CN105823891A - 一种定量检测人二倍体细胞残留蛋白的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种定量检测人二倍体细胞残留蛋白的试剂盒，本发明试剂盒以兔抗人二倍体细胞蛋白多克隆抗体为包被抗体，以豚鼠抗人二倍体细胞蛋白多克隆抗体为检测抗体，对生物制品中残留的人二倍体细胞进行ELISA检测。本发明的检测试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，能够同时对多个样本进行检测，灵敏度达到0.5ng/mL，且成本低廉，无需使用昂贵的实验设备，既可用于临床检测也可用于生物制品生产过程的质量控制，填补了我国目前检测人二倍体细胞残留蛋白的空白，具有良好的经济价值和应用前景。

Description

一种定量检测人二倍体细胞残留蛋白的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体地，涉及疫苗制品中残留蛋白的检测，更具体地，涉及生物制品中人二倍体细胞残留蛋白的检测方法及试剂盒。

背景技术

人二倍体细胞是最安全的细胞基质，具有很多优点：与原代细胞相比，不含有任何外源污染因子，可以建立细胞库，能从一个冻存在安瓿瓶的细胞种子培养扩大并保持良好的均一性。与无限传代细胞，比如vero细胞相比致瘤性以及致癌性的风险非常小。我国以及大部分发达国家通常将人二倍体细胞作为最常用的疫苗生产细胞基质。然而随着科学技术的提高以及人们对安全意识的提高，人二倍体细胞DNA的残留量也将会成为基于人二倍体细胞生产的精制疫苗的主要质量控制指标之一，也将会进行严格的纯化，保证其含量在比较低的水平。

生物制品中的宿主残留蛋白是指疫苗和基因工程药物中来源于宿主细胞的蛋白成分，既包括宿主细胞的结构蛋白也包括宿主细胞分泌的促生长因子。这些蛋白不仅有可能诱导机体产生抗体，引起过敏反应，还有可能有“佐剂效应”引起机体对药物本身产生抗体，影响治疗效果。因此，定量测定病毒性疫苗和基因工程药物中的宿主残留蛋白是质量控制的一种主要手段，有助于保持纯化工艺的有效性和一致性。

由于精制疫苗纯化工艺能够将蛋白残留量控制在比较低的水平，因此需要采用非常敏感的技术对残留的蛋白进行检测。而目前用于检测疫苗残留蛋白的方法主要是SDS-PAGE、HPLC、WesternBlot以及Immunoassay。其中SDS-PAGE可以检测到100pg/band的残留蛋白含量，灵敏度较高，但是主观性较强，仅能进行定性的检测，同时试验步骤较为复杂；HPLC的分辨度比较高，能进行定量检测，但是特异性较差，灵敏度较低；WesternBlot仅能进行定量试验，且操作繁琐，耗时耗力，误差较大；而Immunoassay可以检测到1ng/ml以下的残留蛋白，能对疫苗成品、半成品以及过程产品进行定量检测，同时可以实现高通量检测。

目前传代细胞的残留蛋白检测技术相对比较成熟，然而人二倍体细胞残留蛋白的检测技术尚属空白。随着国内科学技术的提高，病毒性疫苗和基因工程药物将会选择更加安全的细胞基质——人二倍体细胞。为了安全起见，人二倍体细胞残留蛋白的含量将会成为疫苗和药品生产的一个重要质量属性，然而中国药典至今没有明文规定人二倍体细胞残留蛋白的检测，我国也没有相关的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供用于定量检测残留人二倍体细胞残留蛋白的特异、灵敏、快速、简便的方法以及检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用Immunoassay的方法检测生物制品中的人二倍体细胞残留蛋白，本发明利用含有特异性的抗人二倍细胞蛋白多克隆抗体的ELISA试剂盒来定量检测疫苗中残留的人二倍体细胞蛋白，本发明的ELISA试剂盒，以豚鼠抗人二倍体细胞蛋白多克隆抗体为检测抗体。

进一步地，本发明的试剂盒以兔抗人二倍体细胞蛋白多克隆抗体为包被抗体。

所述检测抗体效价大于10⁵。

所述检测抗体其工作浓度为1：40000。

包被抗体效价大于10⁶。

包被抗体的工作浓度为1:1000。

本发明试剂盒的检测抗体用酶标记，所述酶选自辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、葡萄糖氧化酶、荧光素、生物素、胶体金离子、碱性磷酸酶中的一种。

本发明试剂盒适用于待检测人二倍体细胞残留蛋白的浓度为0-4mg/L。

本发明所述的人二倍体细胞包括但不局限于MRC-5，WI-38，KMB-17，2BS，SV-1，SV-4，SV-7等细胞。

本发明提供了上述ELISA试剂盒在定量检测人二倍体细胞残留蛋白中的应用。

本发明还提供了上述ELISA试剂盒在生物制品质量控制中的应用。

优选地，所述生物制品为以人二倍体细胞为基质的各类疫苗，例如狂犬疫苗、水痘疫苗、脊髓灰质炎疫苗、肠道71型灭活疫苗、柯萨奇A16型疫苗、风疹减毒疫苗、麻疹减毒疫苗。

现有技术的ELISA试剂盒通常以多克隆抗体为包被抗体，以单克隆抗体为检测抗体，能够实现较好的目标蛋白定量检测，但本发明实验中意外地发现，采用豚鼠抗人二倍体细胞蛋白多克隆抗体为检测抗体，兔抗人二倍体细胞蛋白多克隆抗体为包被抗体，在规定的浓度下，既能最大限度捕获抗原，又能特异性地与人二倍体细胞结合，能够特异、高效、灵敏、准确地实现人二倍体残留蛋白的定量检测。本发明试剂盒检测周期短，能够同时对多个样品进行检测，检测灵敏度高，能达到0.5ng/ml，无需使用昂贵的实验设备，检测成本低，填补了当前检测残留人二倍体蛋白的技术空白，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为兔多抗SDS电泳图，在约48KD和22KD有两条主蛋白条带，分别为多克隆抗体的重链与轻链。

图2为豚鼠多抗SDS电泳图，在约48KD和22KD有两条主蛋白条带，分别为多克隆抗体的重链与轻链。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1人二倍体细胞蛋白的制备

取MRC-5、2BS、KMB-17和SV-1四类人二倍体细胞进行平面培养。培养条件为36.5±1℃，5％CO₂。培养至细胞融合率为95％以上时，用胰酶消化细胞，并加入0.01MPBS重悬细胞。将上述四种细胞的悬液混合制备成人二倍体细胞混悬液。

将上述的细胞混悬液进行-40℃反复冻融5次后，用移液管将细胞吹匀，1000rpm×5min离心，收集上清，将此上清通过0.8um的滤膜过滤。收集上述滤液，吸入浓缩超滤离心管中(3K)，4℃，10000rpm离心30min，收集浓缩液。采用LOWARY法检测浓缩液中总蛋白质的含量，并稀释浓缩液至总蛋白的含量为2mg/ml，即为人二倍体细胞蛋白。

将上述人二倍体细胞蛋白悬液配制成抗原含量为400ng/mL的溶液，添加10-20％(W/W)的牛血清白蛋白作为保护剂。分装，并进行热加速试验，并检测抗原含量。

实施例2兔抗人二倍体细胞蛋白多克隆抗体的制备方法、效价检测以及纯化

将实施例1获得的人二倍体细胞残留蛋白先后用弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂等体积混合并乳化，免疫两只新西兰大白兔，制备抗人二倍细胞的血清(含有抗人二倍细胞的多克隆抗体)。具体免疫步骤为：

1)根据LOWARY检测总蛋白的结果，将人二倍细胞蛋白用0.01mol/LPBS溶液标定为2mg/ml。

2)第一针：将人二倍体蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合并乳化，多点皮下注射新西兰大白兔，每只注射总量为3ml。

3)第二、三、四针：将人二倍体蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合并乳化，多点皮下注射新西兰大白兔，每只注射总量为3ml。

4)第五针：将人二倍体细胞蛋白注射1.5ml，通过耳缘静脉注射于新西兰大白兔。

5)第五针免后一周取血。

抗人二倍体细胞多克隆抗体的间接法效价检测方法如下：将实施例1获得的人二倍体细胞参考品稀释100倍后包被于酶标板(100μl/孔)，并包被过夜；洗板3遍，用10％小牛血清封闭酶标板，200μl/孔，37℃封闭1小时；然后将上述获得的兔人二倍体细胞多克隆抗体的血清进行如下稀释：1:10²、10³、10⁴、10⁵、2×10⁵、4×10⁵、8×10⁵和1.6×10⁶，并以100μl/孔的量进行加样，37℃下温育1小时；洗板5遍，加入1:8000稀释的羊抗兔Ig-HRP(KPL)100μl/孔，37℃下温育1小时，并洗板5遍；进行显色，并于450nm下读数。如表1所示。

表1兔抗人二倍体细胞多克隆抗体间接法效价450nm吸光度结果

兔1、兔2两份抗人二倍体细胞抗体对于人二倍体细胞间接ELISA效价均大于1.6×10⁶，大于普遍认可的10⁵的抗体效价，可用于酶联免疫试验的原料制备。

针对上述获得的含抗人二倍体细胞的兔血清进行如下的纯化与纯度分析。采用葡萄糖球菌A蛋白(SPA)亲和层析法对抗人二倍体细胞多克隆抗体的兔血清进行纯化：使用0.05mol/LTris-HCl平衡柱，上样，再使用0.05mol/LTris-HCl平衡，使用0.1mol/LGly-HCl缓冲液洗脱，使用紫外检测器检测洗脱液，收集蛋白峰即为纯化后的抗体。对纯化后的抗人二倍体细胞抗体采用BCA试剂盒检测纯化的抗人二倍体细胞兔多克隆抗体的蛋白浓度为11.2mg/ml；将适量稀释的抗人二倍体细胞兔多克隆抗体进行SDS-PAGE还原性电泳：适当稀释纯化的-兔多克隆抗体后取100μl，加入6×SDS-PAGE电泳上样缓冲液20μl，沸水煮沸混合样品3-5分钟；配制SDS-PAGE还原型电泳胶，将煮沸后的样品取样10μl上样进行电泳；预染蛋白Marker(美国，NewEnglandBiolabs)上样13μl；电泳结束后采用考马斯亮蓝染色，用脱色液脱色完全；扫描电泳胶，分析纯化抗体的纯度。

经分析，纯化后的兔抗人二倍体细胞多克隆抗体在约48KD和22KD有两条主蛋白条带，分别为多克隆抗体的重链与轻链，见图1；抗体的纯度为97.8％，纯度≥85％,纯度较高。通过上述制备流程与纯化方法，可以制得高纯度的兔抗人二倍体多克隆抗体，满足酶标试验的要求。纯化后的抗人二倍体细胞的多克隆抗体采用2ml/支进行分装，共5支，-20摄氏度保存。

实施例3豚鼠抗人二倍体细胞多克隆抗体的制备、效价检测以及纯化

1)根据LOWARY检测总蛋白的结果，将人二倍细胞残留蛋白用0.01mol/LPBS稀释至2mg/ml。

2)第一针：将人二倍体蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合并乳化，多点皮下注射豚鼠，每只注射总量为1ml，共两只豚鼠

3)第二、三、四、五针：将人二倍体蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合并乳化，多点皮下注射豚鼠，每只注射总量为1ml。

4)第五针免后一周取血。方法同上，检测抗人二倍体豚鼠多克隆抗体间接法效价如表2所示，并按照上述纯化方法纯化豚鼠多抗。纯化后的人二倍体细胞豚鼠多抗在48KD和22KD有两条主蛋白条带，分别为多克隆抗体的重链与轻链，见图2；抗体的纯度分别为98.6％，纯度≥85％，纯度较高。通过上述制备流程与纯化方法，可以制得高纯度的人二倍体细胞豚鼠多克隆抗体，满足酶标试验的要求。

表2抗人二倍体细胞豚鼠多克隆抗体间接法效价450nm吸光度结果

豚鼠1、豚鼠2两份抗人二倍体细胞抗体对于人二倍体细胞间接ELISA效价均大于10⁵，大于普遍认可的10⁵的抗体效价，可用于酶联免疫试验的原料制备。

实施例4试剂盒的组成及使用步骤

本试剂盒的组成：预包被平底微孔板，参考品，样品稀释液，洗涤液(浓缩)，豚鼠抗人二倍体细胞残留蛋白多克隆抗体-HRP，显色液A和B，终止液，阳性对照，阴性对照。

具体的组成部分为：

本发明采用的微孔板为可拆卸高组合的12条96孔透明微孔板。微孔板包被兔抗人二倍体细胞残留蛋白多克隆抗体的方法如下：

1)用包被缓冲液将包被抗体(兔抗人二倍体细胞残留蛋白抗体，效价大于10⁶)稀释至工作浓度(1:1000稀释)，加入到平底微孔板中，每孔100μl，放入湿盒，4℃孵育过夜，用洗涤液洗涤，拍干。

2)向平底微孔板每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h，用洗涤缓冲液洗涤，拍干。

3)向平底微孔板中加入1:1000的兔多抗包被抗体每孔100μl，37℃，孵育2h，用洗涤缓冲液洗涤，拍干，即得到包被有兔抗人二倍体细胞残留蛋白多克隆抗体的平底微孔板。

本过程中的包被缓冲液为pH＝9.6，浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液，制备方法如下：将1.59g的Na₂CO₃和2.93g的NaHCO₃加双蒸水定容至1L，高压灭菌。

封闭液为：10％的牛血清溶液，其制备方法如下：量取100ml新生牛血清溶解在1LpH＝7.4的0.01MPBS缓冲液中。其中pH＝7.4的0.01MPBS缓冲液的制备方法为：0.3gNaH₂PO₄、2.9gNa2HPO4、0.08gNaCl、加双蒸水定容至1L，高压灭菌后，贮存于2-8℃保存。

1.参考品参考为人二倍体细胞蛋白，浓度梯度分别为400ng/ml，200ng/ml，50ng/ml，12.5ng/ml，6.25ng/ml，0.8ng/ml，0.4ng/ml，0ng/ml。人二倍体细胞残留蛋白参考品稀释液为：2％BSA+0.1％Tween20用0.15MPBS溶解(或者向封闭液中加入0.1％Tween20)。所有配制好的溶液高压灭菌后，贮存于2-8℃冰箱。

2.样品稀释液：小牛血清：100ml；0.01MPBS：900ml；生物素防腐剂：0.5ml。

3.洗涤液(浓缩)的配方为：NaH₂PO₄.2H₂O:2.96g，Na₂HPO₄.12H₂O:29.0g，NaCl:234g，Tween-20:20ml，加纯化水至：1000ml。

4.豚鼠抗人二倍体细胞残留蛋白多克隆抗体-HRP。

5.显色液A：醋酸钠：27.2g，柠檬酸：3.2g，30％H₂O₂：0.6ml，双蒸水：至1000ml，显色液B，TMB：0.4g，EDTA-Na₂：0.4g，柠檬酸：1.9g。

6.终止液：浓硫酸：112ml，纯化水：888ml。

7.阳性对照：为含有10ng/ml人二倍体细胞蛋白。

8.阴性对照：为不含有人二倍体细胞残留蛋白的稀释液。

10、使用ELISA试剂盒的具体步骤

从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。用蒸馏水分别将20倍稀释液及浓缩洗涤液稀释成原倍的溶液待用。加参比品及待测样本：取足够数量的酶标包被板，用样品稀释液将人二倍体细胞参比品稀释成8、4、2、1、0.5ng/mL，然后将待测样本用样品稀释液适当稀释，最后加入到检测板中，100μL/孔。设阴性对照2孔(样品稀释液)，100μL/孔；另设空白对照1孔，不加任何试剂。37℃水浴锅或恒温箱温育70min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置30s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板3次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。加酶标工作液：先用酶标试剂将酶结合物做1:40000倍稀释、混匀，每孔加入稀释好的酶标工作液100μL。温育：37℃水浴锅或恒温箱温育60min。洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置30s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次(也可用洗板机按说明书操作洗板)。显色：每孔先加入显色剂A液50μL，再加入显色剂B液50μL，平板混匀器混匀10s(或用手轻轻震荡混匀10s)，37℃避光显色10-15min。终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应(颜色由蓝色立转黄色)。测定：在终止后15分钟内，用450/630nm双波长测量各孔的吸光值(OD值)。计算Cutoff值：Cutoff＝阴性对照平均值×2.1，平均值小于0.05则按0.05计算。

实施例5确定包被抗体和检测抗体的浓度

包被抗体和检测抗体的工作浓度是ELISA试剂盒的一个重要参数，为了摸索合适的包被抗体及检测抗体浓度，通过棋盘法来确定检测抗体以及包被抗体的最适工作浓度。

1)包被：用包被缓冲液分别按照1:1000，1:5000，1:1500，1:1000的稀释比例稀释兔抗人二倍细胞残留蛋白多克隆抗体(效价大于10⁶)，每孔加入100μl，将微孔板放入湿盒中，4℃孵育过夜。

2)封闭：每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2小时，用洗涤缓冲液洗涤4次，拍干。

3)加入标准品：向平底微孔板中加入100ng/ml、0ng/ml的人二倍细胞残留蛋白参考品，每孔100μl，平行3个复孔。37℃，孵育1.5小时，用洗涤缓冲液洗4次，拍干。

4)加入检测抗体：向微孔板中分别加入1:10000、1:20000、1:40000的豚鼠抗人二倍体细胞残留蛋白酶标检测抗体(效价大于10⁵)，每孔100μl，平行3个复孔。37℃，孵育1.5小时，用洗涤缓冲液洗4次，拍干。

5)显色：向微孔板中加入显色底物A液和B液各50μl，37℃避光显色10-15min.

6)终止：每孔加入50μl终止液，终止反应。

7)读数：450nm下读取吸光值。

8)本次试验共重复3次，结果如表3所示(OD值为平均OD值)。

首先在保证检测抗体的浓度(1:10000)不变的情况下，包被1:10000,1:5000,1:1500,1:1000四种不同浓度的包被抗体，经ELISA检测发现将包被抗体稀释1000倍，检测抗体稀释5000倍，不同浓度的标准品OD值具有梯度关系，且相互之间的OD值有较大的差异，符合建立曲线的初步条件，因此确定包被浓度为1μg/ml。但同时，实验结果也表明，此反应条件下，空白孔的OD值达到0.25以上，略微偏高。因此，需要进一步对检测抗体浓度进行优化。

研究表明，ELISA空白孔反映值与检测抗体的浓度相关，并呈正相关。为了降低空白孔的反映值，本实验设置三种不同稀释倍数的检测抗体，结果表明当检测抗体浓度稀释至40000倍时，空白孔OD值为0.032可以满足ELISA的实验要求。结果如表3所示。

表3包被抗体浓度确认

综上结果可以确定，包被抗体稀释1000倍，检测抗体稀释40000倍时，达到最适抗体浓度。

实施例6确定标准曲线

根据实施例5确定的最佳包被抗体浓度、标准品浓度、检测抗体的浓度，绘制试剂盒的标准曲线的具体步骤如下：

1)包被：每个微孔加入100μl工作浓度的包被抗体稀释液，将微孔板放入湿盒，4℃过夜。

2)封闭：每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2小时，用洗涤缓冲液洗涤4次，拍干。

3)加入标准品:向微孔中分别加入浓度为80ng/ml、40ng/ml、16ng/ml、8ng/ml、4ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0ng/ml的人二倍体细胞残留蛋白参考品。每孔100μl，平行做3个复孔。37℃，孵育1.5h，用洗涤缓冲液洗4遍，拍干。

4)加入检测抗体：向微孔板中加入工作浓度的酶标检测抗体，每孔100μl。37摄氏度，孵育1.5h，用洗涤缓冲液洗4遍，拍干。

5)显色：向微孔板中加入显色底物A液和B液各50μl，37℃避光显色10-15min.

6)终止：每孔加入50μl终止液，终止反应。

7)读数：450nm下读取吸光值。

本实验共重复3次，标准品对应的反应值如表4所示。

表4标准品浓度确认

标准品浓度(ng/mL)	平均OD	CV(％)
			80	3.095	5.45％
40	2.891	4.39％
			16	2.4245	1.27％
8	1.5683	2.03％
			4	0.9065	2.10％
2	0.5000	2.13％
			1	0.2590	0.77％
0.5	0.1370	0.97％
			0.25	0.0805	0.21％
0	0.0108	0.33％

结果显示，数据具有明显的梯度，蛋白浓度大于16ng/mL时，OD值已达到仪器检测上限，无法准确显示结果，蛋白浓度小于16ng/mL时，复孔之间的差异很小，可以满足ELISA的检测要求，本试剂盒的标准曲线R²可以大于0.98。

实施例7试剂盒的线性范围，线性，特异性，灵敏度，准确性，精密度，重复性和耐用性检测。

对于本实验例中所用到的各试剂或材料，如包被的酶标板以及标记的抗体等，如果上述个实施例具体涉及到了其制备，则本实施例中所用到的试剂或材料即是上述实施例所制备的试剂或材料。

1)灵敏度与线性范围见表

将实施例4中的人二倍体细胞参考品稀释至160ng/mL，然后以2倍梯度稀释至：16、8、4、2、0.5、0.25、0ng/mL，加样于酶标板，并采用实施例4的程序进行试验，结果如表5所示：

表5人二倍体细胞残留蛋白检测方法灵敏度与线性范围试验吸光度值

抗原含量在8-0.5ng/mL时，OD值≥阴性对照×2.1，该方法的检测灵敏度为0.5ng/mL。抗原含量在8-0.5ng/mL时，连续5点线性≥0.98，检测线性范围为8-0.5ng/mL。

2)线性实施例4中的人二倍体细胞抗原参考品16ng/mL用样品稀释液稀释至8、4、2、1、0.5ng/mL，采用实施例4的程序进行试验，结果见表6。

表6人二倍体细胞抗原检测方法线性试验吸光值结果

结果显示：该方法的线性相关系数R²≥0.99，线性良好。

3)特异性采用实施例4的方法对CHO细胞，SF-9细胞，新生牛血清，狂犬病毒，肠道71型病毒，2％血清维持液进行特异性试验，检测结果见表7。

表7检测人二倍体细胞含量方法特异性试验450nm吸光度结果

该试剂盒仅对人二倍体细胞有反应，而对Vero细胞、CHO细胞、SF-9细胞、新生牛血清、狂犬病毒、肠道71型病毒、2％血清维持液等无反应。由此说明，该检测系统对于人二倍体细胞有较高的特异性。

4)准确性试验双人稀释人二倍体细胞参考品，是理论抗原含量依次为1、2、4ng/ml，采用实施例4的试验程序，检测上述稀释的抗原含量，其中每人单独稀释6次以获得针对每个抗原含量的6份平行的抗原参考品；比较检测结果与理论值的差异，统计各样品检测的准确性。结果表8：

表8人二倍体细胞含量检测方法准确性试验

对含量为低、中、高三个(1、2、4ng/ml)浓度的12次试验结果的平均回收率分别为99％，104％，109％，所有结果的回收率均在80％-120％范围内，符合标准要求，准确性较高。

5)精密性试验

将人二倍体细胞参考品双人分别稀释，使理论抗原含量分别为10ng/ml、20ng/ml、10ng/ml，采用实施例4的试验程序，检测上述稀释样品的抗原含量，其中每人单独稀释6次获得针对每个抗原含量的6份平行的抗原参考品；分析变异系数(CV％)即检测精密性。结果如表9：

表9人二倍体残留蛋白检测方法精密性试验结果

结果显示，单人6次的变异系数均小于10％，变异系数较小，精密度高。

6)双人重复性试验

将人二倍细胞残留蛋白参考品双人分别稀释，是理论抗原含量依次为10、20、40ng/ml，每人稀释6次，采用实施例9的试验程序检测稀释样品的抗原含量，进行重复性试验，结果如表10：

表10人二倍体细胞残留蛋白检测方法重复性试验结果

双人重复试验显示：变异系数＜10％，具有较好的重复性。

7)耐用性试验

收集以人二倍体细胞为基质的疫苗，狂犬灭活疫苗、水痘减毒活疫苗、脊髓灰质炎灭活疫苗、肠道71型灭活疫苗、风疹减毒疫苗、以及以Vero细胞为基质狂犬灭活疫苗、肠道71型病毒、狂犬病毒、人二倍细胞参考品进行检测。按照上述的试验步骤进行操作，结果见下表11。

表11人二倍体细胞残留蛋白检测方法耐用性试验结果(450nm吸光值)

结果表明，本发明试剂盒能够很好的检测以人二倍体细胞为基质狂犬疫苗、水痘疫苗、脊髓灰质炎疫苗、肠道71型灭活疫苗、柯萨奇A16型疫苗、风疹减毒疫苗、麻疹减毒疫苗。但是对以vero细胞为基质的狂犬灭活疫苗、肠道71型病毒、狂犬病毒等没有有效的反应。此结果证明了本发明可以应用到以人二倍体细胞为基质的疫苗的残留蛋白的检测。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种定量检测人二倍体细胞残留蛋白的试剂盒，其特征在于，其为ELISA试剂盒，以豚鼠抗人二倍体细胞蛋白多克隆抗体为检测抗体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，以兔抗人二倍体细胞蛋白多克隆抗体为包被抗体。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测抗体效价大于10⁵。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述检测抗体其工作浓度为1：40000。

5.如权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，包被抗体的效价大于10⁶。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，包被抗体的工作浓度为1:1000。

7.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，检测抗体用酶标记，所述酶选自辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、葡萄糖氧化酶、荧光素、生物素、胶体金离子、碱性磷酸酶中的一种。

8.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，待检测人二倍体细胞残留蛋白的浓度为0-4mg/L。

9.权利要求1-8任一所述的试剂盒在定量检测人二倍体细胞残留蛋白中的应用。

10.权利要求1-8任一所述的试剂盒在生物制品质量控制中的应用。