CN111474357B - 非洲猪瘟病毒快速检测试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明一方面提供了一种非洲猪瘟快速检测试纸条，所述非洲猪瘟快速检测试纸条由试纸条和样品处理液组成。另一方，本发明还提供了一种制备所述试纸条的方法，包括以下步骤：1)抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体和抗非洲猪瘟病毒P72蛋白单克隆抗体的制备；2)乳胶微球垫和样品垫的制备；3)硝酸纤维素膜检测线和质控线的制备；4)样品处理液配制和分装；5)试纸条组装。本发明所提供的非洲猪瘟快速检测试纸条适用于猪血清、猪全血以及猪组织中非洲猪瘟病毒的检测，其特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测速度快，可用于非洲猪瘟病毒的早期筛查，特别适合现场非洲猪瘟感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验等。

Description

非洲猪瘟病毒快速检测试纸条及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于病毒疫病诊断技术和动物检疫领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒快速检测试纸条及制备方法和应用。
背景技术
非洲猪瘟(英文名称：African Swine fever，简称：ASF)是由非洲猪瘟病毒(英文名称：African Swine fever virus，简称：ASFV)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％，临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似。
ASFV是一种双链的核质大DNA病毒(Nucleocytoplasmic Large DNA Viruses,NCLDV)。根据不同的病毒株型，基因组DNA的碱基数约为17万到19万，其中含有151至167个开放阅读框(Opening Reading Frames,ORFs)[Alejo A,Matamoros T,Guerra M,AndrésG.,2018.A Proteomic Atlas of the African Swine Fever Virus Particle.J Virol92:e01293-18.]。与其它的NCLDV一样，ASFV编码许多蛋白质，这些蛋白质除了专门用于病毒组装的结构蛋白外，还参与逃避宿主防御机制，诸如I型干扰素和细胞凋亡途径等，以及DNA复制的修复和基因表达的调控的生物学过程。大多数ASFV的基因功能是未知的，仍需要人们对其进行探索。ASFV形态为正二十面体，直径约200纳米，由多层物质构成：中央为内含拟核的蛋白质核壳，由内向外分别还有一层脂质包膜和蛋白质衣壳。衣壳由8280个主要的衣壳蛋白p72和60个戊蛋白构成，此外至少有三种蛋白质通过对临近蛋白的粘连来保持衣壳结构的稳定。
目前，市场上针对非洲猪瘟病原的检测主要有荧光定量PCR方法，暂没有其他授权批准的方法用于非洲猪瘟抗原检测。但通过免疫方法对非洲猪瘟病原的检测的研究很多，如CN 109254155 A公开了一种以抗P30蛋白的两株单抗建立的的胶体金检测方法。但随着非洲猪瘟病毒3D精细结构已经被破译[Liu et al.2019.Cryo-EM Structure of theAfrican Swine Fever Virus.Cell Host&Microbe 26(6):836-843.e3.]，该专利提示的方法有所欠缺。因为，根据该文献，发现P72蛋白是其最主要的衣壳蛋白之一，因此为了能进一步准确检测非洲猪瘟病毒抗原，优先选择P72蛋白作为抗原蛋白筛选单克隆抗体，但考虑到非洲猪瘟病毒的空间位阻影响，我们还选择另一个衣壳蛋白P30作为另一个抗原蛋白来筛选单克隆抗体，从而建立一种双抗体夹心测抗原的方法。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，提供一种非洲猪瘟快速检测试纸条；优选地的非洲猪瘟快速检测试纸条，是建立在抗非洲猪瘟病毒P72蛋白单克隆抗体和抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体的基础上。本发明的目的之二，还提供了一种制备该试纸条的方法。
因此，本发明一方面提供了一种非洲猪瘟快速检测试纸条，所述非洲猪瘟快速检测试纸条由试纸条和样品处理液组成，所述试纸条包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；所述乳胶微球垫为乳胶微球标记抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，其中检测线为抗非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体，质控线为羊抗小鼠IgG抗体。
优选地，本发明所述的所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体为单克隆抗体4C11株。
优选地，本发明所述的抗非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体为单克隆抗体7D5株。
优选地，本发明所述的样品处理液为1×PBS溶液。
优选地，本发明所述的样品处理液中还含有氟化钠，所述的氟化钠的浓度为10mg/ml。
另一方，本发明还提供了一种制备所述试纸条的方法，所述方法包括以下步骤：1)抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体和抗非洲猪瘟病毒P72蛋白单克隆抗体的制备；2)乳胶微球垫和样品垫的制备；3)硝酸纤维素膜检测线和质控线的制备；4)样品处理液配制和分装；5)试纸条组装。
优选地，本发明所述的乳胶微球垫和样品垫的制备包括以下步骤：1)标记：将单克隆抗体4C11按1mg/mL乳胶微球的量加入到乳胶微球中，旋转混匀2小时。加入BSA至终浓度为1％，旋转混匀30分钟，在2～8℃下，以10000r/min离心30分钟，弃上清，收集沉淀，沉淀用1mL保存液重悬超声1分钟，置2～8℃保存；2)将重悬好的乳胶微球标记抗体均匀的铺在已处理的乳胶微球垫上，置37℃烘箱烘干15小时，铝箔袋封装，置2～30℃保存备用；3)将300mm×20mm的样品垫浸泡于封闭液中30分钟后，37℃烘箱烘干15小时，铝箔袋封装，置2～30℃保存备用；4)保存液的配制：称取Tris 0.25g、BSA 1g、蔗糖2g加入到90mL双蒸水中溶解，待完全溶解后，混匀，调pH值至8.0，再加入双蒸水定容至100mL；5)封闭液的配制：称取BSA 1g加入到10mL的纯化水中，充分溶解。
优选地，本发明所述的硝酸纤维素膜检测线和质控线制备包括以下步骤：1)包被缓冲液的配制：将1g蔗糖加入到100mL的1×PBS中配制成包被缓冲液，0.22μm滤膜过滤除菌，置2～8℃保存备用；2)将硝酸纤维素膜贴于PVC底板的相应位置，用包被缓冲液将单克隆抗体7D5稀释至1mg/mL，调整划膜机的划线位置及高度，划线为T线，即为检测线，T线靠近乳胶微球垫端，用包被缓冲液将羊抗小鼠IgG抗体稀释到1mg/mL，调整划膜机的划线位置及高度，划线为C线，即为质控线，C线靠近吸收垫，两线距离5～8mm，置37℃烘箱烘干15小时，装入放有干燥剂的铝箔袋中密封，2～30℃保存备用。
优选地，本发明所述的样品处理液配制：取1g氟化钠，加到100ml 1×PBS溶液中，溶解后经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，无菌分装，10mL/管，2～30℃保存备用。
优选地，本发明所述的组装包括：1)将样品垫，乳胶微球垫，吸收垫依次粘贴到已粘有硝酸纤维素膜的PVC底板的相应位置，使乳胶微球垫、吸水垫分别与硝酸纤维素膜部分接触，样品垫与乳胶微球垫部分接触，制成大板；2)用切条机将大板切成3mm宽的试纸条，装上外壳，用铝箔袋密封包装，内含试纸条一个，吸管一个，干燥剂一包，2～30℃避光贮存备用；3)按照50个试纸条、10ml样品处理液和1份说明书的规格组装成试剂盒。
本发明所提供的非洲猪瘟快速检测试纸条适用于猪血清、猪全血以及猪组织(如淋巴结、肝、肾、脾、肺等)中非洲猪瘟病毒的检测，其特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测速度快，可用于非洲猪瘟病毒的早期筛查，特别适合现场非洲猪瘟感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验等。
另外，使用本发明所提出的使用P72蛋白筛选的单克隆抗体和P30蛋白或其他蛋白的单克隆抗体所建立的免疫学诊断方法也应属于本发明的保护范围之内。例如，使用P72蛋白筛选的单克隆抗体和P54蛋白筛选的单克隆抗体建立的胶体金检测方法或ELISA检测方法应属于本发明的保护范围之内。
附图说明
图1杂交瘤细胞鉴别试验结果，其中A是杂交瘤细胞4C11染色体，B是杂交瘤细胞7D5染色体。
图2杂交瘤细胞显微镜检测结果，其中A是杂交瘤细胞4C11染色体，B是杂交瘤细胞7D5染色体。
图3杂交瘤细胞核学检查结果，其中A是杂交瘤细胞4C11染色体，B是杂交瘤细胞7D5染色体。
图4非洲猪瘟病毒检测试纸条的组装，其中A：样品垫，B：乳胶微球垫，C：检测线，D：质控线。
图5非洲猪瘟病毒检测试纸条检测判定。
图6 10份猪血清样品PCR检测结果。
图7部分血清样品试纸条检测结果。
图8 10份猪组织样品PCR检测结果。
图9 190302批试纸条对10份组织样品检测结果。
图10 190302批检测结果(敏感性实验)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。实施例中未进行详细说明的实验方法，通常按照本技术领域常规操作或按照厂商建议的条件进行。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品。
实施例1抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体制备
一、非洲猪瘟病毒P30蛋白的制备
1材料
1.1大肠杆菌BL21感受态细胞，购于博迈德科技有限公司；基因合成由通用生物系统(安徽)有限公司合成(提供质粒PET-30a)；DNA Marker购自Thermo公司、质粒小提试剂盒购自AXYGEN公司；其他化学试剂均为国产分析纯。
1.2 LB培养基称取5.0g酵母提取物、10g胰蛋白胨、10g NaCl，溶于1L纯化水，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
1.3 LB(Kan+)液体培养基LB培养基中加入卡那霉素，使终浓度为100μg/mL，置2～8℃保存。
1.4 LB(Kan+)固体培养基在100mL LB培养基中加入1.5g琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。使用前，将培养基在微波炉中融化，室温冷却，待培养基温度降到50℃左右时，加入卡那霉素使其终浓度为100μg/mL，混匀后倒板，打开平皿盖自然冷却后，置2～8℃保存。
2方法
2.1目的片段合成选择我国非洲猪瘟流行毒株结构蛋白编码基因P30，基因全长621bp，其核苷酸序列见SEQ ID NO1。
2.2重组菌株构建克隆位点NdeI(CATATG)-XhoI(CTCGAG)，克隆载体pET-30a(+)，以上质粒构建由通用生物系统(安徽)有限公司完成。
2.3感受态细胞转化将冰冻的感受态细胞先于冰上溶解，将1μl质粒DNA加入100μl感受态细胞中于冰上放置30分钟，于42℃金属浴热击60秒，迅速放于冰上5分钟。将已摄取了外源遗传物质的感受态细胞加入培养试管,该培养试管有已预热至37℃的LB液体培养基,使总体积为1mL，200r/min培养1小时。复苏的菌液，用加样枪将菌液加到LB(Kan+)平板上，用推棒涂布直至培养基表面无可见的液体，将有培养基的一面向下培养约30分钟后，倒置37℃培养过夜。
从平板上菌落挑取单菌落接种于1mL LB(Kan+)液体培养基，37℃、200r/min培养12～16小时，收集1mL菌液，提取重组质粒，采用PCR扩增反应验证重组质粒是否含有非洲猪瘟p30片段。
2.4菌株的保存对测序正确的菌株按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，检验合格后，取菌液加以终浓度为40％的甘油，置-80℃，作为原始种子批妥善保存。
3 P30蛋白表达
3.1阳性菌株筛选与鉴定将连接产物转化感受态细胞，37℃倒置培养12～16小时后，可见菌落形态为光滑型，单个散在，边缘整齐，表面有光泽、湿润、灰白色，呈典型大肠杆菌菌落形态。挑取其中的1个单菌落进行PCR鉴定和测序鉴定，PCR鉴定结果与预期大小一致，序列比对结果，与GenBank公布的非洲猪瘟病毒p30序列同源性为100％。并将筛选的阳性菌株命名为BL-21-P30。对重组大肠杆菌BL-21-P30进行纯粹检验，检验结果均纯粹，无杂菌或霉菌生长。
3.2 BL-21-P30菌种的P30蛋白表达以1％比例接种含100μg/mL卡纳霉素LB液体培养基，在37℃条件下以200r/min振荡培养2～4小时，至菌液OD600nm为0.6～0.8时，加入终浓度1.0mM IPTG继续诱导4小时。诱导好的重组菌5000g离心10分钟弃上清，沉淀部分使用PBS溶解10分钟后，用超声细胞破碎仪破碎。破碎后4℃离心(12000r/min)30分钟弃上清，沉淀包涵体部分用裂解液(50mM Tris，8M Urea,0.5M NaCl)裂解10分钟，12000r/min离心30分钟取上清过镍柱纯化。使用10倍柱体积裂解液清洗柱体；将上清加入镍柱中，蛋白液缓慢上样；10倍柱体积裂解液洗涤，去除杂蛋白；5倍柱体积洗脱液(50mM Tris，8M Urea,0.5MNaCl，300mM咪唑)洗脱收集纯化的P30蛋白冷冻保存。P30蛋白使用SDS-PAGE蛋白凝胶进行电泳检验，在30KD左右有一条清晰条带，纯度大于等于95％。
二、非洲猪瘟病毒P72蛋白的制备
按照实施例1中“一”的方法制备P72蛋白，其中P72蛋白基核苷酸序列见SEQ IDNO2。
三、抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体制备
1材料
1.1非洲猪瘟病毒P30重组蛋白和P72重组蛋白由浙江理工大学表达、鉴定，保存和供应；骨髓瘤细胞SP2/0购自上海细胞研究所。
1.2培养基DMEM培养基购自gibco公司，货号11995；胎牛血清购自gibco公司，货号10270；次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(Hypoxanthine-aminoperin-thymidine，HAT)培养液购自Sigma，货号H0262；聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)购自Sigma，货号P1781；无菌检验及支原体检验用培养基均购自北京海淀中海动物保健科技公司。
1.3抗体羊抗小鼠酶标二抗购自Sigma，货号A0168；兔抗小鼠亚类试剂购自洛阳塞尔维实验器材有限公司，货号C030215；抗猪流行性腹泻病毒单抗购自美国ICL公司；羊抗小鼠荧光二抗购自Thermo公司，货号31569；兔抗猪荧光二抗购自上海江莱生物科技有限公司。
1.4其它试剂完全弗氏佐剂购自Sigma，货号F5881；不完全弗氏佐剂购自Sigma，货号F5506；BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo公司，货号23227。
1.6实验动物6～8周龄Balb/c小鼠购自扬州大学。
2方法
2.1 ASFV免疫原的制备按照实施例1中“一”和“二”的方法制备非洲猪瘟P30蛋白和P72蛋白。
2.2动物免疫将制备好的ASFV抗原分别免疫Balb/c小鼠。免疫方法如下，皮下免疫弗氏完全佐剂乳化的抗原100μg/只，间隔3周后腹腔注射不完全弗氏佐剂乳化的抗原50μg/只，再间隔3周后腹腔注射不完全弗氏佐剂乳化的抗原50μg/只，融合前3天加强免疫不含佐剂的抗原100μg/只。
2.3细胞融合先将饲养细胞铺96孔细胞板，于37℃、5％CO2培养箱培养备用。无菌取免疫小鼠脾脏，并制成脾细胞悬液，将SP2/0与脾细胞悬液混合(比例为1:5～1:10)于50mL离心管中混匀，以1500r/min离心10分钟，去上清。将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中，在1分钟之内慢慢滴加预热至37℃的50％PEG 1mL，边加边轻轻搅拌。然后慢慢加入预热至37℃的1640液10mL。最后加入30mL 1640液。以1000r/min离心5分钟，收集沉淀。用HAT培养基悬浮融合后的细胞，接种于已铺有饲养细胞的96孔培养板中，100μl/孔。于37℃、5％CO2培养箱中培养。融合后第二天开始观察，应无污染，于第四天每孔补加1滴HAT培养基，第8～10天吸去100μl培养基换HT培养基100μl。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。
2.4纯净性检验
2.4.1无菌检验按现行《中国兽药典》附录方法进行无菌检验。
2.4.2支原体检验按现行《中国兽药典》附录方法进行支原体检验。
2.4.3细胞病毒检验
2.4.3.1分别取杂交瘤细胞7D5和4C11细胞培养液，冻融3次后，分别接种Vero细胞、MDCK细胞和MDBK细胞，另至少设一瓶正常细胞对照，每一种细胞总培养时间应不少于14日。培养期间细胞培养物应至少继代1次。最后一次继代的细胞单层数量和培养面积应符合荧光抗体检查法、致细胞病变检查法和红细胞吸附性外源病毒检验的要求。
2.4.3.2判定在至少14日的培养期内，要对细胞培养物进行常规检查，如果培养期间出现细胞病变，则判为不符合规定。如无细胞病变，培养结束时，细胞单层应按2.2.1.3.3进行检验。
2.4.3.3检查方法
2.4.3.3.1荧光抗体检查法最后一次继代的细胞单层应培养5～7日后用于荧光抗体检查。对每一种特定外源病毒的检验应至少包含三组细胞单层：(1)被检样品细胞培养物；(2)在最后一次继代时分别接种200 TCID50的猪流行性腹泻病毒；(3)正常细胞对照。每一组细胞单层检查面积应不小于6.0cm2。
细胞单层样品经丙酮固定后，用猪流行性腹泻病毒单克隆抗体和狂犬病毒进行荧光抗体检验，检查每一组单层是否存在特定外源病毒的荧光。当阳性对照出现特异荧光，正常细胞无荧光时，如果被检样品出现外源性病毒特异性荧光，判为不合格。如果阳性对照组荧光不明显，或者正常细胞出现不明显荧光，判为无结果，应重检。
2.4.3.3.2致细胞病变检查法取经传代后培养至少7日的敏感细胞单层(每个至少6.0cm2)进行检验。用吉姆萨染色液对细胞单层进行染色。观察细胞单层，检查包涵体、巨细胞或其他由外源病毒引起的CPE的出现情况。如果出现外源病毒所致的特异性CPE，判为不合格；如果疑有外源病毒污染，又不能通过其他试验排除这种可能性时，则判为不合格。
2.4.3.3.3红细胞吸附性外源病毒检验取经传代后至少培养7日的细胞单层(每个至少6.0cm2)进行检验。以PBS洗涤细胞单层2～3次。加入适量0.2％的豚鼠红细胞和鸡红细胞的等量混合悬液，以覆盖整个单层表面为准，分别滴加于不同的细胞单层上。选2个细胞单层，分别在2～8℃和20～25℃放置30分钟，用PBS洗涤，检查红细胞吸附情况。如果出现外源病毒所致的红细胞吸附现象，判为不合格；如果疑有外源病毒污染，又不能通过其他试验排除这种可能性时，则判为不合格。
2.5细胞的鉴别试验用小鼠血清进行免疫荧光试验，荧光显微镜下观察细胞是否有荧光。
2.6培养特性用含15％胎牛血清的DMEM培养液，在37℃，5％CO2培养箱中培养，观察生长状况。
2.7细胞核学检查取体外培养24小时的杂交瘤细胞，收集50个处于有丝分裂中期的细胞进行检查，用秋水仙素法检查染色体数，观察染色体特征是否符合杂交瘤细胞染色体特征。
2.8分泌抗体活性检测将杂交瘤细胞克隆到24孔培养板培养，用间接ELISA法检测细胞上清抗体阳性率及抗体效价。在体外传代3代后再次用间接ELISA法检测细胞上清抗体阳性率及抗体效价。
2.9单克隆抗体的制备及检测
2.9.1单克隆抗体的制备取8～10周龄Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷，每只0.5mL，7～10日后每只小鼠分别注射杂交瘤细胞(7D5株和4C11株)1×106～2×106个，7～10日后，抽取小鼠腹水，在2～8℃下，以1200r/min离心10分钟，收集上清液，将腹水分装1mL/管，-20℃保存备用。
2.9.2腹水抗体效价检测将收获的腹水进行1:10、1:102～1:106倍比稀释，分别加入到已包被封闭好的ELISA检测板孔中，用间接ELISA法检测腹水效价。
2.9.3单克隆抗体的纯化取腹水10mL，融化后2～8℃下，以1200r/min离心10分钟，收集上清，加入40mL醋酸盐缓冲液(0.06mol/L，pH值4.5)，用磁力搅拌混合均匀后在室温(25℃)下缓慢加入330μl辛酸，边滴加边搅拌，室温混合30分钟后，2～8℃静置2小时，在2～8℃下，以10000r/min离心30分钟，收集上清，记上清体积并在冰浴下于30分钟内缓慢加入相同体积2～8℃保存的饱和硫酸铵溶液，2～8℃静置16小时，在2～8℃下，以5000r/min离心30分钟，收集沉淀。用5mL，PBS(0.01mol/L，pH值7.4)溶解沉淀后用PBS(0.01mol/L pH值7.4)500mL透析16小时，期间换透析液至少3次。单克隆抗体7D5和单克隆抗体4C11均按此方法制备。取透析好的单克隆抗体经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装于离心管中，0.1mL/管。
2.9.4抗体特异性检测将纯化的腹水稀释5000倍后加入到已包被P30蛋白的酶标孔中和包被BSA酶标孔，间接免疫荧光法进行特异性检验。
2.9.5类及亚类测定取单克隆抗体，用兔抗小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgM作酶标二抗进行ELISA检测。
2.9.6用BCA蛋白定量试剂盒检测纯化抗体的蛋白含量。
3结果
3.1杂交瘤细胞阳性克隆株筛选结果融合后筛选到4株阳性细胞株，挑选三株效价较高的进行亚克隆，获得稳定分泌抗非洲猪瘟病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株2株，挑选ELISA检测值最高的单克隆细胞株进行扩大和冻存，并分别命名为7D5和4C11(其中7D5是抗非洲猪瘟病毒P72的单克隆抗体，4C11是抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体)。两株杂交瘤细胞分别进行三次克隆化，抗体阳性率为100％。克隆筛选结果见表1。
表1杂交瘤细胞阳性克隆株筛选结果
注：“\”表示该孔无克隆生长，“+”表示免疫荧光结果阳性，“-”表示免疫荧光结果为阴性。
3.2纯净性的检验结果检测结果(表2)表明，杂交瘤细胞7D5和4C11均无菌生长、无支原体生长、无猪流行性腹泻病毒污染。
表2杂交瘤细胞纯净性检验结果
检测项目 杂交瘤细胞7D5 杂交瘤细胞4C11
无菌检验 - -
支原体检验 - -
病毒检验 - -
注：“-”表示检测结果为阴性。
3.3细胞鉴别试验结果杂交瘤细胞7D5和4C11分别与小鼠血清进行间接免疫荧光试验，荧光显微镜下观察结果，杂交瘤细胞7D5和4C11与小鼠血清反应均出现特异的绿色荧光。具体见图1所示。
3.4培养特性杂交瘤细胞7D5和4C11用含15％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液，在37℃，含5％CO2的恒温培养箱中生长良好。显微镜下观察，杂交瘤细胞7D5和4C11均呈圆形、透亮、均匀分布，表明细胞生长状态良好，细胞形态正常。具体见图2所示。
3.5细胞核学检查结果用秋水仙素法检查其染色体数目，两株杂交瘤细胞株染色体数均为88～104条之间，且均有端着丝点染色体和标志染色体。具体见图3所示。
3.6分泌抗体活性检测结果将两株杂交瘤细胞分别克隆到24孔细胞培养板培养，用间接ELISA法测定细胞培养上清抗体，阳性率均为100％，7D5株抗体效价均为1:1280，4C11株抗体效价均为1:2560(表2)。在体外传代3代，再用间接ELISA法检测细胞上清抗体阳性率为100％，7D5株抗体效价均为1:1280，4C11株抗体效价均为1:2560(表3)。
表3细胞上清抗体阳性率及抗体效价检测结果
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8
F17D5效价 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280
7D5传3代后效价 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280
孔号 9 10 11 12 13 14 15 16
7D5效价 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280
7D5传3代后效价 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280
孔号 17 18 19 20 21 22 23 24
7D5效价 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280
7D5传3代后效价 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280 1:1280
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8
4C11效价 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560
4C11传3代后效价 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560
孔号 9 10 11 12 13 14 15 16
4C11效价 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560
4C11传3代后效价 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560
孔号 17 18 19 20 21 22 23 24
4C11效价 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560
4C11传3代后效价 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560 1:2560
3.7单克隆抗体腹水效价检测结果制备腹水经间接ELISA检测，结果为两株单克隆抗体杂交瘤细胞株制备的腹水效价均为1:105(表4)。
表4腹水效价检测结果
3.7抗体的特异性检测结果经间接免疫荧光检测，单克隆抗体7D5和4C11均与P30蛋白反应有特异性的绿色荧光，与BSA反应无绿色荧光出现。
3.8类和亚类检验结果7D5和4C11单克隆抗体亚类均为IgG1，详细结果见表5。
表5单克隆抗体类及亚类检测结果
3.9纯化抗体蛋白含量检测结果纯化抗体经BCA蛋白定量试剂盒检测其蛋白含量，均不低于1mg/mL。单抗7D5为2.0mg/mL，单抗4C11为3.2mg/mL。
4结论本研究制备获得了抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株两株，分别为7D5株和4C11株。经鉴定，两株杂交瘤细胞纯净无污染，核型正常均在88～104之间，杂交瘤细胞培养上清效价7D5为1:1280、4C11为1:2560且分泌抗体稳定，将两株单克隆杂交瘤细胞分别制备腹水，收获腹水经间接ELISA检验，其效价均为1:105，纯化后获得的单克隆抗体特异性好，单克隆抗体类型均为IgG1，蛋白含量均不低于1mg/mL，综上所述，制备获得的杂交瘤细胞株适用于制备非洲猪瘟病毒检测试纸条。
实施例2非洲猪瘟病毒快速检测试纸条制备
一、单克隆抗体的制备及检验
1.1杂交瘤细胞的复苏将杂交瘤细胞(7D5株和4C11株)分别自液氮罐中取出，置37℃水中迅速融化后，以1000r/min离心10分钟，弃上清，沉淀用含15％胎牛血清的DMEM培养基重悬后移入T75克氏瓶中，补加含15％胎牛血清的DMEM培养基至10mL，放37℃、5％CO2培养箱静置培养2～6小时，待细胞贴壁后，轻晃瓶体，使死细胞脱落后倒掉，重新补加15mL含15％胎牛血清的DMEM培养基，细胞瓶上标记细胞名称、代次和时间，置37℃、5％CO2培养箱中培养。
1.2单克隆抗体的制备取8～10周龄Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷，每只0.5mL，7～10日后每只小鼠分别注射杂交瘤细胞7D5和4C111×106～2×106个，7～10日后，分别抽取小鼠腹水，在2～8℃下，以1200r/min离心10分钟，收集上清液，1mL/管分装，-20℃保存备用。
1.3腹水效价检测将收获的腹水用含1％BSA的PBS(0.01mol/L，pH值7.4)十倍比稀释至1:1000000，用间接ELISA法测定腹水的抗体效价。
1.4腹水纯化分别取两株单抗腹水10mL，融化后在2～8℃下，以1200r/min离心10分钟，收集上清，加入40mL醋酸盐缓冲液(0.06mol/LpH值4.5)，用磁力搅拌混合均匀后在室温(25℃)下缓慢加入330μl辛酸，边滴加边搅拌，室温混合30分钟后，2～8℃静置2小时，在2～8℃下，以10000r/min离心30分钟，收集上清，记上清体积并在冰浴下于30分钟内缓慢加入相同体积2～8℃保存的饱和硫酸铵溶液，2～8℃静置16小时，在2～8℃下，以5000r/min离心30分钟，收集沉淀。用5mL，0.01mol/L PBS(pH值7.4)溶解沉淀后用0.01mol/LPBS(pH值7.4)500mL透析16小时，期间换透析液至少3次。
1.5收获取透析好的单克隆抗体经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分别分装于保存管中，0.1mL/管。
1.6保存置-20℃以下保存，保存期暂定为24个月。
二、快速检测试纸条制备
1制造用材料乳胶微球购自上海辉质生物技术有限公司，货号10010711；羊抗小鼠IgG购自武汉博士德生物工程有限公司，货号BA1038；PVC底板购自杭州瑞建，货号SM31-25；样品垫购自通成纸业，货号K75；标记垫购自通成纸业，货号K75；吸水纸购自上海捷宁生物科技有限公司，货号H-1。
2质控线抗体(羊抗小鼠IgG抗体)制备
2.1质控抗体来源本试纸条所用羊抗小鼠IgG抗体为商品化试剂，工作浓度按说明书稀释至1mg/mL。
2.2保存置-20℃以下保存，保存期为12个月。
3硝酸纤维素膜的制备
3.1包被缓冲液的配制将1g蔗糖加入到100mL的PBS(0.01mol/L，pH值7.2)中配制成包被缓冲液，0.22μm滤膜过滤除菌，置2～8℃保存备用。
3.2硝酸纤维素膜的制备将硝酸纤维素膜贴于PVC底板的相应位置，用包被缓冲液将单克隆抗体7D5稀释至1mg/mL，调整划膜机的划线位置及高度，划线为T线，即为检测线，T线靠近乳胶微球垫端，用包被缓冲液将羊抗小鼠IgG抗体稀释到1mg/mL，调整划膜机的划线位置及高度，划线为C线，即为质控线，C线靠近吸收垫，两线距离5～8mm。置37℃烘箱烘干15小时，装入放有干燥剂的铝箔袋中密封，2～30℃保存备用。
4乳胶垫的制备
4.1乳胶微球的制备本试纸条所用的乳胶微球为商化试剂。
4.2标记将抗非洲猪瘟病毒单抗4C11按1mg/mL乳胶微球的量加入到乳胶微球中，旋转混匀2小时。加入BSA至终浓度为1％，旋转混匀30分钟。在2～8℃下，以10000r/min离心30分钟，弃上清，收集沉淀，沉淀用1mL保存液(保存液的配制：称取Tris 0.25g、BSA 1g、蔗糖2g加入到90mL双蒸水中溶解，待完全溶解后，混匀，调pH值至8.0，再加入双蒸水定容至100mL)重悬超声1分钟，置2～8℃保存。
4.3乳胶微球垫的制备将重悬好的乳胶微球标记抗体均匀的铺在已处理的乳胶微球垫上，置37℃烘箱烘干15小时，铝箔袋封装，置2～30℃保存备用。
5样品垫的处理将样品垫(300mm×20mm)浸泡于封闭液(封闭液的配制：称取BSA1g加入到10mL的纯化水中，充分溶解)中30分钟后，37℃烘箱烘干15小时，铝箔袋封装，置2～30℃保存备用。
6非洲猪瘟病毒检测试纸条的组装如图4所示，将样品垫，乳胶微球垫，吸收垫依次粘贴到已粘有硝酸纤维素膜的PVC底板的相应位置，使乳胶微球垫、吸水垫分别与硝酸纤维素膜部分接触，样品垫与乳胶微球垫部分接触，制成大板。.
7包装用切条机将大板切成3mm宽的试纸条，装上外壳，用铝箔袋密封包装，内含试纸条一个，吸管一个，干燥剂一包，2～30℃避光贮存备用，保存期暂定为24个月。
8样品缓冲液的制备将1g氟化钠加到100ml 1×PBS(0.01mol/L PBS pH值7.4)中，溶解后经0.22μm微孔滤膜过滤除菌。无菌分装，10mL/管，2～30℃保存备用。
9试纸条的组装及检验将检验合格的各试纸条组份按下表组装
组分 数量 规格
非洲猪瘟病毒快速检测试纸条(乳胶法) 50袋 1条/袋
样品缓冲液 1管 10mL/管
说明书 1份 /
10试纸条用法与判定
10.1样本处理
10.1.1组织样本的处理方法组织样本与PBS按照1:1的比例研磨后离心取上清直接用于检测。
10.1.2血液检测样本的处理方法直接用于检测。
10.2操作步骤取适量的检测样品(30～40μl，滴管1滴)，缓慢滴加到样品孔中，然后滴加2滴样品缓冲液。加样完成后将试纸条平放在桌面上，5～10分钟内观察结果。
10.3判定(如图5所示)
10.3.1在试纸条上出现两条条带(T：检测线，C：质控线)，判为阳性。
10.3.2在试纸条上仅出现一条蓝色条带(C：质控线)，判为阴性。
10.3.3在试纸条质控线处不出现条带，判为无效。
11试纸条使用注意事项
11.1包装破损、过有效期的，请勿使用。
11.2试纸条贮藏与运输过程中不可冷冻，避免阳光直晒。
11.3试验时，请勿饮食和吸烟。
11.4处理疑似被感染物时，应带上手套，并在处理后将手洗净。
11.5试验完毕后，试纸条和其他物品与检测样品一起进行无害化处理。
12试纸条贮藏与有效期2～30℃阴凉干燥处保存，有效期为24个月。
实施例3非洲猪瘟病毒快速检测试纸条性能评价
一、特异性检验
1材料
1.1试剂条非洲猪瘟病毒快速检测试纸条，参见实施例2制备，批号分别为批号为190301、190302、190305。
1.2特异性质控样品猪口蹄疫病毒抗原来自于改进型口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒(购自中国农业科学院兰州兽医研究院，批号为2018091013S)的口蹄疫O型病毒抗原；猪瘟病毒(购自普莱柯生物工程股份有限公司的活疫苗，批号为12CW1801001)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(购自浙江诗华诺倍威生物技术有限公司的活疫苗，批号为2018002)、猪伪狂犬病毒(购自武汉科前生物股份有限公司的活疫苗，批号为171224)、猪流行性腹泻病毒(和或猪传染性胃肠炎病毒)(购自武汉科前生物股份有限公司的活疫苗，批号为180602)；猪圆环病毒抗原(购自普莱柯生物工程股份有限公司的亚单位疫苗，批号为38CW1804013)。
1.3试剂盒仪器非洲猪瘟荧光定量PCR试剂盒购自青岛立见诊断技术发展中心，批号为041311924；荧光PCR仪购自苏州天隆生物科技有限公司。
1.4样品10份PCR检测为阴性的猪血清样品由杭州洪桥中科基因技术有限公司提供；10份PCR检测为阴性的猪组织样品由杭州洪桥中科基因技术有限公司提供。
2方法
分别检测6份特异性质控样品，10份PCR检测为阴性的猪血清样品，10份PCR检测为阴性的猪组织样品，按照实施例2中“10试纸条用法与判定”进行检测。
3结果
3.1特异性样品检测结果将6份特异性样品(猪口蹄疫O型病毒抗原、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒抗原、猪流行性腹泻病毒/猪传染性胃肠炎病毒)分别用三批非洲猪瘟病毒快速检测试纸条(乳胶法)进行检测，3批试纸条的检测结果全部为阴性，即阴性检出率为100％，具体见表6。
表6非洲猪瘟病毒快速检测试纸条特异性检测结果
注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。
3.2非洲猪瘟病毒已知阴性猪血清样品检测结果将10份非洲猪瘟病毒阴性猪血清样品(PCR检测为阴性)分别用三批非洲猪瘟病毒快速检测试纸条(乳胶法)进行检测，3批试纸条的检测结果全部为阴性，即阴性检出率为100％，具体见表6、图6、图7和表7。
表7 10份阴性样品信息
编号 样品类型 荧光PCR 采集地区 采集日期
1 血清 无Ct值 浙江省衢州常山常山县同弓金桥 2017/5/13
2 血清 无Ct值 浙江省衢州常山常山县同弓金桥 2017/5/13
3 血清 无Ct值 浙江省衢州常山常山县同弓金桥 2017/5/13
4 血清 无Ct值 浙江省衢州常山常山县同弓金桥 2017/5/13
5 血清 无Ct值 浙江省宁波市余姚市小曹娥镇 2017/5/13
6 血清 无Ct值 浙江省宁波市余姚市小曹娥镇 2017/5/13
7 血清 无Ct值 浙江省宁波市余姚市小曹娥镇 2017/5/13
8 血清 无Ct值 浙江省宁波市余姚市小曹娥镇 2017/5/13
9 血清 无Ct值 浙江省杭州萧山围垦 2017/5/13
10 血清 无Ct值 浙江省杭州萧山围垦 2017/5/13
3.3非洲猪瘟病毒已知阴性猪组织样品检测结果将10份非洲猪瘟病毒阴性猪组织样品(PCR检测为阴性)分别用三批非洲猪瘟病毒快速检测试纸条(乳胶法)进行检测，3批试纸条的检测结果全部为阴性，即阴性检出率为100％，具体见表6、图8、图9和表8。
表8 10份猪组织样品信息
编号 样品类型 荧光PCR 采集地区 采集日期
1 肺 无Ct值 浙江省衢州市常山县 2017/5
2 淋巴结 无Ct值 浙江省衢州市常山县 2017/5
3 淋巴结 无Ct值 浙江省衢州市常山县 2017/5
4 肺 无Ct值 浙江省杭州萧山围垦义蓬街道 2017/5
5 脾 无Ct值 浙江省杭州萧山围垦义蓬街道 2017/5
6 淋巴结 无Ct值 浙江省杭州萧山围垦义蓬街道 2017/5
7 肺 无Ct值 浙江省宁波市余姚市泗门镇 2017/5
8 肾 无Ct值 浙江省宁波市余姚市泗门镇 2017/5
9 脾 无Ct值 浙江省宁波市余姚市泗门镇 2017/5
10 肾 无Ct值 浙江省宁波市余姚市泗门镇 2017/5
二、敏感性检验
1材料
1.1非洲猪瘟病毒快速检测试纸条，参见实施例2制备，批号分别为批号为190301、190302、190305。
1.2 49份PCR检测为阳性的样品来自中国动物卫生与流行病学中心。
2方法检测已知的阳性样品用本研究3批非洲猪瘟病毒快速检测试纸条分别检测已知的阳性样品49份，按照实施例2中“10试纸条用法与判定”进行检测。
3结果已知阳性样品的检测结果PCR检测为阳性的样品49份，本研究3批试纸条检测结果为阳性的样品45份，检测结果为阴性的样品4份，阳性检出率为91.84％，且3批试纸条的检测结果一致。再检测的49份样品中，含7份弱阳性样本(Ct值≥27)(编号为3号至9号)，其中6号未检出，弱阳性检出率为6/7＝85.7％；中阳性样本(Ct值在20～27之间)有24份(编号为10号至33号)，其中10号、11号和28号未检出，中阳性检出率为21/24＝87.5％；强阳性样本(Ct值＜20)有18份(1号、2号、34号至49号)，这18份样品均检出，强阳性检出率为100％。具体结果见表9和图10(190302批检测结果)，具体样品信息见表10。
表9已知阳性样品的检测结果
/>
表1049份阳性样品信息
/>
注：样品信息表由中国动物卫生与流行病学中心提供。
三、重复性检验
1材料
1.1非洲猪瘟病毒快速检测试纸条，参见实施例2制备，批号分别为批号为190301、190302、190305。
1.2特异性样品猪口蹄疫病毒抗原来自于改进型口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒(购自中国农业科学院兰州兽医研究院，批号为2018091013S)的口蹄疫O型病毒抗原；猪瘟病毒(购自普莱柯生物工程股份有限公司的活疫苗，批号为12CW1801001)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(购自浙江诗华诺倍威生物技术有限公司的活疫苗，批号为2018002)、猪伪狂犬病毒(购自武汉科前生物股份有限公司的活疫苗，批号为171224)、猪流行性腹泻病毒(和或猪传染性胃肠炎病毒)(购自武汉科前生物股份有限公司的活疫苗，批号为180602)；猪圆环病毒抗原(购自普莱柯生物工程股份有限公司的亚单位疫苗，批号为38CW1804013)。
1.3阴性样品PCR检测为阴性的猪血清样品由杭州洪桥中科基因技术有限公司提供，编号为1、2、3、4、5，具体样品信息见特异性检验。
1.4阳性样品来自中国动物卫生与流行病学中心，其中强阳性样本编号为41、42、43、44、45，弱阳性样本编号为3、4、5、7、8，具体样品信息见敏感性检验。
2方法
2.1操作程序用吸管取1滴的检测样品，缓慢滴入到样品孔中然后加2滴样品缓冲液。加样完成后将试纸条平放在桌面上，5～10分钟之间观察结果。
2.2批内可重复性试验从3批次试纸条中各随机取100个试纸条对强阳性样品5份，弱阳性样品5份，健康猪血清样品5份，猪口蹄疫O型病毒抗原、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒抗原、猪流行性腹泻病毒/猪传染性胃肠炎病毒各1份，每份样品重复检测5次。每次重复检验均为不同实验人员分别进行操作。
2.3批间可重复性试验从三批试纸条190301、190302、190305中各取1盒(50个试纸条)，对5份强阳性样品，5份弱阳性样品，健康猪血清样品5份，猪口蹄疫O型病毒抗原、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒抗原、猪流行性腹泻病毒/猪传染性胃肠炎病毒各1份。3批试纸条的检测分3名实验人员分别进行操作。
2.4结果判定阳性结果：在试纸条的质控线和检测线出现条带；阴性结果：在试纸条上的质控线出现条带，检测线不出现条带；无效结果：在试纸条上的质控线不出现条带。
3结果
3.1批内可重复性试验从3批次试纸条中各随机取100个试纸条，对强阳性样品5份，弱阳性样品5份，健康猪血清样品5份，猪口蹄疫O型病毒抗原、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒抗原、猪流行性腹泻病毒/猪传染性胃肠炎病毒各1份进行检测。结果如下，批内检测结果一致，表明该试纸条能进行较好的批内重复性，结果见表11至13。
表11批内重复试验结果
注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。
表12批内重复试验结果
注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。
表13批内重复试验结果
/>
注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。
3.2批间可重复性试验从三批试纸条190301、190302、190305中各取20个试纸条，对强阳性样品5份，弱阳性样品5份，健康猪血清样品5份，猪口蹄疫O型病毒抗原、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒抗原、猪流行性腹泻病毒/猪传染性胃肠炎病毒各1份进行检测进行检测。结果如下：批间检测结果依然一致(表14)，表明该试纸条能进行较好的批间重复试验。
表14 3个不同批次的试纸条批间重复性试验结果
注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。
另外，本发明人一开始使用的样品处理液是不包含氟化钠(10mg/ml)的，在做敏感性验证的时候，发现符合率较低，约为81.6％；但在加入氟化钠(10mg/ml)后，符合率升高至91.8％(具体见敏感性检验)。我们分析可能是因为血液中某些化学成分(如血糖)离开机体后容易被酶作用而影响测定结果，如果处理液中含有能抑制酶作用的试剂(如氟化钠能抑制糖酵解)，则能防止血糖等化学物质的分解。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序 列 表
<110> 杭州恒奥科技有限公司
<120> 非洲猪瘟病毒快速检测试纸条及其制备方法和应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 621
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒P30核苷酸序列
<400> 1
catatggatt tcatcctgaa tatcagtatg aaaatggaag ttatcttcaa gaccgatctg 60
cgtagtagca gtcaggttgt ttttcatgca ggcagtctgt ataattggtt tagtgtggaa 120
attatcaaca gtggccgcat tgttaccacc gccattaaga ccctgctgag taccgtgaaa 180
tatgatattg ttaaaagcgc ccatatctat gcaggccagg gttataccga acatcaggca 240
caggaagaat ggaatatgat tctgcatgtt ctgtttgaag aagaaaccga aagcagtgcc 300
agcagcgaaa gcattcatga aaagaatgat aatgagacca acgaatgcac cagcagtttt 360
gaaaccctgt ttgaacagga accgagcagt gaagaaccga aagatagcaa actgtatatg 420
ctggcccaga aaaccgttca gcatattgaa cagtatggta aagccccgga ttttaataag 480
gttattcgcg cccataattt tattcagacc attcatggca ccccgctgaa agaagaagaa 540
aaagaagttg tgcgtctgat ggttattaag ctgctgaaaa agaataagct gctgagccat 600
ctgcatctga tgtttctcga g 621
<210> 2
<211> 432
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒P72核苷酸序列
<400> 2
atgcagccta cccaccacgc agaggtaagc tttcaggata gagatacagc tcttccagat 60
gcatgttcat ccatatctga tattaccccc attacttatc cgatcacatt acctattatt 120
aaaaacattt ccgttactgc tcacggtatc aatcttatcg ataaatttcc atcaaagttc 180
tgcagctctt acataccctt ccactacgga ggcaattcga ttaaaacccc cgacgatccg 240
ggcgcgatga tgattacctt tgctttgaaa ccacgggagg aataccaacc cagcggtcat 300
attaacgtat ccagagcaag agaattttat attagctggg acacagatta tgtggggtct 360
atcaccacgg ctgatcttgt ggtatcggca tccgctatta actttcttct tcttcagaat 420
ggttcagctg tg 432

Claims (1)

1.一种非洲猪瘟快速检测试纸条，所述非洲猪瘟快速检测试纸条由试纸条和样品处理液组成，其特征在于，所述试纸条包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；所述乳胶微球垫为乳胶微球标记抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜表面划有检测线和质控线，其中检测线为抗非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体，质控线为羊抗小鼠IgG抗体；所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体为单克隆抗体4C11株；所述的抗非洲猪瘟病毒P72蛋白的单克隆抗体为单克隆抗体7D5株；所述的样品处理液为1×PBS溶液；所述的样品处理液中还含有氟化钠，所述的氟化钠的浓度为10mg/ml。
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