CN114656558B - 一种抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法及应用 - Google Patents

一种抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法及应用，该方法通过杂交瘤技术采用Balb/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合建立杂交瘤细胞株Anti‑XJEmSfAg‑4D6。由该细胞株通过体外培养法、动物体内诱生腹水法获得特异性单克隆抗体，制备了多房棘球绦虫成虫免疫组化试剂盒。本发明为临床和科研机构提供了抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原的特异性单克隆抗体，它既可用于ELISA实验对临床样品进行检测，也可用于免疫组化实验对病理标本进行检测，还可为包虫病研究部门提供便利的研究工具，在终末宿主感染多房棘球绦虫的检测中有广泛的应用价值，为泡型包虫病的基线调查和防控效果评估提供了技术支撑。

Description

一种抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法及 应用
技术领域
本发明属于生物及细胞工程技术领域，涉及一种抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法及其应用。
背景技术
泡型棘球蚴病(AE，Alveolar Echinococcosis)，是由多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis，Em)的幼虫阶段引起的人类最致命的蠕虫病之一，主要以野生动物自然循环为主，流行于北半球，呈局部地方性流行，在我国主要流行于西藏、四川西部、甘肃、青海南部高原、新疆北部和内蒙古东部呼伦贝尔草原等西部牧区和半农牧区。由于我国西部牧区野生狐狸、放牧犬和啮齿类动物分布广泛，使得多房棘球绦虫生活史存在复杂性，增加了宿主动物和人传播和感染该病的风险，可造成严重的社会经济问题。
终末宿主感染多房棘球绦虫的诊断和检测技术有氢溴酸槟榔碱下泻法，剖检法等，这些方法可能感染操作者，并且污染环境，造成包虫病的传播，引起严重的公共卫生安全。
单克隆抗体技术是20世纪70、80年代兴起的分子生物学技术，是针对某一特定的抗原表位由单个B淋巴细胞产生的特异性抗体。随着细胞生物学和分子生物学技术的不断发展，单克隆抗体作为生命科学技术相关研究的重要技术之一，越来越被广泛普及，在食品、农业、生物科技以及医学等各个领域都得到较为广泛的应用，特别是免疫学方面的应用，单克隆抗体可用于疾病的诊断和预防。单克隆抗体可准确识别病原体的类型，且能针对感染性疾病做出精确的判断。病原刺激机体后，机体可对侵入的病原体做出特异性抵抗，包括主动免疫和被动免疫。这两种方式均可使用单克隆抗体。本发明所公布的杂交瘤细胞株Anti-XJEmSfAg-4D6单克隆抗体，可以作为终末宿主多房棘球绦虫抗原ELISA检测的诊断试剂，为多房棘球绦虫的诊断以及大范围普查检测试剂盒的制备提供必要条件。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法及其应用。
本发明的目的是提供能分泌抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明的另一目的是提供由杂交瘤细胞株分泌的抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原的特异性单克隆抗体。
本发明的又一目的是制备的单克隆抗体用于终末宿主感染多房棘球绦虫成虫的检测。
本发明所述的一种抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法，按下列步骤进行：
建立细胞株：
a、抗原制备：
将感染多房棘球蚴包囊的老鼠安乐死，75％酒精消毒3min，移入生物安全柜中，将其腹部朝上，固定于解剖板上，用无菌剪刀和镊子剪开腹部皮肤和腹膜，打开腹腔，将包囊取出，用剪刀剔除周围的结缔组织，剪碎包囊，用双层无菌医用纱布筛进行过滤，收集原头蚴，计数，取15-20万枚原头蚴经口服人工感染犬，25天后剖检犬，收集多房棘球绦虫成虫，取1mL成虫装入5mL离心管中，加入等体积的1％曲拉通X-100，室温轻轻摇晃7-10次，3500rpm/min，温度4℃离心10min，收集上清，即为提取的多房棘球绦虫成虫表膜抗原EmSfAg；
将得到的多房棘球绦虫成虫表膜抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀，超声乳化，小鼠颈背部皮下进行多点注射，免疫剂量：0.1mg/mL，进行首免；分别在14d和28d，用弗氏不完全佐剂乳化抗原进行二免和三免，免疫剂量：0.05mg/mL，分别在25d和38d小鼠尾静脉采血，分离血清，用间接ELISA方法进行抗体水平检测，效价达1:80000以上的Balb/C鼠融合前三天腹腔注射0.1mg抗原进行加强免疫；
b、饲养层细胞的制备：
融合前1d选择一只品系相同健康的Balb/C鼠安乐死，浸泡于75％的酒精中3min，随即放入生物安全柜中，腹部朝上固定于解剖板上，用镊子提起小鼠腹部皮肤，用无菌剪剪开腹部皮肤，经钝性剥离使腹膜充分暴露，用酒精棉球擦拭腹膜消毒，用5mL一次性注射器吸取 DMEM基础培养液，注入小鼠腹腔，注射器停留不动，反复抽吸几次，用原注射器吸出腹腔内液体，注入15mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，用HAT培养液将沉淀中的细胞重悬稀释至1×105个/mL，放入96孔细胞培养板中，100μL/孔，铺5块板，放置在温度37℃， 5％CO2培养箱中备用，24h内密切观察细胞生长情况；
c、骨髓瘤细胞的准备：
骨髓瘤细胞选取SP2/0细胞，融合前30d进行SP2/0细胞的复苏，经过8-氮鸟嘌呤筛选，放入75cm2细胞培养瓶中扩大培养，试验时选取处于对数生长期的、形态良好的、活细胞计数超过95％的骨髓瘤细胞，将其完全吹下，转移到50mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，再用DMEM基础培养液洗涤2次，加DMEM基础培养液至20mL计数，取2×107个细胞待用；
d、脾细胞制备：
取加强免疫的Balb/C鼠安乐死，75％酒精消毒3min，移入生物安全柜中，固定于解剖板上，用无菌剪刀和镊子分别剪开皮肤和腹膜，无菌取出脾脏，放入已盛有DMEM基础培养液的无菌平皿中清洗，剥离被膜上的结缔组织，用温度37℃预热的DMEM基础培养液冲洗一次，碾碎，过200目网筛，用10mL DMEM基础培养液冲洗网筛，制成细胞悬液后转移到50mL 离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，细胞沉淀用DMEM基础培养液同法洗涤1次，用细胞计数器计数，取1×108个脾细胞，悬浮备用；
e、细胞融合：
将步骤c得到的骨髓瘤细胞与步骤d得到的脾细胞按细胞数1:5的比例混合，在50mL离心管内用DMEM基础培养液洗1次，1200rpm离心8min，弃上清，用灭菌滤纸吸净残留液体，轻轻弹击离心管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状，将离心管置于温度37℃水浴中，90s内加入预热的1mL 50％聚乙二醇溶液，边加边轻晃离心管，静置1min，然后每隔2min分别加入1mL， 2mL，3mL，4mL，5mL和10mL的预热DMEM基础培养液，终止融合作用，边加边轻晃离心管，1000rpm离心10min，弃上清，静置8min，加HAT培养液轻轻悬浮细胞，将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔细胞培养板中，100μL/孔，将培养板置于温度37℃、5％CO2培养箱中培养；
f、细胞克隆的观察和换液：
步骤e中细胞融合后第3d开始，对细胞进行仔细观察，记录好细胞的生长状态、培养液有无污染、饲养细胞的状况，第5d开始更换培养液，采用半换液方式，每2-3天换一次HAT 培养液，观察杂交瘤细胞是否出现，10d后，改用HT培养液，三次克隆后换DMEM完全培养液；
g、筛选分泌抗体的杂交瘤细胞：
在细胞融合后的第8d，按步骤f细胞克隆的观察结果，将5块细胞培养板中含有克隆细胞生长的所有细胞孔用间接ELISA法检测杂交瘤细胞抗体，具体步骤如下；
抗原包被：用包被液稀释多房棘球绦虫成虫表膜抗原EmSfAg至4μg/mL，96孔酶标板每孔加入100μL，温度4℃过夜，次日用洗涤缓冲液洗板3次，每次1min，拍干；
封闭：每孔加入200μL封闭液，温度37℃孵育1h，洗涤缓冲液洗板3次，每次1min，拍干；
加待测样品：无菌条件下取细胞培养板上生长成簇的杂交瘤细胞上清液加入到酶标板中，每孔加入100μL，SP2/0细胞上清液为阴性对照，温度37℃孵育1h，洗涤缓冲液洗板3次，每次1min，拍干；
加二抗：将鸡抗小鼠HRP-IgG抗体稀释10000倍，100μL/孔，温度37℃孵育1h，洗涤缓冲液洗板5次，每次1min，拍干；
显色：加入底物显色反应液，100μL/孔，避光温度37℃显色10-15min；
终止：加入终止液，50μL/孔；
读值：以450nm单波长测定各孔OD值。
判定：以阴性对照SP2/0细胞OD值的2.1倍作为阳性判定的临界点，与待测样品的OD 值进行比较，选取阳性孔中高OD值孔，对其所对应的细胞培养孔进行细胞的克隆化；
h、阳性杂交瘤细胞的克隆化采用有限稀释法：
亚克隆前1d制备饲养细胞，将选定的强阳性单个细胞克隆孔中液体吸净，加入新鲜的 DMEM基础培养液，反复吹打，将细胞液移至1.5mL离心管内，1000rpm离心5min，进行细胞计数。取四个平皿，用HT培养液进行稀释，使其浓度分别为1000个细胞/mL、100个细胞/mL、10个细胞/mL和5个细胞/mL；将1000个细胞/mL和100个细胞/mL分别加入铺好饲养层细胞的96孔细胞培养板的第1和第2列中，100μL/孔，第1列每孔100个细胞，第2列每孔10个细胞；10个细胞/mL加入第3-7列，100μL/孔，每孔1个细胞；5个细胞/mL加入第 8-12列中，100μL/孔，每孔0.5个细胞。置温度37℃、5％CO2细胞培养箱中培养4-5d，用倒置显微镜观察细胞形态，标记96孔细胞培养板中有细胞的孔及孔内集落个数，每孔补加150μL 新配置的HT培养液，继续培养4-5d后，再次观察细胞并标记单克隆细胞孔及孔内集落数，培养至第10-14d，待细胞克隆生长到孔底面积的50％时，即取上述标记过的杂交瘤细胞孔内的细胞上清进行抗体检测，如此连续克隆化3-4次，直至所有克隆化细胞孔内上清均为阳性时停止，获得了阳性杂交瘤细胞株Anti-XJEmSfAg-4D6；
i、杂交瘤细胞的扩大培养、冻存及复苏：
杂交瘤细胞的扩大培养：
将步骤h所获得的阳性细胞从96孔细胞培养板中取出放入到24孔细胞培养板中扩大培养，培养液采用DMEM完全培养液；
杂交瘤细胞的冻存：观察24孔培养板中扩大培养的单克隆杂交瘤细胞，当细胞长满孔底时，选择生长旺盛、形态良好、处于对数生长期的细胞，用DMEM基础培养液吹落孔底的细胞，2-3孔收集到离心管中，经1000rpm离心10min，弃上清，加入细胞冻存液制成细胞悬液，分装到冻存管里,标记细胞名称、时间，将冻存管放入细胞冻存盒内，置于-80℃冰箱，6h后转移至液氮中，其中所述细胞冻存液：胎牛血清:DMEM基础培养液:二甲基亚砜按5:4:1体积比混合均匀而成。
杂交瘤细胞的复苏：
冻存一个月后自液氮容器中取出一支Anti-XJEmSfAg-4D6细胞冻存管，迅速放入盛有温度37℃水的烧杯中，不停摇动使其迅速融化，移至超净工作台，无菌开启冻存管，将细胞液悬浮于DMEM基础培养液中，1000rpm离心5min弃上清，以5mL DMEM完全培养液重悬细胞沉淀，移入25cm2细胞培养瓶中，置温度37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，验证细胞是否复苏成功，同时检测其细胞上清，检测方法同步骤g，对照复苏前后分泌能力变化；
j、单克隆抗体的制备：
在接种分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞前一周，选择6-8周Balb/C雌性小鼠，给每只小鼠腹腔注射200μL弗氏不完全佐剂。将处于对数生长期且形态较好的杂交瘤细胞，用新鲜的 DMEM基础培养液吹打下来，1000rpm离心5min，弃上清，再用DMEM基础培养液重悬细胞，细胞计数，并将细胞数调至2×106个/mL或3×105个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL；腹水采集：植入细胞后第7d起，每天观察小鼠健康状况与腹部形态，待小鼠腹部有明显膨大，而小鼠濒临死亡之前，收集腹水，3000rpm离心10min，收集上清液，采集到的腹水于-20℃冻存，即得到抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体。
所述方法制备的抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株于2021年12月 21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：C2021167，分类命名：杂交瘤细胞株Anti-XJEmSfAg-4D6。
所述方法制备的抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体在终末宿主感染多房棘球绦虫 ELISA实验中制备检测试剂中的应用。
所述方法制备的抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体在终末宿主感染多房棘球绦虫免疫组化实验中制备检测试剂中的应用。
本发明所述的一种抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法及应用，其中建立的杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心。其保藏信息如下：保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心。保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。保藏日期：2021年12月21日。保藏编号：CCTCC NO：C2021167。分类命名：杂交瘤细胞株Anti-XJEmSfAg-4D6。
本发明所述的一种抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的制备方法及应用，其有益效果为：
本发明为临床和科研机构提供了抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原的特异性单克隆抗体，它既可用于双抗体夹心ELISA实验对终末宿主临床样品进行检测，也可用于免疫组化实验对病理标本进行检测，还可为包虫病研究部门提供便利的研究工具，在终末宿主感染多房棘球绦虫的检测中有广泛的应用价值，为泡型包虫病的基线调查和防控效果评估提供了技术支撑。
附图说明
图1为本发明获得的杂交瘤细胞株染色体分析，对所制备的杂交瘤细胞株在细胞分裂中期进行Giemsa染色，显示染色体。杂交瘤细胞Anti-XJEmSfAg-4D6平均染色体数为102对，表明细胞株为小鼠骨髓瘤细胞和脾细胞的融合体；
图2为本发明获得的杂交瘤细胞株抗体亚型鉴定，利用Pierce Rapid IsotypingKit with Kappa and Lambda-Mouse试剂盒(Sigma公司)进行单克隆抗体细胞株抗体亚型的鉴定，杂交瘤细胞株Anti-XJEmSfAg-4D6抗体亚型为IgG1，轻链为Kappa链；
图3为本发明制备的抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体腹水效价检测，将杂交瘤细胞Anti-XJEmSfAg-4D6接种Balb/C鼠，获得的腹水经ELISA检测，其腹水效价可达1:640000；
图4为本发明中多房棘球绦虫成虫表膜抗原及其他相关虫体抗原的SDS-PAGE鉴定，其中M：蛋白分子质量标准；1为多房细粒棘球绦虫成虫表膜抗原；2为细粒棘球绦虫成虫表膜抗原；3为多头绦虫虫体抗原；4为泡状带绦虫虫体抗原，5为犬弓首蛔虫虫体抗原，6为复孔绦虫虫体抗原；
图5为本发明制备的单克隆抗体ELISA检测结果，制备的单克隆抗体与多房棘球绦虫成虫表膜抗原及其他相关虫体抗原反应的ELISA检测，1-6为杂交瘤细胞Anti-XJEmSfAg-4D6 分泌的单克隆抗体与上述抗原反应的ELISA结果；7为SP2/0细胞上清与EmSfAg反应的ELISA 结果；8为PBS与EmSfAg反应的ELISA结果；其中1、7和8列包被不同浓度多房棘球绦虫成虫表膜抗原；2列包被不同浓度细粒棘球绦虫成虫表膜抗原；3列包被不同浓度多头绦虫虫体抗原；4列包被不同浓度泡状带绦虫虫体抗原；5列包被不同浓度犬弓首蛔虫虫体抗原；6 列包被不同浓度复孔绦虫虫体抗原；
图6为本发明制备的单克隆抗体Western blotting鉴定，杂交瘤细胞株Anti-XJEmSfAg-4D6 分泌的单克隆抗体与多房棘球绦虫成虫表膜抗原及其他相关虫体抗原反应的Western blotting 鉴定，其中M为蛋白分子质量标准；1为多房棘球绦虫成虫表膜抗原；2为细粒棘球绦虫成虫表膜抗原；3为多头绦虫虫体抗原；4为泡状带绦虫虫体抗原，5为犬弓首蛔虫虫体抗原，6为复孔绦虫虫体抗原；
图7为本发明中免疫组化抗体定位，利用上述单克隆抗体细胞上清原液进行免疫组化试验，其中A为单克隆抗体Anti-EmSfAg-4D6与多房棘球绦虫成虫反应呈棕色(40×)；B为SP2/0 与多房棘球绦虫成虫反应不着色(蓝紫色)(40×)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
本发明通过杂交瘤技术采用Balb/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合建立杂交瘤细胞株，由多房棘球绦虫成虫表膜抗原免疫刺激后的Balb/C小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0细胞融合形成的鼠-鼠杂交瘤细胞，能在体外长期生长和稳定传代，能稳定分泌抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原的特异性单克隆抗体，其染色体数目及抗体亚型见图1和图2。
本发明由上述细胞株通过体外培养法、动物体内诱生腹水法制备单克隆抗体；单克隆抗体细胞株Anti-XJEmSfAg-4D6腹水效价可达1:640000(见图3)；通过SDS-PAGE、ELISA和 Western blotting鉴定，表明单克隆抗体细胞株Anti-XJEmSfAg-4D6产生的抗体具有较强的特异性(见图4、5、6)。
本发明制备了多房棘球绦虫成虫免疫组化试剂盒，利用单克隆抗体细胞上清进行免疫组化试验，单克隆抗体Anti-EmSfAg-4D6细胞上清与多房棘球绦虫成虫反应呈棕色，SP2/0与多房棘球绦虫成虫反应不着色(蓝紫色)(见图7)，说明本单克隆抗体具有较强的特异性。
实施例1
建立细胞株：
抗原制备：
材料：感染多房棘球蚴包囊的老鼠，10-12月龄、体重8-10公斤的健康Beagle犬(购自常州贝乐实验动物养殖有限公司)，50mL离心管，1.5mL离心管，磷酸盐缓冲液(PBS：8g 氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，蒸馏水加至800mL，用1M HCL 调pH至7.2，加水到1000mL)，1％曲拉通X-100(Triton X-100，PBS配制)，台式离心机(Eppendorf)。
步骤：将感染多房棘球蚴包囊的老鼠安乐死，75％酒精消毒3min，移入生物安全柜中，将其腹部朝上，固定于解剖板上。用无菌剪刀和镊子剪开腹部皮肤和腹膜，打开腹腔，将包囊取出，用剪刀剔除周围的结缔组织，剪碎包囊，并用双层无菌医用纱布进行过滤，收集原头蚴，计数，取15-20万枚原头蚴经口服人工感染犬，25天后剖检犬，收集多房棘球绦虫成虫，取 1mL成虫装入5mL离心管中，加入等体积的1％Triton X-100，室温轻轻摇晃7-10次，3500rpm/min，温度4℃离心10min，收集上清，即为提取的多房棘球绦虫成虫表膜抗原(EmSfAg)，用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo公司)测定所获上清蛋白浓度；
免疫小鼠：
材料：试验1所准备的多房棘球绦虫成虫表膜抗原，选择与所用骨髓瘤细胞同源的6-8周龄Balb/C健康雌性小鼠(购自新疆实验动物中心)，弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(Sigma 公司)；
步骤：将多房棘球绦虫成虫表膜抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀，超声乳化，小鼠颈背部皮下进行多点注射，免疫剂量：0.1mg/mL，进行首免；分别在14d和28d，用弗氏不完全佐剂乳化抗原(免疫部位和方法同首免)进行二免和三免，免疫剂量：0.05mg/mL，分别在25d和 38d小鼠尾静脉采血，分离血清，用间接ELISA方法进行抗体水平检测，效价达1:80000以上的Balb/C鼠融合前三天腹腔注射0.1mg抗原进行加强免疫；
饲养层细胞的制备：
材料：Balb/C小鼠1只，高压灭菌的手术器械，超净工作台，96孔细胞培养板，DMEM基础培养液(Hyclone公司)，DMEM完全培养液：DMEM基础培养液40mL加入10mL胎牛血清、100×青霉素-链霉素、100×L-谷氨酰胺(Hyclone公司)，50×HAT储备液(Sigma公司)， HAT培养液：DMEM完全培养液49mL加入1mL 50×HAT储备液；
步骤：融合前1d选择一只品系相同健康的Balb/C鼠安乐死，75％酒精浸泡3min，随即放入生物安全柜中，腹部朝上固定于解剖板上；用无菌剪刀和镊子剪开腹部皮肤，经钝性剥离使腹膜充分暴露；用酒精棉球擦拭腹膜消毒，用5mL一次性注射器吸取DMEM基础培养液，注入小鼠腹腔，注射器停留不动，反复抽吸几次，用原注射器吸出腹腔内液体，注入15mL离心管中。1000rpm离心5min，弃上清，用HAT培养液将沉淀中的细胞重悬稀释至1×105个/mL，放入96孔细胞培养板中，100μL/孔，铺5块板，放置在温度37℃，5％CO2培养箱中备用，24h内密切观察细胞生长情况；
骨髓瘤细胞的准备：
材料：倒置显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司)，细胞计数器(上海医用光学仪器厂)，骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)，DMEM基础培养液，8-氮鸟嘌呤(Sigma公司)；
步骤：骨髓瘤细胞选取SP2/0细胞(本实验室液氮冻存)，融合前30d，进行SP2/0细胞的复苏，经过8-氮鸟嘌呤(Sigma公司)筛选，放入75cm2细胞培养瓶中扩大培养，试验时选取处于对数生长期、形态良好、活细胞计数超过95％的骨髓瘤细胞，将其完全吹下，转移到50mL 离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，再用DMEM基础培养液洗涤2次，加DMEM基础培养液至20mL计数，取2×107个细胞待用；
脾细胞制备：
材料：高压灭菌的手术器械，超净工作台，200目网筛，细胞计数器，75％酒精，DMEM基础培养液；
取上述加强免疫的Balb/C鼠安乐死，75％酒精消毒3min，移入生物安全柜中，固定于解剖板上，用无菌剪刀和镊子分别剪开皮肤和腹膜，无菌取出脾脏，放入已盛有DMEM基础培养液的无菌平皿中清洗，剥离被膜上的结缔组织，用温度37℃预热的DMEM基础培养液冲洗 1次，碾碎，过200目网筛，用10mL DMEM基础培养液冲洗网筛，制成细胞悬液后转移到50mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，细胞沉淀用DMEM基础培养液同法洗涤1次，用细胞计数器计数，取1×108个脾细胞，悬浮备用；
细胞融合：
材料：离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，滤纸，50mL离心管，5-10mLtip头， 1mL吸管，细胞计数器(上海医用光学仪器厂)，50％细胞融合剂聚乙二醇(PEG)1500(Sigma 公司)，DMEM基础培养液，DMEM完全培养液，HAT培养液；
步骤：将骨髓瘤细胞与脾细胞按细胞数比例1:5混合，在50mL离心管内用DMEM基础培养液洗1次，1200rpm离心8min，弃上清，用灭菌滤纸吸净残留液体，轻轻弹击离心管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状；将离心管置于温度37℃水浴中，90s内加入预热的1mL 50％聚乙二醇(PEG)，边加边轻晃离心管，静置1min，然后每隔2min分别加入1mL，2mL，3mL， 4mL，5mL和10mL预热的DMEM基础培养液，终止融合作用，边加边轻晃离心管，1000rpm 离心10min，弃上清，静置8min，加HAT培养液轻轻悬浮细胞，将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔细胞培养板中，100μL/孔，将培养板置于温度37℃、5％CO2培养箱中培养；
细胞克隆的观察和换液：
材料：倒置显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司)，HAT培养液，DMEM完全培养液，50×HT 储备液(Sigma公司)，HT培养液：49mL完全培养液加入1mL 50×HT储备液；
步骤：细胞融合后第3d开始，对细胞进行仔细观察，记录好细胞的生长状态、培养液有无污染、饲养细胞的状况，第5d开始更换培养液，采用半换液方式，每2-3天换1次HAT培养液，观察杂交瘤细胞是否出现；10d后，改用HT培养液，3次克隆后换DMEM完全培养液。
筛选分泌抗体的杂交瘤细胞：
在细胞融合后的第8d，按细胞克隆的步骤观察结果，将5块细胞培养板中含有克隆细胞生长的所有细胞孔用间接ELISA法检测杂交瘤细胞抗体产生的情况；
材料：1)1×磷酸盐缓冲液(PBS)：8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，蒸馏水加至800mL，用1M HCL调pH至7.2，加水到1000mL；2)封闭液(5％脱脂奶粉)：5g脱脂奶粉，1×磷酸盐缓冲液(PBS)加至80mL，充分溶解后，定容到100mL； 3)洗涤缓冲液：0.5mL吐温20(Tween 20)加入到1000mL 1×PBS中；4)底物显色A液： 1.46g磷酸氢二钠、0.933g柠檬酸、0.75％双氧水0.64mL、蒸馏水加至100mL；5)底物显色B 液：TMB(Sigma公司)20mg溶于10mL无水乙醇后加90mL水；6)底物显色反应液：底物显色A液，底物显色B液1:1混合；7)终止液(2M硫酸)取浓硫酸27.62mL，缓缓加入到 473mL的蒸馏水中，混匀即可；8)包被液(0.1M碳酸盐缓冲液)pH 9.6：碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93、蒸馏水加至1000mL；9)辣根过氧化物酶(HRP)标记的鸡抗小鼠IgG抗体(Abcam 公司)；10)酶标仪(TECAN公司)设定波长为450nm。
步骤：抗原包被：用包被液稀释EmSfAg至4μg/mL，96孔酶标板每孔加入100μL，温度4℃过夜，次日用洗涤缓冲液洗板3次，每次1min，拍干；
封闭：每孔加入200μL封闭液，温度37℃孵育1h，洗涤缓冲液洗板3次，每次1min，拍干；
加待测样品：无菌条件下取细胞培养板上生长成簇的杂交瘤细胞上清液加入到酶标板中，每孔加入100μL，SP2/0细胞上清液为阴性对照，温度37℃孵育1h，洗涤缓冲液洗板3次，每次1min，拍干；
加二抗：将鸡抗小鼠HRP-IgG抗体稀释10000倍，100μL/孔，温度37℃孵育1h，洗涤缓冲液洗板5次，每次1min，拍干；
显色：加入底物显色反应液，100μL/孔，避光温度37℃显色10-15min；
终止：加入终止液，50μL/孔；
读值：以450nm单波长测定各孔OD值；
判定：以阴性对照SP2/0细胞OD值的2.1倍作为阳性判定的临界点，与待测样品的OD 值进行比较，选取阳性孔中高OD值孔，对其所对应的细胞培养孔进行细胞的克隆化；
阳性杂交瘤细胞的克隆化(采用有限稀释法)：
材料：倒置显微镜，细胞计数器，DMEM基础培养液，HT培养液；
步骤：亚克隆前1d制备饲养细胞，将选定的强阳性单个细胞克隆孔中液体吸净，加入新鲜的DMEM基础培养液，反复吹打，将细胞液移至1.5mL离心管内，1000rpm离心5min，进行细胞计数，取四个平皿，用HT培养液进行稀释，使其浓度分别为1000个细胞/mL、100 个细胞/mL、10个细胞/mL和5个细胞/mL；将1000个细胞/mL和100个细胞/mL分别加入铺好饲养层细胞的96孔细胞培养板的第1和第2列中，100μL/孔，第1列每孔100个细胞，第 2列每孔10个细胞；10个细胞/mL加入第3-7列，100μL/孔，每孔1个细胞；5个细胞/mL加入第8-12列中，100μL/孔，每孔0.5个细胞。置温度37℃、5％CO2细胞培养箱中培养4-5d，用倒置显微镜观察细胞形态，标记96孔细胞培养板中有细胞的孔及孔内集落个数，每孔补加 150μL新鲜的HT培养液；继续培养4-5d后再次观察细胞并标记单克隆细胞孔及孔内集落数；培养至第10-14d，待细胞克隆生长到孔底面积的50％时，即可取上述标记过的杂交瘤细胞孔内的细胞上清进行抗体检测，检测方法同试验8。如此连续克隆化3-4次，直至所有克隆化细胞孔内上清均为阳性时停止，获得了阳性杂交瘤细胞株Anti-XJEmSfAg-4D6；
杂交瘤细胞的扩大培养：
材料：96孔细胞培养板，24孔细胞培养板，DMEM完全培养液；
将所获得的阳性细胞从96孔细胞培养板中取出放入到24孔细胞培养板中扩大培养，培养液采用DMEM完全培养液；
杂交瘤细胞的冻存：
材料：细胞冻存液：胎牛血清:DMEM基础培养液20mL:二甲基亚砜按体积比5:4:1混合均匀，温度-80℃冰箱(SIEMENS公司)，液氮，冻存管；
步骤：观察24孔培养板中扩大培养的单克隆杂交瘤细胞，当细胞长满孔底时，选择生长旺盛、形态良好、处于对数生长期的细胞，用DMEM基础培养液吹落孔底的细胞，2-3孔收集到离心管中，经1000rpm离心10min，弃上清，加入冻存液制成细胞悬液，分装到冻存管里，标记细胞名称、时间，将冻存管放入细胞冻存盒内，置于-80℃冰箱，6h后转移至液氮中；
杂交瘤细胞的复苏：
材料：25cm2细胞培养瓶，DMEM基础培养液，DMEM完全培养液；
冻存一个月后自液氮容器中取出一支Anti-XJEmSfAg-4D6细胞冻存管，迅速放入盛有温度37℃水的烧杯中，不停摇动使其迅速融化，移至超净工作台，无菌开启冻存管，将细胞悬液悬浮于DMEM基础培养液中，1000rpm离心5min弃上清，以5mL DMEM完全培养液重悬细胞沉淀，移入25cm2细胞培养瓶中，置温度37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，验证细胞是否复苏成功；同时检测其细胞上清，其方法同杂交瘤细胞的筛选，对照复苏前后分泌能力变化；
单克隆抗体的制备(腹水制备)：
材料：6-8周Balb/C雌性小鼠，弗氏不完全佐剂，细胞计数板，DMEM基础培养液；
步骤：在接种分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞前一周，给每只Balb/C小鼠腹腔注射200μL 弗氏不完全佐剂；将处于对数生长期且形态较好的杂交瘤细胞，用新鲜的DMEM基础培养液吹打下来，1000rpm离心5min，弃上清，再用DMEM基础培养液重悬细胞，细胞计数，并将细胞数调至2×106个/mL或3×105个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL；腹水采集：植入细胞后第 7d起，每天观察小鼠健康状况与腹部形态，待小鼠腹部有明显膨大，而小鼠濒临死亡之前，收集腹水，3000rpm离心10min，收集上清液，采集到的腹水于温度-20℃冻存，即得到抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体。
实施例2
杂交瘤细胞株抗体亚型测定：
材料：Pierce Rapid Isotyping Kit with Kappa and Lambda-Mouse试剂盒(Sigma公司)，1.5mL 离心管；
步骤：取450μL稀释液加入1.5mL高压灭菌过的离心管内，再取50μL细胞上清，混匀，取出Pierce Rapid Isotyping Kit with Kappa and Lambda-Mouse试剂盒中的测试板，每个板上滴加150μL稀释好的细胞上清，静置约10min即可。获得的杂交瘤细胞株Anti-XJEmSfAg-4D6 抗体亚型为IgG1，轻链为Kappa链。
实施例3
杂交瘤细胞株染色体核型分析：
材料：秋水仙素，甲醇，冰醋酸(天津永晟精细化工有限公司)，Giemsa染液，中性树胶 (北京鼎国昌盛生物技术有限公司)，载玻片，盖玻片，显微镜及成像系统(千欣仪器有限公司)；
步骤：在细胞对数生长期时向细胞培养瓶中加入秋水仙素，使终浓度为0.04μg/mL，继续培养14h，1000rpm离心10min，收集细胞，加入温度37℃的0.075mol/L的KCL溶液5mL，悬浮细胞，置温度37℃水浴作用30min，加入新鲜配制的固定液(体积比3:1的甲醛:冰醋酸) 1mL，混匀，1000rpm离心10min，弃上清；加入固定液5mL，重悬细胞，室温静置30min，1000rpm离心10min，弃上清，重复该步骤一次；加入固定液5mL，重悬细胞，密封管口，4℃过夜；次日1000rpm离心10min，轻轻吸去上清，视细胞的多少留下0.5-1mL固定液，重悬细胞；吸取细胞悬液，悬空约60cm左右滴在预先于温度-20℃冰箱冷冻的载玻片上，使其自然扩散，自然干燥；Giemsa染色原液按1:10稀释，染片20min；用自来水冲洗染片，自然干燥，中性树脂封片，烘干，于油镜下选择3个细胞形态完整、单个、染色体分散良好、无重叠的细胞进行观察和染色体计数，求平均染色体数量，并拍照保存；其中杂交瘤细胞株 Anti-XJEmSfAg-4D6平均染色体数为102对。
实施例4
杂交瘤细胞株的腹水效价检测：
材料：1)1×磷酸盐缓冲液(PBS)：8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾，蒸馏水加至800mL，用1M HCL调pH至7.2，加水到1000mL；2)封闭液(5％脱脂奶粉)：5g脱脂奶粉，1×磷酸盐缓冲液(PBS)加至80mL，充分溶解后，定容到100mL； 3)洗涤缓冲液：0.5mL吐温20(Tween 20)加入到1000mL 1×PBS中；4)底物显色A液： 1.46g磷酸氢二钠、0.933g柠檬酸、0.75％双氧水0.64mL、蒸馏水加至100mL；5)底物显色B 液：TMB(Sigma公司)20mg溶于10mL无水乙醇后加90mL水；6)底物显色反应液：底物显色A液，底物显色B液1:1混合；7)终止液(2M硫酸)取浓硫酸27.62mL，缓缓加入到 473mL的蒸馏水中，混匀即可；8)包被液(0.1M碳酸盐缓冲液)pH 9.6：碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93、蒸馏水加至1000mL；9)辣根过氧化物酶(HRP)标记的鸡抗小鼠IgG抗体(Abcam 公司)；10)酶标仪(TECAN公司)设定波长为450nm；
步骤：抗原包被：用包被液稀释EmSfAg至4μg/mL，96孔酶标板每孔加入100μL，温度4℃过夜，次日用洗涤缓冲液洗板3次，每次1min，拍干；封闭：每孔加入200μL封闭液，温度37℃孵育1h，洗涤缓冲液洗板3次，每次1min，拍干；加待测样品：将收集到的腹水按1:20000、1:40000、1:80000、1:160000、1:320000、1:640000、1:1280000、1:2560000梯度稀释，SP2/0细胞腹水为阴性对照，按照同样梯度进行稀释，每个梯度各100μL分别加入反应孔中，平行测定两次，温度37℃温箱1h，洗涤缓冲液洗3次，每次1min，拍干；加二抗：将鸡抗小鼠 HRP-IgG抗体稀释10000倍，100μL/孔，温度37℃孵育1h，洗涤缓冲液洗板5次，每次1min，拍干；显色：加入底物显色反应液，100μL/孔，室温避光显色10-15min；终止：加入终止液， 50μL/孔；读值：以450nm单波长测定各孔OD值；判定：抗体梯度OD450值与SP2/0细胞腹水OD450值相比在2倍以上，腹水效价成立，即腹水稀释到该梯度时，此稀释梯度有效。结果显示，杂交瘤细胞株Anti-XJEmSfAg-4D6腹水效价可达1:640000。
实施例5
酶联免疫吸附实验(ELISA)检测杂交瘤细胞株：
材料：多房棘球绦虫成虫表膜抗原，细粒棘球绦虫成虫表膜抗原，多头绦虫虫体抗原，泡状带绦虫虫体抗原，犬弓首蛔虫虫体抗原，复孔绦虫虫体抗原，辣根过氧化物酶(HRP)标记的鸡抗小鼠IgG抗体，TMB(Sigma公司)，酶标仪(TECAN公司)设定波长为450nm；
步骤：抗原包被：多房棘球绦虫成虫表膜抗原、细粒棘球绦虫成虫表膜抗原、多头绦虫虫体抗原、泡状带绦虫虫体抗原、犬弓首蛔虫虫体抗原、复孔绦虫虫体抗原按照40μg/mL、 20μg/mL、10μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL等不同浓度进行包被，每孔加入100μL，温度4℃过夜，次日用洗涤缓冲液洗板3次，每次1min，拍干；封闭：每孔加入200μL封闭液，温度37℃孵育1h，洗涤缓冲液洗板3次，每次1min，拍干；加待测样品：检测Anti-XJEmSfAg-4D6细胞上清，SP2/0细胞上清和PBS为阴性对照，分别加入反应孔中，每孔100μL，温度37℃孵育1h，洗涤缓冲液洗3次，每次1min，拍干；加二抗：将辣根过氧化物酶(HRP)标记的鸡抗小鼠IgG抗体稀释10000倍，100μL/孔，温度37℃孵育1h，洗涤缓冲液洗板5次，每次1min，拍干；显色：加入底物显色反应液，100μL/孔，室温避光显色 10-15min；终止：加入终止液，50μL/孔；读值：以450nm单波长测定各孔OD值；结果显示， Anti-XJEmSfAg-4D6细胞抗体与多房棘球绦虫成虫表膜抗原反应(呈黄色)，与其他虫体不反应(呈透明)，阴性对照SP2/0细胞上清和PBS均不反应(呈透明)。
实施例6
免疫印迹实验(Western blotting)检测杂交瘤细胞株：
材料：多房棘球绦虫成虫表膜抗原，细粒棘球绦虫成虫表膜抗原，多头绦虫虫体抗原，泡状带绦虫虫体抗原，犬弓首蛔虫虫体抗原，复孔绦虫虫体抗原，辣根过氧化物酶(HRP)标记的鸡抗小鼠IgG抗体，4-氯-1-萘酚，封闭液，洗涤缓冲液；
将多房棘球绦虫成虫表膜抗原、细粒棘球绦虫成虫表膜抗原、多头绦虫虫体抗原、泡状带绦虫虫体抗原、犬弓首蛔虫虫体抗原、复孔绦虫虫体抗原进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测；转入NC膜；封闭：加入40mL封闭液到装有NC膜的平皿中，温度4℃孵育过夜，次日用洗涤缓冲液洗膜3次，每次5min；加一抗：将单克隆抗体细胞株Anti-XJEmSfAg-4D6培养上清加入装有NC膜的平皿中，温度37℃孵育1h，洗涤缓冲液洗膜 3次，每次5min；加二抗：将鸡抗小鼠HRP-IgG抗体稀释500倍加入平皿中，温度37℃孵育 1h，洗涤缓冲液洗膜5次，每次5min；显色：加入4-氯-1-萘酚避光显色，出现条带即用蒸馏水终止反应；结果：杂交瘤细胞株Anti-XJEmSfAg-4D6单克隆抗体与多房棘球绦虫成虫表膜抗原反应(特异性条带)，与其他虫体抗原不反应(无反应条带)。
实施例7
免疫组化实验检测杂交瘤细胞株：
材料：单克隆抗体细胞上清，SP2/0细胞上清，多房棘球绦虫成虫，3％过氧化氢，0.01M 枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)，0.01M PBS缓冲液(pH7.2)，10％山羊血清封闭液，免疫组化湿盒，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG，DAB显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司)；
步骤：将多房棘球绦虫成虫经4％多聚甲醛固定12h后，蒸馏水清洗过夜，次日用3％琼脂预包埋，梯度脱水、透明后，进行常规石蜡包埋、切片，切片厚度为4μm。而后切片经脱蜡，梯度脱水；3％过氧化氢室温10min灭活内源性酶；蒸馏水洗3次，5min/次，将切片浸入0.01M 枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)，微波炉加热至沸腾，持续15min进行抗原修复；室温下冷却后用 PBS(pH7.2)洗3次，5min/次，滴加10％山羊血清封闭液，室温孵育1h进行封闭；PBS洗3次，5min/次；滴加细胞上清(单克隆抗体)原液，放入湿盒，温度4℃孵育过夜，次日PBS 洗3次，5min/次，滴加山羊抗小鼠HRP-IgG，室温孵育1h，PBS洗3次，5min/次，用DAB 显色试剂盒进行显色：取试剂盒中A试剂1mL加B试剂1滴，混匀后加至切片，室温显色，镜下控制反应时间，在5-10min之间；苏木素轻度复染；脱水，透明，封片；显微镜观察，杂交瘤细胞株Anti-XJEmSfAg-4D6单克隆抗体与多房棘球绦虫成虫反应呈棕色，SP2/0细胞上清与多房棘球绦虫成虫反应不着色(蓝紫色)，说明本发明具有很强的特异性和敏感性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于该杂交瘤细胞株Anti-XJEmSfAg-4D6抗体亚型为IgG1，于2021年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：C2021167，分类命名：杂交瘤细胞株Anti-XJEmSfAg-4D6。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体在终末宿主感染多房棘球绦虫ELISA实验中制备检测试剂中的应用。
3.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的抗多房棘球绦虫成虫表膜抗原单克隆抗体在终末宿主感染多房棘球绦虫免疫组化实验中制备检测试剂中的应用。
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CN111269890A (zh) * 2020-03-25 2020-06-12 新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心） 抗包虫病抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株和抗包虫病抗原单克隆抗体及其应用
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多房棘球绦虫葡萄糖转运蛋白1重组抗原肽构建及原核表达方法建立;华国勇等;中国高原医学与生物学杂志;113-119页 *

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