CN114573700B

CN114573700B - 糖类抗原ca19-9的检测试剂盒

Info

Publication number: CN114573700B
Application number: CN202210149068.0A
Authority: CN
Inventors: 许峰; 程华; 马子腾; 桑皖怡; 李娜; 温占波
Original assignee: Hebei Boteng Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Hebei Boteng Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2022-02-18
Filing date: 2022-02-18
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2042-02-18
Also published as: CN114573700A

Abstract

本发明公开了一种糖类抗原CA19‑9的检测试剂盒，属于试剂盒技术领域，该发明提供糖类抗原CA19‑9的单克隆抗体4A6和单克隆抗体4G2，其中，单克隆抗体4A6的重链可变区和轻链可变区分别具有SEQ ID No.1和2所示的氨基酸序列；单克隆抗体4A6的重链可变区和轻链可变区具有SEQ ID No.5和6所示的氨基酸序列；以及包括上述抗体的双抗夹心ELISA检测试剂盒；本发明具有检测方法简单，灵敏度高，检测CA19‑9的LOD为21.333ng/mL，与AFP、CEA、铁蛋白、人血清白蛋白无交叉，说明具有良好的特异性，为肿瘤标志物检测开发提供了新方法，具有良好的应用前景。

Description

糖类抗原CA19-9的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及试剂盒技术领域，特别是涉及一种糖类抗原CA19-9的检测试剂盒。

背景技术

恶性肿瘤是人类死亡的主要原因之一，肿瘤的早期诊断和治疗对提高治愈率、改善生活质量和延长生存期至关重要。肿瘤标志物的血清含量水平一般与恶性肿瘤的发生、发展、消退、复发等有良好的相关性，检测这些肿瘤标志物的血清水平，对相关恶性肿瘤的早期诊断、治疗效果和预后转归判断等有重要参考价值，目前已在临床广泛应用。

肿瘤标志物是指肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身合成、释放或者由机体对肿瘤细胞反应而产生的一类物质。糖类抗原CA19-9是一种重要的肿瘤标志物。CA19-9是一种粘蛋白型的糖类蛋白肿瘤标志物，为细胞膜上的糖脂质，因由鼠单克隆抗体116NS19-9识别而命名。CA19-9是迄今报道的对胰腺癌敏感性最高的标志物。在血清中它以唾液粘蛋白形式存在，分布于正常胎儿胰腺、胆囊、肝、肠和正常成年人胰腺、胆管上皮等处，是存在于血液循环的胃肠道肿瘤相关抗原。大部分胰腺癌患者血清CA19-9水平明显增高。如果以正常参考范围上限(37U/mL)为诊断标准，敏感性和特异性均可达90％以上。CA19-9水平与肿瘤的阶段有关，血清中含量的高低提示手术的难易程度。术前CA19-9水平对预后有一定提示作用，低者预后较好，术后CA19-9水平降至正常者生存期长于未下降者。肿瘤复发时，CA19-9可再度升高，并且发生于影像学诊断之前。因此，CA19-9水平还可用作监测肿瘤的复发。

目前发现的用于肿瘤筛查诊断的标志物大都在患者体内含量很低，一般的检测方法不够敏感，难以精确定量测定。因此，敏感、准确、简便、快速的肿瘤标志物检测方法具有十分重要的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种糖类抗原CA19-9的检测试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，该试剂盒具有较高的灵敏度和特异性。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种糖类抗原CA19-9的单克隆抗体4A6，该单克隆抗体4A6的重链可变区具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，该单克隆抗体4A6的轻链可变区具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

本发明还提供一种糖类抗原CA19-9的单克隆抗体4G2，该单克隆抗体4A6的重链可变区具有SEQ ID No.5所示的氨基酸序列，该单克隆抗体4A6的轻链可变区具有SEQ IDNo.6所示的氨基酸序列。

本发明还提供一种如上述的单克隆抗体4A6和/或上述的单克隆抗体4G2在制备糖类抗原CA19-9的检测试剂盒中的应用。

本发明还提供一种用于检测糖类抗原CA19-9的检测试剂盒，该试剂盒包括如上述的单克隆抗体4A6和/或上述的单克隆抗体4G2。

进一步地，所述检测试剂盒为双抗夹心ELISA试剂盒。

进一步地，所述检测试剂盒中，所述单克隆抗体4A6为捕获抗体，所述单克隆抗体4G2为检测抗体。

本发明公开了以下技术效果：

本发明制备了糖类抗原CA19-9的单克隆抗体并建立了双抗夹心ELISA方法，本发明具有检测方法简单，灵敏度高，检测CA19-9的LOD为21.333ng/mL，与AFP、CEA、铁蛋白、人血清白蛋白无交叉，说明具有良好的特异性，为肿瘤标志物检测开发提供了新方法，具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为单克隆抗体亚型测定；

图2为抗体配对实验结果(包被4A6)；

图3为抗体配对实验结果(包被4G2)；

图4为抗体配对实验结果(包被4H8)；

图5为抗体配对实验结果；

图6为抗体配对实验结果(包被4A6)；

图7为检测标准曲线。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1试剂与药品

免疫球蛋白亚型检测试剂盒，HRP标记羊抗小鼠IgG，牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumen，BSA)，卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)，均购自美国Sigma公司；细胞培养板、DMEM培养基，胎牛血清，均购自美国GIBCO公司；层析介质rProteinA FF购自美国GE公司；其他常规试剂均为进口或国产分析纯级。

1.1.2仪器

二氧化碳培养箱；净化工作台；倒置显微镜；电子分析天平；液氮罐；高速冷冻离心机；酶标仪；电热恒温水浴锅；漩涡混合器；洗板机，90-2型磁力搅拌器；各种规格移液器；透析袋；恒温震荡器；微量震荡器。

1.1.3实验动物和细胞

BALB/c小鼠，河北医科大学实验动物中心；SP2/0细胞为本研究室保存。

1.2方法

1.2.1单克隆抗体制备及特性分析

1.2.1.1动物免疫

选取7-8周龄的雌性BALB/c小鼠3只。首先将抗原CA19-9用生理盐水稀释，加入等体积的佐剂进行乳化，颈背部皮下多点注射，免疫抗原量40μg/只，第一次免疫用弗氏完全佐剂，其后的免疫用弗氏不完全佐剂，每隔2周加强免疫一次。三免和五免后7-10天断尾取血，间接ELISA检测小鼠血清抗体效价，选取最佳免疫小鼠进行融合。

1.2.1.2细胞融合

融合前将所需溶液预热到37℃。将骨髓瘤细胞和脾细胞在50mL无菌离心管内混合，充分混匀，DMEM培养基洗一次，1000rpm离心10min，弃上清并轻轻用吸管吸净残留的液体。轻轻弹击摇散底部细胞，一手均匀转动离心管，另一手用1ml吸管吸取lml PEG，并沿管壁加入，时间控制在1min内，将细胞悬液慢慢吸入管中，静止30s，再将细胞悬液缓缓吹出，时间控制在30s，即在5min内加入25ml的DMEM不完全培养液，稀释PEG使其失去促融合作用。1000rpm离心10min，弃上清，沉淀用事先预热好的HAT完全培养基重悬，混匀，将其液体加入己铺有饲养细胞的96孔板，每孔2滴，放入37℃、5％CO₂的培养箱中进行培养。

1.2.1.3阳性单克隆杂交瘤细胞的冻存与复苏

细胞冻存：杂交瘤细胞扩大培养后，选择状态良好的杂交瘤细胞从培养瓶上吹下，将细胞转移到离心管中，1000r/min离心10min，倒掉上清，加入1mL冻存液，移入冻存管，做好标记；用纱布将冻存管包好后逐渐降温，4℃放置60min，-70℃保存24h，最后转入液氮中保存。

细胞复苏：将冻存管从液氮中取出，迅速放入37-40℃水浴中溶化1-2min，然后1000r/min离心10min，弃去上清，加入完全培养液，转入细胞培养瓶，放入37℃，CO₂浓度为5％的二氧化碳培养箱中内培养。

1.2.1.4单克隆抗体的大量制备

采用小鼠体内诱生腹水的方法，取健康的BALB/c雌性小鼠，每只小鼠体内注射石蜡油0.5mL，备用。将扩大培养的阳性克隆杂交瘤细胞吹下，1000r/min离心5min，用不完全培养液悬浮细胞，将细胞个数调整到10⁶/mL，每只小鼠腹腔注射1mL的阳性克隆杂交瘤细胞，7-9天取腹水，-20℃分装保存。

1.2.1.5单克隆抗体腹水纯化

采用辛酸-硫酸铵盐析法进行单克隆抗体的纯化，该方法是一个经典方法，辛酸在偏酸性的条件下能够将免疫球蛋白(IgG)以外的蛋白质都沉淀下来，上清中只剩下IgG。硫酸铵主要也是用于除去非IgG的杂蛋白。该种方法IgG的回收率能达到90％以上。

具体操作如下：脱脂，取出的腹水经4℃放置12h后，10000r/min离心15min，去表面脂肪层取上清；取腹水5mL，加入0.06mol/L pH4.0 NaAc-HAc缓冲液10mL，搅拌均匀；在室温下调pH值至4.8；向调好pH值的腹水加入165μL正辛酸，边搅拌边加入，搅拌30min，4℃静置2h以上；将腹水溶液4℃，6000r/min离心30min，取上清，调pH值至7.2；向上清溶液中边搅拌边加入等量饱和硫酸铵溶液，边搅拌边加入，至硫酸铵溶液终浓度为50％饱和度，搅拌20min后，4℃6000r/min离心30min，取沉淀，将沉淀溶于5.5mL 0.01mol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液(PBS)中；将沉淀悬浮液装入透析袋中，4℃条件下，用0.01mol/L pH 7.2PBS透析过夜(至少更换2次透析液)，取出透析好的溶液-20℃分装保存。

1.2.1.6抗体(血清或腹水)效价测定

采用间接ELISA法进行抗体(血清或腹水)效价测定，具体步骤如下：

(1)抗原包被，采用0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液作为包被液，包被抗原浓度为5μg/mL，96孔酶标板每孔100μL，4℃过夜；

(2)封闭，将包被好的酶标板取出，待其恢复至室温后，倾去包被液，每孔加洗液300μL，每次震荡lmin，洗3-4次，拍干；每孔加200μL 10％小牛血清作为封闭液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；

(3)加待测抗体(血清或腹水)样品，用缓冲溶液将待测血清溶液以200倍开始倍比稀释，每孔加入100μL，并且设置空白对照孔(PBS)和阴性孔(阴性血清)，37℃放置45min；洗涤，洗涤3次，每次震荡lmin，拍干；

(4)加酶标二抗，每孔加入100μL的l:10000稀释的HRP酶标记的山羊抗鼠IgG，37℃放置30min；洗涤，洗涤3次，每次震荡1min，拍干；

(5)显色，每孔加底物显色液100μL，37℃保温避光反应15min；

(6)终止反应；每孔加入50μL终止液；

(7)测定OD_450nm值：用检测波长为450nm的酶标仪读取各孔光密度值。阴性对照孔OD_450nm值为N，阳性为P，以P/N≧2.1，为阳性结果。

1.2.1.7单克隆抗体蛋白含量测定

采用考马斯亮兰法测定偶联物蛋白浓度。具体步骤如下：首先制作标准曲线，配好六种浓度蛋白标准液，与考马斯亮兰G250试剂反应后在595nm波长下进行比色测定，然后以蛋白标准液含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，标准液配制及加液见表1；

纯化抗体蛋白含量测定，取0.1mL待测样品加入0.9mL PBS缓冲液，加5mL考马斯亮兰G250试剂，混匀后放置5分钟，在595nm波长下进行比色测定，记录吸光度值；结果处理，根据公式计算相应蛋白含量，乘以相应稀释倍数即为所测蛋白浓度。

表1蛋白浓度测定方案

1.2.1.8单克隆抗体亚型测定

使用抗体亚型试剂盒鉴定抗体亚型。操作如下：取出试剂盒中检测板，封闭液封闭1h后，加入纯化后的待测抗体，37℃保温保湿30min；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次lmin，拍干；加HRP酶标记的山羊抗鼠各IgG亚型抗体，37℃保温保湿30min；洗涤，洗涤3次，每次1min，拍干；显色，每孔加底物显色液100μL，37℃保温避光反应15min；终止反应，每孔50μL终止液，终止反应；测定OD_450nm值，读取各孔光密度值。

1.2.2双抗夹心法ELISA检测试剂盒研制

1.2.2.1生物素标记抗体

原理：SμLfo-NHS-LC-Biotin含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，能够在pH7-9的磷酸缓冲液中与抗体分子中赖氨酸的自由氨基反应，将生物素分子连接在抗体分子上，形成稳定的生物素标记抗体复合物。

操作步骤：将1mg SμLfo-NHS-LC-Biotin溶于360μL超纯水中。取1mg抗体溶解于500μL pH 7.4磷酸缓冲液。将两种溶液混合，室温下反应1小时。反应完毕后，将反应液装入透析袋中，放入0.1M/L pH7.4磷酸缓冲液中，4℃透析过夜。

ELISA检测过程：包被，将CA19-9抗原以200U/mL的浓度进行包被。封闭，每孔加200μL 10％小牛血清作为封闭液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加生物素标记抗体，每孔加入100μL的l:1000稀释的标记好生物素抗体(同时其他孔中加入未标记生物素的抗体作为对照)，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加酶标亲和素，每孔加入100μL的l:50000稀释的HRP酶标记的亲和素，37℃放置30min；洗涤，洗涤3次，每次震荡1min，拍干；显色，每孔加底物显色液100μL，37℃保温避光反应15min；终止反应，每孔加入50μL终止液，终止反应；测定OD_450nm值，用检测波长为450nm的酶标仪读取各孔光密度值。根据OD值确定最适的包被浓度。

1.2.2.2抗体最适配对

本试剂盒采用双抗夹心法，需要两个能够配对的抗体，故对挑选出的效价最高的3株抗体进行两两配对实验，以确定最适合的配对组合。

1.2.2.3第一轮抗体配对实验

具体步骤为，以5μg/mL浓度包被三株抗体，封闭，每孔加200μL 10％小牛血清作为封闭液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加入200U/mL CA19-9溶液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加生物素标记抗体，每孔加入100μL的l:1000稀释的标记好生物素抗体(同时其他孔中加入未标记生物素的抗体作为对照)，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加酶标亲和素，每孔加入100μL的l:50000稀释的HRP酶标记的亲和素，37℃放置30min；洗涤，洗涤3次，每次震荡1min，拍干；显色，每孔加底物显色液100μL，37℃保温避光反应15min；终止反应，每孔加入50μL终止液，终止反应；测定OD_450nm值，用检测波长为450nm的酶标仪读取各孔光密度值。根据OD值确定最适的包被浓度。

1.2.2.4第二轮抗体配对实验

采用棋盘法，对抗体最适配对进行第二次优化。

具体步骤为，以5μg/mL浓度包被抗体，封闭，每孔加200μL 10％小牛血清作为封闭液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加入100、200、300、400、500U/mL CA19-9溶液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加生物素标记抗体，每孔加入100μL的l:2000、l:4000、l:8000、l:16000、l:32000稀释的标记好生物素抗体，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加酶标亲和素，每孔加入100μL的l:50000稀释的HRP酶标记的亲和素，37℃放置30min；洗涤，洗涤3次，每次震荡1min，拍干；显色、终止反应、测定OD_450nm值操作同1.2.2.3。

1.2.2.5第三轮抗体配对实验

采用棋盘法，对抗体最适配对进行第二次优化。

具体步骤为，以5μg/mL浓度包被抗体，封闭，每孔加200μL 10％小牛血清作为封闭液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加入40、80、120、160、200U/mL CA19-9溶液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加生物素标记抗体，每孔加入100μL的l:1000、l:2000、l:4000、l:8000、l:16000、稀释的标记好生物素抗体，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加酶标亲和素，每孔加入100μL的l:50000稀释的HRP酶标记的亲和素，37℃放置30min；洗涤，洗涤3次，每次震荡1min，拍干；显色、终止反应、测定OD_450nm值操作同1.2.2.3。

1.2.3检测试剂盒特性分析

1.2.3.1标准曲线绘制

定量分析的主要特征就是建立计量-反应曲线，通过已知浓度的标准物质和相应的反应量建立计量-反应关系。然后，通过待测样品的反应量计算出待测样品的浓度。

具体过程为，以5μg/mL浓度包被抗体，封闭，每孔加200μL 10％小牛血清作为封闭液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加入用CA19-9标准溶液配制的系列浓度抗原液，即0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL。37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加生物素标记抗体，每孔加入100μL的l:1000稀释的标记好生物素抗体(同时其他孔中加入未标记生物素的抗体作为对照)，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加酶标亲和素，每孔加入100μL的l:10000稀释的HRP酶标记的亲和素，37℃放置30min；洗涤，洗涤3次，每次震荡1min，拍干；显色，每孔加底物显色液100μL，37℃保温避光反应15min；终止反应，每孔加入50μL终止液，终止反应；测定OD_450nm值，用检测波长为450nm的酶标仪读取各孔光密度值。

重复该实验4次，取平均值。将所得数据利用统计学软件进行线性分析。

1.2.3.2检测限分析

检测限(limit of detection)，也称分析灵敏度(analytical sensitivity)，是指检测方法可检测出的最低被测量浓度。

具体过程为，以5μg/mL浓度包被抗体，封闭，每孔加200μL 10％小牛血清作为封闭液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加入空白溶液(添加了保护剂的洗液)，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加生物素标记抗体，每孔加入100μL的l:1000稀释的标记好生物素抗体(同时其他孔中加入未标记生物素的抗体作为对照)，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加酶标亲和素，每孔加入100μL的l:10000稀释的HRP酶标记的亲和素，37℃放置30min；洗涤，洗涤3次，每次震荡1min，拍干；显色、终止反应、测定OD_450nm值操作同1.2.3.1。

测定20个空白溶液的OD值，计算空白对照OD值的平均数(mean)和标准差(SD)，以空白对照的mean+2SD为判定标准，根据标准曲线计算该系统的最低检测限，即灵敏度。

均值：

标准差：

1.2.3.3准确度分析

准确度通常是指测量结果趋近于真值的程度。目前测定准确度的方法主要有三种，分别是与国家(国际)标准品的对比研究；回收率实验研究和方法学对比研究。本试验采用回收率实验研究来确定检测试剂盒的准确度。

具体过程为，以5μg/mL浓度包被抗体，封闭，每孔加200μL 10％小牛血清作为封闭液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；以一份健康体检血清样品作为基础溶液，分成4份，分别加入相同体积不同浓度的CA19-9标准品，使得最终的添加浓度分别为40、100、200ng/mL。37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；后续步骤同1.2.3.2。

重复该实验3次，取平均值。

计算回收率：

计算平均回收率：

1.2.3.4精密度分析

精密度是考察试剂盒对同一样本重复测定时能否得到相同实验结果的能力的指标，包括批内和批间不精密度，通常用重复多次样本测量结果的变异系数(CV％)表示。

批内精密度是众多种类精密度中最基本的一个，它是在严格的相似条件下，所得到的最佳的精密度。测定结果的变异系数(CV％)应不高于10.0％。

批间精密度是指在同一实验室，由同一(组)操作员在同一仪器上，使用同一方法和同种、同一批号试剂，在一段时间内(一般为一个月或20个工作日)对同一测试样品(常用质控品)测量结果的精密度。测定结果的变异系数(CV％)应不高于15.0％。

具体过程为，以5μg/mL浓度包被抗体，封闭，每孔加200μL 10％小牛血清作为封闭液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；以一份健康体检血清样品作为基础溶液，分成4份，分别加入相同体积不同浓度的CA19-9标准品，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；后续步骤同1.2.3.2。

重复该实验3次，取平均值。

批内精密度测定过程为：对四个浓度(25、50、100、200ng/mL)的样品，用同一批次的试剂盒进行20次的重复检测。计算平均值和变异系数。

均值：

标准差：

批间精密度测定过程为：选取50和200ng/mL两个浓度的样品，每天做2个批次的测试，每批测试时，对同一样品作双份测量，共做20天。评估结束时共有40对，即80个测试结果。根据公式计算出批间精密度。

公式为：

公式为：

1.2.3.5特异性分析

标记免疫分析是特定抗体对特定抗原的特异识别。不同来源的抗体与结构类似物结合从而产生交叉反应是客观存在的，因此特异性检验是正确认识该试剂盒对结构类似物抗干扰能力的指标。

将1000ng/mL CEA、1000ng/mLAFP、1000ng/mL铁蛋白、50mg/mL人血清白蛋白与25U/mL CA19-9标准品同时进行检测，测定检测结果。

具体过程为，以5μg/mL浓度包被抗体，封闭，每孔加200μL 10％小牛血清作为封闭液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加入事先配置好的五种检测物质，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；后续步骤同1.2.3.2。

2结果

2.1抗体的制备与纯化

经过抗原免疫、细胞融合、杂交瘤筛选、克隆和传代，获得稳定分泌CA19-9单克隆抗体的杂交瘤细胞株，编号分别为2B7、3D5、4A6、4G2、4H8、6B2。

对6株抗CA19-9单克隆抗体细胞株(编号分别为：2B7、3D5、4A6、4G2、4H8、6B2)分别进行复苏和腹水制备，均获得超过10mL的腹水。经过辛酸-硫酸铵盐析法纯化，蛋白含量测定后，均获得了超过10mg的抗体。将抗体小剂量分装，-20℃保存，以备后续使用。

2.2抗体效价

将各株经过纯化的抗体用磷酸盐缓冲液稀释到1mg/mL，用间接ELISA进行效价测定，结果见表2。从结果中可以看出，6株抗体中4A6、4G2、4H8三株抗体的效价最高，遂决定对这三株抗体进行后续实验。

表2抗CA19-9小鼠单克隆抗体的效价

2.3抗体亚型

三株抗体亚型结果见表3和图1，从结果中可以看出，4A6和4H8为IgG1型，4G2为IgG3型。

表3单克隆抗体亚型测定

2.4生物素标记抗体检测

在上述条件下对抗体标记生物素的效果进行检测，结果见表4，从表中可以看出，未标记的OD_450nm值都很低，而经过标记的OD_450nm值都高，表明标记成功。

表4生物素标记检测结果

2.5第一轮抗体配对实验

对现有三株抗体进行两两配对后，得到下面的结果，见图2-4，对结果进行总结，见表5，从表中可以看出，4A6和4G2能配对；而4H8可以和其他两株抗体都不能配对。所以第二轮实验中，计划用4A6和4G2进行组合实验。

表5抗体配对情况表

2.6抗体配对实验二

根据第一次配对结果，进行了第二次配对实验，结果见下图5，可以看出，以4A6为捕获抗体，4G2为检测抗体时，整体OD值最高，空白值最低，所以对该抗体配对组合进行第三次实验。

2.7抗体配对实验三

根据第一次和第二次配对结果，进行了第三次配对实验，结果见下图6和表6，可以看出，以4A6为捕获抗体，4G2为检测抗体时，检测灵敏度可以低于10ng/mL，到达了市场现有同类产品的检测水平，所以确定该配对组合用于CA19-9检测试剂盒的组装。

表6抗体配对检测结果

2.8标准曲线绘制

用标准稀释液进行倍比稀释CA19-9标准品为0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL，采用前述建立的双抗体夹心ELISA法重复检测4次，结果表明其具有良好线性关系的检测区间为25～200ng/mL。标准曲线见下图7。

2.9检测限

根据标准的方法，检测了20个空白溶液的OD值，计算空白对照OD值的平均数(mean)和标准差(SD)。其中平均值为0.067，标准差为0.0084，则以空白对照的mean+2SD为判定标准，即以OD值0.084，带入到标准曲线中，根据标准曲线计算该系统的最低检测限为21.333ng/mL，即灵敏度为21.333ng/mL。

2.10准确度

样品中添加不同浓度的CA19-9标准品，进行回收实验。结果见表7。

表7准确度结果(添加回收实验)

2.11批内精密度

选取试剂盒进行批内精密度检测，结果见下表8，各个浓度的变异系数(CV％)都小于10％，表明试剂盒的批内精密度满足检测要求。

表8批内精密度结果

2.12批间精密度

选取两批试剂盒进行批间精密度的检测，结果见下表9，两个浓度的变异系数(CV％)都小于10％，表明试剂盒的批内精密度满足检测要求。

表9批间精密度结果

2.13特异性

将AFP、CEA、铁蛋白、人血清白蛋白分别配置成如下浓度进行检测，同时检测25U/mL CA19－9标准品，结果见下表10，从结果中可以看出，四种干扰物质在极高浓度时的检测结果小于25U/mL CA19－9标准品，表明这些干扰物质不会对检测结果产生影响，CA19－9的检测特异性较好。

表10特异性结果

2.14单克隆抗体可变区基因与序列

本发明的单克隆抗体4A6的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示；单克隆抗体4G2的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示，重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示。

SEQIDNo.1：

QVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTNYWAQWVKQRPGQGLDWIGAIYPGDGNTRYTHKFKGKATLTADKSSSTAYAQLSSLASEDSGVYYCARGEGNYAWFAYWGQGTTVDDSSA

SEQIDNo.2：

DIELTQSPASLSASVGETVTITCQASENIYSYLAWHQQKQGKSPQLLVYNAKTLAGGVSSRFSAAGSGTHFSLKIKSLQPEDFGIYYCQDDYGILPTFGGGTKLSIKRADAAPTVSIFPP

SEQIDNo.3：

QVKLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTNYWMQWVKQRPGQGLDWIGAIYPGDGNTRYTHKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSGVYYCARGEGNYAWFAYWGQGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

SEQIDNo.4：

DIELTQSPASLSASVGETVTITCQASENIYSYLAWHQQKQGKSPQLLVYNAKTLAGGVSSRFSGSGSGTHFSLKIKSLQPEDFGIYYCQHHYGILPTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

SEQIDNo.5：

QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGVTFTSYDINWVRQRPEQGLEWIDDIFPGDGSTKYNEKFKGKATLMMDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCAREDYYDNSYYFDYWGQGTTLTVS

SEQIDNo.6：

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLVVYQQKPDGTVKSSIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDMSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSS

SEQIDNo.7：

QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYDINWVRQRPEQGLEWIGWIFPGDGSTKYNEKFKGKATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCAREDYYDNSYYFDYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

SEQIDNo.8：

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 河北渤腾医药技术有限公司

<120> 糖类抗原CA19-9的检测试剂盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ala Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Arg Tyr Thr His Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Ala Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Glu Gly Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Asp Asp Ser Ser Ala

115 120

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Gly Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Ala

50 55 60

Ala Gly Ser Gly Thr His Phe Ser Leu Lys Ile Lys Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln Asp Asp Tyr Gly Ile Leu Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ser Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro

115 120

<210> 3

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asn Thr Arg Tyr Thr His Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Glu Gly Asn Tyr Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser

195 200 205

Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys

210 215 220

Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser

260 265 270

Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile

290 295 300

Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn

305 310 315 320

Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys

325 330 335

Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu

340 345 350

Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe

355 360 365

Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala

370 375 380

Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr

385 390 395 400

Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly

405 410 415

Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His

420 425 430

Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 4

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val

35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Gly Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Ser Leu Lys Ile Lys Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Ile Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Ile Leu Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

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Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

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180 185 190

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210

<210> 5

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Val Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Asp Asp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Met Met Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

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Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser

115 120

<210> 6

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Val Val Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Ser Ser Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Met Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

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115 120

<210> 7

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

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<210> 8

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

Claims

1.一种糖类抗原CA19-9的单克隆抗体4A6，其特征在于，所述单克隆抗体4A6的重链可变区具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，所述单克隆抗体4A6的轻链可变区具有SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列。

2.一种糖类抗原CA19-9的单克隆抗体4G2，其特征在于，所述单克隆抗体4G2的重链可变区具有SEQ ID No.5所示的氨基酸序列，所述单克隆抗体4G2的轻链可变区具有SEQ IDNo.6所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的单克隆抗体4A6和/或权利要求2所述的单克隆抗体4G2在制备糖类抗原CA19-9的检测试剂盒中的应用。

4.一种糖类抗原CA19-9的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如权利要求1所述的单克隆抗体4A6和/或权利要求2所述的单克隆抗体4G2。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒为双抗夹心ELISA试剂盒。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体4A6为捕获抗体，所述单克隆抗体4G2为检测抗体。