CN111269890A - 抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗包虫病抗原单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗包虫病抗原单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗包虫病抗原单克隆抗体及其应用，该抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，分类命名为杂交瘤细胞株XJ10D8D10，已于2017年09月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201789。本申请对包虫病成虫表膜抗原进行提取,免疫Balb/c小鼠，获得分泌抗包虫病成虫表膜抗原的脾淋巴细胞，将其与SP2/0细胞融合获得分泌抗包虫病成虫表膜抗原的杂交瘤细胞株，从而获得抗包虫病成虫表膜抗原的抗体，该抗体作为诊断试剂，通过粪抗原检测可灵敏的检测出犬的细粒棘球绦虫的感染。为大范围普查检测试剂盒的制备提供必要条件。

Description

抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗包虫病抗原单克 隆抗体及其应用
技术领域
本申请涉及一种细粒棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株；本申请还涉及一种产生单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法。
背景技术
包虫（棘球蚴）病是由细粒棘球绦虫引发的人兽共患寄生虫病，呈世界范围流行，且流行日趋严重，该病在东欧、环地中海所有国家、中亚、北非及南美洲高发流行。我国也是重灾区。该病的免疫诊断、化疗及终末宿主的诊断及疫苗,是当今包虫病防控工作急需解决的问题和深入研究的主要方向。包虫病在我国分布23个省区，新疆、西藏、甘肃、青海、宁夏、内蒙、四川西部等七省区为高发流行区。包虫病是西部地区农牧民因病致贫和因病返贫的主要疾病之一，同时也是影响畜牧业发展的重要疾病。
包虫病高发国家经过20-100年的控制到最终消灭包虫病，证明包虫病是可以控制的，但与发达国家相比，发展中国家急需简单、有效的防控技术手段控制该病。在包虫病疫苗的研制方面，新西兰和澳大利亚合作研制成功了以绵羊为主的中间宿主用疫苗EG（细粒棘球绦虫）95，该疫苗对绵羊包虫病的保护率达95%以上，但该疫苗不能解决终末宿主感染该虫体后排卵污染环境的威胁，不能解决人被感染的问题，包虫病控制的关键在于终末宿主，因此必须开展细粒棘球绦虫终末宿主的免疫和防控研究。
对包虫病流行病学调查和早期诊断进行研究十分必要，目前包虫病人的诊断主要通过影象技术确诊，现对人和终末宿主犬的免疫学诊断的研究处于初步阶段。从整个包虫病的防治上讲，存在两个方面的问题:（1）终末宿主还无免疫接种的疫苗；（2）还没有简便有效的诊断方法用于广大农牧区对人和犬的早期诊断，诊断方法有待突破，以适应于大范围普查的需要。长期的研究和实践表明要有效的防控该病就要及时发现感染犬并进行有效的治疗处理，这个问题的解决需要早期诊断方法的突破，而有效的诊断试剂的研制是创建简单有效的检测方法及产品的突破口。本发明所公布的EgXJ10单克隆抗体作为诊断试剂，通过粪抗原检测可灵敏的检测出犬的细粒棘球绦虫的感染。为大范围普查检测试剂盒的制备提供必要条件。
发明内容
本申请的目的在于提出一种抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗包虫病抗原单克隆抗体及其应用。
本申请的目的是这样实现的：本申请的一种抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，分类命名为杂交瘤细胞株XJ10D8D10，已于2017年09月25日保藏于中国典型培养物保藏中心 (China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201789。
抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株在制备细粒棘球绦虫检测试剂盒中的应用，为大范围普查检测试剂盒的制备提供必要条件。
本申请还提供了一种抗包虫病抗原单克隆抗体，该抗包虫病抗原单克隆抗体即由上述的抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得的。
抗包虫病抗原单克隆抗体在检测细粒棘球绦虫成虫中的应用。
一种细粒棘球绦虫检测试剂盒，包含有所述的抗包虫病抗原单克隆抗体。
一种抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、制备细粒棘球绦虫成虫表膜抗原；
步骤二、制备SP2/0细胞；
步骤三、制备饲养细胞；
步骤四、从小鼠身上制备待融合的脾淋巴细胞；
步骤五、将1.0×108个脾淋巴细胞和2.0×107个骨髓瘤细胞进行细胞融合；
步骤六、融合细胞的选择培养：脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合而成的异核体，即杂交瘤细胞由于具有两种亲代细胞的染色体，从而既可产生原来脾细胞所有的HGPRT(次黄漂呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)，又从骨髓瘤细胞中获得了在组织培养中增殖的特性，因此能在HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择性培养基中存活下来，并不断增殖；
步骤七、阳性杂交瘤细胞株的筛选：待杂交瘤细胞长满孔底1/3-1/2时，换液3-4d后即可取细胞培养上清液100µL，不作稀释用间接ELISA（酶联免疫吸附试验）实验进行特异性抗体的检测，同时用SP2/0细胞培养上清液作阴性对照；检测为阳性的细胞可进行扩大培养，同时选择强阳性的孔进行亚克隆，并注意随时冻存保种；
步骤八、采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞的克隆及扩增，最终制得杂交瘤细胞株XJ10D8D10；
步骤九、选择生长旺盛、形态良好的处于对数生长期的细胞进行阳性杂交瘤细胞的冻存。
由于实施上述技术方案，本申请对包虫病成虫表膜抗原进行提取,免疫Balb/c小鼠，获得分泌抗包虫病成虫表膜抗原的脾淋巴细胞，将其与SP2/0细胞（小鼠骨髓瘤细胞）融合获得分泌抗包虫病成虫表膜抗原的杂交瘤细胞株，从而获得抗包虫病成虫表膜抗原的抗体，该抗体作为诊断试剂，通过粪抗原检测可灵敏的检测出犬的细粒棘球绦虫的感染。为大范围普查检测试剂盒的制备提供必要条件。
附图说明
本申请的具体结构由以下的附图和实施例给出：
图1是本申请中在不同时间内五个批次的细粒棘球绦虫成虫表膜蛋白SDS-PAGE分析图；
图2是本申请中单克隆抗体与犬细粒棘球绦虫不同阶段抗原，及其他相关虫体抗原的Western blot结果；
图3是本申请中单克隆抗体的杂交瘤细胞株培养上清液与多头绦虫，泡状带绦虫、犬细粒棘球绦虫的阳性粪样特异性反应结果图；
图4是本申请中杂交瘤细胞EgXJ101染色体形态（10×100倍）放大图；
图5是本申请中杂交瘤细胞EgXJ102染色体形态（10×100倍）放大图；
图6是本申请中经ELISA鉴定获得的分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株的亚型为免疫球蛋白M(Immunoglobulin M，IgM)的结果图；
图7是本申请中通过试纸条对单克隆抗体的杂交瘤细胞株检测亚型结果图；
图8是本申请中获得的单克隆抗体的杂交瘤细胞株效价示意图；
图9是本申请中单克隆抗体的杂交瘤细胞株EgXJ10细胞培养上清与成虫表膜反应(10×10倍)放大图；
图10是本申请中SP2/0细胞培养上清与成虫表膜反应(10×10倍)放大图。
具体实施方式
本申请不受下述实施例的限制，可根据本申请的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。
实施例：在产生单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株前需作下列准备：
一、实验试剂的准备：Triton X-100，牛血清白蛋白（BSA）、protein assayconcertration 、蛋白marker、聚乙二醇（PEG1500）、RPMI-1640、胎牛血清购自Hyclone公司、100×HT、100×HAT购自Hyclone公司、其余试剂均为国产分析纯、低分子质量标准蛋白Marker购自Promega公司； Tween-20、过硫酸铵（APS）、四甲基二乙胺（TEMED）、20×PBS浓缩液牛血清白蛋白（BSA）、邻苯二胺（OPD）、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG（HRP-IgG）、二甲亚砜（DMSO）、ELISA包被液（pH7.4）、8-氮鸟嘌呤、血清稀释液为本实验室自制；其余试剂均为国产分析纯；
二、实验动物与细胞的准备：比格犬（Beagle）购自广东省高要市康达实验动物科技有限公司， 8周龄清洁级BALB/c雌性小鼠购自新疆实验动物研究中心、SP2/0（小鼠骨髓瘤细胞）购自中科院上海细胞库。
三、主要仪器与设备的准备：电泳仪，台式离心机（Eppendorf 德国）、制冰机（Scotsman，美国）、倒置显微镜（Olympus CK30）、CO2培养箱（Sanyo公司，日本）、台式电子天平（上海精天公司）、细胞培养板、生物安全柜、DYNEX-OPSYS酶标检测仪（USA）、-80℃冷冻冰箱、台式电子天平（上海精天公司）、细胞培养板、细胞冻存管，液氮罐。
一种分泌细粒棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、细粒棘球绦虫成虫表膜抗原的制备：
1、购进比格犬（Beagle）先观察一周，在一周之后每只犬空腹口服丙硫咪唑（20mg/kg）和砒喹酮（5 mg/kg）驱虫；
2、原头蚴感染剂量：驱虫后一周按犬的个体大小、公母搭配随机分为三组，每组空腹口服25万枚原头蚴感染，感染6只犬；
3、细粒棘球绦虫制备：原头蚴感染35天，剖解，取其小肠沿纵轴剪开放入37℃生理盐水中，收集自然脱落的细粒棘球绦虫。再用灭菌PBS液快速、轻缓清洗虫体（尽量保证虫体完整）2-3遍，置于储存管里，自然沉淀，弃上清，沉淀于液氮中保存备用；
4、细粒棘球绦虫成虫表膜蛋白制备：从液氮中取出虫体，置于室温，充分冻融 ，在虫体沉淀中加入等体积的1% Triton X-100，轻缓颠倒，反复7次，使Triton X-100与虫体充分结合，将虫体表膜蛋白完全洗脱下来。用4000rpm,离心10min收集1%Triton X-100洗脱下来的细粒棘球绦虫表膜蛋白(EgSFAg)（即上清）；
5、测成虫表膜蛋白浓度：
（1）dye-reagent 测定：参照BIO-RAD protein assay concerntration 试剂盒测定。具体方法如下:dry-reagent按1份显色液加4份水稀释。每孔加稀释的显色液200ul，待测蛋白按1:10,1:20稀释后加入10ul，充分混匀，在避光下作用5分钟。在酶标仪595nm下读值。以牛血清白蛋白（BSA）作为标准蛋白，分别按1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mg/ml稀释，按以上方法加样测定。测得结果以BSA蛋白的读值做Y=kX+b为曲线，得出待测蛋白浓度。
（2）SDS-PAGE测定：测定的样品制备时间分别为：2008.3.17；2009.2.11；2010.3.26；2010.8.4；2011.3.30采集虫体并提取的虫体表膜蛋白。用2×loading buffer处理的表膜蛋白沸煮5min,取10ul处理后的样品用5%浓缩胶和12%分离胶进行蛋白成份分析，先用90V电压，约15min后，再用120V电压，将样品指示剂跑出胶外，停止电泳。取出胶，用染色液进行染色20min,再用脱色液脱色至背景无蓝色。
步骤二、SP2/0细胞的制备：
1、融合前30d左右，进行SP2/0细胞的复苏，将SP2/0细胞连续传代三次，以保持HGPRT（次黄漂呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）缺陷型；
2、1000r/min离心5min收集8-氮鸟嘌呤处理过的SP2/0细胞， PBS缓冲液洗涤三次，加入完全培养液，放入细胞培养瓶中37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中传代培养；
3、融合前24-48h，选择生长良好和形态典型的SP2/0细胞。进行半传代培养，SP2/0细胞的状态比其数量更重要，也是融合成功的关键因素之一。
步骤三、饲养细胞的制备：
1、在融合前2~3d，选择与免疫小鼠相同品系的BALB/c雌性小鼠，将其移入超净台使之安乐死，75%酒精浸泡消毒3 min后固定于解剖板上；
2、用镊子提起小鼠腹部皮肤，无菌剪开腹部皮肤，经钝性剥离使腹膜充分暴露；
3、用酒精擦拭消毒，用高温消毒过的无菌注射器吸取含20%胎牛血清HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择培养液10mL注入小鼠腹腔，小心反复吹打注射器内的液体（此时勿将针头拔出），大约3-4次之后，用该注射器吸出腹腔内液体（内含巨噬细胞），注入灭菌平皿中，进行细胞计数；
4、调整HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）培养液体积，使细胞浓度在1×105个/mL左右，分装于96孔细胞培养板中，100µL/孔，37℃、饱和湿度，5%CO2培养箱中培养。18-24h后观察细胞生长状态，细胞呈多形性，贴壁紧密，折光性好时可用。
步骤四、脾细胞的制备：
1、用安乐法处死小鼠，在75%的酒精中浸泡5min；
2、无菌条件下剪开小鼠腹腔，取出脾脏；
3、将脾脏移入另一盛有20mL基础培养液的平皿中。用灭菌注射器吸取营养液插入脾脏的一端，推入培养液，将脾脏内细胞冲洗出来，反复冲洗数次，直至脾脏的颜色变白为止；
4、吸出平皿内的脾细胞悬液到管口设有200目的不锈钢筛网的50mL离心管内，拔出筛网去除脂肪和大的结缔组织块，以1000r/min离心5min，沉淀细胞，弃上清液；
5、用4℃的0.91%氯化铵溶液5mL混悬沉淀的细胞，置细胞悬液于水浴条件下5min，破坏从脾脏释出的红细胞；
6、加入基础培养液15mL终止氯化铵的作用。取样进行脾淋巴细胞计数；
7、将脾淋巴细胞以1000r/min离心5min，弃上清液。再加入10mL基础培养液重新悬浮沉淀的脾淋巴细胞。此即为待融合的脾淋巴细胞。
步骤五、细胞融合：
1、将1.0×108个脾细胞2.0×107个骨髓瘤细胞混合于50mL的离心管中，轻轻混匀；
2、1000r/min离心10min，弃上清液，尽可能除得干净；
3、用手指轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状，此步为融合关键步骤；
4、将离心管置于37℃水浴中，吸取1mL37℃预温的50% PEG缓缓滴入离心管内，在1min内加完，边滴加边摇动，使细胞保持在混和状态；
5、在15sec内加入1mL基础培养液（37℃），且不断摇动离心管，继续摇动离心管45sec；
6、在30sec内加入2mL基础培养液（37℃），且不断摇动离心管，继续摇动离心管2min；
7、在30sec内加入4mL完全培养液（37℃），且不断摇动离心管，继续摇动离心管2min；
8、在30sec内加入8mL完全培养液（37℃），且不断混匀，使PEG(聚乙二醇)作用终止。由于稀释使PEG(聚乙二醇)停止作用，注意尽可能不要搅动细胞；
9、将终止反应后的细胞悬液以1000r/min离心10min，弃上清液，加入适量的HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）培养液：以每2×107个脾淋巴细胞中加入10mlHAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）培养液，并以100ul/孔的量加入到一块已含有饲养细胞的96孔细胞培养板中；
10、将接种了融合细胞的96孔培养板，置37℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养；
11、每2-3天换一次HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）培养液，连续两周。观察杂交瘤细胞是否出现。2周后，可改用HT（次黄嘌呤、胸腺嘧啶）培养基。
步骤六、融合细胞的选择培养：细胞融合后，在培养液中存在有五种细胞成分，即：未融合的脾细胞，未融合的骨髓瘤细胞，脾细胞与脾细胞融合而成的同核体，骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合而成的同核体，以及脾细胞与骨髓瘤细胞融合而成的异核体。然而由于存在HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择性培养基，其中的骨髓瘤细胞及其相互融合形成的同核体细胞的DNA合成的主要途径被氨基喋呤阻断，因为缺乏HGPRT (次黄漂呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)，DNA合成旁路途径也不能进行，故它们在HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择性培养基中不能增殖而很快死亡。小鼠脾细胞及其相互融合形成的同核体虽然具有HGPRT(次黄漂呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)，但缺乏在体外培养中增殖的能力，一般在5~7d内也会死亡，唯有脾细胞与骨髓瘤细胞融合而成的异核体，即杂交瘤细胞由于具有两种亲代细胞的染色体，从而既可产生原来脾细胞所有的HGPRT(次黄漂呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)，又从骨髓瘤细胞中获得了在组织培养中增殖的特性，因此能在HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择性培养基中存活下来，并不断增殖。融合后的细胞每3d更换培养液一次，换液时，先吸去原有培养孔1/2的培养液，再加入等量新鲜培养液，所用的培养液按培养时间的不同而有所不同，在融合后第2周内用HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）培养液；第3周用HT（次黄嘌呤、胸腺嘧啶）培养液，第3后用普通的完全培养液。
步骤七、阳性杂交瘤细胞株的筛选：为排除细胞培养上清液中的还未死的小鼠脾细胞所分泌的抗体的影响，可以在检测之前多进行几次半换液，尽可能的减少干扰。待杂交瘤细胞长满孔底1/3-1/2时，换液3-4d后即可取细胞培养上清液100µL，不作稀释用间接ELISA（酶联免疫吸附试验）实验进行特异性抗体的检测，同时用SP2/0细胞培养上清液作阴性对照。检测为阳性的细胞可进行扩大培养，同时选择强阳性的孔进行亚克隆，并注意随时冻存保种。
步骤八、阳性杂交瘤细胞的克隆及扩增（有限稀释法）：
1、制备饲养细胞，方法如2.2所述，可于阳性杂交瘤细胞克隆化前2~3天制备；
2、将已检测为分泌阳性的96孔细胞培养板特定孔中杂交瘤细胞集落（强阳性孔）吹起，混匀，取所有细胞悬液至一无菌青霉素小瓶中，做适当稀释。将上述无菌小瓶中的细胞直接滴于细胞计数板上，进行细胞计数；
3、取上述细胞悬液，用含20%胎牛血清的HT（次黄嘌呤、胸腺嘧啶）培养液或完全培养液准确进行系列稀释，直至1mL含10个细胞。到第2或第3次亚克隆时，可适当的减少细胞密度，如调整至7-8个/mL，即每块96孔细胞培养板加70~80个细胞，这样可加快单个集落的形成；
4、将稀释好的细胞悬液用灭菌排枪加到事先加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，100µL /孔，将培养板置5% CO2，37℃饱和湿度培养箱中培养；
5、适时观察细胞的生长状况，待细胞集落生长到孔底1/3-1/2时半换液，并用所换培养液上清检测；
6、注意尽量选取单克隆细胞集落进行检测筛选与克隆化，同时每次将克隆化剩余细胞转入24孔细胞培养板培养，继而转入培养瓶中进行扩大培养，并及时冻存；
7、经过3-4次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100%时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
8、获得分泌抗体的杂交瘤细胞株后，及时进行扩大培养并冻存。
步骤九：阳性杂交瘤细胞的冻存：
1、选择生长旺盛、形态良好的处于对数生长期的细胞，轻轻将细胞从瓶壁上吹下；
2、1000r/min离心10min，弃上清，收集细胞沉淀；
3、用冻存液将细胞沉淀悬浮，分装于冻存管中，加盖封严，并注明细胞代码冻存日期；
4、将冻存管先放置4℃，放置2h，再移至－80℃低温冰箱中过夜，最后投入液氮容器中，并做好记录，长期保存。
杂交瘤稳定性测定：细胞株连续传代并定期检测其培养上清，对照传代过程中其分泌能力变化；冻存一个月后复苏检测培养基上清，对照复苏前后分泌能力变化。
细粒棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备：
腹水制备：将阳性细胞克隆1O6/ml注射入Balb／c雌性小鼠腹腔，二周后收集腹水。
抗体特异性：分别与原头蚴抗原、成虫虫体抗原、成虫表面抗原，、泡状带绦虫虫体抗原、多头绦虫虫体抗原、犬消化道线虫虫体抗原，进行间接ELISA反应。
杂交瘤细胞株染色体的鉴定：秋水仙碱处理对数生长期的杂主瘤细胞，经低渗处理后进行常规Giemsa染色．计数分析。
免疫球蛋白亚类鉴定：按照SIGMA公司生产的IsoQuickTMKit for MouseMonoclonal Isotyping试剂盒说明进行。
免疫组织化学实验测定抗体在细粒棘球绦虫中定位：将采集的Eg成虫虫体在4％多聚甲醛中固定2h，按常规方法脱水、石蜡包埋、制成切片(5 µm)。2％牛血清白蛋白封闭，单克降培养基上清50µl反应1h，聚合物增强剂50µl反应20min，50µl 酶标抗鼠聚合物(Polymerized HRP Anti Mouse IgM)30min．DAB显色，苏木索复染。显微镜下观察并采集图象。
如图1所示，测定结果：1、得到自然脱落、无肠粘膜的细粒棘球绦虫180毫升；2、每批次从5毫升虫体中得到约5毫升的EgSFAg, 并测得蛋白浓度分别为10-12mg/ml；3、SDS-PAGE分析该虫体蛋白主要以约116.0，70.0，45.0，35.0,30.0 kDa为目的蛋白。
蛋白保存：按0.5毫升的体积分装，置-20℃保存备用。
从SDS-PAGE 结果分析，该蛋白在-20℃可保存4年。该蛋白主要以116.0，66.0，45.0，35.0,30.0 kDa为目的蛋白。在保存期间如出现沉淀，该蛋白需测蛋白浓度与SDA-PAGE蛋白成份分析并行，结果以主要的目的蛋白为参照。
杂交瘤细胞株的建立：将筛选出的阳性细胞孔内的细胞，用有限稀释法经过四次克隆，克隆板阳性率达到100％，筛选得到1株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。连续传代32代和冻存1个月后复苏，ELISA检测抗体滴度无明显降低，仍保持相同的机体分泌能力。
如图2所示，单克隆抗体与犬细粒棘球绦虫不同阶段抗原，及其他相关虫体抗原的Western blot结果：1.细粒棘球绦虫原头蚴抗原；2.细粒棘球绦虫成虫抗原；3.细粒棘球绦虫表膜抗原；4.Mark；5.曲子宫绦虫抗原；6.莫尼茨绦虫抗原；7.细颈囊尾蚴抗原；8.泡状带绦虫抗原；9.多房棘球绦虫抗原；10线虫抗原。
抗体特异性：Western-biot检测结果，抗体能够与成虫虫体抗原、成虫表面抗原、原头蚴抗原结合呈强阳性反应，不与泡状带绦虫虫体抗原、多头绦虫虫体抗原、犬消化道线虫虫体抗原反应。
如图3所示，ELISA检测结果，获得的单克隆体细胞株培养上清与多头绦虫，泡状带绦虫均无反应。与犬细粒棘球绦虫阳性粪样特异性反应。
如图4、5所示，杂交瘤细胞株的染色体分析：EgXJ10细胞染色体数目为97- 106条，有端着修粒及中着丝粒染色体，大部分为端着丝粒，符合杂交瘤细胞的染色体特点。
如图6、7所示，单克隆抗体的免疫球蛋白亚类分型：经检测证明获得的抗EgsfAg单克隆抗体细胞株EgXJ10免疫球蛋白亚型为IgM型,轻链为Kappa型。
如图8所示，获得的单克隆抗体细胞株效价为1:320000。
如图9、10所示，免疫组化抗体定位：从显徽镜下观察，本实验得到的单克隆抗体细胞株培养上清与细粒棘球绦虫虫体表膜呈亮黄色的阳性反应，而SP2/0细胞培养上清与细粒棘球绦虫虫体表膜未出现亮黄色的阳性反应(即阴性)。
以上技术特征构成了本申请的最佳实施例，其具有较强的适应性和最佳实施效果，可根据实际需要增减非必要技术特征，来满足不同情况的需要。

Claims (6)

1.一种抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于：分类命名为杂交瘤细胞株XJ10D8D10，保藏编号为CCTCC NO：C201789。
2.如权利要求1所述的抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株在制备细粒棘球绦虫检测试剂盒中的应用。
3.一种抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、制备细粒棘球绦虫成虫表膜抗原；
步骤二、制备SP2/0细胞；
步骤三、制备饲养细胞；
步骤四、从小鼠身上制备待融合的脾淋巴细胞；
步骤五、将1.0×108个脾淋巴细胞和2.0×107个骨髓瘤细胞进行细胞融合；
步骤六、融合细胞的选择培养：脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合而成的异核体，即杂交瘤细胞由于具有两种亲代细胞的染色体，从而既可产生原来脾细胞所有的HGPRT(次黄漂呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)，又从骨髓瘤细胞中获得了在组织培养中增殖的特性，因此能在HAT（次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶）选择性培养基中存活下来，并不断增殖；
步骤七、阳性杂交瘤细胞株的筛选：待杂交瘤细胞长满孔底1/3-1/2时，换液3-4d后即可取细胞培养上清液100µL，不作稀释用间接ELISA（酶联免疫吸附试验）实验进行特异性抗体的检测，同时用SP2/0细胞培养上清液作阴性对照；检测为阳性的细胞可进行扩大培养，同时选择强阳性的孔进行亚克隆，并注意随时冻存保种；
步骤八、采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞的克隆及扩增，最终制得杂交瘤细胞株XJ10D8D10；
步骤九、选择生长旺盛、形态良好的处于对数生长期的细胞进行阳性杂交瘤细胞的冻存。
4.一种抗包虫病抗原单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得。
5.如权利要求4所述的抗包虫病抗原单克隆抗体在检测细粒棘球绦虫成虫中的应用。
6.一种细粒棘球绦虫检测试剂盒，其特征在于：包含有如权利要求4所述的抗包虫病抗原单克隆抗体。
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