KR102227180B1 - 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 바이러스학 및 종양 치료에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양세포에서 높은 수준으로 특이적으로 복제하여 종양세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus; HSV)를 제공하지만, 정상세포에서는 낮은 수준으로 복제하므로, 본 발명의 재조합형 헤르페스 심플렉스 종양 세포의 사멸율이 높을 뿐만 아니라, 부작용(특히 신경독성)도 현저히 감소한다. 또한, 본 발명은 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스에 근거하여 구성된 바이러스 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 바이러스 벡터를 포함하는 약학적 조성물, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 바이러스 벡터의 용도와 관련이 있다. 본 발명의 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스는 종양세포를 감염시켜 사멸시키는 데 사용될 수 있으며, 유전자 치료를 위해 종양세포에 유전자 약물을 전달하는 데 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 바이러스학 및 종양 치료에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양세포에서 높은 수준으로 특이적으로 복제하여 종양세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus; HSV)를 제공하지만, 정상세포에서는 낮은 수준으로 복제하므로, 본 발명의 재조합형 헤르페스 심플렉스 종양 세포의 사멸율이 높을 뿐만 아니라, 부작용(특히 신경독성)도 현저히 감소한다. 또한, 본 발명은 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스에 근거하여 구성된 바이러스 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 바이러스 벡터를 포함하는 약학적 조성물, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 또는 바이러스 벡터의 용도와 관련이 있다. 본 발명의 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스는 종양세포를 감염시켜 사멸시키는 데 사용될 수 있으며, 유전자 치료를 위해 종양세포에 유전자 약물을 전달하는 데 사용될 수 있다.
방사선치료, 화학치료, 표적약물 등은 현재 종양 치료에 널리 사용되고 있으나, 이들 모두가 불완전한 치료, 큰 부작용, 약물 저항성, 종양 재발과 전이를 억제 불가능, 종양 치료 효과에 대한 불만족 등의 많은 문제를 가지고 있다. 따라서, 새롭고 효과적인 종양 치료법을 개발할 필요가 있다. 최근 몇 년간 종양과 면역의 관계에 대한 사람들의 이해도가 크게 향상되었고, 종양의 면역요법이 급속히 발달하였다. 이 중, 종양 용해성 바이러스(oncolytic virus; OV) 치료는 새로운 형태의 종양면역치료로 주목을 받았다 (Lichty B D, Breitbach CJ, Stojdl DF, et al. Going viral with cancer immunotherapy [J]. Nat Rev Cancer, 2014, 14 (8): 559-567). 종양 용해성 바이러스는 종양 세포에서 선택적으로 복제할 수 있는 종양친화 성질을 가진 바이러스의 일종으로, 정상 세포에서의 확산은 제한적이다. 종양 용해성 바이러스는 종양세포에서 복제되어 종양세포가 용해되어 사멸하도록 유도할 수 있으며, 증폭된 바이러스는 주변 종양세포를 계속 감염시켜 계단식 효과를 낼 수 있다. 또한, 종양세포를 침식하는 과정에서 종양 용해성 바이러스는 종양 항원을 방출하여 신체를 자극하여 특이적인 항종양 면역성을 가진 항종양 항체를 생성하게 하며, 종양 용해성 바이러스의 종양 용해성 효과를 더욱 높일 수 있다. 종양 용해성성 바이러스는 악성 종양 치료 분야에서 가장 인기 있는 새로운 유전자 치료제이다. 특히 고형종양의 국소 치료에서는 종양 용해성 바이러스의 감염과 증식이 주사부위의 종양 축소로 이어지고, 종양세포의 용해로 종양 항원이 종양세포에서 분비되어 체내 다른 부위의 종양과 싸우는 전신성 항종양 면역반응이 일어나게 되어, 체내 다른 부위의 종양과 싸우게 되는 경우도 있는데, 이는 종양 확산과 전이에 대한 전신성 조절에 대한 핵심 면역 반응이다(Russell S J, Peng KW, Bell J C. Oncolytic virotherapy [J]. Nat Biotechnol, 2012, 30 (7): 658-670).
현재의 종양 용해성 바이러스는 바이러스의 종류에 따라 10종 이상으로 나눌 수 있다. 그 중에서도, 종양 용해성 헤르페스 심플렉스 바이러스 타입 I(HSV-1)은 국내외 유전자 공학 종양 치료제로서의 첫 번째 선택이 되었는데, 이 때 사용된 바이러스 벡터는 유전자 운반 능력이 크고, 복제주기가 짧고, 감염 효율이 높으며, 복수의 치료 유전자를 삽입할 수 있는 능력 및 다른 장점들이 있었기 때문이다.
HSV-1 바이러스는 헤르페스 바이러스과에 속하며 사람의 입술, 눈, 얼굴 피부에 헤르페스를 일으키는 일종의 외피 DNA 바이러스의 한 유형이다. 역학 연구에 따르면 인구의 60% 이상이 HSV-1 바이러스에 감염되었다. HSV-1 바이러스의 게놈은 152 kb의 이중 가닥 선형 DNA로 구성되어 있으며, 이는 서로 연결된 두 개의 단편으로 구성된다: 길고 짧은 단편(Macdonald S J, Mostafa HH, Morrison L A, et al. Genome sequence of herpes simplex virus 1 strain KOS [J]. J Virol, 2012, 86 (11): 6371-6372). 긴 단편(L 부위)은 게놈의 약 82%를 차지하고, 짧은 단편(S 영역)은 게놈의 약 18%를 차지하며, 긴 단편과 짧은 단편은 접합 영역에 의해 함께 결찰된다. L 영역은 한 쌍의 반전된 반복 세그먼트를 포함하고, 그 사이의 세그먼트는 고유 세그먼트 UL로 지칭되며; S 영역은 또한 한 쌍의 반전된 반복 세그먼트를 가지며, 그 사이의 세그먼트는 고유 세그먼트 US로 지칭된다. 현재, HSV-1 KOS 균주의 게놈 분석은 모두 완료되었다. KOS 균주의 게놈은 총 152011개의 뉴클레오티드 염기서열을 포함하고, 단백질을 코딩하는 총 72개의 유전자를 포함하며, 상기 고유 세그먼트 UL은 12개의 유전자를 포함하며, UL 말단 역반복 세그먼트(terminal inverted repeat segment; TRL)와 UL 중간 역반복 서열(intermediate inverted repeat sequence; IRL)은 각각 3개의 동일한 유전자(각각 ICP34.5, ICP0 및 LAT)를 포함하고, US 말단 역반복 세그먼트(terminal inverted repeat segment; TRS) 및 US 중간 역반복 서열(intermediate inverted repeat sequence; IRS)는 각각 하나의 동일한 유전자(ICP4)로 구성된다.
HSV-1이 풍부하게 복제될 때, HSV-1은 전사 수준에서 계단식 조절 방식으로 단백질을 합성한다. 이러한 단백질은 합성 시간 순서에 따라 α, β 및 γ의 세 종류로 분류할 수 있다. HSV-1 바이러스는 우선 ICP0, ICP4, ICP22, ICP27, ICP47 등 5개의 즉각적인 단백질(IE proteins)을 인코딩하는 α형 유전자를 전사하고, 이는 차례로 β, γ형 유전자를 활성화시켜, 바이러스의 조기(early; E)와 후기(late; L) 단백질의 발현을 촉진한다. 즉각적인-초기 단백질 ICP0은 다양한 세포 유전자뿐만 아니라 모든 유형의 바이러스 유전자(즉, IE, E 및 L)를 독립적으로 활성화할 수 있다(일부 경우 ICP4의 상승적 활성화가 필요할 수 있다). ICP0은 여러 개의 세포내 전사 인자 또는 조절 단백질과 상호작용하고 숙주 세포에서 특정 유전자의 전사를 활성화시킬 뿐만 아니라, 유비퀴틴 라이게이즈 E3 기능성 도메인(Kawaguchi Y, Bruni R, Roizman B. Interaction of herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 with elongation factor 1delta: ICP0 affects translational machinery [J]. J Virol, 1997, 71 (2): 1019-1024)을 통해 바이러스 게놈 발현 및 바이러스 유전자 전사를 조절한다. ICP4와 ICP27은 바이러스 복제에 필요한 즉각적인 초기 단백질이다(DeLuca N A, McCarthy A M, Schaffer P A. Isolation and characterization of deletion mutants of herpes simplex virus type 1 in the gene encoding immediate-early regulatory protein ICP4 [J]. J Virol, 1985, 56 (2): 558-570; Sacks WR, Greene C C, Aschman D P, et al. Herpes simplex virus type 1 ICP27 is an essential regulatory protein [J]. J Virol, 1985, 55 (3): 796-805). ICP27은 RNA 중합효소 II와 상호작용하여 바이러스 유전자의 전사를 촉진하는 다기능 조절 단백질이다. ICP27은 ICP4와 상호작용하여 초기 및 후기 유전자 발현을 활성화할 수 있다. ICP27은 또한 바이러스 복제 관련 유전자를 상향 조절함으로써 바이러스 DNA 복제를 간접적으로 촉진한다. 또한, ICP27은 세포 원시 RNA의 스플라이싱을 억제하고 바이러스성 mRNA의 전좌 및 번역을 촉진하는 기능을 가지고 있다. ICP34.5는 항바이러스 단백질 PKR의 작용을 역전시켜 숙주와 바이러스 단백질 합성을 계속하게 하여 바이러스 복제를 촉진할 수 있다. 또한 ICP34.5는 PP1 포스파테이즈 활성(Randall G, Roizman B. Transcription of the derepressed open reading frame P of herpes simplex virus 1 precludes the expression of the antisense gamma (1) 34.5 gene and may account for the attenuation of the mutant virus [J]. J Virol, 1997, 71 (10): 7750-7757)을 조절함으로써 숙주의 항바이러스 반응을 피할 수 있다.
현재까지, 다양한 종양 용해성 HSV-1 바이러스 벡터는 임상 연구 단계로서, R3616 돌연변이 균주(HSV-1 F 균주에서 유래)에서 ICP34.5 유전자의 결핍으로 얻은 HSV1716(MacKie R M, Stewart B, Brown S M. Intralesional injection of herpes simplex virus 1716 in metastatic melanoma [J]. Lancet, 2001, 357(9255): 525-526; and Papanastassiou V, Rampling R, Fraser M, et al. The potential for efficacy of the modified (ICP 34.5(-)) herpes simplex virus HSV1716 following intratumoural injection into human malignant glioma: a proof of principle study [J]. Gene Ther, 2002, 9(6): 398- 406); R3616 돌연변이 균주(Markert J M, Medlock M D, Rabkin S D, et al. Conditionally replicating herpes simplex virus mutant, G207 for the treatment of malignant glioma: results of phase I trial [J]. Gene Ther, 2000, 7(10): 867-874; and Markert J M, Razdan S N, Kuo H C, et al. A phase 1 trial of oncolytic HSV-1, G207, given in combination with radiation for recurrent GBM demonstrates safety and radiographic response [J]. Mol Ther, 2014, 22(5): 1048-1055)에서 ICP34.5/ICP6 유전자를 이중 넉아웃하여 얻은 G207; R7020 돌연변이 균주에서 ICP34.5/ICP0/ICP4/UL56 유전자 1카피를 삭제하여 얻은 NV1020(HSV-1 F 균주에서 유래)(Gutermann A, Mayer E, von Dehn-Rothfelser K, et al. Efficacy of oncolytic herpesvirus NV1020 can be enhanced by combination with chemotherapeutics in colon carcinoma cells [J]. Hum Gene Ther, 2006, 17(12): 1241-1253; and Geevarghese S K, Geller D A, de Haan H A, et al. Phase I/II study of oncolytic herpes simplex virus NV1020 in patients with extensively pretreated refractory colorectal cancer metastatic to the liver [J]. Hum Gene Ther, 2010, 21(9): 1119-1128); 및 임상 HSV-1 단리 JS1에서 ICP34.5/ICP47 유전자를 더블 녹아웃시켜 얻은 T-VEC(Liu B L, Robinson M, Han Z Q, et al. ICP34.5 deleted herpes simplex virus with enhanced oncolytic, immune stimulating, and anti-tumour properties [J]. Gene Ther, 2003, 10(4): 292-303)을 포함한다. 미국 암젠 사(Amgen Company)에서는 재조합형 HSV-1 바이러스 T-VEC가 진행성 흑색종 환자에 대한 3상 임상시험에서 획기적인 발전을 이루여 FDA가 승인한 최초의 종양 용해성 바이러스형 치료제가 되었다. 그러나, 이 데이터는 T-VEC 치료 그룹이 강력한 호전을 보였음에도 지속시간 응답률(duration response rate; DRR)의 1차 종말점에 도달했을 뿐 개선된 전체 생존(overall survival; OS)의 2차 종말점에 도달하지 못했음을 시사한다(Andtbacka R H, Kaufman H L, Collichio F, et al. Talimogene Laherparepvec Improves Durable Response Rate in Patients With Advanced Melanoma [J]. J Clin Oncol, 2015, 33(25): 2780-2788). 이는 주로 T-VEC가 강한 독성 부작용을 가지고 있으며 초기 종양 내 치료 용량이 106 PFU 바이러스에 불과해 종양 치료 효과가 현저하게 감소하고 환자가 종양 용해성 치료에 가장 적합한 시기를 놓치게 되기 때문이다.
헤르페스 심플렉스 바이러스 타입 I의 종양 용해성 요법은 최근 몇 년 동안 일정한 성과를 거두었지만, 암 치료의 임상 연구에 들어간 재조합형 HSV-1 바이러스의 분석은 종양 용해성 바이러스가 서로 다른 유전적 변형, 서로 다른 종양 용해성 효과 및 안전성을 보이고, 그들의 종양 적응증 및 종양 치료 효과도 다르기 때문에 서로 달랐다(Eager R M, Nemunaitis J. Clinical development directions in oncolytic virus therapy [J]. Cancer Gene Ther, 2011, 18(5): 305-317). 일반적으로, 기존의 종양 용해성 바이러스는 상당한 독성 및 부작용이 있고, 안전성이 떨어지며, 종양 용해성 바이러스의 치료용량이 제한되어 있기 때문에 종양 치료 연구에 심각한 문제를 일으킨다(Liu T C, Galanis E, Kirn D. Clinical trial results with oncolytic virotherapy: a century of promise, a decade of progress [J]. Nat Clin Pract Oncol, 2007, 4(2): 101-117). 종양 용해성 바이러스의 치료 효과는 투여된 바이러스의 용량과 양의 상관관계가 있다. 종양 용해성 바이러스의 특이성 및 안전성이 충분히 높지 않은 경우, 신체에 심각한 부작용을 피하기 위해 종양 용해성 바이러스의 필요한 복용량을 제한해야 할 수도 있다. 이것은 종양 용해성 바이러스의 임상 치료 효과에 심각한 영향을 미치고 특정한 안전 위험을 야기한다. 미국의 암젠 사의 T-VEC를 예로 들면, 그 독성/부작용은 T-VEC의 임상적 효과를 제한하는 중요한 요소들이다. 과학자들이 실험해 왔지만, 지금까지 종양 세포에서 높은 수준으로 복제하고 정상 세포에 심각한 부작용을 일으키지 않으면서 종양 세포를 죽일 수 있는 종양 용해성 바이러스는 발견되지 않았다. 따라서, 종양 용해성 바이러스 요법의 낮은 독성과 높은 효용성을 얻기 위해 새로운 종양 용해성 바이러스를 개발할 필요가 있다.
종래기술에서 종양에 대한 유전자 요법에서 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스의 결점을 극복하기 위해, 본 발명의 발명가들은 종양에서 높은 수준에서 복제할 수 있고 종양 세포에 높은 치사율을 나타낼 뿐만 아니라, 부작용(특히 신경독성)이 현저하게 감소된 새로운 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스를 만들었다. 따라서, 본 발명의 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스는 종양 용해성 바이러스의 높은 치료 효과를 유지할 뿐만 아니라, 종양 용해성 바이러스의 안전성을 크게 향상시킨다.
본 발명에서, 본 명세서에서 사용되는 과학 및 기술 용어는 달리 언급되지 않는 한, 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 또한, 본 명세서에 사용된 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 및 면역학적 실험 절차는 모두 해당 분야에서 널리 사용되는 일상적인 단계이다. 또한, 본 발명의 이해를 돕기 위해, 관련 용어의 정의 및 설명이 아래에 제공된다.
본 명세서에 사용된 용어 "재조합 HSV 바이러스"는 야생형 HSV 바이러스와 비교하여 인공적으로 도입된 돌연변이를 포함하는 조작된 HSV 바이러스를 지칭한다. 본 발명의 재조합 HSV 바이러스는 그의 생산 방식에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 HSV 바이러스는 상동 재조합에 의해 또는 재조합 HSV 바이러스에 감염된 숙주 세포를 배양함으로써 생성될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "바이러스 벡터"는 바이러스 게놈에 기초하여 구성되고 외인성 뉴클레오티드 서열을 보유할 수 있는 핵산 전달 비히클을 지칭한다. 일반적으로, 상기 바이러스 벡터는 적합한 숙주 세포에서 그 안에 포함된 유전자 (내인성 및 외인성)를 자가-복제 및/또는 발현시킬 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 온전한 야생형 바이러스의 게놈, 또는 돌연변이 되거나 변형된 바이러스 게놈을 포함할 수 있다. 그러나, 안전상의 이유로, 상기 바이러스 벡터는 일반적으로 바람직하게는 돌연변이 되거나 변형된 바이러스 게놈을 포함한다. 본 발명의 바이러스 벡터는 HSV의 바이러스 게놈으로부터 유래되므로, 본 발명의 바이러스 벡터는 또한 HSV 바이러스 벡터로 지칭될 수 있다.
본 명세서에서, "목적하는 기능성 단백질을 발현하지 않는다"라는 표현은 세포가 바이러스 또는 바이러스 벡터 또는 바이러스 게놈에 감염된 경우, 상기 바이러스 또는 바이러스 벡터 또는 바이러스 게놈이 생물학적으로 기능적인 활성에 관련된 단백질 생성 또는 발현할 수 없음을 의미한다. 예를 들어, 상기 바이러스 또는 바이러스 벡터 또는 바이러스 게놈은 유전자 결실로 인해 목적 단백질을 전혀 생성 또는 발현하지 않거나, 기능상실 돌연변이로 인한 생물학적 기능적 활성없이 목적 단백질을 생성 또는 발현할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "기능상실 돌연변이"는 돌연변이 된 유전자에 의해 코딩되고 발현된 단백질의 생물학적으로 기능적인 활성의 손실을 초래하는 돌연변이를 지칭한다. 기능상실 돌연변이는 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 프레임시프트 돌연변이, 염기 결실, 염기 치환, 염기 첨가, 및 이들의 임의의 조합(예를 들어, 유전자 단편의 결실 또는 치환 또는 첨가)을 포함하나, 기능상실 돌연변이를 포함하는 유전자가 생물학적으로 기능적 활성을 갖는 단백질을 생산하거나 발현할 수 없는 한, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 용어 "필수 유전자"는 HSV 바이러스의 생존 및 복제를 유지하는데 필수적인 유전자를 지칭한다. 이러한 필수 유전자의 구체적인 예는 ICP27 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62883.1 참조), ICP4 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62888.1 참조), VP5 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62846.1), gL 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62828.1 참조), gH 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62849.1 참조), gD 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62894 참조) .1), gK 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62882.1 참조), gB 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62855.1 참조), gN 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62878.1 참조), UL5 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62832.1 참조), UL6 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62833.1 참조), UL8 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62835.1 참조), UL9 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62836.1 참조), UL12 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62839.1 참조), UL25 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62852.1 참조), UL26 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62853.1 참조), UL28 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62856.1 참조), UL29 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62857.1 참조), UL30 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62858.1 참조), UL33 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62861.1), UL36 참조 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62864.1 참조), UL38 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62866.1 참조), UL42 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62870.1 참조), UL48 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62876.1), UL52 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62881.1 참조) 을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. HSV 바이러스의 필수 유전자에 대한 자세한 설명은 예를 들어 Roizman B, Knipe DM. Herpes simplex viruses and their replication. In: Knipe D M, Howley P M, editors. Fields Virology. 2nd ed. Vol 2. Philadelphia, PA Lippincot, Williams and Wilkins, 2001: 2399-2460; Subak-Sharpe J H, Dargan D J. HSV molecular biology: general aspects of herpes simplex virus molecular biology. Virus Genes, 1998, 16(3): 239-251을 참조할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "비 필수 유전자"는 HSV 바이러스의 생존 및 복제를 유지하는데 요구되지 않는 유전자를 지칭한다. 일반적으로, HSV 바이러스 게놈에서 이러한 유전자는 HSV 바이러스의 생존 및 복제 능력에 영향을 미치지 않으면 서 녹아웃(결실) 또는 돌연변이 될 수 있다. 이러한 필수 유전자의 구체적인 예는 UL3 유전자(예를 들어, GenBank 번호 AFE62830.1 참조), UL4 유전자(예를 들어, GenBank 번호 AFE62831.1 참조), UL14 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62841.1), UL16 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62843.1 참조), UL21 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62848.1 참조), UL24 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62851 참조), UL31 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62859.1 참조), UL32 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62860.1 참조), US3 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62891.1 참조), UL51 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62880.1 참조), UL55 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62884.1 참조), UL56 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62885.1 참조), US2 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62890.1), US12 유전자(예를 들어, GenBank No. AFE62901.1; 즉, ICP47 유전자 참조) 및 LAT 유전자(예를 들어, GenBank No. JQ673480.1 참조). HSV 바이러스의 비 필수 유전자에 대한 자세한 설명은 예를 들어 Roizman B, Knipe D M. Herpes simplex viruses and their replication. In: Knipe D M, Howley P M, editors. Fields Virology. 2nd ed. Vol 2. Philadelphia, PA: Lippincot, Williams and Wilkins, 2001: 2399-2460; Subak-Sharpe J H, Dargan D J. HSV molecular biology: general aspects of herpes simplex virus molecular biology. Virus Genes, 1998, 16(3): 239-251를 참조할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "ICP0 단백질"은 RL2 유전자에 의해 코딩되고 HSV 바이러스의 초기 유전자 산물 중 하나인 HSV 바이러스의 감염된 세포 단백질 0을 지칭한다. ICP0 단백질의 아미노산 서열은 공지되어 있고, 예를 들어 공개 데이터베이스 NCBI(AFE62827.1)에서 볼 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "ICP34.5 단백질"은 HSV 바이러스의 감염된 세포 단백질 34.5를 지칭하며, 이는 RL1 유전자에 의해 코딩되고 HSV 바이러스의 직접적인 초기 유전자 산물 중 하나이다. ICP34.5 단백질의 아미노산 서열은 공지되어 있으며, 예를 들어 공개 데이터베이스 NCBI(AFE62826.1)에서 볼 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "ICP27 단백질"은 UL54 유전자에 의해 코딩되는 HSV 바이러스의 감염된 세포 단백질 27을 지칭한다. ICP27 단백질의 아미노산 서열은 공지되어 있으며, 예를 들어 공개 데이터베이스 NCBI(AFE 62883.1)에서 볼 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "ICP4 단백질"은 RS1 유전자에 의해 코딩되는 HSV 바이러스의 감염된 세포 단백질 4를 지칭한다. ICP4 단백질의 아미노산 서열은 공지되어 있고, 예를 들어 공개 데이터베이스 NCBI(AFE 62888.1)에서 볼 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "VP5 단백질"은 UL19 유전자에 의해 코딩되는 HSV 바이러스의 주요 캡시드 단백질을 지칭한다. VP5 단백질의 아미노산 서열은 공지되어 있고, 예를 들어 공개 데이터베이스 NCBI(AFE62846.1)에서 볼 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "ICP0 유전자"는 HSV 바이러스 게놈에서 ICP0 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 용어 "ICP34.5 유전자"는 HSV 바이러스 게놈에서 ICP34.5 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 용어 "ICP27 유전자"는 HSV 바이러스 게놈에서 ICP27 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 용어 "ICP4 유전자"는 HSV 바이러스 게놈에서 ICP4 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 용어 "VP5 유전자"는 HSV 바이러스 게놈에서 VP5 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "외인성 뉴클레오티드 서열"은 원래의 서열과는 다른 인공적으로 도입된 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 외인성 뉴클레오티드 서열은 바이러스 게놈에서 발견되지 않은 임의의 유전자를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 그러나, 특정 경우에, 바람직하게는, 외인성 뉴클레오티드 서열은 면역 조절 폴리펩티드, 사이토카인, 케모카인, 항체 및 세포독성 펩티드와 같은 치료 용도를 갖는 폴리펩티드를 코딩한다.
본 명세서에 사용된 용어 "면역 조절 폴리펩티드"는 면역 세포의 기능을 조절하는 폴리펩티드를 지칭하며, 이의 예에는 CD40L, OX40L, 유도성 보조자극 분자(inducible costimulatory molecules; ICOS), FTL3L, LIGHT, CD137L, CD70, 4-1BB, GITR 및 CD28(예를 들어, Khalil D N, Smith E L, Brentjens R J, et al. The future of cancer treatment: immunomodulation, CARs and combination immunotherapy [J]. Nat Rev Clin Oncol, 2016, 13 (5): 273-290 참조)이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 용어 "사이토카인"은 당업자에게 잘 알려진 의미를 갖는다. 그러나, 본 발명의 방법에서, 본 발명의 재조합 바이러스가 종양을 치료하는데 사용되는 경우, 사이토카인은 종양 치료에 사용될 수 있는 사이토카인인 것이 특히 바람직하다. "사이토카인"의 예는 인터류킨(예를 들어, IL-2, IL-12 및 IL-15), 인터페론(예를 들어, IFNα, IFNβ, IFNγ), 종양 괴사 인자(예를 들어, TNFα), 콜로니 자극 인자(예를 들어, GM-CSF), 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다(예를 들어, Ardolino M, Hsu J, Raulet D H. Cytokine treatment in cancer immunotherapy [J]. Oncotarget, 2015, 6 (23): 19346-19347 참조).
본 명세서에 사용된 용어 "케모카인"은 당업자에게 잘 알려진 의미를 갖는다. 그러나, 본 발명의 방법에서, 본 발명의 재조합 바이러스가 종양을 치료하는데 사용될 때, 사이토카인은 종양 치료에 사용될 수 있는 케모카인인 것이 특히 바람직하다. "케모카인"의 예는 CCL2, RANTES, CCL7, CCL9, CCL10, CCL12, CCL15, CCL19, CCL21, CCL20, XCL-1 및 이들의 임의의 조합(예를 들어, Homey B, Muller A, Zlotnik A. CHEMOKINES: AGENTS FOR THE IMMUNOTHERAPY OF CANCER? [J]. Nat Rev Immunol, 2002, 2: 175-184 참조)을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 용어 "세포 독성 펩티드"는 세포에 독성이 있거나 세포예정사를 유도하는 폴리펩티드를 지칭하며, 이의 예에는 티미딘 카이네이즈 TK(TK/GCV), TRAIL 및 FasL(예를 들어, Candolfi M, King G D, Muhammad A G, et al. Evaluation of proapototic transgenes to use in combination with Flt3L in an immune-stimulatory gene therapy approach for Glioblastoma multiforme(GBM) [J]. FASEB J, 2008, 22: 1077.13 참조)이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 당업자에게 잘 알려진 의미를 갖는다. 그러나, 본 발명의 방법에서, 본 발명의 재조합 바이러스가 종양을 치료하는데 사용되는 경우, 항체는 종양 치료에 사용될 수 있는 항체인 것이 특히 바람직하다. "항체"의 예는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIGIT 항체, 항-BTLA 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-Tim-3 항체, 항-Lag-3 항체, 항-CD137 항체, 항-OX40 항체, 항-GITR 항체, 항-CD73 항체, 항-KIR 항체, 항-ICOS 항체, 항-CSF1R 항체, 항-EGFR 항체, 항-VEGFR 항체, 항-HER2 항체 및 항-PDGFR 항체(예를 들어, Khalil D N, Smith E L, Brentjens R J, et al. The future of cancer treatment: immunomodulation, CARs and combination immunotherapy [J]. Nat Rev Clin Oncol, 2016, 13 (5): 273-290; and Hughes P E, Caenepeel S, Wu L C. Targeted Therapy and Checkpoint Immunotherapy Combinations for the Treatment of Cancer [J]. Trends Immunol, 2016, 37 (7): 462-476 참조)를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 용어 "약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제"는 당업계에 공지된 대상체 및 활성 성분과 약리학적 및/또는 생리학적으로 양립 가능한 담체 및/또는 부형제를 지칭하고(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995 참조), 및 pH 조절제, 계면 활성제, 보조제, 이온 강도 증강제를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, pH 조절제는 포스페이트 완충제; 계면 활성제는 양이온성, 음이온성 또는 비이온성 계면 활성제, 예컨대 Tween-80; 아주반트는 알루미늄 아주 반트(예를 들어, 수산화 알루미늄), 프로인트 아주반트 (예를 들어, 완전한 프로인트 아주반트); 이온 강도 증강제는 염화나트륨을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 용어 "유효량"은 원하는 효과를 달성하거나 적어도 부분적으로 달성하기에 충분한 양을 지칭한다. 예를 들어, 예방적 유효량은 질병의 발병을 예방, 제어 또는 지연시키기에 충분한 양을 지칭하고; 질환에 대한 치료 유효량은 질환을 앓고 있는 환자에서 질환 및 그의 합병증을 치료 또는 적어도 부분적으로 제어하기에 충분한 양을 지칭한다. 이러한 유효량의 결정은 당업자의 능력 내에 있다. 예를 들어, 치료적 사용에 효과적인 양은 치료될 질환의 중증도, 환자 자신의 면역계의 전반적인 상태, 연령, 체중 및 성별과 같은 환자의 일반적인 상태, 약물 투여 방식, 기타 동시에 적용되는 처리 등.
종양 요법을 위한 기존 재조합 HSV 바이러스의 안전성 문제 및 부작용을 극복하기 위해, 본 발명자들은 기능적 ICP0 및 ICP34.5 단백질을 발현하지 않는 신규 한 재조합 HSV 바이러스를 구축하였다(예를 들어, ICP0 및 ICP34.5 유전자의 2개의 카피가 결실되었다). 본 발명의 재조합 HSV 바이러스는 종양 세포에서 높은 수준의 복제 능력을 가지며 다양한 종양 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있지만, 정상 세포에서 현저하게 감소된 복제 능력 및 사멸 능력을 나타낸다. 또한, 본 발명의 재조합 HSV 바이러스는 동물에서 현저하게 감소된 신경 독성을 나타내고, 상당히 증가된 용량으로 동물에게 투여될 수 있음이 또한 밝혀졌다. 따라서, 기존의 재조합 HSV 바이러스와 비교하여, 본 발명의 재조합 HSV 바이러스는 높은 종양 분해능을 유지할 뿐만 아니라 안전성이 크게 개선되어 보다 높은 용량으로 투여될 수 있고 광범위한 적용 전망을 갖는다.
재조합 HSV 바이러스
이에, 일 측면에서, 본 발명은 기능성 ICP0 단백질 및 ICP34.5 단백질을 발현하지 않는 재조합 HSV 바이러스를 제공한다.
당업자에게 잘 알려진 바와 같이, 목적 단백질(예를 들어, ICP0 단백질 및/또는 ICP34.5 단백질)의 기능적 발현은 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 변형시킴으로써 방지될 수 있다. 예를 들어, 기능상실 돌연변이는 목적 단백질을 코딩하는 유전자(예를 들어, ICP0 단백질 및/또는 ICP34.5 단백질)에 도입될 수 있거나 또는 목적 단백질을 코딩하는 유전자(예를 들어, ICP0 단백질 및/또는 ICP34.5 단백질)가 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 결실되거나 치환되어, 목적 단백질의 기능적 발현을 방지할 수 있다.
HSV 바이러스의 게놈은 ICP0 유전자의 2개의 카피 및 ICP34.5 유전자의 2개의 카피를 포함하는 것으로 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 재조합 HSV 바이러스에서 ICP0 단백질 및 ICP34.5 단백질의 기능적 발현을 방지하기 위해, ICP0 유전자의 2개의 카피 및 ICP34.5 유전자의 2개의 카피를 동시에 변형시킬 필요가 있다. 그러나, ICP0 유전자의 2개의 카피 및 ICP34.5 유전자의 2개의 카피(4개의 뉴클레오티드 세그먼트)의 변형은 서로 독립적이며 동일하거나 상이할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다.
따라서, 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스는 다음과 같은 게놈을 갖는다:
ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 결실되거나 또는 치환되고;
ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 결실되거나 또는 치환된다.
바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 다음 변형을 포함한다:
ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 결실되거나 또는 치환되고; 및
ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 결실되거나 또는 치환된다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 1개의 카피는 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기들의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하고, 다른 카피는 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기들의 첨가, 결실 및/또는 치환) 또는 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 결실되거나 또는 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 1개의 카피가 결실되고, ICP0 유전자의 다른 카피는 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기들의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 결실되거나 또는 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 1개의 카피는 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 치환되고, ICP0 유전자의 다른 카피는 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기들의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 결실되거나 또는 치환된다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 동일한 기능상실 돌연변이를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 상이한 기능상실 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 기능상실 돌연변이를 포함한다. 제1 기능상실 돌연변이 및 제2 기능상실 돌연변이는 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 결실된다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 독립적으로 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 동일한 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 상이한 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 치환된다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고, ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환된다. 제1 외인성 뉴클레오티드 서열 및 제2 외인성 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 1개의 카피는 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기들의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하고, ICP34.5 유전자의 다른 카피는 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기들의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 결실되거나 또는 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 1개의 카피가 결실되고, ICP34.5 유전자의 다른 카피는 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기들의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 결실되거나 또는 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 1개의 카피는 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 치환되고, ICP34.5 유전자의 다른 카피는 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기들의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열) 로 결실되거나 또는 치환된다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 동일한 기능상실 돌연변이를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 상이한 기능상실 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 기능상실 돌연변이를 포함한다. 제3 기능상실 돌연변이 및 제4 기능상실 돌연변이는 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 결실된다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 2개의 카피 각각은 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 독립적으로 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 동일한 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 상이한 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 치환된다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환된다. 제3 외인성 뉴클레오티드 서열 및 제4 외인성 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하고, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및 / 또는 치환)를 포함한다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 기능상실 돌연변이를 포함하고; ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 기능상실 돌연변이를 포함한다. 제1 기능상실 돌연변이, 제2 기능상실 돌연변이, 제3 기능상실 돌연변이 및 제4 기능상실 돌연변이는 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하고, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 결실된다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 기능상실 돌연변이를 포함하고; 및 ICP34.5 유전자의 2개의 카피가 결실된다. 제1 기능상실 돌연변이 및 제2 기능상실 돌연변이는 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하고, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 치환된다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 기능상실 돌연변이를 포함하고; 그리고, ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환된다. 제1 기능상실 돌연변이 및 제2 기능상실 돌연변이는 동일하거나 상이할 수 있다. 제3 외인성 뉴클레오티드 서열 및 제4 외인성 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피가 결실되고; ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함한다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피가 결실되고; ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 기능상실 돌연변이를 포함한다. 제3 기능상실 돌연변이 및 제4 기능상실 돌연변이는 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피가 결실되고; ICP34.5 유전자의 2개의 카피가 결실된다. 이러한 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스는 ICP0 단백질 및 ICP34.5 단백질을 발현하지 않는다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 야생형 HSV-1 바이러스 게놈의 nt510과 nt5439 사이의 염기 서열 및 nt120802와 nt125731 사이의 염기 서열의 결실을 갖는다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피가 결실되고; ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 각각 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 독립적으로 치환된다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피가 결실되고; ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환된다. 제3 외인성 뉴클레오티드 서열 및 제4 외인성 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 독립적으로 치환되고, ICP34.5 유전자의 2카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함한다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고 ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고; ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 기능상실 돌연변이를 포함한다. 제1 외인성 뉴클레오티드 서열 및 제2 외인성 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 제3 기능상실 돌연변이 및 제4 기능상실 돌연변이는 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 독립적으로 치환되고, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 결실된다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고 ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고; ICP34.5 유전자의 2개의 카피가 결실된다. 제1 외인성 뉴클레오티드 서열 및 제2 외인성 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 독립적으로 치환되고, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 각각 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 독립적으로 치환된다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고 ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고; ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고 ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환된다. 제1 외인성 뉴클레오티드 서열, 제2 외인성 뉴클레오티드 서열, 제3 외인성 뉴클레오티드 서열 및 제4 외인성 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, 제1 기능상실 돌연변이, 제2 기능상실 돌연변이, 제3 기능상실 돌연변이 및 제4 기능상실 돌연변이는 각각 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 프레임시프트 돌연변이, 염기 결실, 염기 치환, 염기 첨가, 및 이들의 임의의 조합(예를 들어, 유전자 단편의 결실 또는 치환 또는 첨가)로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, 제1 외인성 뉴클레오티드 서열, 제2 외인성 뉴클레오티드 서열, 제3 외인성 뉴클레오티드 서열 및 제4 외인성 뉴클레오티드 서열은 각각 형광 단백질, 면역 조절 폴리펩티드, 사이토카인, 케모카인, 항체, 및 세포독성 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 외래 단백질을 독립적으로 코딩한다.
바람직하게는, 상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(예를 들어, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 녹색 형광 단백질), 적색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 특정 실시예에서, 상기 면역조절 폴리펩티드는 CD40L, OX40L, 유도성 동시 자극 분자(inducible costimulatory molecule; ICOS), FTL3L, LIGHT, CD137L, CD70, 4-1BB, GITR, CD28, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 특정 실시예에서, 상기 사이토카인은 인터루킨(예를 들어, IL-2, IL-12, 및 IL-15), 인터페론(예를 들어, IFNα, IFN
, IFNγ), 종양 괴사 인자(예를 들어, TNFα), 콜로니 자극 인자(예를 들어, GM-CSF) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 특정 실시예에서, 상기 케모카인은 CCL2, RANTES, CCL7, CCL9, CCL10, CCL12, CCL15, CCL19, CCL21, CCL20, XCL-1 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 특정 실시예에서, 상기 세포 독성 펩티드는 티미딘 카이네이즈 TK(TK/GCV), TRAIL, FasL, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 특정 실시예에서, 상기 항체는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIGIT 항체, 항-BTLA 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-Tim-3 항체, 항-Lag-3 항체, 항-CD137 항체, 항-OX40 항체, 항-GITR 항체, 항-CD73 항체, 항-KIR 항체, 항-ICOS 항체, 항-CSF1R 항체, 항-EGFR 항체, 항-VEGFR 항체, 항-HER2 항체, 항-PDGFR 항체 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
지난 5년 동안, PD-1에 대한 항체 약물은 임상적으로 큰 성공을 거두었으며 FDA에 의해 흑색종 및 폐암과 같은 고형 종양 환자의 치료에 대한 승인을 받았다. 그러나 임상 연구에 따르면 항-PD-1 항체는 고형 종양 환자의 약 30%에서만 효과적이다. 이는 T 세포가 고형 종양으로 침투하기 어렵고 항-PD-1 항체와 함께 고형 종양 내부의 종양 세포에 작용할 수 없기 때문일 수 있다. 임의의 이론에 구속되지 않으면서, 종양 용해성 HSV 바이러스는 종양 세포를 직접 표적화 및 사멸시킬 뿐만 아니라 면역 세포(예를 들어 T 세포)를 유도하여 종양을 침윤시킨다. 따라서, 본 발명의 재조합 HSV 바이러스와 항-PD-1 항체의 병용은 종양 치료 효과를 향상시키는 데 특히 유리할 수 있고, 종양 면역 요법에 큰 응용 가능성을 갖는다. 따라서, 바람직한 특정 실시예에서, 외래 단백질은 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체 또는 이들의 임의의 조합이다. 예를 들어, 상기 외래 단백질은 항-PD-1 단쇄 항체이다.
바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스는 재조합 HSV-1 바이러스, 재조합 HSV-2 바이러스, 또는 HSV-1/HSV-2 키메라 바이러스(즉, 게놈이 HSV-1로부터 유래된 DNA 및 HSV-2로부터 유래된 DNA 둘 모두를 포함하는 재조합 HSV 바이러스)이다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스는 HSV-1 균주 KOS로부터 유래된다.
바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스는 기능성 UL43 단백질, 기능성 UL41 단백질(즉, vhs 단백질), 기능성 UL48 단백질(즉, VMW65 단백질), 또는 이들의 임의의 조합을 발현할 수 있다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스는 기능성 UL43 단백질을 발현할 수 있다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스는 기능성 UL41 단백질을 발현할 수 있다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스는 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스는 기능성 UL43 단백질 및 기능성 UL41 단백질을 발현할 수 있다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스는 기능성 UL43 단백질 및 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스는 기능성 UL41 단백질 및 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스는 기능성 UL43 단백질, 기능성 UL41 단백질 및 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, 상기 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 기능성 UL43 단백질을 발현할 수 있는 UL43 유전자, 및 기능성 UL41 단백질을 발현할 수 있는 UL41 유전자(즉, vhs 유전자), 및/또는 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있는 UL48 유전자(즉, VMW65 유전자)를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 기능성 UL43 단백질을 발현할 수 있는 UL43 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 기능성 UL41 단백질을 발현할 수 있는 UL41 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있는 UL48 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 기능성 UL43 단백질을 발현할 수 있는 UL43 유전자 및 기능성 UL41 단백질을 발현할 수 있는 UL41 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 기능성 UL43 단백질을 발현할 수 있는 UL43 유전자 및 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있는 UL48 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 기능성 UL41 단백질을 발현할 수 있는 UL41 유전자 및 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있는 UL48 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 기능성 UL43 단백질을 발현할 수 있는 UL43 유전자, 기능성 UL41 단백질을 발현할 수 있는 UL41 유전자, 및 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있는 UL48 유전자를 포함한다.
바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 UL43 유전자, UL41 유전자(즉, vhs 유전자) 및/또는 UL48 유전자(즉, VMW65 유전자), 및 UL43 유전자, UL41 유전자 및/또는 UL48 유전자는 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는 UL43 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는 UL41 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는 UL48 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는 UL43 유전자 및 UL41 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는 UL43 유전자 및 UL48 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는 UL41 유전자 및 UL48 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는 UL43 유전자, UL41 유전자 및 UL48 유전자를 포함한다.
바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 하나 이상의 비 필수 유전자가 결실 또는 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)되는 변형을 추가로 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 비 필수 유전자는 UL3 유전자, UL4 유전자, UL14 유전자, UL16 유전자, UL21 유전자, UL24 유전자, UL31 유전자, UL32 유전자, US3 유전자, UL51 유전자, UL55 유전자, UL56 유전자, US2 유전자, US12 유전자(즉, ICP47 유전자), LAT 유전자, JQ673480.1의 nt5853-nt7485에 상응하는 뉴클레오티드 단편, 및 이들의 임의의 조합이다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈에서, UL3 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈에서, UL4 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈에서, UL14 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈에서, UL16 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈에서, UL21 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈에서, UL24 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈에서, UL31 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈에서, UL32 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈에서, US3 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈에서, UL51 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈에서, UL55 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈에서, UL56 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈에서, US2 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈에서, US12 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈에서, LAT 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈에서, JQ673480.1의 nt5853-nt7485에 상응하는 뉴클레오티드 단편이 결실 또는 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다.
바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 하기 변형 중 하나 이상을 추가로 포함한다: UL55 유전자, US2 유전자, LAT 유전자, 및 JQ673480.1의 nt5853-nt7485에 상응하는 뉴클레오티드 단편 중 하나 이상에서의 결실 또는 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨). 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 하기 변형을 추가로 포함한다: UL55 유전자, US2 유전자, LAT 유전자, 및 JQ673480.1의 nt5853-nt7485에 상응하는 뉴클레오티드 단편의 결실 또는 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨).
바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 필수 유전자는 결실되지 않으며 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 필수 유전자에 대한 코딩 서열은 결실되거나 돌연변이 되지 않는다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스는 모든 필수 유전자를 발현할 수 있다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 모든 필수 유전자를 포함하고, 필수 유전자 중 어느 것도 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 모든 필수 유전자를 포함하고, 필수 유전자의 코딩 서열 중 어느 것도 돌연변이를 포함하지 않는다. 일반적으로, 상기 필수 유전자는 HSV 바이러스의 생존 및 복제에 필수적이므로, 따라서, 재조합 HSV 바이러스에서, 필수 유전자 중 어느 것도 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는다. 그러나, 이러한 필수 유전자의 프로모터가 조작될 수 있으므로(예를 들어, 필수 유전자의 천연 프로모터가 hTERT의 프로모터와 같은 종양-특이적 프로모터로 대체될 수 있음), 이로써 본 발명의 재조합 HSV 바이러스의 기능/특성에 영향을 미치지 않으면서 재조합 HSV 바이러스의 안전성이 추가로 향상됨을 이해해야 한다. 따라서, 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈에서, 하나 이상의 필수 유전자의 천연 프로모터는 hTERT의 프로모터와 같은 종양-특이적 프로모터로 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, 필수 유전자는 ICP27 유전자, ICP4 유전자, VP5 유전자, gL 유전자, gH 유전자, gD 유전자, gK 유전자, gB 유전자, gN 유전자, UL5 유전자, UL6 유전자, UL8 유전자, UL9 유전자, UL12 유전자, UL25 유전자, UL26 유전자, UL28 유전자, UL29 유전자, UL30 유전자, UL33 유전자, UL36 유전자, UL38 유전자, UL42 유전자, UL48 유전자, UL52 유전자, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 특정 실시예에서, 상기 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 상기 기재된 바와 같은 ICP0 유전자의 2개의 카피 및 ICP34.5 유전자의 2개의 카피를 제외하고는 야생형 HSV 바이러스의 다른 모든 유전자를 포함하고, 다른 유전자 중 어느 것도 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는다. 그러나, 다른 유전자의 프로모터가 조작될 수 있으므로(예를 들어, 천연 프로모터가 hTERT의 프로모터와 같은 종양-특이적 프로모터로 대체될 수 있음), 이로써 본 발명의 재조합 HSV 바이러스의 기능/특성에 영향을 미치지 않으면서 재조합 HSV 바이러스의 안전성이 추가로 향상됨을 이해해야 한다. 따라서, 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 하나 이상의 HSV 유전자의 천연 프로모터가 hTERT의 프로모터와 같은 종양-특이적 프로모터로 치환된 변형을 추가로 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, HSV 유전자는 VP5 유전자, ICP27 유전자 및 ICP4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 추가로 포함한다:
(1) VP5 유전자의 천연 프로모터를 hTERT 프로모터와 같은 종양-특이적 프로모터로 치환하고;
(2) ICP27 유전자의 천연 프로모터를 hTERT 프로모터와 같은 종양-특이적 프로모터로 치환하고;
(3) ICP4 유전자의 천연 프로모터를 hTERT 프로모터와 같은 종양-특이적 프로모터로 치환하고;
(4) UL55 유전자, US2 유전자, LAT 유전자, 및 JQ673480.1의 nt5853-nt7485에 상응하는 뉴클레오티드 단편 중 하나 이상의 결실 또는 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나, 또는 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨);
바람직한 특정 실시예에서, 상기 hTERT 프로모터는 서열번호 5에 제시된 서열을 갖는다.
또한, 본 발명의 재조합 HSV 바이러스는 또한 하나 이상의 외인성 뉴클레오티드 서열을 보유하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 제5 외인성 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 제5 외인성 뉴클레오티드 서열은 형광 단백질, 면역조절 폴리펩티드, 사이토카인, 케모카인, 항체 및 세포 독성 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 외래 단백질을 코딩한다.
본 명세서에서, 기능상실 돌연변이는 당업계에 잘 알려진 기술에 의해 상기 언급된 바와 같이 다양한 바이러스 유전자에 도입될 수 있다. 예를 들어, 기능상실 돌연변이는 바이러스 유전자를 기능적으로 불활성화시키기 위해 염기의 결실, 치환 또는 삽입에 의해 바이러스 유전자 내로 도입될 수 있다. 특정 실시예에서, 바이러스 유전자는 결실(예를 들어, 전체 유전자 또는 그의 일부의 결실)에 의해 기능적으로 불활성화된다. 이러한 실시예에서, 목적 바이러스 유전자 서열의 25% 이상, 50% 이상, 75% 이상 또는 100% 이상이 결실될 수 있거나, 또는 10 bp 이상, 100 bp 이상, 또는 1000% 이상 목적 바이러스 유전자의 서열의 bp가 결실될 수 있다. 특정 실시예에서, 프레임시프트 돌연변이는 바이러스 유전자를 기능적으로 불활성화시키기 위해 염기의 삽입 또는 결실에 의해 야기된다. 특정 실시예에서, 바이러스 유전자는 목적 전체 유전자 또는 이의 일부를 외인성 뉴클레오티드 서열로 대체함으로써 기능적으로 불활성화된다.
바이러스 벡터
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 HSV 바이러스의 게놈을 포함하거나 본 발명에 따른 재조합 HSV 바이러스의 게놈으로 구성된 바이러스 벡터를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 기능성 ICP0 단백질 및 ICP34.5 단백질을 발현하지 않는 돌연변이 된 HSV 게놈을 포함하거나 이로 구성된 바이러스 벡터를 제공한다.
바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서,
ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 결실 또는 치환되고;
ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 결실 또는 치환된다.
바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 다음 변형을 포함한다:
ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 결실 또는 치환되고;
ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 결실 또는 치환된다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 1개의 카피는 기능상실 돌연변이 (예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하고, ICP0 유전자의 다른 카피는 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하거나 또는 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 결실되거나 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 1개의 카피는 결실되고 ICP0 유전자의 다른 카피는 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하거나 또는 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 결실되거나 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 1개의 카피는 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 치환되고, ICP0 유전자의 다른 카피는 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하거나 또는 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 결실되거나 치환된다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 동일한 기능상실 돌연변이를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 상이한 기능상실 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 기능상실 돌연변이를 포함한다. 제1 기능상실 돌연변이 및 제2 기능상실 돌연변이는 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 결실된다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 독립적으로 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 동일한 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 상이한 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 치환된다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고 ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환된다. 제1 외인성 뉴클레오티드 서열 및 제2 외인성 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 1개의 카피는 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하고, ICP34.5 유전자의 다른 카피는 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하고 또는 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 결실되거나 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 1개의 카피가 결실되고 ICP34.5 유전자의 다른 카피는 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하고 또는 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 결실되거나 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 1개의 카피는 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 치환되고 ICP34.5 유전자의 다른 카피는 기능상실 돌연변이 (예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환) 또는 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 결실되거나 치환된다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 동일한 기능상실 돌연변이를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, CP34.5 유전자의 2개의 카피는 상이한 기능상실 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 기능상실 돌연변이를 포함한다. 제3 기능상실 돌연변이 및 제4 기능상실 돌연변이는 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 결실된다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 2개의 카피 각각은 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 독립적으로 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 동일한 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 상이한 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 치환된다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환된다. 제3 외인성 뉴클레오티드 서열 및 제4 외인성 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하고 ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함한다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 기능상실 돌연변이를 포함하고; ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 기능상실 돌연변이를 포함한다. 제1 기능상실 돌연변이, 제2 기능상실 돌연변이, 제3 기능상실 돌연변이 및 제4 기능상실 돌연변이는 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함하고, 및 ICP34.5 유전자의 2개의 카피가 결실된다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 기능상실 돌연변이를 포함하고; 그리고, ICP34.5 유전자의 2개의 카피가 삭제된다. 제1 기능상실 돌연변이 및 제2 기능상실 돌연변이는 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환) 및 ICP34.5 유전자의 2개의 카피를 포함하고 각각 독립적으로 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 치환된다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 기능상실 돌연변이를 포함하고; 그리고, ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환된다. 제1 기능상실 돌연변이 및 제2 기능상실 돌연변이는 동일하거나 상이할 수 있다. 제3 외인성 뉴클레오티드 서열 및 제4 외인성 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피가 결실되고; ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함한다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피가 결실되고; ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 기능상실 돌연변이를 포함한다. 제3 기능상실 돌연변이 및 제4 기능상실 돌연변이는 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피가 결실되고; ICP34.5 유전자의 2개의 카피가 결실된다. 이러한 실시예에서, 상기 바이러스 벡터는 ICP0 단백질을 암호화하는 유전자 및 ICP34.5 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하지 않는다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 nt510과 nt5439 사이의 염기 서열 및 야생형 HSV-1 바이러스 게놈의 nt120802와 nt125731 사이의 염기 서열이 결여되어 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피가 결실되고; ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 각각 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 독립적으로 치환된다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피가 결실되고; ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환된다. 제3 외인성 뉴클레오티드 서열 및 제4 외인성 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 독립적으로 치환되고, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이(예를 들어, 하나 이상의 염기의 첨가, 결실 및/또는 치환)를 포함한다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고 ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고; ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 기능상실 돌연변이를 포함한다. 제1 외인성 뉴클레오티드 서열 및 제2 외인성 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 제3 기능상실 돌연변이 및 제4 기능상실 돌연변이는 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 독립적으로 치환되고, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 결실된다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고 ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고; ICP34.5 유전자의 2개의 카피가 결실된다. 제1 외인성 뉴클레오티드 서열 및 제2 외인성 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 독립적으로 치환되고, ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 각각 외인성 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 외래 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열)로 독립적으로 치환된다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고 ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고; ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고 ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환된다. 제1 외인성 뉴클레오티드 서열, 제2 외인성 뉴클레오티드 서열, 제3 외인성 뉴클레오티드 서열 및 제4 외인성 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, 제1 기능상실 돌연변이, 제2 기능상실 돌연변이, 제3 기능상실 돌연변이 및 제4 기능상실 돌연변이는 각각 독립적으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 프레임시프트 돌연변이, 염기 결실, 염기 치환, 염기 첨가, 및 이들의 임의의 조합(예를 들어, 유전자 단편의 결실 또는 치환 또는 첨가).
바람직한 특정 실시예에서, 제1 외인성 뉴클레오티드 서열, 제2 외인성 뉴클레오티드 서열, 제3 외인성 뉴클레오티드 서열 및 제4 외인성 뉴클레오티드 서열은 각각 형광 단백질, 면역조절 폴리펩티드, 사이토카인, 케모카인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 외래 단백질을 독립적으로 코딩한다.
바람직한 특정 실시예에서, 상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(예를 들어, 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 갖는 녹색 형광 단백질), 적색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 황색 형광 단백질, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 특정 실시예에서, 상기 면역조절 폴리펩티드는 CD40L, OX40L, 유도성 동시 자극 분자(inducible costimulatory molecule; ICOS), FTL3L, LIGHT, CD137L, CD70, 4-1BB, GITR, CD28, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 특정 실시예에서, 상기 사이토카인은 인터루킨(예를 들어, IL-2, IL-12, 및 IL-15), 인터페론(예를 들어, IFNα, IFNβ, IFNγ), 종양 괴사 인자(예를 들어, TNFα), 콜로니 자극 인자(예를 들어, GM-CSF) 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 특정 실시예에서, 상기 케모카인은 CCL2, RANTES, CCL7, CCL9, CCL10, CCL12, CCL15, CCL19, CCL21, CCL20, XCL-1 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 특정 실시예에서, 상기 세포 독성 펩티드는 티미딘 카이네이즈 TK(TK/GCV), TRAIL, FasL, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 특정 실시예에서, 상기 항체는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIGIT 항체, 항-BTLA 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-Tim-3 항체, 항-Lag-3 항체, 항-CD137 항체, 항-OX40 항체, 항-GITR 항체, 항-CD73 항체, 항-KIR 항체, 항-ICOS 항체, 항-CSF1R 항체, 항-EGFR 항체, 항-VEGFR 항체, 항-HER2 항체, 항-PDGFR 항체 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 특정 실시예에서, 외래 단백질은 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체 또는 이들의 임의의 조합이다. 예를 들어, 상기 외래 단백질은 항-PD-1 단쇄 항체이다.
바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 HSV-1 바이러스, HSV-2 바이러스 또는 HSV-1/HSV-2 키메라 바이러스(즉, 게놈이 HSV-1로부터 유래된 DNA 및 HSV-2로부터 유래된 DNA 둘 모두를 포함하는 재조합 HSV 바이러스)이다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 HSV-1 균주 KOS의 게놈으로부터 유래된다. 바람직한 특정 실시예에서, 상기 돌연변이 된 HSV 게놈은 GenBank: JQ673480.1에 제시된 게놈으로부터 유래된다.
바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능성 UL43 단백질, 기능성 UL41 단백질(즉, vhs 단백질), 기능성 UL48 단백질(즉, VMW65 단백질), 또는 이들의 임의의 조합을 발현할 수 있다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능성 UL43 단백질을 발현할 수 있다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능성 UL41 단백질을 발현할 수 있다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능성 UL43 단백질 및 기능성 UL41 단백질을 발현할 수 있다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능성 UL43 단백질 및 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능성 UL41 단백질 및 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능성 UL43 단백질, 기능성 UL41 단백질 및 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있다.
바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능성 UL43 단백질을 발현할 수 있는 UL43 유전자, 및 기능성 UL41 단백질을 발현할 수 있는 UL41 유전자(즉, vhs 유전자), 및/또는 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있는 UL48 유전자(즉, VMW65 유전자)를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능성 UL43 단백질을 발현할 수 있는 UL43 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능성 UL41 단백질을 발현할 수 있는 UL41 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있는 UL48 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능성 UL43 단백질을 발현할 수 있는 UL43 유전자 및 기능성 UL41 단백질을 발현할 수 있는 UL41 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능성 UL43 단백질을 발현할 수 있는 UL43 유전자 및 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있는 UL48 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능성 UL41 단백질을 발현할 수 있는 UL41 유전자 및 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있는 UL48 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능성 UL43 단백질을 발현할 수 있는 UL43 유전자, 기능성 UL41 단백질을 발현할 수 있는 UL41 유전자, 및 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있는 UL48 유전자를 포함한다.
바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 UL43 유전자, UL41 유전자(즉, vhs 유전자) 및/또는 UL48 유전자(즉, VMW65 유전자), 및 UL43 유전자, UL41 유전자 및/또는 UL48 유전자는 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는다. 바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는 UL43 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는 UL41 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는 UL48 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는 UL43 유전자 및 UL41 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는 UL43 유전자 및 UL48 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는 UL41 유전자 및 UL48 유전자를 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는 UL43 유전자, UL41 유전자 및 UL48 유전자를 포함한다.
바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 하나 이상의 비 필수 유전자가 결실 또는 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)되는 변형을 추가로 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 비 필수 유전자는 UL3 유전자, UL4 유전자, UL14 유전자, UL16 유전자, UL21 유전자, UL24 유전자, UL31 유전자, UL32 유전자, US3 유전자, UL51 유전자, UL55 유전자, UL56 유전자, US2 유전자, US12 유전자(즉, ICP47 유전자), LAT 유전자, JQ673480.1의 nt5853-nt7485에 상응하는 뉴클레오티드 단편, 및 이들의 임의의 조합이다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서, UL3 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서, UL4 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서, UL14 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서, UL16 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서, UL21 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서, UL24 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서, UL31 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서, UL32 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서, US3 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서, UL51 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서, UL55 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서, UL56 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서, US2 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서, US12 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서, LAT 유전자는 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서, JQ673480.1에 상응하는 nt5853-nt7485의 뉴클레오티드 단편이 결실되거나 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨)된다.
바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 하기 변형 중 하나 이상을 추가로 포함한다: UL55 유전자, US2 유전자, LAT 유전자, 및 JQ673480.1의 nt5853-nt7485에 상응하는 뉴클레오티드 단편 중 하나 이상에서의 결실 또는 돌연변이(예를 들어, 기능 손실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨). 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 하기 변형을 추가로 포함한다: UL55 유전자, US2 유전자, LAT 유전자, 및 JQ673480.1의 nt5853-nt7485에 상응하는 뉴클레오티드 단편의 결실 또는 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨).
바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서 필수 유전자는 결실되지 않으며 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서 필수 유전자의 코딩 서열은 결실되거나 돌연변이 되지 않는다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 모든 필수 유전자를 발현할 수 있다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 모든 필수 유전자를 포함하고, 필수 유전자 중 어느 것도 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는다. 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 모든 필수 유전자를 포함하고, 필수 유전자의 코딩 서열 중 어느 것도 돌연변이를 포함하지 않는다. 일반적으로, 상기 필수 유전자는 HSV 바이러스의 생존 및 복제에 필수적이므로, 따라서, 재조합 HSV 바이러스의 게놈에서, 필수 유전자 중 어느 것도 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는다. 그러나, 이러한 필수 유전자의 프로모터가 조작될 수 있으므로(예를 들어, 필수 유전자의 천연 프로모터가 hTERT의 프로모터와 같은 종양-특이적 프로모터로 대체될 수 있음), 이로써 본 발명의 재조합 HSV 바이러스의 기능/특성에 영향을 미치지 않으면서 재조합 HSV 바이러스의 안전성이 추가로 향상됨을 이해해야 한다. 따라서, 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈에서, 하나 이상의 필수 유전자의 천연 프로모터는 hTERT의 프로모터와 같은 종양-특이적 프로모터로 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, 필수 유전자는 ICP27 유전자, ICP4 유전자, VP5 유전자, gL 유전자, gH 유전자, gD 유전자, gK 유전자, gB 유전자, gN 유전자, UL5 유전자, UL6 유전자, UL8 유전자, UL9 유전자, UL12 유전자, UL25 유전자, UL26 유전자, UL28 유전자, UL29 유전자, UL30 유전자, UL33 유전자, UL36 유전자, UL38 유전자, UL42 유전자, UL48 유전자, UL52 유전자, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 상기 기재된 바와 같은 ICP0 유전자의 2개의 카피 및 ICP34.5 유전자의 2개의 카피를 제외하고는 야생형 HSV 바이러스의 다른 모든 유전자를 포함하고, 다른 유전자 중 어느 것도 기능상실 돌연변이를 포함하지 않는다. 그러나, 다른 유전자의 프로모터가 조작될 수 있으므로(예를 들어, 천연 프로모터가 hTERT의 프로모터와 같은 종양-특이적 프로모터로 대체될 수 있음), 이로써 본 발명의 재조합 HSV 바이러스의 기능/특성에 영향을 미치지 않으면서 재조합 HSV 바이러스의 안전성이 추가로 향상됨을 이해해야 한다. 따라서, 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 하기 변형을 추가로 포함한다: 하나 이상의 HSV 유전자의 천연 프로모터가 hTERT의 프로모터와 같은 종양-특이적 프로모터로 치환된다. 바람직한 특정 실시예에서, HSV 유전자는 VP5 유전자, ICP27 유전자 및 ICP4 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 추가로 포함한다:
(1) VP5 유전자의 천연 프로모터를 hTERT 프로모터와 같은 종양-특이적 프로모터로 치환하고;
(2) ICP27 유전자의 천연 프로모터를 hTERT 프로모터와 같은 종양-특이적 프로모터로 치환하고;
(3) ICP4 유전자의 천연 프로모터를 hTERT 프로모터와 같은 종양-특이적 프로모터로 치환하고;
(4) UL55 유전자, US2 유전자, LAT 유전자, 및 JQ673480.1의 nt5853-nt7485에 상응하는 뉴클레오티드 단편 중 하나 이상의 결실 또는 돌연변이(예를 들어, 기능상실 돌연변이를 포함하거나, 또는 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환됨);
바람직한 특정 실시예에서, 상기 hTERT 프로모터는 서열번호 5에 제시된 서열을 갖는다.
또한, 돌연변이 된 HSV 게놈은 또한 하나 이상의 외인성 뉴클레오티드 서열을 보유하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 특정 실시예에서, 돌연변이 된 HSV 게놈은 제5 외인성 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 바람직한 특정 실시예에서, 제5 외인성 뉴클레오티드 서열은 형광 단백질, 면역조절 폴리펩티드, 사이토카인, 케모카인, 항체 및 세포 독성 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된 외래 단백질을 코딩한다.
숙주 세포
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 HSV 바이러스에 감염되거나 본 발명에 따른 재조합 HSV 바이러스의 게놈을 포함하거나 본 발명에 따른 바이러스 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 이러한 숙주 세포는, 대장균 세포와 같은 원핵 세포, 및 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 동물 세포(예를 들어, 마우스 세포, 인간 세포 등과 같은 포유 동물 세포)와 같은 원핵 세포를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 재조합 HSV 바이러스는 종양 세포에서 높은 복제 능력을 갖지만, 정상 세포에서는 낮은 수준으로만 복제된다. 따라서, 바람직한 특정 실시예에서, 세포는 종양 세포이다. 이러한 종양 세포는 폐암 세포(예를 들어, H1299, H520, H1975, NCI-H358, 및 A549); 간암 세포(예를 들어, Huh7, Hep3B, HepG2, GSG7701, SMMC7721, Hepa1-6, BEL7404, PLC/PRF 및 QGY7703); 유방암 세포(예를 들어, MADMB231, MCF7 및 MADMB468); 골육종 세포(예를 들어, U2OS 및 SAOS2); 난소암 세포(예를 들어, SKOV3 및 CAOV3); 자궁 경부암 세포(예를 들어, SiHA 및 Hela); 전립선암 세포(예를 들어, PC-3); 신경 교종 세포(예를 들어, U87MG); 흑색종 세포(예를 들어, A375); 결장 직장암 세포(예를 들어, HCT116) 및 췌장암 세포(예를 들어, Panc-1)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
제조 방법
다른 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 본 발명의 재조합 HSV 바이러스의 제조 방법에 관한 것이다:
(1) 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계;
(2) 숙주 세포가 병변을 겪은 후, 숙주 세포를 수집하고 용해시켜 숙주 세포의 용해물을 수득하는 단계; 및
(3) 용해물로부터 본 발명의 재조합 HSV 바이러스를 회수하는 단계.
약학적 조성물
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 HSV 바이러스, 또는 본 발명에 따른 재조합 HSV 바이러스의 게놈, 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터, 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 폐암, 간암, 유방암, 골육종, 난소암, 전립선암, 신경 교종, 흑색종, 결장 직장암, 및 췌장암과 같은 종양의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지된 주사 투여와 같은 방법에 의해 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 특정 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 주사(예를 들어, 종양 내 주사)에 의해 투여된다. 바람직한 특정 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 주사용 용액 또는 동결 건조된 분말이다.
바람직한 특정 실시예에서, 재조합 HSV 바이러스 또는 재조합 HSV 바이러스 또는 바이러스 벡터의 게놈은 치료 유효량(예를 들어, 종양 치료에 대한 치료적 유효량)으로 존재한다. 바람직한 특정 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 단위 용량 형태로 제공된다. 예를 들어, 본 발명을 제한하려는 것은 아니지만, 약학적 조성물의 단위 용량 당 포함된 재조합 HSV 바이러스의 양은 102-103 pfu, 103-104 pfu, 104-105 pfu, 105-106 pfu, 106-107 pfu, 107-108 pfu 또는 108-109 pfu와 같은 102-109 pfu 일 수 있다.
사용/사용 방법
본 발명의 재조합 HSV 바이러스는 다양한 종양의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 재조합 HSV 바이러스, 또는 본 발명의 바이러스 벡터 또는 이의 약학적 조성물을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 종양의 치료 방법에 관한 것이다. 바람직한 특정 실시예에서, 상기 종양은 폐암, 간암, 유방암, 골육종, 난소암, 전립선암, 신경 교종, 흑색종, 결장 직장암 및 췌장암을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 특정 실시예에서, 대상체는 인간과 같은 포유동물이다. 바람직한 특정 실시예에서, 본 발명의 재조합 HSV 바이러스 또는 본 발명의 바이러스 벡터 또는 본 발명의 약학적 조성물은 주사(예를 들어, 종양 내 주사)에 의해 대상체에게 투여된다.
다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 종양을 치료하기 위한 약학적 조성물의 제조에 있어서의 본 발명의 재조합 HSV 바이러스 또는 본 발명의 바이러스 벡터의 용도에 관한 것이다. 바람직한 특정 실시예에서, 상기 종양은 폐암, 간암, 유방암, 골육종, 난소암, 전립선암, 신경 교종, 흑색종, 결장 직장암 및 췌장암을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 특정 실시예에서, 대상체는 인간과 같은 포유동물이다. 바람직한 특정 실시예에서, 약학적 조성물은 주사(예를 들어, 종양 내 주사)에 의해 투여된다. 바람직한 특정 실시예에서, 약학적 조성물은 주사용 용액 또는 동결 건조된 분말이다.
종래 기술의 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스에 비해, 본 발명의 재조합 HSV 바이러스는 종양세포에서 복제 능력이 높고, 여러 종양세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있지만, 정상 세포에서 복제 수준 및 사멸 능력을 현저히 감소시켰다. 또한, 본 발명의 재조합 HSV 바이러스는 동물에서 신경 독성이 현저하게 감소하고, 상당히 증가된 용량으로 동물에게 투여될 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, 기존의 재조합형 HSV 바이러스와 비교했을 때, 본 발명의 재조합 HSV 바이러스는 높은 수준의 종양 용해성 능력을 유지할 뿐만 아니라 상당히 개선된 안전성을 가지고 있어, 더 높은 용량으로 투여할 수 있으며, 적용 전망이 넓다.
도 1A는 재조합 바이러스 OVN의 구축 방법을 보여준다.
도 1B는 재조합 바이러스 OVH의 구축 방법을 보여준다.
도 2는 재조합 바이러스 HSV1716, NV1020, G207, OncoVexGM-CSF(T-VEC) 및 OVN에포함된 게놈 변형의 개략도이고; 상기 기호 "x"는 결실을 나타낸다.
도 3은 바이러스 균주 KOS와 비교하여 재조합 바이러스 OVN, OVH 및 dICP0에 포함된 게놈 변형의 개략도이고; 상기 기호 "x"는 결실을 나타낸다.
도 4는 바이러스 균주 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0의 게놈을 이용하여 ICP0 유전자, ICP34.5 유전자, ICP27 유전자 또는 hTERT 코어 프로모터를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 수득된 생성물의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 5는 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0의 IE 유전자 발현(mRNA)에 대한 실시간 정량적 PCR 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 L-O2 세포(도 6A) 또는 U-2 OS 세포(도 6B)의 감염 후 1의 MOI(multiplicity of infection of 1)에서 바이러스 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0로 48시간 동안의 바이러스 역가(virus titers)를 나타낸다.
도 7은 0.01의 MOI에서 바이러스 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0으로 단층 U-2 OS 세포의 감염 후 상이한 시점(12시간, 24시간, 36시간, 48시간 및 60시간)에서 바이러스 역가를 나타낸다. 도 7의 결과는 바이러스 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0가 종양 세포(예: U-2 OS 세포)에서 상당히 유사한 복제 능력을 가지고 있음을 보여준다.
도 8은 1의 MOI에서 바이러스성, OVN, OVH 또는 dICP0으로 72시간 동안 L-O2 세포(도 8A) 또는 U-2 OS 세포(도 8B)의 감염 후 세포 생존율을 나타낸다. 상기 MOCK은 바이러스에 감염되지 않은 세포를 나타낸다. 도 8의 결과는 바이러스 KOS, OVN, OVH 및 dICP0이 종양 세포(예: U-2 OS 세포)에서 실질적으로 유사한 세포 사멸 능력을 가지고 있지만, 바이러스 OVN과 OVH는 정상 세포(예: L-O2 세포)의 바이러스 KOS과 dICP0보다 상당히 낮은 세포 살상 능력을 가지고 있음을 보여준다.
도 9는 48시간 동안 바이러스 OVN 또는 OVH로 다양한 종양 세포를 감염시킨 후의 세포 생존율을 나타내고; 상기 MOCK은 바이러스에 감염되지 않은 종양 세포를 나타낸다. 도 9의 실험 결과는 재조합 바이러스 OVN 및 OVH가 다양한 종양 세포를 유의하게 사멸시킬 수 있음을 보여준다.
도 10은 주어진 용량에서 바이러스 KOS, dICP0, OVN 또는 OVH의 두개내 주입 후 마우스의 생존율을 나타낸다; 상기 대조군(Vehicle)은 바이러스를 주입하지 않은 마우스를 나타낸다.
도 11은 OVN 또는 OVH로 처리한 후 Huh7 세포를 접종한 누드 마우스의 종양 체적-시간 곡선(도 11A) 및 생존율-시간 곡선(도 11B)을 나타내고; 상기 DMEM은 처리되지 않은 마우스를 나타낸다.
도 12는 OVN 또는 OVH로 처리한 후 Hpa1-6 세포를 접종한 마우스(C57BL/6)의 좌측 측면 종양(도 12A) 및 우측 측면 종양(도 12B)의 종양 부피-시간 곡선을 나타내고; 상기 DMEM은 처리되지 않은 마우스를 나타낸다.
도 13은 재조합 바이러스 OVH, OVH1 및 OVH2와 재조합 바이러스 OVN 사이의 게놈 구조의 차이를 나타낸 개략도이고; 상기 재조합 바이러스 OVH의 ICP27 유전자의 천연(native) 프로모터 서열인 OVN과 비교되며, 재조합 바이러스 OVH2의 ICP4 유전자의 천연 프로모터 사열은 각각 hTERT 코어 프로모터 서열로 대체되었다.
도 14는 재조합 바이러스 d34.5/0lacZ, OVN, OVN-GFP, OVN-PD-1-scfv, OVH-GFP 및 OVH-PD-1-scfv 사이의 게놈 구조 차이의 개략도이고; 상기 "NULL"은 삭제를 나타낸다.
도 15는 재조합 바이러스 OVN-GFP 또는 OVH-GFP에 감염된 U-2 OS 세포의 형광 현미경 관찰 결과를 나타낸다.
도 16은 24시간 또는 48시간 동안 재조합 바이러스 OVH 또는 OVH-PD-1-scfv로 U-2 OS 세포를 감염시킨 후, PD-1/PD-L1의 특정 결합을 억제하는 세포 상등액의 능력(도 16A) 및 세포 상등액과 PD-1 단백질의 상호작용에 대한 분석 결과(도 16B)를 나타내며; 상기 MOCK은 바이러스에 감염되지 않은 종양 세포를 나타낸다.
도 17은 OVH 또는 OVH-PD-1-scfv로 처리한 후 Hpa1-6 세포를 접종한 마우스(C57BL/6)의 좌측 측면(도 17A) 및 오른쪽 측면(도 17B) 종양의 종양 부피-시간 곡선을 나타낸다. 상기 대조군은 미처리 마우스를 나타낸다.
도 18은 각각 0.01 MOI에서 바이러스 OVN, OVN-dUL41, OVN-dUL43, OVN-dUL48, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT 또는 OVN-dNF로 60시간 동안 U-2 OS 세포를 감염시킨 후의 바이러스 역가를 나타낸다.
도 19는 각각 0.5의 MOI로 OVN, OVN-dUL41, OVN-dUL43, OVN-dUL48, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT 또는 OVN-dNF를 72시간 동안 정상 세포(L-O2 세포, 도 19A) 또는 종양 세포(U-2 OS 세포, 도 19B)에 감염시킨 후의 세포 생존율을 나타낸다.
도 1B는 재조합 바이러스 OVH의 구축 방법을 보여준다.
도 2는 재조합 바이러스 HSV1716, NV1020, G207, OncoVexGM-CSF(T-VEC) 및 OVN에포함된 게놈 변형의 개략도이고; 상기 기호 "x"는 결실을 나타낸다.
도 3은 바이러스 균주 KOS와 비교하여 재조합 바이러스 OVN, OVH 및 dICP0에 포함된 게놈 변형의 개략도이고; 상기 기호 "x"는 결실을 나타낸다.
도 4는 바이러스 균주 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0의 게놈을 이용하여 ICP0 유전자, ICP34.5 유전자, ICP27 유전자 또는 hTERT 코어 프로모터를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 수득된 생성물의 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 5는 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0의 IE 유전자 발현(mRNA)에 대한 실시간 정량적 PCR 분석 결과를 나타낸다.
도 6은 L-O2 세포(도 6A) 또는 U-2 OS 세포(도 6B)의 감염 후 1의 MOI(multiplicity of infection of 1)에서 바이러스 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0로 48시간 동안의 바이러스 역가(virus titers)를 나타낸다.
도 7은 0.01의 MOI에서 바이러스 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0으로 단층 U-2 OS 세포의 감염 후 상이한 시점(12시간, 24시간, 36시간, 48시간 및 60시간)에서 바이러스 역가를 나타낸다. 도 7의 결과는 바이러스 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0가 종양 세포(예: U-2 OS 세포)에서 상당히 유사한 복제 능력을 가지고 있음을 보여준다.
도 8은 1의 MOI에서 바이러스성, OVN, OVH 또는 dICP0으로 72시간 동안 L-O2 세포(도 8A) 또는 U-2 OS 세포(도 8B)의 감염 후 세포 생존율을 나타낸다. 상기 MOCK은 바이러스에 감염되지 않은 세포를 나타낸다. 도 8의 결과는 바이러스 KOS, OVN, OVH 및 dICP0이 종양 세포(예: U-2 OS 세포)에서 실질적으로 유사한 세포 사멸 능력을 가지고 있지만, 바이러스 OVN과 OVH는 정상 세포(예: L-O2 세포)의 바이러스 KOS과 dICP0보다 상당히 낮은 세포 살상 능력을 가지고 있음을 보여준다.
도 9는 48시간 동안 바이러스 OVN 또는 OVH로 다양한 종양 세포를 감염시킨 후의 세포 생존율을 나타내고; 상기 MOCK은 바이러스에 감염되지 않은 종양 세포를 나타낸다. 도 9의 실험 결과는 재조합 바이러스 OVN 및 OVH가 다양한 종양 세포를 유의하게 사멸시킬 수 있음을 보여준다.
도 10은 주어진 용량에서 바이러스 KOS, dICP0, OVN 또는 OVH의 두개내 주입 후 마우스의 생존율을 나타낸다; 상기 대조군(Vehicle)은 바이러스를 주입하지 않은 마우스를 나타낸다.
도 11은 OVN 또는 OVH로 처리한 후 Huh7 세포를 접종한 누드 마우스의 종양 체적-시간 곡선(도 11A) 및 생존율-시간 곡선(도 11B)을 나타내고; 상기 DMEM은 처리되지 않은 마우스를 나타낸다.
도 12는 OVN 또는 OVH로 처리한 후 Hpa1-6 세포를 접종한 마우스(C57BL/6)의 좌측 측면 종양(도 12A) 및 우측 측면 종양(도 12B)의 종양 부피-시간 곡선을 나타내고; 상기 DMEM은 처리되지 않은 마우스를 나타낸다.
도 13은 재조합 바이러스 OVH, OVH1 및 OVH2와 재조합 바이러스 OVN 사이의 게놈 구조의 차이를 나타낸 개략도이고; 상기 재조합 바이러스 OVH의 ICP27 유전자의 천연(native) 프로모터 서열인 OVN과 비교되며, 재조합 바이러스 OVH2의 ICP4 유전자의 천연 프로모터 사열은 각각 hTERT 코어 프로모터 서열로 대체되었다.
도 14는 재조합 바이러스 d34.5/0lacZ, OVN, OVN-GFP, OVN-PD-1-scfv, OVH-GFP 및 OVH-PD-1-scfv 사이의 게놈 구조 차이의 개략도이고; 상기 "NULL"은 삭제를 나타낸다.
도 15는 재조합 바이러스 OVN-GFP 또는 OVH-GFP에 감염된 U-2 OS 세포의 형광 현미경 관찰 결과를 나타낸다.
도 16은 24시간 또는 48시간 동안 재조합 바이러스 OVH 또는 OVH-PD-1-scfv로 U-2 OS 세포를 감염시킨 후, PD-1/PD-L1의 특정 결합을 억제하는 세포 상등액의 능력(도 16A) 및 세포 상등액과 PD-1 단백질의 상호작용에 대한 분석 결과(도 16B)를 나타내며; 상기 MOCK은 바이러스에 감염되지 않은 종양 세포를 나타낸다.
도 17은 OVH 또는 OVH-PD-1-scfv로 처리한 후 Hpa1-6 세포를 접종한 마우스(C57BL/6)의 좌측 측면(도 17A) 및 오른쪽 측면(도 17B) 종양의 종양 부피-시간 곡선을 나타낸다. 상기 대조군은 미처리 마우스를 나타낸다.
도 18은 각각 0.01 MOI에서 바이러스 OVN, OVN-dUL41, OVN-dUL43, OVN-dUL48, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT 또는 OVN-dNF로 60시간 동안 U-2 OS 세포를 감염시킨 후의 바이러스 역가를 나타낸다.
도 19는 각각 0.5의 MOI로 OVN, OVN-dUL41, OVN-dUL43, OVN-dUL48, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT 또는 OVN-dNF를 72시간 동안 정상 세포(L-O2 세포, 도 19A) 또는 종양 세포(U-2 OS 세포, 도 19B)에 감염시킨 후의 세포 생존율을 나타낸다.
서열 정보의 설명
본 발명에 관련된 서열에 관한 정보는 표 1에 제공된다.
| 서열번호 | 설명 | 서열번호 | 설명 |
| 1 | GenBank: JQ673480.1의 nt33-nt5876 | 2 | LacZ의 유전자 서열 |
| 3 | GenBank: JQ673480.1의 nt112861-nt113422 of | 4 | GenBank: JQ673480.1의 nt113590-nt115194 |
| 5 | hTERT 코어(core) 프로모터 서열 | 6 | GenBank: JQ673480.1의 nt510(125731)-nt5439(120802) |
| 7 | GFP의 아미노산 서열 | 8 | PD-1 scFv의 아미노산 서열 |
| 9-16 | 프라이머 서열 | 17 | GenBank: JQ673480.1의 nt91088-nt92557 |
| 18 | GenBank: JQ673480.1의 nt94721-nt95968 | 19 | GenBank: JQ673480.1의 nt103527-nt104999 |
| 20 | GenBank: JQ673480.1의 nt115418-nt115978 | 21 | GenBank: JQ673480.1의 nt133911-nt134786 |
| 22 | GenBank: JQ673480.1의 nt4781-nt7062 | 23 | GenBank: JQ673480.1의 nt5853-nt7485 |
서열번호 1:
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서열번호 2:
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서열번호 3:
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서열번호 4:
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서열목록 5:
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서열목록 6:
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서열목록 7:
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
서열목록 8:
DVLMTQTPLFLPVSLGDQASIFCRSSQNIVHINGNTYLEWYLQKPGQFPKLLMYKVSNRFFGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSDVQVQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGSSITSDFAWEWIRQFPGNKLECMGYIGYSGGTIYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARWHGSSHWYFDVWGAGTTVTVSS
서열목록 17:
CTACTCGTCCCAGAATTTGGCCAGGACGTCCTTGTAGAACGCGGGTGGGGGGGCCTGGGTCCGCAGCTGCTCCAGAAACCTGTCGGCGATATCAGGGGCCGTGATATGCCGGGTCACAATAGATCGCGCCAGGTTTTCGTCGCGGATGTCCTGGTAGATAGGCAGGCGTTTCAGAAGAGTCCACGGCCCCCGCTCCTTGGGGCCGATAAGCGATATGACGTACTTAATGTAGCGGTGTTCCACCAGCTCGGTGATGGTCATGGGATCGGGGAGCCAGTCCAGGGACTCTGGGGCGTCGTGGATGACGTGGCGTCGCCGGCTGGCCACATAACTGCGGTGCTCTTCCAGCAGCTGCGCGTTCGGGACCTGGACGAGCTCGGGCGGGGTGAGTATCTCCGAGGAGGACGACCTGGGGCCGGGGTGGCCCCCGGTAACGTCCCGGGGATCCAGGGGGAGGTCCTCGTCGTCTTCGTATCCGCCGGCGATCTGTTGGGTTAGAATTTCGGTCCACGAGACGCGCATCTCGGTGCCGCCGGCGGCCGGCGGCAAAGGGGGCCTGGTTTCCGTGGAGCGCGAGCTGGTGTGTTCCCGGCGGATGGCCCGCCGGGTCTGAGAGCGACTCGGGGGGGTCCAGTGACATTCGCGCAGCACATCCTCCACGGAGGCGTAGGTGTTATTGGGATGGAGGTCGGTGTGGCAGCGGACAAAGAGGGCCAGGAACTGGGGGTAGCTCATCTTAAAGTACTTTAGTATATCGCGACAGTTGATCGTGGGAATGTAGCAGGCGCTAATATCCAACACAATATCACAGCCCATCAACAGGAGGTCAGTGTCTGTGGTGTACACGTACGCGACCGTGTTGGTGTGATAGAGGTTGGCGCAGGCATCGTCCGCCTCCAGCTGACCCGAGTTAATGTAGGCGTACCCCAGGGCCCGGAGAACGCGAATACAGAACAGATGCGCCAGACGCAGGGCCGGCTTCGAGGGCGCGGCGGACGGCAGCGCGGCTCCGGACCCGGCCGTCCCCCGGGTCCCCGAGGCCAGAGAGGTGCCGCGCCGGCGCATGTTGGAAAAGGCAGAGCTGGGTCTGGAGTCGGTGATGGGGGAAGGCGGTGGAGAGGCGTCCACGTCACTGGCCTCCTCGTCCGTCCGGCATTGGGCCGTCGTGCGGGCCAGGATGGCCTTGGCTCCAAACACAACCGGCTCCATACAATTGACCCCGCGATCGGTAACGAAGATGGGGAAAAGGGACTTTTGGGTAAACACCTTTAATAAGCGACAGAGGCAGTGTAGCGTAATGGCCTCGCGGTCGTAACTGGGGTATCGGCGCTGATATTTGACCACCAACGTGTACATGACGTTCCACAGGTCCACGGCGATGGGGGTGAAGTACCCGGCCGGGGCCCCAAGGCCCTGGCGCTTGACCAGATGGTGTGTGTGGGCAAACTTCATCATCCCGAACAAACCCAT
서열목록 18:
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서열목록 19:
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서열목록 20:
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서열목록 21:
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서열목록 22:
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서열목록 23:
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이하, 첨부된 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 당업자는 다음의 도면 및 예가 단지 본 발명을 예시하고 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해할 것이다. 본 발명의 다양한 목적 및 유리한 양태는 하기 도면 및 바람직한 실시예의 상세한 설명에 따라 당업자에게 명백할 것이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 모델
본 발명은 다음의 실시예를 참조로 설명되며, 이는 예시하기 위한 것이므로 본 발명을 제한하지 않는다.
달리 명시되지 않는 한, 본 출원에 사용된 분자 생물학 실험 방법, 바이러스 실험 방법, 면역 분석법, 및 동물 실험 방법은 모두 당업자에 의해 통상적으로 사용되는 실험 방법이다. 예를 들어, 분자 생물학 실험 방법은 문헌 J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, and F. M. Ausubel et al., Guide to Molecular Biology Experiments, 3rd edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995에 설명된 방법일 수 있다. 각각의 실시예에서 사용된 시약(예를 들어, 효소, 플라스미드, 및 프라이머)은 상업적 회사로부터 구입하였고, 다양한 시약(예를 들어, 효소)을 제조업체가 권장하는 조건으로 사용하였다. 당업자는 실시예가 본 발명을 예시하고, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해할 것이다.
실시예 1. 재조합 바이러스 OVN 및 OVH의 구축
(1.1) 헤르페스 심플렉스 바이러스 타입 1(HSV-1)의 배양 및 역가 결정
야생형 HSV-1 균주 KOS는 ATCC(Cat. No. VR-1493TM)로부터 구입하였고, 전체 게놈 정보는 NCBI(GenBank: JQ673480.1)에 공지되었다. 배양된 베로(Vero) 세포(ATCC, USA, Cat. No. CCL-81TM에서 구입)를 0.1의 MOI에서 균주 KOS로 감염시켰다. 48시간 후, 모든 세포를 세포 스크레이퍼로 수집하고 원심분리하여 세포 배양 배지를 제거하였다. 수득된 세포 침전물을 새로운 완전 배지에 재현탁시키고 -80℃에서 저장하였다. 이어서, 상기 세포 현탁액을 반복적으로 동결-해동한 후(3회) 원심분리하고, 상등액을 수집하여 바이러스 용액을 얻었다. 상기 바이러스 용액을 분취하여 -80℃에서 보관하였다.
U-2 OS 세포(미국 ATCC, 카탈로그 번호 HTB-96TM에서 구입)를 1 x 106 세포의 밀도로 6 cm 배양 플레이트에 접종하였다. 세포를 단층으로 성장시킨 후, 상기에서 수득한 바이러스 용액을 10배 연속 희석한 후, 세포를 각각 다른 희석 구배의 바이러스 용액(500ul)으로 감염시켰다. 감염 75분 후, 세포 배양 배지를 폐기하고, 5 mL의 새로운 완전 배지를 첨가하고, 세포를 추가로 배양하였다. 2시간 후, 10 mL의 메틸셀룰로스 배지를 첨가하고, 플레이트를 인큐베이터에 2일 동안 두었다. 이어서, 0.01% 중성 적색을 포함하는 기초 배지를 플레이트에 첨가하고 12시간 동안 배양을 계속하였다. 배양 완료 후, 모든 세포 배양 배지를 버리고, 각 배양 플레이트의 플라크를 세었다. 각 배양 플레이트의 플라크 수 및 바이러스 용액의 희석 계수에 따라, 바이러스 역가는 다음 식에 따라 계산되었다: 바이러스 역가(PFU/mL)= 플레이트 당 플라크 수 x 2 x 바이러스 희석 계수.
(1.2) 재조합 플라스미드의 구축
야생형 HSV-1 바이러스 게놈(GenBank: JQ673480.1)의 33번째 염기(nt33) 내지 5876번째 염기(nt5876) 사이의 서열(서열번호 1)을 상업적으로 이용 가능한 PUC57 벡터(상하이 성공)에 클로닝)에 제한 효소 SacI 및 PstI를 사용하여 클로닝하여 플라스미드 PUC57-F0를 수득하였다. 이어서, 플라스미드 PUC57-F0에서 NcoI 및 SalI 절단 부위 사이의 서열을 제한엔도뉴클레이즈 NcoI 및 SalI를 사용하여 LacZ(서열번호 2)의 유전자 서열로 치환하여 플라스미드 PUC57-d34.5/0lacZ를 수득하였다. 또한, 플라스미드 PUC57-F0의 NcoI 및 SalI 절단 부위 사이의 서열도 절단하여 플라스미드 PUC57-d34.5/0을 수득하였다.
(1.3) 재조합 바이러스 OVN 및 OVH의 구축 및 식별
재조합 바이러스 OVN 및 OVH의 구축 전략은 각각 도 1A-1B에 도시되어 있다.
(1.3.1) 재조합 바이러스 d34.5/0lacZ의 구축
U-2 OS 세포를 웰당 1 x 105 세포의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종하고 세포 배양 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 재조합 플라스미드 PUC57-d34.5/0lacZ를 형질감염 시약 리포펙타민 2000을 사용하여 U-2 OS 세포로 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 세포를 3의 MOI에서 바이러스 균주 KOS로 감염시켰다. 세포 변성 효과가 관찰된 후, 세포를 수확하였다. 회수한 세포를 동결-융해 법을 반복하여 용해한 후 원심분리하고, 상등액을 회수하여 바이러스 용액을 얻었다. 얻어진 바이러스 용액의 바이러스 역가를 측정하였다.
수거된 바이러스를 단층의 U-2 OS 세포가 배양된 배양 플레이트에 접종하였다. 2일 동안 배양한 후, 0.01% 중성 적색 및 100 ug/mL X-gal을 포함하는 기초 배지를 배양 플레이트에 균일하게 첨가하고, 세포를 12시간 동안 추가로 배양하였다. 이어서, 배양 플레이트 상에 나타나는 청색 플라크를 선택하고, 청색 플라크로부터 수득된 바이러스를 모노클로날화하여(3회) 재조합 바이러스 d34.5/0lacZ를 수득 하였다. 시퀀싱에 의해 확인된 후, 재조합 바이러스 d34.5/0lacZ 게놈에서 ICP34.5 및 ICP0 유전자의 2개의 카피가 균주 KOS와 비교하여 lacZ 유전자로 치환된 것으로 밝혀졌다.
(1.3.2) 재조합 바이러스 OVN(d34.5/0)의 구축
U-2 OS 세포를 웰당 1 x 105 세포의 밀도로 24-웰 플레이트에 접종하고 세포 배양 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 재조합 플라스미드 PUC57-d34.5/0을 형질감염 시약 리포펙타민 2000을 사용하여 U-2 OS 세포로 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 세포를 3의 MOI에서 재조합 바이러스 d34.5/0lacZ로 감염시켰다. 세포병리학적 효과가 관찰된 후 세포를 수확하였다. 회수한 세포를 동결-해동 방법을 반복하여 용해한 후 원심분리하고, 상등액을 회수하여 바이러스 용액을 얻었다. 얻어진 바이러스 용액의 바이러스 역가를 측정하였다.
수확된 바이러스를 단층의 U-2 OS 세포가 배양된 배양 플레이트에 접종하였다. 2일 동안 배양한 후, 0.01% 중성 적색 및 100 ug/mL X-gal을 포함하는 기초 배지를 배양 플레이트에 균일하게 첨가하고, 세포를 12시간 동안 추가로 배양하였다. 이어서, 배양 플레이트 상에 나타나는 백색 플라크를 선택하고, 백색 플라크로부터 수득된 바이러스를 모노클로날화하여(3회) 재조합 바이러스 OVN(d34.5/0)을 수득하였다. 시퀀싱에 의해 확인된 후, lacZ 유전자의 2개의 카피는 재조합 바이러스 d34.5/0lacZ와 비교하여 재조합 바이러스 OVN(d34.5/0) 게놈에서 결실되었고; 야생형 HSV-1 게놈(GenBank: JQ673480.1)의 nt510 내지 nt5439(서열번호 6) 및 nt120802 내지 nt125731(서열번호 6)의 서열은 균주 KOS와 대비하여 재조합 바이러스 OVN(d34.5/0)에서 결실되었다.
(1.3.3) 재조합 바이러스 OVH의 구축
야생형 HSV-1 바이러스 게놈(GenBank: JQ673480.1)의 염기 112861(nt112861) 내지 113422(nt113422)(서열번호 3)의 서열을 제한엔도뉴클레이즈 SacI 및 PmeI를이용하여 상업적으로 이용가능한 PUC57 벡터에 클로닝함으로써 플라스미드 PUC57-27p0를 얻었다. 이어서, 야생형 HSV-1 바이러스 게놈(GenBank: JQ673480.1)의 염기 113590(nt113590) 내지 염기 115194(nt115194)(서열번호 4)의 서열을 사용하여 플라스미드 PUC57-27p0에 클로닝하였다. 제한효소 SpeI 및 PstI에 의해 플라스미드 PUC57-27p1을 수득하였다. 플라스미드 PUC57-27p1에서, ICP27 유전자의 천연 프로모터 서열(야생형 HSV-1 게놈의 nt113422 내지 nt113590(GenBank: JQ673480.1))이 결실되었다.
이어서, 플라스미드 PUC57-27p1에서 PmeI 및 SpeI 절단 부위 사이의 서열을 LacZ 발현 서열(서열번호 2)로 치환하여 플라스미드 PUC57-27p/lacZ를 수득하였다. 또한, 플라스미드 PUC57-27p1에서 PmeI 및 SpeI 절단 부위 사이의 서열은 성인 텔로머레이즈 역전사 효소 hTERT의 핵심 프로모터 서열로 대체되었고(서열번호 5; Takakura M, Kyo S, Kanaya T, et al. Cloning of human telomerase catalytic subunit (hTERT) gene promoter and identification of proximal core promoter sequences essential for transcriptional activation in immortalized and cancer cells [J]. Cancer Res, 1999, 59 (3): 551-557), 이로써 플라스미드 PUC57-27p/htert를 수득하였다. 플라스미드 PUC57-27p/htert에서, ICP27 유전자는 종양-특이적 프로모터(즉, hTERT 코어 프로모터)에 의해 조절되었다.
이어서, (1.3.1) 및 (1.3.2)에 기재된 구축 방법을 참조하면, 재조합 바이러스 OVN을 출발 바이러스로 사용하였고, hTERT 코어 프로모터 서열을 플라스미드 PUC57-27p/lacZ 및 PUC57-27p/htert를 사용하여 ICP27 유전자를 조절하여 재조합 바이러스 OVN 게놈에 도입함으로써 재조합 바이러스 OVH를 구축하였다. 시퀀싱에 의해 확인된 후, ICP27 유전자의 천연 프로모터 서열(야생형 HSV-1 게놈의 nt113423 내지 nt113589(GenBank: JQ673480.1))은 재조합 바이러스 OVN과 비교하여 재조합 바이러스 OVH 게놈에서 hTERT 코어 프로모터(서열번호 5)로 대체되었다.
(1.4) 재조합 바이러스 OVN 및 OVH와 알려진 재조합 HSV 바이러스의 비교
현재, 예를 들어 HSV1716, NV1020, G207, OncoVexGM-CSF(T-VEC) 등을 포함하는 다양한 재조합 HSV 바이러스가 종양 요법에 사용하기 위해 개발되었다. 이들 재조합 HSV 바이러스 및 본 발명의 재조합 바이러스 OVN 및 OVH에 포함된 게놈 변형은 하기 표 2에 요약되어 있다.
| 명칭 | 유전학적 변형 | 국가 |
| HSV1716 | ICP34.5의 2개 카피 결실 | UK |
| NV1020 | UL/US 연접의 15kb 단편 결실(예를 들어, ICP34.5, ICP0, ICP4 및 UL56의 1개 카피 결실) | USA |
| G207 | ICP34.5 및 ICP6의 2개 카피 결실 | USA |
| OncoVexGM-CSF（T-VEC） | ICP34.5 및 ICP47의 2개 카피 결실 | USA |
| OVN | (ICP34.5 및 ICP0)의 2개 카피 결실 | China |
| OVH | (ICP34.5 및 ICP0)의 2개 카피 결실, ICP27 유전자의 천연 프로모터 hTERT 코어 프로모터로 대체 | China |
도 2는 재조합 바이러스 HSV1716, NV1020, G207, OncoVexGM-CSF(T-VEC) 및 OVN에 포함된 게놈 변형의 개략도이다.
실시예 2. 재조합 바이러스 OVN 및 OVH의 특성
재조합 바이러스 dICP0는 균주 KOS와 비교하여 ICP0 유전자의 2개의 카피를 결실시킨 실시예 1에 기재된 방법을 참조하여 구축하였다. 바이러스 균주 KOS 및 재조합 바이러스 dICP0를 재조합 바이러스 OVN 및 OVH를 특성화하기 위한 대조군 바이러스로서 사용하였다. 도 3은 바이러스 균주 KOS와 비교하여 재조합 바이러스 OVN, OVH 및 dICP0에 포함된 게놈 변형의 개략도이다. 재조합 바이러스 dICP0는 바이러스 균주 KOS와 비교하여 ICP0 유전자의 2개 카피의 결실을 갖고; 재조합 바이러스 OVN은 ICP34.5 유전자의 2개 카피 및 ICP0 유전자의 2개 카피의 결실을 갖고; 재조합 바이러스 OVH는 ICP34.5 유전자의 2개 카피 및 ICP0 유전자의 2개 카피의 결실을 갖고, ICP27 유전자의 천연 프로모터는 hTERT 코어 프로모터로 대체되었다.
재조합 바이러스 OVN, OVH 및 dICP0에서의 유전자 결실을 PCR에 의해 확인하였다. 간단히, ICP0 유전자, ICP34.5 유전자, ICP27 유전자 또는 hTERT 코어 프로모터의 특이적 증폭을 위한 프라이머를 사용하고 바이러스 균주 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0의 게놈을 주형으로 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머는 표 3에 요약되어 있다.
| 서열번호 | 프라이머 명칭 | 서열 (5'-3') |
| 9 | ICP0-F | GACGTGTGCGCCGTGTGCACGGATGA |
| 10 | ICP0-R | ACTCTGTTCTTGGTTCGCGGCCTGAGCCA |
| 11 | ICP34.5-F | ATGGCCCGCCGCCGCCATCGC |
| 12 | ICP34.5-R | TTAGACCGAGTTCGCCGGGC |
| 13 | ICP27-F | ATGGCGACTGACATTGATATGCTAATTGA |
| 14 | ICP27-R | CTAAAACAGGGAGTTGCAATAAAAATATTTGC |
| 15 | htertp-F | CTCCCAGTGGATTCGCGGGCACAGAC |
| 16 | htertp-R | CTGCCTGAAACTCGCGCCGCGAGGA |
반응이 완료된 후, PCR 생성물을 겔 전기 영동에 의해 분석하였다. 결과는 도 4에 도시되어 있다. 도 4는 주형으로서 바이러스 균주 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0의 게놈을 사용하여 PCR에 의해 수득된 생성물의 겔 전기영동 결과 및 ICP0 유전자, ICP34.5 유전자, ICP27 유전자 또는 hTERT 코어 프로모터를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머를 나타낸다; 레인 1은 DNA 분자량 마커를 나타내고; 레인 2는 주형으로서 바이러스 균주 KOS 게놈을 사용하는 PCR 생성물을 나타내고; 레인 3은 주형으로서 재조합 바이러스 dICP0 게놈을 사용하는 PCR 산물을 나타내고; 레인 4는 주형으로서 재조합 바이러스 OVN 게놈을 사용하는 PCR 산물을 나타내고; 레인 5는 주형으로서 재조합 바이러스 OVH 게놈을 사용하는 PCR 산물을 나타내고; 레인 6은 주형으로서 물을 사용하는 PCR 생성물을 나타낸다.
도 4의 결과는 바이러스 균주 KOS의 게놈이 ICP0 유전자, ICP34.5 유전자 및 ICP27 유전자를 포함하지만 hTERT 코어 프로모터를 포함하지 않았고; 재조합 바이러스 dICP0의 게놈은 ICP34.5 유전자 및 ICP27 유전자를 포함하지만, ICP0 유전자 및 hTERT 코어 프로모터를 포함하지 않았으며; 재조합 바이러스 OVN의 게놈은 ICP27 유전자를 포함하지만, ICP34.5 유전자, ICP0 유전자 및 hTERT 코어 프로모터를 포함하지 않았으며; 재조합 바이러스 OVH의 게놈은 ICP27 유전자 및 hTERT 코어 프로모터를 포함하지만, ICP34.5 유전자 및 ICP0 유전자는 포함하지 않았음을 나타낸다.
또한, 실시간 정량적 PCR을 이용하여 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0 감염 후 세포의 유전자 발현(mRNA)을 분석하였다. 간략하게, U-2 OS 숙주 세포는 각각 KOS, OVN, OVH 및 dICP0에 감염되었다. 세포 변성 효과가 관찰된 후, 세포를 수확하고 총 mRNA를 추출하였다. 전체 mRNA를 cDNA로 역전사하고, ICP0 유전자, ICP34.5 유전자 또는 ICP27 유전자를 각각 증폭시키는 프라이머를 사용하여 실시간 정량적 PCR을 수행하였다. 결과는 도 5에 도시하였다.
도 5는 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0의 IE 유전자 발현(mRNA)의 실시간 정량적 PCR 분석 결과를 보여준다. 도 5의 결과는 균주 KOS가 ICP0 유전자, ICP34.5 유전자 및 ICP27 유전자를 발현할 수 있음을 나타내고; 재조합 바이러스 dICP0는 ICP34.5 유전자 및 ICP27 유전자를 발현할 수 있었지만, ICP0 유전자는 발현하지 않았음을 나타내며; 재조합 바이러스 OVN 및 OVH는 ICP27 유전자를 발현할 수 있었지만, ICP34.5 유전자 또는 ICP0 유전자는 발현하지 않았음을 나타낸다. 이는 재조합 바이러스 dICP0가 ICP0 유전자의 2개의 카피를 결실시켰으며, ICP0 단백질은 숙주 세포의 감염 후에 발현될 수 없음을 나타내고; 재조합 바이러스 OVN 및 OVH는 둘 다 ICP34.5 유전자 및 ICP0 유전자의 2개의 카피를 결실시켰으므로, ICP0 단백질 및 ICP34.5 단백질은 숙주 세포의 감염 후에 발현될 수 없었음을 나타낸다.
실시예 3. 재조합 바이러스 OVN/OVH의 복제 능력 및 사멸 능력의 평가
대수 성장기의 정상 세포(L-O2 세포) 및 종양 세포(U-2 OS 세포)를 6 cm 배양 플레이트에 5-7.5 x 106 세포/플레이트의 밀도로 접종하였다. 이어서, 배양된 세포를 1의 MOI에서 바이러스 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0로 감염시켰다. 48시간의 감염 후, 세포의 상태를 현미경으로 관찰하고 사진을 찍었다. 이어서, 바이러스에 감염된 세포를 소화시키고, 세포의 생존율을 트리판 블루 염색에 의해 계산하였다. 세포 생존율(%)= (바이러스에 감염된 후 생존 세포의 수)/(바이러스에 감염되지 않은 대조 세포의 수) x 100. 각 실험 그룹에 대해 3-웰 복제물을 설정하고 실험 결과는 평균 3회의 독립적인 실험의 평균이었다. 또한, 바이러스 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0으로 정상 세포(L-O2 세포) 및 종양 세포(U-2 OS 세포)를 감염시킨 후 상이한 시점에서 바이러스 역가를 실시예 1에 기재된 프로토콜을 참조하여 결정하였다. 각 그룹의 실험에 대해 3-웰 복제를 설정하였고 실험 결과는 3회의 독립적 실험의 평균이었다. 실험 결과는 도 6-8에 도시되었다.
도 6은 1의 MOI에서 바이러스 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0에 의한 L-O2 세포(도 6A) 또는 U-2 OS 세포(도 6B)의 48시간 감염 후 바이러스 역가를 도시한다. 도 6A에서, 바이러스 KOS 및 dICP0 둘 다 L-O2 세포의 감염 후 높은 수준의 복제를 보였고, 그들의 바이러스 역가는 48시간의 감염 후 대략 1.94 x 107 및 3.01 x 106 pfu/ml에 도달하였다; 바이러스 OVN 및 OVH의 복제 능력은 유의하게 감소하였고, 바이러스 역가는 48시간의 감염 후 단지 약 2.14 x 105 및 1.85 x 103 pfu/ml였다. 도 6b의 결과는 바이러스 KOS, OVN, OVH 및 dICP0가 U-2 OS 세포의 감염 후 높은 수준의 복제를 보였으며, 그들의 바이러스 역가는 48시간의 감염 후 1.01-1.83 x 108 pfu/ml였다는 것을 보여준다. 이들 결과는 바이러스 KOS 및 dICP0가 정상 세포(예를 들어, L-O2 세포) 및 종양 세포(예를 들어, U-2 OS 세포)에서 높은 수준으로 복제될 수 있음을 나타내고; 반면 바이러스 OVN 및 OVH는 종양 세포(예를 들어, U-2 OS 세포)에서만 높은 수준으로 복제할 수 있었으며(복제 능력은 바이러스 KOS 및 dICP0에 비해 약간만 감소), 복제 능력은 정상 세포(예를 들어, L-O2 세포)에서 유의하게 감소하였다. 예를 들어, L-O2 세포에서, 바이러스 OVN 및 OVH의 복제 능력은 바이러스 KOS의 복제 능력과 비교하여 각각 약 90배 및 104배 감소하였다; 바이러스 OVN 및 OVH의 복제 능력은 바이러스 dICP0의 복제 능력과 비교하여 각각 약 14 배 및 1.6 x 103 배 감소하였다.
도 7은 0.01의 MOI에서 바이러스 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0로 단층 U-2 OS 세포의 감염 후 상이한 시점(감염 후 12시간, 24시간, 36시간, 48시간 및 60시간)에서의 바이러스 역가를 보여준다. 도 7의 결과는 바이러스 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0가 종양 세포(예를 들어, U-2 OS 세포)에서 실질적으로 유사한 복제 능력을 가짐을 보여준다.
도 8은 1의 MOI에서 바이러스 KOS, OVN, OVH 또는 dICP0로 L-O2 세포(도 8A) 또는 U-2 OS 세포(도 8B)를 감염시킨 72시간 후의 세포 생존율을 나타낸다; 여기서 MOCK는 바이러스에 감염되지 않은 세포를 나타낸다. 도 8a의 결과는 감염 72시간 후, 바이러스 KOS 및 dICP0 대 L-O2 세포의 사멸 능력이 각각 약 91.5% 및 89%(둘 다 L-O2 세포에 대한 사멸 능력을 가짐); L-O2 세포에 대한 바이러스 OVN 및 OVH의 사멸 능력은 각각 약 42% 및 5%였다(그들의 L-O2 세포에 대한 사멸 능력은 상당히 감소되었다). 도 8b의 결과는 바이러스 KOS, OVN, OVH 및 dICP0가 72시간 동안 감염 후 U-2 OS 세포의 100%를 사멸시킬 수 있음을 보여준다(모두 U-2 OS 세포에 대해 매우 강한 사멸 능력을 가짐). 이들 결과는 바이러스 KOS 및 dICP0가 정상 세포(예를 들어, L-O2 세포) 및 종양 세포(예를 들어, U-2 OS 세포)에 대해 매우 높은 사멸 능력을 가졌음을 나타내고; 바이러스 OVN 및 OVH는 종양 세포(예를 들어, U-2 OS 세포)에 대해서만 높은 사멸 능력을 가졌지만(그의 사멸 능력은 바이러스 KOS 및 dICP0의 사멸 능력과 실질적으로 동일함), 그러나 그들의 사멸 능력은 정상 세포에 대한 사멸 능력(예를 들어, L-O2 세포)가 유의하게 감소하였다. 예를 들어, L-O2 세포에서 바이러스 OVN 및 OVH의 사멸 능력은 바이러스 KOS와 비교하여 각각 약 54.1% 및 94.5% 감소하였다; 바이러스 OVN 및 OVH의 사멸 능력은 바이러스 dICP0에 비해 각각 약 52.8% 및 94.4% 감소하였다.
도 6-8의 실험 결과는 야생형 바이러스 KOS 및 재조합 바이러스 dICP0와 비교하여, 정상 세포에서의 재조합 바이러스 OVN 및 OVH의 복제 능력 및 사멸 능력이 현저히 감소되는 반면, 이들의 복제 능력 및 종양 세포에서의 사멸 능력은 실질적으로 동일(또는 약간 감소)하였다. 이는 본 발명의 재조합 바이러스 OVN 및 OVH가 종양 세포에서 높은 복제 능력 및 높은 사멸 능력(좋은 항 종양 활성으로)을 유지할 뿐만 아니라 정상 세포에 대한 독성을 상당히 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 재조합 바이러스 OVN 및 OVH는 항 종양 치료에 유용하며, 정상 세포에 대해 더 높은 안전성을 가지며 더 높은 용량으로 사용될 수 있다.
또한, 다양한 종양 세포에 대한 재조합 바이러스 OVN 및 OVH의 사멸 능력 또한 상기 기재된 방법을 참조하여 결정되었다. 간략하게, 양호한 상태의 대수 성장기의 종양 세포를 6 cm 배양 플레이트에 5-7.5 x106 세포/플레이트의 밀도로 접종하였다. 이어서, 배양된 종양 세포를 1의 MOI에서 바이러스 OVN 또는 OVH로 감염시켰다. 감염 48시간 후, 감염된 종양 세포를 소화시키고, 트립판 블루 염색에 의해 종양 세포의 생존율을 계산하였다. 본 실험에서는 바이러스에 감염되지 않은 세포를 대조군으로 사용하였다. 세포 생존율(%)= (바이러스에 감염된 후 생존 세포의 수)/(바이러스에 감염되지 않은 대조 세포의 수) x 100. 각 실험 그룹에 대해 3-웰 복제물을 설정하고 실험 결과는 평균 3개의 독립적인 실험의 평균이었다. 실험 결과는 도 9에 도시되어 있다.
도 9는 48시간 동안 바이러스 OVN 또는 OVH로 다양한 종양 세포를 감염시킨 후의 세포 생존율의 결과를 보여준다; 여기서 MOCK는 바이러스에 감염되지 않은 종양 세포를 나타낸다. 도 9의 실험 결과는 재조합 바이러스 OVN 및 OVH가 예를 들어 폐암 세포 H1299, H520, H1975, NCI-H358 및 A549(5 균주); 간암 세포 Huh7, Hep3B, HepG2, GSG7701, SMMC7721, Hepa1-6, BEL7404, PLC/PRF, QGY7703(9 균주); 유방암 세포 MADMB231, MCF7, MADMB468(3 균주); 골육종 세포 U2OS 및 SAOS2(2 균주); 난소암 세포 SKOV3 및 CAOV3(2 균주); 자궁 경부암 세포 SiHA 및 Hela(2 균주); 전립선 암 세포 PC-3(1 균주); 신경 교종 세포 U87MG(1 균주); 흑색종 A375(1 균주); 결장 직장암 HCT116(1 균주) 및 췌장암 Panc1(1 균주);를 포함하는 다양한 종양 세포를 유의하게 사멸시킬 수 있음을 보여준다; OVN 및 OVH는 유사한 종양 사멸 능력을 가졌다. 이들 실험 결과는 본 발명의 재조합 바이러스 OVN 및 OVH가 다양한 종양 세포에 대해 우수한 사멸 활성을 가지며 종양 치료에 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 4. 재조합 바이러스 OVN/OVH의 신경 독성 및 생체 내 안전성 평가
헤르페스 바이러스는 신경 독성이고 신경학적으로 잠재되어 있으며, 가장 큰 위험은 인간이나 동물의 중추 신경계를 감염시켜 뇌염과 같은 심각한 부작용을 초래할 수 있는 위험이다. 따라서 헤르페스 바이러스의 안전성을 평가하는 가장 직접적이고 민감한 방법은 바이러스를 어린 마우스에 두개 내(intracranially)로 주입하고 바이러스에 의한 마우스 중추 신경계의 직접적인 사멸을 평가하는 것이다. 이 예에서, 우리는 바이러스의 두개 내 주사에 의해 유도된 마우스 뇌염 모델을 사용하여 마우스에서 다양한 재조합 HSV-1 바이러스의 신경 독성 및 안전성을 평가하였다.
간략하게, 4-6주령 BALB/c 암컷 마우스(n= 10)를 실험 대상으로 사용하였고, 20 ul의 바이러스를 뇌의 좌측 전엽에서 관상 봉합사 및 시상 봉합사의 접합부 근처에 두개 내로 천천히 주사하였다. 주사 후, 생쥐의 발병률 및 생존이 매일 관찰되었다. 도 10은 주어진 용량에서 바이러스 KOS, dICP0, OVN 또는 OVH의 두개 내 주사 후 마우스의 생존율을 나타낸다; 비히클은 바이러스를 주사하지 않은 마우스를 나타낸다.
결과는 1 x 104 PFU의 야생형 바이러스 KOS의 두개 내 주사 시, 마우스의 100%가 중등도 내지 중증의 부작용을 나타내었다; 질병의 발병 후, 생쥐는 종종 모발 상승, 식욕 부진, 감기, 확장 및 심지어 마비와 같은 증상을 동반하였다; 바이러스 주사 후 4-6일 이내에 마우스의 100%가 죽었다(도 10). 바이러스 dICP0의 1 x 105 PFU의 두개 내 주사시, 바이러스 주사 후 4-8일 이내에 마우스의 약 80%가 사망하였고, 마우스의 20%만이 일주일 후에 점차적으로 회복되었다.
바이러스 OVN의 고용량(1 x 107 PFU)을 두개 내 주사한 경우, 전체 실험 기간 동안 마우스(0/10)가 죽지 않았으며, 마우스의 생존율은 100%였다. 이는 야생형 바이러스 KOS 및 재조합 바이러스 dICP0에 비해 바이러스 OVN의 신경 독성이 현저히 감소하고 생체 내 안전성이 현저하게 개선되었으며 사용된 용량은 각각 최소 1000 배 및 100 배 증가할 수 있음을 나타낸다.
바이러스 OVN의 고용량(4 x 107 PFU)을 두개 내 주사한 경우, 전체 실험 기간 동안 단 하나의 마우스(1/10)만 사망하였고, 마우스 생존율은 90%였다. 이는 바이러스 OVN이 마우스에서 반 치사 용량이 4 x 107 PFU보다 높으므로 생체 내 안전성이 우수함을 나타낸다.
바이러스 OVH의 4 x 107 PFU를 두개 내 주사할 때, 전체 실험 기간 동안 마우스(0/10)는 죽지 않았으며, 마우스 생존율은 100%였다. 더욱 중요한 것은 실험 기간 내내 마우스가 부작용을 보이지 않았다는 것이다. 이는 바이러스 OVH가 바이러스 OVN과 비교하여 신경 독성을 추가로 현저하게 감소시키고 생체 내 안전성을 추가로 향상시켰음을 나타낸다.
상기 실험 결과는 본 발명의 바이러스 OVN 및 OVH가 신경 독성이 낮고 생체 내 안전성이 높으며 응용 가능성이 광범위하다는 것을 보여준다.
실시예 5. 재조합 바이러스 OVN/OVH의 치료 가능성 평가
종양 세포(Huh7 및 Hepa1-6)를 37℃ 5% CO2 인큐베이터에서 10% 송아지 혈청을 포함하는 완전한 배지에서 배양하였다. 세포가 대수 성장기로 성장할 때, 세포를 0.05% 트립신으로 분해하고 PBS로 세척하여 PBS에 재현탁된 세포 현탁액(세포 밀도 5 x 107/mL)을 얻었다.
0.1 mL의 Huh7 세포 현탁액을 5-6주령 누드 마우스 각각의 우측 옆구리에 피하로 접종하였다. 마우스의 종양이 6 mm x 6 mm로 성장할 때(종양 부피는 대략 100 mm3), 마우스를 그룹화하고(n= 8/그룹), 치료를 시작하였다(0 일). 치료 요법은 다음과 같았다: 1 x 107 PFU 바이러스(OVN 또는 OVH) 또는 동일한 부피의 DMEM(대조군으로 사용됨)을 총 3회 주사를 위해 3일마다 1회 종양 내 주사하였다.
5주령 마우스(C57BL/6) 각각의 좌우 측면에 0.1 mL의 Hepa1-6 세포 현탁액을 피하 접종하였다. 마우스의 종양이 6 mm x 6 mm로 성장할 때(종양 부피는 약 100 mm3), 마우스를 그룹화하고 처리를 시작하였다. 치료 요법은 다음과 같았다: 1 x 107 PFU 바이러스(OVN 또는 OVH) 또는 동일한 부피의 DMEM을 3일마다 한번씩 총 3회 주사하여 종양 내 주사하였다.
마우스의 상태를 3일마다 모니터링하고 전자 버니어 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 측정하였다. 종양 부피 및 종양 억제율은 하기 식에 따라 계산되었다:
V(볼륨)= [L x (W)2]/2; L은 긴 직경을 나타내고, W는 짧은 직경을 나타낸다.
종양 억제율= (대조군의 종양 부피-실험군의 종양 부피)/대조군의 종양 부피 x 100%.
실험 결과는 도 11-12에 요약되어 있다.
도 11은 OVN 또는 OVH로 처리한 후 Huh7 세포로 접종된 누드 마우스의 종양 부피-시간 곡선(도 11A) 및 생존율-시간 곡선(도 11B)을 도시하고; 여기서 DMEM은 처리되지 않은 마우스를 나타낸다. 도 11A의 결과는 3회 용량의 바이러스 주사 후, 재조합 바이러스 OVN 및 OVH가 종양 성장을 유의하게 억제하였음을 보여주고; 21 일에, OVN의 억제율은 86.1%에 도달하였고, OVH의 억제율은 78%에 도달하였다. 도 11b의 결과는 3회의 바이러스 주사 후, 재조합 바이러스 OVN 및 OVH가 종양 보유 누드 마우스의 생존 시간을 상당히 연장시켰음을 보여주며; 60일째에, 누드 마우스의 대조군은 완전히 죽었고, 재조합 바이러스 OVN 또는 OVH로 투여된 누드 마우스는 실험 종료 후에도 여전히 75%의 생존율을 가졌다.
도 12는 OVN 또는 OVH로 처리한 후 Hepa1-6 세포로 접종된 마우스(C57BL/6)의 좌측 측면 종양(도 12A) 및 우측 측면 종양(도 12B)의 종양 부피-시간 곡선을 나타내고; 여기서 DMEM은 처리되지 않은 마우스를 나타낸다. 도 12의 결과는 우측 측면 종양에 3회 용량의 바이러스 주사 후, 재조합 바이러스 OVN 및 OVH가 마우스의 우측 측면 종양을 안전하게 제거할 뿐만 아니라 좌측 측면 종양을 제거한다는 것을 보여준다.
이들 실험 결과는 본 발명의 바이러스 OVN 및 OVH가 생체 내에서 종양을 치료할 수 있는 상당한 잠재력을 가지고 있으며 광범위한 응용 전망을 가지고 있음을 확인시켜 주었다.
실시예 6. 다른 재조합 바이러스의 구성 및 특성(1)
본 실시예에서, 재조합 바이러스 OVN 및 OVH에 기초하여 일련의 유래 재조합 바이러스가 구축되었다.
실시예 1(특히 1.3.1 내지 1.3.3)에 기재된 방법을 참조하면, 재조합 바이러스 OVN을 출발 바이러스로서 사용하고, hTERT 코어 프로모터 서열을 조절하기 위한 재조합 플라스미드에 의해 재조합 바이러스 OVN 게놈에 도입되었다. VP5 유전자 또는 ICP4 유전자에 의해 재조합 바이러스 OVH1 및 OVH2가 구성된다.
시퀀싱에 의해 확인된 후, VP5 유전자의 천연 프로모터 서열(야생형 HSV-1 게놈의 nt40729 내지 nt40475(GenBank: JQ673480.1))은 재조합 바이러스 OVN과 비교하여 재조합 바이러스 OVH1 게놈에서 hTERT 코어 프로모터 서열(서열번호 5)로 치환되었고; 재조합 바이러스 OVH2 게놈에서, 야생형 HSV-1 게놈(GenBank: JQ673480.1)의 ICP4 유전자(nt146151 내지 nt146867 및 nt131706 내지 nt130990)의 고유 프로모터 서열은 hTERT 코어 프로모터 서열(서열번호 5)이다.
도 13은 재조합 바이러스 OVH, OVH1 및 OVH2와 재조합 바이러스 OVN 사이의 게놈 구조의 차이를 보여주는 개략도이고; 여기서, 재조합 바이러스 OVH의 ICP27 유전자의 천연 프로모터 서열, 재조합 바이러스 OVH1의 VP5 유전자의 천연 프로모터 서열 및 재조합 바이러스 OVH2의 ICP4 유전자의 천연 프로모터 서열은 재조합 바이러스 OVN과 비교하여 각각 프로모터 서열 hTERT 코어로 치환되었다.
또한, 실시예 1(특히 1.3.1 내지 1.3.3)에 기술된 방법을 참조하면, 재조합 바이러스 d34.5/0lacZ를 출발 바이러스, 및 GFP 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 7) 및 항-인간 PD-1 단쇄 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 8) 재조합 플라스미드를 사용하여 lacZ 유전자를 대체함으로써, 재조합 바이러스 d34.5/0lacZ 게놈에 도입되었고, 이로써 재조합 바이러스 OVN-GFP 및 OVN-PD-1-scfv를 구축하고 수득한다. 재조합 바이러스 OVN-GFP 게놈에서, 재조합 바이러스 d34.5/0lacZ와 비교하여 시퀀싱에 의해 확인된 후, lacZ 유전자의 2개의 카피는 GFP 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(즉, 재조합 바이러스 OVN-GFP의 게놈에서, 야생형 HSV-1 게놈의 nt510 내지 nt5439의 서열 및 nt120802 내지 nt125731의 서열(GenBank: JQ673480.1)은 GFP 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 치환됨)로 치환되었다; 재조합 바이러스 OVN-PD-1-scfv의 게놈에서, lacZ 유전자의 2개 카피는 PD-1 단쇄 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열(즉, 재조합 바이러스 OVN-PD-1-scfv의 게놈에서, 야생형 HSV-1 게놈(GenBank: JQ673480.1)의 nt510 내지 nt5439의 서열 및 nt120802 내지 nt125731의 서열은 PD-1 단쇄 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)로 치환되었다.
또한, 재조합 바이러스 OVN-GFP 및 OVN-PD-1-scfv를 출발 바이러스로 사용하고, hTERT 코어 프로모터 서열을 출발 바이러스 게놈에 도입하여 플라스미드 PUC57-27p/lacZ를 사용하여 ICP27 유전자를 조절하고 PUC57-27p/htert에 의해 재조합 바이러스 OVH-GFP 및 OVH-PD-1-scfv를 구축하고 수득하였다.
시퀀싱에 의해 확인된 후, 재조합 바이러스 OVN-GFP와 비교하여, 재조합 바이러스 OVH-GFP 게놈에서 ICP27 유전자의 고유 프로모터 서열(야생형 HSV-1 게놈의 nt113423 내지 nt113589(GenBank: JQ673480.1))은 hTERT 코어 프로모터 서열(서열번호 5)로 치환되었다. 재조합 바이러스 OVH-PD-1-scfv와 비교하여, 재조합 바이러스 OVH-PD-1-scfv 게놈에서 ICP27 유전자의 천연 프로모터 서열(야생형 HSV-1 게놈의 nt113423 내지 nt113589(GenBank: JQ673480.1))은 hTERT 코어 프로모터 서열 (서열번호 5)로 치환되었다.
도 14는 재조합 바이러스 d34.5/0lacZ, OVN, OVN-GFP, OVN-PD-1-scfv, OVH-GFP 및 OVH-PD-1-scfv의 게놈 구조 차이를 보여주는 개략도이다.
U-2 OS 세포(미국 ATCC에서 구입, 품목 번호 HTB-96TM)를 1 x 106 세포의 밀도로 6 cm 배양 플레이트에 접종하였다. 세포를 단층으로 성장시킨 후, 세포를 재조합 바이러스 OVN-GFP 및 OVH-GFP로 각각 감염시켰다. 세포 변성 효과가 관찰된 후, 재조합 바이러스 OVN-GFP 및 OVH-GFP로 감염된 세포가 형광 현미경으로 관찰되었다. 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15는 재조합 바이러스 OVN-GFP 또는 OVH-GFP로 감염된 U-2 OS 세포의 형광 현미경 관찰 결과를 나타낸다. 도 15의 결과는 OVN-GFP 및 OVH-GFP 감염 U-2 OS 세포가 녹색 형광을 방출할 수 있음을 보여준다. 이는 재조합 바이러스 OVN-GFP 및 OVH-GFP가 숙주 세포의 감염 후 GFP 단백질을 발현할 수 있음을 나타낸다.
U-2 OS 세포(미국 ATCC에서 구입, 카탈로그 번호 HTB-96TM)를 1 x 106 세포의 밀도로 6 cm 배양 플레이트에 접종하였다. 세포를 단층으로 성장시킨 후, 세포를 재조합 바이러스 OVH 및 OVH-PD-1-scfv로 각각 감염시켰다. 세포의 배양 상청액은 후속 분석을 위해 감염 24시간 및 48시간 후에 각각 수확되었다. 감염 48시간 후 수집된 상등액은 연속 2배 구배 희석을 하였고, PD-1과 PD-L1 사이의 상호 작용을 억제하는 각각의 희석액의 상등액의 능력은 PD-1 단백질에 결합하기 위한 PD-1 단쇄 항체와 PD-L1 단백질 간의 경쟁에 기초한 ELISA 방법에 의해 결정되었다. 또한, PD-1에 결합하기 위해 감염 후 24시간 및 48시간에 수집된 상등액의 능력은 PD-1 단쇄 항체와 PD-1 단백질 사이의 반응성에 기초한 ELISA 방법에 의해 결정되었다. 실험 결과는 도 16에 도시되었다.
도 16은 24시간 또는 48시간 동안 재조합 바이러스 OVH 또는 OVH-PD-1-scfv로 U-2 OS 세포를 감염시킨 후, 세포 상등액이 PD-1/PD-L1의 특이적 결합을 억제하는 능력을 나타낸다(도 16A), 및 세포 상청액과 PD-1 단백질 사이의 상호 작용의 분석 결과(도 16B); 여기서 MOCK는 바이러스에 감염되지 않은 종양 세포를 나타낸다. 도 16의 결과는 OVH-PD-1-scfv- 감염 U-2 OS 세포의 상청액이 PD-1/PD-L1의 특이적 결합을 억제할 수 있었고 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있음을 보여준다. 이는 재조합 바이러스 OVH-PD-1-scfv가 숙주 세포의 감염 후 PD-1 단쇄 항체를 발현시켰으며, 이는 PD-1에 결합하고 PD-1과 PD-L1 사이의 상호 작용을 차단함을 나타낸다.
도 15-16의 실험 결과는 본 발명의 재조합 바이러스 OVN 및 OVH의 게놈이 외래 유전자를 운반 및 발현하기 위한 바이러스 벡터로서 유용하다는 것을 나타낸다.
또한, 종양을 치료하는 재조합 바이러스 OVH 및 OVH-PD-1-scfv의 능력은 또한 실시예 5에 기재된 방법에 따라 Hepa1-6 세포를 접종한 마우스(C57BL/6)에서 확인되었다. 결과는 도 17에 도시되어 있다.
도 17은 OVH 또는 OVH-PD-1-scfv 처리 후 Hepa1-6 세포로 접종된 마우스(C57BL/6)의 좌측 측면(도 17A) 및 오른쪽 측면(도 17B)의 종양의 종양 부피-시간 곡선을 나타낸다; 여기서 비히클은 처리되지 않은 마우스를 나타낸다. 도 17의 결과는 우측 측면 종양에 3회 용량의 바이러스 주사 후, 재조합 바이러스 OVH 및 OVH-PD-1-scfv가 마우스의 우측 측면 종양을 안전하게 제거할 뿐만 아니라 좌측 측면 종양을 깨끗하게 한다는 것을 보여준다.
이들 실험 결과는 본 발명의 재조합 바이러스 OVH-PD-1-scfv 및 OVH가 생체 내에서 종양을 치료할 수 있는 상당한 잠재력을 가지고 있으며 광범위한 응용 전망을 가지고 있음을 확인시켜 준다.
실시예 7. 다른 재조합 바이러스의 구성 및 특성 (2)
본 실시예에서, 재조합 바이러스 OVN에 기초하여 일련의 유래 재조합 바이러스가 구축되었다. 간략하게, 실시예 1(특히 1.3.1 내지 1.3.3)에 기술된 방법을 참조하면, 재조합 바이러스 OVN이 출발 바이러스로서 사용되었고, 비 필수 유전자 UL41, UL43, UL48, UL55, US2, LAT 또는 재조합 바이러스 OVN 게놈에서 NF는 각각 재조합 플라스미드를 사용하여 결실되어, 재조합 바이러스 OVN-dUL41, OVN-dUL43, OVN-dUL48, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT 및 OVN-dNF를 구축 및 수득하였다.
시퀀싱에 의한 검증에 따르면, 재조합 바이러스 OVN과 비교하여, 재조합 바이러스 OVN-dUL41 게놈은 UL41(vhs) 유전자(GenBank: AFE62869.1; 야생형 HSV-1 게놈(GenBank: JQ673480.1)의 nt91088 내지 nt92557에 상응함)를 결실시켰다; 재조합 바이러스 OVN-dUL43 게놈은 UL43 유전자(GenBank: AFE62871.1; 야생형 HSV-1 게놈의 nt94721 내지 nt95968에 상응함(GenBank: JQ673480.1))의 결실을 가졌다; 재조합 바이러스 OVN-dUL48 게놈은 UL48(VMW65) 유전자(GenBank: AFE62876.1; 야생형 HSV-1 게놈의 nt103527 내지 nt104999에 상응함(GenBank: JQ673480.1))의 결실; 재조합 바이러스 OVN-dUL55 게놈은 UL55 유전자(GenBank: AFE62884.1; 야생형 HSV-1 게놈의 nt115418-nt115978에 상응함(GenBank: JQ673480.1))의 결실; 재조합 바이러스 OVN-dUS2 게놈은 US2 유전자(GenBank: AFE62890.1; 야생형 HSV-1 게놈의 nt133911 내지 nt134786(GenBank: JQ673480.1)의 결실에 상응함; 재조합 바이러스 OVN-dLAT 게놈은 LAT 유전자(야생형 HSV-1 게놈의 nt4781 내지 nt7062에 상응함(GenBank: JQ673480.1))의 결실; 및 재조합 바이러스 OVN-dNF 게놈은 뉴클레오티드 단편(NF)(야생형 HSV-1 게놈의 nt5853 내지 nt7485에 상응함(GenBank: JQ673480.1))의 결실을 가짐.
대안적으로, 예를 들어, CRISPR 기술을 사용할 수도 있는데, 예를 들어, 특정 sgRNA 프라이머를 설계하고 시판되는 LentiCRISPR v2 벡터(Addgene)를 사용하여, 재조합 바이러스 OVN 게놈에서 비 필수 유전자 UL41, UL43, UL48, UL55, US2, LAT 또는 NF는 각각 결실될 수 있다.
비 필수 유전자 UL41, UL43, UL48, UL55, US2, LAT 및 NF에 대한 정보는 표 4에 제공된다.
| 유전자 명칭 | GenBank No. | 게놈 중 위치 | 서열번호 |
| UL41 (vhs) | AFE62869.1 | nt91088-nt92557 | 17 |
| UL43 | AFE62871.1 | nt94721-nt95968 | 18 |
| UL48 (VMW65) | AFE62876.1 | nt103527-nt104999 | 19 |
| UL55 | AFE62884.1 | nt115418-nt115978 | 20 |
| US2 | AFE62890.1 | nt133911-nt134786 | 21 |
| LAT | Derived from JQ673480.1 | nt4781-nt7062 | 22 |
| Nucleotide fragment (NF) | Derived from JQ673480.1 | nt5853-nt7485 | 23 |
양호한 상태 및 대수 성장기에 있는 종양 세포(U-2 OS 세포)를 5-7.5 x 106 세포/플레이트의 밀도로 6 cm 배양 플레이트에 접종하였다. 이어서, 배양된 세포를 0.01의 MOI에서 재조합 바이러스 OVN, OVN-dUL41, OVN-dUL43, OVN-dUL48, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT 또는 OVN-dNF로 각각 감염시켰다. 감염 60시간 후, 상기 재조합 바이러스의 바이러스 역가는 실시예 1에 기술된 프로토콜을 참조하여 결정하였다. 각각의 실험 그룹에 대해 3-웰 복제물을 설정하였고 실험 결과는 3회의 독립적인 실험의 평균이었다. 실험 결과는 도 18에 도시되어 있다.
도 18은 바이러스 OVN, OVN-dUL41, OVN-dUL43, OVN-dUL48, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT 또는 OVN-dNF로 U-2 OS 세포를 감염시킨 60시간 후의 바이러스 역가를 0.01의 MOI에서 각각 나타낸 것이다. 도 18의 결과는 U-2 OS 세포의 감염 후, 바이러스 OVN, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT 및 OVN-dNF가 높은 수준에서 복제됨을 나타냈다: 감염 60시간 후, 바이러스 역가는 108 pfu/ml 정도의 1.01-1.18 x 108 pfu/ml 사이이고; 바이러스 OVN-dUL43, OVN-dUL41 및 OVN-dUL48은 낮은 수준에서 복제됨을 나타냈다: 감염 60시간 후, 바이러스 역가는 104 내지 106 pfu/ml의 순서로 107 pfu/ml보다 낮았다. 이들 재조합 바이러스의 바이러스 역가는 또한 표 5에 제공된다.
| 재조합 바이러스 | 바이러스 역가(pfu/ml) | 재조합 바이러스 | 바이러스 역가(pfu/ml) |
| OVN | 1.01 x 108 ± 8.54 x 106 | OVN-dUL55 | 1.05 x 108 ± 5.00 x 106 |
| OVN-dUL41 | 1.80 x 105 ± 2.65 x 104 | OVN-dUS2 | 1.18 x 108 ± 2.89 x 106 |
| OVN-dUL43 | 1.83 x 106 ± 2.89 x 105 | OVN-dLAT | 1.07 x 108 ± 5.77 x 106 |
| OVN-dUL48 | 3.37 x 104 ± 3.21 x 103 | OVN-dNF | 1.02 x 108 ± 7.64 x 106 |
이들 결과는 바이러스 OVN, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT 및 OVN-dNF가 종양 세포(예를 들어, U-2 OS 세포)에서 높은 수준으로 복제될 수 있음을 나타내고; 반면 종양 세포(예를 들어, U-2 OS 세포)에서 바이러스 OVN-dUL43, OVN-dUL41 및 OVN-dUL48의 복제 능력은 유의하게 감소되었음을 나타낸다. 예를 들어, U-2 OS 세포에서 바이러스 OVN-dUL41, OVN-dUL43 및 OVN-dUL48의 복제 능력은 바이러스 OVN 과 비교하여 각각 약 561배, 55배 및 3 x 103배 감소하였다.
또한, 배양된 정상 세포(L-O2 세포) 또는 종양 세포(U-2 OS 세포)는 각각 0.5의 MOI에서 재조합 바이러스 OVN, OVN-dUL41, OVN-dUL43, OVN-dUL48, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT 또는 OVN-dNF로 감염되었다. 감염 72시간 후, 세포의 생존율을 측정하였다. 각각의 실험 세트에 대해 3-웰 복제물을 설정하였고 실험 결과는 3회의 독립적인 실험의 평균이었다. 실험 결과는 도 19에 도시되어 있다.
도 19는 MOI 0.5에서 바이러스 OVN, OVN-dUL41, OVN-dUL43, OVN-dUL48, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT 또는 OVN-dNF에 의한 감염 72시간 후 정상 세포(L-O2 세포; 도 19A) 또는 종양 세포(U-2 OS 세포; 도 19B)의 세포 생존율을 각각 나타낸다.
도 19A의 결과는 감염 72시간 후 L-O2 세포에서 바이러스 OVN-dUL41 및 OVH-dUL48의 사멸률이 각각 약 17.67% 및 14.33%임을 나타내고; L-O2 세포에서 둘 모두의 사멸 능력은 바이러스 OVN의 사멸 능력보다 강했음을 나타낸다. L-O2 세포에서 바이러스 OVN-dUL43, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT 및 OVN-dNF의 사멸률은 8.33% 내지 11.00%였으며, 이는 바이러스 OVN의 사멸률과 유의하게 다르지 않았다.
도 19b의 결과는 감염 72시간 후 U-2 OS 세포에서 바이러스 OVN, OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT 및 OVN-dNF의 사멸률이 100%임을 나타냈다(즉, 종양 세포에 대한 높은 사멸 능력). U-2 OS 세포에서 바이러스 OVN-dUL41, OVN-dUL43 및 OVN-dUL48의 사멸 능력은 상당히 감소되었다.
L-O2 및 U-2 OS 세포에 대한 이들 재조합 바이러스의 사멸률은 또한 표 6에 제공된다.
| 사멸률 | ||
| 재조합 바이러스 | L-O2 세포 | U-2 OS 세포 |
| OVN | 90.00% ± 1.00% | 0.87% ± 0.71% |
| OVN-dUL41 | 82.33% ± 0.58% | 76.00% ± 2.65% |
| OVN-dUL43 | 89.00% ± 1.00% | 52.67% ± 0.58% |
| OVN-dUL48 | 85.67% ± 1.15% | 68.33% ± 0.58% |
| OVN-dUL55 | 90.33% ± 0.58% | 0.90% ± 0.10% |
| OVN-dUS2 | 90.67% ± 0.58% | 0.77% ± 0.06% |
| OVN-dLAT | 90.33% ± 0.58% | 0.46% ± 0.05% |
| OVN-dNF | 91.67% ± 0.58% | 0.90% ± 0.10% |
이들 결과는 바이러스 OVN과 유사하게 바이러스 OVN-dUL55, OVN-dUS2, OVN-dLAT 및 OVN-dNF는 정상적인 세포(예를 들어, L-O2 세포)에 대한 사멸 활성이 매우 제한적이지만 이들의 사멸 능력은 종양 세포(예를 들어, U-2 OS 세포)에서는 극도로 높았고; 이는 4개의 재조합 바이러스가 바이러스 OVN과 동등함을 나타낸다. 바이러스 OVN과 비교하여, 바이러스 OVN-dUL41 및 OVH-dUL48은 정상 세포(예를 들어, L-O2 세포)에 대한 사멸 능력을 향상시킬 뿐만 아니라 종양 세포(예를 들어, U-2 OS 세포)에 대한 사멸 능력을 상당히 감소시켰으며; 이는 2개의 재조합 바이러스가 정상 세포에 대한 독성을 증가시키고 항 종양 활성을 감소시켰음을 나타낸다. 바이러스 OVN-dUL43의 정상 세포(예를 들어, L-O2 세포)에 대한 사멸 활성은 바이러스 OVN과 비교하여 유의미하게 향상되지 않았지만, 종양 세포(예를 들어, U-2 OS 세포)에 대한 그의 사멸 활성은 상당히 감소되었다.
구체적으로, 정상 세포에서, 바이러스 OVN-dUL41, OVN-dUL43 및 OVH-dUL48의 사멸 능력은 바이러스 OVN과 비교하여 각각 약 7.67%, 1.00% 및 4.33% 증가하였다. 종양 세포에서, 바이러스 OVN-dUL41, OVN-dUL43 및 OVH-dUL48의 사멸 능력은 바이러스 OVN과 비교하여 각각 약 75.13%, 51.80% 및 67.46% 감소하였다.
상기 실험 결과는 본 발명의 재조합 HSV 바이러스에서 UL41, UL43 및 UL48 이외의 비 필수 유전자(예를 들어, UL55, US2, LAT 및 NF)가 추가로 변형될 수 있음을 나타내며, 예를 들어, 기능상실 돌연변이가 삽입되거나 결실된다.
본 발명의 특정 실시 예가 상세하게 설명되었지만, 당업자는 본 발명의 세부 사항에서 다양한 변형 및 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 전체 범위는 첨부된 청구 범위 및 그의 등가물에 의해 주어진다.
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gcaaaaaagg cgggcggcgg tccgggcggc gtgcgcgcgc gcggcgggcg tggggggcgg 60
ggccgcggga gcgggggagg agcgggggag gagcgggggg aggagcgggg ggaggagcgg 120
ggggaggagc ggggggagga gcggggggag gagcgggggg aggagcgggg ggaggagcgg 180
ggggaggagc ggggggagga gcggggggag gagcgggggg aggagcgggg ggaggagcgg 240
ggggaggagc ggggggagga gcggggggag gagcggggga ggagcggcca gaccccggaa 300
acgggccccc cccaaaacac accccccggg ggtcgcgcgc ggccctttaa aggcgggcgg 360
cgggcagccc gggccccccg cggccgagac tagcgagtta gacaggcaag cactactcgc 420
ctctgcacgc acatgcttgc ctgtcaaact ctaccacccc ggcacgctct ctgtctccat 480
ggcccgccgc cgccatcgcg gcccccgccg cccccggccg cccgggccca cgggcgcggt 540
cccaaccgca cagtcccagg taacctccac gcccaactcg gaacccgtgg tcaggagcgc 600
gcccgcggcc gccccgccgc cgccccccgc cagtgggccc ccgccttctt gttcgctgct 660
gctgcgccag tggctccacg ttcccgagtc cgcgtccgac gacgacgacg acgactggcc 720
ggacagcccc ccgcccgagc cggcgccaga ggcccggccc accgccgccg ccccccgccc 780
ccggtcccca ccgcccggcg cgggcccggg gggcggggct aacccctccc accccccctc 840
acgccccttc cgccttccgc cgcgcctcgc cctccgcctg cgcgtcaccg cagagcacct 900
ggcgcgcctg cgcctgcgac gcgcgggcgg ggagggggcg ccgaagcccc ccgcgacccc 960
cgcgaccccc gcgaccccca cgcgggtgcg cttctcgccc cacgtccggg tgcgccacct 1020
ggtggtctgg gcctcggccg cccgcctggc gcgccgcggc tcgtgggccc gcgagcgggc 1080
cgaccgggct cggttccggc gccgggtggc ggaggccgag gcggtcatcg ggccgtgcct 1140
ggggcccgag gcccgtgccc gggccctggc ccgcggagcc ggcccggcga actcggtcta 1200
acgttacacc cgaggcggcc tgggtcttcc gcggagctcc cgggagctcc gcaccaagcc 1260
gctctccgga gagacgatgg caggagccgc gcatatatac gcttggagcc ggcccgcccc 1320
cgaggcgggc ccgccctcgg agggcgggac tggccaatcg gcggccgcca gcgcggcggg 1380
gcccggccaa ccagcgtccg ccgagtcgtc ggggcccggc ccactgggcg gtaactcccg 1440
cccagtgggc cgggccgccc acttcccggt atggtaatta aaaacttgca gaggccttgt 1500
tccgcttccc ggtatggtaa ttagaaactc attaatgggc ggccccggcc gcccttcccg 1560
cttccggcaa ttcccgcggc ccttaatggg caaccccggt attccccgcc tcccgcgccg 1620
cgcgtaacca ctcccctggg gttccgggtt atgttaattg cttttttggc ggaacacacg 1680
gcccctcgcg cattggcccg cgggtcgctc aatgaacccg cattggtccc ctggggttcc 1740
gggtatggta atgagtttct tcgggaaggc gggaagcccc ggggcaccga cgcaggccaa 1800
gcccctgttg cgtcggcggg aggggcatgc taatggggtt ctttggggga caccgggttg 1860
gtcccccaaa tcgggggccg ggccgtgcat gctaatgata ttctttgggg gcgccgggtt 1920
ggtccccggg gacggggccg ccccgcggtg ggcctgcctc ccctgggacg cgcggccatt 1980
gggggaatcg tcactgccgc ccctttgggg aggggaaagg cgtggggtat aagttagccc 2040
tggcccgacg gtctggtcgc atttgcacct cggcactcgg agcgagacgc agcagccagg 2100
cagactcggg ccgccccctc tccgcatcac cacagaagcc ccgcctacgt tgcgaccccc 2160
agggaccctc cgtcagcgac cctccagccg catacgaccc ccatggagcc ccgccccgga 2220
gcgagtaccc gccggcctga gggccgcccc cagcgcgagg tgaggggccg ggcgccatgt 2280
ctggggcgcc atgttggggg gcgccatgtt ggggggcgcc atgttggggg acccccgacc 2340
cttacactgg aaccggccgc catgttgggg gacccccact catacacggg agccgggcgc 2400
catgttgggg cgccatgtta gggggcgtgg aaccccgtga cactatatat acagggaccg 2460
ggggcgccat gttagggggc gcggaacccc ctgaccctat atatacaggg accggggtcg 2520
ccctgttagg ggtcgccatg tgaccccctg actttatata tacagacccc caacacctac 2580
acatggcccc tttgactcag acgcagggcc cggggtcgcc gtgggacccc cctgactcat 2640
acacagagac acgcccccac aacaaacaca cagggaccgg ggtcgccgtg ttagggggcg 2700
tggtccccac tgactcatac gcagggcccc cttactcaca cgcatctagg ggggtgggga 2760
ggagccgccc gccatatttg ggggacgccg tgggaccccc gactccggtg cgtctggagg 2820
gcgggagaag agggaagaag aggggtcggg atccaaagga cggacccaga ccacctttgg 2880
ttgcagaccc ctttctcccc cctcttccga ggccagcagg ggggcaggac tttgtgaggc 2940
ggggggggag ggggaactcg tgggcgctga ttgacgcggg aaatcccccc attcttaccc 3000
gccccccctt ttttcccctc agcccgcccc ggatgtctgg gtgtttccct gcgaccgaga 3060
cctgccggac agcagcgact cggaggcgga gaccgaagtg ggggggcggg gggacgccga 3120
ccaccatgac gacgactccg cctccgaggc ggacagcacg gacacggaac tgttcgagac 3180
ggggctgctg gggccgcagg gcgtggatgg gggggcggtc tcggggggga gccccccccg 3240
cgaggaagac cccggcagtt gcgggggcgc cccccctcga gaggacgggg ggagcgacga 3300
gggcgacgtg tgcgccgtgt gcacggatga gatcgcgccc cacctgcgct gcgacacctt 3360
cccgtgcatg caccgcttct gcatcccgtg catgaaaacc tggatgcaat tgcgcaacac 3420
ctgcccgctg tgcaacgcca agctggtgta cctgatagtg ggcgtgacgc ccagcgggtc 3480
gttcagcacc atcccgatcg tgaacgaccc ccagacccgc atggaggccg aggaggccgt 3540
cagggcgggc acggccgtgg actttatctg gacgggcaat cagcggttcg ccccgcggta 3600
cctgaccctg ggggggcaca cggtgagggc cctgtcgccc acccaccctg agcccaccac 3660
ggacgaggat gacgacgacc tggacgacgg tgaggcgggg gggcggcgag gaccctgggg 3720
gaggaggagg aggggggggg gagggaggaa taggcgggcg ggcgggcgag gaaagggcgg 3780
gccggggagg gggcgtaacc tgatcgcgcc ccccgttgtc tcttgcagca gactacgtac 3840
cgcccgcccc ccgccggacg ccccgcgccc ccccacgcag aggcgccgcc gcgccccccg 3900
tgacgggcgg ggcgtctcac gcagcccccc agccggccgc ggctcggaca gcgcccccct 3960
cggcgcccat cgggccacac ggcagcagta acactaacac caccaccaac agcagcggcg 4020
gcggcggctc ccgccagtcg cgagccgcgg tgccgcgggg ggcgtctggc ccctccgggg 4080
gggttggggt tgttgaagcg gaggcggggc ggccgagggg ccggacgggc ccccttgtca 4140
acagacccgc cccccttgca aacaacagag accccatagt gatcagcgac tcccccccgg 4200
cctctcccca caggcccccc gcggcgccca tgccaggctc cgccccccgc cccggtcccc 4260
ccgcgtccgc ggccgcgtcg ggccccgcgc gcccccgcgc ggccgtggcc ccgtgtgtgc 4320
gggcgccgcc tccggggccc ggcccccgcg ccccggcccc cggggcggag ccggccgccc 4380
gccccgcgga cgcgcgccgt gtgccccagt cgcactcgtc cctggctcag gccgcgaacc 4440
aagaacagag tctgtgccgg gcgcgtgcga cggtggcgcg cggctcgggg gggccgggcg 4500
tggagggtgg acacgggccc tcccgcggcg ccgccccctc cggcgccgcc ccctccggcg 4560
cccccccgct cccctccgcc gcctctgtcg agcaggaggc ggcggtgcgt ccgaggaaga 4620
ggcgcgggtc gggccaggaa aacccctccc cccagtccac gcgtcccccc ctcgcgccgg 4680
caggggccaa gagggcggcg acgcaccccc cctccgactc agggccgggg gggcgcggcc 4740
agggagggcc cgggaccccc ctgacgtcct cggcggcctc cgcctcttcc tcctccgcct 4800
cttcctcctc ggccccgact cccgcggggg ccacctcttc cgccaccggg gccgcgtcct 4860
cctccgcttc cgcctcctcg ggcggggccg tcggtgccct gggagggaga caagaggaaa 4920
cctccctcgg cccccgcgct gcttctgggc cgcgggggcc gaggaagtgt gcccggaaga 4980
cgcgccacgc ggagacttcc ggggccgtcc ccgcgggcgg cctcacgcgc tacctgccca 5040
tctcgggggt ctctagcgtg gtcgccctgt cgccttacgt gaacaagacg atcacggggg 5100
actgcctgcc catcctggac atggagacgg ggaacatcgg ggcgtacgtg gtcctggtgg 5160
accagacggg aaacatggcg acccggctgc gggccgcggt ccccggctgg agccgccgca 5220
ccctgctccc cgagaccgcg ggtaaccacg tgacgccccc cgagtacccg acggcccccg 5280
cgtcggagtg gaacagcctc tggatgaccc ccgtggggaa catgctgttc gaccagggca 5340
ccctagtggg cgccctggac ttccgcagcc tgcggtctcg gcacccgtgg tccggggagc 5400
agggggcgtc gacccgggac gagggaaaac aataagggac gcccccgtgt ttgtggggag 5460
gggggggtcg ggcgctgggt ggtctctggc cgcgcccact acaccagcca atccgtgtcg 5520
gggaggtgga aagtgaaaga cacgggcacc acacaccagc gggtcttttg tgttggccct 5580
aataaaaaaa actcagggga tttttgctgt ctgttgggaa ataaaggttt acttttgtat 5640
cttttccctg tctgtgttgg atgtatcgcg ggggtgcgtg ggagtggggg tgcgtgggag 5700
tgggggtgcg tgggagtggg ggtgcgtggg agtgggggtg cgtgggagtg ggggtgcgtg 5760
ggagtggggg tgcgtgggag tgggggtgcg tgggagtggg ggtgcgtggg agtgggggtg 5820
ccatgttggg caggctctgg tgtt 5844
<210> 2
<211> 3049
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LacZ gene
<400> 2
gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca 60
gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 120
caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg cgctttgcct ggtttccggc accagaagcg 180
gtgccggaaa gctggctgga gtgcgatctt cctgaggccg atactgtcgt cgtcccctca 240
aactggcaga tgcacggtta cgatgcgccc atctacacca acgtgaccta tcccattacg 300
gtcaatccgc cgtttgttcc cacggagaat ccgacgggtt gttactcgct cacatttaat 360
gttgatgaaa gctggctaca ggaaggccag acgcgaatta tttttgatgg cgttaactcg 420
gcgtttcatc tgtggtgcaa cgggcgctgg gtcggttacg gccaggacag tcgtttgccg 480
tctgaatttg acctgagcgc atttttacgc gccggagaaa accgcctcgc ggtgatggtg 540
ctgcgctgga gtgacggcag ttatctggaa gatcaggata tgtggcggat gagcggcatt 600
ttccgtgacg tctcgttgct gcataaaccg actacacaaa tcagcgattt ccatgttgcc 660
actcgcttta atgatgattt cagccgcgct gtactggagg ctgaagttca gatgtgcggc 720
gagttgcgtg actacctacg ggtaacagtt tctttatggc agggtgaaac gcaggtcgcc 780
agcggcaccg cgcctttcgg cggtgaaatt atcgatgagc gtggtggtta tgccgatcgc 840
gtcacactac gtctgaacgt cgaaaacccg aaactgtgga gcgccgaaat cccgaatctc 900
tatcgtgcgg tggttgaact gcacaccgcc gacggcacgc tgattgaagc agaagcctgc 960
gatgtcggtt tccgcgaggt gcggattgaa aatggtctgc tgctgctgaa cggcaagccg 1020
ttgctgattc gaggcgttaa ccgtcacgag catcatcctc tgcatggtca ggtcatggat 1080
gagcagacga tggtgcagga tatcctgctg atgaagcaga acaactttaa cgccgtgcgc 1140
tgttcgcatt atccgaacca tccgctgtgg tacacgctgt gcgaccgcta cggcctgtat 1200
gtggtggatg aagccaatat tgaaacccac ggcatggtgc caatgaatcg tctgaccgat 1260
gatccgcgct ggctaccggc gatgagcgaa cgcgtaacgc gaatggtgca gcgcgatcgt 1320
aatcacccga gtgtgatcat ctggtcgctg gggaatgaat caggccacgg cgctaatcac 1380
gacgcgctgt atcgctggat caaatctgtc gatccttccc gcccggtgca gtatgaaggc 1440
ggcggagccg acaccacggc caccgatatt atttgcccga tgtacgcgcg cgtggatgaa 1500
gaccagccct tcccggctgt gccgaaatgg tccatcaaaa aatggctttc gctacctgga 1560
gagacgcgcc cgctgatcct ttgcgaatac gcccacgcga tgggtaacag tcttggcggt 1620
ttcgctaaat actggcaggc gtttcgtcag tatccccgtt tacagggcgg cttcgtctgg 1680
gactgggtgg atcagtcgct gattaaatat gatgaaaacg gcaacccgtg gtcggcttac 1740
ggcggtgatt ttggcgatac gccgaacgat cgccagttct gtatgaacgg tctggtcttt 1800
gccgaccgca cgccgcatcc agcgctgacg gaagcaaaac accagcagca gtttttccag 1860
ttccgtttat ccgggcaaac catcgaagtg accagcgaat acctgttccg tcatagcgat 1920
aacgagctcc tgcactggat ggtggcgctg gatggtaagc cgctggcaag cggtgaagtg 1980
cctctggatg tcgctccaca aggtaaacag ttgattgaac tgcctgaact accgcagccg 2040
gagagcgccg ggcaactctg gctcacagta cgcgtagtgc aaccgaacgc gaccgcatgg 2100
tcagaagccg ggcacatcag cgcctggcag cagtggcgtc tggcggaaaa cctcagtgtg 2160
acgctccccg ccgcgtccca cgccatcccg catctgacca ccagcgaaat ggatttttgc 2220
atcgagctgg gtaataagcg ttggcaattt aaccgccagt caggctttct ttcacagatg 2280
tggattggcg ataaaaaaca actgctgacg ccgctgcgcg atcagttcac ccgtgcaccg 2340
ctggataacg acattggcgt aagtgaagcg acccgcattg accctaacgc ctgggtcgaa 2400
cgctggaagg cggcgggcca ttaccaggcc gaaagcagcg ttgttgcagt gcacggcaga 2460
tacacttgct gatgcggtgc tgattacgac cgctcacgcg tggcagcatc aggggaaaac 2520
cttatttatc agccggaaaa cctaccggat tgatggtagt ggtcaaatgg cgattaccgt 2580
tgatgttgaa gtggcgagcg atacaccgca tccggcgcgg attggcctga actgccagct 2640
ggcgcaggta gcagagcggg taaactggct cggattaggg ccgcaagaaa actatcccga 2700
ccgccttact gccgcctgtt ttgaccgctg ggatctgcca ttgtcagaca tgtatacccc 2760
gtacgtcttc ccgagcgaaa acggtctgcg ctgcgggacg cgcgaattga attatggccc 2820
acaccagtgg cgcggcgact tccagttcaa catcagccgc tacagtcaac agcaactgat 2880
ggaaaccagc catcgccatc tgctgcacgc ggaagaaggc acatggctga atatcgacgg 2940
tttccatatg gggattggtg gcgacgactc ctggagcccg tcagtatcgg cggaattcca 3000
gctgagcgcc ggtcgctacc attaccagtt ggtctggtgt caaaaataa 3049
<210> 3
<211> 562
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> herpes simplex virus 1
<400> 3
ccacctggtg ttttgtctcc accatcggcc tgacagagct gtattgtatt ctgcggcggg 60
gcccggcccc caagaacgca gacaaggccg ccgccccggg gcgatccaag gggctgtcgg 120
gcgtctgcgg gcgctgttgt tccatcatcc tgtcgggcat cgcaatgcga ttgtgttata 180
tcgccgtggt ggccggggtg gtgctcgtgg cgcttcacta cgagcaggag atccagaggc 240
gcctgtttga tgtatgacgt cacatccagg ccggcggaaa ccggaacggc atatgcaaac 300
tggaaactgt cctgtcttgg ggcccaccca cccgacgcgt catatgtaaa tgaaaatcgt 360
tcccccgagg ccatgtgtag cctggatccc aacgaccccg cccatgggtc ccaattggcc 420
gtcccgttac caagaccaac ccagccagcg tatccacccc cgcccgggtc cccgcggaag 480
cggaacggtg tatgtgatat gctaattaaa tacatgccac gtacttatgg tgtctgattg 540
gtccttgtct gtgccggagg tg 562
<210> 4
<211> 1605
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> herpes simplex virus 1
<400> 4
accggtgcgc caccaccaga ggccatatcc gacaccccag ccccgacggc agccgacagc 60
ccggtcatgg cgactgacat tgatatgcta attgacctcg gcctggacct ctccgacagc 120
gatctggacg aggacccccc cgagccggcg gagagccgcc gcgacgacct ggaatcggac 180
agcaacgggg agtgttcctc gtcggacgag gacatggaag acccccacgg agaggacgga 240
ccggagccga tactcgacgc cgctcgcccg gcggtccgcc cgtctcgtcc agaagacccc 300
ggcgtaccca gcacccagac gcctcgtccg acggagcggc agggccccaa cgatcctcaa 360
ccagcgcccc acagtgtgtg gtcgcgcctc ggggcccggc gaccgtcttg ctcccccgag 420
cggcacgggg gcaaggtggc ccgcctccaa cccccaccga ccaaagccca gcctgcccgc 480
ggcggacgcc gtgggcgtcg caggggtcgg ggtcgcggtg gtcccggggc cgccgatggt 540
ttgtcggacc cccgccggcg tgcccccaga accaatcgca acccgggggg accccgcccc 600
ggggcggggt ggacggacgg ccccggcgcc ccccatggcg aggcgtggcg cggaagtgag 660
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gcgcccgccg ccgacaccat cgacgccacc acgcggttgg tcctgcgctc catctccgag 840
cgcgcggcgg tcgaccgcat cagcgagagc ttcggccgca gcgcacaggt catgcacgac 900
ccctttgggg ggcagccgtt tcccgccgcg aatagcccct gggccccggt gctggcgggc 960
caaggagggc cctttgacgc cgagaccaga cgggtctcct gggaaacctt ggtcgcccac 1020
ggcccgagcc tctatcgcac ttttgccggc aatcctcggg ccgcatcgac cgccaaggcc 1080
atgcgcgact gcgtgctgcg ccaagaaaat ttcatcgagg cgctggcctc cgccgacgag 1140
acgctggcgt ggtgcaagat gtgcatccac cacaacctgc cgctgcgccc ccaggacccc 1200
attatcggga cggccgcggc ggtgctggat aacctcgcca cgcgcctgcg gccctttctc 1260
cagtgctacc tgaaggcgcg aggcctgtgc ggcctggacg aactgtgttc gcggcggcgt 1320
ctggcggaca ttaaggacat tgcatccttc gtgtttgtca ttctggccag gctcgccaac 1380
cgcgtcgagc gtggcgtcgc ggagatcgac tacgcgaccc ttggtgtcgg ggtcggagag 1440
aagatgcatt tctacctccc cggggcctgc atggcgggcc tgatcgaaat cctagacacg 1500
caccgccagg agtgttcgag tcgtgtctgc gagttgacgg ccagtcacat cgtcgccccc 1560
ccgtacgtgc acggcaaata tttttattgc aactccctgt tttag 1605
<210> 5
<211> 260
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
ctgcgctgtc ggggccaggc cgggctccca gtggattcgc gggcacagac gcccaggacc 60
gcgcttccca cgtggcggag ggactgggga cccgggcacc cgtcctgccc cttcaccttc 120
cagctccgcc tcctccgcgc ggaccccgcc ccgtcccgac ccctcccggg tccccggccc 180
agccccctcc gggccctccc agcccctccc cttcctttcc gcggccccgc cctctcctcg 240
cggcgcgagt ttcaggcagc 260
<210> 6
<211> 4930
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> herpes simplex virus 1
<400> 6
catggcccgc cgccgccatc gcggcccccg ccgcccccgg ccgcccgggc ccacgggcgc 60
ggtcccaacc gcacagtccc aggtaacctc cacgcccaac tcggaacccg tggtcaggag 120
cgcgcccgcg gccgccccgc cgccgccccc cgccagtggg cccccgcctt cttgttcgct 180
gctgctgcgc cagtggctcc acgttcccga gtccgcgtcc gacgacgacg acgacgactg 240
gccggacagc cccccgcccg agccggcgcc agaggcccgg cccaccgccg ccgccccccg 300
cccccggtcc ccaccgcccg gcgcgggccc ggggggcggg gctaacccct cccacccccc 360
ctcacgcccc ttccgccttc cgccgcgcct cgccctccgc ctgcgcgtca ccgcagagca 420
cctggcgcgc ctgcgcctgc gacgcgcggg cggggagggg gcgccgaagc cccccgcgac 480
ccccgcgacc cccgcgaccc ccacgcgggt gcgcttctcg ccccacgtcc gggtgcgcca 540
cctggtggtc tgggcctcgg ccgcccgcct ggcgcgccgc ggctcgtggg cccgcgagcg 600
ggccgaccgg gctcggttcc ggcgccgggt ggcggaggcc gaggcggtca tcgggccgtg 660
cctggggccc gaggcccgtg cccgggccct ggcccgcgga gccggcccgg cgaactcggt 720
ctaacgttac acccgaggcg gcctgggtct tccgcggagc tcccgggagc tccgcaccaa 780
gccgctctcc ggagagacga tggcaggagc cgcgcatata tacgcttgga gccggcccgc 840
ccccgaggcg ggcccgccct cggagggcgg gactggccaa tcggcggccg ccagcgcggc 900
ggggcccggc caaccagcgt ccgccgagtc gtcggggccc ggcccactgg gcggtaactc 960
ccgcccagtg ggccgggccg cccacttccc ggtatggtaa ttaaaaactt gcagaggcct 1020
tgttccgctt cccggtatgg taattagaaa ctcattaatg ggcggccccg gccgcccttc 1080
ccgcttccgg caattcccgc ggcccttaat gggcaacccc ggtattcccc gcctcccgcg 1140
ccgcgcgtaa ccactcccct ggggttccgg gttatgttaa ttgctttttt ggcggaacac 1200
acggcccctc gcgcattggc ccgcgggtcg ctcaatgaac ccgcattggt cccctggggt 1260
tccgggtatg gtaatgagtt tcttcgggaa ggcgggaagc cccggggcac cgacgcaggc 1320
caagcccctg ttgcgtcggc gggaggggca tgctaatggg gttctttggg ggacaccggg 1380
ttggtccccc aaatcggggg ccgggccgtg catgctaatg atattctttg ggggcgccgg 1440
gttggtcccc ggggacgggg ccgccccgcg gtgggcctgc ctcccctggg acgcgcggcc 1500
attgggggaa tcgtcactgc cgcccctttg gggaggggaa aggcgtgggg tataagttag 1560
ccctggcccg acggtctggt cgcatttgca cctcggcact cggagcgaga cgcagcagcc 1620
aggcagactc gggccgcccc ctctccgcat caccacagaa gccccgccta cgttgcgacc 1680
cccagggacc ctccgtcagc gaccctccag ccgcatacga cccccatgga gccccgcccc 1740
ggagcgagta cccgccggcc tgagggccgc ccccagcgcg aggtgagggg ccgggcgcca 1800
tgtctggggc gccatgttgg ggggcgccat gttggggggc gccatgttgg gggacccccg 1860
acccttacac tggaaccggc cgccatgttg ggggaccccc actcatacac gggagccggg 1920
cgccatgttg gggcgccatg ttagggggcg tggaaccccg tgacactata tatacaggga 1980
ccgggggcgc catgttaggg ggcgcggaac cccctgaccc tatatataca gggaccgggg 2040
tcgccctgtt aggggtcgcc atgtgacccc ctgactttat atatacagac ccccaacacc 2100
tacacatggc ccctttgact cagacgcagg gcccggggtc gccgtgggac ccccctgact 2160
catacacaga gacacgcccc cacaacaaac acacagggac cggggtcgcc gtgttagggg 2220
gcgtggtccc cactgactca tacgcagggc ccccttactc acacgcatct aggggggtgg 2280
ggaggagccg cccgccatat ttgggggacg ccgtgggacc cccgactccg gtgcgtctgg 2340
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cgaccaccat gacgacgact ccgcctccga ggcggacagc acggacacgg aactgttcga 2700
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cttcccgtgc atgcaccgct tctgcatccc gtgcatgaaa acctggatgc aattgcgcaa 2940
cacctgcccg ctgtgcaacg ccaagctggt gtacctgata gtgggcgtga cgcccagcgg 3000
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ggggaggagg aggagggggg ggggagggag gaataggcgg gcgggcgggc gaggaaaggg 3300
cgggccgggg agggggcgta acctgatcgc gccccccgtt gtctcttgca gcagactacg 3360
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ccgtgacggg cggggcgtct cacgcagccc cccagccggc cgcggctcgg acagcgcccc 3480
cctcggcgcc catcgggcca cacggcagca gtaacactaa caccaccacc aacagcagcg 3540
gcggcggcgg ctcccgccag tcgcgagccg cggtgccgcg gggggcgtct ggcccctccg 3600
ggggggttgg ggttgttgaa gcggaggcgg ggcggccgag gggccggacg ggcccccttg 3660
tcaacagacc cgcccccctt gcaaacaaca gagaccccat agtgatcagc gactcccccc 3720
cggcctctcc ccacaggccc cccgcggcgc ccatgccagg ctccgccccc cgccccggtc 3780
cccccgcgtc cgcggccgcg tcgggccccg cgcgcccccg cgcggccgtg gccccgtgtg 3840
tgcgggcgcc gcctccgggg cccggccccc gcgccccggc ccccggggcg gagccggccg 3900
cccgccccgc ggacgcgcgc cgtgtgcccc agtcgcactc gtccctggct caggccgcga 3960
accaagaaca gagtctgtgc cgggcgcgtg cgacggtggc gcgcggctcg ggggggccgg 4020
gcgtggaggg tggacacggg ccctcccgcg gcgccgcccc ctccggcgcc gccccctccg 4080
gcgccccccc gctcccctcc gccgcctctg tcgagcagga ggcggcggtg cgtccgagga 4140
agaggcgcgg gtcgggccag gaaaacccct ccccccagtc cacgcgtccc cccctcgcgc 4200
cggcaggggc caagagggcg gcgacgcacc ccccctccga ctcagggccg ggggggcgcg 4260
gccagggagg gcccgggacc cccctgacgt cctcggcggc ctccgcctct tcctcctccg 4320
cctcttcctc ctcggccccg actcccgcgg gggccacctc ttccgccacc ggggccgcgt 4380
cctcctccgc ttccgcctcc tcgggcgggg ccgtcggtgc cctgggaggg agacaagagg 4440
aaacctccct cggcccccgc gctgcttctg ggccgcgggg gccgaggaag tgtgcccgga 4500
agacgcgcca cgcggagact tccggggccg tccccgcggg cggcctcacg cgctacctgc 4560
ccatctcggg ggtctctagc gtggtcgccc tgtcgcctta cgtgaacaag acgatcacgg 4620
gggactgcct gcccatcctg gacatggaga cggggaacat cggggcgtac gtggtcctgg 4680
tggaccagac gggaaacatg gcgacccggc tgcgggccgc ggtccccggc tggagccgcc 4740
gcaccctgct ccccgagacc gcgggtaacc acgtgacgcc ccccgagtac ccgacggccc 4800
ccgcgtcgga gtggaacagc ctctggatga cccccgtggg gaacatgctg ttcgaccagg 4860
gcaccctagt gggcgccctg gacttccgca gcctgcggtc tcggcacccg tggtccgggg 4920
agcagggggc 4930
<210> 7
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GFP
<400> 7
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 8
<211> 253
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PD-1 scFv
<400> 8
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Phe Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Phe Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ile
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Phe
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Met Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Phe Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Ser Asp Val Gln Val Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
130 135 140
Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Ser
145 150 155 160
Ser Ile Thr Ser Asp Phe Ala Trp Glu Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly
165 170 175
Asn Lys Leu Glu Cys Met Gly Tyr Ile Gly Tyr Ser Gly Gly Thr Ile
180 185 190
Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser
195 200 205
Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr
210 215 220
Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp His Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe
225 230 235 240
Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
gacgtgtgcg ccgtgtgcac ggatga 26
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
actctgttct tggttcgcgg cctgagcca 29
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
atggcccgcc gccgccatcg c 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
ttagaccgag ttcgccgggc 20
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
atggcgactg acattgatat gctaattga 29
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
ctaaaacagg gagttgcaat aaaaatattt gc 32
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
ctcccagtgg attcgcgggc acagac 26
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
ctgcctgaaa ctcgcgccgc gagga 25
<210> 17
<211> 1470
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> herpes simplex virus 1
<400> 17
ctactcgtcc cagaatttgg ccaggacgtc cttgtagaac gcgggtgggg gggcctgggt 60
ccgcagctgc tccagaaacc tgtcggcgat atcaggggcc gtgatatgcc gggtcacaat 120
agatcgcgcc aggttttcgt cgcggatgtc ctggtagata ggcaggcgtt tcagaagagt 180
ccacggcccc cgctccttgg ggccgataag cgatatgacg tacttaatgt agcggtgttc 240
caccagctcg gtgatggtca tgggatcggg gagccagtcc agggactctg gggcgtcgtg 300
gatgacgtgg cgtcgccggc tggccacata actgcggtgc tcttccagca gctgcgcgtt 360
cgggacctgg acgagctcgg gcggggtgag tatctccgag gaggacgacc tggggccggg 420
gtggcccccg gtaacgtccc ggggatccag ggggaggtcc tcgtcgtctt cgtatccgcc 480
ggcgatctgt tgggttagaa tttcggtcca cgagacgcgc atctcggtgc cgccggcggc 540
cggcggcaaa gggggcctgg tttccgtgga gcgcgagctg gtgtgttccc ggcggatggc 600
ccgccgggtc tgagagcgac tcgggggggt ccagtgacat tcgcgcagca catcctccac 660
ggaggcgtag gtgttattgg gatggaggtc ggtgtggcag cggacaaaga gggccaggaa 720
ctgggggtag ctcatcttaa agtactttag tatatcgcga cagttgatcg tgggaatgta 780
gcaggcgcta atatccaaca caatatcaca gcccatcaac aggaggtcag tgtctgtggt 840
gtacacgtac gcgaccgtgt tggtgtgata gaggttggcg caggcatcgt ccgcctccag 900
ctgacccgag ttaatgtagg cgtaccccag ggcccggaga acgcgaatac agaacagatg 960
cgccagacgc agggccggct tcgagggcgc ggcggacggc agcgcggctc cggacccggc 1020
cgtcccccgg gtccccgagg ccagagaggt gccgcgccgg cgcatgttgg aaaaggcaga 1080
gctgggtctg gagtcggtga tgggggaagg cggtggagag gcgtccacgt cactggcctc 1140
ctcgtccgtc cggcattggg ccgtcgtgcg ggccaggatg gccttggctc caaacacaac 1200
cggctccata caattgaccc cgcgatcggt aacgaagatg gggaaaaggg acttttgggt 1260
aaacaccttt aataagcgac agaggcagtg tagcgtaatg gcctcgcggt cgtaactggg 1320
gtatcggcgc tgatatttga ccaccaacgt gtacatgacg ttccacaggt ccacggcgat 1380
gggggtgaag tacccggccg gggccccaag gccctggcgc ttgaccagat ggtgtgtgtg 1440
ggcaaacttc atcatcccga acaaacccat 1470
<210> 18
<211> 1248
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> herpes simplex virus 1
<400> 18
atgctccgca acgacagcca ccgggccgcg tccccggagg acggccaggg acgggtcgac 60
gacggacggc cacacctcgc gtgcgtgggg gccctggcgc gggggttcat gcatatctgg 120
cttcaggccg ccacgctggg ttttgcggga tcggtcgtta tgtcgcgcgg gccgtacgcg 180
aatgccgcgt ctggggcgtt cgccgtcggg tgcgccgtgc tgggctttat gcgcgcaccc 240
cctcccctcg cgcggcccac cgcgcggata tacgcctggc tcaaactggc ggccggtgga 300
gcggcccttg ttctgtggag tctcggggag cccggaacgc agccgggggc cccgggcccg 360
gccacccagt gcctggcgct gggcgccgcc tatgcggcgc tcctggtgct cgccgatgac 420
gtctatccgc tctttctcct cgccccgggg cccctgttcg tcggcaccct ggggatggtc 480
gtcggcgggc tgacgatcgg aggcagcgcg cgctactggt ggatcggtgg gcccgccgcg 540
gccgccttgg ccgcggcggt gttggcgggc ccgggggcga ccaccgccag ggactgcttc 600
tccagggcgt gccccgacca ccgccgcgtc tgcgtcatcg tcgcaggcga gtctgtttcc 660
cgccgccccc cggaggaccc agagcgaccc ggggaccccg ggccaccgtc ccccccgaca 720
ccccaacgat cccaggggcc gccggccgat gaggtcgcac cggccggggt agcgcggccc 780
gaaaacgtct gggtgcccgt ggtcaccttt ctgggggcgg gcgcgctcgc cgtcaagacg 840
gtgcgagaac atgcccggga aacgccgggc ccgggcctgc cgctgtggcc ccaggtgttt 900
ctcggaggcc atgtggcggt ggccctgacg gagctgtgtc aggcgcttat gccctgggac 960
cttacggacc cgctgctgtt tgttcacgcc ggactgcagg tcatcaacct cgggttggtg 1020
tttcggtttt ccgaggttgt cgtgtatgcg gcgctagggg gtgccgtgtg gatttcgttg 1080
gcgcaggtgc tggggctccg gcgtcgcctg cacaggaagg accccgggga cggggcccgg 1140
ttggcggcga cgcttcgggg cctcttcttc tccgtgtacg cgctggggtt tggggtgggg 1200
gcgctgctgt gccctccggg gtcaacgggc gggtggtcgg gcgattga 1248
<210> 19
<211> 1473
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> herpes simplex virus 1
<400> 19
ctacccaccg tactcgtcaa ttccaagggc atcggtaaac atctgctcaa actcgaagtc 60
ggccatatcc agagcgccgt agggggcgga gtcgtggggg gtaaatcccg gacccgggga 120
atccccgtcc cccaacatgt ccagatcgaa atcgtctagc gcgtcggcat gcgccatcgc 180
cacgtcctcg ccgtctaagt ggagctcgtc ccccaggctg acatcggtcg ggggggccgt 240
cgacagtctg cgcgtgtgtc ccgcggggag aaaggacagg cgcggagccg ccagccccgc 300
ctcttcgggg gcgtcgtcgt ccgggagatc gagcaggccc tcgatggtag acccgtaatt 360
gtttttcgta cgcgcgcggc tgtacgcgtg ttcccgcatg accgcctcgg agggcgaggt 420
cgtgaagctg gaatacgagt ccaacttcgc ccgaatcaac accataaagt acccagaggc 480
gcgggcctgg ttgccatgca gggtgggagg ggtcgtcaac ggcgcccctg gctcctccgt 540
agccgcgctg cgcaccagcg ggaggttaag gtgctcgcga atgtggttta gctcccgcag 600
ccggcgggcc tcgattggca ctccccggac ggtgagcgct ccgttgacga acatgaaggg 660
ctggaacaga cccgccaact gacgccagct ctccaggtcg caacagaggc agtcaaacag 720
gtcgggccgc atcatctgct cggcgtacgc ggcccatagg atctcgcggg tcaaaaatag 780
atacaaatgc aaaaacagaa cacgcgccag acgagcggtc tctcggtagt acctgtccgc 840
gatcgtggcg cgcagcattt ctcccaggtc gcgatcgcgt ccgcgcatgt gcgcctggcg 900
gtgcagctgc cggacgctgg cgcgcaggta ccggtacagg gccgagcaga agttggccaa 960
cacggttcga tagctctcct cccgcgcccg tagctcggcg tggaagaaac gagagagcgc 1020
ttcgtagtag agcccgaggc cgtcgcgggt ggccggaagc gtcgggaagg ccacgtcgcc 1080
gtgggcgcga atgtcgattt gggcgcgttc ggggacgtac gcgtcccccc attccaccac 1140
atcgctgggc agcgttgata ggaatttaca ctcccggtac aggtcggcgt tggtcggtaa 1200
cgccgaaaac aaatcctcgt tccaggtatc gagcatggta catagcgcgg ggcccgcgct 1260
aaagcccaag tcgtcgagga gacggttaaa gagggcggcg ggggggacgg gcatgggcgg 1320
ggagggcatg agctgggcct ggctcaggcg ccccgttgcg tacagcggag gggccgccgg 1380
ggtgtttttg ggacccccgg ccgggcgggg gggtggtggc gaagcgccgt ccgcgtccat 1440
gtcggcaaac agctcgtcga ccaagaggtc cat 1473
<210> 20
<211> 561
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> herpes simplex virus 1
<400> 20
atgacagcga cccccctcac caacctgttc ttacgggccc cggacataac ccacgtggcc 60
cccccttact gcctcaacgc cacctggcag gccgaaacgg ccatgcacac cagcaaaacg 120
gactccgctt gcgtggccgt gcggagttac ctggtccgcg cctcctgtga gaccagcggc 180
acaatccact gctttttctt tgcggtatac aaggacaccc accatacccc tccgctgatt 240
accgagctcc gcaactttgc ggacctggtt aaccacccgc cggtcctacg cgaactggag 300
gataagcgcg gggtgcggct gcggtgtgcg cggccgttta gcgtcgggac gattaaggac 360
gtctctgggt ccggcgcgtc ctcggcggga gagtacacga taaacgggat cgtgtaccac 420
tgccactgtc ggtatccgtt ctcaaaaaca tgctggatgg gggcctccgc ggccctacag 480
cacctgcgct ccatcagctc cagcggcatg gccgcccgcg cggcagagca tcgacgcgtc 540
aagattaaaa ttaaggcgtg a 561
<210> 21
<211> 876
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> herpes simplex virus 1
<400> 21
ctacagggtg gtaaccggat agcagatgtg aggaagtctg ggccgttcgc cgcgaacggc 60
gatcagaggg tccgtttctt gcggaccacg gcccggtgat gtgggttgct cgtctaaaat 120
ctcgggcata cccatacacg cacaacacgg acgccgcacc gaatgggacg tcgtaagggg 180
gtgggaggta gctgggtggg gtttgtgcag agcaatcagg gaccgcagcc agcgcataca 240
atcgcgctcc cgtccgttgg tcccgggcag gaccacgccg tactggtatt cgtaccggct 300
gagcagggtc tccagggggt ggttgggtgc cgcggggaac ggggtccacg ccacggtcca 360
ctcgggcaaa aaccgagtcg gcacggccca cggttctccc acccacgcgt ctggggtctt 420
gatggcgata aatcttaccc cgagccggat tttttgggcg tattcgagaa acggcacaca 480
cagatccgcc gcgcctacca cccacaagtg gtagaggcga ggggggctgg gttggtctcg 540
gtgcaacagt cggaagcacg ccacggcgtc cacgacctcg gtgctctcca aggggctgtc 600
ctccgcaaac aggcccgtgg tggtgtttgg ggggcagcga caggacctag tgcgcacgat 660
cgggcgggtg ggtttgggta agtccatcag cggctcggcc aaccgtcgaa ggttggccgg 720
gcgaacgacg accggggtac ccaggggttc tgatgccaaa atgcggcact gcctaagcag 780
gaagctccac agggccgggc ttgcgtcgac ggaagtccgg ggcagggcgt tgttctggtc 840
aaggagggtc attacgttga cgacaacaac gcccat 876
<210> 22
<211> 2282
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> herpes simplex virus 1
<400> 22
cccgggaccc ccctgacgtc ctcggcggcc tccgcctctt cctcctccgc ctcttcctcc 60
tcggccccga ctcccgcggg ggccacctct tccgccaccg gggccgcgtc ctcctccgct 120
tccgcctcct cgggcggggc cgtcggtgcc ctgggaggga gacaagagga aacctccctc 180
ggcccccgcg ctgcttctgg gccgcggggg ccgaggaagt gtgcccggaa gacgcgccac 240
gcggagactt ccggggccgt ccccgcgggc ggcctcacgc gctacctgcc catctcgggg 300
gtctctagcg tggtcgccct gtcgccttac gtgaacaaga cgatcacggg ggactgcctg 360
cccatcctgg acatggagac ggggaacatc ggggcgtacg tggtcctggt ggaccagacg 420
ggaaacatgg cgacccggct gcgggccgcg gtccccggct ggagccgccg caccctgctc 480
cccgagaccg cgggtaacca cgtgacgccc cccgagtacc cgacggcccc cgcgtcggag 540
tggaacagcc tctggatgac ccccgtgggg aacatgctgt tcgaccaggg caccctagtg 600
ggcgccctgg acttccgcag cctgcggtct cggcacccgt ggtccgggga gcagggggcg 660
tcgacccggg acgagggaaa acaataaggg acgcccccgt gtttgtgggg aggggggggt 720
cgggcgctgg gtggtctctg gccgcgccca ctacaccagc caatccgtgt cggggaggtg 780
gaaagtgaaa gacacgggca ccacacacca gcgggtcttt tgtgttggcc ctaataaaaa 840
aaactcaggg gatttttgct gtctgttggg aaataaaggt ttacttttgt atcttttccc 900
tgtctgtgtt ggatgtatcg cgggggtgcg tgggagtggg ggtgcgtggg agtgggggtg 960
cgtgggagtg ggggtgcgtg ggagtggggg tgcgtgggag tgggggtgcg tgggagtggg 1020
ggtgcgtggg agtgggggtg cgtgggagtg ggggtgcgtg ggagtggggg tgccatgttg 1080
ggcaggctct ggtgttaacc acagagccgc ggcccgggct gcctgaccac cgatccccga 1140
aagcatcctg ccactggcat ggagccagaa ccacagtggg ttgggtgtgg gtgttaagtt 1200
tccgcgagcg cctgcccgcc cggactgacc tggcctctgg ccgccacaaa gggcgggggg 1260
gggggttaac tacactatag ggcaacaaag gatgggaggg gtagcggggc gggacggggc 1320
gcccaaaagg gggtcggcca caccacagac gtgggtgttg gggggtgggg cggaggggtg 1380
gggggggaga cagaaacagg aacatagtta gaaaacaaga atgcggtgca gccagagaat 1440
cacaggagac gaggggatgg gcgtgttggt taccaaccca cacccaggca tgctcggtgg 1500
tatgaaggag ggggggcggt gtttcttaga gaccgccggg ggacgtgggg ttggtgtgca 1560
aaggcacgcg cacccgcgcc ggccaggtgg gccggtaccc catccccccc tcccccgacc 1620
cttcccaccc ccgcgtgcca gagatcaccc cggtcccccg gcacccgcca ctcctccata 1680
tcctcgcttt aggaacaact ttaggggggg gtacacacgc gccgtgcatt tccttccaca 1740
ccccccccct cccccgcact cccccccccc aggcagtaag acccaagcat agagagccag 1800
gcacaaaaac acaggcgggg tgggacacat gccttcttgg agtacgtggg tcattggcgt 1860
ggggggttac agcgacaccg gccgaccccc tggcggtctt ccagccggcc cttagataag 1920
ggggcagttg gtggtcggac gggtaagtaa cagagtctaa ctaagggtgg gaggggggga 1980
aaataacggg ctggtgtgct gtaacacgag cccacccgcg agtggcgtgg ccgaccttag 2040
cctctggggc gccccctgtc gtttgggtcc ccccccctct attggggaga agcaggtgtc 2100
taacctacct ggaaacgcgg cgtctttgtt gaacgacacc ggggcgccct cgacgagtgg 2160
gataacgggg gaggaaggga gggaggaggg tactgggggt gaaggggggg ggggagaagc 2220
gagaacagga aaggcgacgg agcccggcag aacaccgagg aaaaaaaaac cacagcgcat 2280
gc 2282
<210> 23
<211> 1633
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> herpes simplex virus 1
<400> 23
ccatgttggg caggctctgg tgttaaccac agagccgcgg cccgggctgc ctgaccaccg 60
atccccgaaa gcatcctgcc actggcatgg agccagaacc acagtgggtt gggtgtgggt 120
gttaagtttc cgcgagcgcc tgcccgcccg gactgacctg gcctctggcc gccacaaagg 180
gcgggggggg gggttaacta cactataggg caacaaagga tgggaggggt agcggggcgg 240
gacggggcgc ccaaaagggg gtcggccaca ccacagacgt gggtgttggg gggtggggcg 300
gaggggtggg gggggagaca gaaacaggaa catagttaga aaacaagaat gcggtgcagc 360
cagagaatca caggagacga ggggatgggc gtgttggtta ccaacccaca cccaggcatg 420
ctcggtggta tgaaggaggg ggggcggtgt ttcttagaga ccgccggggg acgtggggtt 480
ggtgtgcaaa ggcacgcgca cccgcgccgg ccaggtgggc cggtacccca tccccccctc 540
ccccgaccct tcccaccccc gcgtgccaga gatcaccccg gtcccccggc acccgccact 600
cctccatatc ctcgctttag gaacaacttt aggggggggt acacacgcgc cgtgcatttc 660
cttccacacc ccccccctcc cccgcactcc ccccccccag gcagtaagac ccaagcatag 720
agagccaggc acaaaaacac aggcggggtg ggacacatgc cttcttggag tacgtgggtc 780
attggcgtgg ggggttacag cgacaccggc cgaccccctg gcggtcttcc agccggccct 840
tagataaggg ggcagttggt ggtcggacgg gtaagtaaca gagtctaact aagggtggga 900
gggggggaaa ataacgggct ggtgtgctgt aacacgagcc cacccgcgag tggcgtggcc 960
gaccttagcc tctggggcgc cccctgtcgt ttgggtcccc ccccctctat tggggagaag 1020
caggtgtcta acctacctgg aaacgcggcg tctttgttga acgacaccgg ggcgccctcg 1080
acgagtggga taacggggga ggaagggagg gaggagggta ctgggggtga aggggggggg 1140
ggagaagcga gaacaggaaa ggcgacggag cccggcagaa caccgaggaa aaaaaaacca 1200
cagcgcatgc gccgggccgt tgtggggccc cgggccgggg ccccttgggt ccgccggggc 1260
cccgggccgg gccgccacgg gggccggccg ttggcggtaa ccccgagtgt tcatctcagg 1320
ccccgggccg ggaacccgga aaagcctccg gggggccttt ttcgcgtcgc gtgccggcga 1380
gcgggtccgg acggggcccg gaccgccgcg gtcgggggcc cctcgtcccg ggccgtacgc 1440
ggccttcgcc ccgtgagggg acagacgaac gaaacattcc ggcgacggaa cgaaaaacac 1500
cccagacggg ttaaagaaac agaaaccgca acccccacca cccccgaaac ggggaaaacg 1560
aaaaaacaga ccagcggccg gccggcgctt agggggagga tgtcgccgac gccccttggc 1620
cgccccggct gca 1633
Claims (18)
- 기능성 ICP0 단백질 및 ICP34.5 단백질을 발현하지 않고; 기능성 UL43 단백질, 기능성 UL41 단백질, 기능성 UL48 단백질 또는 이들의 임의의 조합을 발현할 수 있는 재조합 HSV 바이러스.
- 제1항에 있어서, 상기 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 하기 변형을 포함하는 것인, 재조합 HSV 바이러스:
ICP0 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이를 포함하거나, 또는 결실되거나, 또는 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고; 및
ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 각각 독립적으로 기능상실 돌연변이를 포함하거나, 또는 결실되거나, 또는 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환된다. - 제2항에 있어서, 상기 재조합 HSV 바이러스의 게놈은,
(1) ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 기능상실 돌연변이를 포함; 및 ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 기능상실 돌연변이를 포함;
(2) ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 기능상실 돌연변이를 포함; 및 ICP34.5 유전자의 2개의 카피가 결실;
(3) ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 기능상실 돌연변이를 포함; 및 ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환;
(4) ICP0 유전자의 2개의 카피는 결실; 및 ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 기능상실 돌연변이를 포함;
(5) ICP0 유전자의 2개의 카피는 결실; 및 ICP34.5 유전자의 2개의 카피는 결실;
(6) ICP0 유전자의 2개의 카피는 결실; 및 상기 ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환;
(7) ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고, ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환; 및 ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 기능상실 돌연변이를 포함하고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 기능상실 돌연변이를 포함;
(8) ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고, ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환; 및 ICP34.5의 2개의 카피는 결실; 또는
(9) ICP0 유전자의 제1 카피는 제1 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고, ICP0 유전자의 제2 카피는 제2 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환; 및 ICP34.5 유전자의 제1 카피는 제3 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환되고, ICP34.5 유전자의 제2 카피는 제4 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환;
되는 것인, 재조합 HSV 바이러스. - 제3항에 있어서, 상기 재조합 HSV 바이러스는 다음 중 어느 하나 이상인 것인 재조합 HSV 바이러스:
제1 기능상실 돌연변이, 제2 기능상실 돌연변이, 제3 기능상실 돌연변이, 및 제4 기능상실 돌연변이는 각각 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 프레임시프트 돌연변이, 염기 결실, 염기 치환, 염기 첨가 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택; 및
제1 외인성 뉴클레오티드 서열, 제2 외인성 뉴클레오티드 서열, 제3 외인성 뉴클레오티드 서열 및 제4 외인성 뉴클레오티드 서열은 각각 형광 단백질, 면역 조절 폴리펩티드, 사이토카인, 케모카인, 항체, 및 세포독성 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 외래 단백질을 독립적으로 코딩. - 제4항에 있어서, 상기 재조합 HSV 바이러스는 다음 중 어느 하나 이상인 것인 재조합 HSV 바이러스:
(1) 형광 단백질은 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 황색 형광 단백질 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택;
(2) 면역조절 폴리펩티드는 CD40L, OX40L, 유도성 동시 자극 분자(inducible costimulatory molecule; ICOS), FTL3L, LIGHT, CD137L, CD70, 4-1BB, GITR, CD28 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택;
(3) 사이토카인은 인터루킨, 인터페론, 종양 괴사 인자, 콜로니 자극 인자 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택;
(4) 케모카인은 CCL2, RANTES, CCL7, CCL9, CCL10, CCL12, CCL15, CCL19, CCL21, CCL20, XCL-1 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택;
(5) 세포 독성 펩티드는 티미딘 카이네이즈 TK(TK/GCV), TRAIL, FasL 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택; 및
(6) 항체는 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIGIT 항체, 항-BTLA 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-Tim-3 항체, 항-Lag-3 항체, 항-CD137 항체, 항-OX40 항체, 항-GITR 항체, 항-CD73 항체, 항-KIR 항체, 항-ICOS 항체, 항-CSF1R 항체, 항-EGFR 항체, 항-VEGFR 항체, 항-HER2 항체, 항-PDGFR 항체 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택. - 제2항에 있어서, 상기 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 기능성 UL43 단백질을 발현할 수 있는 UL43 유전자, 기능성 UL41 단백질을 발현할 수 있는 UL41 유전자, 기능성 UL48 단백질을 발현할 수 있는 UL48 유전자, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인, 재조합 HSV 바이러스.
- 제6항에 있어서, 상기 재조합 HSV 바이러스는 다음과 같이 이루어진 군으로부터 선택된 하기 특성 중 하나 이상을 추가로 갖는 재조합 HSV 바이러스:
(1) 하나 이상의 비 필수 유전자가 결실 또는 돌연변이;
(2) 재조합 HSV 바이러스의 필수 유전자는 결실되지 않고, 기능상실 돌연변이를 포함하지 않음;
(3) ICP0 유전자의 2개의 카피 및 ICP34.5 유전자의 2개의 카피를 제외하고, 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 야생형 HSV 바이러스의 다른 모든 유전자를 포함하고, 다른 유전자 중 어느 것도 기능상실 돌연변이를 포함하지 않음; 및
(4) 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 하나 이상의 HSV 유전자의 천연 프로모터가 종양-특이적 프로모터로 치환된 변형을 추가로 포함. - 제7항에 있어서, 상기 재조합 HSV 바이러스는 다음과 같이 이루어진 군으로부터 선택된 하기 특성 중 하나 이상을 추가로 갖는 재조합 HSV 바이러스:
(1) 비 필수 유전자는 UL3 유전자, UL4 유전자, UL14 유전자, UL16 유전자, UL21 유전자, UL24 유전자, UL31 유전자, UL32 유전자, US3 유전자, UL51 유전자, UL55 유전자, UL56 유전자, US2 유전자, US12 유전자, LAT 유전자, JQ673480.1의 nt5853-nt7485에 상응하는 뉴클레오티드 단편 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택;
(2) 비 필수 유전자는 기능상실 돌연변이를 포함 또는 외인성 뉴클레오티드 서열로 치환;
(3) 필수 유전자는 ICP27 유전자, ICP4 유전자, VP5 유전자, gL 유전자, gH 유전자, gD 유전자, gK 유전자, gB 유전자, gN 유전자, UL5 유전자, UL6 유전자, UL8 유전자, UL9 유전자, UL12 유전자, UL25 유전자, UL26 유전자, UL28 유전자, UL29 유전자, UL30 유전자, UL33 유전자, UL36 유전자, UL38 유전자, UL42 유전자, UL48 유전자 및 UL52 유전자를 포함; 및
(4) 종양-특이적 프로모터는 hTERT의 프로모터. - 제6항에 있어서, 상기 재조합 HSV 바이러스의 게놈은 다음과 같이 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형을 추가로 포함한다:
(1) VP5 유전자의 천연 프로모터를 종양-특이적 프로모터로 치환;
(2) ICP27 유전자의 천연 프로모터를 종양-특이적 프로모터로 치환;
(3) ICP4 유전자의 천연 프로모터를 종양-특이적 프로모터로 치환; 및
(4) UL55 유전자, US2 유전자, LAT 유전자 및 JQ673480.1의 nt5853-nt7485에 상응하는 뉴클레오티드 단편으로 이루어진 군에서 하나 이상의 결실 또는 돌연변이. - 제1항에 있어서, 상기 재조합 HSV 바이러스는 다음 중 선택된 하나 이상의 특성을 갖는 것인, 재조합 HSV 바이러스:
(1) 재조합 HSV 바이러스는 재조합 HSV-1 바이러스, 재조합 HSV-2 바이러스 또는 재조합 HSV-1/HSV-2 키메라 바이러스;
(2) 재조합 HSV 바이러스는 HSV-1 균주 KOS로부터 유래; 및
(3) 재조합 HSV 바이러스가 제5 외인성 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 HSV 바이러스의 게놈을 포함하거나 또는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 HSV 바이러스의 게놈으로 구성된 바이러스 벡터.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 HSV 바이러스에 감염, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 HSV 바이러스의 게놈을 포함, 또는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 HSV 바이러스의 게놈을 포함하는 바이러스 벡터;로 형질 감염된 숙주 세포.
- 제12항에 있어서, 상기 세포는 폐암 세포, 간암 세포, 유방암 세포, 골육종 세포, 난소암 세포, 자궁 경부암 세포, 전립선 암 세포, 신경 교종 세포, 흑색종 세포, 결장 직장암 세포 및 췌장암 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 세포인 것인, 숙주 세포.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 HSV 바이러스를 얻는 방법:
(1) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 HSV 바이러스로 감염, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 HSV 바이러스의 게놈을 포함, 또는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 HSV 바이러스의 게놈을 포함하는 바이러스 벡터;로 형질감염된 숙주 세포를 배양하는 단계;
(2) 숙주 세포가 용해되어 숙주 세포의 용해물을 수득한 후 숙주 세포를 수집하고 용해시키는 단계; 및
(3) 용해물로부터 재조합 HSV 바이러스를 회수하는 단계. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 HSV 바이러스, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 HSV 바이러스의 게놈, 또는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 재조합 HSV 바이러스의 게놈;을 포함하는 바이러스 벡터; 및
약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제;
를 포함하는 종양 치료용 약학적 조성물. - 제15항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 다음 중 하나 이상을 특징으로 하는 것인, 약학적 조성물:
(1) 약학적 조성물은 폐암, 간암, 유방암, 골육종, 난소암, 전립선암, 신경 교종, 흑색종, 결장 직장암 및 췌장암으로 이루어진 군에서 선택된 종양의 치료용;
(2) 약학적 조성물은 주사용 용액 또는 동결건조된 분말;
(3) 약학적 조성물은 재조합 HSV 바이러스, 재조합 HSV 바이러스의 게놈, 또는 바이러스 벡터;의 치료적 유효량을 포함;
(4) 약학적 조성물은 단위 용량 형태로 존재; 및
(5) 재조합 HSV 바이러스는 약학적 조성물의 단위 용량 당 102-109 pfu 함유. - 삭제
- 제15항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 다음 중 하나 이상을 특징으로 하는 것인, 약학적 조성물:
(1) 종양은 폐암, 간암, 유방암, 골육종, 난소암, 전립선암, 신경 교종, 흑색종, 결장 직장암 및 췌장암으로 이루어진 군에서 선택;
(2) 대상체는 포유 동물; 및
(3) 대상체는 인간.
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