JP7200104B2 - 免疫系刺激分子を発現する腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスベクター - Google Patents
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Description
本特許出願は、2016年8月1日出願の米国仮特許出願第62/369,646号の、米国特許法第119条(e)項の下での利益を請求し、この仮特許出願は、すべての目的のためにその全体がこの参照により本明細書の開示に含まれる。
本発明は概して、免疫系を刺激する分子を発現する腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス(oHSV)ベクターに関する。
本開示の例示的な特長、本開示の性質および種々の利点は、種々の実施形態の添付の図面および後述の発明を実施するための形態から明らかであろう。非限定的および非網羅的な実施形態が添付の図面に関して説明されており、この中で類似の標識または参照番号は、別段の指定がない限り、種々の見解のいたるところにある類似の部分を指す。図面における要素の大きさおよび相対的な位置は、必ずしも尺度通りに描かれていない。例えば、種々の要素の形状は、図面のレジビリティを改善するよう選択、拡大、および配置される。描かれている要素の詳細な形状は、図面における認識を容易にするために選択されている。1つ以上の実施形態は、添付の図面に関して後述される。
本開示は、以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明および本明細書に含まれる実施例に対する参照によってより容易に理解され得る。簡潔に述べると、本開示は、免疫刺激分子を発現する腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス1型または2型ベクターを提供する。代表的なベクターは、IL-12、IL-15およびIL-15Rαのうちの1つ以上をコードする発現カセットを含む。ある特定のベクターは、マウスまたはヒトIL-12、マウスまたはヒトIL-15、およびマウスまたはヒトIL-15Rαをコードする。ある特定の実施形態内で、ベクターは、マウスまたはヒトIL-12、hIL15、およびhIL15受容体アルファサブユニットをコードする。他の実施形態内で、ベクターは、hIL-12、HIL15およびHIL15受容体アルファサブユニットをコードする。これら3つのタンパク質は、1個、2個、または3個の転写産物上に発現し得る。同じ転写産物上に発現するとき、転写後プロセシングが続いて起こり、個々のタンパク質の発現を結果として生じる。このような場合、コード領域はIRES配列、または自己開裂性2Aペプチドをコードする配列によって分離されている。コード領域は、二方向プロモーターによって発現し得る。HSVベクターは場合により、分泌することができる1つ以上のPD-L1ペプチドを発現する。
腫瘍溶解性ウイルスとは、好ましくは選択的様式で癌細胞を溶解するであろう(腫瘍溶解性)ウイルスである。非分裂細胞よりも分裂細胞において選択的に複製するウイルスはしばしば、腫瘍溶解性である。本明細書における使用に適している腫瘍溶解性ウイルスには、単純ヘルペスウイルス1型および2型が含まれる。
oHSVベクターは、1つ以上の免疫刺激分子(例えば、IL-12、IL-15、およびIL-15Rα)をコードする核酸配列を含む。例示的なIL-12、IL-15、およびIL-15Rαのアミノ酸配列は、配列表(配列番号1~6)に提示される。アミノ酸配列をコードするいかなるDNA配列も適切であるが、概して、コドンは、oHSVを受容する予定の対象種において優先的に発現するために選択されるであろう。
インターロイキン12(IL-12)は主として、細菌(例えば、リポ多糖)、病原体または活性化型T細胞に応答して、樹状細胞、マクロファージ、および単球によって産生される。IL-12は、IFNガンマ産生、細胞増殖を誘導することができ、ナチュラルキラー細胞およびT細胞を活性化することができる。T細胞からTh1細胞への分化にとっても必須である。IL-12は、腫瘍の成長を抑制することもできる。マウスIL-12は、マウスおよびヒトの両細胞に対して等しく活性があり、いずれもoHSVベクターにおける使用に適している。
IL-15は、ナチュラルキラー細胞およびT細胞の活性化および増殖を調節し、かつ他の生物活性を有してもよいサイトカインである。少なくとも2つのアイソフォームがあり、これらは単一ペプチドの配列が異なっており、同一の成熟タンパク質配列を有する。長めのシグナルペプチドを有するアイソフォーム(時にLSP-IL15と呼ばれる)の配列は、GenBank(NCBI)受託番号NP000576を有しており、短めのシグナルペプチドを有するアイソフォーム(時にSSP-IL15と呼ばれる)は、受託番号NP751915を有している。いずれのアイソフォームもoHSVベクターにおける使用に適している。多型において認められるようなアミノ酸の挿入、欠失および置換は、このタンパク質がIL-15を結合している限り、あり得る。
インターロイキン15受容体アルファサブユニット(IL-15Rα)は、IL-15を結合する複合体の3つのサブユニットのうちの1つである。アルファサブユニットは、高い親和性でIL-15を結合し、他のサブユニットとは無関係にIL-15へ結合することができる。少なくとも4つのバリアント(アイソフォーム)があり、本明細書ではバリアント1(NP 002180.1)(配列番号3)、バリアント2(NP 751950.2)(配列番号4)、バリアント3(NP 001230468.1)(配列番号5)、およびバリアント4(NP_001243694)(配列番号6)と呼ぶ。アルファサブユニットは、IL-15結合活性を保有している最短領域であるSushiドメイン(別名補体制御タンパク質(CCP)、短鎖共通反復(SCR)またはSUSHI反復)を含有する。典型的なSushiドメインは、2つのジスルフィド結合を形成する4個のシステインを含有する約60~70個のアミノ酸であり、タンパク質間相互作用における共通のモチーフである。IL-15RαのSushiドメインは、残基31~約95を包含する(バリアント1に対する参照における)(配列番号11)。他のバリアントにおけるSushiドメインの位置は既知である。sIL-15Rαにおけるシステインのいずれかのアミノ酸置換は、インビボでの急性炎症および異質遺伝子的抗原に対するT細胞応答を阻害する能力を消失させる(Wei et al.J Immunol.167:277,2001)。
プログラム死リガンド1(PD-L1)は、おそらくPD-1受容体を結合する作用として、免疫系を抑制する上での役割を担っている。タンパク質間相互作用を遮断することは、癌療法を改善するために示されてきた。
IL-12、IL-15およびIL-15Rαという分子は、oHSVベクターにおける種々の異なる立体配置にあることができる。例えば、分子のそれぞれは、別個のプロモーター/調節領域から個別に発現し得、または1つもしくは2つの別個のプロモーター/調節領域から共発現し得る。
例えば、癌のような疾患の作用を予防、治療、または改善させるために使用され得る治療用組成物が提供される。より詳細には、本明細書に説明する少なくとも1つの腫瘍溶解性ウイルスを含む治療組成物が提供される。代表例としては、IL12、IL15および/またはIL受容体15アルファサブユニットのうちの1つ以上についての発現カセットを有するoHSVが挙げられる。一実施形態内で、発現カセットは、IL12、IL15およびIL受容体15アルファサブユニットの全部を発現する。好ましい実施形態内で、発現カセットは、マウスまたはヒトIL12、hIL15、およびhIL15受容体アルファサブユニットを含む。
本明細書に説明する組成物に加えて、このような組成物を用いて癌を治療しまたは改善させる種々の方法が提供され、この方法は、対象へ本明細書に説明する有効用量または有効量のHSVベクターを投与するステップを含む。
実施例
図1Aおよび図1Bは、代表的なoHSVベクターの例示的な概略図を提供する。
本実施例において、種々のコンストラクトおよびその配列が提示される。
TF-Fc:Fcへ融合してVG161の構築に使用されるPD-L1ブロッキングペプチド。
本実施例において、IL-12発現のウェスタンブロットおよびELISAのデータを示す。
本実施例において、IL-15発現のウェスタンブロットおよびELISAのデータを示す。
hVG161による細胞の感染後のIgG4の発現
本実施例において、IgG4発現のウェスタンブロットおよびELISAのデータを示す。
PD-L1ブロッキングペプチドは、Igκ鎖リーダー配列(配列番号501)を用いて作製した。2つ以上のブロッキングペプチドが同じコンストラクトの中にあるとき、これらをGly-Serの豊富な配列(Gly4Ser)3(配列番号503)と連結させた。以下のコンストラクトを作製する。
ET+TF:
METDTLLLWVLLLWVPGSTGEYRMSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTAHPSPSPRSAGQF(配列番号538)、
YT+TF:
METDTLLLWVLLLWVPGSTGYYRMSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTAHPSPSPRSAGQF(配列番号539)、
マウスTF:METDTLLLWVLLLWVPGSTGTRYPSPSPKPEGRF(配列番号540)、
マウスWT+TF:
METDTLLLWVLLLWVPGSTGWNRLSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTRYPSPSPKPEGRF(配列番号541)。
METDTLLLWVLLLWVPGSTGTAHPSPSPRSAGQFTAHPSPSPRSAGQFTAHPSPSPRSAGQFGGGGSGGGGSGGGGSEYRMSPSNQTEYRMSPSNQTEYRMSPSNQT(配列番号542)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGEYRMSPSNQTEYRMSPSNQTEYRMSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTAHPSPSPRSAGQFTAHPSPSPRSAGQFTAHPSPSPRSAGQF(配列番号543)。
MYRMQLLSCIALSLALVTNSTAHPSPSPRSAGQFISAMVRSPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号546)
ET+TF:
MYRMQLLSCIALSLALVTNSEYRMSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTAHPSPSPRSAGQFISAMVRSPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号547)
YT+TF:
MYRMQLLSCIALSLALVTNSYYRMSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTAHPSPSPRSAGQFISAMVRSPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号548)
マウスTF:
MYRMQLLSCIALSLALVTNSTRYPSPSPKPEGRFISAMVRSGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(配列番号549)
マウスWT+TF:
MYRMQLLSCIALSLALVTNSWNRLSPSNQTGGGGSGGGGSGGGGSTRYPSPSPKPEGRFISAMVRSGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(配列番号550)。
本実施例において、種々のコンストラクトを作製して、二方向CMVプロモーターの制御下にあるIL-15とIL-15Rαとを共発現させる。
本実施例において、種々のコンストラクトを作製して、EF1αプロモーターの制御下にある多重シストロン性転写産物においてIL-15とIL-15Rαとを発現させる(配列番号551)。IL-15およびIL-15Rαは、例示的なIRES配列によって連結されている(配列番号552)。
本実施例において、種々のコンストラクトを作製して、CMVプロモーターの制御下にある多重シストロン性転写産物においてIL-12、IL-15およびIL-15Rαを発現させる。IL-12、IL-15およびIL-15Rαは、例示的なp2A配列によって連結されている(配列番号554)。
本実施例において、コンストラクトを作製して、塩基829と塩基830との間のUL3とUL4との間の遺伝子間領域内にPD-L1ブロッキングペプチドを発現させる。配列番号556においては、塩基1~675:UL3コード配列、塩基676~829:UL3とUL4との間にありPD-L1ブロッカーカセットの上流にある領域、塩基830~833:UL3とUL4との間にあり、PD-L1ブロッカーカセットの下流にある領域、塩基834~1433:UL4コード配列である。
組換えヒトPD-L1 Fcタンパク質を96ウェルの平底プレートの底部へ4℃で一晩コーティングした。一晩のプレートコーティングの後、異なるPD-L1ブロッカーをプレートの各ウェルへと添加し、室温で2時間インキュベートした後、組換えヒトPD-1 Fcタンパク質を添加した。ビオチン化抗ヒトIgG抗体およびストレプトアビジン-HRPをその後核ウェルへと添加し、PD-L1に対するヒトPD-1の結合を、TMB基質を添加することによって検出した。発色は、マイクロプレートリーダーによって450nmの波長で測定した。阻害百分率は、ペプチド合成していない対照と比較することによって計算した。図21は、2つの異なる濃度(3および10μM)のペプチドET、ET+TF、YT、YT+TF、TW、TW+TF、WT、WT+TFおよびTFによる阻害百分率を示す。10μΜで、阻害は約22%~約48%の範囲であった。
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を抗CD3抗体プラスヒトIL-2で24時間刺激した後、異なる合成されたPD-L1ブロッカーおよびカルセイン-AM標識標的細胞とともに4時間インキュベートした。細胞培養上清を4時間のインキュベーション後に収集し、放出されたカルセイン-AM蛍光をマイクロプレートリーダーによって測定した。細胞毒性百分率を次式に基づいて計算した:[(試料の読み取り-最小放出)/(最大放出-最小放出)]×100。
ヒトPBMCを培地対照、IL-12単独、IL-15RA単独、またはIL-12、IL-15、およびIL-15Rα1の組み合わせプラス抗IL-12または抗IL-15中和抗体とともに48時間インキュベートした。細胞培養上清を収集して、ヒトIFNγおよびTNFαの産生をELISAによって測定した。
ヒトPBMCを腫瘍標的細胞および培地対照、IL-12単独、IL-15RA単独、またはIL-12、IL-15、およびIL-15RA1の組み合わせプラス抗IL-12または抗IL-15中和抗体とともに24時間共インキュベートした。細胞培養上清を収集して、LDHアッセイにより細胞毒性を測定した。細胞毒性百分率は、次式に基づいて計算した:[(試料の読み取り-最小放出)/(最大放出-最小放出)]×100。
本実施例において、3×104個のH460またはLS174T腫瘍細胞を96ウェルプレートの各ウェルへ播種し、37℃で一晩培養した。翌日、播種した細胞にVG001骨格、VG161-PLBh、またはVG161-15hウイルス(MOI=1)を24時間感染させ、ヒトIL-12、ヒトIL-15、およびヒトIgG4の産生を評価した(図25A~図25C)。3×105個のヒトPBMCをその後培養物へ24時間添加してLDHアッセイによって細胞毒性を評価し(図25D)、または48時間添加してELISAによってヒトIFNg産生を評価した(図25E)。細胞毒性アッセイについて、細胞毒性百分率は、次式に基づいて計算した:[(実際の読み取り-最小放出)/(最大放出-最小放出)]×100%。培地のみとともにインキュベートした腫瘍細胞から収集した上清を最小放出として使用し、溶解緩衝液とともにインキュベートした上清を最大放出として使用した。
図26A~図26Dは、種々のコンストラクトについてのインビトロアッセイの結果を示す。
図31A~図31Bにおいて、A20マウスB細胞リンパ腫腫瘍を有するBALB/cマウスに合計1×10^7PFU/個体のVG161-1215PLBm(mVG161)ウイルスもしくはVG001骨格ウイルスのいずれかを、またはPBS(ビヒクル対照)を腫瘍内に5回注射した。腫瘍の大きさの測定は、注射後の示される時刻に実施した。VG161-1215PLBmで処置したマウスは、PBSで処置したマウスと比較して、腫瘍体積の有意な(P<0.05)減少を呈した。
図32A~図32C、図33A~図33Dおよび図34A~図34Eにおける成長曲線および細胞毒性データは、hVG161ウイルスが、親HSV-345ウイルスと同様に複製することを示す。これらのデータは、ウイルスがマウス腫瘍細胞株においてヒト細胞株と比較して同様には成長しないことも示したが、HSV-1は、マウス細胞においてほとんど成長しないことが既知である。
ヒトPBMCを培地単独、組換えIL-12単独、組換えIL-15単独、またはIL-12プラス異なる形態のIL-15/IL-15RA1複合体で、抗IL-12(6mg/ml)または抗IL-15(0.5mg/ml)中和抗体の有無の下で48時間刺激した。培養上清をその後、図35Aおよび図35Bに示されるELISAアッセイを用いたヒトIFNgおよびヒトTNFαの産生について収集した。
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を培地単独、組換えIL-12単独、組換えIL-15単独、またはIL-12プラスIL-15/IL-15RA1複合体を用いて、抗IL-12(6mg/ml)または抗IL-15(0.5mg/ml)の有無の下で48時間刺激した。培養上清をその後、図36Aおよび図36Bに示すようなELISAアッセイを用いたヒトIFNgおよびヒトTNFa産生のために収集した。
CT26結腸癌細胞をbalb/cマウスに植え込み、PBS、VG160、またはVG161mウイルスの注射を受けた。腫瘍試料を注射24時間後に収集し、CD8+T細胞、CD4+T細胞、またはNK細胞の百分率をフローサイトメトリーによって評価した。結果は、図38A~図38Cに示す。
1)IL12、IL15および/またはIL受容体15アルファサブユニットのうちの1つ以上を発現するHSVベクター。一実施形態内で、HSVベクターは、IL12、IL15およびIL受容体15アルファサブユニットを発現する発現カセットを含む。種々の実施形態内で、発現するIL12、IL15およびIL15受容体アルファサブユニット配列は、哺乳類起源(例えば、マウス起源またはヒト起源)である。好ましい実施形態内で、発現カセットは、マウスまたはヒトIL12、マウスまたはヒトIL15、およびマウスまたはヒトIL15受容体アルファサブユニットを発現する。さらに他の実施形態内で、発現カセットは、マウスまたはヒトIL12、hIL15ならびにマウスおよびh15受容体アルファサブユニットのいずれかを発現する。
Claims (18)
- i)IL12、
ii)IL15、および、
iii)IL15受容体のアルファサブユニット、
を発現する発現カセットを含む、腫瘍溶解性HSVベクター。 - 自己開裂性2Aペプチドをコードする核酸配列が、
i)IL12、
ii)IL15、および/または、
iii)IL15受容体のアルファサブユニット、
についてのコード配列間でインフレームに位置する、請求項1に記載の腫瘍溶解性HSVベクター。 - 核酸配列が、VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP、QCTNYALLKLAGDVESNPGP、ATNF-SLLKQAGDVEENPGP、HYAGYFADLLIHDIETNPGP、GIFN-AHYAGYFADLLIHDIETNPGP、KAVRGYHADYYKQRLIHDVEMNPGP、GATNF-SLLKLAGDVELNPGP、EGRGSLLTCGDVEENPGP、AARQMLLLLSGDVETNPGP、FLRKRTQLLMSGDVESNPGP、GSWTDILLLLSGDVETNPGP、TRAEUEDELIRAGIESNPGP、AKFQIDKILISGDVELNPGP、SKFQIDKILISGDIELNPGP、SSIIRTKMLVSGDVEENPGPおよびCDAQRQKLLLSGDIEQNPGPからなる群より選択される自己開裂性2Aペプチドをコードする、請求項2に記載の腫瘍溶解性HSVベクター。
- 1つ以上のIRES配列が、
i)IL12、
ii)IL15、および/または
iii)IL15受容体アルファサブユニット
についてのコード配列間に位置する、請求項1に記載の腫瘍溶解性HSVベクター。 - i)IL12、
ii)IL15および、
iii)IL15受容体アルファサブユニット、
の1以上が、二方向プロモーターによって発現する、請求項1に記載の腫瘍溶解性HSVベクター。 - IL15受容体アルファサブユニットが、バリアント1、バリアント2、バリアント3およびバリアント4からなる群より選択されるhIL15受容体アルファサブユニットである、請求項1に記載の腫瘍溶解性HSVベクター。
- さらにPD-L1ブロッキングペプチドを発現する、請求項1に記載の腫瘍溶解性HSVベクター。
- 複数のPD-L1ブロッキングペプチド間のペプチドリンカーをコードする配列をさらに含む、請求項7に記載の腫瘍溶解性HSVベクター。
- PD-L1ブロッキングペプチドの3’末端へ連結したFcドメインをコードする配列をさらに含む、請求項7に記載の腫瘍溶解性HSVベクター。
- 発現カセットが、HSVゲノムの内部反復領域または末端反復領域中、US1とUS2遺伝子、UL3とUL4ウイルス遺伝子、または、UL50とUL51遺伝子の間に挿入される、請求項1に記載の腫瘍溶解性HSVベクター。
- ICP4またはICP27調節領域においてNFkBおよびOCT4/SOX2増強要素をさらに含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性HSVベクター。
- ICP34.5遺伝子が欠失している、請求項1~10のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性HSVベクター。
- 発現カセットがCMVプロモーターまたはEL-1αプロモーターを含む、請求項1に記載の腫瘍溶解性HSVベクター。
- HSVが、HSV-1またはHSV-2のいずれかである、請求項1~13のいずれかに記載の腫瘍溶解性HSVベクター。
- ICP34.5遺伝子が、腫瘍細胞において過少発現するmiRNAの標的配列を含有する3’UTRによって調節される、請求項1に記載の腫瘍溶解性HSVベクター。
- 請求項1~15のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性HSVベクターを含む、医薬組成物。
- 請求項1~15のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性HSVベクターを含む、癌治療用医薬組成物。
- 癌が、癌腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫および肉腫からなる群より選択される、請求項17に記載の医薬組成物。
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