CN102220292B - 重组ii型单纯疱疹病毒、其制备方法及应用和肿瘤诊断试剂盒 - Google Patents
重组ii型单纯疱疹病毒、其制备方法及应用和肿瘤诊断试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种重组II型单纯疱疹病毒，其剔除了野生II型单纯疱疹病毒HG52株的ICP34.5基因，并在其基因组中插入了荧光蛋白表达盒。本发明还提供了前述重组II型单纯疱疹病毒的制备方法，所述的重组II型单纯疱疹病毒在制备诊断肿瘤的药物中的应用以及包括所述的重组II型单纯疱疹病毒的肿瘤诊断试剂盒。本发明提供的重组II型单纯疱疹病毒，剔除了ICP34.5的基因，能选择性地在肿瘤细胞内生长繁殖，并且其插入了荧光蛋白表达盒，能够在肿瘤细胞中发出荧光，从而包括所述的重组II型单纯疱疹病毒的肿瘤诊断试剂盒能够快速、准确、灵敏并广谱地检测出待测样本中是否含有肿瘤细胞。
Description
技术领域
本发明涉及重组II型单纯疱疹病毒及其制备方法、所述重组II型单纯疱疹病毒的制备方法，所述的重组II型单纯疱疹病毒在制备诊断肿瘤的药物中的应用以及包括所述的重组II型单纯疱疹病毒的肿瘤诊断试剂盒。
背景技术
现有的肿瘤的早期诊断以及肿瘤转移诊断技术存在诸多不足。
例如，影像学诊断(如X线诊断技术、超声波诊断技术、X线计算机体层摄影术(CT)、内镜技术、磁共振成像(MRI)、多层螺旋CT、正电子发射体层扫描(PET)等技术)对微小转移灶的检出率低；病理组织学诊断(如前哨淋巴结活检、骨髓穿刺活检等)会给受试者带来很大痛苦，并且诊断结果受取样部位以及医生经验影响，造成准确率欠佳且灵敏度差；血清肿瘤标志物的检测(如c-erbB2蛋白、癌胚抗原(CEA)、糖蛋白(CA15-3)、粘液样癌相关抗原(MCA)、白细胞介素(IL)-6、IL-8、E-selectin、组织蛋白酶D、碱性纤维母细胞生长因子β(TGFβ)等)存在每种标记物对应的肿瘤种类少以及每种肿瘤存在多种标记物的问题，造成假阳性偏高等等。
综上，急需快速、准确、灵敏并广谱的肿瘤的早期诊断以及肿瘤转移诊断技术。
发明内容
本发明的目的是克服现有的肿瘤早期诊断以及肿瘤转移诊断方法微小转移灶的检出率低、检测灵敏度差以及能够检测到的肿瘤种类有限的缺点，提供一种重组II型单纯疱疹病毒，使用该病毒可以快速、准确、灵敏并广谱地实现肿瘤的早期诊断以及肿瘤转移的诊断。
本发明提供了一种重组II型单纯疱疹病毒，其中，所述病毒剔除了野生II型单纯疱疹病毒HG52株的ICP34.5基因，并在其基因组中插入了荧光蛋白表达盒。
本发明还提供了一种重组II型单纯疱疹病毒的制备方法，其中，该方法包括从野生型II型单纯疱疹病毒HG52株中剔除ICP34.5基因，构建重组II型单纯疱疹病毒HG52d34.5-荧光蛋白的步骤：
A.提取野生II型单纯疱疹病毒HG52株的全长病毒DNA；
B.构建含有ICP34.5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒pH2dI34.5：
B1.使用表1所示的引物，以步骤A得到的全长病毒DNA为模板，PCR扩增ICP34.5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列；
表1
B2.将步骤B1扩增所得PCR产物上游侧翼区序列插入到pSP72质粒的PvuII/XbaI位点，得到pSP72H2d34.5US质粒；
B3.将步骤B1扩增所得PCR产物下游侧翼区序列插入到步骤B2获得的pSP72H2d34.5US质粒的EcoRV/BglII位点，得到含ICP34.5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的pH2d34.5质粒；
B4.将荧光蛋白表达盒插入到步骤B3获得的pH2d34.5质粒的EcoRV位点，得到pH2d34.5荧光蛋白质粒；
C.构建剔除ICP34.5基因的重组II型单纯疱疹病毒HG52d34.5荧光蛋白：
C1.将步骤A得到的野生II型单纯疱疹病毒HG52株的全长病毒DNA与步骤B得到的pH2d34.5荧光蛋白质粒共转染BHK细胞，全长病毒DNA上的ICP34.5基因与pH2d34.5荧光蛋白质粒上的荧光蛋白表达盒发生同源重组，发生重组病毒的毒斑发荧光；
C2.挑选荧光毒斑，纯化出重组II型单纯疱疹病毒HG52d34.5-荧光蛋白。
本发明还提供了本发明所述的重组II型单纯疱疹病毒在制备诊断肿瘤的药物中的应用。
本发明还提供了一种肿瘤诊断试剂盒，其中，所述试剂盒包括本发明所述的重组II型单纯疱疹病毒。
本发明所述的重组II型单纯疱疹病毒，剔除了ICP34.5的基因，能选择性地在肿瘤细胞内生长繁殖，并且其插入了荧光蛋白表达盒，能够在肿瘤细胞中发出荧光，从而包括所述的重组II型单纯疱疹病毒的肿瘤诊断试剂盒能够快速、准确、灵敏并广谱地检测出待测样本中是否含有肿瘤细胞。
本发明获得的单纯疱疹病毒的分类命名为II型单纯疱疹病毒，拉丁文学名为Herpes Simplex Virus Type 2，于2010年3月26日保藏至位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.3593。被保藏的生物材料H2d3d4-GFP株，其株号的含义为：H2指II型单纯疱疹病毒HG52株(HSV2)；d3指剔除ICP34.5；d4指剔除ICP47；GFP指插入绿色荧光蛋白表达盒。
附图说明
图1为本发明实施例1的重组II型单纯疱疹病毒的示意图；
图2为通过DNA同源重组技术构建本发明的重组II型单纯疱疹病毒的示意图；
图3为构建ICP47侧翼区域(Flanking Region，简称FLR)及相关质粒的示意图；
图4为构建HG52dICP47-GFP的示意图；
图5为构建HG52dICP47的示意图；
图6为构建ICP34.5侧翼区域(FLRs)及相关质粒的示意图；
图7为构建HG52d47d34.5-GFP的示意图；
图8为实施例5的试剂盒检测肿瘤细胞密度为5个/毫升全血的荧光照片(放大倍数400倍)结果；
图9为实施例5的试剂盒检测肿瘤细胞密度为0个/毫升全血的荧光照片(放大倍数400倍)结果。
具体实施方式
本发明提供了一种重组II型单纯疱疹病毒，其中，所述病毒剔除了野生II型单纯疱疹病毒HG52株的ICP34.5基因，并在其基因组中插入了荧光蛋白表达盒。
本发明的重组II型单纯疱疹病毒的基因组中可以插入本领域可用的各种荧光蛋白表达盒。所述荧光蛋白表达盒优选选自由绿色荧光蛋白表达盒、青色荧光蛋白表达盒、红色荧光蛋白表达盒和黄色荧光蛋白表达盒所组成的组中。最优选绿色荧光蛋白表达盒。其中，所述荧光蛋白的颜色(绿、青、红和黄等)是由它们的荧光发射光落入可见光谱的哪个公知波长范围内来确定的。所述青色(蓝色)荧光蛋白是将绿色荧光蛋白的66位的酪氨酸残基突变为组氨酸形成的。这一转变使蓝色发射光最大波长为450nm，而突变为色胺后，荧光的峰值可在480nm。所述红色荧光蛋白可以来源于珊瑚、水母和海葵(例如Discosoma striata)。得自Discosoma striata红色荧光蛋白DsRed的荧光发射光谱峰值为583nm而激发光谱主要峰值为558nm，其他次要峰值在500nm附近。黄色荧光蛋白能通过将绿色荧光蛋白的203位苏氨酸突变为色氨酸，得到稳定生色团在激发状态的偶极矩，从而使激发光和发射光的波长均增加20nm。增强黄色荧光蛋白(EYFP)是目前应用最广最亮的荧光蛋白之一。所述荧光蛋白所发的荧光可以通过荧光显微镜或流式细胞仪等常规的检测手段和仪器得到定量或定性的检测。
优选情况下，所述的重组II型单纯疱疹病毒还剔除了野生II型单纯疱疹病毒HG52株的ICP47基因。在不影响重组II型单纯疱疹病毒特异性转染肿瘤细胞以及繁殖的前提下，剔出不必要的基因可以使病毒繁殖得更快。本发明对荧光蛋白表达盒的插入位置并没有特别的限定，优选重组II型单纯疱疹病毒在被剔除的ICP34.5基因的位置上和/或被剔除的ICP47基因的位置上插入荧光蛋白表达盒。更优选地，所述病毒在被剔除的ICP34.5基因的位置上插入绿色荧光蛋白表达盒。
本发明还提供了一种重组II型单纯疱疹病毒的制备方法，其中，该方法包括从野生型II型单纯疱疹病毒HG52株中剔除ICP34.5基因，构建重组II型单纯疱疹病毒HG52d34.5-荧光蛋白的步骤：
A.提取野生II型单纯疱疹病毒HG52株的全长病毒DNA；
B.构建含有ICP34.5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒pH2dI34.5：
B1.使用表1所示的引物，以步骤A得到的全长病毒DNA为模板，PCR扩增ICP34.5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列；
表1
B2.将步骤B1扩增所得PCR产物上游侧翼区序列插入到pSP72质粒的PvuII/XbaI位点，得到pSP72H2d34.5US质粒；
B3.将步骤B1扩增所得PCR产物下游侧翼区序列插入到步骤B2获得的pSP72H2d34.5US质粒的EcoRV/BglII位点，得到含ICP34.5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的pH2d34.5质粒；
B4.将荧光蛋白表达盒插入到步骤B3获得的pH2d34.5质粒的EcoRV位点，得到pH2d34.5荧光蛋白质粒；
C.构建剔除ICP34.5基因的重组II型单纯疱疹病毒HG52d34.5荧光蛋白：
C1.将步骤A得到的野生II型单纯疱疹病毒HG52株的全长病毒DNA与步骤B得到的pH2d34.5荧光蛋白质粒共转染BHK细胞，全长病毒DNA上的ICP34.5基因与pH2d34.5荧光蛋白质粒上的荧光蛋白表达盒发生同源重组，发生重组病毒的毒斑发荧光；
C2.挑选荧光毒斑，纯化出重组II型单纯疱疹病毒HG52d34.5-荧光蛋白。
同理，本发明所述的重组II型单纯疱疹病毒的制备方法中，可以使用本领域常用的荧光蛋白表达盒。优选地，所述荧光蛋白表达盒选自由绿色荧光蛋白表达盒、青色荧光蛋白表达盒、红色荧光蛋白表达盒和黄色荧光蛋白表达盒所组成的组中。
优选地，重组II型单纯疱疹病毒的制备方法，其中，所述方法还包括从野生型II型单纯疱疹病毒HG52株中剔除ICP47基因，构建HG52dICP47重组II型单纯疱疹病毒的步骤：
a.提取野生型II型单纯疱疹病毒HG52株的全长病毒DNA；
b.构建含有ICP47基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒pdICP47H2：
b1.使用表2所示的引物，以步骤a得到的全长病毒DNA为模板，PCR扩增ICP47基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列；
表2
b2.将步骤b1扩增所得PCR产物上游侧翼区序列插入到pSP73质粒的SmaI位点，得到pSP73ICP47US质粒；
b3.将步骤b1扩增所得PCR产物下游侧翼区序列插入到pSP73质粒的SmaI位点，得到pICP47DS质粒；
b4.用限制性内切酶SacI和BamHI从步骤b3获得的pICP47DS质粒中酶切出下游侧翼区序列，并将该下游侧翼区序列插入到步骤b2获得的pSP73ICP47US质粒的BglII位点，得到含ICP47基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的pdICP47H2质粒，
b5.将荧光蛋白表达盒插入到步骤b4获得的pdICP47H2质粒的EcoRV位点，得到pdICP47H2-荧光蛋白质粒；
c.构建剔除ICP47基因的重组II型单纯疱疹病毒HG52dICP47：
c1.将步骤a得到的全长病毒DNA与步骤b得到的pdICP47H2-荧光蛋白质粒共转染BHK细胞，全长病毒DNA上的ICP47基因与pdICP47H2-荧光蛋白质粒上的荧光蛋白表达盒发生同源重组，发生重组病毒的毒斑发荧光；
c2.挑选荧光毒斑，纯化出重组II型单纯疱疹病毒HG52dICP47-荧光蛋白；
c 3.提取重组II型单纯疱疹病毒HG52dICP47-荧光蛋白的全长病毒DNA；
c4.将步骤c3得到的重组II型单纯疱疹病毒HG52dICP47-荧光蛋白的全长病毒DNA与步骤b4获得的pdICP47H2质粒共转染BHK细胞，重组II型单纯疱疹病毒HG52dICP47-荧光蛋白上的荧光蛋白表达盒发生同源重组被剔除；
c5.挑选无荧光毒斑，纯化出重组II型单纯疱疹病毒HG52dICP47；
d.构建剔除ICP34.5基因的重组II型单纯疱疹病毒载体HG52dICP47d34.5-荧光蛋白：
d1.将步骤c5得到的重组II型单纯疱疹病毒HG52dICP47的全长病毒DNA与的步骤B4得到的pH2d34.5荧光蛋白质粒共转染BHK细胞，全长病毒DNA上的ICP34.5基因与pH2d34.5荧光蛋白质粒上的荧光蛋白表达盒发生同源重组，发生重组病毒的毒斑发荧光；
d2.挑选荧光毒斑，纯化出重组II型单纯疱疹病毒HG52dICP47d34.5-荧光蛋白。
更优选地，所述的重组II型单纯疱疹病毒的制备方法包括以下步骤：
e1.将步骤c3得到的重组II型单纯疱疹病毒HG52dICP47-荧光蛋白的全长病毒DNA与的步骤B4得到的pH2d34.5荧光蛋白质粒共转染BHK细胞，全长病毒DNA上的ICP34.5基因与pH2d34.5荧光蛋白质粒上的荧光蛋白表达盒发生同源重组，得到重组II型单纯疱疹病毒HG52dICP47-荧光蛋白-d34.5-荧光蛋白；
或者e2将的步骤C2得到的重组II型单纯疱疹病毒HG52d34.5-荧光蛋白的全长病毒DNA与步骤b5得到的pdICP47H2-荧光蛋白质粒共转染BHK细胞，全长病毒DNA上的ICP47基因与pdICP47H2-荧光蛋白质粒上的荧光蛋白表达盒发生同源重组，得到重组II型单纯疱疹病毒HG52dICP47-荧光蛋白-d34.5-荧光蛋白。
进一步优选地，本发明的重组II型单纯疱疹病毒的制备方法还包括对所有涉及的质粒进行测序以证实无突变发生的步骤。对于质粒序列的监控，可以保证整个载体制备过程的准确性。
本发明所得的重组II型单纯疱疹病毒可以采用常规的方法保存。例如短期保存可将直接将病毒封存于或悬浮于50％甘油盐水中，置于-30℃冰箱中。长期保存可以采用：
(1)快速低温冰冻法，在病毒悬浮液内加入灭活的动物血清或其它蛋白保护剂，优选再加二甲基亚砜(例如5％至10％)，并迅速冷冻和保存于-70℃或-196℃下。含有病毒的组织材料可以直接低温冰冻保存；如先浸入50％甘油缓冲盐水中，再行低温保存(-70℃或-196℃下)。
(2)冷冻干燥法，在真空条件下使冰冻的病毒悬浮液脱水。通常是用低温脱水法，并以干燥剂或冷凝法除去冷凝器内尚未凝结的多余水汽。常用的干燥剂有五氧化二磷、硫酸钙、氯化钙和硅胶等。冷冻干燥病毒时，一般应用脱脂牛乳、灭活的正常动物血清、饱和蔗糖溶液等作为保护剂。真空干燥时，将病毒悬浮液与5-10倍量的保护剂混合，分装安瓶，每支0.2-0.5ml，立即放入事先预冷的-30℃至-40℃酒精中冻结1-2小时，随后迅速置于盛有干燥剂的干燥器内，立即抽气干燥。充分干燥后，打开干燥器取出干燥毒种安瓶，再行抽气使其真空，并在火焰上熔封安瓶口。这样的冻干毒种一般可在4℃冰箱内保存几年到十年以上。这样可以得到本发明所得的重组II型单纯疱疹病毒干粉。
本发明还提供了本发明所述的重组II型单纯疱疹病毒在制备诊断肿瘤的药物中的应用。
本发明还提供了一种肿瘤诊断试剂盒，其中，所述试剂盒包括本发明所述的重组II型单纯疱疹病毒。本发明肿瘤诊断试剂盒中的重组II型单纯疱疹病毒可以是重组II型单纯疱疹病毒干粉形式，也可以是重组II型单纯疱疹病毒悬浮液的形式。
本发明所述的肿瘤诊断试剂盒所检测的样品可以是含有活肿瘤细胞的任何液体待测样本，例如骨髓和各种体液：脑脊液、关节液、腹水、心包液、唾液、精液、阴道的液体、乳汁、血液、组织液、淋巴液、尿液、汗液、肺腔的液体，腹膜的液体，关节的液体、羊水、胸腔积液和腹腔积液等。优选选自受试者全血、血浆、淋巴细胞悬浮液、骨髓、胸腔积液和腹腔积液所组成的组中。所述淋巴细胞悬浮液是指经密度梯度离心等本领域常用的技术手段从体液(例如外周血)中分离的淋巴细胞悬浮液。所述体液在进行检测时可以进行适当的处理，例如对全血样本加入肝素等抗凝剂抗凝。
由于本发明的重组II型疱疹病毒能够转染几乎各种类型的肿瘤细胞，因此本发明所述的肿瘤诊断试剂盒适用于多种肿瘤的早期诊断以及多种肿瘤转移的诊断。尤其适用于循环系统原发灶以及各种癌症转移灶的诊断。转移瘤性癌包括的脑部转移瘤、肺部转移瘤、肝部转移瘤、颈部转移瘤。具体地，可以适用于涉及B-细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、总细胞白血病、中性细胞白血病、T-细胞白血病、慢性T-细胞白血病、HTLV-II-联合白血病、急性淋巴囊肿白血病、慢性淋巴囊肿白血病、肥大细胞白血病和脊髓白血病等的原发灶，并且可以适用于以下肿瘤的转移灶：内鼻腔癌、骨鼻窦癌、鼻咽癌、唇癌、口腔癌、口咽癌、喉癌、下咽部癌、耳癌、美克耳细胞癌、唾液腺癌肺癌、非-小细胞支气管癌、小细胞支气管癌、纵隔癌、细支气管-小泡癌、小支气管癌食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌和胆管癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、肝细胞癌、肾癌、扁平细胞癌、输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌、睾丸癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、恶性滋养层疾病、卵巢癌、输卵管癌、腹腔癌、乳房癌、乳腺癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副肾外皮癌、内分泌胰腺癌、多内分泌瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、间皮瘤、皮肤癌、黑素瘤、中央神经系统癌、髓母细胞瘤、星形细胞瘤、骨髓癌和神经节细胞瘤、眼癌、成神经细胞瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、中央神经系统的基本淋巴瘤、急性白血病、淋巴组织白血病、血浆细胞瘤、骨髓纤维化综合症、涉及B-细胞白血病、总细胞白血病、中性细胞白血病、T-细胞白血病、慢性T-细胞白血病、HTLV-II-联合白血病、急性淋巴囊肿白血病、慢性淋巴囊肿白血病、肥大细胞白血病和脊髓白血病、迷芽瘤、导管癌、网状内皮细胞组织增殖、成软骨细胞瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、纤维瘤、纤维肉瘤；大细胞癌、脂肪瘤、脂肪肉瘤、白血病性肉瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、骨皮瘤、尤因皮瘤；滑膜瘤；腺纤维瘤；腺淋巴瘤、脊索瘤、颅咽管瘤、无性细胞瘤、错构瘤、间质瘤、中肾瘤、肌肉瘤、成釉细胞瘤、牙骨质瘤、牙瘤、畸胎瘤、胸腺瘤、成绒毛膜细胞瘤、腺肌肉瘤、腺瘤、胆管瘤、珠光瘤、圆柱瘤、囊腺瘤、粒层细胞癌、汗腺腺瘤、岛状细胞瘤、乳突淋瘤、塞尔托利细胞癌、囊细胞癌、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成肌细胞瘤、肌瘤、肌肉瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、室管瘤、神经节细胞瘤、神经胶质瘤；成神经管细胞瘤、脑脊膜瘤、神经鞘瘤、成神经细胞瘤、神经上皮瘤、纤维神经瘤、神经瘤、副神经节瘤、非嗜铬副神经节瘤、血管角质瘤、嗜酸性的成血管淋巴增殖、硬化型血管瘤、血管肉瘤、血管球瘤、血管内皮瘤、血管瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管瘤、松果体瘤、叶状膀胱肉瘤、淋巴管肉瘤、卵巢瘤、卡波济氏肉瘤、肥大细胞肉瘤、胸腔瘤、消化系统瘤、脑垂体瘤、眼眶瘤、头部和颈部肿瘤、耳部肿瘤、骨盆肿瘤、多发性神经纤维瘤。本发明还适用于免疫力缺陷导致的恶性肿瘤，例如AIDS导致的恶性肿瘤，如卡波济氏肉瘤、与AIDS联发的淋巴瘤、与AIDS联发的中央神经系统淋巴瘤、与AIDS联发的霍奇金疾病和与AIDS联发的肛门与生殖器癌、乳头状瘤。
优选地，本发明所述的肿瘤诊断试剂盒还包括：
(1)RPMI-1640培养基、pH为7的红细胞裂解液和pH为7.2-7.4的磷酸缓冲液，其中，所述红细胞裂解液包含0.15M氯化铵、10nM碳酸氢钾和1nM乙二胺四乙酸；或者
(2)RPMI-1640培养基、比重为1.077±0.001千克/升的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Urografin)和pH为7.2-7.4的磷酸缓冲液。
所述RPMI-1640培养基用于将本发明的重组II型单纯疱疹病毒制备成病毒滴度为1×106PFU/ml至1×108PFU(空斑形成单位)/ml的病毒悬液，并维持待测样本中肿瘤细胞的增殖，优选制备成病毒滴度为5×106PFU/ml至5×107PFU/ml(空斑形成单位)的病毒悬液。本领域中常规使用的能够起到同样作用的细胞培养基也可以包括在本发明的肿瘤诊断试剂盒中，例如DMEM培养基、F12培养基等。由于全血样品中存在大量无核红细胞，可能会影响到对荧光的观察，因此对于全血样品等红细胞含量高的待测样本可以使用所述红细胞裂解液事先除去待测样本中的红细胞，所述待测样本中的其他有核细胞不会被裂解。
本发明的肿瘤诊断试剂盒的使用方法可以以说明书的形式包括在本发明的肿瘤诊断试剂盒中。本发明的肿瘤诊断试剂盒的使用方法可以包括以下步骤：
1)取受试者外周血5ml，加入45ml红细胞裂解液，室温下孵育10分钟。
2)待红细胞裂解后，离心(2000rpm，10分钟)。
3)去上清，将细胞沉淀重悬浮于10ml pH值为7.3的磷酸缓冲液(PBS)，离心(2000rpm，10分钟)。
4)去上清，将细胞沉淀重悬浮于0.2ml RPMI-1640中。
5)将0.2ml由步骤4)得到的细胞与0.1ml本发明重组II性疱疹病毒悬液(106Pfu/ml)混合并加入24孔培养板的孔中。
6)将培养板孵育于含5％CO2的37℃孵箱内。
7)6-10小时后用荧光显微镜或流式细胞仪检测发荧光的肿瘤细胞，并计数。
或者包括：
1)在50ml离心管中加入10ml比重为1.077±0.001千克/升的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Urografin)。
2)取5ml肝素抗凝静脉血与等体积pH值为7.3的PBS充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。
3)离心后管内分为三层，上层为血清和PBS液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为单个核细胞(包括淋巴细胞、单核细胞及肿瘤细胞)。
4)吸取单个核细胞层。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的pH值为7.3的PBS，1500rpm×10分钟，用所述PBS洗涤细胞两次。再将细胞重悬浮于0.4ml的RPMI1640中。
5)将0.4ml由步骤4)得到的细胞与0.1ml本发明重组II性疱疹病毒悬液(106Pfu/ml)混合并加入12孔培养板的孔中。
6)将所述培养板孵育于含5％CO2的37℃孵箱内。
7)6-10小时后用荧光显微镜或流式细胞仪检测发荧光的肿瘤细胞，并计数。
本发明的肿瘤诊断试剂盒最低能够检测到1个肿瘤细胞/毫升浓度的肿瘤细胞；每ml血中≥5个肿瘤细胞的情况下灵敏度和准确性都很高。
本发明涉及的单纯疱疹病毒的分类命名为单纯疱疹病毒II型HG52株，拉丁文学名为Herps simplex virus type II，Genbank编号Z86099，可以商购，例如可以从英国健康保护部培养物保藏协会(Health Protection Agency CultureCollections)(英国HPA)购买。HG52全基因组序列已知。
下面结合实施例进一步说明本发明，除非特别说明本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。
实施例1
本实施例用于说明本发明的重组II型单纯疱疹病毒。
从野生型HSV-2(HG52)基因组中剔除ICP47基因，构建HG52dICP47。
(1)纯化HG52野生型病毒的DNA
用BHK细胞培养野生型HG52病毒，用DNAzolTM基因组DNA分离试剂盒(Helena Biosciences Cat.No.DN127200)纯化病毒DNA。将BHK细胞生长于175平方厘米的培养瓶中，培养液为含10％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM。培养条件为37℃，5％二氧化碳。当细胞长至90％饱和时，接种病毒。继续孵化24-48小时，当90％以上细胞出现细胞病变时，去除培养液，并加入10ml的DNAzol。用10ml吸管吸吹5次、并将细胞裂解液转移到50ml的Falcon试管中，加入5ml的100％乙醇，轻轻地作圆周运动摇动试管，让病毒DNA充分析出。用吸头将DNA挑到另一试管中，用70％的乙醇洗一遍，再用吸头将DNA挑到小离心管中。吸净残留的乙醇，将DNA溶于1ml灭菌水中，分装后存于-20℃备用。
(2)构建pdICP47H2质粒
ICP47基因在HG52基因组中位于nt147775-148035。剔除ICP47基因，需构建含ICP47基因上游侧翼区序列、下游侧翼区序列(FLR)的质粒。上游侧翼区序列和下游游侧翼区序列均经PCR扩增。PCR使用的引物如下：
上游(US)FLR：nt146554-147775DNA片段
正向引物146554AGAGTCACGACGCATTTGCCC146574
反向引物147775ATACGATCTCGTCGACCGGGG147755
下游(DS)FLR：nt148033-149211DNA片段
正向引物148033CATGGTGTCCCGTCCACGAAG148053
反向引物149211GGTTCGTGGTAATGAGATGCC149191
PCR(50ul反应体积)扩增上游和下游FLR时，均用以下反应条件
20ng野生型病毒DNA
30mM Tris-HCl(pH9.2)
10mM硫酸镁
15mM氯化钠
100uM dNTPs
50pMol正向引物
50pMol反向引物
1U(酶反应单位)TaqDNA聚合酶
35个循环扩增，每个循环的温度和时间为：95℃，60秒；62℃，20秒；72℃，120秒。
将上FLR和下游FLR克隆到pSP73中，即得到pdICP47H2(如图3所示)。
从pcDNA3CMFGFP质粒中，用Nru I/Pvu II酶切下CMV-GFP-BGHpA片段、并插入pdICP47H2的EcoRV位点，得到pdICP47H2GFP(如图3所示)。
(3)构建剔除ICP47基因的HG52重组病毒(HG52dICP47)所使用的溶液和细胞：
A、病毒DNA，1毫克/毫升，用DNAzol试剂盒制备(同上)。
B、质粒DNA 1毫克/毫升。
C、Hepes转染缓冲液，140mM NaCL，5mM KCL，0.75mM Na2HPO4，5.5mM D-glucose，20mM Hepes，pH为7.05。(0.22μm孔径滤膜常温过滤除菌)
D、2M CaCl2(过滤除菌，室温保存)
E、6孔培养板上有80-90％密度生长的BHK细胞。
F、1.6％的羧甲基纤维素(CMC，121℃下20分钟高压灭菌)
操作步骤：
1)取两个无菌的eppendorf试管，在其中一个里加入400微升的Hepes转染缓冲液。
2)在另一试管中加入31微升2M CaCl2，20微升病毒DNA，8微升质粒DNA。轻轻混匀后，用移液器将其缓慢加入到400微升的Hepes转染缓冲液中。
3)轻轻混匀后，于室温下静置40分钟。
4)40分钟后，在6孔培养板中吸去BHK细胞的培养液，将上述转染混合液缓慢加入培养板中，每一孔对应一个转染混合液，然后5％CO2、37℃孵箱中放置30分钟。
5)30分钟后在每孔中加入1毫升细胞培养液，然后再将细胞培养板放回37℃孵箱中，孵育5小时。
6)用Hepes缓冲液配制20％DMSO溶液，置于冰中。
7)5小时后，移去培养板中的所有培养液，并用1毫升新鲜培养液清洗细胞2次。
8)每孔加入1毫升20％DMSO液，室温下放置90秒。
9)迅速移去20％DMSO液、并用新鲜培养液小心清洗细胞2次。
10)每孔中加入2毫升新鲜细胞培养液，置37℃，5％CO2孵化箱。48小时可观察到病毒噬斑。将培养板置于-70℃冰箱冻存一次。解冻后，收获细胞和培养液。
11)用6孔培养板培养BHK细胞，待细胞达70％密度时，吸除培养液并每孔加入1ml无血清培养液，然后每孔加入0.1或10微升收获液并覆盖2ml的CMC∶完全培养液(2∶5)。培养两天后，在显微镜直视下，用20微升移液枪挑取带有绿色荧光的病毒噬斑，即为剔除了ICP47基因的HG52重组病毒(HG52dICP47-GFP，如图4所示)。经5次挑斑纯化重组病毒，再用如前所述的方法培养病毒并制备提取病毒基因组DNA。
12)将纯化的HG52dICP47-GFP病毒DNA与pdICP47H2质粒DNA一起转染BHK细胞，HG52dICP47-GFP上的GFP经重组后被剔除，得到HG52dICP47重组病毒(如图5所示)。此轮重组病毒形成的病毒噬斑不发绿色荧光，故挑选无绿荧光的病毒斑，经5次的挑斑纯化，然后进行重组病毒的培养及病毒DNA的提取。
剔除ICP34.5基因，构建HG52dICP47dICP34.5-GFP
(1)构建pH2d34.5质粒。
PCR扩增出ICP34.5基因上游侧翼区序列下游侧翼区序列(FlankingRegion，简称FLR)。所用PCR引物序列见下表1。
表1
PCR(50ul反应体积)扩增上游和下游FLR时，均用以下反应条件
20ng野生型病毒DNA
30mMTris-HCl(pH9.2)
10mM硫酸镁
15mM氯化钠
100uMdNTPs
50pMol正向引物
50pMol反向引物
1U(酶反应单位)TaqDNA聚合酶
35个循环扩增，每个循环的温度和时间为：95℃，60秒；62℃，20秒；72℃，120秒。
首先，上游FLR的PCR产物插入到pSP72质粒的PvuII/XbaI位点，得到pSP72H2d34.5US。下游FLR的PCR产物则插入到pSP72H2d34.5US的EcoRV/BglII位点，得到含ICP34.5基因上下游侧翼区序列的pH2d34.5。最后，将CMV IE启动子控制的GFP表达盒插入到pH2d34.5的EcoRV位点，得到pH2d34.5-GFP。pH2d34.5及有关质粒的构建见图6。所有质粒均经序列分析证实无突变。
用6孔培养板准备80-90％密度的BHK细胞。
将上述HG52dICP47病毒DNA与pH2d34.5-GFP质粒DNA共同转染BHK细胞内，经同源重组，GFP表达盒置换了ICP34.5基因，使重组病毒的毒斑发绿色荧光。经过5轮的噬斑纯化，挑选绿荧光毒斑，就能纯化重组病毒(HG52dICP47d34.5GFP，如图7所示)。
重组病毒(HG52dICP47d34.5GFP)经培养扩增，最终得到1010pfu的重组病毒溶液，溶剂为DMEM培养基。
实施例2-4
本实施例用于说明本发明的重组II型单纯疱疹病毒。
按照与实施例1的步骤相同的原理，制备实施例2的重组病毒HG52d34.5GFP(剔除ICP34.5基因，并在ICP34.5基因的位置上插入GFP表达盒)、实施例3的重组病毒HG52dICP47GFPd34.5(剔除ICP34.5基因和ICP47基因，并在ICP47基因的位置上插入GFP表达盒)和实施例4HG52dICP47GFPd34.5GFP(剔除ICP34.5基因和ICP47基因，并在ICP34.5基因和ICP47基因的位置上插入GFP表达盒)。
实施例5-12
本实施例用于说明本发明的肿瘤诊断试剂盒。
将实施例1-4制得的1010pfu的重组病毒溶液在2000rpm的条件下离心10分钟，弃去上清的DMEM培养基，并使病毒悬浮在RPMI-1640培养基中，并且得到病毒滴度为1×107cfu的病毒悬浮液。
病毒滴度为1×107cfu的实施例1-4的病毒悬浮液分别与pH为7的红细胞裂解液和pH为7.3的磷酸缓冲液构成实施例5-8的肿瘤诊断试剂盒，其中，所述红细胞裂解液由0.15M氯化铵、10nM碳酸氢钾和1nM乙二胺四乙酸组成。
病毒滴度为1×107cfu的实施例1-4的病毒悬浮液分别与比重为1.077±0.001千克/升的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Urografin)和pH为7.3的磷酸缓冲液实施例9-12的肿瘤诊断试剂盒。
检测实施例1
本检测实施例用于说明本发明的肿瘤诊断试剂盒的有效性和灵敏度。
取35岁男性健康志愿者外周血全血200ml，加入40毫克(4000个国际单位)肝素抗凝，每40ml分别混入从ATCC购买的人皮肤黑素瘤细胞SK-MEL-28，使该肿瘤细胞的密度分别达到0个/毫升全血、1个/毫升全血、5个/毫升全血、50个/毫升全血和500个/毫升全血。混匀后每5ml一份，测试本发明实施例5-12的肿瘤诊断试剂盒，测试结果如表3所示。
实施例5-8按照以下步骤进行测试：
1)取上述外周血样本5ml，加入45ml红细胞裂解液，室温下孵育10分钟。
2)待红细胞裂解后，离心(2000rpm，10分钟)。
3)去上清，将细胞沉淀重悬浮于10ml pH值为7.3的磷酸缓冲液(PBS)，离心(2000rpm，10分钟)。
4)去上清，将细胞沉淀重悬浮于0.2ml RPMI-1640中。
5)将0.2ml由步骤4)得到的细胞与0.1ml本发明重组II性疱疹病毒悬液(106Pfu/ml)混合并加入24孔培养板的孔中。
6)将培养板孵育于含5％CO2的37℃孵箱内。
7)10小时后用荧光显微镜检测发滤色荧光的肿瘤细胞，并计数具有明确可见的荧光的肿瘤细胞数，计数结果＞1即为阳性。
实施例9-12按照以下步骤进行测试：
1)在50ml离心管中加入10ml比重为1.077±0.001千克/升的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Urografin)。
2)取5ml上述肝素抗凝静脉血样本与等体积pH值为7.3的PBS充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。
3)离心后管内分为三层，上层为血清和PBS液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为单个核细胞(包括淋巴细胞、单核细胞及肿瘤细胞)。
4)吸取单个核细胞层。置入另一离心管中，加入6倍体积的pH值为7.3的PBS，1500rpm×10分钟，用所述PBS洗涤细胞两次。再将细胞重悬浮于0.4ml的RPMI1640中。
5)将0.4ml由步骤4)得到的细胞与0.1ml本发明重组II性疱疹病毒悬液(106Pfu/ml)混合并加入12孔培养板的孔中。
6)将所述培养板孵育于含5％CO2的37℃孵箱内。
7)8小时后用荧光显微镜检测发滤色荧光的肿瘤细胞，并计数具有明确可见的荧光的肿瘤细胞数，计数结果＞1即为阳性。
表3
图8为实施例5的试剂盒检测肿瘤细胞密度为5个/毫升全血的荧光照片(放大倍数400倍)结果，图中箭头标出了5个具有明确可见的荧光的肿瘤细胞。图9为实施例5的试剂盒检测肿瘤细胞密度为0个/毫升全血的荧光照片(放大倍数400倍)结果，其中没有出现1个具有明确可见的荧光的肿瘤细胞。
图8和图9以及表3说明，本发明的肿瘤诊断试剂盒最低能够检测到1个肿瘤细胞/毫升浓度的肿瘤细胞；每ml血中≥5个肿瘤细胞的情况下灵敏度和准确性都很高。并且优选在ICP34.5基因的位置上插入绿色荧光蛋白表达盒。
检测实施例2
本检测实施例用于说明本发明的肿瘤诊断试剂盒的早期诊断作用和广谱性。
采用实施例5-12的肿瘤诊断试剂盒，按照检测实施例1的方法对表4所示的肿瘤患者进行诊断，诊断结果如表5所示。
表4
表5
从表4和表5的记载可以看出，本发明的肿瘤诊断试剂盒对于多种不同肿瘤都能实现灵敏和快速的诊断。
序列表
<110>刘滨磊
<120>重组II型单纯疱疹病毒、其制备方法及应用和肿瘤诊断试剂盒
<130>OICN1030177
<160>8
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增ICP47基因上游侧翼区序列的合成的寡聚核苷酸正向引物
<400>1
agagtcacga cgcatttgcc c 21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增ICP47基因上游侧翼区序列的合成的寡聚核苷酸反向引物
<400>2
atacgatctc gtcgaccggg g 21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增ICP47基因下游侧翼区序列的合成的寡聚核苷酸正向引物
<400>3
catggtgtcc cgtccacgaa g 21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增ICP47基因下游侧翼区序列的合成的寡聚核苷酸反向引物
<400>4
ggttcgtggt aatgagatgc c 21
<210>5
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增ICP34.5基因上游侧翼区序列的合成的寡聚核苷酸正向引物
<400>5
aaatcagctg cggtgaaggt cgtcgtcaga g 31
<210>6
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增ICP34.5基因上游侧翼区序列的合成的寡聚核苷酸反向引物
<400>6
aaattctaga gccggcttcc cggtatggta a 31
<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增ICP34.5基因下游侧翼区序列的合成的寡聚核苷酸正向引物
<400>7
aaatgatatc cagcccgggc cgtgttgcgg g 31
<210>8
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增ICP34.5基因下游侧翼区序列的合成的寡聚核苷酸反向引物
<400>8
aaatagatct ctctgacctg agtgcaggtt a 31
Claims (15)
1.一种重组II型单纯疱疹病毒在制备诊断肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述病毒为重组II型单纯疱疹病毒HG52株，且所述病毒剔除了野生II型单纯疱疹病毒HG52株的ICP34.5基因，所述病毒在被剔除的ICP34.5基因的位置上插入了荧光蛋白表达盒。
2.根据权利要求1所述的重组II型单纯疱疹病毒在制备诊断肿瘤的药物中的应用，其中，所述荧光蛋白表达盒选自由绿色荧光蛋白表达盒、青色荧光蛋白表达盒、红色荧光蛋白表达盒和黄色荧光蛋白表达盒所组成的组中。
3.根据权利要求1或2所述的重组II型单纯疱疹病毒在制备诊断肿瘤的药物中的应用，其中，所述病毒还剔除了野生II型单纯疱疹病毒HG52株的ICP47基因。
4.根据权利要求3所述的重组II型单纯疱疹病毒在制备诊断肿瘤的药物中的应用，其中，所述病毒在被剔除的ICP34.5基因的位置上和被剔除的ICP47基因的位置上插入了荧光蛋白表达盒。
5.根据权利要求4所述的重组II型单纯疱疹病毒在制备诊断肿瘤的药物中的应用，其中，所述病毒在被剔除的ICP34.5基因的位置上插入了绿色荧光蛋白表达盒。
6.一种肿瘤诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括重组II型单纯疱疹病毒，所述病毒为重组II型单纯疱疹病毒HG52株，且所述病毒剔除了野生II型单纯疱疹病毒HG52株的ICP34.5基因，所述病毒在被剔除的ICP34.5基因的位置上插入了荧光蛋白表达盒。
7.根据权利要求6所述的肿瘤诊断试剂盒，其中，所述荧光蛋白表达盒选自由绿色荧光蛋白表达盒、青色荧光蛋白表达盒、红色荧光蛋白表达盒和黄色荧光蛋白表达盒所组成的组中。
8.根据权利要求6所述的肿瘤诊断试剂盒，其中，所述病毒还剔除了野生II型单纯疱疹病毒HG52株的ICP47基因。
9.根据权利要求7所述的肿瘤诊断试剂盒，其中，所述病毒还剔除了野生II型单纯疱疹病毒HG52株的ICP47基因。
10.根据权利要求8所述的肿瘤诊断试剂盒，其中，所述病毒在被剔除的ICP34.5基因的位置上和被剔除的ICP47基因的位置上插入了荧光蛋白表达盒。
11.根据权利要求9所述的肿瘤诊断试剂盒，其中，所述病毒在被剔除的ICP34.5基因的位置上和被剔除的ICP47基因的位置上插入了荧光蛋白表达盒。
12.根据权利要求10所述的肿瘤诊断试剂盒，其中，所述病毒在被剔除的ICP34.5基因的位置上插入了绿色荧光蛋白表达盒。
13.根据权利要求11所述的肿瘤诊断试剂盒，其中，所述病毒在被剔除的ICP34.5基因的位置上插入了绿色荧光蛋白表达盒。
14.根据权利要求6至13中任一项所述的肿瘤诊断试剂盒，其中，所述试剂盒检测的样品选自受试者全血、血浆、淋巴细胞悬浮液、骨髓、胸腔积液和腹腔积液所组成的组中。
15.根据权利要求6至13中任一项所述的肿瘤诊断试剂盒，其中，所述试剂盒还包括
(1)RPMI-1640培养基、pH为7的红细胞裂解液和pH为7.2-7.4的磷酸缓冲液，其中，所述红细胞裂解液包含0.15M氯化铵、10nM碳酸氢钾和1nM乙二胺四乙酸；或者
(2)RPMI-1640培养基、比重为1.077±0.001千克/升的聚蔗糖-泛影葡胺和pH为7.2-7.4的磷酸缓冲液。
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