(MIP-3b), CXCL9(MIG), CXCLlO(IP-1O), CXCL12(SDF-1), CCL21(6Ckine), OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-디펜신, HMGB1, Flt3L, IFN-베타, TNF-알파, dnFADD, TGF-알파, PD-L1 RNAi, PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드, TGFbRII DN, ICOS-L 및 SlOO으로부터 선택됨)의 발현을 야기하는, 유전자 스위치의 세포 활성의 임의의 측정가능한 증가를 말한다.
본 명세서에 사용될 때, 질환을 "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 질환의 징후 또는 증상을 완화시키기 위한 노력으로, 포유동물(인간 또는 비-인간)에 하나 이상의 약물 또는 시험관 내에서 조작된 세포를 투여하는 것을 포함할 수 있는 프로토콜을 실시하는 것을 말한다. 따라서, "치료하는" 또는 "치료"는 징후 또는 증상의 완전한 완화를 요구하는 것으로 반드시 이해되어서는 안되며, 치유를 요구하지 않으며, 개체에 대한 단지 한계 효과만을 갖는 프로토콜을 구체적으로 포함한다.
본 명세서에 사용될 때, "면역 세포"는 수지상 세포, 대식세포, 호중구, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 천연 살해 세포 및 림프구(예를 들어, B 및 T 세포)를 포함한다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "수지상 세포" 및 "DC"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "치료법 지원 세포"(TSC)는 면역조절자의 기능을 가진 하나 이상의 단백질 및, 선택적으로 IL-12의 기능을 가진 단백질을 종양 미세환경에 전달하기 위해 본 발명의 벡터로 변경(예를 들어, 형질감염, 전기천공, 등)될 수 있는 세포이다. 그러한 TSC는 줄기 세포, 섬유아세포, 내피 세포 및 각질세포를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "시험관 내에서 조작된 면역 세포" 또는 "시험관 내에서 조작된 면역 세포 집단" 또는 "조작된 면역 세포 집단" 또는 "면역조절자를 발현하는 면역 세포" 또는 "IL-12를 발현하는 면역 세포"는 면역조절자 및/또는 IL-12를 조건적으로 발현하는 면역 세포, 예를 들어, 수지상 세포를 말하며, 그 경우는 활성화 리간드에 의해 활성화될 수 있는 유전자 스위치의 조절하에 있을 수 있다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "시험관 내에서 조작된 TSC" 또는 "시험관 내에서 조작된 TSC 집단" 또는 "조작된 TSC의 집단" 또는 "면역조절자를 발현하는 TSC" 또는 "IL-12를 발현하는 TSC"는 활성화 리간드에 의해 활성화될 수 있는 유전자 스위치의 조절하에 있을 수 있는, 면역조절자 및/또는 IL-12를 조건적으로 발현하는 치료법 지원 세포, 예를 들어, 줄기 세포, 섬유아세포, 내피 세포 및 각질세포를 말한다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "변경된 세포"는 형질감염, 전기천공, 미세주입, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전 및 리포펙션(리소좀 융합)을 포함하지만 이로 한정되지 않는 과정에 의해 변경된 세포를 말한다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "MOI" 또는 "감염다중도(Multiplicity of Infection)"는 특정 실험에서 단일 세포를 감염시키는 아데노바이러스 입자의 평균 수(예를 들어, 재조합 아데노바이러스 또는 대조 아데노바이러스)를 말한다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "종양"은 전암 또는 암 세포 및/또는 조직이건 간에, 생체 내 또는 시험관 내에서의 모든 양성 또는 악성 세포 성장 및 증식을 말한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명의 벡터 및 방법은 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 암의 예는 유방암, 전립선암, 림프종, 피부암, 췌장암, 결장암, 흑색종, 악성 흑색종, 난소암, 뇌암, 원발성 뇌 암종, 두경부 암, 신경교종, 아교모세포종, 간암, 방광암, 비소세포 폐암, 머리 또는 목 암종, 유방 암종, 난소 암종, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 윌름(Wilms') 종양, 자궁 암종, 고환 암종, 방광 암종, 췌장 암종, 위 암종, 결장 암종, 전립선 암종, 비뇨생식기 암종, 갑상선 암종, 식도 암종, 골수종, 다발성 골수종, 부신 암종, 신장 세포 암종, 자궁내막 암종, 부신 피질 암종, 악성 췌장 인슐린종, 악성 유암종, 융모막암종, 균상식육종, 악성 고칼슘혈증, 자궁 과형성, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 과립구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 모양 세포성 백혈병, 신경아세포종, 횡문근육종, 카포시 육종, 진성다혈구증, 본태성 혈소판증가증, 호킨스병, 비-호킨스 림프종, 연부조직육종, 중피종, 골육종, 원발성 고분자글로불린혈증, 및 망막모세포종, 등을 포함한다. 다른 실시 양태에서, 본 발명의 벡터 및 방법은 이상지질혈증, 죽상동맥경화증, 인슐린 내성, 당뇨병(예를 들어, 제I형 당뇨병, 제II형 당뇨병, MODY, 및 임신 당뇨병), 비만, 내당능장애, 죽상 질환, 고혈압, 심장병(관상 동맥 질환, 뇌졸증, 심부전, 관상동맥 부전증, 및 고혈압을 포함하나, 이로 제한되지는 않음), 고지혈증, 당 불내성, 인슐린 내성, 고혈당증, 고인슐린혈증, 대사 증후군X(또는 증후군 X, 또는 인슐린 내성 증후군, 또는 리벤스(Reaven's) 증후군, 또는 대사 심혈관 위험 증후군), 고혈압, 만성 피로, 가속 노화, 퇴행성 질환, 노화의 내분비 결핍, Gm1 강글리오시드증, 모르쿠오-B 질환, 크라베병(Krabbe's disease), 파브리병, 고셔병, 타이-작스병(Tay-Sachs disease), 샌드호프병, 푸코사이드축적증, 탄수화물 대사 장애(예를 들어, 글리코겐 축적 질환), 아미노산 대사 장애(예를 들어, 페닐케톤뇨증, 메이플시럽뇨증, 글루타릭산혈증 타입 1), 유기산 대사 장애(예를 들어, 알캅톤뇨증), 지방산 산화 및 미토콘드리아 대사 장애(예를 들어, 중간쇄 아실 데하이드로게나제 결핍), 포르피린 대사 장애(예를 들어, 급성 간헐성 포르피린증), 퓨린 또는 피리미딘 대사 장애(예를 들어, 레쉬-니한 증후군), 스테로이드 대사 장애(예를 들어, 선천성 부신 과형성), 미토콘드리아 기능 장애(예를 들어, 컨스-세이어 증후군), 및 퍼옥시좀 기능 장애(예를 들어, 젤위거 증후군)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 장애를 포함하나, 이로 제한되지 않는, 대사-관련 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시 양태에서, 본 발명의 벡터 및 방법은 아크로하이드라 자가면역 활성 만성 간염, 급성 파종성 뇌척수염, 급성 출혈성 뇌백질염, 에디슨병, 감마글로불린혈증, 무감마글로불린혈증, 원형 탈모증, 근위축성 측색 경화증, 강직성 척수염, 항-GBM/TBM 신장염, 항인지질항체 증후군, 항합성효소 증후군, 관절염, 아토피성 알러지, 아토피성 피부염, 재생불량성 빈혈, 자가면역 심근증, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환, 자가면역 림프증식성 증후군, 자가면역 말초 신경병증, 자가면역 췌장염, 자가면역 다발성내분비 증후군 제I형, 제II형, & 제III형, 자가면역 프로게스테론 피부염, 자가면역 혈소판감소성 자반병, 자가면역 포도막염, 발로병/발로 동심성 경화증, 베체트 증후군, 버거스병, 비커스타프 뇌염, 블라우 증후군, 수포성 유천포창, 캐슬만병, 만성 피로 면역 기능장애 증후군, 만성 염증성 탈수초성 말초신경병증, 만성 재발성 다초좀 골수염, 처그-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창, 만성 소화 장애증, 코간 증후군, 한랭응집소병, 보체 결합 2 결핍, 두개동맥염, CREST 증후군, 크론병, 쿠싱 증후군, 피부 백혈구 파괴 혈관염, 데고병, 헤르페스모양피부염, 피부진균증, 진성 당뇨병 타입 1, 광범위형 피부 전신 경화증, 드레슬러 증후군, 원판상 홍반성 루푸스, 습진, 골부착부위염-관련 관절염, 호산성 근막염, 후천성 표피 수포증, 결절성 홍반, 필수적 혼합 한냉글로불린혈증, 에반 증후군, 진행성 골화성 섬유형성이상, 섬유근염, 섬유화 아베올리티스(Fibrosing aveolitis), 위염, 위장 유천포창, 거대 세포 동맥염, 굿파스튜어 증후군, 그레이브스병, 귈랑-바레 증후군(Guillain-Barr'e syndrome)(GBS), 하시모토 뇌염, 하시모토 갑상선염, 용혈성 빈혈,(헤노호-쉔라인 자반증)(Henoch-Schonlein purpura), 임신 헤르페스, 휴즈 증후군(또는 항인지질항체 증후군), 하이포감마글로불린혈증, 특발성 염증성 탈수초성병, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병, IgA 신장병(또는 버거스병(Berger's disease)), 포함체 근육염, 오를리 탈수초성 다발신경병, C 특발성 관절염, 청소년기 류마티스 관절염, 램버트-이튼 근무력 증후군, 백혈구파쇄성 맥관염, 편평 태선, 경화 태선, 선상 IgA 질환(LAD), 루게릭병, 루푸스양 간염, 홍반성 루푸스, 마지드 증후군, 메니에르병(Meniere's disease), 현미경적 다발성혈관염, 밀러-피셔 증후군, 혼합 결합 조직병, 무하-하버만병(Mucha-Habermann disease), 머클-웰스 증후군, 다발성 골수종, 중증 근무력증, 근육염, 기면증, 시신경 척수염(또한 데빅병), 눈의 반흔성 유천포창, 오르드 갑상선염(Ord thyroiditis), 회귀성 류마티즘, PANDAS(연쇄상구균과 연관된 청소년기 자가면역 신경정신병적 장애), 부종양 소뇌 변성, 부종양 소뇌 변성, 파리 롬버그 증후군, 파르소나지-터너 증후군(Parsonnage-Turner Syndrome), 주변 포도막염, 천포창, 보통 천포창, 악성 빈혈, 정맥주위 뇌척수염, POEMS 증후군, 결절성 다발동맥염, 류마티스성 다발성근육통, 다발근육염, 일차 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 괴저성 농피증, 적아구로(pure red cell aplasia), 라스무센 뇌염, 레이노 현상, 재발성 다발 연골염, 라이터 증후군, 후복막 섬유증, 류마티스 관절염, 류마티스열, 슈미트 증후군, 슈니츨러 증후군, 공막염, 쇼그렌 증후군, 척추관절증, 점성혈 증후군, 스틸병, 아급성세균성심내막염(SBE), 수삭 증후군, 스위트 증후군, 시데남 무도병(Sydenham Chorea), 교감성안염, 타카야수 동맥염, 일시적 동맥염, 토로사-헌트 증후군(Tolosa-Hunt Syndrome), 횡단성 척수염, 궤양성 대장염, 미분화 결합조직 질환, 미분화 척추관절증, 맥관염, 베게너 육아종증, 윌슨 증후군, 및 비스코트-알드리히 증후군(Wiskott-Aldrich Syndrome)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 장애를 포함하나, 이로 제한되지 않는 자가면역 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시 양태에서, 본 발명의 벡터 및 방법은 개방각 녹내장(예를 들어, 일차 개방각 녹내장, 색소성 녹내장, 및 박리성 녹내장, 저 안압녹내장), 폐쇄각 녹내장(임상적으로 닫힌 각 녹내장, 협우각 녹내장, 동공 차단 녹내장, 및 섬모체 차단 녹내장으로서 공지됨)(예를 들어,급성 폐쇄각 녹내장 및 만성 폐쇄각 녹내장), 무홍채성 녹내장, 선천성 녹내장, 청소년기 녹내장, 렌즈-유도성 녹내장, 신생혈관 녹내장(예를 들어, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 디코이, 색소 유래 성장 인자(PDGF), 엔도스타틴, 안지오스타틴, 또는 안지오포에틴-1로 구성된 벡터를 사용하는), 외상-후 녹내장, 스테로이드-유도성 녹내장, 스터지-웨버 증후군 녹내장, 및 포도막염-유도성 녹내장, 당뇨망막병증(예를 들어, VEGF 디코이, PDGF, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 또는 안지오포에틴-1으로 구성된 벡터를 사용함), 황반 변성(예를 들어, VEGF 디코이, PDGF, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 안지오포에틴-1, ATP 결합 카세트 서브패밀리 A 멤버 4로 구성된 벡터를 사용함), 황반 변성(예를 들어, VEGF 디코이, PDGF, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 안지오포에틴-1, ATP 결합 카세트 서브패밀리 A 멤버 4로 구성된 벡터를 사용함), 맥락막 신생혈관화,(예를 들어, VEGF 디코이, PDGF, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 또는 안지오포에틴-1으로 구성된 벡터를 사용함), 혈관 누출, 및/또는 망막 부종, 세균성 결막염, 진균성 결막염, 바이러스성 결막염, 포도막염, 각막후면 침전물, 황반 부종(예를 들어, VEGF 디코이, PDGF, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 또는 안지오포에틴-1으로 구성된 벡터를 사용함), 안내 렌즈 삽입 후 염증 반응, 포도막염 증후군(예를 들어, 만성 홍채염 또는 만성 내안구염), 망막 혈관염(예를 들어, as seen in 류마티스 관절염, 청소년기 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 진행 전신 경화증, 결절성 다발동맥염, 베게너 육아종증, 관자 동맥염, 아다만티아데스 베체트병, 쇼그렌, 재발성 다발 연골염 및 HLA-B27 관련 척수염), 사코이드증, 일스 병(Eales disease), 급성 망막 괴사, 보고트 고야나기 하라다 증후군, 안구 톡소플라스마증, 방사성 망박병증, 증식성 유리체망막병증, 내안구염, 안구 녹내장(예를 들어, 염증성 녹내장), 시신경염, 허혈성 시신경병증(예를 들어, 이소성 NADH 데하드로게나제 유닛 4로 구성된 벡터), 갑상선 관련 안병증, 안와 가성종양, 색소 분산 증후군(색소성 녹내장), 공막염, 상공막염 맥락막질환(예를 들어, 급성 후부 다발성 판상을 포함하나, 이로 제한되지 않는, "흰-점" 증후군), 망막증(예를 들어, 포낭성 황반 부종, 중심성 장애 맥락막병증 및 추정 안 히스토플라즈마증 증후군(presumed ocular histoplasmosis syndrome(예를 들어, 신경교세포 유래 향신경성 인자, 페리페린-2로 구성된 벡터)), 망막 혈관 질환(예를 들어, 당뇨 망막 병증, 코츠병 및 망막소동맥대혈관류), 망막 동맥 폐쇄, 망막 정맥 폐쇄, 미숙아 망막증, 망막 색소변성증(예를 들어, 망막 색소 특이적 벡터 65kDa 단백질로 구성된 벡터), 가족성 삼출성 유리체망막병증(familial exudative vitreoretinopathy; FEVR), 결절성 맥락막 혈관병증, 황반 망막 전막 및 백내장으로 구성된 그룹으로부터 선택된 장애를 포함하나, 이로 제한되지 않는 안구 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시 양태에서, 본 발명의 벡터 및 방법은 빈혈, 출혈 및 응고 장애(예를 들어, 파종성 혈관내 응고(DIC), 혈우병, 헤노흐-쇤라인 자색반(Henoch-Schonlien Purpura), 유전성 출혈성 모세혈관확장증, 혈소판감소증(ITP, TTP), 혈전성향증, 본 빌러브란트 병(Von Willebrand's disease)), 백혈병(예를 들어, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병), 림프종(예를 들어, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종), 골수증식성 장애(예를 들어, 골수섬유증, 진성 다혈증, 혈소판혈증), 형질 세포 장애(예를 들어, 마크로글로불린혈증, 비정형의 모노클로날 감마글로불린병증, 다발성 골수종), 비장 장애, 백혈구 장애(예를 들어, 호염기성 장애, 호산성 장애, 림프구감소증, 단구 장애, 호중구감소증, 호중성 백혈구증가증), 혈전증, 심부정맥 혈전증(DVT), 혈색소침착증, 월경과다증, 겸상 적혈구 빈혈증, 및 지중해빈혈증으로 구성된 그룹으로부터 혈관 장애를 포함하나, 이로 제한되지 않는 혈관 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시 양태에서, 본 발명의 벡터 및 방법은 고셔병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 다발성 경화증(MS), 헌팅턴병, 프레드리치 실조(Fredrich's ataxia), 경도 인지 장애, 대뇌 아밀로이드 맥관병증, 파킨소니즘병(Parkinsonism Disease), 레비소체병, 전두 측두엽 치매(FTD) 다계통위축증(MSA), 진행성 핵상마비, 및 운동 장애(실조, 뇌성마비, 무도병아데토시스, 근육긴장이상, 투렛 증후군, 핵황달을 포함함) 및 트레머 장애(tremor disorders), 및 백질이영양증(including 부신백질이영양증, 이염성백질이영양증, 카나반병, 알렉산더병, 펠리제우스-메르즈바하병(Pelizaeus-Merzbacher disease)을 포함함), 지방갈색소증, 모세관확장실조, 레트 증후군, 알파-사이뉴클레이노파씨(alpha.-synucleinopathy)(예를 들어, 레비소체병, 다계통위축증, 할레포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 또는 전두 측두엽 치매), 니만-피크 타입 C병(NPCD), 척수소뇌실조증 타입 1, 타입 2, 및 타입 3, 및 치상핵적핵담창구시상하핵 위축증(DRLPA)으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 신경 장애를 포함하나, 이로 제한되지는 않는 신경 장애를 치료하기 하기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시 양태에서, 본 발명의 벡터 및 방법은 천식, 폐확장부전, 기관지염, COPD(만성 폐쇄성 폐 질환), 폐기종, 폐암, 중피종, 폐렴, 석면증, 아스페르길루스종, 아스페르길루스증, 아스페르길루스증 - 급성 침습성, 기관지 확장증, 폐쇄세기관지기질화 폐렴(BOOP), 호산성 폐렴, 괴사성 폐렴, ral 유출, 진폐증, 기흉, 폐 방선균증, 폐포단백증, 폐 탄저병, 폐 동정맥 기형, 폐 섬유증, 폐 색전, 폐 조직구증 X(호산성 육아종), 폐 고혈압, 폐 부종, 폐 출혈, 폐 노카르디아증, 폐 결핵, 폐 정맥성 간 질환, 류마티스 폐 질환, 유육종증, 방사선 섬유증, 과민성 폐렴, 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 청소년기 호흡 곤란 증후군, 특발성 폐 섬유증, 특발성 간질성 폐렴, 림프관평활근종증, 폐 랑게르한스 세포 조직구증, 폐포단백증, 굴염, 편도염, 중이염, 인두염, 후두염, 폐 과오종, 폐 분리증, 선천성 낭성선 종양기형), 및 낭포성 섬유증으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 폐 질환을 포함하나, 이로 제한되지는 않는 폐 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시 양태에서, 본 발명의 벡터 및 방법은 전신 홍반성 루푸스, 피부진균증, 경피증, 전신 괴사성 동맥염, 피부 괴사 정맥염, 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군, 레이노 현상, 라이터 증후군, 관절염, 건선성 관절염, 혈청음성 척추관절염, 쇼그렌 증후군, 전신 경화증, 피부진균증/다발근육염, 혼합 결합 조직병, 및 강직성 척수염으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 류마티스 장애를 포함하나, 이로 제한되지는 않는 류마티스 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시 양태에서, 본 발명의 벡터 및 방법은 피부사상균증(예를 들어, 백선증, 링웜(ringworm) 또는 백선 감염), 무좀, 손발톱주위염, 어루러기, 홍색음선, 피부스침증, 진균성 기저귀 발진, 칸디다 음문염, 칸디다 귀두염, 외이도염,(피부 및 점막피부) 칸디다증 , 만성 점막칸디다증(예를 들어, 아구창 및 질 칸디다증), 크립토콕쿠스증, 지오트리쿰증, 트리코스포론증, 아스페르길루스증, 페니실륨증, 말피부사상균증, 접합균증, 스포로트리코시스, 색소효모균증, 콕시디오이데스 진균증, 히스토플라스마증, 분아균증, 파라콕시디오이드진균증, 가성알레쉐리아증, 균종, 곰팡이각막염, 이진균증, 뉴모시스티스병, 및 진균혈증, 아시네토박터 감염, 방선균증, 아프리카 수면병, AIDS(후천성 면역 결핍 증후군), 아메바성 감염, 아나플라즈마증, 탄저병, 용혈성 아카노박테리아균 감염, 아르헨티나 출혈성열, 회충증, 아스페르길루스증, 아트로바이러스 감염, 바베시아증, 바실러스 세레우스 감염, 세균성 폐렴, 세균성 질염(BV), 균 유사체 감염, 발란티듐증, 베이리사스카리스 감염, BK 바이러스 감염, 흑색사모증, 블라스토시스티스 호미니스 감염, 보렐리아 감염, 보툴리누스증(및 유아보툴리누스증), 브라질 출혈성 열, 브루셀라병, 버크홀데리아 감염, 브룰리 궤양, 칼시바이러스 감염(노로바이러스 및 사포바이러스), 칸디다증, 고양이할큄병, 연조직염, 샤가스병(아메리카 트리파노소마증), 무른궤양, 수두, 클라미디아, 콜레라, 크로모블라스토마이코시스, 간흡충증, 클로스트리듐디피실레 , 콕시디오이데스 진균증, 콜로라도진드기열(CTF), 보통 감기(급성 바이러스 비인두염; 급성 코리자(coryza)), 크로이츠펠트-야콥병(CJD), 크립토코쿠스증, 크립토스포리디오시스증, 오우스 유충이행증(ous larva migrans)(CLM), 뎅기열, 이핵아메바증, 디프테리아, 열두조충증, 열두조충증, 드라쿤쿨루스증, 에볼라 출혈열, 단방포충증, 에르리히증, 요충증(Pinworm ooinfection), 엔테로코쿠스 감염, 엔테로바이러스 감염, 발진티푸스, 유행성 발진티푸스, 돌발성 발진, 비대흡충증, 간질증, 치명성 가계 불면증(FFI), 사상충증, 푸소박테리움 감염, 가스 괴저병(크로스티리디아성 근괴), 지오트리쿰진균증, 게르스트만 슈투로이슬러 샤잉커 증후군(GSS), 편모충증 마비저, 턱구충증, 임질, 서혜부 육아종(도너반증), 그룹 A 연쇄상구균 감염, 그룹 B 연쇄상구균 감염, 해마필러스 인플루엔자, 손, 발 및 입 질3환(HFMD), 한타 바이러스 폐증후군(HPS) 헬리코박터 피롤리 감염, 아이씨-요독증 증후군(HUS), 출혈열콩팥증후군(HFRS), A, B, C, D, E형 감염, 헤프레스 심플렉스, 히스토플라스마증, 구충 감염, 엔 보카바이러스 감염, 인간 에윙기 에르리히증(Human ewingii ehrlichiosis), 인간 과립구 아나플라즈마증(HGA), 인관 과립구 아나플라즈마증(HGA), 인간 단구 에르리히증, 인간 파필로마바이러스(HPV) 감염, 인간 파라인플루엔자 바이러스 감염, 막양조충증, 엡스타인-바 바이러스 감염성 전염성 단핵증(모노), 인플루엔자(플루), 아이소스포라증, 카와사키병, 각막염, 킨겔라 킨개(Kingella kingae) 감염, 쿠루(Kuru), 라사열(Lassa fever), 레지오넬라증(레지오넬라병), 레지오넬라증(폰티악열), 레슈마니아증, 나병, 렙토스피라증, 리스테리아증, 라임병(라임보렐리오시스), 림프사상충증(코끼리피부병), 림프구 맥락수막염, 말라리아, 마르부르크 출혈성열(MHF), 홍역, 유사비저(Melioidosis)(휘트모어 병), 수막염, 뇌척수막염, 요코가와흡충증, 미포자충증, 전염성 연속증(MC), 볼거리, 발진열(풍토성 발진열), 마이코플라스마 폐렴, 균종, 구더기증, 신생아 결막염(신생아안염),(신규)변종 크로이츠펠트-야콥병(vCJD, nvCJD), 노카르디아증, 사상충증(리버 블라인드니스(River blindness)), 파라콕시디오이드진균증(남아메리카 분아균증), 폐흡충증, 파스투렐라병, 머리이기생증(머리 이), 몸 이 감염증(몸 이), 음모슬증(사면발이, 크랩 이(Crab lice)), 골반 염증성 질환(PID), 백일해(백일 기침), 흑사병(plague), 폐렴구균 감염, 폐포자충 폐렴(PCP), 폐렴, 급성 회백수염, 급성 회백수염, 프리보텔라 감염, 메리 아메바성 뇌막뇌염(PAM), 진행성 다초점성 백질뇌증, 앵무병, 큐열(Query fever), 광견병, 서교증, 호흡기 세포융합 바이러스 감염, 비육아증, 이노바이러스 감염, 리케차 감염, 리케차성폭스, 리프트 밸리 열(RVF), 록키산 홍반열(RMSF), 로타바이러스 감염, 루벨라, 살모넬라증, SARS(중증 급성 호흡기 증후군), 옴, 주혈흡충증, 패혈증, 세균성 이질(세균성 적리), 대상포진(띠 헤르페스), 스몰폭스(마마), 스포로트리코시스, 포도상구균 식중독, 포도상구균 감염, 간충증, 매독, 조충증, 타누스(개구장애), 백선성모창(동전 버짐), 두부백선(두피의 백선), 샅백선(몸의 백선), 완백선(완선), 손 백선증(손의 백선), 흑색 백선증, 조갑백선(조갑진균증), 어루러기(전풍), 개회충증(장기유충 이행충(VLM)), 톡소포자충증, 선모충증, 트리코모나스증, 편충증(편충 감염), 결핵, 야생토끼병, 우레아플라스마 우레아리티쿰 감염, 베네수엘라 말 뇌염, 베니수엘라 출혈성 열, 바이러스성 폐렴, 서부 나일강 열, 백색 사모(White piedra)(블란카 백선), 에르시니아 슈도투베르쿨로시스 ( Yersinia pseudotuberculosis) 감염, 예르시니아증, 황열, 및 접합균증과 같은 진균성 질환으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 전염성 질환을 포함하나, 이로 제한되지는 않는 전염성 질환을 인간에서 치료하기 위하여 사용될 수 있다.
다른 실시 양태에서, 본 발명의 벡터 및 방법은 포유동물에서 하나 이상의 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일 태양에서, 포유동물은 인간이다. 다른 태양에서, 포유동물은 비-인간 동물이다. 본 발명의 기술을 사용해 치료될 수 있는 다양한 질환이 용이하게 포함될 수 있다. 이들 질환은 만성 신장 질환, 골관절염, 종양학, 바이러스성 상기도 감염, 고양이 형질 세포 구내염, 고양이 호산구성 육아종, 고양이 백혈병 바이러스 감염, 개 디스템퍼 감염, 전신성 진균 감염, 심근증, 점액성 다당류증 VII, 및 전염성 질환을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
*일 태양에서, 치료되는 질환은 동물에서 전염성 질환이며 이들 질환은 소 호흡기 질환, 돼지 호흡기 질환, 조류 인플루엔자, 조류 전염성 기관지염, 소 해면 양뇌증, 개 레슈마니아증(Canine leishmaniasis), 만성 소모성 질병, 인간 면역 결핍성 바이러스(HIV), 간염, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 돼지 콜레라(Classical swine fever), 에키노콕쿠스(Echinococcus), 유행성 폐렴, FIP, 구제역(Foot-and-mouth disease), 자그시에크테(Jaagsiekte), 메디-비스나병(Maedi-Visna), 동물에서 유방염, 개 소포자균, Orf(동물 질환), 가성우역(Peste des petits ruminants), 폭스병, 부리 및 깃털 병(Psittacine beak and feather disease), 광견병, 지중해열(부르셀라병) 또는 뱅병(Bang's disease) 또는 파상열, 몰타열, 전염 유산, 유행성 유산, 살모넬라 식중독, 장용성 파라타이포시스(enteric paratyphosis), 세균성 이질, 가성 결핵증, 흑사병(plague), 역병성열, 결핵, 비브리오, 선회병, 바일병(Weil's disease)(렙토스피라증) 또는 렙토스파이라성열, 유행성 출혈열(황달 출혈성 렙토스피라증), 낙농업 종사자 열(dairy worker fever)(L. hardjo), 재귀열, 진드기-매개 재귀열, 스피로헤타성 열병, 베가본드열, 기아열, 라임 관절염, 반워스 증후군(Bannworth's syndrome)(라임병), 진드기-매개 메닌고폴리뉴라이티스, 만성유주성홍반, 비브리오증, 대장균증(Colibacteriosis), 대장균 독혈증, 폐결핵, 돼지 창자 부종, 장용성파라타이포시스, 포도상구균 식사성 중독증, 포도상구균 위창자염, 개 코로나 바이러스(CCV) 또는 개 파보바이러스성 장염, 고양이 전염성 복막염 바이러스, 전염성위창자염(TGE) 바이러스, 해거먼 레드마우스 병(ERMD), 전염성 조혈괴사증(IHN), 돼지 악티노바실루스(헤모필루스) 흉막폐렴, 한센병, 스트렙토트리코시스(Streptotrichosis), 양의 피부 진균증, 가성피저(Pseudoglanders), 위트모어병, 프란시스병, 사슴-파리열, 야토병, 오하라병, 연쇄간균성열, 하버힐열, 유행성 관절염 부종, 서교증, 수송 또는 운반열, 출혈성 패혈증, 오르니토시스, 앵무병, 클라미디아증, 북미분아균증, 시카고병, 길크리스트병, 고양이 발톱병, 양성 림프성망내증, 양성 비세균성 임파선염, 간균성 혈관종증, 간균성 간자색반병, 큐열(Query fever), 발칸 인플루엔자, 발칸 그리프(Balkan grippe), 애버트와열, 진드기-매개열, 뉴모릭케시오시스(pneumorickettsiosis), 아메리카 참진드기발진티푸스, 진드기-매개 발진티푸스, 수포성 리켓치아증, 큐 가든 반점열, 벼룩-매개 발진티푸스, 풍토성 발진티푸스, 도시발진티푸스, 링웜, 피부사상균증, 백선, 피부사상균증, 소포자균증, 완선, 무좀, 스포트릭스 쉔키, 2형 진균, 크립토콕쿠스증 및 히스토플라스마증, 양상 표피 멍키폭스, BEMP, 원숭이 헤르페스바이러스, 원숭이 B병 베네수엘라말뇌염, 제C형 기면성뇌염, 황열, 흑토병, 헌터바이러스 폐 증후군, 한국형 유행성 출혈열, 유행성신염, 유행성출혈열, 출혈성 신증신염, 림프구맥락수막염, 캘리포니아뇌염/라 크로세 뇌염, 아프리카 출혈열, 그린 또는 벨벳 원숭이병, 하이드로포비아, 광견병(Lyssa), 전염성 간염, 유행성 간염, 유행성황달, 홍역, 모빌라이(Morbilli), 돼지 및 말 인플루엔자, 가금 흑사병, 뉴캐슬병, 파이로플라스마병, 톡소포자충증, 아프리카 수면병, 감비아파동편모충증, 로데시아파동편모충증, 샤가스병 , 샤가스-마짜병, 남아메리카 파동편모충증, 이질 아메바, 대장섬모충이질, 크립토스포리듐증, 람블편모충증, 피부리슈만편모충증: 치클레로궤양, 에스푼디아, 피안볼(pianbol), 우타(uta), 및 부바(buba)(아메리카에서); 오리엔탈 소어, 알레포 보일(Aleppo boil)(구 세계에서); 배그대드 보일(Bagdad boil), 델리 보일(Delhi boil), 바우루 궤양(Bauru ulcer), 내장레슈마니아증: 칼라-아자(kala-azar), 미포자충증, 고래회충유충증, 선모충증, 복부주혈선충증, 호산구 뇌수막염 또는 뇌막뇌염(A. 광동주혈선충), 복부 복부주혈선충증(A. 코스타리센시스), 구충증, 아메리카구충증, 구충병, 모세선충증, 부르기아시스(Brugiasis), 톡소카리아시스, 장결절충, 간충증, 증모세선충, 회충증, 열두조충증, 고충증, 포충증, 포충병, 에키노콕쿠스 과립증, 낭포성 포충병, 촌충 감염, 주혈흡충 등을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
전염성 병원균에 의해 유발된 악성 질환의 치료가 또한 포함된다. 이런 질환의 예로는 골육종, 백혈병, 림프종, EBV에 기인한 버킷 림프종, 라우스 레트로바이러스에 의해 기인한 라우스 육종, 제8형 헤르페스 바이러스에 의해 기인한 카포시육종, HTLV-I 레트로바이러스에 기인한 성인 T-세포 백혈병, 또는 HTLV-II에 기안한 모발상 세포 백혈병, 및 감염성 제제 및 바이러스에 의해 기인한 수많은 다른 종양 및 백혈병이 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
일 실시 양태에서, 하나 이상의 상기 질환을 치료하는데 사용되는 하나 이상의 단백질은 에리스로포이에틴, 그렐린, 오스테오프로테게린, RANKL, RANKL 디코이, TNF-a 길항제, IL-1 길항제, G-CSF, GM-CSF, IFN-a, IFN-g, 안지오스타틴, 엔도스타틴, TNF-a, PP1DCY-LSRLOC, β-글루쿠로니다제, IL-12를 포함하나, 이로 제한 되는 것은 아니다. 다른 실시 양태에서, 본 발명의 하나 이상의 단백질은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10R DN 또는 이의 서브유닛(subunit), IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, IL-24, IL-27, GM-CSF, IFN-알파, IFN-감마, IFN-알파 1, IFN 알파 2, IL-15-R-알파, CCL3(MIP-1a), CCL5(RANTES), CCL7(MCP3), XCL1(림포탁틴), CXCL1(MGSA-알파), CCR7, CCL19(MIP-3b), CXCL9(MIG), CXCL10(IP-10), CXCL12(SDF-1), CCL21(6Ckine), OX40L, 4-1BBL, CD40, CD70, GITRL, LIGHT, b-디펜신(Defensin), HMGB1, Flt3L, IFN-베타, TNF-알파, dnFADD, BCG, TGF-알파, PD-L1 RNAi, PD-L1 안티센스 올리고뉴클레오티드, TGFbRII DN, ICOS-L, S100를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
일 실시 양태에서, 하나 이상의 개시된 질환을 앓는 포유동물에 투여되는 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 일 실시 양태에서, 벡터는 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 실시 양태에서, 유전자 스위치는 EcR-기반 유전자 스위치이다. 다른 실시 양태에서, 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제1 프로모터의 조절하의 제1 전사 인자 서열 및 제2 프로모터의 조절하의 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 여기서, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질은 상호작용하여 리간드-의존성 전사 인자ㄹ르를 형성한다. 일 태양에서, 리간드는 다이아실하이드라진이다. 다른 태양에서, 리간드는 RG-115819, RG-115932, 및 RG-115830로부터 선택된다. 또 다른 태양에서, 리간드는 아미도케톤 또는 옥사디아졸린이다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 하나 이상의 리소좀 축적 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 일 태양에서, 포유동물은 인간이다. 다른 태양에서, 포유동물은 비-인간 동물이다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 리소좀 축적 질환의 예로는 폼페병/글리코겐 축적 질환 타입, 고셔병(제I형, 제II형, 제III형), 파브리병, 점액 다당류증 II(헌터 증후군), 점액 다당류증 VI(마로토-라미 증후군), 점액 다당류증 I, 이염백질이영양증, 신경리포푸신증 또는 CLN6병(비정형 후기 영아기, 후기 개시 변이, 초기 청소년기, 핀란드 변이 후기 영아기 CLN5, 얀스키비-엘슈보스키병/후기 영아기 CLN2/TPP1병, 쿠프스/성인-개시 NCL/CLN4병, 노던 간질/변이 후기 영아기 CLN8, 산타부오리-할티아(Santavuori-Haltia)/영아기 CLN1/PPT병, 베타-만노시도시스), 바텐-스필메이어-보그트(Batten-Spielmeyer-Vogt)/연소성 NCL/CLN3병, 산필립포 증후군 타입 A, 산필립포 증후군 타입 B, 산필립포 증후군 타입 C, 산필립포 증후군 타입 D, MPSI 후를러 증후군, 니만-피크 병(타입 A, 타입 B, 타입 C, 타입 D), 본 발명은 결핍/GM2 강글리오시드 축적증, 알파-만노시도시스, 아스파틸글루코사미누리아, 콜레스테릴 에스테르 축적병, 만성 헥소사미니다제A 결핍, 시스티노시스, 대논병(Danon disease), 파아버병(Farber disease), 푸코시드축적증, 갈락토시알리도시스(골드버그 증후군), GM1 강글리오시드 축적증(영아기, 후기 영아기/청소년기, 성인/만성의), I-세포병/뮤코리피드증 II, 영아기 유리 시알산 축적병/ISSD, 청소년기 헥소사미니다제 A 결핍, 크라베병(영아기 개시, 후기 개시), 뮤코다당증 장애(가성-후를러 다발성이영양증/뮤코리피드증 IIIA, 샤이에 증후군, MPS I 후를러-샤이에 증후군, 모르쿠오 타입 A/MPS IVA, 모르쿠오 타입 B/MPS IVB, MPS IX 히알루로니다제 결핍, 슬라이 증후군(MPS VII), 뮤코리피드증 I/시알리다아제결핍증, 뮤코리피드증 IIIC, 뮤코리피드증 타입 IV), 다발 설파타제 결핍, 피크노디소토시스, 샌드호프병/성인 개시/GM2 강글리오시드 축적증, 샌드호프병/GM2 강글리오시드 축적증 - 영아기, 샌드호프병/GM2 강글리오시드 축적증 - 청소년기, 쉰들러병, 살라병, 영아기 시알산 축적병, 테이-삭스/GM2 강글리오시드 축적증, 월만병, 아스파릴글루코사미누리아, 및 프로사포닌가 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
산필리포 증후군 타입 A는 산필리포 증후군 타입 A/MPS IIIA와 동의어이고, 산필리포 증후군 타입 B는 산필리포 증후군 타입 B/MPS IIIB와 동의어이고, 산필리포 증후군 타입 C는 산필리포 증후군 타입 C/MPS IIIC와 동의어이고, 산필리포 증후군 타입 D는 산필리포 증후군 타입 D/MPS IIID와 동의어인 것으로 여겨진다.
일 실시 양태에서, 하나 이상의 상기 리소좀 축적 질환을 치료하기 위해 사용되는 본 발명의 벡터에 의해 발현된 하나 이상의 단백질은 a-갈락토시다제 A, 아릴설파타제 A, a-글루코시다제, b-글루코시다제, 글루코세레브로시다제, CLN6 단백질, 청소년기 관련 CLN3, N-설포글루코사민 설포하이로라제(SGSH), a-N-아세틸글루코사미니다제, 아세틸-CoA-글루코사미니드 아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사민-6-설파타제, a-L-아이두로니다제, 아릴설파타제 B, 산 스핑고미엘리나제, 아이우두로네이트 설파타제를 포함하나, 이로 제한되지는 않는다.
일 실시 양태에서, 하나 이상의 개시된 리소좀 축적 질환을 앓는 포유동물에 투여되는 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 일 실시 양태에서, 벡터는 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 실시 양태에서, 유전자 스위치는 EcR-기반 유전자 스위치이다. 다른 실시 양태에서, 유전자 스위치를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제1 프로모터의 조절하의 제1 전사 인자 서열 및 제2 프로모터의 조절하의 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 여기서, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 코딩되는 단백질은 상호작용하여 리간드-의존성 전사 인자를 형성한다. 일 태양에서, 리간드는 다이아실하이드라진이다. 다른 태양에서, 리간드는 RG-115819, RG-115932, 및 RG-115830로부터 선택된다. 또 다른 태양에서, 리간드는 아미도케톤 또는 옥사디아졸린이다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 하나 이상의 간질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일 태양에서, 포유동물은 인간이다. 다른 태양에서, 포유동물은 비-인간 동물이다. 일 태양에서, 간 질환은 B형 간염이다. 다른 태양에서, 간 질환은 C형 간염이다. 일 실시 양태에서, 본 발명의 벡터에 의해 발현된 단백질은 IFN-α이다. 다른 실시 양태에서, 본 발명의 벡터에 의해 발현된 단백질은 세룰로플라스민을 포함한다. .
B형 및 C형 간염 바이러스 감염 및 치료에 대한 인간 간 키메라 마우스 모델의 비-제한적인 예는 [Bissig, K.D. et al., J. Clin . Investigation 120: 924(2010)]에 개시되어 있다. 인간 간세포 모델의 다른 비-제한적인 예는 예쿠리스TM(YecurisTM)(Portlan, OR)에 의해 상용화된 인간화된 마우스 시스템이다.
항바이러스/항감염성 치료를 평가하기 위해 유용한 뇌염 모델의 비-제한적인 예는 [O'Brien, L. et al., J. General Virology 90: 874-882(2009)]에 개시되어 있다.
항바이러스/항감염성 치료를 평가하기 위해 유용한 인플루엔자 모델의 비-제한적인 예는 [Beilharz, M.W. et al., Biochemical Biophysical Research Communications 355: 740-744(2007); 및 Koerner, I. et al., J. Virology 81: 2025-2030(2007)]에 개시되어 있다.
일 실시 양태에서, 하나 이상의 개시된 간 질환을 앓는 포유동물에 투여되는 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 일 실시 양태에서, 벡터는 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 실시 양태에서, 유전자 스위치는 EcR-기반 유전자 스위치이다. 다른 실시 양태에서, 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 제1 프로모터의 조절하의 제1 전사 인자 서열 및 제2 프로모터의 조절하의 제2 전사 인자 서열을 포함하며, 여기서, 상기 제1 전사 인자 서열 및 상기 제2 전사 인자 서열에 의해 인코딩되는 단백질은 상호작용하여 리간드-의존성 전사 인자를 형성한다. 일 태양에서, 리간드는 다이아실하이드라진이다. 다른 태양에서, 리간드는 RG-115819, RG-115932, 및 RG-115830로부터 선택된다. 또 다른 태양에서, 리간드는 아미도케톤 또는 옥사디아졸린이다.
본 발명은 면역조절자의 기능을 가진 단백질 및, 선택적으로 IL-12를 조건적으로 발현하기 위하여 세포, 예를 들어, 면역 세포 및 TSC의 조작, 및 암 또는 종양 또는 둘 모두의 치료를 위한 치료적 용도 및/또는 응용을 제공한다. 면역조절자의 기능을 가진 단백질 및 선택적으로 IL-12를 조건적으로 발현하는 시험관 내에서 조작된 면역 세포 및 TSC는 단백질(들)의 구성적 생산에 비하여 안전한 개선이다. 부가적으로, 면역조절자 및 선택적으로 IL-12 발현의 타이밍과 수준을 조절하는 능력은 치료 효능의 개선된 조절을 제공한다. 따라서, 시험관 내에서 조작된 면역 세포 및 TSC는 인간 또는 비-인간 유기체에서 암 또는 종양의 치료를 위한 치료제로서 약학 조성물로 제제화될 수 있다. 대안적으로, 면역 세포, TSC 또는 그 서브세트의 시험관 내에서 조작된 집단은 면역 조절자 및 선택적으로 IL-12 단백질 생산을 인간 또는 비-인간 유기체의 신체 내의 특정 영역(정상 조직, 암, 또는 종양)에 조건적으로 전달하기 위해 비히클로서 사용될 수 있다. 면역 세포는 자가 조직의 또는 비자가조직의 수지상 세포일 수 있다. 수지상 세포는 골수로부터 또는 말초 혈액 순환으로부터 단리될 수 있다. 인간 환자에서, 수지상 세포 집단은 백혈구 성분 채집술(leukophoresis) 절차를 통해 단리될 수 있으며, 여기서는 백혈구 분획은 단리되어 제거되며 다른 혈액 구성요소는 환자에게 재주입된다.
다른 실시 양태에서, 수지상 세포는 인간 조혈 줄기 세포를 면역조절자의 기능을 가진 단백질 및 선택적으로 IL-12의 기능을 가진 단백질을 발현하는 본 발명의 벡터로 형질감염시키고, 형질감염된 줄기 세포를 분화시켜 수지상 세포를 생성함으로써 제조될 수 있다. 미국 특허 제6,734,014호를 참고한다.
일 실시 양태에서, 유전자 스위치를 함유한 핵산 아데노바이러스 벡터가 제공되며, 여기서, VP16-RXR 및 Gal4-EcR을 위한 코딩 서열은 인간 유비퀴틴 C 프로모터의 조절하에 아데노바이러스 셔틀 벡터내로 삽입되는 EMCV 내부 리보좀 진입 부위(IRES) 서열에 의해 분리된다. 예를 들어, IRES 서열에 의해 분리되고, 합성 유도성 프로모터의 조절하에 배치된 IL12의 p40 및 p35 서브유닛을 위한 코딩 서열은 유비퀴틴 C 프로모터의 상류에 삽입된다. 다른 실시예에서, 합성 유도성 프로모터의 조절하에 배치된 TNF-알파의 코딩 서열은, 유비퀴틴 C 프로모터의 상류에 삽입된다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 이. 콜라이 BJ5183 세포에서 아데노바이러스 골격(AdEasy1)과 재조합된 두 개의 융합 단백질 및 유도성 IL-12 또는 TNF-알파 서브유닛을 위한 전사 유닛(VP16-RXR 및 Gal4-EcR)을 보유한 셔틀 벡터를 제공한다. 재조합 클론을 확인한 후, rAd.RheoIL12 게놈을 보유한 플라스미드는 XL10-골드 세포에서 성장되고 정제되며, 플라스미드 골격이 분해되고 HEK293 세포 내 또는 CHO 세포로의 형질감염에 의해 패키징된다.
농도를 향상시키기 벡터의 정제는 밀도 구배 정제(예를 들어, 세슘 클로라이드(CsCl)) 또는 크로마토그래피 기술(예를 들어, 컬럼 또는 배취 크로마토그래피)에 의해서와 같은 임의의 적합한 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터는 둘 또는 세개의 CsCl 밀도 구배 정제 단계로 처해질 있다. 벡터, 예를 들어, 복제-결핍성 아데노바이러스 벡터는 바람직하게 아데노바이러스로 감염된 세포를 용해하는 것, 용해물을 크로마토그래피 레진에 적용하는 것, 크로마토그래피 레진으로부터 아데노바이러스를 용출하는 것, 및 아데노바이러스를 함유하는 분획을 수집하는 것을 포함하는 방법을 사용하여 복제-결핍성 아데노바이러스 벡터로 감염된 세포로부터 정제된다.
구체적 실시 양태에서, 생성된 일차 바이러스 스톡은 HEK 293 세포 또는 CHO 세포의 재감염에 의해 증폭되며 CsCl 밀도-구배 원심분리에 의해 정제된다.
일 실시 양태에서 면역조절자 예를 들어, TNF-알파 및/또는 IL-12 유전자는 야생형 유전자 서열이다. 다른 실시 양태에서, 면역조절자 예를 들어, TNF-알파 및/또는 IL-12 유전자는 변경된 유전자 서열, 예를 들어, 키메라 서열 또는 바람직한 코돈을 사용하도록 변경된 서열이다.
일 실시 양태에서, IL-12 유전자는 야생형 마우스 IL-12 서열이다. 다른 실시 양태에서, 이 서열은 야생형 마우스 서열과 적어도 85% 동일하며, 예를 들어 야생형 마우스 서열과 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일하다. 추가의 실시 양태에서, IL-12 유전자 서열은 마우스 IL-12 폴리펩티드를 코딩한다. 다른 실시 양태에서, IL-12 유전자는 야생형 마우스 IL-12 폴리펩티드와 적어도 85% 동일하며, 예를 들어 야생형 마우스 IL-12 폴리펩티드와 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일하다.
일 실시 양태에서, 면역조절자 및/또는 IL-12 유전자는 인간 야생형 서열이다. 다른 실시 양태에서, 이 서열은 야생형 인간 서열과 적어도 85% 동일하며, 예를 들어 야생형 인간 서열과 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일하다. 추가의 실시 양태에서, 이 유전자 서열은 인간 폴리펩티드를 코딩한다. 다른 실시 양태에서, 이 유전자는 야생형 인간 폴리펩티드와 적어도 85% 동일하며, 예를 들어 야생형 인간 폴리펩티드와 적어도 90%, 95%, 또는 99% 동일하다.
DC는 인간, 마우스 또는 기타 포유동물 유래의 골수로부터 단리될 수 있다. 수지상 세포는 인간, 마우스 또는 기타 포유동물의 혈액으로부터 단리될 수 있다. 인간 환자에 있어서, 수지상 세포 집단은 당업계에 공지된 바와 같이 백혈구 성분 채집(leukophoresis) 절차를 통하여 단리될 수 있으며, 여기서, 백혈구 세포 분획이 단리되어 제거되고 다른 혈액 성분은 환자에게 재주입된다. 일 실시 양태에서, DC는 이전에 기술된 바와 같이 쥐과 골수로부터 유래된다(Tatsumi et al., 2003). 간략하게는 야생형 또는 EGFP Tg 마우스 골수(bone marrow, BM)는 37℃에서 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 7일 동안 1000 단위/ml의 재조합 쥐과 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자 및 재조합 mIL-4(미국 뉴저지주 로키 힐 소재의 페프로테크(Peprotech))가 보충된 조절 배지(conditioned medium, CM)에서 배양된다. 그 후 CD11c+ DC는 예를 들어 특이적 MACSTM 비드를 이용하여, 제조업자(미국 캘리포니아주 오번 소재의 밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotec))의 지시에 따라 단리된다. 이러한 방식으로 생성된 CD11c+ DC는 CD11b, CD40, CD80, 및 클래스 I 및 클래스 II MHC 항원의 공동 발현 및 형상에 기반하면 순도가 >95%이다.
본 발명의 일 실시 양태는 인간 또는 비-인간 유기체에서 유전자 치료법으로서 암, 또는 종양 또는 이들 둘 모두의 치료를 위한 치료적 응용에 적합한, 면역조절자의 기능을 갖는 단백질 및 선택적으로 IL-12를 조건부로 발현하는 조작된 면역 세포 및 TSC를 제공한다. 일 실시 양태에서, 본 발명은 유전자 스위치를 함유하는 조작된 면역 세포 및 TSC를 제공한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 엑디손 수용체의 적어도 일부분을 포함하는 조작된 면역 세포 및 TSC를 제공한다. 다른 실시 양태에서, 본 발명은 엑디손 수용체 기반의 유전자 스위치를 포함하는 조작된 면역 세포 및 TSC를 제공한다. 다른 실시 양태에서, 본 발명은 레오스위치를 포함하는 조작된 면역 세포 및 TSC를 제공한다. 다른 실시 양태에서, 본 발명은 유전자 스위치 및 유전자 스위치를 조정하는 리간드를 포함하는 조작된 면역 세포 및 TSC를 포함하는 키트를 제공한다. 다른 실시 양태에서, 본 키트는 다이아실하이드라진 리간드를 추가로 포함한다. 다른 실시 양태에서, 본 키트는 RG-115830 또는 RG-115932를 포함한다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 TSC 및 면역 세포의 조작된 집단을 제공한다. 일 실시 양태에서, 7일에 배양된 DC를 구성적 또는 유도성 프로모터로 구동되는 면역조절자 및/또는 IL-12를 인코딩하는 재조합 아데노바이러스로 처리되거나, 또는 일련의 감염 다중도(multiplicity of infection, MOI)에 걸쳐 모크(mock) 대조 아데노바이러스 벡터(rAdψ5)로 감염된다. 48시간 후, 감염된 DC를 수확하고, 62.5 pg/ml의 더욱 낮은 검출 한계를 이용하여 특이적 ELISA 키트(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 비디-파밍젠(BD-PharMingen))를 이용하여 면역조절자 및/또는 IL-12의 생성에 대하여 그리고 표현형에 대하여 분석한다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 면역조절자 및/또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 조건부로 발현할 수 있는 유전자 스위치를 갖는 벡터, 예를 들어 DNA 벡터를 포함하며, 활성화 리간드를 추가로 포함하는 시험관 내에서 조작된 면역 세포 집단 및 TSC를 제공한다. 추가의 실시 양태에서, 본 발명은 조작된 DC를 환자에게 투여하는 단계 및 그 후 활성화 리간드, 예를 들어 RG-115819, RG-115830 또는 RG-115932를 상기 환자에게 투여하는 단계에 의해 암, 예를 들어 흑색종 또는 신경교종의 치료 방법을 제공한다. 소정의 실시 양태에서, 본 발명은 면역조절자 예를 들어, TNF-알파를 조건부로 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스를투여하는 것, 및 활성화 리간드를 투여하는 것을 포함하는 암, 예를 들어 흑색종 또는 전립선암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 환자는 암을 가진 인간 또는 동물일 수 있다. 치료 방법 및 생성물, 조작된 세포, 키트 및 리간드는 인간 치료법 및 수의학적 동물 치료법에서 응용성을 갖는다. 따라서, 본 생성물 및 방법은 인간 및 수의학적 동물 목적용으로 사용되는 것이 고려된다.
따라서, 일 실시 양태에서, 면역조절자 예를 들어, TNF-알파를 발현하는 폴리뉴클레오티드, 및 활성화 리간드는 암을 가진 환자에게 공-투여된다. 활성화 리간드는 일반적으로 수일에 걸쳐, 예를 들어 폴리뉴틀레오티드의 투여 전 및 후에 투여된다. 면역조절자, 예를 들어 TNF-알파에 기인한 전신 독성이 발달할 경우, 부작용을 약화시키기 위한 노력으로서 그후 활성화 리간드의 투여는 감소되거나 제거될 수 있다.
다른 실시 양태에서, 면역조절자 예를 들어, TNF-알파를 발현하는 폴리뉴클레오티드 및 활성화 리간드는 하나 이상의 리소좀 축적 질환, 또는 하나 이상의 간 질환을 앓는 환자에게 공동-투여된다. 활성화 리간드는 일반적으로 수일에 걸쳐, 예를 들어 폴리뉴틀레오티드의 투여 전 및 투여 후에 투여된다. 전신 독성이 발달할 경우, 부작용을 약화시키기 위한 노력으로서 그후 활성화 리간드의 투여는 감소되거나 제거될 수 있다.
소정의 실시 양태에서, 본 발명은 면역조절자, 예를 들어 TNF-알파를 조건부로 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 투여하는 것, 및 활성화 리간드를 투여하는 것을 포함하는 종양 크기를 감소시키는 방법을 제공한다. 또한 면역조절자, 예를 들어 TNF-알파를 조건부로 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 투여하는 것, 및 활성화 리간드를 투여하는 것을 포함하는 종양 형성을 방지하는 방법이 제공된다. 일부 실시 양태에서, 본 발명은 면역조절자, 예를 들어 TNF-알파를 조건부로 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 투여하는 것, 및 활성화 리간드를 투여하는 것을 포함하는 신생물 장애의 하나 이상의 증상을 감소시키는 방법을 제공한다. 특히, 면역조절자를 조건부 발현하는 벡터, 예를 들어,아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 면역조절자를 구성적으로 발현하는 벡터와 비교할 때 치료되는 대상에서 전신 독성을 감소, 방지, 개선시킬 수 있다.
소정의 실시 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 하나 이상의 단백질을 조건부로 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 투여하는 것, 및 활성화 리간드를 투여하는 것을 포함하는 하나 이상의 질환 또는 하나 이상의 리소좀 축적 질환, 또는 하나 이상의 간 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시 양태에서, 본 발명은 포유동물에서 면역조절자, 예를 들어 TNF-알파를 조건부로 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 투여하는 것, 및 활성화 리간드를 투여하는 것을 포함하는 하나 이상의 질환 또는 하나 이상의 리소좀 축적 질환, 또는 하나 이상의 간 질환의 하나 이상의 증상을 감소 또는 개선시키는 방법을 제공한다.
단백질-기반 태그는 효과적인 표적화를 위한 고도의 특이적인 번역-후 변경에 대한 필요성을 감소시키거나 제거한다. 유용한 단백질-기반 태그는 IGF2R 표적화(IGF2(GILT)/ IGF2 조작), 트랜스페린 수용체 표적화(트랜스페린, TfR-표적화 펩티드), 및 Tat 단백질(세포 표면 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(HSPG)이 Tat의 내재화를 매개함)을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
태그로서 사용될 수 있는 리소좀을 표적하기 위한 다른 단백질은 비타민 D 결합 단백질, 폴레이트 결합 단백질, 락토트랜스페린, 성 호르몬 결합 글로불린, 트랜스티레틴, 프로 사포신, 레티놀 결합 단백질, 아포 리포단백질 B, 아포 리포단백질 E, 프로락틴, 수용체 관련 단백질(일 실시 양태에서, HNEL 서열 없음), 천연 트랜스페린, 및 돌연변이 트랜스페링(transferring)(예를 들어, K225E/R651A 돌연변이 또는 K225E/K553A 돌연변이)를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
일 실시 양태에서, 발현 작제물은 리포터 서열, 국소화 태그 서열, 탐지 태그 서열 중 하나 이상을 또한 인코딩한다. 본 발명의 조성물 또는 조성물을 사용하는 방법은 생체 내에서 신생 세포 또는 종양의 성장을 제거, 감소, 억제 또는 조절하는 임의의 화학요법제 또는 제제(예를 들어, 치료적 레지멘과 결합되어 제공됨)와 조합하여 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "화학요법제" 또는 "화학요법약"은 생체 내 종양의 성장을 치료 또는 방지하기 위하여 투여되는 임의의 치료적 화합물을 의미하는 것으로 이해되어진다. 특히, 본 발명과 상용성인 화학요법제는 악성 세포의 성장을 감소 또는 지연시키기 위해 사용되는 작은 분자와 같은 "통상적인" 화학요법제 및 항체, 사이토카인, 안티센스 분자 등과 같은 더욱 최근에 개발된 생물제제 모두를 포함한다.
일 태양에서, 본 발명은 면역조절자 예를 들어, TNF-알파 및/또는 IL-12의 기능을 갖는 단백질을 발현하는 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC의 집단또는 벡터 예를 들어, 아데노바이러스 벡터를 포함하는 인간 또는 비-인간에게 투여하기에 적합한 약학 조성물을 제공하며, 여기서, 본 제형은 종양내 투여에 의해 투여하기에 적합하다. 다른 실시 양태에서, 조성물 예를 들어, 약학적 조성물은 면역조절자 예를 들어, TNF-알파를 조건부로 발현하는 벡터를 포함한다. 일부 실시 양태에서, 조성물은 약 1 x105 이상의 입자 유닛(pu)의 유전자 전이 벡터를 포함한다. "입자 유닛"은 단일 벡터 입자이다. 소정의 실시 양태에서, 조성물은 약 1 x106 입자 유닛의 유전자 전이 벡터(예를 들어,약 1 x 107 이상의 입자 유닛, 약 1 x 108 이상의 입자 유닛, 또는 약 1 x 109 이상의 입자 유닛)를 포함한다. 다른 실시 양태에서, 조성물은 약 1 x 1010 이상의 pu, 1 x 1011 이상의 pu, 1 x 1012 이상의 pu, 1 x 1013 이상의 pu, 1 x 1014 이상의 pu, 또는 1 x 1015 이상의 pu의 유전자 전이 벡터, 특히 복제-결핍성 아데노바이러스 벡터와 같은, 바이러스 벡터를 포함한다. 조성물에서 유전자 전이 벡터의 입자 유닛의 수는 본 명세서에서 추가로 기술된 바와 같은 유전자 전이 벡터의 표준 용액(즉, 공지된 유전자 전이 벡터 농도의 용액)의 흡광도를 조성물의 흡광도와 비교하는 것과 같은 임의의 적합한 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명은 활성화 리간드, 예를 들어 RG-115819, RG-115830 또는 RG-115932를 함유하는 약학 조성물을 추가로 제공하며, 여기서, 본 조성물은 복강내 투여, 경구 투여 또는 피하 투여에 의해 투여하기에 적합하다.
본 발명의 조성물, 예를 들어, 조작된 DC, 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터), 또는 활성화 리간드를 포함하는 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 담체는 조작된 수지상 세포, 유전자 전이 벡터, 또는 활성화 리간드에 대한 임의의 적합한 담체일 수 있다. 조성물에 대한 적합한 담체의 예는 미국 특허 제6,225,289호에 기술되어 있다. 담체는 전형적으로 액체일 것이나, 또한 고체일 수 있거나, 액체와 고체 성분의 조합일 수 있을 것이다. 담체는 바람직하게 약학적으로 허용가능한(예를 들어, 생리학적으로 또는 약물학적으로 허용가능한) 담체(예를 들어, 부형제 또는 희석제)이다. 약학적으로 허용가능한 담체는 널리 공지되어 있고 용이하게 입수가능하다. 담체의 결정은, 적어도 일부분은, 조성물에 성분에 의해 그리고 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 결정될 것이다. 조성물은 특히 조성물 및/또는 그의 최종-용도의 안정성을 강화하기에 적합한 임의의 다른 적합한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 넓고 다양한 본 발명의 조성물의 적합한 형태가 있다.
경구 투여에 적합한 제형은 (a) 물, 식염수, 또는 오렌지 쥬스와 같은 희석제에 용해된 활성 성분의 유효량과 같은, 액체 용액, (b) 고체 또는 과립으로서, 활성 성분의 미리결정된 양을 각각 함유하는 캡슐, 향냥 또는 정제, (c) 적절한 액체 내에 현탁액, 및 (d) 적합한 에멀전을 포함한다. 정제 형태는 하나 이상의 락토오스, 만니톨, 옥수수 전분, 감자 전분, 미결정 셀룰로오스, 아카시아, 젤라틴, 콜로이달 실리콘 디옥사이드, 크로스카르멜로스 소디움, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 및 다른 부형제, 착색제, 희석제, 완충제, 습윤제, 보존제, 향미제, 및 약물학적으로 적절한 부형제를 포함할 수 있다. 로젠지 형태는 향미제에, 일반적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트에 뿐만 아니라, 비활성 염기(젤라틴 및 글리세린, 또는 수쿠로즈 및 아카시아 같은)에 활성 성분을 포함하는 향정, 및 에멀전, 겔, 및 활성 성분에 추가로, 당업계에 공지된 바와 같은 그러한 부형제를 함유하는 것 등을 포함할 수 있다.
예를 들어, 벡터, 면역 세포 또는 TSC 또는 시험관 내 조작된 세포의 집단을 포함하는 조성물은 완충제 예를 들어, TRIS를 포함할 수 있다. 일 실시 양태에서, 조성물은 TRIS 및/또는 글리세린을 포함할 수 있다. 다른 실시 양태에서, 조성물은 산미제, 음이온 또는 비이온 계면활성제, 적합성 제제, 및/또는 희석제를 또한 포함한다.
흡입을 통한 투여를 위해 적합한 제형은 에어로솔 제형을 포함한다. 에어로솔 제형은 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 니트로젠, 등과 같은 가압된 허용가능한 압축가스로 위치될 수 있다. 이들은 네불라이저 또는 오토마이저로부터 전달을 위하여 비-가압된 조제로서 또한 제형화될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형은 항-산화제, 완충제, 세균발육저지제, 및 의도된 수용제의 혈액과 등장액인 제형을 부여하는 용질을 함유하는, 수용성 및 비수용성, 등장 멸균 주사액, 및 현탁화제, 용해제, 점증제, 안정제, 및 보존제를 포함할 수 있는 수용성 및 비-수용성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 앰플 및 바이알과 같은 단일-투여량 또는 다중-투여량 봉합된 컨테이너에 존재할 수 있으며, 사용하기 바로 직전에, 주사를 위해, 멸균 액체 부형제 예를 들어, 물의 첨가만을 필요로 하는 동결-건조(감압하에 동결건조된) 조건에서 저장될 수 있다. 임시 주사액 및 현탁액은 이전 상세히 기술된 멸균 파우더, 분말 및 종제로부터 준비될 수 있다.
항문 투여에 대해 적합한 제형은 에멀전화 베이스 또는 물-용해성 베이스와 같은 다양한 베이스와 활성 성분을 혼합함으로써 좌제로서 준비될 수 있다. 질내 투여에 대한 적합한 제형은 활성 성분에 추가로, 당업계에 적절한 것으로 공지된 담체와 같은 것을 함유하는, 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포옴 또는 스프레이 포뮬라로서 존재할 수 있다.
추가로, 조성물은 추가적인 치료적 또는 생물학적-활성인 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 적응증의 치료에서 유용한 치료적 인자가 존재할 수 있다. 이부프로펜 또는 스테로이드와 같은 염증을 조절하는 인자는 조성물의 일부분으로 유전자 전이 벡터의 생체내 투여와 관련된 붓기 및 염증 및 생리적 고통을 감소시킬 수 있다. 면역 시스템 억제자는 조성물 방법과 함께 투여되어 유전자 전이 벡터 자체 또는 장애와 관련된 임의의 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 대안적으로, 면역 증강자는 조성물에 포함되어 질환에 대항하는 몸의 천연적인 저항을 상향 조절할 수 있다. 게다가, 사이토카인은 조성물과 함께 투여되어 종양 부위에 면역 이펙터 세포를 유인할 수 있다.
본 명세서에 기술된 특정 실시 양태에서, 본 발명은
a. 포유동물에 있어서 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC의 집단을 종양내 투여하는 단계; 및
b. 상기 포유동물에게 치료적 유효량의 활성화 리간드를 투여하는 단계
를 순서대로 포함하는 종양 치료 방법을 제공한다.
일 실시 양태에서, 활성화 리간드는 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC 또는 벡터 예를 들어, 아데노바이러스 벡터를 포함하는 조성물과 실질적으로 동일한 시점에서, 예를 들어 상기 세포 또는 벡터 조성물을 투여하기 1시간 전 또는 1시간 후에 투여된다. 다른 실시 양태에서, 활성화 리간드는 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC 또는 벡터를 투여한 후 약 24시간 이하의 시점에서 투여된다. 또 다른 실시 양태에서, 활성화 리간드는 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC 또는 벡터 이후 약 48시간 이하의 시점에서 투여된다. 다른 실시 양태에서, 리간드는 RG-115932이다. 다른 실시 양태에서, 리간드는 일일 약 1 내지 50 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 다른 실시 양태에서, 리간드는 일일 약 30 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 다른 실시 양태에서, 리간드는 7 내지 28일의 기간 동안 매일 투여된다. 다른 실시 양태에서, 리간드는 14일의 기간 동안 매일 투여된다. 다른 실시 양태에서, 약 1 x 106 개 내지 1 x 108 개의 세포가 투여된다. 다른 실시 양태에서, 약 1 x 107 개의 세포가 투여된다.
일 실시 양태에서, 수지상 세포는 IL-2 및 IL-12를 조건부로 발현하도록 조작된다. IL-2는 이펙터 및 조절 T 세포, NK 세포 및 NK-T 세포에 강력한 조절 효과를 발휘한다. 세포에서의 IL-2 및 IL-12의 발현은 각각의 다른 수용체를 상호 상향조절하고 별도의 시그널링 경로에 의한 상보적인 생물학적 영향에 의해 상이하게 유도될 것으로 예상된다. 또한 IL-2와 IL-12의 조합은 면역 자극의 지속 기간을 연장하고 동물이 더욱 잘 견딜 수 있는 세포의 유효 투여량을 감소시킬 것으로 예상된다. Dietrich 2002, Wigginton 2002, 2001, 1996 및 Koyama, 1997, McDermott 및 Atkins 2008]; Berntsen et al 2008; Tarhini et al 2008; Heemskerk et al 2008; Horton et al 2008을 참조하라. IL-2의 폴리뉴클레오티드 서열은 수탁번호 U25676(인간); NM_008366(마우스); NM_204153(닭); 및 NM_053836(랫트)으로 입수가능하다. IL-12의 폴리뉴클레오티드 서열은 수탁번호 NM_000882(인간 IL12A); NM_002187(인간 IL12B); NM_008351(마우스 IL12a); NM_008352(마우스 IL12b); NM_213588(닭 IL12A); NM_213571(닭 IL12B); NM_053390(랫트 IL12a); 및 NM_022611(랫트 IL12b)로 입수가능하다. 서열 번호 13, 15, 21 및 23의 서열은 인간 및 마우스 IL-12와 그의 서브유닛을 코딩한다.
다른 실시 양태에서, 수지상 세포는 IL-18 및 IL-12를 조건부로 발현하도록 조작된다. IL-18은 IFN-감마 생성을 유도하며 T 헬퍼 세포 발생 및 NK 활성화를 촉진한다. 게다가, IL-18은 GM-CSF 생성을 증대시킬 수 있고 IL-1O 생성을 감소시킬 수 있다. IL-18 및 IL-12의 발현은 어느 하나의 사이토카인이 단독으로 투여될 때 관찰되는 한계를 극복할 것으로 예상된다. 수지상 세포에서의 IL-12 및 IL-18의 발현은 수지상 세포가 어느 하나의 사이토카인 단독으로 변환될 때보다 더욱 강한 종양 항원-특이적 Th1 반응을 촉진할 것으로 예상된다.
IL-12 및 IL-18 둘 모두를 분비하도록 조작된 DC의 종양내 주사는 최고 수준의 INF-γ 생성 및 완전한 종양 거부를 매개하였다(Tatsumi 2003). Vujanovic, 2006을 참조하라. 또한 Coughlin, 1998, Subleski, 206, Tatsumi, 2003, 및 Sabel, 2007; Shiratori et al 2007; Lian et al 2007; Iinuma et al 2006을 참조하라. IL-12 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는 상기를 참조하라. IL-18의 폴리뉴클레오티드 서열은 수탁번호 U90434(인간); NM_008360(마우스); EU747333(닭); 및 AY258448(랫트)로 입수가능하다.
다른 실시 양태에서, 수지상 세포는 IL-15 및 IL-12를 조건부로 발현하도록 조작된다. IL-15는 일부의 생물 활성을 IL-2와 공유하는데, IL-2는 또한 IL-15가 암에 대한 치료법에 잠재적으로 유용해지도록 한다. IL-15는 NK 세포 및 활성화된 T 세포의 증식을 촉진하며, 이펙터 T 세포의 확장을 지원한다. IL-15 표현은 NK 세포에 의한 증강된 IFN-감마 생성에 있어서 IL-12와 함께 상승 작용한다는 것이 보고되었다. Koka, 2004; Basak 2008; Lasek et al 2004. IL-15 및 IL-12의 종양내 전달은 흑색종 모델에서 유의한 종양 퇴화를 유도하였다(Lasek 1999). IL-12의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는 상기를 참조하라. 서열 번호 11 및 19의 서열은 인간 및 마우스 IL-15를 코딩한다. 도 2 및 도 4는 인간 및 마우스 IL-12 및 IL-15에 사용될 수 있는 발현 시스템의 플라스미드 지도이다.
다른 실시 양태에서, 수지상 세포는 IL-21 및 IL-12를 조건부로 발현하도록 조작된다. IL-21 및 그의 수용체는 IL-2 및 IL-15와 서열 상동성을 공유한다. IL-21은 NK 세포의 확장 및 성숙을 촉진한다. IL-21을 이용하여 NK 세포를 처리하면 IL-12 수용체가 유의하게 상향조절되기 때문에 IL-21의 생물적 효과는 IL-12와 함께 잠재적으로 상승 작용을 한다. 게다가, IL-21은 IL-12 신호 전달을 증강시킬 수 있으며 IFN-감마 생성 증가를 위하여 협력하였다. IL-12 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는 상기를 참조하라. IL-21의 폴리뉴클레오티드 서열은 수탁번호 AF254069(인간); NM_021782(마우스); NM_001024835(닭); 및 NM_0O1108943(랫트)으로 입수가능하다. 서열 번호 6, 7, 8, 9, 및 17의 서열은 인간 및 마우스 IL-21을 코딩한다. 서열 번호 1 및 2는 마우스 및 인간 IL-12 및 IL-21을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 작제물이다. 도 7 및 도 8은 각각 인간 및 마우스 IL-12 및 IL-21의 발현을 위하여 사용될 수 있는 발현 시스템의 플라스미드 지도이다.
다른 실시 양태에서, 수지상 세포는 TNF-알파 및 IL-12를 조건부로 발현하도록 조작된다. TNF-알파는 면역 세포의 강력한 활성자이다. 게다가, TNF-알파는 T 세포 상에서의 IFN-감마 및 IL-12 수용체의 증강된 발현에 있어서 IL-12와 함께 상승 작용할 수 있다. 동물 모델에서, IL-12 및 TNF-알파 둘 모두의 적용은 DN8+ T 세포에 의한 종양 침윤, 유의한 IFN-감마 생성 및 후속적인 종양 퇴화로 이어졌다. Sabel, 2003, 2004, 2007, Taniguchi, 1998, Lasek, 2000; 및 Xia et al 2008을 참조하라. IL-12의 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는 상기를 참조하라. TNF-알파를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 수탁번호 X02910(인간); NM_013693(마우스); 및 BC107671(랫트)로 입수가능하다.
다른 실시 양태에서, 수지상 세포는 IL-7 및 IL-12를 조건부로 발현하도록 조작된다. IL-7은 IL-2 패밀리의 구성원이며, T 세포 및 B 세포 림프구 생성(lympophoiesis)에 중요하다. IL-7은 나이브 및 기억 CD8+ T 세포의 생존 및 증식의 항상성을 조절한다. IL-7은 종양에 대한 CTL 생성을 증강시키는 것으로 입증되었다. 게다가, IL-12는 IL-7 매개된 증식을 증강시키도록 CD8+ T 세포 상에서 유도되어 작용한다. 또한, IL-7 및 IL-12는 CD8+ T 세포의 세포독성을 상승적으로 증강시킨다는 것이 보고되었다. Mehrotra, 1995; Sharma et al 2003; Tirapu et al 2002. 따라서, IL-7 및 IL-12의 공동발현은 더욱 최적인 항종양 반응을 제공할 것으로 예상된다. IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는 상기를 참조하라. IL-7을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 수탁번호 J04156(인간); NM_008371(마우스); NM_001037833(닭); 및 NM_013110(랫트)로 입수가능하다.
다른 실시 양태에서, 수지상 세포는 GM-CSF 및 IL-12를 조건부로 발현하도록 조작된다. GM-CSF는 조혈 전구 세포의 분화 및 증식을 조절하며, 수지상 세포와 같은 전문적인 항원 제시 세포(antigen presenting cell, APC)의 성숙에서 특히 중요한 역할을 한다. 또한 GM-CSF는 수지상 세포가 항원을 프로세싱하고 제시하는 능력을 증강시킨다. GM-CSF는 동물 연구에서 IL-12와는 상이하게 기능하며, 이들 둘 모두는 유의한 항종양 반응을 유발한다. IL-12(T 세포 활성화)와 GM-CSF(수지상 세포 활성화)의 조합은 항종양 면역성이 더욱 강력해지도록 할 것으로 예상된다. 동물 연구에서, IL-12 처리와 조합된 GM-CSF가 다수의 암 모델에서 종양 성장을 유의하게 억제하였다. (Wang, 2001; Chang, 2007; Jean, 2004; Nair, 2006; Hill 2002; Small et al 2007). 인간 임상 시험에서, GM-CSF + IL-12는 골수종 환자의 치료에 성공적으로 사용되었으며, 여기서, 상기 둘 모두의 사이토카인의 조합된 작용은 순환 B 세포를 감소시켰다. (Rasmussen, 2003; Hansson, 2007; Abdalla, 2007). 단일 세포에서의 GM-CSF 및 IL-12의 공동발현에 의해 순환 B 세포의 감소와 같은 원하지 않는 전신 효과가 회피될 것으로 예상된다. IL-12를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서는 상기를 참조하라. GM-CSF의 폴리뉴클레오티드 서열은 수탁번호 M11734(인간); NM_009969(마우스); EU520303(닭); NM_001037660(랫트 Csf2ra); 및 NM_133555(랫트 Csf2rb)로 입수가능하다.
다른 실시 양태에서, 수지상 세포는 케모카인(예를 들어, CCL3(MIP-1a), CCL5(RANTES), CCL7(MCP3), XCL1(림포탁틴), CCL19(MIP-3b), CXCL9(MIG), CXCL1O(IP-10), CXCL12(SDF-1), 또는 CCL21(6Ckine)) 및 IL-12를 조건부로 발현하도록 조작된다. 케모카인은 다양한 염증 및 비염증 상태 하에서 백혈구 및 기타 세포 유형의 왕래(trafficking) 및 활성화를 조절하는 화학주성 사이토카인이다. 염증성 사이토카인은 염증 및 조직 손상에 있어서 백혈구의 모집을 제어한다. 항상성 케모카인은 조혈 동안 골수 및 흉선에서뿐만 아니라 이차 림프 기관으로의 그리고 이차 림프 기관 내에서의 내비게이팅(navigating) 백혈구(예를 들어, 수지상 세포)와 같이 항존(housekeeping) 기능을 충족시킨다. 동물 연구에 있어서, IL-12 및 CXCL1O을 발현하는 2가지 별도의 아데노바이러스를 종양내로 동시 주입하면 CT26 쥐과 결장직장 선암종 세포주로부터 유래되는 종양 결절이 100% 퇴화되었다. [Narvaiza et al., 2000. Emtage et al., 1999]에는 IL2 및 XCL1(림포탁틴) 또는 IL-12 및 XCL1을 발현하는 2가지 이중 재조합 아데노바이러스 벡터가 기술되어 있다. 마우스에서 유방 선암종에 상기 벡터들을 종양내 주사하면 강력한 항종양 반응이 유발되었고 보호 면역이 생기게 되었다. 다른 동물 연구에서, IL-12 및 CCL27을 발현하는 아데노바이러스 벡터들의 동시 형질도입은 종양 퇴화 및 장기간 특이 면역으로 이어졌다. (Gao et al., 2007). 따라서, 본 발명에 따른 IL-12 및 케모카인의 동시발현은 상승 작용적 항종양 활성으로 이어질 것으로 예상된다.
다른 실시 양태에서, 수지상 세포는 항혈관신생 사이토카인(예를 들어, IP-10 및 Mig) 및 IL-12를 조건부로 발현하도록 조작된다. IP-10 및 Mig는 T 세포 및 NK 세포에 있어서 화학주성물질이며 이들이 혈관신생을 억제하는 능력은 NK 세포에 의존적이다. 동물 연구에 의하면, 하나가 IP10을 발현하며 다른 것이 IL-12를 발현하는 두 아데노바이러스를 이용한 병용 요법이 두드러진 항종양 시너지로 이어졌음이 밝혀졌다.(Narvaiza et al., 2000). 다른 연구에서, IPlO 또는 MIG 및/또는 IL-12를 발현하는 아데노바이러스 벡터를 유방 선암종 및 섬유육종의 쥐과 모델에 있어서 종양내 투여하였다. IP-10 또는 MIG를 IL-12와 조합하여 투여하면, IP1O, MIG, IL-12 단독 또는 대조 처리 동물과 비교할 때 종양이 상당히 퇴화되었으며 종양을 지닌 동물의 생존 시간이 증가하였고, 이때 IP-10, IL12 조합이 가장 효과적이었다.(Palmer, 2001). 또한 [Mazzolini, 2003; 및 Huang, 2004]를 참조하라. 따라서, 항혈관신생 사이토카인 및 IL-12의 동시발현이 상승작용적 항종양 활성으로 이어질 것이라 예상된다.
효과적인 IL-12-매개 유전자 치료법을 증명하기 위하여, 조건부 cDNA 발현 시스템이 사용되는데 이는 종양내 주사 후 다양한 시점에서 면역 세포 또는 TSC에 의한 면역조절자 및/또는 IL-12 생성이 시작되게 한다. C57BL/6 마우스에 있어서 공격적 B16 흑색종 모델에서의 결과를 기반으로 하면 하기 결론이 만들어진다: 1) 상승된 수준의 IL-12가 활성화 리간드 RG-115830의 존재 하에서는 DC.RheoIL12로부터 분비되지만 상기 리간드의 부재 하에서는 그러하지 않음; 2) DC 주사 24시간 내에 RG-115830이 처리 동물에 투여되는 한 종양내 DC.RheoIL12-기반 치료법은 종양내 DC.cIL 12-기반 치료법만큼 효과적임(그리고 이후의 시점에 리간드가 제공되면 RG-115830 치료법은 실패함); 3) DC에서의 IL-12 발현은 종양 미세환경에서의 이들 세포의 생존을 연장시키는 것으로 보이며 이는 종양-배출 림프절로 이동하는 더욱 많은 개수의 종양내-주사 DC와 관련됨; 및 4) 치료 결과에 상관되는 가장 강한 면역이라는 것은 당해 치료법에 의해 교차-프라이밍되는 종양-특이적 CD8+ T 세포의 수준이며 종양 미세환경 내에서 유지되는 주사된 DC의 개수가 아님. 전체적으로는, 이들 데이터는 항-종양 T 세포의 종양 미세환경 내로의 주사 DC-매개 모집 등과 같이 제1형 CD8+ T 세포 이펙터의 구심성(교차-프라이밍)에 대한 긍정적인 영향을 기반으로 하면 그리고 이후의 원심성 이벤트(event)에 대해서는 그러하지 않다는 것을 기반으로 하면, DC.IL12-기반 치료법이 성공적일 가능성이 있음을 시사한다.
종양내 주사 이전에, 세포(면역 세포 또는 TSC)는 세포의 활성을 촉진하는 인자로 처리될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포는 OX40L, 4-1BBL, CD40, CD40L, GITRL, CD70, LIGHT 또는 ICOS-L을 포함하는 양성 공동 자극 분자 또는 항-CTLA4, 항-PD-L1 또는 항-PD-L2 항체와 같은 음성 공동 자극 분자와 같은 공동 자극 분자로 처리될 수 있다. 예를 들어, 세포(예를 들어, 면역 세포 또는 TSC)는 하나 이상의 공동 자극 분자를 발현하는 세포, 예를 들어, CD40 리간드 분자를 발현하는 J588 림프종 세포와 함께 인큐베이션될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 세포(면역 세포 또는 TSC)는 반대 면역 억제 분자(허용성 억제제), 예를 들어 항-TGF-베타 항체(미세환경 내에서의 TGF 시그널링을 억제하기 위하여), 항-IL10 항체, TGFbRII DN(유전자 변경 세포 내에서의 TGF 시그널링의 억제를 위하여), IL-1OR DN, dnFADD(세포 내에서의 세포 사멸 경로를 억제하기 위하여), 항-SOCS1 항체, siRNA 또는 방해용 물질(decoy)(세포 내에서의 억제 사이토카인 시그널링을 억제하기 위하여) 또는 항-TGFa 항체로 처리될 수 있다.
도 1 내지 도 8에 예시된 폴리뉴클레오티드 서열을 지니는 재조합 아데노바이러스가 생성된다. 예를 들어, hIL-21은 좌측 ITR의 상류 부위에서의 제한효소 절단에 의해 선형화된 hIL-21 발현 벡터, 및 HEK293 세포와 같은 허용 세포주 내의 적절한(예, E3 결실) 아데노바이러스 골격의 동시 형질감염에 의해 생성된다. 쥐과 면역조절 유전자를 지니는 아데노바이러스 벡터는 쥐과 치료 모델에서 사용하기 위한 쥐과 수지상 세포 또는 TSC의 형질도입에 사용된다. 인간 치료 응용에 있어서, 면역조절 유전자의 인간 상동체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적절한 벡터 내에 삽입된다. 인간 치료 응용을 위한 아데노바이러스 벡터는 GMP 상태 하에 생성된다. III/IV기 흑색종 환자에 있어서의 치료 개요(임상 시험)의 예로는 하기가 있다: 이 사례에서의 치료는 아데노바이러스가 형질도입된 수지상 세포의 종양내 주사 및 활성자 약물(리간드)의 14일간의 매일 경구 투여를 포함한다. 대상은 임상 시험 30일 이전 내지 1주일 이전에 스크리닝된다. 각각의 대상에게 고지에 입각한 동의서에 서명하도록 요청한 후 임의의 절차를 개시한다. 연구자는 그 성질, 목표, 지속 기간, 잠재적인 위험, 및 상기 임상 시험 동안 수행되는 절차와, 대상의 진료 기록이 FDA에 의해 검토될 수도 있다는 가능성을 모든 대상에게 고지할 것이다. 대상(총 16 내지 20명)은 4개의 코호트(cohort)로 임의로 분류된다. 모든 코호트는 제1 투여량의 리간드를 경구 투여한지 대략 3시간 후 최대 5x107개의 형질도입된 수지상 세포의 종양내 주사를 받을 것이다. 4개의 코호트는 받는 리간드의 매일 경구 투여량이 상이하다: 예, 코호트 1= 0.01 mg/kg; 코호트 2= 0.3 mg/kg; 코호트 3= 1 mg/kg; 코호트 4=3 mg/kg. 처리 코스 동안, 활성자 약물 및 그의 주요 대사산물의 단일 투여량 및 정상 상태의 약동학적 특성의 평가를 위하여 명시된 시간 간격으로 혈액을 채취한다. 또한, 바이러스 벡터, RTS 구성요소 및 종양에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응의 평가를 위하여 명시된 시점에서 혈액을 채취한다. 혈청 화학 검사, 소변 검사 및 혈액 검사(안전 프로파일)을 위하여 명시된 시점에서 혈액을 채취하고 소변을 수집한다. 종양 및/또는 배출 림프절 생검체를 명시된 시점에서 취하여 트랜스유전자 발현 및 종양에 대한 면역 반응을 당해 치료법의 결과로서 평가한다. 이상 반응(adverse event)의 경우 환자에 대하여 초기 종결에 대한 기준을 확립하고, 이상 반응을 기록한다. 환자를 이상 반응 및 치료 결과에 대하여 1개월, 2개월, 3개월 및 4개월에서 추적한다.
다른 실시 양태에서, 종양 치료를 필요로 하는 대상에게 (a) 면역조절자, 예를 들어 본 명세서에 개시된 면역조절자를 구성적으로 또는 조건부로 발현하도록 조작된 수지상 세포를 투여하며/또는, (b) 면역조절자, 예를 들어 본 명세서에 개시된 면역조절자를 구성적으로 또는 조건부로 발현하는 벡터를 대상에게 종양내 주사한다. 일 실시 양태에서, 수지상 세포는 Ad-면역조절용 벡터, 특히 Ad-RTS-면역조절자 벡터를 발현하도록 조작된다. 다른 실시 양태에서, 대상에게 종양내 주사되는 벡터는 Ad-면역조절자 벡터, 특히 Ad-RTS-면역조절자 벡터이다.
다른 실시 양태에서, 종양 치료를 필요로 하는 대상에게(a) IL-12를 구성적으로 또는 조건부로 발현하도록 조작된 수지상 세포를 투여하며,(b) IL-12를 구성적으로 또는 조건부로 발현하는 벡터를 대상에게 종양내 주사한다. 일 실시 양태에서, 수지상 세포는 Ad-IL-12 벡터, 특히 Ad-RTS-IL-12 벡터를 발현하도록 조작된다. 다른 실시 양태에서, 대상에게 종양내 주사되는 벡터는 Ad-IL-12 벡터, 특히 Ad-RTS-IL-12 벡터이다.
다른 실시 양태에서, 종양 치료를 필요로 하는 대상에게(a) IL-12를 구성적으로 또는 조건부로 발현하도록 조작된 수지상 세포를 투여하며,(b) 대상에게 하나 이상의 항암 화학치료제를 투여한다. 일 실시 양태에서, 조작된 수지상 세포는 Ad-IL-12 벡터, 특히 Ad-RTS-IL-12 벡터를 발현하도록 조작된다. 하나 이상의 항암 화학치료제는 조작된 수지상 세포가 투여되기 이전에, 조작된 수지상 세포가 투여된 후에, 또는 조작된 수지상 세포의 투여와 동시에 투여될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 항암 화학치료제로는 파클리탁셀, 파클리탁셀 유도체 또는 유사체, 테모졸로마이드, 테모졸로마이드 유도체 또는 유사체, 수니티닙, 수니티닙 유도체 또는 유사체, 젬시타빈 또는 젬시타빈 유도체 또는 유사체가 있다.
다른 실시 양태에서, 종양 치료를 필요로 하는 대상에게(a) IL-12를 구성적으로 또는 조건부로 발현하도록 조작된 수지상 세포를 투여하며,(b) IL-12를 구성적으로 또는 조건부로 발현하는 벡터를 대상에게 종양내 주사하며,(c) 대상에게 하나 이상의 항암 화학치료제를 투여한다. 일 실시 양태에서, 수지상 세포는 Ad-IL-12 벡터, 특히 Ad-RTS-IL-12 벡터를 발현하도록 조작된다. 다른 실시 양태에서, 대상에게 종양내 주사되는 벡터는 Ad-IL-12 벡터, 특히 Ad-RTS-IL-12 벡터이다. 하나 이상의 항암 화학치료제는 조작된 수지상 세포 및 IL-12 발현 벡터가 투여되기 이전에, 조작된 수지상 세포 및 IL-12 발현 벡터가 투여된 후에, 또는 조작된 수지상 세포 및 IL-12 발현 벡터의 투여와 동시에 투여될 수 있다. 일 실시 양태에서, 항암 화학치료제로는 파클리탁셀, 파클리탁셀 유도체 또는 유사체, 테모졸로마이드, 테모졸로마이드 유도체 또는 유사체, 수니티닙, 수니티닙 유도체 또는 유사체, 젬시타빈 또는 젬시타빈 유도체 또는 유사체가 있다.
다른 실시 양태에서, 종양 치료를 필요로 하는 대상에게 (a) 면역조절자, 예를 들어 본 명세서에 개시된 면역조절자를 구성적으로 또는 조건부로 발현하도록 조작된 수지상 세포를 투여하며, (b) 대상에게 하나 이상의 항암 화학치료제를 투여한다. 일 실시 양태에서, 조작된 수지상 세포는 Ad-면역조절자 벡터, 특히 Ad-RTS-면역조절자 벡터를 발현하도록 조작된다. 하나 이상의 항암 화학치료제는 조작된 수지상 세포가 투여되기 이전에, 조작된 수지상 세포가 투여된 후에, 또는 조작된 수지상 세포의 투여와 동시에 투여될 수 있다. 일 실시 양태에서, 항암 화학치료제로는 파클리탁셀, 파클리탁셀 유도체 또는 유사체, 테모졸로마이드, 테모졸로마이드 유도체 또는 유사체, 수니티닙, 수니티닙 유도체 또는 유사체, 젬시타빈 또는 젬시타빈 유도체 또는 유사체가 있다.
다른 실시 양태에서, 종양 치료를 필요로 하는 대상에게 (a) 면역조절자, 예를 들어 본 명세서에 개시된 면역조절자를 구성적으로 또는 조건부로 발현하도록 조작된 수지상 세포를 투여하며, (b) 면역조절자, 예를 들어 본 명세서에 개시된 면역조절자를 구성적으로 또는 조건부로 발현하는 벡터를 대상에게 종양내 주사하며, (c) 대상에게 하나 이상의 항암 화학치료제를 투여한다. 일 실시 양태에서, 수지상 세포는 Ad-면역조절자 벡터, 특히 Ad-RTS-면역조절자 벡터를 발현하도록 조작된다. 다른 실시 양태에서, 대상에게 종양내 주사되는 벡터는 Ad-면역조절자 벡터, 특히 Ad-RTS-면역조절자 벡터이다. 하나 이상의 항암 화학치료제는 조작된 수지상 세포 및 면역조절자 발현 벡터가 투여되기 이전에, 조작된 수지상 세포 및 면역조절자 발현 벡터가 투여된 후에, 또는 조작된 수지상 세포 및 면역조절자 발현 벡터의 투여와 동시에 투여될 수 있다. 일 실시 양태에서, 항암 화학치료제로는 파클리탁셀, 파클리탁셀 유도체 또는 유사체, 테모졸로마이드, 테모졸로마이드 유도체 또는 유사체, 수니티닙, 수니티닙 유도체 또는 유사체, 젬시타빈 또는 젬시타빈 유도체 또는 유사체가 있다.
본 발명의 방법들 중 임의의 방법에서, 질환 또는 장애는 본 출원에 개시된 질환 또는 장애일 수 있다. 일 실시 양태에서, 질환 또는 장애는 본 명세서의 표 1a 내지 표 1b에 열거된 질환 또는 장애이다. 다른 실시 양태에서, 질환 또는 장애는 본 명세서의 표 3a 내지 표 3g에 열거된 질환 또는 장애이다.
본 발명의 방법들 중 임의의 방법에서, 암 또는 종양은 본 출원에 개시된 질환 또는 장애일 수 있다. 일 실시 양태에서, 암 또는 종양은 본 명세서의 표 1a 내지 표 1b에 열거된 암 또는 종양이다. 다른 실시 양태에서, 암 또는 종양은 본 명세서의 표 3a 내지 표 3g에 열거된 암 또는 종양이다.
환자 유래의 생물 샘플에서의 Th1/Tc1형 사이토카인, IFN-감마의 활성 또는 발현 수준을 측정함으로써 세포 집단에 대한 면역조절자 및/또는 IL-12의 발현의 영향을 측정하는 것이 가능하다.
본 발명의 목적상, 본 발명은 암 환자에서 시험관 내에서 조작된 면역 세포 또는 TSC-기반의 치료 요법의 효능을 결정하는 방법을 제공하며, 이는
a. 시험관 내에서 조작된 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 TSC의 투여 전에 인간 환자로부터 얻어진 제1 생물 샘플에서 인터페론-감마(IFN-감마)의 발현 수준 또는 활성 수준 또는 이들 둘 모두를 측정하는 단계;
b. 상기 환자에게 시험관 내에서 조작된 세포를 종양내 투여하는 단계;
c. 상기 환자에게 유효량의 활성화 리간드를 투여하는 단계;
d. 상기 활성화 리간드의 투여 이후의 시점에서 상기 환자로부터 얻어진 제2 생물 샘플에서 IFN-감마의 발현 수준 또는 활성 수준 또는 이들 둘 모두를 측정하고 그에 의해 시험 수준에 대한 데이터를 생성하는 단계; 및
e. 대조구 수준을 IFN-감마의 시험 수준과 비교하는 단계
를 포함하고, 여기서, 대조구 수준에 비하여 시험 수준 면에서 IFN-감마의 발현 수준, 활성 수준, 또는 이들 둘 모두가 증가함을 보여주는 데이터는 이 치료적 치료 요법이 상기 환자에서 효과적임을 나타낸다. 또한 본 발명은
f. 생검체를 취하여 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)를 계수하는 단계 및/또는
g. 종양이 본 치료에 반응하여 퇴화하는 것을 관찰하는 단계
의 추가적인 단계를 선택적으로 포함할 수 있다.
"대상"이라는 용어는 온전한 곤충, 식물 또는 동물을 의미한다. 또한 대상이 진균류 또는 효모일 때 리간드가 동일하게 잘 작용할 것으로 기대된다. 본 발명에서 사용하기 위한 동물은 척추동물, 예를 들어 포유동물, 예컨대 인간, 설치류, 원숭이류 및 기타 동물을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 이때 인간 또는 마우스가 더욱 바람직하다. 기타 동물은 수의학적 동물, 예를 들어 개, 고양이, 말, 소, 양, 염소, 돼지 등을 포함한다.
본 발명은 벡터, 예를 들어, 복제-결핍성 아데노바이러스 벡터에, 하나 이상의 조절 서열 및 선택적으로 시그널 펩티드를 인코딩하는 핵산을 도입함으로써, 면역조절자 예를 들어, TNF-알파의 발현을 증가시키는 방법을 추가로 제공하며, 여기서 벡터는 면역조절자를 조건부로 발현한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "단백질 발현"은 제한 없이, 전사, 전사-후, 번역, 및/또는 번역-후를 포함한다. 본 발명은 또한 면역조절자 예를 들어, TNF-알파의 mRNA 또는 단백질 발현을 증가시키는 방법을 포함하며, 이 방법은 TNF-알파를 조건부로 발현하는 벡터를 생성하는 단계로서, 상기 벡터는 상기 TNF-알파를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드서열에 연결된 하나 이상의 조절 서열을 추가로 포함하는 단계, 활성화 리간드를 추가하여, 면역조절자의 발현을 유도하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 하나 이상의 조절 서열 및/또는 시그널 펩티드가 상기 TNF-알파의 발현을 개선시킨다. 본 발명에 대한 다양한 조절 영역은 기술된 5' 비번역 영역(5' UTR), 3'UTR, 또는 둘 모두를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 일 실시 양태에서, 5' UTR는 5U2이다. 5U2는 5' 말단 상의 인접한 엑손 2 스플라이스 공여자 및 3' 말단 상의 인접한 엑손 3 스플라이스 수용체 이어서 소 카세인 5' UTR의 부위의 일부 부위를 가지며, 돌연변이된 추정의 컨센서스 폴리-A 부위를 가진 융합 개 SERCA2 인트론 2이다. 다른 실시 양태에서, 3' 조절 영역은 SV40 또는 hGH의 폴리아데닐화 시그널이다.
소정의 실시 양태에서, 본 발명의 방법은 또한 TNF-알파를 조건부로 발현하는 벡터를 생성함으로써 TNF-알파 분비를 개선하는 것에 관한 것이며, 여기서 상기 벡터는 추가로 시그널 펩티드를 포함하고, 이에 따라 TNF-알파 천연 시그널 펩티드 유전자 예를 들어, TNF-알파 야생형 시그널 펩티드를 포함하는 벡터와 비교하여 TNF-알파의 분비가 증가된다. 특히, 본 발명에 사용된 시그널 펩티드는 코돈-최적화된다. 특정한 실시양태에서, 시그널 펩티드는 IL-2 야생형 시그널 펩티드 유전자에 의해 인코딩된다. 추가의 특정한 실시 양태에서, 시그널 펩티드는 코돈-최적화된 IL-2 시그널 펩티드 유전자에 의해 인코딩된다.
이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 본 발명은 임상 현장에서 종양내로 투여되는 시험관 내에서 조작된 면역 세포 및 TSC 기반의 유전자 치료법의 사용을 지원할 것으로 예상되는데, 이는 일차적인 연구 종점으로서의 목적하는 임상 반응, 및 이차적인 연구 종점으로서의 교차-프라이밍된 항-종양 CD8+ T 세포(IFN-감마를 생성함)에 초점을 맞춘다. 생체 내에서 면역조절자 및/또는 IL-12의 발현을 시작하고 중단하는 능력은, 단백질 발현의 타이밍 및 수준 둘 모두가 리간드 투여에 의해 제어될 수 있다는 점에서 그리고 또한 면역조절자 및/또는 IL-12 발현의 타이밍이 본 방법의 치료적 유효성에 결정적일 것으로 예상된다는 점에서 안전 및 치료적 제어의 요소를 본 치료법에 부가한다.
또한 본 발명은 인간 질환의 효과적이고 효율적인 치료를 위한 혁신적인 접근법으로서 조건부로 발현되는 관심있는 유전자를 포함하는, 시험관 내에서 조작된 세포의 치료적 응용을 지원한다.
본 발명은 이를 필요로 하는 포유동물에서 종양을 치료, 종양 크기를 감소, 또는 종양 형성을 방지하는 방법을 제공하며, 여기서 세포 내에 함유되지 않은 하나 이상의 면역조절자의 기능(들)을 갖는 단백질(들)을 조건부로 발현하는 벡터가 종양 미세환경에 종양내로 투여된다. 이 실시 양태에서, 벡터는 면역 세포 또는 TSC로서와 같이 세포에서 패키징되지 않고 종양에 투여된다. 본 발명은 이를 필요로 하는 포유동물에서 질환을 치료하는 방법을 또한 제공하는데, 여기서 세포 내에 함유되지 않은 하나 이상의 면역조절자의 기능(들)을 갖는 단백질(들)을 조건부로 발현하는 벡터가 상기 포유동물로 투여된다. 이 실시 양태에서, 벡터는 면역 세포 또는 TSC와 같은 세포에서 패키징되지 않고 종양에 투여된다.
일 실시 양태에서, 면역 세포, TSC, 수지상 세포, 또는 골수 수지상 세포는 벡터와 함께 종양내로 투여되지 않는다.
다른 실시 양태에서, 세포 내에 함유되지 않는 본 발명의 벡터는 종양내 투여되는 면역 세포, TSC, 수지상 세포, 또는 골수 수지상 세포와 동시에, 이전, 또는 이후에 종양내로 투여될 수 있다.
일 실시 양태에서, 세포 내에 함유되지 않는 본 발명의 벡터는 면역 세포 또는 TSC가 투여되는 동일한 병변에 종양내 투여된다. 다른 실시 양태에서, 세포 내에 함유되지 않는 본 발명의 벡터는 면역 세포 또는 TSC가 투여되는 것과 상이한 병변에 종양내 투여된다.
일 실시 양태에서, 벡터는 각각의 투여 주기에서 동일 병변(들)에 투여된다. 다른 실시 양태에서, 투여되는 벡터는 각각의 투여 주기에서 동일 병변(들)에 투여되지 않는다.
일 실시 양태에서, 종양은 본 명세서 예를 들어, 표 1a 내지 1b 및 3a 내지 3g에 열거된 임의의 암의 종양이다. 다른 실시 양태에서, 종양은 흑색종, 결장 종양, 췌장 종양, 유방 종양, 폐 종양 또는 신장 종양이다. 다른 실시 양태에서, 종양은 악성 흑색종이다. 다른 실시 양태에서, 종양은 III 기 C 또는 IV 기 악성 흑색종이다.
일 실시 양태에서, 종양내 투여량은 벡터 투여 주기 당 적어도 약 1.0 x 109 개 바이러스 입자이다. 다른 실시 양태에서, 종양내 투여량은 벡터 투여 주기 당 적어도 약 1.0 x 1010 개 바이러스 입자이다. 다른 실시 양태에서, 종양내 투여량은 벡터 투여 주기 당 약 1.0 x 109 개 내지 약 1.0 x 1013 개 바이러스 입자이다. 다른 실시 양태에서, 종양내 투여량은 벡터 투여 주기 당 약 1.0 x 1010 개 내지 약 1.0 x 1013 개 바이러스 입자이다. 다른 실시 양태에서, 종양내 투여량은 벡터 투여 주기 당 약 1.0 x 1010 개, 약 1.0 x 1011 개, 약 1.0 x 1012 개 또는 약 1.0 x 1013 개 바이러스 입자이다. 일 실시 양태에서, 벡터는 AD-RTS-IL-12이다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 포유동물에서 간 질환을 치료하기 위한 방법을 추가로 제공하며, 여기서 세포 내에 함유되지 않는 단백질(들)을 조건부로 발현하는 벡터가 상기 포유동물로 투여된다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 포유동물에서 리소좀 축적 질환을 치료하기 위한 방법을 추가로 제공하며, 여기서 세포 내에 함유되지 않는 단백질(들)을 조건부로 발현하는 벡터가 상기 포유동물로 투여된다.
다른 실시 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 비-인간 포유동물에서 질환을 치료하기 위한 방법을 추가로 제공하며, 여기서 세포 내에 함유되지 않는 단백질(들)을 조건부로 발현하는 벡터가 상기 포유동물로 투여된다.
활성화 리간드 투여량은 일일 약 5 내지 100 mg, 예를 들어, 일일 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 mg이다. 일 실시 양태에서, 활성화 리간드는 적어도 하루에 한번 투여된다. 다른 실시 양태에서, 활성화 리간드는 하루에 한번 약 14일 동안 투여된다.
일 실시 양태에서, 벡터의 적어도 두개의 투여량(예를 들어, 약 1x1011 및 1x1012)이 활성화 리간드의 적어도 세개의 상이한 투여량 수준(예를 들어, 일일 약 5 mg 내지 약 100 mg)과 조합하여 사용된다.
당업자는 다양한 정도의 활성화 리간드 활성을 위해, 벡터의 효과적인 플라스마 수준의 범위를 하도록 투여량을 최적화할 수 있을 것이다.
일 실시 양태에서, 대상에 투여되는 활성화 리간드의 투여량은 종양내 벡터 투여 주기 내에서 활성화 리간드의 투여 기간에 걸쳐 변화된다. 다른 실시 양태에서, 대상에 투여되는 활성화 리간드의 투여량은 종양내 벡터 투여 주기 내에서 활성화 리간드의 투여 기간에 걸쳐 감소된다. 다른 실시 양태에서, 대상에 투여되는 활성화 리간드의 투여량은 종양내 벡터 투여 주기 내에서 활성화 리간드의 투여 기간에 걸쳐 증가(확대)된다.
일 실시 양태에서, 대상은 종양내 벡터 투여의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 주기로 처리된다. 다른 실시 양태에서, 대상은 종양내 벡터 투여의 3-7 주기로 처리된다. 다른 실시 양태에서, 대상은 종양내 벡터 투여의 4-6 주기로 처리된다. 다른 실시 양태에서, 대상은 종양내 벡터 투여의 5 또는 6 주기로 처리된다. 다른 실시 양태에서, 대상은 종양내 벡터 투여의 6 주기로 처리된다. 일 실시 양태에서, 종양내 벡터 투여의 각각의 주기는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 주 간격으로 수행된다. 다른 실시 양태에서, 종양내 벡터 투여의 각각의 주기는 4주 간격으로 수행된다.
일 실시 양태에서, 벡터의 투여량은 종양내 벡터 투여의 각각의 후속적인 주기에서 변화된다. 다른 실시 양태에서, 벡터의 투여량은 종양내 벡터 투여의 각각의 후속적인 주기에서 감소된다. 다른 실시 양태에서, 벡터의 투여량은 종양내 벡터 투여의 각각의 후속적인 주기에서 증가된다.
일 실시 양태에서, 벡터 및 활성화 리간드의 투여량, 종양내 벡터 투여 주기의 수 및 길이, 벡터 투여의 빈도 및 활성화 리간드 투여의 빈도는 본 명세서에 실시예 11의 표 8에 나타나 있다.
일 실시 양태에서, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 및 세포 내에 함유되지 않는 본 발명의 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 또한 제공한다. 적합한 담체는 항산화제, 킬레이트제, 완충제, 세균발육저지제, 및 등장액인 제형을 부여하는 용질, 및 현탁제, 가용화제, 점증제, 안정제, 및 보존제를 포함할 수 있는 수용성 및 비수용성 멸균 현탁액을 함유하는, 식염수, 증류수, 소디움 클로라이드 용액, 소디움 클로라이드 및 무기염의 혼합물 또는 그들의 유사한 혼합물, 만니톨, 락토오스, 덱스트란, 및 글루코스와 같은 물질의 용액, 글리신 및 아르기닌과 같은 아미노산 용액, 유기산 용액 또는 염 용액의 혼합물 및 글루코스 용액, 수용성 및 비수용성, 등장 멸균 주사액을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 제형은 앰플 및 바이알과 같은 단일-투여량 또는 다중-투여량 밀봉용기로 제공될 수 있으며, 사용하기 바로 직전에, 주사를 위해, 멸균 액체 부형제 예를 들어, 물의 첨가만을 필요로 하는 동결-건조(감압하에 동결건조된) 조건에서 저장될 수 있다.
본 발명의 목적상, 만일 본 명세서에 인용된 임의의 참고문헌 및 본 명세서의 임의의 교시 또는 시사 사이에 상충되는 것이 있을 경우 본 명세서가 지배할 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 완전히 전체적으로 참고로 포함된다.
전술한 실시 양태 및 실시예는 어떠한 점에서든 본 발명의 범주를 한정하고자 하는 것이 아니며, 본 명세서에 제시된 특허청구범위는 본 명세서에서 명백하게 제시되어 있든 그렇지 않든 간에 모든 실시 양태 및 실시예를 포함하고자 하는 것임이 이해되어야 한다.
2008년 10월 8일자로 출원되고 발명의 명칭이 "조작된 수지상 세포 및 암 치료에 있어서의 용도(Engineered Dendritic Cells 및 Uses For Treatment Of Cancer)"인 미국 특허 출원 제12/247,738호가 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 2008년 9월 29일자로 출원되고 발명의 명칭이 "치료적 유전자-스위치 작제물 및 치료적 생물 분자의 발현을 위한 생물반응기와 그 용도(Therapeutic Gene-Switch Constructs 및 Bioreactors For The Expression Of Biotherapeutic Molecules, 및 Uses Thereof)"인 미국 특허 출원 제12/241,018호가 또한 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.
도 1은 hIL-12를 인코딩하는 2시스트론 전사체(bicistronic transcript)에 있어서의 조절 프로모터(regulated promoter) 발현 시스템의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 2는 hIL-21 및 hIL-15를 인코딩하는 2시스트론 전사체에 있어서 조절 프로모터 발현 시스템의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 3은 mIL-12를 인코딩하는 2시스트론 전사체에 있어서의 조절 프로모터 발현 시스템의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 4는 mIL-21 및 mIL-15를 인코딩하는 2시스트론 전사체에 있어서의 조절 프로모터 발현 시스템의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 5는 hIL-21을 위한 조절 프로모터 발현 시스템의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 6은 mIL-21을 위한 조절 프로모터 발현 시스템의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 7은 hIL-12 및 hIL-21을 인코딩하는 3시스트론 전사체(tricistronic transcript)에 있어서의 조절 프로모터 발현 시스템의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 8은 mIL-12 및 mIL-21을 인코딩하는 3시스트론 전사체에 있어서의 조절 프로모터 발현 시스템의 플라스미드 지도를 도시한다.
도 9는 E1 및 E3 영역이 결실되었고 레오스위치®(등록상표) 테라퓨틱 시스템(Therapeutic System)(RTS)-IL-12 구성요소들이 E1 영역을 대체하는 벡터 rAd.RheoIL12의 구조를 도시한다. "IL12"로 표지된 박스는 IRES에 의해 분리된 IL-12p40 및 IL-12p35 코딩 서열을 나타낸다.
도 10은 번역, 전사-후, 번역, 및 번역-후 과정에 대한 요약 차트를 도시한다.
도 11은 생산 중심점을 나타낸 모듈러 요소를 도시한다.
도 12는 스위치 및 유도성 모듈러 합성 유전자를 가진 아데노바이러스-적합성 울트라벡터® 골격의 모식도를 도시한다.
도 13은 TNFwt 5'UTR, TNFwtUV 시그널 펩티드, TNFwt UV 오픈 리딩 프레임(ORF), 및 SV40e + pA의 3' 조절 영역을 포함하는 조절된 프로모터 발현 시스템에 대한 아데노바이러스 벡터 맵(벡터 43318)을 도시한다.
도 14는 TNFwt 5'UTR, TNFoptUV 시그널 펩티드, TNFopt UV ORF, 및 SV40e + pA의 3' 조절 영역을 포함하는 조절된 프로모터 발현 시스템에 대한 아데노바이러스 벡터 맵(벡터 43319)을 도시한다.
도 15는 TNFwt 5'UTR, IL-2optUV 시그널 펩티드, TNFoptUVORF, 및 SV40e + pA의 3' 조절 영역을 포함하는 조절된 프로모터 발현 시스템에 대한 아데노바이러스 벡터 맵(벡터 43320)을 도시한다.
도 16은 5U2 5'UTR, TNFwtUV 시그널 펩티드, TNFwtUV ORF, 및 SV40e + pA의 3' 조절 영역을 포함하는 조절된 프로모터 발현 시스템에 대한 아데노바이러스 벡터 맵(벡터 43321)을 도시한다.
도 17은 5U2 5'UTR, TNFoptUV 시그널 펩티드, TNFoptUV ORF, 및 SV40e + pA의 3' 조절 영역을 포함하는 조절된 프로모터 발현 시스템에 대한 아데노바이러스 벡터 맵(벡터 43322)을 도시한다.
도 18은 5U2 5'UTR, IL-2optUV 시그널 펩티드, TNFoptUV ORF, 및 SV40e + pA의 3' 조절 영역을 포함하는 조절된 프로모터 발현 시스템에 대한 아데노바이러스 벡터 맵(벡터 43323)을 도시한다.
도 19는 TNFwt 5'UTR, TNFwtUV 시그널 펩티드, TNFwtUV ORF, 및 hGH + pA의 3' 조절 영역을 포함하는 조절된 프로모터 발현 시스템에 대한 아데노바이러스 벡터 맵(벡터 43324)을 도시한다.
도 20은 TNFwt 5'UTR, TNFoptUV 시그널 펩티드, TNFoptUV ORF, 및 hGH + pA의 3' 조절 영역을 포함하는 조절된 프로모터 발현 시스템에 대한 아데노바이러스 벡터 맵(벡터 43325)을 도시한다.
도 21은 TNFwt 5'UTR, IL-2optUV 시그널 펩티드, TNFoptUV ORF, 및 hGH + pA의 3' 조절 영역을 포함하는 조절된 프로모터 발현 시스템에 대한 아데노바이러스 벡터 맵(벡터 43326)을 도시한다.
도 22는 5U2 5'UTR, TNFwtUV 시그널 펩티드, TNFwtUV ORF, 및 hGH + pA의 3' 조절 영역을 포함하는 조절된 프로모터 발현 시스템에 대한 아데노바이러스 벡터 맵(벡터 43327)을 도시한다.
도 23은 5U2 5'UTR, TNFwtUV 시그널 펩티드, TNFwtUV ORF, 및 hGH + pA의 3' 조절 영역을 포함하는 조절된 프로모터 발현 시스템에 대한 아데노바이러스 벡터 맵(벡터 43328)을 도시한다.
도 24는 5U2 5'UTR, TNFwtUV 시그널 펩티드, TNFwtUV ORF, 및 hGH + pA의 3' 조절 영역을 포함하는 조절된 프로모터 발현 시스템에 대한 아데노바이러스 벡터 맵(벡터 43329)을 도시한다.
도 25는 TNFwt5'UTR, TNFwtUV 시그널 펩티드, TNFwtUV ORF, 및 TNFwt 3'UTR를 포함하는 조절된 프로모터 발현 시스템에 대한 아데노바이러스 벡터 맵(벡터 43533)을 도시한다.
도 26은 TNFwt5'UTR, TNF 전체-길이 ORF, 및 TNFwt 3'UTR를 포함하는 조절된 프로모터 발현 시스템에 대한 아데노바이러스 벡터 맵(벡터 43534)을 도시한다.
도 27은 레오스위치® 리간드를 통한 다양한 PT3 성분(-/+) 유도를 가진 벡터를 사용한 HEK293 세포의 형질감염 후에 TNF-알파의 정규화된 분비 단백질 수준을 보여주는 그래프를 도시한다.
도 28은 레오스위치® 리간드를 통한 다양한 PT3 성분(-/+) 유도를 가진 벡터를 사용한 CHO-K1 세포의 형질감염 후에 TNF-알파의 정규화된 분비 단백질 수준을 보여주는 그래프를 도시한다.
도 29는 HEK293 세포의 형질감염 후에 TNF-알파 분비의 배 차이(fold differences)를 도시한다.
도 30은 5U2 5'UTR와 wtUV TNF-알파 5'UTR 사이에 단백질 분비 차이를 도시한다.
도 31은 마우스 B16F0 흑색종 모델에서 Ad-RTS-IL-12 투여량 반응 연구를 보여주는 선 그래프이다. 마우스는 (1ee7; 1ee8; 1ee9; 5ee9; 1ee10; 5ee10 바이러스 입자(vp)의 투여량으로 Ad-RTS-IL-12을 12일째에 단일 주사하여 처리하였고 리간드는 11일째에 개시하는 사료를 사용해 전달하였다. x 축은 종양 세포 접종 후 날짜를 보여주며 y 축은 종양 부피를 나타낸다. 투여량 수준은 상당한 항-종양 효과를 보였다. 대조군과 비교한 종양 감소 %를 나타낸다.
도 32는 연구 기간에 걸친 체중 변화를 보여주는 선 그래프이다. 변화는 y 축 상에 체중 %로서 나타낸다.
도 33a 및 33b는 루이스 마우스 폐 암종(LLC) 모델에서 Ad-RTS-mIL12의 항 종양 활성(도 33a) 및 안전성(33b)을 보여주는 선 그래프이다. 루이스 폐 종양은 면역적격성 C57b/6 마우스에서 피하에서 성장하였다. 종양은 바람직한 크기에 도달할 경우, 치료를 개시하였다. 동물에게 종양 세포 접종 후 6, 9 및 13일째에 단일 투여량의 AdRTS-mIL12(1e10 vp)를 제공하였다. 활성자와 함께한 Ad-RTS-mIL12는 대조군 동물과 비교할 때 두드러진 항-종양 활성을 나타냈다. 어떠한 주요한 독성도 발견되지 않았다.
도 34a 및 34b는 Ad-RTS-mIL12로 처리된 마우스 흑색종(B16F0) 모델에서 효능(도 34a) 및 안전성(도 34b)를 보여주는 선 그래프이다. 종양은 C57b/6 마우스의 옆구리 상에 피하에 발달하였다. 단일 투여량의 Ad-RTS-mIL12(1e10 vp)을 세포 접종 후 13일째(화살표)에 종양내(i.t.) 투여하였다. 활성화 리간드(50, 100, 250, 500, 750 및 1000 mg/kg)를 실험 종료시까지 벡터 주사 전에 24시간 째에 제공하였다. 종양 성장 억제는 퍼센트로서 나타내고 대조군과 비교하였다. Ad-RTS-IL12는 넓은 활성자 투여량 윈도우에서 치료적 잇점을 보여주었다. 치료는 잘 받아들여졌다.
도 35a 및 도 35b는 마우스 결장 암(CT26Luc) 모델에서 Ad-RTS-mIL12의 효능(도 35a) 및 안전성(도 35b)를 보여주는 선 그래프이다. 쥐 결장 종양은 Balb/C 마우스의 옆구리 영역 상에 피하에서 자랐다. 동물은 세포 접종 후 11일째 및 18일째(화살표)에 1e10 vp/100μl 투여량 수준의 Ad-RTS-mIL12를 사용해 두번 종양내 처리하였다. 활성자는 벡터 주사 전에 24시간 째에 시작하였다. 종양 부피 및 체중은 실험 기간에 걸쳐 모니터링하였다. Ad-RTS-mIL12를 사용한 처리는 대조군 동물과 비교할 때 뛰어난 종양 성장 억제(100%)를 초래하였다. 눈에 띄게, Ad-RTS-mIL12와 활성자를 사용해 처리된 모든 동물은 종양이 완전히 사라졌다.
도 36a 및 36b는 췌장 암(PAN02) 모델에서 Ad-RTS-mIL12의 효능(도 36a) 및 안전성(도 36b)을 보여주는 선 그래프이다. 피하에 PAN02 종양을 갖는 마우스를 조양 세포 접종 후 7일째 및 14일째(화살표)에 1e10 vp/100μl 투여량 수준의 Ad-RTS-mIL12의 단일 투여량을 사용해 종양내(i.t.) 처리하였다. 활성자 사료는 실험이 종료될 때까지 벡터 투여 하루 전에 동물에 제공하였다. 대조군 또는 벡터 단독 그룹은 정상 설치류 사료만을 제공받았다. 결과는 대조군 동물과 비교하여 Ad-RTS-IL12가 현저한 항종양 활성(97%)를 나타냄을 시사한다. Ad-RTS-IL12 치료법의 결과로서 어떠한 주요한 체중 변화도 관찰되지 않았다.
도 37은 AD-RTS-mIFN 알파에 대한 벡터 맵이다.
도 38은 AD-RTS-mTNF 알파에 대한 벡터 맵이다.
도 39a 및 39b는 유방암(4T1) 모델에서 Ad-RTS-mIL12의 효능(도 39a) 및 안전성(도 39b)을 보여주는 선 그래프이다. 4T1 종양은 BALB/C 마우스의 옆구리 상에 피하(s.c.)에서 자랐다. 종양을 갖는 마우스를 무작위로 4개 군의 각각 5마리 동물로 나누었다; 비처리 대조군, 활성화 리간드(L) 단독, Ad-RTS-mIL12 단독 및 Ad-RTS-mIL12 및 활성화 리간드. Ad-RTS-mIL12의 단일 주사를 1e10 v.p. /100μl PBS의 투여량 수준으로 종양내(i.t.)에 세가지 상이한 시간 지점(화살표)에서 제공하였다. 활성화 리간드를 실험이 종료할 때까지 벡터 주사 전에 24시간 째에 사료를 통해 마우스에 제공하였다. 종양 크기(부피) 및 체중(%)은 평균±SE로서 나타낸다. 비처리된 동물(대조군)은 급격히 종양이 성장하였다. 활성화 리간드 단독 처리 또는 활성화 리간드 없이 Ad-RTS-mIL12의 3회 투여량은 대조군과 비교하여 각각 22% 및 35%의 약간의 종양 성장 억제를 가졌다. 눈에 띄게, Ad-RTS-IL12와 활성화 리간드의 처리는 비처리 대조군과 비교할 때 82%의 현저한 종양 성장 억제를 초래하였다. 모든 처리에서 어떠한 주요한 체중 손실이 발견되지 않았다.
도 40은 인터페론 알파-2a에 대한 벡터 맵이다.
실시예 1
렌카(Renca) 신장 세포 암 종양 모델에서 종양-특이적 면역 반응 및 항종양 활성을 유도할 수 있는 가장 효과적인 사이토카인 및 수지상 세포의 투여량을 결정하기 위하여 연구에 착수한다.
2가지 종양 세포주, 렌카 및 렌카-HA를 이 연구에 사용한다. 렌카-HA는 렌카 세포를 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)으로 형질감염시킴으로써 제조된다. 렌카-HA 모델의 이점은 항원-특이적 T 세포를 추적하는 능력이며, 그 이유는 CD8 및 CD4 특이적 HA-유래 에피토프 둘 모두가 공지되어 있고 이들이 사용되어 왔었기 때문이다.
특정 목표 - 수지상 세포의 종양내 투여 후 HA-특이적 면역 반응의 유도를 결정.
렌카-HA 종양을 BALB/c 마우스에서 피하에 확립한다. 종양이 감지가능해질 때, 수지상 세포를 종양 내에 주사한다. 수지상 세포 투여는 총 3회의 투여에 있어서 7일 간격으로 2회 반복한다.
하기 마우스 군을 사용한다(각각의 군은 3마리의 마우스를 포함함):
1. 미처리 마우스;
2. 대조 플라스미드로 형질도입된 5x105개의 수지상 세포로 처리한 마우스;
3. 대조 플라스미드로 형질도입된 106개의 수지상 세포로 처리한 마우스;
4. 대조 플라스미드로 형질도입된 5x106개의 수지상 세포로 처리한 마우스;
5. IL-12로 형질도입된 수지상 세포를 사용한, 군 2 내지 군 4와 동일한 것;
6. IL-15로 형질도입된 수지상 세포를 사용한, 군 2 내지 군 4와 동일한 것;
7. IL-21로 형질도입된 수지상 세포를 사용한, 군 2 내지 군 4와 동일한 것.
상이한 사이토카인들의 조합의 영향을 시험하기 위하여, 마우스를 하기로 동시에 처리한다:
8. IL-12로 형질도입된 5x1O5개의 수지상 세포 및 IL-15로 형질도입된 5x1O5
개의 수지상 세포,
9. IL-12로 형질도입된 5x105개의 수지상 세포 및 IL-21로 형질도입된 5x105개의 수지상 세포, 및
10. IL-15로 형질도입된 5x1O5개의 수지상 세포 및 IL-21로 형질도입된 5x1O5개의 수지상 세포.
마지막으로 투여한 후 4일 째, 종양 보유 마우스의 림프절을 수집하고, MHC 클래스 I 매칭된 펩티드(CD8+T 세포 반응을 검출하기 위함) 또는 MHC 클래스 II 매칭된 펩티드(CD4+ T 세포 반응을 검출하기 위함) 중 어느 하나로 세포를 자극한다.
하기 분석을 이용한다:
1. 엘리스폿(ELISPOT) IFN-γ 및 IL-2;
2. T-세포 증식;
3. 림프절 세포에 의한 TNFα, IL-1O, IL-4, 및 GM-CSF 방출의 검출.
또한, 림프절 세포의 NK 활성을 표적으로서 YAC 세포를 이용하여 평가한다.
이와 동시에, 세포를 항-CD3/CD28 항체로 자극하여 T 세포의 비특이적 반응을 평가한다.
항원-특이적 면역 반응을 유도할 수 있는 수지상 세포의 가장 효과적인 투여량을 결정한다.
특정 목표 2 - 사이토카인 유전자로 형질도입된 수지상 세포의 항종양 활성의 평가.
면역 반응의 통계적으로 유의적인 유도를 보여준 사이토카인 형질도입된 수지상 세포만을 추가의 실험에서 사용한다.
렌카-HA 종양 보유 마우스의 처리를 특정 목표 1에 기술된 바와 같이 수행한다. 이전의 실험에서 특이적 활성을 나타내는 사이토카인으로 형질도입된 DC의 단회 투약을 이용한다. 대조구로서, 대조 아데노바이러스로 형질도입된 수지상 세포를 이용한다. 통계적 유의도를 달성하기 위하여, 각각의 군은 10마리의 마우스를 포함한다.
종양 성장을 평가한다. 렌카-HA 종양은 항종양 효과의 면역학적 모니터링 및 초기 시험에 유용한 면역원성 에피토프를 포함한다. 그러나, 당해 치료법의 잠재적인 항종양 활성을 확증하기 위하여 비-형질감염 종양 세포를 사용할 필요가 있다. 따라서, 상기에 기술된 실험을 렌카 종양 모델을 이용하여 반복한다.
실시예 2
III 및 IV기 흑색종을 갖는 대상에서, RTS의 제어 하에 hIL-12 및 하나 이상의 기타 면역조절자를 발현하도록 조작된 아데노바이러스 형질도입 자가유래 수지상 세포의 종양내 주사(들)의 안전성, 허용성, 트랜스유전자 기능, 및 면역학적 효과를 하기에 기술하는 것과 같은 절차를 통하여 평가할 것이다.
III 및 IV기 흑색종을 갖는 연구 대상을 포함하는 연구를 대상들의 4개의 코호트(군)에서 수행할 것인데, 각각의 대상은 인간 인터루킨-12(hIL-12),및 하나 이상의 다른 면역조절자를 발현하도록 조작된 아데노바이러스 형질도입된 자가유래(그가 유래된 동일 대상 내로 재삽입됨) 수지상 세포(DC)의 단일한 종양내주사(흑색종 종양 내로)를 활성자 약물(활성화 리간드)의 일일 경구 투여량과 조합하여 5 x 107개의 투여량으로 받는다. 이 연구는 인간 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 유도가능한 발현을 위하여 아데노바이러스 백터로 생체 외로(ex vivo)(세포를 대상으로부터 꺼낸 후) 형질도입된 수지상 세포의 주사를 이용할 것이다. IL-12 및 하나 이상의 또는 기타 면역조절자의 생성은 활성자 약물(RG-115932)의 경구 투여에 의한 RTS의 활성화를 통하여 주사된 DC로부터 "개시된다"(유도된다). 안전성 및 허용성은 신체 조사(ECOG 수행 상태를 포함함), 생명 징후 측정, 혈청 화학 검사, 소변 검사, 혈액 검사, 이상 반응 "부작용", 및 아데노바이러스, RTS의 구성요소 및 활성자 약물에 대한 항체 및 세포 면역 반응을 통하여 평가할 것이다. 추이를 평가하기 위하여, 표적 종양, 배출 림프절 및 말초 순환계의 생검체에서 경구 활성자 약물 및 그의 주요 대사 산물의 단일 투여량 및 정상 상태 약동학/ADME, hIL-12 수준, 기타 면역조절자 수준, 및 세포 면역 반응(T 세포)의 분석치와, 혈청 사이토카인 프로파일을 측정할 것이다.
예를 들어, III 및 IV기 흑색종을 갖는 16명의 대상을 4개의 코호트로 나누며, 이때 코호트 1 및 2는 3명의 대상을 포함하며 코호트 3 및 4는 5명의 대상을 포함한다. 모든 대상은 RTS의 제어 하에 인간 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자를 코딩하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 5 x 107개의 자가유래 DC의 단일한 종양내 주사를 받을 것이다. 예를 들어, 대상에게 RTS 제어 하의 인간 IL-12 및 면역조절자, 예를 들어 IL-15 또는 IL-21을 코딩하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 자가유래 DC의 종양내 주사를 투여한다.
대상은 활성자 약물의 단일한 일일 경구 투여량(코호트 1: 0.01 mg/kg, 코호트 2: 0.1 mg/kg, 코호트 3: 1.0 mg/kg 또는 코호트 4: 3 mg/kg)을 받을 것인데, 제1 투여량은 1일에 DC를 주사하기 약 3시간 전에 시작하며 연속 13일 이상 동안 더 계속된다. 아데노바이러스로 형질도입된 자가유래 수지상 세포의 추가의 주사(들)를 활성자 약물의 14개의 단일(1회) 일일 경구 투여량과 조합하여 재치료 기준을 만족하는 적격인 대상에게 투여할 수 있다. 시험관 내에서 조작된 수지상 세포를 주사한 후 최대 1개월 동안 코호트 1의 각각의 군 내의 모든 대상에 대하여 안전성, 허용성 및 수지상 세포 기능을 평가한 후 대상이 그 다음 최고 투여량의 활성자 약물을 받도록 등록한다. 안전성 평가는 조작된 수지상 세포의 초기 주사 후 3개월 동안 모든 대상에서 계속할 것인데, 만일 독성이 관찰되거나 대상이 추가의 수지상 세포 주사(들)를 받을 경우 추적 기간을 총 6개월로 연장하여 대상 안전성을 모니터링할 가능성이 있다.
그러한 연구는 흑색종을 갖는 대상에서 경구 활성자 약물과 조합된, 아데노바이러스로 형질도입된 자가유래 수지상 세포의 단일 또는 다중 종양내 주사들(들)의 안전성 및 허용성을 입증한다. 본 연구는 경구 활성자 약물의 정상 상태 약동학적 특징/ADME를 제공한다. 본 연구는 활성자 약물의 경구 투여에 의해 RTS의 활성화에 응답하는 표적 종양 및/또는 배출 림프절에서의 아데노바이러스로 형질도입된 자가유래 수지상 세포의 hIL-12 발현 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 발현을 측정함으로써 대상에서 RTS의 기능성을 입증한다. 더욱이, 본 연구는 활성자 약물의 경구 투여 이후 표적 종양, 배출 림프절 및 말초 순환계에서의 세포 면역 반응의 견지에서 아데노바이러스로 형질도입된 자가유래 수지상 세포의 면역학적 효과를 입증한다.
흑색종을, 특히 흑색종에 대한, 예시적인 암으로서 선택한다. 특히 고형 종양 중 흑색종은 면역치료적 접근법에 반응하는 것으로 밝혀졌으며, 흑색종 종양은 종양내 주사 및 생검에 있어서 쉽게 접근가능하다. 이 연구에 포함된 대상은 III 또는 IV기의 절제불능 흑색종을 가지며, 상기 흑색종은 적어도 0.5 cm의 직경, 임의의 종양 두께, 특정한 수의 림프절의 연루, 통과 전이(in-transit metastasis), 또는 원격 전이를 갖는다.
레오스위치 테라퓨틱 시스템, hIL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자를 보유하는 아데노바이러스의 제조
생체 외 아데노바이러스 벡터 형질도입에 의해 재조합 DNA를 수지상 세포(DC)에 전달한다. 종양내에 주사된 미성숙 수지상 세포 유래의 하나 이상의 다른 면역조절자 및 인간 IL-12(p70)의 발현을 위하여 상기 재조합 DNA를 사용하는데, 이는 종양 환경에서 DC의 생존성을 부여하고 DC의 성숙을 자극하여 이것이 후속적으로 배출 림프절로 이동하게 한다. 이는 T 헬퍼 세포가 Th1형으로 분화되는 성향 및 또한 종양 항원과의 교차 프라이밍에 의한 종양-특이적 세포독성 T 세포의 활성화에 이르게 된다.
재조합 아데노바이러스 벡터로서 사용되는 재조합 DNA는 레오스위치(등록상표) 테라퓨틱 시스템(RTS)의 제어 하에 인간 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자가 발현되게 한다. RTS는 인간 유비퀴틴 C 프로모터로부터 발현되는 2시스트론 메시지(message)를 포함하며, 2가지 융합 단백질, Gal4-EcR 및 VP16-RXR을 코딩한다. Gal4-EcR은 효모 Gal4의 DNA 결합 도메인(아미노산 1-147)과 곤충인 코리스토네우라 푸미페라나(Choristoneura fumiferana) 유래의 엑디손 수용체의 DEF 도메인 사이의 융합물이다. 다른 실시 양태에서, RTS는 인간 유비퀴틴 C 프로모터로 부터 발현되는 2시스트론 메시지로 이루어지며 2가지 융합 단백질, Gal4-EcR 및 VP16-RXR을 코딩한다. Gal4-EcR은 효모 Gal4의 DNA 결합 도메인(아미노산 1-147)과 곤충인 코리스토네우라 푸미페라나 유래의 엑디손 수용체의 DEF 도메인 사이의 융합물이다. VP16-RXR은 HSV-VP16의 전사 활성화 도메인과, 인간 및 메뚜기 서열로부터 유래되는 키메라 RXR의 EF 도메인 사이의 융합물이다. 이들 Gal4-EcR 및 VP16-RXR 서열은 EMCV 유래의 내부 리보좀 진입 부위(IRES)에 의해 분리된다. 이들 두 융합 단백질은, Gal4-EcR이 소분자 약물(RG-115932)에 결합할 때 이량체화되며, 6개의 Gal4-결합 부위 및 합성 최소 프로모터를 포함하는 Gal4-반응성 프로모터로부터의 hIL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 전사를 활성화시킨다. 상기에 기술된 RTS 전사 유닛은 hIL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자 전사 유닛의 하류에 위치한다. 이러한 전체 RTS-hIL12-면역조절자 카세트를 E1 영역을 결실시킨 부위의 아데노바이러스 5 게놈 내로 포함시킨다. 아데노바이러스 골격에는 E3 유전자가 또한 결여되어 있다. 아데노바이러스 벡터 Ad-RTS-hIL-12의 맵이 미국 특허 출원 공개 제2009/0123441 A1호의 도 8에 예시되어 있다.
본 연구에서 사용되는 재조합 아데노바이러스 벡터는 바이러스 벡터 서열에 더하여 하기의 예시적인 조절 요소를 포함한다: 인간 유비퀴틴 C 프로모터, EMCV로 부터 유래되는 내부 리보좀 진입 부위, 6개 카피의 Gal4-결합 부위, 3개 카피의 SP-1 결합 부위, 및 합성 최소 프로모터 서열을 포함하는 유도성 프로모터, SV40 폴리아데닐화 부위, 및 인간 알파-글로빈 유전자로부터 유래되는 전사 종결 서열. 다른 조절 요소가 대안으로서 이용될 수 있음을 이해하여야 한다.
예시적인 재조합 아데노바이러스 벡터 Ad-RTS-hIL-12-면역조절자(들)을 하기 방식으로 제조한다. EMCV-IRES(내부 리보좀 진입 부위)에 의해 분리된 수용체 융합 단백질, VP16-RXR 및 Gal4-EcR의 코딩 서열을 인간 유비퀴틴 C 프로모터(항시적 프로모터)의 제어 하의 아데노바이러스 셔틀 벡터 내로 삽입한다. 후속적으로, IRES에 의해 분리된 hIL-12의 p40 서브유닛 및 p35 서브유닛의 코딩 서열과, 하나 이상의 다른 면역조절자의 코딩 서열을 유비퀴틴 C 프로모터 및 수용체 서열의 상류에 삽입되는 6개 카피의 Gal4-결합 부위를 포함하는 합성 유도성 프로모터의 제어 하3에 둔다. 셔틀 벡터는 좌측 말단으로부터 맵 유닛 16(map unit 16, mu16)까지의 아데노바이러스 혈청형 5형 서열을 포함하는데, 이로부터 E1 서열을 결실시키고 RTS, IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자 서열로 대체한다(RTS-hIL-12). RTShIL-12-면역조절자(들)를 지닌 셔틀 벡터는 활성자 약물-의존성 IL-12 및 다른 면역조절자(들)의 발현을 위하여 HT-1080 세포에서의 일시적 형질감염에 의해 시험한다. 그 후 셔틀 벡터를 HEK 293 세포 내로의 동시 형질감염에 의해 아데노바이러스 골격과 재조합시켜 재조합 아데노바이러스 Ad-RTS-hIL-12-면역조절자(들)를 얻는다. 아데노바이러스 골격은 E3 유전자 및 게놈의 좌측 말단의 mu 0으로부터 mu 9.2까지의 서열 결실을 포함한다. 셔틀 벡터 및 아데노바이러스 골격은 mu 9.2로부터 mu16까지의 중복 서열을 포함하는데, 상기 중복 서열은 이들 사이의 재조합 및 재조합 아데노바이러스 벡터의 생성을 허용한다. 재조합 아데노바이러스 벡터는 E1 및 E3 영역이 결핍되어 있기 때문에, 이 바이러스는 정상적인 포유동물 세포에서는 복제-결핍성이다. 그러나, 이 바이러스는 아데노바이러스-5 E1 영역을 보유하는 HEK293 세포에서는 복제될 수 있고, 따라서 E1 기능을 트랜스로(in trans) 제공할 수 있다.
예시적인 재조합 아데노바이러스 벡터를 하기 방식으로 제조한다: 인간 IL12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 유도가능한 발현을 위한 DNA 요소를 지닌 선형화 셔틀 벡터, 및 아데노바이러스 골격을 HEK293 세포 내로 동시 형질감염시킨다. 셔틀 벡터와 바이러스 골격 상의 중복 서열들 사이의 재조합에 의해 재조합 아데노 바이러스를 생성하고, 이를 HEK293 세포 내에서 바이러스 입자로 패키징시킨다. HEK293 세포를 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM에서 성장시킨다.
제안된 연구에 사용되는 바이러스를 CsCl 밀도 구배 원심분리에 의해 정제하였다. 재조합 아데노바이러스는 2라운드의 플라크 정제를 거치며, 생성된 시드 스톡(seed stock)을 이용하여, 충분히 특성화된 주 세포 은행(master cell bank)으로부터의 HEK293 세포 내에서 증폭시킴으로써 주 바이러스 은행(master viral bank, MVB)을 생성한다. MVB는 광범위한 cGMP/GLP 방출 시험을 받는데, 이는 복제가능 아데노바이러스(replication competent adenovirus, RCA), 살균성(sterility), 마이코플라즈마(마이코플라스마), 우발성 바이러스, 레트로바이러스, 인간 바이러스 HIV 1/2, HTLV 1/2, HAV, HBV, HCV, EBV, B 19, CMV, HHV-6, 7 및 8, 소 및 돼지 바이러스, 전 벡터 서열결정 및 인간 세포주에서의 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 AD-유도 발현에 의한 기능 시험을 포함한다.
*MVB로부터의 바이러스를 cGMP 설비에서 정제 바이러스의 생성에 사용할 수 있으며, 이는 다시 아이덴티티(identity), RCA, 살균성, 마이코플라즈마, 우발성 바이러스, 바이러스 입자 대 감염 유닛의 비, 숙주 세포 DNA의 오염, 내독소 및 단백질 및 인간 세포주에서의 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 AD-유도 발현에 의한 기능 시험을 포함하는 방출 시험을 받을 수 있다.
재조합 아데노바이러스를 제조하기 위한 적합한 방법은 또한 문헌[참조: Anderson, R.D., Gene Therapy 7: 1034-1038(2000)]에 제공되어 있다.
재조합 아데노바이러스를 숙주 세포내로 도입하기 위한 적합한 방법은 문헌[참조: Komita, H. et al., Cancer Gene Therapy 16:883-891(2009)]에 제공되어 있다.
hIL-12 트랜스유전자 및 하나 이상의 다른 면역조절자 및 레오스위치®(등록상표) 테라퓨틱 시스템(RTS)을 포함하는 아데노바이러스에 의한 자가유래 수지상 세포의 형질도입
인간 대상으로부터 유래된 수지상 세포를 생체 외에서 형질도입시키고 종양 내로 주사한다. DC는 바이러스 형질감염 전에 생육성, 순도(전형적으로 DC 표현형을 나타내는 세포가 >80%임), 살균성, 마이코플라즈마 및 내독소에 대하여 특성화할 것이다. 바이러스 형질도입 후에, 상기 세포를 반복적으로 세척하여 임의의 비흡수 바이러스를 제거한다. 마지막 세척물로부터의 상청액을 PCR에 의해 잔류 바이러스 함량에 대하여 시험할 것이다. DC를 아데노바이러스 벡터(비-통합 벡터)에 의해 생체 외에서 형질도입시키고 종양내 주사 및 후속적인 배출 림프절로의 이동 후 DC의 수명은 짧기 때문에, 상기 바이러스 DNA는 임의의 비-표적 세포 내로 포함될 것으로는 예상되지 않는다. DC의 아데노바이러스 형질도입에 사용한 프로토콜은 80-90% 형질도입율을 생성할 것으로 예상되며 이는 매우 효율적인 것으로 여겨진다.
백혈구 성분 채집술에 의한 PBMC의 수확: 대상은 유피씨아이 아웃페이션트(UPCI Outpatient)의 아페레시스 유닛(Apheresis Unit)에서 표준적인 90분 내지 120분간의 백혈구 성분 채집술을 받는다. 백혈구 성분 채집 절차는 하나의 팔에서 혈관으로부터 혈액을 채취하는 것; 원심분리기(세포 분리기)에 혈액을 통과시키는 것 - 여기서, 혈액의 성분들이 분리되며 하나 이상의 성분이 제거됨 - ; 및 남아있는 성분들을 동일한 팔 또는 다른 팔의 대상의 혈관에 반환하는 것을 포함한다. 세포 분리 장치를 통하여 혈액을 프로세싱할 때 임의의 한 시점에서 대상의 전체 혈액 부피 중 15% 이하를 채혈한다. 세포 분리기에서, 혈액을 혈장, 혈소판, 백혈구 세포 및 적혈구 세포로 분리한다. 백혈구 세포(WBC)를 제거하고, 모든 다른 성분들을 대상의 순환계 내로 반환한다. 이 절차에 있어서 두 말초 정맥 주사선을 사용하려는 시도가 매번 이루어진다. 이것이 가능하지 않은 경우, 중심 정맥 주사선(central line)이 필요할 수 있다. 대상은 백혈구 성분 채집술을 받도록 의사가 깨끗이 해야 하며, 상기 절차 이전에 생명 징후(혈압을 포함함)에 대하여 일상적으로 스크리닝한다.
프로세싱: 수집 후, 류카팩(leukapack)을 CPL로 수동으로 전달하고, 엘루트라TM(ELUTRA™)에서 원심분리에 의한 정화(elutriation)에 의해 즉각적으로 프로세싱한다. 이는 임상 용도로 인가된 페쇄 시스템이다. 단구 분획을 회수하고, 세포의 회수 및 생존성을 확립한 후 세포를 IL-4 및 GM-CSF의 존재 하에 6일간의 배양을 위하여 아스트롬(Aastrom) 카트리지로 옮긴다. 모든 프로세싱 및 세척 절차를 살균 조건 하에서 수행한다.
초기 도말: 단일 류카팩으로부터 회수한 단핵구를 트립판 블루 염료의 존재 하에 계수하여 생육성 세포의 개수를 결정한다. 단핵구를 유세포 분석법에 의해 순도에 대하여 평가한다. 단핵구를 SOP-CPL-0166 당 1,000 IU/mL의 IL-4 및 1,000 IU/mL의 GM-CSF를 함유하는 무혈청, 무항생제 셀제닉스(CellGenix) 배지 중에 5 내지 10 x 106개의 세포/mL로 재현탁하고, 아스트롬 카트리지 내에 넣는다. 50 ml의 최소 로딩 부피 및 최소 세포 개수가 카세트 접종에 요구된다.
배양: 미성숙 DC 생성을 위한, 완전 페쇄형의 cGMP-상용성 자동 배양 장치인 레플리셀 시스템(Replicell System) 내의 인큐베이터 내에 아스트롬 카트리지를 넣는다.
미성숙 DC의 수확: 6일째에, 아스트롬 카트리지를 인큐베이터로부터 꺼내고, 미성숙 DC를 수확한다. 이 세포를 1,500 rpm에서의 원심분리에 의해 회수하고, 셀제닉스 배지에서 세척하고, 트립판 블루 염료의 존재 하에 계수하고, 형태적 특징 및 표현형적 특징에 대하여 조사한다.
생육성: 이것은 트립판 블루의 존재 하에 혈구계에 의한 세포 계수를 수행함으로써 결정한다. 일반적으로, 수확된 세포의 >95%가 생육가능하며, 즉, 트립판 블루 염료가 배제된다. 생육성이 70% 미만일 경우, 미성숙 DC는 버린다.
표현형 결정: 배양에서 생성된 세포를 혈구계에서의 현미경 관찰에 의해 계수하고, 트립판 블루 염료를 이용하여 예비 감별 계수치(DC 대 림프절)를 얻는다. DC 대 림프절을 게이팅 온(gating on)하고 미성숙 DC의 높은 전방 및 측방 산란 특성을 그의 확인을 위한 기준으로서 이용하여 감별 계수치의 확인을 한다. 미성숙 DC는 일상적으로 수지상 세포 형태를 갖는 >80%의 세포를 포함하며 DC 표현형을 갖는다.
IL- 12p70 효력의 분석: 성숙 DC(mDC)는 고유한 면역성 시그널(예를 들어, LPS)을 첨가하거나 첨가하지 않고서 CD40L의 활성화시에 또는 자발적으로 IL-12p70을 생산하는 능력을 갖는다. 표준화된 IL-12p70 생성 분석법은 최근에 확립되었으며, 다양한 조건 하에 생성된 DC 백신의 적은 샘플 또는 많은 로트에 응용가능하다. 현재의 효력 분석법은 독특한 두 단계로 이루어지는데, 제1 단계는 자극자로서 인간 CD40 리간드 유전자로 안정하게 형질감염된 J588 림프종 세포와 함께 반응 DC(responder DC)를 공동 인큐베이션하는 것을 포함한다. 제2 단계는 루미넥스 시스템에서 J558/CD40L +/- LPS로 자극한 DC에 의해 분비되는 IL-12p70의 수준에 대하여 이들 공동 배양물 유래의 상청액을 시험하는 것을 포함한다. 이 효력 분석법은 18.5%(n=30)의 분석간 변동 계수(inter-assay CV) 및 광범위한 동적 범위를 가지며, 이는 대단히 상이한 수준의 IL-12p70 생성을 특징으로 하는 다양한 DC 생성물의 평가를 용이하게 한다. 13명의 정상적인 공여자의 단구로부터 생성된 DC 생성물을 이용하여 확립한 분석법에 있어서의 정상적인 범위는 8-999pg/mL이었으며, 이때 평균은 270 pg/mL이었다.
수지상 세포에 있어서의 생성 및 방출 기준
시험관 내에서 생성된 수지상 세포의 각각의 로트(lot)를 내독소뿐만 아니라 미생물 오염물(호기성 및 혐기성 박테리아, 진균류 및 마이코플라즈마)의 존재에 대해서도 시험하고 표현형 및 기능 면에서 특성화한다. 대상에게 주사될 모든 수지상 세포는 신선하며, 냉동 보존을 겪지 않는다.
DC의 품질 보증 시험: 상기에 기술된 바와 같이 생성한 DC를 살균성, 생육성, 순도, 효력 및 안정성에 대하여 평가한다. 세포 생성물의 방출에 대한 기준을 확립하고 이를 엄격하게 따른다.
생육성: 배양에서 생성된 세포를 혈구계에서의 현미경적 관찰에 의해 계수하고, 트립판 블루 염료를 이용하여 감별 계수치(DC 대 림프절)를 얻는다. 이 계수치는 시험 배양물 중 생육성 세포의 백분율을 제공한다. 트립판 블루에 의한 배제에 의해 세포 생육성이 70% 초과이고 단핵구-유래 DC 마커로서 HLA-DR 및 CD86을 발현하는 세포가 최소 70%인 것이 방출 기준의 통과에 요구된다. 추가의 마커, 예를 들어 DC 성숙 상태를 평가하기 위한 CD83 및 CCR7 및, 림프구 오염을 평가하기 위한 CD3 및 CD19를 탐색적 분석을 위하여 포함시킬 수 있다.
순도: FITC- 및 PE-콘쥬게이션된 mAb로 염색된 세포의 2색(two-color) 유세포 분석법을 이용하여 형태적으로 확인된 DC 집단이 DC에 있어서 정의된 표면 항원을 발현하며 단핵구 및 T 및 B 세포 계열 항원이 결여됨을 결정한다. 백신 제조에 있어서, 생성된 DC는 HLA-DR 및 CD86을 발현하여야 하며, CD3, CD19 또는 CD14는 발현하지 않아야 한다. mDC인 것으로 여겨지기 위해서는 세포는 CD83+ 및 CCR7+을 발현하여야 한다.
효력: DC에 있어서의 효력 측정치를 한정하기 위하여, 본 출원인은 상기에 기술된 바와 같이 DC가 IL-12p70을 생성하는 능력을 결정한다.
살균성: 유니버시티 오브 피츠버그(University of Pittsburgh) 의료 센터 미생물학 실험실에서 비디 박텍 시스템(BD Bactec system)(미국 메릴랜드주 스팍스 소재의 벡톤 디킨슨 컴퍼니(Becton Dickinson Co.))을 이용하여 박테리아(호기성 및 혐기성) 및 진균류 배양에 의해 DC를 시험한다. 미생물 배양의 최종 결과는 14일 후에 입수가능하다. 백신 용도의 DC의 방출 이전에, 그람 염색을 수행하며, 이는 미생물의 존재에 대하여 음성이어야 한다.
IMCPL은 핵산 혼성화 기술을 기반으로 하는 젠-프로브 마이크로플라즈마 티슈 컬쳐 래피드 디텍션 시스템(Gen-Probe 마이코플라스마 Tissue Culture Rapid Detection System)(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 젠-프로브, 인크.(Gen-Probe, Inc.))의 이용에 의해 마이코플라즈마에 대하여 시험한다. 리물루스 아뫼보사이트 라이세이트 파이로젠 플러스(Limulus Amoebocyte Lysate Pyrogen Plus) 분석(미국 메릴랜드주 워커빌 소재의 바이오 위트테이커, 인크.(Bio Whittaker, Inc.))을 이용하여 내독소 시험을 수행한다. 내독소 시험은 최종 생성물의 수확시에 그리고 최종 생성물의 방출 이전에 세포 배양물에서 수행한다. 허용가능한 내독소 수준은 체중 1 kg 당 <5 EU이다. 비형질도입 및 형질도입 수지상 세포를 추가의 분석을 위하여 냉동 보관한다.
모든 형질도입 세포는 트랜스유전자을 발현할 것으로 예상된다. 80% 초과의 DC가 형질도입될 것으로 예상된다. 천연 코딩 서열이 트랜스유전자 내에서 유지되기 때문에 생성물은 생물학적 활성을 갖는다. 종양 내로 주사된 바이러스-형질도입된 DC는 미성숙 DC 표현형의 것이며, DC가 성숙을 겪게 될 때까지는 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자를 발현하지 않으며, 따라서, 이 단계에서 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 발현은 대부분 트랜스유전자으로부터의 것이다. IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자 트랜스유전자의 발현은 투여량-의존적 방식으로 소분자 활성자 약물 RG-115932에 의해 유도되기 때문에, 형질도입된 DC에서의 트랜스유전자의 발현 수준을 원하는 수준으로 제어할 수 있다. 인간 대상에게의 투여용으로 제조된 형질도입된 DC의 작은 부분을 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 발현의 활성자 약물-의존성 유도에 대하여 시험관 내에서 시험할 수 있다. IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 발현을 4 ng/ml의 민감성으로 ELISA에 의해 분석할 수 있다.
제안된 연구에서 사용된 벡터에 의해 형질도입된 세포로부터의 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 시험관 내 유도는 ELISA로 결정할 때 24시간 후에 106개의 세포 당 약 500 ng의 IL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자를 생성할 것으로 예상된다. 마우스 흑색종 모델을 이용한 전임상 연구에서, 106개 이상의 형질도입된 DC의 종양내 주사가 효력을 나타낸다. 그러나, 요구되는 종양내 주사는 이 양 미만의 수준에서 효력을 나타낼 수 있으며, 따라서 5 x 107개의 형질도입된 DC의 주사는 더 적거나 더 많은 양이 필요한지를 결정하기 위한 출발 시점으로서 이용될 수 있을 것으로 예상된다.
예를 들어, 시험관 내에서, IL12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 유전자를 지니는 재조합 아데노바이러스 벡터로 형질도입된 인간 및 마우스 세포주 및 일차 수지상 세포는 투여량 의존적 방식으로 활성자 약물에 반응하는 IL12 발현의 유도를 나타낸다.
6.3. 활성자 약물의 제형화
본 명세서에서 사용되는 활성자 약물을 하기 제형들 중 임의의 하나로 제형화한다:
(1) 100% 라브라졸(Labrasol);
(2)(a) 멘톨,(b) 티몰,(c) 유칼립톨,(d) 아스파탐,(e) 소디움 사카린,(f) 시트르산,(g) 페퍼민트 맛,(h) 크림 맛,(i) 라브라졸을 함유하는 리스테린 착향 라브라졸(Listerine flavored Labrasol)(미국 소재의 래티튜드 파마슈티칼스 인크.(Latitude Pharmaceuticals Inc.);
(3) 미글리올(Miglyol) 812 및 포스포리폰(phospholipon) 9OG(미국 소재의 래티튜드 파마슈티칼스 인크.); 또는
*(4) 미글리올 812, 포스포리폰 9OG 및 비타민 E 토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 석시네이트(미국 소재의 래티튜드 파마슈티칼스 인크.).
전달
다양한 농도 및 특정 프로토콜을 생각할 수 있지만, 환자를 치료하는 한 가지 예는 경구 활성자 약물(RG-115932)과 조합된, RTS의 제어 하의 hIL-12(인간 인터루킨 12) 및 하나 이상의 다른 면역조절자를 발현하도록 조작하고 살균 식염수 중에 현탁시킨 5 x 107개의 농도의 형질도입된 자가유래 수지상 세포(AdDC)의 종양내 주사(들)를 받는 환자를 포함한다.
초기 치료
1일에서의 입원 방문: 1일에, 기초 신체 검사(생명 징후, 체중, 및 ECOG 상태를 포함함)를 수행한다. 소변을 수집하고, 기초 혈청 화학 검사, 소변 검사 및 혈액 검사(안전성 프로파일)를 위하여 혈액을 채취한다. 시험관 내 조작 수지상 세포를 종양내 주사하기 대략 3시간 전에, 각각의 대상에게 식사 직후 활성자 약물을 투약한다(코호트 1 - 0.01 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1.0 mg/kg, 및 3 mg/kg). 1일에 활성자 약물 및 그의 주요 대사 산물의 단일 투여량의 약동학적 특성의 평가를 위하여 명시된 시간 간격으로(사전 투약, AD를 투약한지 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 및 24시간 후) 혈액을 채취한다. 각각의 대상은 RTS의 제어 하에 hIL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자를 발현하도록 조작된, 5 x 107개의 세포의 농도의 아데노바이러스 형질도입된 자가유래 수지상 세포의 1회 종양내 주사를 받는다. 대상을 국소 주사 부위 반응 및/또는 과민 반응에 대하여 주의깊게 모니터링한다. 2일 내지 14일에서의 입원 방문: 2일 내지 14일에, 각각의 대상에게 식사 직후 활성자 약물을 투약한다. 생명 징후 및 이상 반응을 2일 내지 14일에 매일 수집한다. 4일 ± 24시간에, hIL-12 및 세포 면역 반응의 측정을 위하여 종양 및/또는 배출 림프절의 생검체를 대략 50%의 대상으로부터 제거한다. 8일에, 체중을 측정한다. 8일 ± 24시간에, hIL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자 및 세포 면역 반응을 측정을 위하여 4일에 생검을 수행하지 않은 대상으로부터 종양 및/또는 배출 림프절의 생검체를 제거한다. 아데노바이러스 및/또는 RTS 구성요소에 대한 잠재적인 항체 및 세포 면역 반응의 분석을 위하여 4일 ± 24시간 및 8일 ± 24시간에 혈액을 채취한다. 또한 혈청 사이토카인 프로파일을 얻어서 다른 사이토카인의 발현이 hIL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 트랜스유전자을 이용한 치료에 의해 영향을 받는지를 결정한다. 8일에, 기초 혈청 화학 검사, 소변 분석 및 혈액 검사(안전성 프로파일)를 위하여 소변을 수집하고 혈액을 채취한다. 활성자 약물 및 그의 주요 대사 산물의 정상 상태에서의 약동학적 특성/ADME의 평가를 위하여 8일에 명시된 시간 간격으로(사전투약, AD 투약한지 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 및 24시간 후) 혈액을 채취한다.
14일에서의 입원 방문: 14일에, 각각의 대상에게 식사 직후 활성자 약물을 투약한다. 각각의 대상은 신체 검사(생명 징후, 키, 체중 및 ECOG 상태를 포함함)를 받는다. 혈청 화학 검사, 소변 검사 및 혈액 검사(안전성 프로파일)를 위하여 소변을 수집하고 혈액을 채취한다. 아데노바이러스 및/또는 RTS 구성요소에 대한 잠재적인 항체 및 세포 면역 반응의 분석을 위하여 14일 ± 24시간에 혈액을 채취한다. 또한 혈청 사이토카인 프로파일을 얻어서 다른 사이토카인의 발현이 영향을 받는지를 결정한다.
명시된 입원 및 외래 방문에서 혈액을 대상으로부터 수집하여 아데노바이러스 및 RTS의 구성요소에 대한 잠재적인 항체 및 세포 면역 반응을 측정한다. 기초혈청 사이토카인 프로파일을 위하여 혈액을 얻는다. AdVeGFP 감염성 차단 유형 분석을 이용하여 아데노바이러스 벡터에 대한 항체 반응을 검출한다(Gambotto, Robins et al. 2004). RTS 구성요소에 대한 항체 반응을 환자 유래의 혈청 및 발현 벡터로부터 생성된 RTS를 이용하여 웨스턴 블롯 및/또는 ELISA에 의해 평가한다. 게다가, IL-12, IFN-감마, IP-IO, 및 다른 Thl/Th2 사이토카인, 예를 들어 IL-2, TNF-알파, IL-4, IL-5, 및 IL-10에 대하여 루미넥스에 의해 혈청에서 복합적인 사이토카인 시험을 수행한다. 이들 항체 및 사이토카인 분석은 약 10 ml의 혈액을 필요로 한다.
아데노바이러스 및/또는 RTS의 구성요소에 대한 잠재적인 항체 및 세포 면역반응: 혈액을 명시된 입원 및 외래 방문시에 대상으로부터 수집하여 아데노바이러스 및 RTS의 구성요소와 종양 항원에 대한 잠재적인 항체 및 세포 면역 반응을 평가한다. AdVeGFP 감염성 차단형의 분석을 이용하여 아데노바이러스 벡터에 대한 항체 반응을 검출한다(Nwanegbo, et al. 2004). 대상 유래의 혈청 및 발현 벡터로부터 생성된 RTS 단백질을 이용하여 웨스턴 블롯 및/또는 ELISA에 의해 RTS 구성요소에 대한 항체 반응을 평가한다. 게다가, IL-12, IFN-감마, IP-1O, 및 다른 Thl/Th2 사이토카인, 예를 들어 IL-2, TNFα, IL-4, IL-5, 및 IL-10에 대하여 루미넥스에 의해 혈청에서 복합적인 사이토카인 시험을 수행한다. 이들 항체 및 사이토카인 분석은 약 10 ml의 혈액을 필요로 할 것이다.
세포 면역 반응 분석에서는 약 50-60 ml의 혈액을 이용하며, CD4 및 CD8 T 세포 하위세트를 그로부터 분리한다. AdV-유래 항원 및 RTS-유래 항원 - 만약에 있다면 - 에 의해 활성화되는 T 세포에 의한 IFN-감마 생성에 대한 ELISPOT 분석에서, 상기 분리한 T 세포를 AdV 공 벡터(empty AdV vector), AdV-RTS, 또는 AdVRTS-hIL12-면역조절자(들) 벡터로 형질도입된 자가유래 DC와 혼합한다. 공유되는 흑색종 항원을 발현하는 DC 및/또는 그러한 종양 세포를 이용하여 유사한 분석을 수행하여 종양에 대한 초기 면역 반응을 평가한다. 필요할 경우 추가의 분석을 또한 수행할 수 있다.
임신 검사: 임신 가능성이 있는 여성은 스크리닝 방문시에 그리고 재치료 시기의 첫 번째 입원 방문 전에 소변 임신 검사를 시행한다. 이 검사는 초기 치료 기간 및 모든 재치료 기간 둘 모두 동안 활성자 약물을 투여하기 적어도 72시간 전, 48시간 전, 24시간 전 또는 12시간 전에 수행한다. 소변 임신 검사가 양성이라면, 혈청 임신 검사에 의해 확인을 한다. 임신이 확인될 경우, 대상을 임상 시험에 들어가지 못하게 하거나 재치료기를 계속하지 못하도록 한다. 임신 검사는 필요한 만큼 많은 횟수로 재수행할 수 있다.
수반되는 의약에 관한 조사: 스크리닝할 때, 그리고 재치료기의 첫 번째 입원 방문 전에, 동반되는 의약의 목록을 제공하도록 각각의 대상에게 요청하여 임상 시험 및 추적 시기 동안 일어나는 이상 반응에 대한 임의의 가능한 관계를 결정한다.
재치료 기준: 대상이 불리한 반응 - 이는 제한하는 것임 - 이 없이 이전의 AdDC 접종에 견딘다면 그리고 잠재적인 재치료시에 질환 또는 증상 감퇴의 진행이 전혀 없는 것으로 보이면, 이들은 재치료에 대하여 고려된다. 주요 연구자, 및 치료 의사의 의견상, 14 연속일 동안 활성자 약물(코호트 1로부터의 최대 허용 투여량)과 조합된 AdDC의 추가적인 종양내 주사(들)에 대하여 잠재적인 임상 이득이 있으면, 하기 기준을 충족할 경우 재치료를 대상에게 제공한다:
1. 제한 독성이 전혀 없었음,
2. 대상의 질환은 안정적이거나 임상적 또는 주관적 개선 징후를 나타냄, 및
3. 레오스위치®(등록상표) 테라퓨틱 시스템의 아데노바이러스 구성요소에 대한 항체 또는 세포 면역 반응의 증거가 전혀 없음.
트랜스유전자 기능 및 면역학적 효과의 평가: hIL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 트랜스유전자 발현, 및 세포 면역 반응의 생체 내 평가를 위하여, 스크리닝 동안(-12일 내지 -7일), 임상 시험의 4일, 8일 및 14일째, 및 추적한지 1개월에 종양 및 관련된 배출 림프절의 펀치 또는 절제 생검체를 수집한다. hIL-12 및 하나 이상의 다른 면역조절자의 트랜스유전자 발현, 및 세포 면역 반응의 생체 내 평가를 위하여 -12일 내지 -7일에 그리고 재치료 기간 중 14일에 종양 및 관련된 배출 림프절의 미세 니들 흡인 생검체를 수집한다. 생검체를 표준 광학 현미경 검사법 및 면역조직화학적 방법에 의해 평가하여 종양 및 배출 림프절 내로의 T 세포의 세포 침윤을 평가한다. 생검체 조각을 연구 대상 배경을 모르는 병리학자가 판독한다. 종양 및 배출 림프절에서 DC에 의해 유도된 IL-12 발현과 내인성 IL-12 발현을 구별하기 위하여, 적절하게 디자인된 프라이머를 이용하여 RNA에 대한 RT-PCR을 사용할 것이다. 스크리닝시에, 임상 시험 4일, 8일 및 14일째에, 추적 1개월째에 그리고 재치료 기간 중 -12일 내지 -7일, 8일 및 14일 째에 혈청 사이토카인 프로파일을 위하여 혈액을 채취한다. 혈청 사이토카인 프로파일을 얻어서 다른 사이토카인의 발현이 hIL-12 트랜스유전자을 이용한 치료에 의해 영향을 받는지를 결정한다. 복합적인 사이토카인 검사를 IL-12, IFN-감마, IP-1O, 및 다른 Thl/Th2 사이토카인, 예를 들어 IL-2, TNFa, IL-4, IL-5 및 IL-1O에 대하여 루미넥스에 의해 혈청에서 수행될 것이다. 이들 항체 및 사이토카인 분석은 약 10 ml의 혈액을 필요로 한다.
활성자 약물의 단회 투약 및 정상 상태 약동학: 단회 투약시의 약동학적 특성의 평가를 위하여 임상 시험 1일째에 그리고 활성자 약물 및 그의 주요 대사 산물의 정상 상태 약동학적 특성/ADME의 측정을 위하여 임상 시험 8일째에 명시된 시간 간격으로(사전투약, 아침 투약을 한지 0.5시간 후, 1시간 후, 1.5시간 후, 2시간 후, 4시간 후, 6시간 후, 8시간 후, 12시간 후, 16시간 후 및 24시간 후) 혈액을 채취한다. 활성자 약물 및 그의 주요 대사 산물의 하기의 정상 상태 약동학 종점을 얻기 위하여 HPLC로 혈장을 평가한다: Cmax(관찰된 최대 혈장 농도), Tmax(관찰된 최대 혈장 농도까지의 시간), Ctrough(0시간 및 24시간에서의 농도들의 평균으로서 계산된 관찰된 최소 혈장 농도), C24h(24시간에서의 혈장 농도), AUC24h(0시간으로 부터 24시간까지의 혈장 농도-시간 곡선 하의 면적), Ke(겉보기 제거 속도), 및 T112(겉보기 반감기).
전술한 실시 양태 및 실례는 어떠한 점에서도 본 발명의 범주를 한정하고자 하는 것이 아니며 본 명세서에 제시된 특허청구범위는 본 명세서에 명백하게 제시되든 제시되지 않든 모든 실시 양태 및 실례를 포함하고자 하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예 3
합리적으로 선택된, 모듈러 유전자 성분의 매트릭스를 울트라벡터®(ULTRAVECTOR)(등록상표)과 같은 조합 트랜스유전자 기술의 적용을 통해 DNA 발현 작제물내로 신속하게 조립할 수 있다. 전사, 전사-후, 해독 및 해독 후 공정에 개별적으로 영향을 미치는 조립된 유전자 성분이 함께 유전자 발현 수준에 영향을 주는지를 입증하기 위하여, 레오스위치 기술을 임의로, 인공 5'UTR, 다양한 3'Reg + 폴리(A) 시그날(SV40 및 hGH), 시그날 펩티드(TNF-알파 및 IL-2), 및 코돈 최적화(+/-) 계획과 함께, 사용하여 전사를 조절함으로써 TNF-알파를 생산하여 분비하는 세포의 능력을 증가시킨다. 도 11은 사용된 모듈러 성분을 설명하며, 유일한 제한 부위에 의해 인접된 각각의 모듈러 성분을 그래프로 나타냄으로써 모듈러 조합의 상세한 조립 방법을 제공한다.
모듈러 조립은 합성 유전자를 수용하도록 설계된 DNA 골격과 관련하여 수행하였다. 아데노바이러스 패키징을 위해 가공된 울트라벡터®(등록상표) 골격의 한가지 예는 도 12에 묘사한다. 조합 모듈러 설계는 천연적으로 발견된 것들보다 더 짧을 수 있는 조밀한 조절 서열의 사용을 허용하므로 치료제의 아데노바이러스 전달과 잘 조합한다.
모듈러 조합의 시험관내 평가
[표 7] 11개의 시험 벡터 및 조립된 DNA를 생성하는 매트릭스
Figure 112017107941059-pat00027
벡터를 HEK293T 세포주내로 일시적으로 형질감염시켜 모듈러 조합이 TNF-알파 생산량을 증가시켰는지를 평가하였다. TNF-알파의 발현을 유도하기 위해, 리간드 또는 비히클 대조구를 세포에 투여하였다. 상청액을 수집하고 TNF-알파 수준을 ELISA를 통해 측정하였다. 야생형에 근접한 기준치를 설정하기 위해, 벡터 43318은 UV 확인된 야생형 TNF-알파 5'UTR, 시그날 펩타이드, 코딩 서열, 및 SV40pA 3'Reg를 함유한다. 개별적으로, TNF-알파 시그날 펩타이드 또는 성숙한 단백질 코딩 서열의 Opt(1,2) 코돈 최적화의 모듈 변화는 단백질 분비에 있어서 증분적 증가를 생성한다(벡터 43319, 43320). TNF-wt 5'UTR에 대한 5U2 5'UTR의 추가의 모듈러 치환은 분비수준을 추가로 상승시킨다(벡터 43322, 43323). TNF-알파의 최대 분비는, 야생형 5'UTR, 시그날 펩타이드, 및 코딩 서열 모듈이 5U2, IL2, 및 TNFOptUV 각각의 모드(mod)로 치환되는 경우(벡터 43329)에 달성된다.
TNF-알파의 증가된 분비가 세포 유형 의존성이 아님을 입증하기 위해, 11개의 실험 벡터를 CHO-K1 세포를 형질감염시키고 2개의 대조군 벡터를 가하였다(참조: 도 27). 벡터 43534(도 26) 및 벡터 43533(도 25)는 야생형 TNF-알파 모듈을 함유함으로써 대조군으로서 제공된다. 벡터 43534는 울트라벡터®(등록상표) 조립 중심점(pivot)이 존재하지 않는 야생형 TNF-알파 서열로 구성된다. 특히, 울트라벡터®(등록상표) 조립 중심점의 존재는 THF-알파의 생산 및 분비에 역으로 영향을 미치지 않는다. 당해 데이타 세트에서 본 발명자들은 또한 폴리A 모듈을 함유하는 SV40 또는 hGH를 지닌 TNF-알파 야생형 3' Reg의 치환이 TNF-알파 분비를 증가시킴을 입증한다. 최대 TNF-알파 생산량은 5U2, IL2 시그날 펩타이드, TNFOptUV, 및 hGHpA 조합으로 달성되었다. CHO-K1 세포로부터의 데이타는 5'UTR, IL-2 시그날 펩타이드, 및 TNFOptUV 코딩 서열을 사용한 증분적 증가의 동일 경향성을 나타낸다. 흥미롭게도, 증가의 크기는 2개 세포 유형에서 약간 상이하다. 이는, 모듈이 각각의 세포 유형에서 유사하게 수행되지만, 특이 세포 또는 조직 유형에서 생리학적 차이는 모듈러 치환 효과의 크기에 영향을 미칠 수 있다. 각각의 범주에서 추가의 모듈을 더 포함시키기 위해 조합 매트릭스를 증가시키는 것은 시험한 세포 유형 또는 조직에 따른 우수한 조합을 확인하도록 할 수 있다. 보다 큰 매트릭스에 포함될 수 있었던 추가의 모듈의 예는 서열 번호 41 내지 46으로 포함된다.
실시예 4. 동물 모델에서 치료학적 후보물의 평가
암, 예를 들면, 전립선 암 또는 두부 및 경부 암을 치료하기 위한 유도성의 최적화된 TNF-알파 작제물의 효력을 입증하기 위해, 질병의 두부 및 경부 암 마우스 모델을 사용할 수 있다. Smad4의 단일 유전자 녹아웃은 악성 인간 두부 및 경부 편평세포 암종(HNSCC)의 자발적인 모델을 생성하는 것으로 입증되었다(PMID: 19841536).
이러한 마우스 품종의 부재하에서, 인간 기원한 HNSCC 종양 세포는 누드 마우스내로 이식될 수 있다. 종양 확립 후 최적화된 TNF-알파 작제물을 아데노바이러스를 사용하여 종양내로 도입시킬 수 있다. 다양한 투여량의 리간드를 마우스에게 투여하여 생산된 최적화된 TNF-알파의 수준을 조절할 수 있다. 종양 부하는 측정될 것이며 종양 괴사를 평가하여 최적화된 TNF-알파 작제물로부터의 잠재적인 치료 후보물을 확인하였다.
실시예 5. 치료학적 양태 실시예
조작된 TNF-알파 트랜스유전자은 복제하지 않는 아데노바이러스 DNA 벡터의 종양내 주사에 의해 환자에게 투여된다. 당해 유전자 프로그램은 IL-2에 대한 코돈-최적화된 시그날 펩타이드와 융합된, 포유동물-코돈 최적화된 성숙한 사이토카인을 코딩한다. 결과적으로, 트랜스유전자 cds(IL-2 SP + TNF-알파)는 야생형 TNF-알파 5'UTR 및 SV40 3' Reg + 폴리(A) 시그날에 의해 인접되며, 이의 발현은 활성화 리간드(즉, 벡터 VVN-43320내로 구현된 DNA, 도 15 참조)의 조심스러운 "다이얼드-인(dialed-in)" 투여량의 투여를 통해 레오스위치 기술(RheoSwitch technoloy)에 의해 조절된다. 예비 데이타는, DNA 요소들의 이러한 조합이 분비된 TNF-알파의 최대의 가능한 유도를 생성하지만 여전히 이의 발현의 "강력한(tight)" 및 "누출이 없는(non-leaky)" 조절을 제공함을 나타낸다. 즉, 발현의 유도되지 않은, 기본 수준은 이러한 트랜스유전자 구조에서 낮게 남으며, 환자에서 조절되지 않은, 표적을 벗어난 효과(off-target effect)를 거의 발휘하지 않을 수 있다.
본 발명의 대체 양태에서, 조작된 TNF-알파 트랜스유전자은 아데노바이러스에 의해 환자에게, 높은 기본 발현 및 최대 트랜스유전자 발현 둘다를 나타내는, 벡터 VVN-43329(참조: 도 24)와 유사한 모듈러 DNA 구조로 투여된다. 당해 DNA는 인공적으로 조작된 5'U2 및 hGH 폴리(A) 시그날, 및 완전한 포유동물 코돈 최적화 및 IL-2 시그날 펩타이드를 사용한다. 환자에서 전신계적 독성의 조절은 종양내 주사시 낮은 아데노바이러스 MOI의 사용으로 달성된다. 보다 적은 정도로, 발현 수준 및 일시적인 조절은 또한 레오스위치 활성화 리간드를 통해 조절된다. 이러한 유전자 생성물의 분포의 추가의 조절은 필수적인 기관에서 표적을 벗어난(off-target) 발현을 금지할 수 있는 조직-특이적인 miRNA 반응 요소의 혼입을 통해, 또는 향상된 향성에 대한 아데노바이러스 캡시드를 인공적으로 가공함을 통해 달성될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에서, 조작된 TNF-알파 트랜스유전자은 5'U2 요소를 통해 인공 mRNA에 대해 고 안전성을 부여하는 것으로 가설화되어 있는, VVN-43328(도 23)에서의 DNA와 유사하다. 그러나, 당해 작제물은 향상된 분비를 위해 IL-2 시그날 펩티드를 사용하지 않으며, 이는 TNF-알파의 N'-말단을 코딩하는 DNA로부터의 야생형 서열을 보유한다. 알려지지 않는 이유로 인하여, 인공 TNF-알파의 고 수준의 분비는 내용에 상관없이 환자의 결과에 유해한 것으로 잘 입증될 수 있는 반면, 메탈로프로테이나제를 통한 "사이토카인 쉐딩(cytokine shedding)"의 천연 메카니즘은 인자를 이의 종양 환경에 국한시킴으로써 환자의 독성을 제한할 수 있다. 외인성 TNF-알파의 천연적인 쉐딩이 여전히 표적을 벗어난 효과를 입증하는 경우, 이의 엑토도메인 스톡(ectodomain stalk)은 돌연변이에 의해 절단되어 천연의 프로테아제에 의한 가용화를 금지할 수 있고, 당해 인자는 실질적으로 제II 형 막관통 단백질로서 세포-세포 접촉을 통해 활성을 효력화시킬 수 있다. 대안적으로, 벡터 VVN-43328에 의해 기술된 작제물과 유사한 트랜스유전자은 외인성 프로테아제에 대한 분해 부위를 함유하는 돌연변이된 스톡 엑토도메인을 지닌 구성적으로 발현된 TNF-알파를 코딩할 수 있다. 이러한 외인성 프로테아제는 궁극적으로 레오스위치 기술-조절된 프로모터 요소하에 있음으로써, 활성화 리간드의 존재시에만 발현될 수 있다. 따라서, TNF-알파의 분해 및 생체내 가용성(표면 발현은 아님)은 모듈러 트랜스유전자 요소를 통해 조절될 것이다.
실시예 6. Ad-RTS-IL-12의 항-종양 효력
Ad-RTS-IL-12의 항-종양 효과는 흑색종, 직장결장, 췌장, 유방, 폐 및 신장 암의 일련의 랫트 종양 모델에서 평가되어 왔다. 예시적인 투여량 반응 실험은 하기 나타낸다. 면역-적격 암컷 C57bl/6 마우스(6 내지 8주령)에게 B16F0 랫트 흑색종 암 세포를 피하 접종하였다. 종양 세포 접종 후 11일 째에, 육안으로 보이는 종양 결절이 명백해진 경우(평균 약 40mm3인 종양 부피), 마우스를 각각 5마리 동물의 군으로 분리하였다. 대조 염수 처리된 군; 활성화 리간드 처리된 군; Ad-RTS-mIL12(lee10 vp)만이 처리된 군을 포함하는 9개 군이 존재하였으며 6개 군은 상이한 투여량의 벡터 Ad-RTS-mIL-12(1e7, 1E8, 1E9, 5e9, 1e10, 5e10 바이러스 입자) 및 활성 인자 리간드로 처리하였다. + 리간드 군에서 마우스에게는 벡터 투여 전 1일째에 2018 TeKlad Global 18% 단백질 설치류 식이(Harlan Laboratories) 사료(1000mg 리간드/사료 kg) 속에 100mg/kg의 활성화 리간드를 제공하였다. 대조군에서의 마우스에게는 2018 Teklad Global 18% 단백질 설치류 식이 사료를 제공하였다. 100μl의 PBS 중 Ad-RTS-mIL12의 단일 투여는 12일 째에 종양내로 주사하였다. 종양 부피 및 체중은 캘리퍼스 및 체중계를 사용하여 매 2 내지 3일마다 측정하고, 대조 종양이 2000mm3에 이를 때까지 동물에게 수행하였다. 데이타를 스터디 로그 동물 연구 소프트웨어(Study Log animal study software)로 업로딩하였다.
도 31에 나타낸 바와 같이, 실질적인 항-종양 효과가 1ee8 vp(73% 내지 99%) 초과의 Ad-RTS-IL-12 투여량에서 관찰되었다. 시험한 Ad-RTS-IL-12의 최저 투여량, 1ee7 vp는 항-종양 효과를 입증하지 않았다. 활성화 리간드의 부재하에서, 1EE10 vp에서 고 투여량의 Ad-RTS-IL-12는 효과를 나타내지 않았으며, 이는 Ad-RTS-IL-12 및 활성화 리간드 둘다의 조합이 요구됨을 나타낸다. 리간드 자체에 의한 치료는 효과가 없음을 나타내었다. 따라서, 당해 연구는 활성화 리간드와 함께 Ad-RTS-IL-12에 의해 매개된 강력한 항-종양 효과를 설명한다.
체중 분석은 도 32에 나타낸다. Ad-RTS-IL-12의 최대 투여량 수준(5ee10 vp)에서 처리한 동물은 19일째에 일시적인 체중 감소를 나타내었지만, 26일째에 회복하였다. 다른 군의 처리시 동물은 어떠한 명확한 투여량 반응 관계를 나타내지 않았으며 체중 증가에 있어서 단지 약간의 변화만이 관찰되었다.
실시예 7. 루이스 폐 암 모델에서 Ad-RTS-IL-12의 효능
암컷, 6 내지 8주령 C57b/6 면역적격 마우스에게 랫트 루이스 폐 암종 세포(Lewis lung carcinoma cell: LLC)를 피하(s.c.) 접종하였다. 세포 접종 후 5일 째에, 마우스를 무작위처리하고 총 4개 군- 비 처리(대조군), 활성자(RG-115932)만, Ad-RTS-mIL-12 단독 및 Ad-RTS-mIL-12과 활성자의 처리군(n=5)으로 지정하였다. 활성자(L)를 제공받은 코호트에게 활성자(1000mg/kg의 사료)와 배합된 (2018 Teklad Global 18% 단백질 설치류 식이(Harlan Laboratories) 사료를 자유로이 공급하였다. Ad-RTS-mIL-12 만을 사용한 처리를 제공받거나 처리를 하지 않은 코호트에게는 정규 식이를 계속 제공하였다. 치료는, 종양이 28±6mm3에 이르렀을때 개시하였다. Ad-RTS-mIL-12(1e10 vp/PBS 중 100μl)를 마우스에게 종양내(i.t.) 주사를 통해 종양 세포 접종 후 6, 9 및 13일 째에 제공하였다. 활성자 사료(L)를 벡터 투여 전 24시간 째에 마우스에게 제공하기 시작하였다. 각각의 마우스의 종양 크기 및 체중을 캘리퍼스 및 체중계를 사용하여 실험 종료까지 주당 3회 모니터링하였다. 실험은, 마우스 종양 크기가 >1200mm3을 초과하였을 때 종결하였다. 데이타는 스터디 로그 동물 연구 소프트웨어로 업로딩하였다.
처리 후 종양 부피는 도 33a에 나타낸다. 대조군 및 활성자(L)만의 군에서 루이스 폐 종양을 지닌 마우스는 대략적으로 유사한 종양 성장 역학을 나타내었다. 3개 투여량의 Ad-RTS-mIL-12 만이 중간 종양 성장을 이끌었다. 중요하게도, 활성자(L)와 Ad-RTS-mIL-12는 대조군과 비교하여 현저한 종양 성장 억제율(78%)을 생산하였다. 당해 데이타는, 활성자의 존재하에서 Ad-RTS-mIL-12가 루이스 폐 종양 성장을 억제함을 제안한다. 체중은 독성의 지표로서 모니터링하였다. 어떠한 중요한 체중 감소도 실험 과정 동안 발견되지 않았다.
실시예 8. 흑색종 모델에서 Ad-RTS-IL-12의 항-종양 효능
암컷, 6 내지 8주령의 C57b/6 면역적격성 마우스에게 랫트 흑색종 암세포(B16F0)를 피하(s.c.) 접종하였다. 세포 접종 후 10일 째에, 마우스를 총 9개의 군: 비 처리(대조), 활성자(L)(RG-115932)만, 및 Ad-RTS-mIL-12 단독, 및 Ad-RTS-mIL-12에 대한 리간드의 상이한 활성자 투여량(50, 100, 250, 500 및 1000mg/kg)으로 처리군 및 대조군(n = 5)으로 무작위적으로 지정하였다. 활성자(L)를 제공받은 코호트에게 활성자(1000mg/kg의 사료)와 배합된 설치류 2018 Teklad Global 18% 단백질 설치류 식이 사료를 자유로이 공급하였다. Ad-RTS-mIL-12 만을 사용한 처리를 제공받거나 처리받지 않은 코호트는 정규의 2018 Teklad Global 18% 단백질 설치류 식이 사료 식이를 계속 제공하였다. 치료는, 종양이 56±18mm3에 이르렀을 때 개시하였다. 단일 투여량의 Ad-RTS-mIL-12(1e10 vp/PBS 중 100μl)를 마우스에게 종양내(i.t.) 주사를 통해 종양 세포 접종 후 13일 째에 제공하였다. 활성자(L) 사료를 마우스에게 벡터 주사 전 24시간째에 제공하였다. 각각의 마우스의 종양 크기 및 체중을 캘리퍼스 및 체중계를 사용하여 실험의 종료까지 주당 3회 모니터링하였다. 실험은, 종양 크기가 >2000mm3을 초과하였을 때 종결하였다. 데이타는 스터디 로그 동물 연구 소프트웨어내로 업로딩하였다.
처리 후 종양 부피 및 체중 변화는 도 34a 및 34b에 나타낸다. 대조군 및 활성자(L)만의 군에서 흑색종 종양을 지닌 마우스는 유사하게 공격적인 종양 성장을 나타내었다. 종양 성장 역학은, 활성자 사료가 항-종양 활성을 가지지 않았음을 나타내었다. 동물에게 리간드를 포함하지 않는 단일 투여량의 Ad-RTS-mIL-12 만을 제공하는 경우 약간의 종양 크기 억제(12%)가 26일째에 관찰되었다. Ad-RTS-mIL-12 및 활성자(L)를 사용한 처리는 대조 마우스와 비교하여 종양 크기 억제(73% 내지 98%)를 생성하였다. 단일 투여량의 Ad-RTS-mIL-12와 50mg/kg의 활성자(L)는 대조 종양과 비교하여 유의적인 종양 감소를 생성하였다. 놀랍게도, 항-종양 활성(90 내지 98%)은, 투여량 활성자 사료가 50mg/kg 활성자 식이와 비교하여 100mg/kg 내지 1000mg/kg으로부터 할때 명백하였다. 당해 데이타는, Ad-RTS-mIL-12가 흑색종 모델에서 활성임을 나타내며 광범위한 치료학적 활성화 리간드 투여량 윈도우(window)를 나타낸다. 체중은 독성의 지표로서 모니터링하였다. 13일 및 17일 째에, 약간의 일시적인 체중 변화(<5%)가 1000mg/kg의 활성자 투여량에서 발견되었다. 주요 체중 감소는 나머지 실험 동안 발견되지 않았다. 체중 변화와 관련된 활성자 투여량 반응은 발견되지 않았다. 상이한 투여량하에서 AdRTS-mIL-12를 사용한 처리는 어떠한 독성의 어떠한 신호없이 잘 견뎠다.
실시예 9. 결장 암 모델에서 Ad-RTS-IL-12의 항-종양 효능
암컷, 6 내지 8주령의 Balb/C 면역적격성 마우스에게 안정한 랫트 결장 암 세포(CT26Luc)를 발현하는 루시퍼라제를 피하(s.c.) 접종하였다. 세포 접종 후 10일 째에, 마우스를 총 3개의 군: 비 처리(대조), 활성자(L)(RG-115932) 단독, 및 Ad-RTS-mIL-12와 활성자의 처리군 및 대조군(n = 5)으로 무작위적으로 지정하였다. 활성자(L)를 제공받은 코호트에게 활성자(1000mg/kg의 사료)와 배합된 설치류 2018 Teklad Global 18% 단백질 설치류 식이 사료(harlan Laboratories)를 자유로이 공급하였다. 처리를 제공받지 않은 코호트는 2018 Teklad Global 18% 단백질 설치류 식이 사료를 계속 제공하였다. 처리는, 종양이 40±17mm3에 이르렀을 때 개시하였다. Ad-RTS-mIL-12(1e10 vp/PBS 중 100μl)를 마우스에게 종양내(i.t.) 주사를 통해 종양 세포 접종 후 11일 및 18일 째에 제공하였다. 활성자(L) 사료를 마우스에게 벡터 주사 전 24시간째에 제공하였다. 각각의 마우스의 종양 크기 및 체중을 캘리퍼스 및 체중계를 사용하여 실험의 종료까지 주당 3회 모니터링하였다. 실험은, 마우스 종양 크기가 >2000mm3을 초과하였을 때 종결하였다. 데이타는 스터디 로그 동물 연구 소프트웨어내로 업로딩하였다.
처리 후 종양 부피 및 체중 변화는 도 35a 및 35b에 나타낸다. 대조군 및 활성자(L) 만의 군에서 결장 암종을 지닌 마우스는 유사하게 공격적인 종양 성장을 나타내었다. 종양 성장 역학은, 활성자 사료가 항-종양 활성을 가지지 않았음을 나타내었다. Ad-RTS-mIL-12 및 활성자(L) 만의 2회 투여량은 대조 마우스와 비교하여 완전한 퇴행 및 종양 크기 억제(100%)를 생성하였다. 놀랍게도, 5마리의 동물 중 5마리가 Ad-RTS-mIL12 처리의 결과로서 종양이 완전히 사라졌다. Ad-RTS-mIL-12 처리 후 종양이 사라진 마우스에게 모 CT26Luc 세포를 사용하여 재-챌린지하였다. 5마리의 나이브 Balb/c 동물에게 또한 대조군으로서 CT26Luc를 피하 접종하였다. 동물은 예측한 바와 같이 종양 결절로 진행되었다. 중요하게도, 종양은 재챌린지(re-challengend) 후 4주 째에 재챌린지된 동물 모두에서 발달하지 않았다. 당해 연구는, Ad-RTS-mIL-12 치료요법이 공격적인 결장 암 모델에 대해 강력한 항-종양 면역성을 발달했음을 나타낸다. 체중은 독성의 지표로서 모니터링하였다. 실험 과정 동안에 주요 체중 감소는 발견되지 않았다.
실시예 10. 췌장 암 모델에서 Ad-RTS-IL 12의 항-종양 효능
암컷, 6 내지 8주령의 C57b/6 면역적격성 마우스에게 동계의 PAN02 췌장 암 세포(ATCC)를 피하(s.c.) 접종하였다. 세포 접종 후 6일 째에, 마우스를 4개의 군- 비 처리, 활성자(L)(RG-115932) 단독, Ad-RTS-mIL12 단독 및 Ad-RTS-mIL-12과 활성자의 각각 5마리 동물의 군으로 무작위적으로 지정하였다. 활성화 리간드를 제공받은 코호트에게 활성자(1000mg/kg의 사료)와 배합된 2018 Teklad Global 18% 단백질 설치류 식이 사료를 자유로이 공급하였다. Ad-RTS-mIL-12 만을 사용한 처리를 제공받거나 처리받지 않은 코호트는 2018 Teklad Global 18% 단백질 설치류 식이 사료를 계속 제공하였다. 마우스에게 종양 세포 이식 후 7일 및 14일 째에 1e10 vp/PBS 중 100μl의 투여량 수준에서 Ad-RTS-mIL12의 단일 종양내(i.t.) 주사를 사용한 처리를 제공하였다. 종양 크기는 벡터 처리 개시 싯점에 평균 STGT mm3 이었다.
각각의 마우스의 종양 크기 및 체중을 실험의 종료까지 주당 3회 모니터링하였다. 실험은, 종양 크기가 600mm3을 초과하였을 때 종결하였다. 췌장 종양은 매우 서서히 성장하므로, 본 발명자들은 실험의 종결로서 정의하였다. 처리하지 않은 마우스에서 종양 성장은 정상이었다.
당해 종양 모델에서, 활성자 단독 또는 Ad-RTS-mIL12 단독을 사용한 처리를 제공받은 마우스에서 적은 종양 성장 지연이 인식되었다. 대조적으로, 모든 Ad-RTS-mIL12 처리된 마우스에서 종양 성장은 처리를 제공받지 않은 대조군 마우스의 것과 비교하여 현저하게 억제(97%)되었다. 체중은 실험 전체에서 캘리퍼스 및 체중계를 사용하여 독성의 척도로서 측정하였다. Ad-RTS-mIL12를 주사한 동물의 체중은 12 내지 13일 째에 일시적인 체중 감소(<5%)를 제외하고는 투여 후 유의적인 체중 감소를 나타내지 않았다. 또한, 병리학적 행위(기면, 헝클어진 털, 파행, 탈수, 구부린 자세 등)이 어떠한 동물에서도 관찰되지 않았다. 종양 퇴행은, 대조 동물이 희생될 때인, 37일 째까지 유지되었다. 데이타는 스터디 로그 동물 연구 소프트웨어내로 업로딩하였다.
결과는 도 36a 및 36b에 나타낸다.
실시예 11. 유방암 모델에서 Ad-RTS-IL12의 항-종양 효능
당해 연구의 목표는 랫트 유방암 모델에서 이의 효능 및 독성에 대해 Ad-RTS-mIL12를 사용한 종양내 처리를 평가하는 것이다.
6주 내지 8주령 암컷 BalbC 마우스 챨스 리버 래보러터리즈(Charles River Laboratories) 또는 Harlan(USA)으로부터 입수하였다. 동물 보호 및 실험 절차는 기관 규정(Intrexon's Institution Animal Care and Use Committee guideline)에 따라 수행하였다.
랫트 유방 암종(4T1) 세포주는 ATCC(버지니아주 마나사스 소재)로부터 입수하였다. 4T1 세포를 Roswell Park Memorial Institute 배지(RPMI) 1640(ATCC, 버지니아주 마나사스 소재)에서 성장시켰다. 배지에 열-불활성화시킨 태아 송아지 혈청(FCS) 10% v/v, 2-mM L-글루타민(Atlanta Biologicals, Inc. 조지아주 라우렌스빌 소재), 100 IU/ml 페니실린 G 및 100㎍/ml의 스트렙토마이신을 보충하였다. 세포를 5% CO2 속에서 37℃로 성장시켰다. 모든 세포주를 정규적으로 시험하여 미코플라스마가 없는 것으로 밝혀졌다.
암컷, 6 내지 8주령의 BALB/c 면역적격성 마우스에게 동계 유방암(4T1) 세포, 1e5 세포/50μl를 피하(s.c.) 접종하였다. 세포 접종 후 8일 째에, 생쥐를 4개의 군- 비 처리, 활성자 단독, 및 Ad-RTS-mIL-12 단독, 및 Ad-RTS-mIL-12과 활성자의 각각 5마리 동물의 군으로 무작위 처리하였다. 활성자(L)를 제공받은 코호트에게 활성자(1000mg/kg)와 배합된 설치류 사료를 자유로이 공급하였다. Ad-RTS-mIL-12 만을 사용한 처리를 제공받거나 처리받지 않은 코호트는 표준 식이(Harlan laboratories, USA)를 계속 제공하였다. 활성화 리간드는 대조 동물에게 투여된 동일한 사료 1Kg에 대해 1000mg의 활성화 리간드로 제형화된 Harlan Teklad(Harlan의 통상의 식이 분배)로부터 생성하였다. 마우스에게 종양 세포 이식 후 9, 12 및 14일 째에, 1e10 vp/PBS 중 100μl의 투여량 수준에서 Ad-RTS-mIL-12의 단일 종양내(i.t.) 주사를 사용한 처리를 제공하였다. 평균 종양 크기 부피는 벡터 처리 개시 시기에 36mm3이었다. 각각의 마우스의 종양 크기 및 체중을 실험 종결까지 주당 3회 모니터링하였다. 실험은, 종양 크기가 >1000mm3을 초과하였을 때 종결하였다.
유방암 4T1 세포를 사용한 접종 후 8일 째에, 마우스를 무작위 처리하여 하기 표에 나타낸 바와 같이, 총 4개 군- 비 처리(대조), 활성자 단독(L), Ad-RTS-mIL12 단독 및 Ad-RTS-mIL12와 활성자에 대해 처리군 및 대조군(n = 5/군)으로 지정하였다.
Figure 112017107941059-pat00028
처리는, 종양이 36mm3에 이르렀을 때 개시하였다. 처리 후 종양 부피는 도 39a에 나타낸다. 대조군, Ad-RTS-IL-12 처리된 및 활성화 리간드(L) 만의 군에서 4T1 종양을 지닌 마우스는 26일 째에 각각 ~20% 및 35%의 종양 성장 억제를 나타내었다(도 39a). 중요하게도, Ad-RTS-mIL-12와 활성화 리간드의 3회 투여량은 대조군(p<0.005)과 비교하여 현저한 종양 성장 억제(82%)를 생성하였다 당해 데이타는, 활성자의 존재하에서 Ad-RTS-mIL12가 유방암(4T1) 모델에서 강력한 항-종양 활성을 나타냄을 제안한다. 체중을 독성의 지표로서 모니터링하였다. 주요 체중 손실 또는 사망은 실험 과정 동안 발견되지 않았다(도 39b).
당해 결과는, Ad-RTS-mIL12와 활성화 리간드의 직접적인 종양내 주사가 종양 퇴행을 유도하는데 매우 효과적이며 유방암 모델에서 안정함을 입증한다. 항-종양 활성은 당해 모델에서 유의적(<0.005)이었다.
실시예 12. 면역 세포 없는 Ad-RTS-IL-12 벡터의 투여를 위한 임상 프로토콜
다음은 절제가능하지 않은 IIIC 기 또는 IV 기 악성 흑생종의 치료를 위한 Ad-RTS-IL-12 벡터의 투여 형태인 본 발명을 실시하기 위해 사용될 수 있는 임상 프로토콜이다.
당해 1b상 임상 시험의 목적은 활성화 리간드의 14회의 매일 경구 투여량과 조합된 Ad-RTS-IL-12의 종양내 주사의 6회의 치료 주기의 안전성 및 목적한 반응, 종양 반응율, 및 면역학적 및 다른 생물학적 활성을 평가하기 위한 것이다. Ad-RTS-IL-12 투여량은 초기(제1 주기)에 활성화 리간드의 5mg/일의 투여량과 함께 1x1011 개의 바이러스 입자(vp)로 투여될 것이다. 바이러스 입자와 활성화 리간드 둘다의 투여량은 단 선행 치료 주기가 환자에 의해 견뎌졌다면 이후에 고정된 스케쥴(도 8)에 따라서, 각각의 환자에 대한 각각의 반복 치료 주기에 대해 확대될 것이며,
당해 1b 상 연구의 목적은 다음과 같다:
1. 절제가능하지 않은 제IIIC 기 또는 제 IV 기 악성 흑색종을 가진 환자에서 활성화 리간드의 확대된 투여량과 함께 환자내 확대된 투여량의 AD-RTS-IL-12의 종양내 주사의 반복된 치료 주기의 안전성 및 내약성(tolerance)의 평가.
2. 진단 CT 스캔(고형 종양에서 반응 평가 기준(RECIST 1.1) 기준), PET 스캔 및 사진(적용가능한 경우)을 사용함으로써 효능의 지표 수득.
3. 주사된 표적 종양(들), 종양을 포함하는 배출 림프절(접근가능한 경우) 및 말초 순환에서 세포 면역 반응(특히 IL-12 및 기타 사이토카인의 유전자 발현, 세포독성 T 림프구 및 Treg의 빈도) 및 다른 생물학적 활성(예를 들면, 세포자멸사 및 면역 세포 침윤)의 측면에서, 및 전(prior) 활성화 리간드 투여량 및 종양 반응을 사용한 면역학적 및 다른 생물학적 매개변수에 있어서의 변화를 상관시키기 위해, 활성화 리간드와 조합된 AD-RTS-IL-12의 면역학적 효과를 평가함으로써 환자에서 레오스위치 테라퓨틱 시스템TM(RTSTM)의 기능성 평가.
4. 흡수 정도가 AD-RTS-IL-12 투여량에 의존하는지에 상관없이 어느 세포가 바이러스를 흡수하는지를 측정하기 위한, 종양 세포 및 종양내 수지상 세포 및 대식구내로의 AD-RTS-IL-12의 흡수 정도의 평가. 종양, 종양을 포함하는 배출 림프절(접근가능한 경우) 및 말초 순환에서 염증 반응 및 면역 반응(세포독성 림프구 및 Treg와 같은 세포성 및 사이토카인의 유도)의 측정. 면역학적 및 다른 생물학적 매개변수에 있어서의 변화는 AD-RTS-IL-12 및 활성화 리간드 투여량 및 종양 반응과 관련될 것이다.
5. 환자의 소세트에서 8 및 9일째에 각각의 주기에서 정지 상태 동안 약동학적 프로파일의 평가.
6. PK 평가할 환자에서 Holter 모니터링에 의해 수득한 ECG에서의 QT/QTc 간격의 평가.
지표:
*적어도 4개의 접근가능한 병변을 갖는 절제가능하지 않은 III C 기(이행중(in transit)), IV 기(M1a, M1b 또는 M1c(LDH ≤ 2xULN) 악성 흑색종.
연구 설계:
각각 28일 지속되며, 각각 활성화 리간드의 14회의 매일 1회 경구 투여량과 함께 Ad-RTS-IL-12을 종양내 주사하는, 6회 치료 주기의 안전성, 용인성, 종양성 반응(RECIST 1.1) 및 면역학적 및 기타 생물학적 효과의 1b 상, 개방 표지(open label), 단일 암(single arm), 다중심 평가. AD-RTS-IL-12 및 활성화 리간드 둘다의 투여량은 앞서의 치료 주기를 견디는 모든 환자에 대해 도 1 및 표 1에 따라 확대될 것이다.
연구 집단:
종양내 주사 또는 생검을 위한 최소 4개의 접근가능한 병변(최대 직경 ≤ 3cm; 최소 직경 ≥ 1cm) 또는 촉지가능한 종양을 포함한 림프절(최대 직경 ≤5cm; 최소 ≥5cm)을 가진, 0 내지 1의 ECOG 수행능 상태의 절제가능하지 않은 III C 기 또는 IV 기 악성 흑색종을 지닌, ≥ 18세의 연령의 모든 인종의 남성 및 여성.
시료 크기:
IIIC 기 또는 IV 기 흑색종을 지닌, 최소 12명 및 최대 28명의 환자를 본 연구에 도입시킬 것이다. 단, 선행 치료 주기는 잘 견디면, 당해 프로토콜에서 모든 환자는 AD-RTS-IL-12 및 활성화 리간드의 환자-내 투여량 확대와 도 1 및 표 1a 내지 표 1b에 따른 각각 반복된 치료 주기를 사용하여 단일 암내로 도입될 것이다.
시험 생성물:
각각의 주기 동안, 환자는 활성화 리간드에 대한 투여량-의존성 반응에 있어서 유도가능한 hIL-12를 발현하도록 조작된 유전자 치료요법(AD-RTS-IL-12)의 종양내 주사와 경구 활성화 리간드의 조합물로 치료될 것이다. AD-RTS-IL-12는 중심 제조 부위에서 제조된 후 동결되어 적절한 임상 부위로 보내질 것이다. 모든 환자에게 AD-RTS-IL-12(대략 1.0 x 1011 및 1.0 x 1012개의 총 바이러스 입자/주사)의(4주 간격으로 6회 주기까지 동안 주기당 1회로) 종양내 주사가 제공될 것이다. 환자에게 또한 각각의 주기 동안 14일의 연속일 동안 활성화 리간드의 1회 1일의 경구 투여량이 제공될 것이다. AD-RTS-IL-12 및/또는 활성화 리간드 투여량은 선행의 치료 주기를 견딘 모든 환자에서 2 내지 6 주기의 개시시 환자내에서 확대될 것이다(참조: 표 8). AD-RTS-IL-12는 각각의 주기에서 상이한 병변내로 주사될 것이며, 병변의 수가 한정된 경우, 주사는 연속적인 회전으로 수행될 것이다. 최소 4개의 접근가능한 병변 중 1개는, 그 병변이 AD-RTS-IL-12의 전신계 효과를 평가하는데 사용될 것이므로 주사되지 않을 것이다. 환자 투여는 적어도 24시간의 시차를 두게될 것이다. 각각의 종양내 주사는 주기 동안 1회, 활성화 리간드의 제1 투여량 후 대략 3시간(± 30분)에 일어날 것이다.
투여량:
활성화 리간드: 최저 투여량/일: 5mg; 중간 투여량/일: 20mg; 최대 투여량/일: 100 mg. 활성화 리간드는 매 주기의 처음 14일 동안 투여될 것이다.
Ad-RTS-IL-12: 투여량: 병변 전체, 특히 종양 가장자리 부위에 분배된 주사 부피로, 총 0.5ml 용적의 멸균 용액 속에 현탁된 주사당 대략 1.0 x 1011 또는 1.0 x 1012의 바이러스 입자/종양.
[표 8]
Figure 112017107941059-pat00029
다음의 보다 많은 투여량 수준을 사용한 치료는, 선행 치료의 안전성 및 내약성이 확인될 때까지 개시하지 않을 것이다. MTD가 정의된 경우, 추가의 확대는 일어나지 않을 것이다.
투여 경로:
활성화 리간드: 식사 30분 내에 경구적으로 섭취되는 연질 젤라틴 캅셀제 속 용액;
AD-RTS-IL-12:
필요한 경우, 하나의 접근가능한 종양 병변 또는 종양을 포함하는(촉지가능한) 배출 림프절내로 각각의 주기의 첫째날에 주사됨.
환자 평가 방법:
모든 환자에게 표 8에 따른 치료를 제공하고 한 암으로 도입시킬 것이다. 안전성 및 내약성은 각각의 치료 주기 동안 및 후에 모든 환자에 대해 엄격하게 평가될 것이다. 투여량 확대는, 선행의 주기 치료가 견뎌진 경우에만 일어날 수 있다.
시험 기간:
본 연구는 스크리닝 후 대략 28주 동안 각각의 환자에 대해 지속될 것이다.
스크리닝 평가를 위해 23일 까지의 기간(-30일 내지 -7일) 후, 환자는 연구에 참여하는 것이 승인될 것이다. -6 내지 -2일째에, 기준 생검을 수행하고 0일 째에, Holter 모니터링을 사용하여 심장 기능의 기준 평가를 PK에 대해 평가되는 환자에서 수행할 것이다. 각각의 주기 1일 째에, 승인된 환자는 실험 치료(AD-RTS-IL-12의 1회 종양내 주사 및 활성화 리간드의 1회 경구 투여량)의 수령을 시작할 것이다. 각각의 주기에서 활성화 리간드 치료는 총 14일 동안 지속된 후, 14일의 세척 및 안전성에 대한 관찰이 이어질 것이다. 연구 치료는 6개 주기로 이루어지며, 각각은 후속되는 14일을 포함하여 총 28일 지속된다. 치료 후 후속된 평가는 마지막 주사(활성화 리간드의 마지막 투여량 후 4주째) 후 6주 째에 수행될 것이다. 혈액 중 바이러스 DNA가 측정될 것이다. 바이러스 DNA가 최종 투여 후 6주째에 존재하는 경우, 추가의 바이러스 DNA 평가가 지속될 것이다. 그러나, 각각의 공급원에 대해 Q-PCR에 의한 2회의 연속적인 음성 결과가 입증되는 경우, 추가의 시험은 필요하지 않을 것이다.
*제1 종점:
안전성 및 내약성은 신체 시험(ECOG 수행능 상태 포함), ECG에 있어서 QT/QTc 간격(PK 환자에 있어서), 생명 징후 측정, 혈청 화학 검사, 소변 검사, 혈액 검사, 및 어떠한 부작용에 대한 환자의 보고에 의해 평가될 것이다.
CT 스캔으로 평가한 것으로서, 목적한 반응 및 반응 속도.
제2 종점:
8명의 환자의 소세트(AD-RTS-IL-12 투여량 수준 당 4명)에서 활성화 리간드의 정상 상태 약동학.
b. 치료의 결과로서, 종양, 종양을 포함하는 배출 림프절(접근가능한 경우) 및 말초 순환내에서 염증 및 면역 반응(세포독성 림프구 및 Treg와 같은 세포, 및 사이토카인의 유도)의 정도.
c. AD-RTS-IL-12 및 활성화 리간드 투여량 및 종양 반응과 면역학적 및 다른 생물학적 매개변수에 있어서의 변화를 관련시킴.
d. PET 스캔 및 사진에 의해 또한 평가된 효력.
e. 장기간 후속조치는 5년까지 수행될 것이다. 환자는 주치의와 매년 접촉될 것이다.
포함 기준:
a. ≥18세의 모든 인종을 포함하는 남성 또는 여성;
b. 임의의 종양 두께의 원발성 피부, 점막 또는 손발톱아래 흑색종으로부터 또는 미지의 원발성 부위로부터 발생하는, 비절제성 III C 단계(이행중) 또는 IV 단계 흑색종(LDH ≤ 2x ULN인 M1a, M1b, M1c);
c. 종양내 주사 또는 생검을 위한 최소 4개의 접근가능한 비내장 병변(최대 직경 ≤3cm; 최소 ≥ 1cm) 또는 촉지가능한 종양을 포함하는 림프절(최대 직경 ≤5cm; 최소 ≥1.5cm). 적어도 하나의 병변에는 주사하지 않을 것이다.
d. 0 또는 1의 ECOG 수행능 상태;
e. 연구 도입 전 30일내에 또는 스크리닝 시기에 대조-향상된 MRI 스캔에 의해 평가된 것으로서 가시적인 뇌 전이가 없는 환자;
f. 연구 치료를 사용한 치료 전 및 반복된 치료 주기 및 다음과 같은 활성화 리간드 투여량 확대 전 30일 내에 실험실 값으로 평가한, 적절한 기준 혈액학적 및 기관 기능: 헤모글로빈 ≥10 g/L, 과립구 > 2500/mm3, 림프구 > 1000/ mm3, 혈소판 > 100,000/ mm3, 혈청 크레아티닌 < 1.5 x ULN, AST, ALT, 알칼린 포스파타제 < 2.5 x ULN, LDH ≤ 2 x ULN, 혈청 빌리루빈 < 1.5 x ULN, 절대적 호중구 > 500/ mm3;
g. 조사자의 의견(수행능 상태에 있어 주로 평가된 것)에 있어서 적어도 대략 6개월의 예측된 생존;
h. 여성은 폐경 후 또는 외과적으로 불임이거나 효과적인 피임이 실시되어야 한다; 외과적으로 불임이 아니며 이의 배우자가 폐경 후 또는 외과적으로 불임이 아닌 남성은 효과적인 피임을 실시하여야 한다;
i. PT/PTT에 의해 측정된 정상적인 응고 매개변수;
j. 서명한, IRB-승인된 자원자 통지된 동의서.
배제 기준:
a. 특수한 치료요법을 필요로 하는 활성의 급성 바이러스, 박테리아, 또는 진균 감염;
b. 효과적인 면역 반응을 증가시키기 위한 능력에 대한 관심으로 인한 HIV-감염;
c. 스테로이드(>10 mg의 프레드니솔론 또는 비교가능한 것) 또는 다른 면역억제성 치료요법을 필요로 하는 활성 자가면역병;
d. 대비-향상된 MRI 스캔에 의해 평가된 것으로서, 스크리닝 시기(또는 연구 도입 전 30일내)에 검출가능한 외 전이를 가진 환자;
e. > 3cm(LD)의 병변 또는 >5 cm(LD)의 촉지성의, 종양을 포함한 림프절을 가진 환자;
f. < 10 g/L의 헤모글로빈을 가진 환자;
g. LDH가 >2 x ULN인 경우 IV 기 내장 전이 또는 다른 원격 전이의 존재;
h. AD-RTS-IL-12 또는 활성화 리간드로 이미 치료한 환자;
i. 종양내 유전자 치료요법으로 이미 치료한 환자;
J. 기관 동종이식의 수용자;
k. 다른 피부암을 제외한, 다른 공존하는 임상적으로 활성인 악성 질병;
l. 이전 화학치료요법, 호르몬 치료요법, 방사선치료요법, 면역치료요법, 또는 어떠한 제1 계통 치료요법(first line therapy)의 완료 이래로 30일 미만이 경과됨(연구 의약의 제1 투여량 전);
m. 임상적으로 유의적인 뇌혈관병;
n. 심각한 심부전(뉴욕 심장 협회 분류(New York Heart Association Class III 또는 IV 기) 또는 관상 동맥병의 병력 또는 공존;
o. 허용되지 않는 마취 또는 수술 위험으로 고려될 수 있는 허혈성 심장 또는 폐병과 같은 급성 의학 상태;
p. 출혈 또는 응고 질환의 병력 또는 현존;
q. 코르티코스테로이드(>10mg의 프레드니솔론 또는 비교가능한 것) 및 사이클로스포린 A와 같은 공존하는 면역억제 치료요법;
r. 공존하는 조사 치료, 또는 과거 30일내(연구 의약의 첫번째 투여량 전) 임의의 조사 치료를 사용한 치료;
s. CYP450 3A4 경로에 의해 대사되는 공존하는 의약;
t. 수유 또는 임신중인 여성;
u. 예를 들면, 2개의 벤젠 환을 함유하는, 활성화 리간드와 관련될 수 있는 벤조산과 같은, 생성물의 임의의 성분과 관련될 수 있는 과민증의 병력을 가진 환자;
v. 조사자의 의견에 있어서 안전성 또는 제안된 치료의 전달을 허용가능하지 않게 감소시킬 수 있거나 자원자의 통지된 동의서를 입수할 수 없는 어떠한 의학적 또는 정신질환 상태.
통계적 방법:
목적 반응(CR + PR)은 CT 스캔[고형 종양에 있어서 반응 평가 기준(RECIST 1.1)을 이용함]에 의한 주사된 및 주사되지 않은 종양 병변(들) 및 촉지가능한 종양크기에 있어서의 변화를 포함한 림프절에 있어서의 변화를 기준으로 할 것이다. PET 스캔 및/또는 사진은 대사 활성 또는 크기(피부 병변) 각각에서의 변화를 평가하는데 사용될 것이다.
OS 및 ORR의 1차 분석은 신뢰 구간을 포함할 것이며, 시료 크기가 12, 16, 20, 24명의 환자들에게 이른 경우, 및 마지막 환자의 치료 후 6주 째에 수행될 것이다.
인구학, 면역학 및 생물학적 활성 척도, 및 또한 부작용 비율 및 실험 값을 포함하는 안전성 매개변수는 후속 조치의 말기에 기술적으로 분석될 것이다. 결과는 표, 그래프 및 환자별 목록에 요약될 것이다.
평균, 중간(median), 표준 편차 및 막대그래프를 포함하는 기술적 통계는 연속적인 측정을 요약하기 위해 사용될 것이다. 빈도 수는 대상 종양 반응을 포함하는 단정적인 변수를 위해 사용될 것이다. 면역학적 및 생물학적 활성은 항종양 효과와 관련될 것이다. 이들 통계는 계층(종양 병변의 크기: ≤ 1cm의 최대 직경 [LD], > 1cm LD; 포함된 DLN의 크기: ≤ 3cm LD, > 3cm LD; 병변의 위치: 내장, 비-내장; 병변의 주사 상태: 주사됨, 주사되지 않음). 통계는 각각의 치료 주기의 종결시 및 종합적으로 수행될 것이다. 종합적인 분석의 경우, 관찰은 계층을 통과하여 조합될 것이지만 주기를 통과하지는 않을 것이다.
순응도:
시험들은 현재의 의약품임상시험관리기준(Good Clinical Practice: cGCP)에 따라 수행한다.
<110> INTREXON CORPORATION <120> Vectors Conditionally Expressing Therapeutic Proteins, Host Cells Comprising the Vectors, and Uses Thereof <130> IPA120855-US-D1 <150> 61/316,792 <151> 2010-03-23 <150> 61/366,731 <151> 2010-07-22 <150> 61/431,364 <151> 2011-01-10 <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13294 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic mIL-12 and mIL-21 <400> 1 taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac 60 cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca 120 attaatcgca ccggtatcta tgtcgggtgc ggagaaagag gtaatgaaat ggcagctagc 180 atcatcaata atatacctta ttttggattg aagccaatat gataatgagg gggtggagtt 240 tgtgacgtgg cgcggggcgt gggaacgggg cgggtgacgt agtagtgtgg cggaagtgtg 300 atgttgcaag tgtggcggaa cacatgtaag cgacggatgt ggcaaaagtg acgtttttgg 360 tgtgcgccgg tgtacacagg aagtgacaat tttcgcgcgg ttttaggcgg atgttgtagt 420 aaatttgggc gtaaccgagt aagatttggc cattttcgcg ggaaaactga ataagaggaa 480 gtgaaatctg aataattttg tgttactcat 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Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro 50 55 60 gag gac gtg gag acc aac tgc gag tgg agc gcc ttc agc tgc ttc cag 240 Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln 65 70 75 80 aag gcc cag ctg aag tcc gcc aac acc ggc aac aac gag aga atc atc 288 Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile 85 90 95 aac gtg agc atc aag aag ctg aag cgg aag ccc ccc agc acc aac gcc 336 Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala 100 105 110 gga aga aga cag aag cac aga ctg acc tgt ccc agc tgc gac agc tac 384 Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr 115 120 125 gag aag aag ccc ccc aag gag ttc ctg gag aga ttc aag agc ctg ctg 432 Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu 130 135 140 caa aag atg atc cac cag cac ctg agc agc aga acc cac ggc agc gag 480 Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu 145 150 155 160 gac agc tga 489 Asp Ser <210> 18 <211> 162 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Met Arg Ser Ser Pro Gly Asn Met Glu Arg Ile Val Ile Cys Leu Met 1 5 10 15 Val Ile Phe Leu Gly Thr Leu Val His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln 20 25 30 Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln 35 40 45 Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro 50 55 60 Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln 65 70 75 80 Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile 85 90 95 Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala 100 105 110 Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr 115 120 125 Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu 130 135 140 Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu 145 150 155 160 Asp Ser <210> 19 <211> 489 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic hIL-15 <220> <221> CDS <222> (1)..(489) <400> 19 atg aga atc agc aag ccc cac ctg aga agc atc agc atc cag tgt tac 48 Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 1 5 10 15 ctg tgc ctg ctg ctg aac agc cac ttc ctg acc gag gcc ggt atc cac 96 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 gtc ttc atc ctg ggc tgc ttc agc gcc gga ctg ccc aag acc gag gcc 144 Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 aac tgg gtg aac gtg atc tct gac ctg aag aag atc gag gac ctg atc 192 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 cag tcc atg cac atc gac gcc acc ctg tac acc gag agc gac gtt cat 240 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80 ccc agc tgc aag gtg acc gcc atg aag tgc ttc ctg ctg gag ctg caa 288 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 85 90 95 gtg atc tcc ctg gag agc ggc gac gcc agc atc cac gac acc gtg gag 336 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 100 105 110 aac ctg att atc ctg gct aac aac agc ctg agc agc aac ggc aac gtg 384 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125 acc gag agc ggc tgc aag gag tgt gag gag ctg gag gag aag aac atc 432 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 130 135 140 aag gag ttc ctc cag agc ttc gtg cat atc gtc cag atg ttc atc aac 480 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 145 150 155 160 acc agc tga 489 Thr Ser <210> 20 <211> 162 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His 20 25 30 Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala 35 40 45 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 50 55 60 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 65 70 75 80 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 85 90 95 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 100 105 110 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val 115 120 125 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 130 135 140 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 145 150 155 160 Thr Ser <210> 21 <211> 987 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic hIL-12, p40 <220> <221> CDS <222> (1)..(987) <400> 21 atg ggt cac cag cag ttg gtc atc tct tgg ttt tcc ctg gtt ttt ctg 48 Met Gly His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 gca tct ccc ctc gtg gcc ata tgg gaa ctg aag aaa gat gtt tat gtc 96 Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 gta gaa ttg gat tgg tat ccg gat gcc cct gga gaa atg gtg gtc ctc 144 Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu 35 40 45 acc tgt gac acc cct gaa gaa gat ggt atc acc tgg acc ttg gac cag 192 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln 50 55 60 agc agt gag gtc tta ggc tct ggc aaa acc ctg acc atc caa gtc aaa 240 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys 65 70 75 80 gag ttt gga gat gct ggc cag tac acc tgt cac aaa gga ggc gag gtt 288 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val 85 90 95 cta agc cat tcg ctc ctg ctg ctt cac aaa aag gaa gat gga att tgg 336 Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp 100 105 110 tcc act gat att tta aag gac cag aaa gaa ccc aaa aat aag acc ttt 384 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe 115 120 125 cta aga tgc gag gcc aag aat tat tct gga cgt ttc acc tgc tgg tgg 432 Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp 130 135 140 ctg acg aca atc agt act gat ttg aca ttc agt gtc aaa agc agc aga 480 Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg 145 150 155 160 ggc tct tct gac ccc caa ggg gtg acg tgc gga gct gct aca ctc tct 528 Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser 165 170 175 gca gag aga gtc aga ggg gac aac aag gag tat gag tac tca gtg gag 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agt tgc ctg gcc 336 Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala 100 105 110 tcc aga aag acc tct ttt atg atg gcc ctg tgc ctt agt agt att tat 384 Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr 115 120 125 gaa gac ttg aag atg tac cag gtg gag ttc aag acc atg aat gca aag 432 Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys 130 135 140 ctt ctg atg gat cct aag agg cag atc ttt cta gat caa aac atg ctg 480 Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu 145 150 155 160 gca gtt att gat gag ctg atg cag gcc ctg aat ttc aac agt gag act 528 Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr 165 170 175 gtg cca caa aaa tcc tcc ctt gaa gaa ccg gat ttt tat aaa act aaa 576 Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys 180 185 190 atc aag ctc tgc ata ctt ctt cat gct ttc aga att cgg gca gtg act 624 Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr 195 200 205 att gat aga gtg atg agc tat ctg aat gct tcc taa 660 Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser 210 215 <210> 24 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Met Gly Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Ala Thr Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Asp His Leu Ser Leu Ala Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro 20 25 30 Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val 35 40 45 Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys 50 55 60 Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser 65 70 75 80 Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys 85 90 95 Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala 100 105 110 Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr 115 120 125 Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys 130 135 140 Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu 145 150 155 160 Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr 165 170 175 Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys 180 185 190 Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr 195 200 205 Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser 210 215 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <400> 25 Arg Arg Gly Gly Thr Thr Cys Ala Asn Thr Gly Ala Cys Ala Cys Tyr 1 5 10 15 Tyr <210> 26 <211> 13 <212> DNA <213> Drosophila melanogaster <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <400> 26 aggtcanagg tca 13 <210> 27 <211> 15 <212> DNA <213> Drosophila melanogaster <400> 27 gggttgaatg aattt 15 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic homing endonuclease (HE) enzyme (I-SceI) <400> 28 tagggataac agggtaat 18 <210> 29 <211> 37323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Ad-RTS-hIL-12 (SP1-RheoIL-12) <400> 29 catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60 ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120 gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180 gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240 taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300 agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tatttgtcta gggagatccg 360 gtaccggcgc gcgcgccgtt tggccgcctc gagtctagag atccggtgag tattaggcgc 420 gcaccaggtg ccgcaataaa atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt ggttttttgt 480 gtgaatcgat agtactaaca tacgctctcc atcaaaacaa aacgaaacaa aacaaactag 540 caaaataggc tgtccccagt gcaagtgcag gtgccagaac atttctctat cgataatgca 600 ggtcggagta ctgtcctccg agcggagtac tgtcctccga gcggagtact gtcctccgag 660 cggagtactg tcctccgagc ggagtactgt cctccgagcg gagtactgtc ctccgagcgg 720 agactcttcg aaggaagagg ggcggggtcg atcgaccccg cccctcttcc ttcgaaggaa 780 gaggggcggg gtcgaagacc tagagggtat ataatgggtg ccttagctgg tgtgtgagct 840 catcttcctg tagatcacgc gtgccaccat gggtcaccag cagttggtca tctcttggtt 900 ttccctggtt tttctggcat ctcccctcgt ggccatatgg gaactgaaga aagatgttta 960 tgtcgtagaa ttggattggt atccggatgc ccctggagaa atggtggtcc tcacctgtga 1020 cacccctgaa gaagatggta tcacctggac cttggaccag agcagtgagg tcttaggctc 1080 tggcaaaacc ctgaccatcc aagtcaaaga gtttggagat gctggccagt acacctgtca 1140 caaaggaggc gaggttctaa gccattcgct cctgctgctt cacaaaaagg aagatggaat 1200 ttggtccact gatattttaa aggaccagaa agaacccaaa aataagacct ttctaagatg 1260 cgaggccaag aattattctg gacgtttcac ctgctggtgg ctgacgacaa tcagtactga 1320 tttgacattc agtgtcaaaa gcagcagagg ctcttctgac ccccaagggg tgacgtgcgg 1380 agctgctaca ctctctgcag agagagtcag aggggacaac aaggagtatg agtactcagt 1440 ggagtgccag gaggacagtg cctgcccagc tgctgaggag agtctgccca ttgaggtcat 1500 ggtggatgcc gttcacaagc tcaagtatga aaactacacc agcagcttct tcatcaggga 1560 catcatcaaa cctgacccac ccaagaactt gcagctgaag ccattaaaga attctcggca 1620 ggtggaggtc agctgggagt accctgacac ctggagtact ccacattcct acttctccct 1680 gacattctgc gttcaggtcc agggcaagag caagagagaa aagaaagata gagtcttcac 1740 ggacaagacc tcagccacgg tcatctgccg caaaaatgcc agcattagcg tgcgggccca 1800 ggaccgctac tatagctcat 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Artificial Sequence <220> <223> optUV 1:2 coding sequence Homo sapiens tumor necrosis factor (TNF superfamily, member 2) <400> 36 gtgagaagca gcagcaggac ccctagcgat aagcctgtgg ctcacgtcgt cgctaaccct 60 caggccgagg gccagctcca gtggctgaat agaagggcca atgccctgct cgccaacggc 120 gtcgagctga gagacaatca gctcgtggtc ccctccgagg gactgtatct gatttactcc 180 caggtcctgt ttaagggaca gggatgccct agcacacacg tcctgctgac ccacaccatt 240 agcaggatcg ctgtgtccta ccaaaccaaa gtgaatctgc tgtccgctat caaaagccct 300 tgccaaagag aaacccctga gggagccgaa gccaaaccct ggtacgaacc catttacctc 360 ggcggagtgt ttcagctgga gaaaggcgat agactcagcg ctgagattaa caggcccgat 420 tacctcgact ttgccgaaag cggacaggtc tactttggca ttatcgctct gtaa 474 <210> 37 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of TNF-alpha <400> 37 Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val 1 5 10 15 Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg 20 25 30 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu 35 40 45 Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala 85 90 95 Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys 100 105 110 Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys 115 120 125 Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe 130 135 140 Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 145 150 155 <210> 38 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40e 3Reg containing polyA <400> 38 aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60 aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120 tatcatgtct gg 132 <210> 39 <211> 627 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGH 3Reg containing PolyA <400> 39 tgatgggtgg catccctgtg acccctcccc agtgcctctc ctggccctgg aagttgccac 60 tccagtgccc accagccttg tcctaataaa attaagttgc atcattttgt ctgactaggt 120 gtccttctat aatattatgg ggtggagggg ggtggtatgg agcaaggggc aagttgggaa 180 gacaacctgt agggcctgcg gggtctattg ggaaccaagc tggagtgcag tggcacaatc 240 ttggctcact gcaatctccg cctcctgggt tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccga 300 gttgttggga ttccaggcat gcatgaccag gctcagctaa tttttgtttt tttggtagag 360 acggggtttc accatattgg ccaggctggt ctccaactcc taatctcagg tgatctaccc 420 accttggcct cccaaattgc tgggattaca ggcgtgaacc actgctccct tccctgtcct 480 tctgatttta aaataactat accagcagga ggacgtccag acacagcata ggctacctgg 540 ccatgcccaa ccggtgggac atttgagttg cttgcttggc actgtcctct catgcgttgg 600 gtccactcag tagatgcctg ttgaatt 627 <210> 40 <211> 1155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human TNF alpha 3'UTR <400> 40 ggaggacgaa catccaacct tcccaaacgc ctcccctgcc ccaatccctt tattaccccc 60 tccttcagac accctcaacc tcttctggct caaaaagaga attgggggct tagggtcgga 120 acccaagctt agaactttaa gcaacaagac caccacttcg aaacctggga ttcaggaatg 180 tgtggcctgc acagtgaagt gctggcaacc actaagaatt caaactgggg cctccagaac 240 tcactggggc ctacagcttt gatccctgac atctggaatc tggagaccag ggagcctttg 300 gttctggcca gaatgctgca ggacttgaga agacctcacc tagaaattga cacaagtgga 360 ccttaggcct tcctctctcc agatgtttcc agacttcctt gagacacgga gcccagccct 420 ccccatggag ccagctccct ctatttatgt ttgcacttgt gattatttat tatttattta 480 ttatttattt atttacagat gaatgtattt atttgggaga ccggggtatc ctgggggacc 540 caatgtagga gctgccttgg ctcagacatg ttttccgtga aaacggagct gaacaatagg 600 ctgttcccat gtagccccct ggcctctgtg ccttcttttg attatgtttt ttaaaatatt 660 tatctgatta agttgtctaa acaatgctga tttggtgacc aactgtcact cattgctgag 720 cctctgctcc ccaggggagt tgtgtctgta atcgccctac tattcagtgg cgagaaataa 780 agtttgctta gaaaagaaac atggtctcct tcttggaatt aattctgcat ctgcctcttc 840 ttgtgggtgg gaagaagctc cctaagtcct ctctccacag gctttaagat ccctcggacc 900 cagtcccatc cttagactcc tagggccctg gagaccctac ataaacaaag cccaacagaa 960 tattccccat cccccaggaa acaagagcct gaacctaatt acctctccct cagggcatgg 1020 gaatttccaa ctctgggaat tccaatcctt gctgggaaaa tcctgcagct caggtgagat 1080 ttccggctgt tgcagctggc cagcagtccg gagagagctg gagaggagcc gcattctcag 1140 gtacctgaat cacac 1155 <210> 41 <211> 1155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human TNF alpha 3'UTR AtoC mutant <400> 41 ggaggacgaa catccaacct tcccaaacgc ctcccctgcc ccaatccctt tattaccccc 60 tccttcagac accctcaacc tcttctggct caaaaagaga attgggggct tagggtcgga 120 acccaagctt agaactttaa gcaacaagac caccacttcg aaacctggga ttcaggaatg 180 tgtggcctgc acagtgaagt gctggcaacc actaagaatt caaactgggg cctccagaac 240 tcactggggc ctacagcttt gatccctgac atctggaatc tggagaccag ggagcctttg 300 gttctggcca gaatgctgca ggacttgaga agacctcacc tagaaattga cacaagtgga 360 ccttaggcct tcctctctcc agatgtttcc agacttcctt gagacacgga gcccagccct 420 ccccatggag ccagctccct ctatttatgt ttgcacttgt gattctttct tctttctttc 480 ttctttcttt ctttacagat gaatgtattt atttgggaga ccggggtatc ctgggggacc 540 caatgtagga gctgccttgg ctcagacatg ttttccgtga aaacggagct gaacaatagg 600 ctgttcccat gtagccccct ggcctctgtg ccttcttttg attatgtttt ttaaaatatt 660 tatctgatta agttgtctaa acaatgctga tttggtgacc aactgtcact cattgctgag 720 cctctgctcc ccaggggagt tgtgtctgta atcgccctac tattcagtgg cgagaaataa 780 agtttgctta gaaaagaaac atggtctcct tcttggaatt aattctgcat ctgcctcttc 840 ttgtgggtgg gaagaagctc cctaagtcct ctctccacag gctttaagat ccctcggacc 900 cagtcccatc cttagactcc tagggccctg gagaccctac ataaacaaag cccaacagaa 960 tattccccat cccccaggaa acaagagcct gaacctaatt acctctccct cagggcatgg 1020 gaatttccaa ctctgggaat tccaatcctt gctgggaaaa tcctgcagct caggtgagat 1080 ttccggctgt tgcagctggc cagcagtccg gagagagctg gagaggagcc gcattctcag 1140 gtacctgaat cacac 1155 <210> 42 <211> 618 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human GAST, 3' -UTR <400> 42 caatcctaga accaagcttc agagcctagc cacctcccac cccactccag ccctgtcccc 60 tgaaaaactg atcaaaaata aactagtttc cagtggatca atggactgtg tcagtgttgt 120 agggcagagg agggggactc atctgggctc atctgggggt gaagttgtgg cagggactaa 180 gagctgagtg cctcttaggg gcagggaccg tcccccagag ccccacattg aacgagaatc 240 cacaggtatg ggcaggataa tatatggtag ggttcatagc cagagtaacc ttttttttta 300 atttttattt tattttattt ttgagatgga gtttcgctct tgtctcccag gctggagtgc 360 aataatgaga cctcagctca ctgcaacctc tgcctcctag gttcaagcga ttttcctgcc 420 tcagcctccc aagtagctgg gattacaggt gcccgccacc acacctggct aatttttttg 480 tatttttagt ggggacgggg tttcaccatg ttggccaggc tggtcttgaa ctcctgacct 540 cagtgatcca cccgcctcgg cctcccaaag tgctgggatt acagcatgag ccaccgtgcc 600 cagcctcaga gtaagctt 618 <210> 43 <211> 589 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic 3' REG <400> 43 ttctcaagaa agccctcatt tttataacct ggcaaaatct tgttaatgtc attgctaaaa 60 aataaataaa agctagatac tggaaaccta actgcaatgt ggatgtttta cccacatgac 120 ttattatgca taaagccaaa tttccagttt aagtaattgc ctacaataaa aagaaatttt 180 gcctgccatt ttcagaatca tcttttgaag ctttctgttg atgttaactg agctactaga 240 gatattctta tttcactaaa tgtaaaattt ggagtaaata tatatgtcaa tatttagtaa 300 agcttttctt ttttaatttc caggaaaaaa taaaaagagt atgagtcttc tgtaattcat 360 tgagcagtta gctcatttga gataaagtca aatgccaaac actagctctg tattaatccc 420 catcattact ggaataaaag atctttattt tcattagatc tgtgtgttgg ttttttgtgt 480 gggccttggg ggagggggag gccagaatgg ccttggggga gggggaggcc agaatggcct 540 tgggggaggg ggaggccaga atggccttgg gggaggggga ggccagaat 589 <210> 44 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hum GAPDH 5UTR <400> 44 aaattgagcc cgcagcctcc cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca 60 tcttcttttg cgtcgccagc cgagccacat cgctcagaca cc 102 <210> 45 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> wtUV Insulin SP coding sequence <400> 45 atggccctgt ggatgcgcct cctgcccctg ctggcgctgc tggccctctg gggacctgac 60 ccagccgcag cc 72 <210> 46 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> wtUV Human FGF-19 signal peptide <400> 46 atgcggagcg ggtgtgtggt ggtccacgta tggatcttgg ccggactgtg gctggccgtg 60 gccgggagac ccctcgcctt ctcggacgcc ggaccc 96 <210> 47 <211> 10780 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PolyDNA_from_VVN_43318 <400> 47 taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac 60 cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca 120 attaattaag ctagcatcat caataatata ccttattttg gattgaagcc aatatgataa 180 tgagggggtg gagtttgtga cgtggcgcgg ggcgtgggaa cggggcgggt gacgtagtag 240 tgtggcggaa gtgtgatgtt gcaagtgtgg cggaacacat gtaagcgacg gatgtggcaa 300 aagtgacgtt tttggtgtgc gccggtgtac acaggaagtg acaattttcg cgcggtttta 360 ggcggatgtt gtagtaaatt tgggcgtaac cgagtaagat ttggccattt tcgcgggaaa 420 actgaataag aggaagtgaa atctgaataa ttttgtgtta ctcatagcgc gtaatatttg 480 tctagggaga tccggtaccg gcgcgcgcgc cgtttggccg cctcgagtct agagatccgg 540 tgagtattag gcgcgcacca ggtgccgcaa taaaatatct ttattttcat tacatctgtg 600 tgttggtttt ttgtgtgaat cgatagtact aacatacgct ctccatcaaa acaaaacgaa 660 acaaaacaaa ctagcaaaat aggctgtccc cagtgcaagt gcaggtgcca gaacatttct 720 ctatcgataa tgcaggtcgg agtactgtcc tccgagcgga gtactgtcct ccgagcggag 780 tactgtcctc cgagcggagt actgtcctcc gagcggagta ctgtcctccg agcggagtac 840 tgtcctccga gcggagactc ttcgaaggaa gaggggcggg gtcgatcgac cccgcccctc 900 ttccttcgaa ggaagagggg cggggtcgaa gacctagagg gtatataatg ggtgccttag 960 ctggtgtgtg agctcatctt cctgtagatc acgcgtctcc ctcagcaagg acagcagagg 1020 accagctaag agggagagaa gcaactacag accccccctg aaaacaaccc tcagacgcca 1080 catcccctga caagctgcca ggcaggttct cttcctctca catactgacc cacggctcca 1140 ccctctctcc cctggaaagg acaccgctag cgccaccatg agcactgaaa gcatgatccg 1200 ggacgtggag ctggccgagg aagccctccc caagaaaacc ggcggccccc aggggagcag 1260 aagatgtttg ttcctgagcc tgttttcctt cctgatcgtg gcaggcgcta ccaccctgtt 1320 ctgcctgctg cactttggag tgatcggccc ccagagggag gagttcccca gggacctctc 1380 tctaatcagc cctctggccc aggcaggatc cgtcagatca tcttctcgaa ccccgagtga 1440 caagcctgta gcccatgttg tagcaaaccc tcaagccgag ggccagctcc agtggctgaa 1500 ccgccgggcc aatgccctgc tcgccaacgg cgtcgagctg agagataacc agctggtggt 1560 gccatcagag ggcctgtacc tcatctactc ccaggtcctg ttcaagggcc aaggctgccc 1620 ctccacccat gtgctcctca cccacaccat cagccgcatc gccgtgagct accagaccaa 1680 ggtcaacctc ctctctgcca tcaagagccc ctgccagagg gagaccccag agggggccga 1740 ggccaagccc tggtatgagc ccatctacct cggcggggtg ttccagctgg agaagggtga 1800 ccgactcagc gctgagatca atagacccga ctatctcgac tttgccgaga gcggccaggt 1860 gtactttggg atcattgccc tgtgaatcga ttcgtacgtc gacatcgaga acttgtttat 1920 tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt 1980 tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg 2040 ggcgcgccgg cctccgcgcc gggttttggc gcctcccgcg ggcgcccccc tcctcacggc 2100 gagcgctgcc acgtcagacg aagggcgcag cgagcgtcct gatccttccg cccggacgct 2160 caggacagcg gcccgctgct cataagactc ggccttagaa ccccagtatc agcagaagga 2220 cattttagga cgggacttgg gtgactctag ggcactggtt ttctttccag agagcggaac 2280 aggcgaggaa aagtagtccc ttctcggcga ttctgcggag ggatctccgt ggggcggtga 2340 acgccgatga ttatataagg acgcgccggg tgtggcacag ctagttccgt cgcagccggg 2400 atttgggtcg cggttcttgt ttgtggatcg ctgtgatcgt cacttggtga gtagcgggct 2460 gctgggctgg gtacgtgcgc tcggggttgg cgagtgtgtt ttgtgaagtt ttttaggcac 2520 cttttgaaat gtaatcattt gggtcaatat gtaattttca gtgttagact agtaaattgt 2580 ccgctaaatt ctggccgttt ttggcttttt tgttagacga gctagcgccg ccaccatggg 2640 ccctaaaaag aagcgtaaag tcgccccccc gaccgatgtc agcctggggg acgagctcca 2700 cttagacggc gaggacgtgg cgatggcgca tgccgacgcg ctagacgatt tcgatctgga 2760 catgttgggg gacggggatt ccccgggtcc gggatttacc ccccacgact ccgcccccta 2820 cggcgctctg gatatggccg acttcgagtt tgagcagatg tttaccgatg cccttggaat 2880 tgacgagtac ggtggggaat tcgagatgcc tgtggacagg atcctggagg cagagcttgc 2940 tgtggaacag aagagtgacc agggcgttga gggtcctggg ggaaccgggg gtagcggcag 3000 cagcccaaat gaccctgtga ctaacatctg tcaggcagct gacaaacagc tattcacgct 3060 tgttgagtgg gcgaagagga tcccacactt ttcctccttg cctctggatg atcaggtcat 3120 attgctgcgg gcaggctgga atgaactcct cattgcctcc ttttcacacc gatccattga 3180 tgttcgagat ggcatcctcc ttgccacagg tcttcacgtg caccgcaact cagcccattc 3240 agcaggagta ggagccatct ttgatcgggt gctgacagag ctagtgtcca aaatgcgtga 3300 catgaggatg gacaagacag agcttggctg cctgagggca atcattctgt ttaatccaga 3360 ggtgaggggt ttgaaatccg cccaggaagt tgaacttcta cgtgaaaaag tatatgccgc 3420 tttggaagaa tatactagaa caacacatcc cgatgaacca ggaagatttg caaaactttt 3480 gcttcgtctg ccttctttac gttccatagg ccttaagtgt ttggagcatt tgtttttctt 3540 tcgccttatt ggagatgttc caattgatac gttcctgatg gagatgcttg aatcaccttc 3600 tgattcataa tctagcctag cccccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa 3660 gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt 3720 cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg 3780 gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc 3840 ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc 3900 ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa 3960 aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc 4020 tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg 4080 gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaacg 4140 tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat ctctaggcgc 4200 caccatgaag ctactgtctt ctatcgaaca agcatgcgat atttgccgac ttaaaaagct 4260 caagtgctcc aaagaaaaac cgaagtgcgc caagtgtctg aagaacaact gggagtgtcg 4320 ctactctccc aaaaccaaaa ggtctccgct gactagggca catctgacag aagtggaatc 4380 aaggctagaa agactggaac agctatttct actgattttt cctcgagaag accttgacat 4440 gattttgaaa atggattctt tacaggatat aaaagcattg ttaacaggat tatttgtaca 4500 agataatgtg aataaagatg ccgtcacaga tagattggct tcagtggaga ctgatatgcc 4560 tctaacattg agacagcata gaataagtgc gacatcatca tcggaagaga gtagtaacaa 4620 aggtcaaaga cagttgactg tatcgccgga attcccgggg atccggcctg agtgcgtagt 4680 acccgagact cagtgcgcca tgaagcggaa agagaagaaa gcacagaagg agaaggacaa 4740 actgcctgtc agcacgacga cggtggacga ccacatgccg cccattatgc agtgtgaacc 4800 tccacctcct gaagcagcaa ggattcacga agtggtccca aggtttctct ccgacaagct 4860 gttggtgaca aaccggcaga aaaacatccc ccagttgaca gccaaccagc agttccttat 4920 cgccaggctc atctggtacc aggacgggta cgagcagcct tctgatgaag atttgaagag 4980 gattacgcag acgtggcagc aagcggacga tgaaaacgaa gagtcggaca ctcccttccg 5040 ccagatcaca gagatgacta tcctcacggt ccaacttatc gtggagttcg cgaagggatt 5100 gccagggttc gccaagatct cgcagcctga tcaaattacg ctgcttaagg cttgctcaag 5160 tgaggtaatg atgctccgag tcgcgcgacg atacgatgcg gcctcagaca gtattctgtt 5220 cgcgaacaac caagcgtaca ctcgcgacaa ctaccgcaag gctggcatgg ccgaggtcat 5280 cgaggatcta ctgcacttct gccggtgcat gtactctatg gcgttggaca acatccatta 5340 cgcgctgctc acggctgtcg tcatcttttc tgaccggcca gggttggagc agccgcaact 5400 ggtggaagag atccagcggt actacctgaa tacgctccgc atctatatcc tgaaccagct 5460 gagcgggtcg gcgcgttcgt ccgtcatata cggcaagatc ctctcaatcc tctctgagct 5520 acgcacgctc ggcatgcaaa actccaacat gtgcatctcc ctcaagctca agaacagaaa 5580 gctgccgcct ttcctcgagg agatctggga tgtggcggac atgtcgcaca cccaaccgcc 5640 gcctatcctc gagtccccca cgaatctcta ggcggcctct agagcggccg ccaccgcggg 5700 gagatccaga catgataaga tacattgatg agtttggaca aaccacaact agaatgcagt 5760 gaaaaaaatg ctttatttgt gaaatttgtg atgctattgc tttatttgta accattataa 5820 gctgcaataa acaagttaac aacaacaatt gcattcattt tatgtttcag gttcaggggg 5880 aggtgtggga ggttttttaa agcaagtaaa acctctacaa atgtggtatg gctgattatg 5940 atccggctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc 6000 ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc 6060 gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgagg tcgactctag tccccgcggt 6120 ggcagatctg gaaggtgctg aggtacgatg agacccgcac caggtgcaga ccctgcgagt 6180 gtggcggtaa acatattagg aaccagcctg tgatgctgga tgtgaccgag gagctgaggc 6240 ccgatcactt ggtgctggcc tgcacccgcg ctgagtttgg ctctagcgat gaagatacag 6300 attgaggtac tgaaatgtgt gggcgtggct taagggtggg aaagaatata taaggtgggg 6360 gtcttatgta gttttgtatc tgttttgcag cagccgccgc cgccatgagc accaactcgt 6420 ttgatggaag cattgtgagc tcatatttga caacgcgcat gcccccatgg gccggggtgc 6480 gtcagaatgt gatgggctcc agcattgatg gtcgccccgt cctgcccgca aactctacta 6540 ccttgaccta cgagaccgtg tctggaacgc cgttggagac tgcagcctcc gccgccgctt 6600 cagccgctgc agccaccgcc cgcgggattg tgactgactt tgctttcctg agcccgcttg 6660 caagcagtgc agcttcccgt tcatccgccc gcgatgacaa gttgacggct cttttggcac 6720 aattggattc tttgacccgg gaacttaatg tcgtttctca gcagctgttg gatctgcgcc 6780 agcaggtttc tgccctgaag gcttcctccc 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tcagacgaag ggcgcaggag cgtcctgatc cttccgcccg gacgctcagg 3540 acagcggccc gctgctcata agactcggcc ttagaacccc agtatcagca gaaggacatt 3600 ttaggacggg acttgggtga ctctagggca ctggttttct ttccagagag cggaacaggc 3660 gaggaaaagt agtcccttct cggcgattct gcggagggat ctccgtgggg cggtgaacgc 3720 cgatgattat ataaggacgc gccgggtgtg gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt 3780 gggtcgcggt tcttgtttgt ggatcgctgt gatcgtcact tggtgagtag cgggctgctg 3840 ggctgggtac gtgcgctcgg ggttggcgag tgtgttttgt gaagtttttt aggcaccttt 3900 tgaaatgtaa tcatttgggt caatatgtaa ttttcagtgt tagactagta aattgtccgc 3960 taaattctgg ccgtttttgg cttttttgtt agacgagcta gcgccgccac catgggccct 4020 aaaaagaagc gtaaagtcgc ccccccgacc gatgtcagcc tgggggacga gctccactta 4080 gacggcgagg acgtggcgat ggcgcatgcc gacgcgctag acgatttcga tctggacatg 4140 ttgggggacg gggattcccc ggggccggga tttacccccc acgactccgc cccctacggc 4200 gctctggata tggccgactt cgagtttgag cagatgttta ccgatgccct tggaattgac 4260 gagtacggtg gggaattcga gatgcctgtg gacaggatcc tggaggcaga gcttgctgtg 4320 gaacagaaga gtgaccaggg cgttgagggt cctgggggaa ccgggggtag cggcagcagc 4380 ccaaatgacc ctgtgactaa catctgtcag gcagctgaca aacagctatt cacgcttgtt 4440 gagtgggcga agaggatccc acacttttcc tccttgcctc tggatgatca ggtcatattg 4500 ctgcgggcag gctggaatga actcctcatt gcctcctttt cacaccgatc cattgatgtt 4560 cgagatggca tcctccttgc cacaggtctt cacgtgcacc gcaactcagc ccattcagca 4620 ggagtaggag ccatctttga tcgggtgctg acagagctag tgtccaaaat gcgtgacatg 4680 aggatggaca agacagagct tggctgcctg agggcaatca ttctgtttaa tccagaggtg 4740 aggggtttga aatccgccca ggaagttgaa cttctacgtg aaaaagtata tgccgctttg 4800 gaagaatata ctagaacaac acatcccgat gaaccaggaa gatttgcaaa acttttgctt 4860 cgtctgcctt ctttacgttc cataggcctt aagtgtttgg agcatttgtt tttctttcgc 4920 cttattggag atgttccaat tgatacgttc ctgatggaga tgcttgaatc accttctgat 4980 tcataatcta gcggccctag cccccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa 5040 gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt 5100 cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg 5160 gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc 5220 ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc 5280 ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa 5340 aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc 5400 tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg 5460 gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaacg 5520 tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat ctctagggcc 5580 gcgccaccat gaagctactg tcttctatcg aacaagcatg cgatatttgc cgacttaaaa 5640 agctcaagtg ctccaaagaa aaaccgaagt gcgccaagtg tctgaagaac aactgggagt 5700 gtcgctactc tcccaaaacc aaaaggtctc cgctgactag ggcacatctg acagaagtgg 5760 aatcaaggct agaaagactg gaacagctat ttctactgat ttttcctcga gaagaccttg 5820 acatgatttt gaaaatggat tctttacagg atataaaagc attgttaaca ggattatttg 5880 tacaagataa tgtgaataaa gatgccgtca cagatagatt ggcttcagtg gagactgata 5940 tgcctctaac attgagacag catagaataa gtgcgacatc atcatcggaa gagagtagta 6000 acaaaggtca aagacagttg actgtatcgc cggaattccc ggggatccgg cctgagtgcg 6060 tagtacccga gactcagtgc gccatgaagc ggaaagagaa gaaagcacag aaggagaagg 6120 acaaactgcc tgtcagcacg acgacggtgg acgaccacat gccgcccatt atgcagtgtg 6180 aacctccacc tcctgaagca gcaaggattc acgaagtggt cccaaggttt ctctccgaca 6240 agctgttgga gacaaaccgg cagaaaaaca tcccccagtt gacagccaac cagcagttcc 6300 ttatcgccag gctcatctgg taccaggacg ggtacgagca gccttctgat gaagatttga 6360 agaggattac gcagacgtgg cagcaagcgg acgatgaaaa cgaagagtcg gacactccct 6420 tccgccagat cacagagatg actatcctca cggtccaact tatcgtggag ttcgcgaagg 6480 gattgccagg gttcgccaag atctcgcagc ctgatcaaat tacgctgctt aaggcttgct 6540 caagtgaggt aatgatgctc cgagtcgcgc gacgatacga tgcggcctca gacagtattc 6600 tgttcgcgaa caaccaagcg tacactcgcg acaactaccg caaggctggc atggccgagg 6660 tcatcgagga tctactgcac ttctgccggt gcatgtactc tatggcgttg gacaacatcc 6720 attacgcgct gctcacggct gtcgtcatct tttctgaccg gccagggttg gagcagccgc 6780 aactggtgga agagatccag cggtactacc tgaatacgct ccgcatctat atcctgaacc 6840 agctgagcgg gtcggcgcgt tcgtccgtca tatacggcaa gatcctctca atcctctctg 6900 agctacgcac gctcggcatg caaaactcca acatgtgcat ctccctcaag ctcaagaaca 6960 gaaagctgcc gcctttcctc gaggagatct gggatgtggc ggacatgtcg cacacccaac 7020 cgccgcctat cctcgagtcc cccacgaatc tctaggcggc ctctagagcg gccgccaccg 7080 cggggagatc cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg 7140 cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt 7200 ataagctgca ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag 7260 ggggaggtgt gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg tatggctgat 7320 tatgatcccg gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctt gacacatgca 7380 gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 7440 gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgaggtcga ctctagtccc 7500 cgcggtggca gatctggaag gtgctgaggt acgatgagac ccgcaccagg tgcagaccct 7560 gcgagtgtgg cggtaaacat attaggaacc agcctgtgat gctggatgtg accgaggagc 7620 tgaggcccga tcacttggtg ctggcctgca cccgcgctga gtttggctct agcgatgaag 7680 atacagattg aggtactgaa atgtgtgggc gtggcttaag ggtgggaaag aatatataag 7740 gtgggggtct tatgtagttt tgtatctgtt ttgcagcagc cgccgccgcc atgagcacca 7800 actcgtttga tggaagcatt gtgagctcat atttgacaac gcgcatgccc ccatgggccg 7860 gggtgcgtca gaatgtgatg ggctccagca ttgatggtcg ccccgtcctg cccgcaaact 7920 ctactacctt gacctacgag accgtgtctg gaacgccgtt ggagactgca gcctccgccg 7980 ccgcttcagc cgctgcagcc accgcccgcg ggattgtgac tgactttgct ttcctgagcc 8040 cgcttgcaag cagtgcagct tcccgttcat ccgcccgcga tgacaagttg acggctcttt 8100 tggcacaatt ggattctttg acccgggaac ttaatgtcgt ttctcagcag ctgttggatc 8160 tgcgccagca ggtttctgcc ctgaaggctt cctcccctcc caatgcggtt taaaacataa 8220 ataaaaaacc agactctgtt tggatttgga tcaagcaagt gtcttgctgt ctttatttag 8280 gggttttgcg cgcgcggtag gcccgggacc agcggtctcg gtcgttgagg gtcctgtgta 8340 ttttttccag gacgtggtaa aggtgactct ggatgttcag atacatgggc ataagcccgt 8400 ctctggggtg gaggtagcac cactgcagag cttcatgctg cggggtggtg ttgtagatga 8460 tccagtcgta gcaggagcgc tgggcgtggt gcctaaaaat gtctttcagt agcaagctga 8520 ttgccagggg caggcccttg gtgtaagtgt ttacaaagcg gttaagctgg gatgggtgca 8580 tacgtgggga tatgagatgc atcttggact gtatttttag gttggctatg ttcccagcca 8640 tatccctccg gggattcatg ttgtgcagaa ccaccagcac agtgtatccg gtgcacttgg 8700 gaaatttgtc atgtagctta gaaggaaatg cgtggaagaa cttggagacg cccttgtgac 8760 ctccaagatt ttccatgcat tcgtccataa tgatggcaat gggcccacgg gcggcggcct 8820 gggcgaagat atttctggga tcactaacgt catagttgtg ttccaggatg agatcgtcat 8880 aggccatttt tacaaagcgc gggcggaggg tgccagactg cggtataatg gttccatccg 8940 gcccaggggc gtagttaccc tcacagattt gcatttccca cgctttgagt tcagatgggg 9000 ggatcatgtc tacctgcggg gcgatgaaga aaacggtttc cggggtaggg gagatcagct 9060 gggaagaaag caggttcctg agcagctgcg acttaccgca gccggtgggc ccgtaaatca 9120 cacctattac cgggtgcaac tggtagttaa gagagctgca gctgccgtca tccctgagca 9180 ggggggccac ttcgttaagc atgtccctga ctcgcatgtt ttccctgacc aaatccgcca 9240 gaaggcgctc gccgcccagc gatagcagtt cttgcaagga agcaaagttt ttcaacggtt 9300 tgagaccgtc cgccgtaggc atgcttttga gcgtttgacc aagcagttcc aggcggtccc 9360 acagctcggt cacctgctct acggcatctc gatccagcat atctcctcgt ttcgcgggtt 9420 ggggcggctt tcgctgtacg gcagtagtcg gtgctcgtcc agacgggcca gggtcatgtc 9480 tttccacggg cgcagggtcc tcgtcagcgt agtctgggtc acggtgaagg ggtgcgctcc 9540 gggctgcgcg ctggccaggg tgcgcttgag gctggtcctg ctggtgctga agcgctgccg 9600 gtcttcgccc tgcgcgtcgg ccaggtagca tttgaccatg gtgtcatagt ccagcccctc 9660 cgcggcgtgg cccttggcgc gcagcttgcc cttggaggag gcgccgcacg aggggcagtg 9720 cagacttttg agggcgtaga gcttgggcgc gagaaatacc gattccgggg agtaggcatc 9780 cgcgccgcag gccccgcaga cggtctcgca ttccacgagc caggtgagct ctggccgttc 9840 ggggtcaaaa accaggtttc ccccatgctt tttgatgcgt ttcttacctc tggtttccat 9900 gagccggtgt ccacgctcgg tgacgaaaag gctgtccgtg tccccgtata cagacttgag 9960 aggcctgtcc tcgaccgatg cccttgagag ccttcaaccc agtcagctcc ttccggtggg 10020 cgcggggcat gactatcgtc gccgcactta tgactgtctt ctttatcatg caactcgtag 10080 gacaggtgcc ggcagcgctc tgggtcattt tcggcgagga ccgctttcgc tggagcgcga 10140 cgatgatcgg cctgtcgctt gcggtattcg gaatcttgca cgccctcgct caagccttcg 10200 tcactggtcc cgccaccaaa cgtttcggcg agaagcaggc cattatcgcc ggcatggcgg 10260 ccgacgcgct gggctacgtc ttgctggcgt tcgcgacgcg aggctggatg gccttcccca 10320 ttatgattct tctcgcttcc ggcggcatcg ggatgcccgc gttgcaggcc atgctgtcca 10380 ggcaggtaga tgacgaccat cagggacagc ttcaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 10440 aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 10500 atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 10560 cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 10620 ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 10680 gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 10740 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 10800 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 10860 cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 10920 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 10980 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 11040 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 11100 actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 11160 taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 11220 gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 11280 tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 11340 ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 11400 accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 11460 agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 11520 acgttgttgc cattgctgca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 11580 tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 11640 cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 11700 tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 11760 ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 11820 gctcttgccc ggcgtcaaca cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 11880 tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 11940 ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 12000 gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 12060 cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 12120 gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaa 12166

Claims (17)

  1. 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 투여 주기당 1.0×1011 내지 2.0×1011개의 바이러스 입자를 포함하는, 인간에서 신경교종 종양을 치료하기 위한 조성물로서, 상기 폴리뉴클레오티드가:
    (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된, 리간드-의존성 전사 인자를 인코딩하는 적어도 하나의 전사 인자 서열, 및
    (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 작동가능하게 연결된, 면역조절자 단백질을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드를 포함하고;
    상기 면역조절자 단백질이 IL-12p70이고,
    상기 리간드-의존성 전사가 10 내지 20 mg/일의 다이아실하이드라진 리간드의 투여량에 의해 활성화되고,
    바이러스 입자가 아데노바이러스 입자인, 조성물.
  2. 10 내지 20 mg/일의 다이아실하이드라진 리간드를 포함하는, 인간에서 신경교종 종양을 치료하기 조성물로서, 상기 리간드가 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 내 리간드-의존성 전사 인자를 활성화시키고, 상기 폴리뉴클레오티드가:
    (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된, 리간드-의존성 전사 인자를 인코딩하는 적어도 하나의 전사 인자 서열, 및
    (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 의해 작동가능하게 연결되는, 면역조절자 단백질을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드를 포함하고;
    상기 면역조절자 단백질이 IL-12p70이고,
    상기 벡터가 투여 주기당 1.0×1011 내지 2.0×1011개의 바이러스 입자를 포함하는 투여량으로 투여되고,
    바이러스 입자가 아데노바이러스 입자인, 조성물.
  3. 하기의 적어도 2개의 성분을 포함하는, 인간에서 신경교종 종양을 치료하기 위한 조성물:
    (A) 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 투여 주기당 1.0×1011 내지 2.0×1011개의 바이러스 입자로서, 바이러스 입자는 아데노바이러스 입자이고, 상기 폴리뉴클레오티드는:
    (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된, 리간드-의존성 전사 인자를 인코딩하는 적어도 하나의 전사 인자 서열, 및
    (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 작동가능하게 연결된, 면역조절자 단백질을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드를 포함함(여기서, 면역조절자 단백질은 IL-12p70임);
    (B) 리간드-의존성 전사 인자를 활성화시키는 10 내지 20 mg/일의 다이아실하이드라진 리간드의 1회 이상의 투여량.
  4. 삭제
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 다이아실하이드라진 리간드의 양이 20 mg/일인 것인, 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 종양 내로 투여되는 것인, 조성물.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 경구로 투여되는 것인, 조성물.
  10. 삭제
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 치료되는 신경교종 종양이 아교모세포종인 것인, 조성물.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 다이아실하이드라진 리간드가 RG-115819, RG-115830, 또는 RG-115932인 것인, 조성물.
  13. 삭제
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 면역조절자 단백질이 인간 IL-12p70인 것인, 조성물.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드의 제1 투여량이 바이러스 입자의 투여 24시간 전부터 바이러스 입자의 투여 24시간 후까지의 기간에 인간에 투여되는 것인, 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 리간드가 7 내지 28일의 기간 동안 매일 투여되는 것인, 조성물.
  17. 하기의 적어도 2개의 성분을 포함하는 키트:
    (A) 엑디손 수용체-기반 유전자 스위치를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 투여 주기당 1.0×1011 내지 2.0×1011개의 바이러스 입자로서, 바이러스 입자는 아데노바이러스 입자이고, 상기 폴리뉴클레오티드는:
    (1) 프로모터에 작동가능하게 연결된, 리간드-의존성 전사 인자를 인코딩하는 적어도 하나의 전사 인자 서열, 및
    (2) 상기 리간드-의존성 전사 인자에 의해 활성화되는 프로모터에 작동가능하게 연결된, 면역조절자 단백질을 인코딩하는, 폴리뉴클레오티드를 포함함(여기서, 면역조절자 단백질은 IL-12p70임);
    (B) 리간드-의존성 전사 인자를 활성화시키는 10 내지 20 mg/일의 다이아실하이드라진 리간드의 1회 이상의 투여량.

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