CN105021824A

CN105021824A - 用于定量检测生物医药制品中残留cho宿主细胞蛋白的elisa试剂盒及其使用方法

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Publication number: CN105021824A
Application number: CN201510390711.9A
Authority: CN
Inventors: 谈竺; 鲍晓光
Original assignee: YOUZRE BIOTECH Co Ltd
Current assignee: YOUZRE BIOTECH Co Ltd
Priority date: 2015-07-06
Filing date: 2015-07-06
Publication date: 2015-11-04

Abstract

本发明公开了用于定量检测生物医药制品中残留CHO宿主细胞蛋白的ELISA试剂盒及其使用方法，该ELISA试剂盒包括：包被有Goat？anti？CHO？HCP抗体的ELISA微孔板、CHO？HCP抗原液、羊抗CHO？HCP辣根过氧化酶标记的抗体贮存液、ELISA专用洗液100倍浓缩液、ELISA专用稀释液、ELISA显色底物A液和B液、终止液。使用ELISA试剂盒定量检测生物医药制品中残留CHO宿主细胞蛋白的方法参见说明书。本发明利用含有特异性的CHO？HCP抗体的ELISA试剂盒来定量检测生物医药制品中残留的CHO？HCP蛋白，检测时间短，检测效率高，能够同时对多个样本进行检测，检测灵敏度高(能达到0.3ng/ml)，无需使用昂贵的实验设备，检测成本低。

Description

用于定量检测生物医药制品中残留CHO宿主细胞蛋白的ELISA试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及用于定量检测生物医药制品中残留CHO宿主细胞蛋白的ELISA试剂盒及其使用方法。

背景技术

分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。全世界批准正式应用于人类疾病治疗或疾病预防的基因工程产品约有三十多种，其中只有一种(乙肝疫苗)是由酵母菌生产的，其余所有产品都是由CHO细胞和大肠杆菌生产的，大肠杆菌不能形成有活性的二聚体(如白介素2)，也不具有糖基化的功能(如EPO)，而CHO却具有如上的功能，因此CHO成为表达复杂生物大分子的理想宿主。另外CHO细胞在基因工程使用中还有一个优点，该细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利。

虽然，CHO分泌的内源蛋白很少但是依然会有少量蛋白残留在生物制品的半成品或成品中。人们将由CHO细胞产生或编码的，但与重组蛋白无关的一类蛋白质残留物称作宿主细胞蛋白(Host Cell Protein，HCP)。使用遗传修饰过的CHO细胞系来生产蛋白药物的企业都会受到生产过程相关的杂质的污染。CHOHCP可能会存在于生产过程的每一个环节。常规的分析方法可以较好的对生物医药产品进行精确的定量。但是对于产品或半成品中残留的HCP即宿主细胞蛋白来说，即使经过多道纯化工艺，依然会有残留。作为药物使用的蛋白制剂，安全是第一位的。残留在成品中的CHO HCP可能会引起免疫应答，甚至给病人带来病理反应。同时残留的HCP也有可能会降低蛋白药物的效果。因此，生物医药企业在质控环节必须对生产的半成品或成品的HCP进行定量测定。

目前，用于HCP测定的方法主要有：SDS-PAGE(银染)，HPLC(高效液相色谱)，Western Blot以及Immunoassay。这四种方法各有优略。SDS-PAGE可以检测到100pg/band的HCP含量，灵敏度较高，但是主观性较强，仅能进行定性的检测，操作繁琐复杂，且容易受到实验条件的限制。HPLC分辨率高，能进行定量检测，但是其灵敏度低，缺乏特异性。Western Blot仅能对残留的HCP进行定性测定，有时甚至不能检测到特异性的HCP。Immunoassay可以检测到1ng/ml以下的HCP，能对生物医药半成品或成品进行半定量分析，且可以实现高通量检测。

对于生物医药制品中HCP的检测，2010版《中国药典》规定的检测方法是双抗夹心ELISA法。截至目前，《中国药典》仅对残留的大肠杆菌和Vero细胞HCP有明确的规定检测方法，对CHO细胞残留的宿主细胞的检测没有明文的规定。中华人民共和国境内也没有相关专利的报道。因此，开发CHO HCP的检测既能填补该领域的空白，也能为以后制定检测CHO HCP的行业标准方法奠定基础。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种用于定量检测生物医药制品中残留CHO宿主细胞蛋白的ELISA试剂盒及其使用方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

用于定量检测生物医药制品中残留CHO宿主细胞蛋白的ELISA试剂盒,其特征在于，该ELISA试剂盒包括：

包被有Goat anti CHO HCP抗体的ELISA微孔板；

CHO HCP抗原液；

羊抗CHO HCP辣根过氧化酶标记的抗体贮存液；

ELISA专用洗液100倍浓缩液；

ELISA专用稀释液；

ELISA显色底物A液和B液；

终止液。

所述CHO HCP抗原液是由CHO-S，CHO-K1和CHO-DHFR三类CHO细胞的HCP组成。

使用ELISA试剂盒定量检测生物医药制品中残留CHO宿主细胞蛋白的方法，其包括如下步骤：

步骤一，向包被有羊抗CHO HCP抗体的平底微孔板加入CHO HCP抗原的样本溶液，并洗涤；

步骤二，向洗涤后的酶标板中加入HRP抗CHO HCP抗体溶液，再次洗涤；

步骤三，向再次洗涤后的酶标板中加入显色剂显色，然后加入终止液反应，测定450mm下的吸光度制；

步骤四，根据标准曲线得到所述样本溶液中CHO HCP抗原的含量。

其中，羊抗CHO HCP抗体溶液的浓度为0.5-2mg/L。

其中，样本溶液中CHO HCP抗原的浓度为0-400g/L。

其中，羊HRP抗CHO HCP抗体溶液的浓度为0.05-1.0mg/L。

本发明首先制备CHO HCP蛋白，蛋白电泳后，确认蛋白条带与预期的一致，然后用HCP蛋白免疫山羊，制备多克隆抗体。用ELISA的方法对CHO HCP进行检测，条件优化完毕后，用一系列蛋白样本进行验证检测。最后本发明提供了一种定量检测生物医药制品中残留的CHO HCP蛋白的方法及ELISA检测试剂盒。

本发明具有如下有益效果：

本发明利用含有特异性的CHO HCP抗体的ELISA试剂盒来定量检测生物医药制品中残留的CHO HCP蛋白，检测时间短，检测效率高，能够同时对多个样本进行检测，检测灵敏度高(能达到0.3ng/ml)，无需使用昂贵的实验设备，检测成本低。

附图说明

图1为CHO HCP ELISA标准曲线。

图2为CHO HCP蛋白凝胶电泳图。

图3为实施例1中CHO HCP ELISA标准曲线。

图4为实施例2中CHO HCP ELISA标准曲线。

图5为实施例3中CHO HCP ELISA试剂盒标准曲线。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

在图1，图3-5中，横坐标是CHO HCP标准品浓度，纵坐标是吸光度OD值。

用于定量检测生物医药制品中残留CHO宿主细胞蛋白的ELISA试剂盒,其包括：包被有Goat anti CHO HCP抗体的ELISA微孔板、CHO HCP抗原液、羊抗CHO HCP辣根过氧化酶标记的抗体贮存液、ELISA专用洗液100倍浓缩液、ELISA专用稀释液、ELISA显色底物A液和B液、终止液。

其中，CHO HCP抗原的制备方法包括如下步骤：

1. CHO细胞培养：

1.1 CHO的复苏

⑴预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

⑵取保存的安倍瓶迅速加入37度水浴锅中，不断摇动，保证1min内解冻。

⑶在超净台中加入37度预热的CHO无血清无蛋白培养基9mL至离心管中，同时加入细胞冷冻液，800rpm离心5min。

⑷弃上清，加入37度预热的CHO无血清无蛋白培养基，放入细胞培养板中36.5℃5％二氧化碳培养箱中过夜。

⑸第二天进行换液。

1.2细胞的冻存

⑴取出培养瓶，用移液枪将瓶中旧培养基吹打，吸至离心管内。1000rpm*10min离心，离心后弃上清，加入新鲜培养基吹散沉淀。

⑵取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。

⑶取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色。计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。

⑷计数板计数，用新鲜完全培养基调节细胞浓度为5-10×106胞/ml。再离心，弃上清。用预冷的冻存液重悬细胞，每个冻存管内加入1ml重悬细胞液。放4°冰箱5min，放-20°30min，再放-80°过夜。

⑸第二天将细胞置于液氮中。

1.3细胞的扩大培养

⑴用移液器将细胞培养板中旧培养基吹打，吸至离心管内。800rpm*5min离心，离心后弃上清，加入新鲜培养基吹散沉淀。加入一次性细胞培养瓶中，放入36.5℃5％二氧化碳培养箱中震荡培养两天。

⑵CHO细胞培养震荡两天后，用移液器将细胞吹匀吸入离心管中，800rpm*5min离心，离心后收集上清，沉淀中加入新的培养基将CHO细胞重悬，按照1:2的比例传代细胞培养。

2.蛋白提取

2.1 CHO HCP提取

⑴收集细胞扩大培养中离心后的上清，将收集的上清通过0.8um的滤膜过滤。

⑵收集的滤液，吸入浓缩超滤离心管中(3K)，4℃，10000rpm离心，30min。收集浓缩液。

2.2蛋白浓度的检测

⑴标准曲线的绘制，将标准品稀释成100ug，200ug，400ug，600ug，800ug，1000ug的稀释样本，稀释的样本加上空白对照与考马斯亮蓝染色1：5比例混合，充分混合后，室温下反应3-5min，595nm波长下检测。绘制标准曲线。

将标准品按照以下倍数稀释1，10，50，100，500，1000倍稀释，或是按照紫外法检测的结果将待测产品稀释至1mg/mL，与考马斯亮蓝染色1：5混合，充分混合后室温下反应3-5min，595nm波长下读值。

2.3 SDS-PAGE检测

⑴配置10％的分离胶10min倒入玻璃电泳板间，立即覆盖一层蒸馏水。放置30min。

⑵待分离胶凝固之后配置5％的浓缩胶4mL，混匀。

⑶倒去玻璃板中的蒸馏水，并用滤纸吸干，灌入分离胶，插上梳子。

⑷拔掉梳子，在样本中加入电泳缓冲液，混匀。上样20ul，连接电源，稳压180v，跑胶，待溴酚蓝染料刚跑出分离胶时，停止电泳。取下胶板，标记凝胶，并取出凝胶。

⑸将剥离的凝胶放入染色液中，染色1-2h。

⑹加入脱染剂,置于80rpm摇床上脱色,每小时更换一次脱色液,至完全脱色.凝胶成像,并记录。

(7)凝胶成像结果见图2，该图左侧为蛋白Marker，中间为BSA阳性对照，右侧为CHO HCP蛋白。

其中，羊抗CHO HCP抗体的制备方法(含以下步骤)：

1.免疫原制备

用CHO细胞宿主蛋白进行BCA法定量样品，进行SDS-PAGE和考染，确认样品的条带分子量和含量分布。

2.制备针对免疫原蛋白的羊多抗

(1)抽取免疫前血清，每只羊5ml；

(2)使用宿主蛋白免疫山羊，共2只。初步免疫后进行加强若干次。

(3)①在免疫后的第25天取血，用WB&ELISA法检测免疫效果(WB:每张膜上样200ug宿主蛋白；ELISA：每孔1ug宿主蛋白)。

②然后加强免疫，48天取大血，WB&ELISA检测免疫效果。

ELISA检测试剂盒

本发明的ELISA检测试剂盒的组成如下表1所示：

表1 CHO HCP ELISA检测试剂盒组成

以下对ELISA检测试剂盒的组成作进一步的说明。

1.预包被平底微孔板

平底微孔板为可拆卸高结合的12条96孔透明微孔板，购自Corning。

平底微孔板中包被有羊抗CHO HCP抗体的包被方法如下：

a.用包被缓冲液将包被抗体(羊抗CHO HCP抗体)稀释到工作浓度(1:1000倍稀释)，加入到平底微孔板中，每孔100μl，放入湿盒，4℃孵育过夜，用洗涤液洗涤，拍干；

b.平底微孔板每孔加入480μl封闭液，37℃封闭2h，用洗涤缓冲液洗涤，拍干；

c.向平底微孔板中加入工作浓度的包被抗体溶液，每孔100μl，37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液洗涤，拍干，即得包被有羊抗CHO HCP抗体的平底微孔板。

其中，在步骤a中，包被缓冲液为pH＝9.6，浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液，其制备方法如下：将1.59g的Na2CO3和2.93g的NaHCO3加双蒸水定容至1L，高压灭菌备用。

在步骤b中，封闭液为0.05％-0.5％的牛血清白蛋白溶液，其制备方法如下：称取0.5-5g牛血清白蛋白溶解在1LpH＝7.4浓度为0.15M的磷酸盐缓冲液(PBS)中。

pH＝7.4浓度为0.15M的磷酸盐缓冲液的制备方法如下：称取0.2g KH2PO4、2.9g Na2HPO4·12H2O、8.0g NaCl和0.2g KCl加双蒸水定容至1000ml，高压灭菌后，贮存于4℃冰箱保存。

2.标准品

标准品为CHO HCP蛋白，浓度分别是400ng/ml,200ng/ml,50ng/ml,12.5ng/ml,6.25ng/ml,0.8ng/ml,0.4ng/ml，0ng/ml。

3.稀释液：2％BSA+0.1％Tween 20用0.15M PBS溶解(或者封闭液中加入0.1％Tween20)。所有配制好的溶液高压灭菌后，贮存于4℃冰箱保存。

4.洗涤液(100倍浓缩)。

5.酶结合物(HRP)：为HRP标记的CHO HCP抗体。

6.显色剂：包括显色剂A和显色剂B。显色剂A是H2O2，显色剂B是TMB。

7.终止液：为H2SO4溶液。

8.阳性对照：为一定浓度的CHO HCP蛋白。

9.阴性对照：不含有CHO HCP蛋白的稀释液。

以下对利用上述ELISA检测试剂盒定量检测生物医药制品中残余的CHO HCP蛋白的方法作进一步的说明。该方法包括如下步骤：

(1)向包被有羊抗CHO HCP抗体的平底微孔板中加入含有CHO HCP抗原的样本溶液，并洗涤；

(2)向洗涤后的平底微孔板中加入羊HRP抗CHO HCP抗体溶液，于37℃下孵育,洗涤，拍干；

(3)向洗涤后的平底微孔板中每孔加入显色剂A和显色剂B，避光显色，加入终止液终止反应，测定吸光度值；

(4)根据标准曲线得到所述样本溶液中所述CHO HCP抗原的含量。

其中，在步骤(2)中，羊HRP抗CHO HCP抗体溶液的工作浓度为1:40000倍稀释。

在步骤(4)中，标准曲线的绘制方法如下：

4.1确定包被抗体及检测抗体的浓度

包被抗体及检测抗体的工作浓度是ELISA试剂盒一个重要的参数，为了摸索合适的包被抗体及检测抗体浓度，通过棋盘法来确定检测抗体及包被抗体的最适工作浓度。

具体操作步骤如下：

(1)包被：用包被缓冲液分别按1：10000，1：5000，1：1500，1：1000的稀释比例稀释羊抗CHO HCP抗体，每孔加入100μl,将微孔板放入湿盒中，4℃，孵育过夜；

(2)封闭：每孔加入480μl封闭液，37℃封闭2h，用洗涤缓冲液洗涤4次，拍干；

(3)加入标准品：向平底微孔板中加入100ng/ml及0ng/ml的CHO HCP蛋白溶液，每孔100μl，均做三个复孔。37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液4次，拍干；

(4)加入检测抗体：向微孔板中加入不同工作浓度的羊抗CHO HCP酶标检测抗体，每孔100μl,均做三个复孔。37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液4次，拍干；

(5)显色：向微孔板中加入显色底物A液和显色底物B液各50μl，37℃避光显色10-15min；

(6)终止：每孔加入50μl终止液，终止反应；

(7)读数：450nm下，利用ELX800酶标仪读取吸光度值。

本次实验共重复三次，结果如表2所示(表中所有OD均为三次实验的平均OD)。

首先在保证检测抗体浓度(1：10000稀释)不变的情况下，包被4种不同工作浓度的羊抗CHO HCP抗体，经ELISA检测发现将包被抗体稀释1000倍，检测抗体稀释5000倍(结果详见表2)，不同浓度的标准品OD具有梯度关系，且相互之间的OD有较大的差异，符合建立曲线的初步条件，因此确定包被浓度为2μg/ml。但同时，实验结果也表明，此反应条件下，空白孔的OD值达到0.25以上，略微偏高。鉴于此，需进一步对检测抗体浓度进行优化。

研究表明ELISA空白孔反应值与检测抗体的浓度有很大的关系，且一般呈正相关。为了降低空白孔的反应值，本实验设置三种不同稀释倍数的检测抗体，结果表明，当对检测抗体稀释40000倍时，空白孔OD只有0.136，空白反应值较低，可以满足ELISA的实验要求。

表2 CHO HCP ELISA试剂盒包被浓度及检测抗体浓度摸索结果

综合分析以上实验结果，可以确定当包被抗体稀释1000倍,检测抗体稀释40000倍时，是最适宜的抗体浓度。

4.2确定标准品浓度的梯度

标准品浓度梯度的确定是获得较为理想的标准曲线的前提。根据上步所确定的包被抗体和检测抗体的工作浓度，本实验在保持包被抗体浓度和检测抗体浓度不变的前提下，设置8个不同浓度的标准品梯度：800ng/ml，400ng/ml,200ng/ml,50ng/ml,12.5ng/ml,6.25ng/ml,0.78ng/ml,0.39ng/ml及0ng/ml。每个浓度设置3个复孔并通过双抗夹心ELISA法确定最佳的标准品浓度梯度。具体操作步骤如下：

(1)包被：每个微孔加入100μl工作浓度的包被抗体稀释液,将微孔板放入湿盒中，4℃，孵育过夜；

(3)加入标准品：向微孔板中分别加入浓度为800ng/ml，400ng/ml,200ng/ml,50ng/ml,12.5ng/ml,6.25ng/ml,0.78ng/ml,0.39ng/ml，0ng/ml的CHO HCP溶液。每孔100μl，均做三个复孔。37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液4次，拍干；

(4)加入检测抗体：向微孔板中加入工作浓度的酶标检测抗体，每孔100μl。37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液4次，拍干；

(5)显色：向微孔板中加入显色底物A液和显色底物B液各50μl，避光显色10-15min；

(6)终止：每孔加入50μl终止液，终止反应；

(7)读数：450nm下，利用ELX800酶标仪读取吸光度值。

本次实验共重复三次。

根据上步所确定的包被抗体和检测抗体的工作浓度，本实验在保持包被抗体浓度和检测抗体浓度不变的前提下，设置不同浓度的标准品梯度，并通过双抗夹心ELISA法检测反应值，以确定最佳的标准品浓度梯度，实验结果如表3所示。本次实验每一个标准品浓度设置3个复孔，表中OD为平均值。

表3 CHO HCP梯度稀释检测结果

如上表所示，读板后发现在800ng/mL到0pg/mL的标准品浓度区间内最终OD值有很好的区分度，但是当浓度为800ng/ml时，OD值达到3.69，略微偏高。当浓度值为400ng/ml时，OD值2.876，且从400-0.78ng/ml OD具有梯度关系，区分度较好。另外，由于生物医药制品残留的HCP浓度不高，因此检测此类的试剂盒必须在标准品浓度较低的情况下，具有较高的检测灵敏度。据此推测本试剂盒标准品浓度在400ng/ml以下的区间范围，有可能得到可信度较高的标准曲线。

4.3确定标准曲线

通过前面的步骤，已经寻找到了最佳的包被浓度抗体浓度，和较为理想的标准品浓度梯度，绘制试剂盒的标准曲线的具体操作步骤如下：

(3)加入标准品：向微孔板中分别加入浓度为400ng/ml,200ng/ml,50ng/ml,12.5ng/ml,6.25ng/ml,0.8ng/ml,0.4ng/ml，0ng/ml的CHO HCP溶液。每孔100μl，均做三个复孔。37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液4次，拍干；

(4)加入检测抗体：向微孔板中加入工作浓度的检测抗体，每孔100μl。37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液4次，拍干；

(6)终止：每孔加入50μl终止液，终止反应；

(7)读数：450nm下，利用ELX800酶标仪读取吸光度值。

(8)利用统计分析软件绘制标准曲线。

本次实验共重复三次。

根据前两步确定的包被抗体和检测抗体的工作浓度，以及他们所能检测的标准品浓度范围，在保持包被抗体浓度和检测抗体浓度不变的前提下，设置七个不同浓度的标准品梯度。每个浓度作一个平行样，以尽可能减少实验操作误差的干扰。通过双抗夹心ELISA法检测反应值，并以此绘制标准曲线。绘制出的标准曲线如图1所示。

标准品浓度及对应的反应值如表4所示。

表4 CHO HCP标准曲线数据

由表数据，分析发现，数据具有明显的梯度，复孔之间差异很小，可以满足ELISA的实验需求。利用分析软件绘制标准曲线如图1所示。本试剂盒标准曲线R2值达到0.9987可信度较高。

以下对ELISA检测试剂盒的QC分析作进一步的说明。

1.线性分析

以本实验室纯化的CHO HCP作为样本，用ELISA稀释液按1：500，1：1000，1：2000，1：4000进行梯度稀释，每个稀释倍数设置3个复孔。利用双抗夹心ELISA计算各个稀释倍数下的样本浓度，以评估该试剂盒是否具有良好的线性。本次实验共重复三次。

利用本实验室纯化的CHO HCP作为检测样本，线性梯度稀释后，检测试剂盒线性情况，结果如表5所示。表中所有浓度均为3次试验的平均值。

表5 CHO HCP ELISA试剂盒线性分析结果

如上表所示，本试剂盒的线性范围为：100.29％—120.7％，可见其具有很好的线性。

2.回收率分析

以CHO HCP作为样本，利用CHO无血清细胞培养液稀释HCP，使其终浓度为200ng/ml。本次实验共重复三次，每次实验设置三个复孔。

ELISA检测后，根据本试剂盒所获得的标准曲线和样本的OD计算样本浓度，并与起始浓度200ng/ml比较，计算回收率。回收率计算方法如下：

回收率＝样本计算浓度/样本实际浓度x 100％。

利用CHO细胞培养基稀释CHO HCP，使其终浓度200ng/ml。ELISA检测后，根据本试剂盒所获得的标准曲线和样本的OD计算样本浓度和回收率结果如表6所示。本次实验共重复三次，表中OD为三次实验的平均值。

表6 CHO HCP ELISA试剂盒回收率分析结果

回收实验结果表明，回收率在75％-105％之间，平均值为94.42％，回收率较高。说明本试剂盒具有很好的准确度。

3.批内批间差分析

取2个批次的预包被微孔板，以CHO HCP作为样本，用双抗夹心ELISA法检测样本浓度，以计算同一样本在同一批次不同孔和不同批次间的差异，即评估本试剂盒的批内批间差(CV)。本实验共重复三次。批内批间差计算公式如下：

批内批间差＝SD/Mean x 100％，其中SD为标准差，Mean为浓度平均值。

选择两个不同浓度的样本，以两个不同批次(Lot.Y20141218和Lot.Y20141228)的包被了包被抗体的微孔板，检测样本CHO HCP浓度，并计算批内批间差，结果如表7a和表7b所示。

表7a CHO HCP ELISA试剂盒批内分析

表7b CHO HCP ELISA试剂盒批间分析

由表可知，本试剂盒批内差小于11.5％，批内差均小于4.2％，表明试剂盒精确度较高。

4.特异性分析

以纯化后的Vero、毕赤酵母和大肠杆菌的宿主细胞蛋白HCP作为检测样本，利用双抗夹心ELISA法检测交叉反应性，以评估本试剂盒的特异性。本实验共重复三次。

灵敏度是ELISA试剂盒的重要参数之一，只有具有较高的灵敏度才有可能符合生物医药制品QC过程中CHO HCP检测的要求。通过计算发现本试剂盒的灵敏度为0.31ng/mL。

5.灵敏度分析

取预包被微孔板，其中两条用于绘制标准曲线。其余20个微孔中加入ELISA稀释液，利用双抗夹心ELISA法计算本试剂盒的灵敏度。本实验共重复三次。灵敏度计算方法如下：

读取20个微孔的OD值，计算20个OD值的标准差和平均值。将OD平均值加上两倍的标准差，得到一个新的数值，代入到标准曲线的方程中，所计算出来的浓度即为本试剂盒的灵敏度。

分别取1533ng/mL的E.Coli HCP、1481.1ng/mL的vero HCP、1074.69ng/mL的毕赤酵母HCP各200μL，每孔100μl,加到包被并封闭好的试剂盒孔内。每个样本做一个复孔，进行夹心法ELISA实验，检测各待测样本与试剂盒的交叉反应程度，结果如表8所示(表中所有OD均为三次实验的平均值)。

表8 CHO HCP ELISA试剂盒特异性分析

实验结果表明Vero细胞、毕赤酵母大肠杆菌宿主细胞蛋白对ELISA反应的干扰程度非常小，与试剂盒之间基本无交叉反应。说明本试剂盒有很好的特异性，能特异性的与CHO宿主细胞蛋白蛋白反应，且不受上述细胞HCP的干扰。

以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1高浓度CHO宿主蛋白样本的检测

1.材料：

本实施例中的样本为CHO-S，CHO-K1和CHO-DHFR三类CHO细胞的宿主细胞蛋白混合物，制备方法同上。定量后，稀释到300ng/ml，作为待测样本用。

2.方法：

(3)加入标准品和样本：向微孔板中分别加入浓度为400ng/ml,200ng/ml,50ng/ml,12.5ng/ml,6.25ng/ml,0.8ng/ml,0.4ng/ml，0ng/ml的CHO HCP标准品溶液和待测样本溶液。每孔100μl，均做三个复孔。37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液4次，拍干；

(6)终止：每孔加入50μl终止液，终止反应；

(7)读数：450nm下，利用ELX800酶标仪读取吸光度值。

(8)利用统计分析软件绘制标准曲线。

3.结果

标准品OD值见表9：

表9 标准品浓度及OD值

样本三个复孔的OD平均值为2.637，CV值为4.82％。

标准曲线见图3。

二次曲线方程如下：

Y＝a X²+b X+c

a＝-0.000015329

b＝0.012746

c＝0.19028

R2＝0.99879

样本OD值代入方程后，计算出样本浓度为301ng/ml。

4.结论：

本实施例中，样本CHO HCP浓度很高，其基质成分复杂，对ELISA检测有较大的干扰。而生物制品中基质成分单一，因此本实施例用浓度很高的样本进行检测，准确性依然很高，证明了本ELISA检测试剂盒在检测高浓度CHO HCP蛋白方面的优势。

实施例2低浓度CHO宿主蛋白样本的检测

1.材料：

本实施例中的样本为CHO-S，CHO-K1和CHO-DHFR三类CHO细胞的宿主细胞蛋白混合物，制备方法同上。定量后，分别稀释到1ng/ml和10ng/ml，作为待测样本用。实施例1中样本浓度较高，本实施例中浓度很低，目的在于验证本方法在低浓度样本中的检测效能。

2.方法：

(3)加入标准品和样本：向微孔板中分别加入浓度为400ng/ml,200ng/ml,50ng/ml,12.5ng/ml,6.25ng/ml,0.8ng/ml,0.4ng/ml，0ng/ml的CHO HCP标准品溶液和两份待测样本溶液。每孔100μl，均做三个复孔。37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液4次，拍干；

(6)终止：每孔加入50μl终止液，终止反应；

(7)读数：450nm下，利用ELX800酶标仪读取吸光度值。

(8)利用统计分析软件绘制标准曲线。

3.结果

标准品OD值见表10：

表10 标准品浓度及OD值

样本三个复孔的OD平均值为0.1028和0.1604，CV值分别为5.23％和5.10％。

标准曲线如图4。

二次曲线方程如下：

Y＝a X²+b X+c

a＝-0.0000073936

b＝0.0067869

c＝0.092776

R^2＝0.99636

样本OD值代入方程后，计算出样本浓度为1.48ng/ml和10.07ng/ml。

4.结论：

本实施例中，样本CHO HCP浓度较低，与常规待测样本中的浓度类似，浓度为10ng/ml的样本准确性很高，检测结果是10.07ng/ml。浓度为1ng/ml的样本准确性较高，检测结果是1.48ng/ml。也基本与样本实际浓度吻合。因此本实施例用浓度很低的样本进行检测，准确性依然很高，证明了本ELISA检测试剂盒在检测高浓度CHO HCP蛋白方面的优势。

实施例3重组乙型肝炎疫苗生物制品样本的检测

1.材料：

本实施例中的样本为某河北制药公司生产的重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)，本样本是将编码乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的基因插入适当载体，重组到CHO细胞内，表达出HBsAg经纯化和添加佐剂制备出的疫苗。实施例1和2中的样本均为CHO细胞培养物，本实施例中的样本是真正的生物制品，本实施例的目的在于检测商品化生物制品中可能的残留的CHO HCP的量。

2.方法：

(3)加入标准品和样本：向微孔板中分别加入浓度为400ng/ml,200ng/ml,50ng/ml,12.5ng/ml,6.25ng/ml,0.8ng/ml,0.4ng/ml，0ng/ml的CHO HCP标准品溶液和三份待测样本溶液(待测样本分别为原液样本，1:5倍稀释和1:10倍稀释后的样本)。每孔100μl，均做三个复孔。37℃，孵育1.5h,用洗涤缓冲液4次，拍干；

(6)终止：每孔加入50μl终止液，终止反应；

(7)读数：450nm下，利用ELX800酶标仪读取吸光度值。

(8)利用统计分析软件绘制标准曲线。

3.结果

标准品OD值如下表11：

表11 标准品浓度及OD值

400 2.782 4.33

样本三个复孔的OD平均值为0.1514，0.1512和0.15117，CV值分别为2.20％，1.98％和3.51％。

标准曲线如图5所示，其中，

二次曲线方程如下：

Y＝a X²+b X+c

a＝-0.000015759

b＝0.012869

c＝0.15115

R2＝0.99770

样本OD值代入方程后，计算出样本浓度为0.0221ng/ml，0.0037ng/ml，和0.0019ng/ml。

4.结论：

本实施例中，样本是商品化的重组蛋白疫苗制品，对其进行5倍和10倍稀释后，然后进行检测。从检测结果中可以发现，原液的CHO HCP浓度已经很低，约为0.02ng/ml，而对样本进行稀释后，浓度更是低于了检测限，虽然重组蛋白疫苗制品，检测前浓度未知，本次检测得到的极低的浓度也从侧面证明了本生物制品中CHO HCP残留量极低。因此本实施例用实际的商品化样本进行检测，准确性依然很高，证明了本ELISA检测试剂盒在检测高浓度CHO HCP蛋白方面的优势。

以上所述仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限于上述实施方式，凡是属于本发明原理的技术方案均属于本发明的保护范围。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明的原理的前提下进行的若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.用于定量检测生物医药制品中残留CHO宿主细胞蛋白的ELISA试剂盒,其特征在于，该ELISA试剂盒包括：

包被有Goat anti CHO HCP抗体的ELISA微孔板；

CHO HCP抗原液；

羊抗CHO HCP辣根过氧化酶标记的抗体贮存液；

ELISA专用洗液100倍浓缩液；

ELISA专用稀释液；

ELISA显色底物A液和B液；

终止液。

2.根据权利要求1所述的用于定量检测生物医药制品中残留CHO宿主细胞蛋白的ELISA试剂盒,其特征在于，所述CHO HCP抗原液是由CHO-S，CHO-K1和CHO-DHFR三类CHO细胞的HCP组成。

3.一种使用如权利要求1或2所述的ELISA试剂盒定量检测生物医药制品中残留CHO宿主细胞蛋白的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，羊抗CHO HCP抗体溶液的浓度为0.5-2mg/L。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，样本溶液中CHO HCP抗原的浓度为0-400g/L。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，羊HRP抗CHO HCP抗体溶液的浓度为0.05-1.0mg/L。