CN113956355A - 抗人脑利钠肽(bnp)兔单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗人脑利钠肽(bnp)兔单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了兔抗人脑利钠肽(BNP)单克隆抗体OTIR5G8和OTIR5D11,所述的抗体是利用分选特异B细胞并培养筛选及分子克隆重组产生。所述兔单克隆抗体OTIR5G8和OTIR5D11的免疫原分别为人脑利钠肽(BNP)特定表位合成多肽，其OTIR5G8抗体轻链(VL)的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；OTIR5G8抗体的重链(VH)的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。其OTIR5D11轻链(VL)的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示；OTIR5D11的重链(VH)的氨基酸序列如SEQIDNo.12所示。本发明的抗人脑利钠肽(BNP)兔单克隆抗体可应用于检测BNP的各种免疫检测试剂盒的制备，包括但不限于双抗体夹心ELISA或化学发光法试剂盒的制备，为与BNP相关的疾病诊断提供辅助手段，也为下一步工程抗体的制备提供基础。

Description

抗人脑利钠肽(BNP)兔单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及抗人脑利钠肽(BNP)兔单克隆抗体及其在免疫检测方面应用。
背景技术
人BNP由proBNP裂解而来，proBNP裂解后C端为BNP，N端为NT-proBNP。BNP氨基酸序列即为proBNP的77-108氨基酸序列，氨基酸序列则通常记为1-32，是一种3.5KDa的肽段。BNP的理论等电点为10.95。
心力衰竭是一种复杂的临床症状群，是各种心脏病的严重阶段。发病率高，5年存活率与恶性肿瘤相仿。BNP和NT-proB-NP均是心衰诊断及预后的生物标志物。BNP具有利钠利尿，抗醛固酮作用，舒张血管，降低血压作用。BNP属于一类具有类似环状结构的多肽激素家族，该家族还包括ANP、CNP和尿扩张素。该家族的典型结构为一个由一对半胱氨酸之间二硫键所形成的17个氨基酸的环状结构。人BNP的二硫键位置为C10和C26。
BNP是检测心功能衰竭和冠脉病变的重要指标，对临床病情的评估具有重要价值。BNP诊断心力衰竭敏感而且特异，可作为呼吸困难鉴别诊断的一个指标。随着心衰程度的加重，BNP水平逐渐升高。BNP水平在评估心力衰竭的预后和危险分层中具有重要的标志物作用。BNP水平越高，其预后越差。在健康成年人体内，血浆BNP的参考上限为35pg/ml。
中国专利关于BNP兔单克隆抗体的条目基本没有，申请公布号CN 101878225 A涉及特异性性识别序列FGRKMDR的鼠单克隆抗体，由登录号CNCM I-3746杂交瘤产生，不是兔单克隆抗体，同国际专利申请号US20100209939A1。国际专利申请号US2006/0183154 A1(HUMAN RING SPECIFIC ANTIBODIES)公布了hBNP鼠单克隆抗体及多克隆抗体、嵌合抗体，识别BNP的环状结构，由杂交瘤3-631-436产生，未提到兔单克隆抗体及抗体CDR序列。国际专利申请号US 6,677,124B2(MONOCLONAL ANYIBODY RECOGNIZING C-TERMINUS HBNP)公布了C-terminus of hBNP鼠单克隆抗体，由杂交瘤BC203,FERM BP-3515产生，未提到兔单克隆抗体及抗体CDR序列。国际专利申请号US 9,255,930 B2(BNP-SP ANTIBODIES)公布了BNP-SP(17-26)peptide的鼠单克隆抗体及鼠重组抗体细胞系，未提到兔单克隆抗体及抗体CDR序列。
发明内容
本发明的目的是提供特异性好、亲和力高的抗BNP兔单克隆抗体OTIR5G8和OTIR5D11及其在双抗体夹心ELISA或化学发光法制备的免疫检测试剂盒中的应用，为与BNP相关的疾病提供辅助诊断，也为下一步工程抗体的制备提供基础。
所述兔单克隆抗体为兔单克隆抗体OTIR5G8或兔单克隆抗体OTIR5D11。
所述兔单克隆抗体OTIR5G8以26-32aa合成多肽为免疫原，兔单克隆抗体OTIR5D11以11-26aa合成多肽为免疫原。通过免疫注射新西兰大白兔，取免疫兔子外周血单核细胞(PMBCs)，分选特异性B细胞培养、筛选并利用分子克隆重组技术获得。
所述兔单克隆抗体OTIR5G8，其轻链可变区(VL)含110aa，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述抗体的重链(VH)含108aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
所述兔单克隆抗体OTIR5G8，其中VL区域包括3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，抗原决定簇的区域相应地分别为27aa-34aa，52aa-54aa和91aa-100aa。其氨基酸序列分别如SEQ ID No.3-5所示。
所述兔单克隆抗体OTIR5G8，其中VH区域包括3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，抗原决定簇的区域相应地分别为25aa-32aa，50aa-56aa和93aa-97aa。其氨基酸残基序列分别如SEQ ID No.6-8所示。
所述兔单克隆抗体OTIR5D11，其轻链可变区(VL)含109aa，其氨基酸序列如SEQ IDNO.11所示；所述抗体的重链(VH)含107aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
所述兔单克隆抗体OTIR5D11，其中VL区域包括3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，抗原决定簇的区域相应地分别为27aa-34aa，52aa-54aa和91aa-99aa。其氨基酸序列分别如SEQ ID No.13-15所示。
所述兔单克隆抗体OTIR5D11，其中VH区域包括3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，抗原决定簇的区域相应地分别为25aa-32aa，50aa-56aa和93aa-97aa。其氨基酸残基序列分别如SEQIDNo.16-18所示。
所述的兔单克隆抗体包括兔单克隆抗体OTIR5G8或兔单克隆抗体OTIR5D11可以与BNP高特异性结合，可通过本领域技术人员所公知的的方法，制备成检测BNP的各种免疫检测试剂盒。尤其是，应用于双抗体夹心ELISA或化学发光法制备的免疫检测试剂盒中。双抗体夹心ELISA检测BNP标准抗原，检测灵敏度能达到31.25pg/ml；板式化学发光法检测BNP标准抗原，检测灵敏度能达到10pg/ml。
附图说明
图1为兔单克隆抗体OTIR5G8和OTIR5D11重链和轻链全长扩增产物的电泳图，M为DNA分子量Marker。
图2为双抗体夹心ELISA法检测BNP血浆样本，横坐标为BNP血浆样本中BNP浓度，纵坐标为检测的OD值。
图3为双抗体夹心ELISA法检测BNP标准抗原，横坐标为BNP标准抗原浓度，纵坐标为检测的OD值。标准曲线的R2＝0.9962，线性检测范围0-250pg/mL，推出样品浓度计算公式：y＝0.0082x–0.0076。
图4为板式化学发光检测BNP标准抗原，横坐标为BNP标准抗原浓度，纵坐标为检测的化学发光读数。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件、实验室手册中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1:抗BNP兔单克隆抗体的制备
一、BNP免疫原的制备
根据BNP1-32aa序列设计2个免疫原多肽，2个多肽序列分别为26-32aa：CKVLRRH及10-26aa：CFGRKMDRISSSSGLGC，多肽纯度在90％以上，达到了制备单抗的纯度要求。多肽由第三方中肽生化有限公司合成。
二、动物免疫
上述合成的BNP多肽以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下注射方法免疫2kg左右的新西兰大白兔，免疫剂量为500μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为250μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；依据ELISA效价128000时的OD450大于1.0为标准，根据结果判定是否收集PBMCs或是继续免疫，选取抗体效价最高的兔子进行PBMCs收集。
三、PBMCs分离、特异性B细胞分选、克隆重组将兔仰卧固定在手术台上，将心脏部位被毛减掉，用酒精消毒皮肤，选择心搏最明显处用50ml注射器穿刺，针头刺入心脏后即有血液涌入注射器，取得所需血量后迅速将针头拔出，将注射器中的全血转入无菌50ml管中，与等量的PBS混匀后逐滴缓慢的加入到淋巴细胞分离液上方，室温400×g离心30分钟，离心后，液面由上至下分为四层：黄色血浆层、白色薄膜层即单个核细胞层、分离液层及红细胞层，小心吸取单个核细胞层并用PBS洗涤去除血小板和淋巴细胞分离液后即可获得兔PBMCs。从兔PBMCs中继续分选抗原特异性的B细胞进行培养，培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA板筛选阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后提取RNA并反转录成cDNA,天然配对的兔单克隆抗体轻重链全长序列从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，通过克隆重组方法构建兔单克隆抗体表达载体，并经测序确定序列。扩增的全长PCR产物结果如图1。
四、单克隆抗体的制备和纯化为了获得多株识别人BNP蛋白的兔单克隆抗体，本发明将兔单克隆抗体重链、轻链基因装载在表达载体上，将质粒转染KEK293细胞，转染120-144小时获得培养上清中含有重组的识别人BNP蛋白的兔单克隆抗体。收取细胞悬液，离心取上清，亲和层析法进行抗体纯化。以BCA法测定纯化后的单抗浓度，再分装、冻干。
实施例2:抗BNP兔单克隆抗体OTIR5G8或OTIR5D11的鉴定
一、兔单克隆抗体的特异性鉴定
采用间接ELSA法检测。以BNP、NT-proBNP、CTNI、CTNT、BSA等蛋白包被酶标板，浓度为2μg/ml，4℃过夜，以含1％BSA的PBST封闭酶标板，加104倍稀释的纯化抗体，37℃反应50min，PBST洗板3次，加HRP-羊抗兔Ig二抗，37℃反应50min，PBST洗板5次，加TMB显色10min，加终止液，酶标仪测A450。
结果显示，NT-proBNP、CTNI、CTNT、BSA与兔单克隆抗体OTIR5G8或OTIR5D11反应均为阴性，OD450均小于0.1；BNP与OTIR5G8或OTIR5D11抗体反应呈阳性，OD450均值2.85，说明本发明的抗BNP兔单克隆抗体OTIR5G8或OTIR5D11对BNP具有高度特异性。
二、兔单克隆抗体的效价
采用倍比稀释法稀释兔单克隆抗体OTIR5G8或OTIR5D11，用间接ELISA测抗体效价，结果显示本发明涉及的兔单克隆抗体OTIR5G8或OTIR5D11效价分别为6.6×106或1.3×107。
三、抗体配对
为了挑选包被抗体和检测抗体的最佳组合，采用棋盘组合，将26-32aa表位兔单克隆抗体与10-26aa表位兔单克隆抗体相互配对。基本步骤：多株单克隆抗体分别包被酶标板，4℃过夜。第二天取出酶标板，PBST洗涤一次，1％BSA溶液37℃封闭2小时，PBST洗涤3次；每孔加入BNP全长多肽100μl，浓度分别为5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125和0pg/ml，37℃孵育1小时；孵育完成后取出酶标板，PBST洗涤3次，分别加入HRP标记的上述多株抗体作为检测抗体，37℃孵育1小时。PBST洗涤5次，加入TMB底物，37℃显色10min。取出后加终止液，在酶标仪上测定OD450读数。根据样品的OD值与阴性对照的背景值，选出最为理想的兔单克隆抗体对，配对筛选结果见表1。本发明涉及的抗体OTIR5G8作为包被抗体，抗体OTIR5D11作为检测抗体最佳。
表1抗体配对实验筛选结果
Figure BDA0003178773130000051
四、对BNP血浆样本的检测
7个BNP血浆样本，BNP浓度分别为39.7pg/ml、108pg/ml、287pg/ml、425.6pg/ml、1125.7pg/ml、2046.4pg/ml、3287.3pg/ml，以OTIR5G8抗体为包被抗体、OTIR5D11抗体为检测抗体，用上述检测方法检测7个BNP血浆样本，检测结果见表2。本发明所述的兔单克隆抗体可检测不同浓度的BNP血浆样本且检测结果与血浆BNP浓度呈正比。依据表2制作BNP血浆样本检测图，见图2。
表2.双抗体夹心ELISA法检测BNP血浆样本
包被抗体 5G8
pg/ml OD450nm
39.7 0.273
108 0.951
287 1.366
425.6 1.74
1125.7 2.803
2046.3 3.481
3287.3 3.597
0 0.026
检测抗体 5D11
实施例3:兔单克隆抗体OTIR5G8或OTIR5D11可变区基因与氨基酸序列分析
分别以OTIR5G8或OTIR5D11抗体的重组质粒为DNA模板，根据模板上轻链及重链5'端载体序列设计轻链可变区及重链可变区测序引物，采用测序仪ABI3730进行测序。经测序获得兔单克隆抗体OTIR5G8和OTIR5D11轻链及重链可变区核苷酸序列。
利用互联网，在http://www.imgt.org上使用IMGT/V-QUEST分析软件，分别将轻链与重链的核苷酸序列进行测序结果数据分析，得到兔单克隆抗体OTIR5G8的轻链氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，重链氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。VL全长为110个氨基酸，其FR的4个结构域氨基酸数分别为26、17、36和10，CDR的3个结构域氨基酸数分别为8、3和10，CDR1、CDR2和CDR3的区域相应地分别为27aa-34aa，52aa-54aa和91aa-100aa，其氨基酸序列分别:QSVYKNNW、RAS、LGSYDCSSAD。
通过分析，所述兔单克隆抗体OTIR5G8VH全长为108个氨基酸，其FR的4个结构域氨基酸数分别为24、17、36和11，CDR的3个结构域氨基酸数分别为8、7和5，CDR1、CDR2和CDR3分别为25aa-32aa，50aa-56aa和93aa-97aa，其氨基酸序列分别为GFSLISYD、LGSGSSA、ARGTG。
通过分析，所述兔单克隆抗体OTIR5D11的轻链氨基酸序列如SEQIDNO.11所示，重链氨基酸序列如SEQIDNO.12所示。VL全长为109个氨基酸，其FR的4个结构域氨基酸数分别为26、17、36和10，CDR的3个结构域氨基酸数分别为8、3和9，CDR1、CDR2和CDR3的区域相应地分别为27aa-34aa，52aa-54aa和91aa-99aa，其氨基酸序列分别:QSVYDNNA、KAS、LGEYYDDAE。
通过分析，所述兔单克隆抗体OTIR5D11VH全长为107个氨基酸，其FR的4个结构域氨基酸数分别为24、17、36和10，CDR的3个结构域氨基酸数分别为8、7和5，CDR1、CDR2和CDR3分别为25aa-32aa，50aa-56aa和93aa-97aa，其氨基酸序列分别为GFSLSSYA、IDSSGTI、ARGMN。
实施例4:抗BNP兔单克隆抗体OTIR5G8或OTIR5D11用于制备双抗体夹心ELISA检测试剂盒
采用本领域技术人员所公知的基于ELISA双抗体夹心法原理的检测技术，制作BNP检测试剂盒，用于临床上与BNP相关疾病辅助诊断。
一、试剂盒组成
1.包被OTIR5G8抗体的板条：用PBS缓冲液稀释抗体至5μg/ml，包被到微孔板上，每孔100μl，4℃孵育过夜，以PBST洗涤3次，甩干；加含有1％BSA、5％蔗糖、0.05％Proclin300的PBS进行封闭，37℃反应2h，弃去孔内封闭液，甩干；将包被板置于37℃烘箱2h，即完成包被，以铝箔袋密封，存放于4℃保存备用。
2.试剂配制
1.酶结合物配制采用简易过碘酸钠法标记抗BNP兔单克隆抗体OTIR5D11，滴定工作浓度，配制成1:20的浓缩液，稀释液为含1％BSA、5％甘油、0.05％Proclin300的PBS，过滤除菌。
2.洗涤缓冲液为常规的pH7.4的PBST，含0.05％Proclin300，配制成20倍浓缩液。
3.酶的底物液(显色液)单组分TMB(从市场采购)。
4.样本稀释液含1％BSA、0.05％Proclin300的PBS，过滤除菌。
5.终止液用10mlHCl(36-38％)加入110ml蒸馏水中，混合过程需缓慢进行，配置成1N的HCl。
6.标准品合成全长BNP多肽，以含1％BSA、5％蔗糖、10％甘油、0.05％Proclin300的PBS为稀释液，将样品稀释为20μg/ml，过滤除菌，无菌分装。
二、检测操作要点
1、为保证检测结果的准确性，建议标准品及样本均设双孔测定。每次检测均需做标准曲线。
2、如标本中待测物质含量过高，请先用样本稀释液进行稀释，以使样本符合试剂盒的检测范围，最后计算时再乘以相应的稀释倍数。
3、加样：加样时，请使用一次性的洁净吸头，避免交叉污染。加样时应尽量轻缓，避免起泡，将样本加于酶标板孔底部，切勿沿孔壁加样。
4、温育：为防止样本蒸发或污染，温育过程中酶标板必须覆上板贴，实验过程中酶标板应避免处于干燥的状态。温育过程中应随时观察温箱温度是否恒定于37℃，及时调整。温育过程中，温箱不易开启太多次，以免影响温度平衡。
5、洗涤：洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
6、显色：为保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。可在加入底物溶液后每隔一段时间观察一下显色情况以控制反应时间(比如每隔10分钟)。当肉眼可见标准品前3-4孔有明显梯度蓝色，后3-4孔显色不明显时，即可加入终止液终止反应，此时蓝色立刻变为黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
7、底物溶液应为浅蓝色或无色，如果颜色严重变深则必须弃用。底物溶液易受污染，请避光妥善保存。
三、标准BNP抗原不同稀释度标准曲线的确定
上述制备的检测BNP蛋白双抗体夹心ELISA检测试剂盒从4度冰箱取出，平衡到室温。将标准品用PBS从20μg/ml稀释到250pg/ml，制备成0、3.9、7.8、15.625、31.25、62.5、125、250pg/ml共8个系列浓度标准品，按照上述的检测方法在每孔中加入标准品100μl，进行温育，然后弃去液体，加入HRP标记的检测抗体工作液进行温育，弃去孔内液体，甩干后每孔加入底物溶液，避光显色后每孔加入终止溶液，在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的光密度OD值做标准曲线，结果见表3。依据表3制作BNP检测标准曲线，见附图3。标准曲线的R2＝0.9962，线性检测范围0-250pg/mL，推出样品浓度计算公式：y＝0.0082x–0.0076。检测灵敏度能达到31.25pg/ml。
表3.双抗体夹心ELISA法检测BNP标准品
包被抗体 5G8
pg/ml OD450nm
250 2.004
125 1.112
62.5 0.529
31.25 0.224
15.625 0.086
7.8125 0.033
3.90625 0.024
0 0.010
检测抗体 5D11
实施例5：抗BNP兔单克隆抗体OTIR5G8或OTIR5D11用于板式化学发光免疫检测
采用本领域技术人员所公知的基于双抗体夹心法原理的板式化学发光免疫检测技术，制作BNP检测试剂盒，用于临床上与BNP相关疾病辅助诊断。
一、检测原理与方法
采用基于双抗体夹心法原理的板式化学发光免疫检测技术。在不透光的白色微孔板内包被抗BNP的兔单克隆抗体OTIR5G8，将封闭好的包被板放置到科斯迈全自动发化学发光仪上，设置仪器程序，将标准品或待测标本与辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔单克隆抗体OTIR5D11同时进行温育，则三者形成抗体-抗原-抗体复合物。洗涤除去未结合的物质，加入北京科跃中楷化学发光底物，反应10min后科斯迈全自动发化学发光仪显示化学发光值。依据信噪比大于2.0判读结果为阳性。发光值的大小反映了结合的酶标抗体的量，它与标本中的BNP的浓度成正比。根据所测定的标准品的发光值绘制标准曲线,待测标本中的BNP浓度值即可从标准曲线上获得。
二、检测BNP的板式化学发光检测试剂盒组成
1.包被OTIR5G8抗体的板条：同实施例4。
2.试剂配制
1.酶结合物配制同实施例4。
2.洗涤缓冲液同实施例4。。
3.化学发光显色液A液和B液，购于北京科跃中楷生物技术有限公司。
4.样本稀释液含1％BSA、0.05％Proclin300的PBST，过滤除菌。
5.标准品合成全长BNP多肽，以含1％BSA、5％蔗糖、10％甘油、0.05％Proclin300的PBS为稀释液，将样品稀释为5μg/ml，过滤除菌，无菌分装。
三、对BNP标准抗原的检测
把BNP标准抗原进行梯度稀释，分别为0pg/ml、10pg/ml、30pg/ml、100pg/ml、300pg/ml、1000pg/ml，以OTIR5G8抗体为包被抗体、OTIR5D11抗体为检测抗体，用上述检测方法检测6个梯度稀释的抗原，检测结果见表4。根据信噪比大于2.0判定，本发明所述的兔单克隆抗体用于板式化学发光免疫检测试剂，最低灵敏度为10pg/ml，线性范围为10-1000pg/ml。依据表4制作BNP检测标准曲线，见图4
表4.板式化学发光法检测BNP标准抗原
Figure BDA0003178773130000101
序列表
<110> 无锡傲锐东源生物科技有限公司
<120>抗人脑利钠肽（BNP）兔单克隆抗体及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 110
<212> PRT
<213> Oryctolaguscuniculus (rabbit)
<400> 1
Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Lys Asn
20 25 30
Asn Trp Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Leu Lys Arg
35 40 45
Leu Thr Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60 65
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val
70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Ser Tyr Asp Cys
85 90 95
Ser Ser Ala Asp Phe Gly Gly Gly Thr Glu Met Val Val Lys
100 105 110
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> Oryctolaguscuniculus (rabbit)
<400> 2
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ile Ser Tyr Asp
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Phe Leu Gly Ser Gly Ser Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Thr
85 90 95
Gly Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> Oryctolaguscuniculus (rabbit)
<400> 3
Gln Ser Val Tyr Lys Asn Asn Trp
1 5
<210> 4
<211> 3
<212> PRT
<213> Oryctolaguscuniculus (rabbit)
<400> 4
Arg Ala Ser
1
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Oryctolaguscuniculus (rabbit)
<400> 5
Leu Gly Ser Tyr Asp Cys Ser Ser Ala Asp
1 5 10
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Oryctolaguscuniculus (rabbit)
<400> 6
Gly Phe Ser Leu Ile Ser Tyr Asp
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Oryctolaguscuniculus (rabbit)
<400> 7
Leu Gly Ser Gly Ser Ser Ala
1 5
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> Oryctolaguscuniculus (rabbit)
<400> 8
Ala Arg Gly Thr Gly
1 5
<110> 无锡傲锐东源生物科技有限公司
<120>抗人脑利钠肽（BNP）兔单克隆抗体及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 11
<211> 109
<212> PRT
<213> Oryctolaguscuniculus (rabbit)
<400> 11
Ala Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asp Asn
20 25 30
Asn Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Arg
35 40 45
Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65 70 75 80
Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Glu Tyr Tyr Asp
85 90 95
Asp Ala Glu Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> Oryctolaguscuniculus (rabbit)
<400> 12
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Asp Ser Ser Gly Thr Ile Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Thr
65 70 75 80
Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Met
85 90 95
Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> Oryctolaguscuniculus (rabbit)
<400> 13
Gln Ser Val Tyr Asp Asn Asn Ala
1 5
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> Oryctolaguscuniculus (rabbit)
<400> 14
Lys Ala Ser
1
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> Oryctolaguscuniculus (rabbit)
<400> 15
Leu Gly Glu Tyr Tyr Asp Asp Ala Glu
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> Oryctolaguscuniculus (rabbit)
<400> 16
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> Oryctolaguscuniculus (rabbit)
<400> 17
Ile Asp Ser Ser Gly Thr Ile
1 5
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> Oryctolaguscuniculus (rabbit)
<400> 18
Ala Arg Gly Met Asn
1 5

Claims (9)

1.抗人脑利钠肽(BNP)的兔单克隆抗体，其特征在于：所述兔单克隆抗体为兔单克隆抗体OTIR5G8或兔单克隆抗体OTIR5D11。
2.根据权利要求1所述的抗人脑利钠肽(BNP)兔单克隆抗体OTIR5G8和兔单克隆抗体OTIR5D11，其特征在于：兔单克隆抗体OTIR5G8以26-32aa合成多肽为免疫原，兔单克隆抗体OTIR5D11以11-26aa合成多肽为免疫原。通过免疫注射新西兰大白兔，取免疫兔子外周血单核细胞(PMBCs)，分选特异性B细胞培养、筛选并利用分子克隆重组技术获得。
3.根据权利要求1所述的抗人脑利钠肽(BNP)兔单克隆抗体OTIR5G8，其特征在于:其轻链可变区(VL)含110aa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述抗体的重链(VH)含108aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.根据权利要求1所述的抗人脑利钠肽(BNP)兔单克隆抗体OTIR5G8，其中VL区域包括3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，抗原决定簇的区域相应地分别为27aa-34aa，52aa-54aa和91aa-100aa。其氨基酸序列分别如SEQ ID No.3-5所示。
5.根据权利要求1所述的抗人脑利钠肽(BNP)兔单克隆抗体OTIR5G8，其中VH区域包括3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，抗原决定簇的区域相应地分别为25aa-32aa，50aa-56aa和93aa-97aa。其氨基酸残基序列分别如SEQ ID No.6-8所示。
6.根据权利要求1所述的抗人脑利钠肽(BNP)兔单克隆抗体OTIR5D11，其特征在于:其轻链可变区(VL)含109aa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述抗体的重链(VH)含107aa，其氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。
7.根据权利要求1所述的抗人脑利钠肽(BNP)兔单克隆抗体OTIR5D11，其中VL区域包括3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，抗原决定簇的区域相应地分别为27aa-34aa，52aa-54aa和91aa-99aa。其氨基酸序列分别如SEQ ID No.13-15所示。
8.根据权利要求1所述的抗人脑利钠肽(BNP)兔单克隆抗体OTIR5D11，其中VH区域包括3个抗原决定簇：CDR1、CDR2和CDR3，抗原决定簇的区域相应地分别为25aa-32aa，50aa-56aa和93aa-97aa。其氨基酸残基序列分别如SEQ ID No.16-18所示。
9.权利要求1所述的抗人脑利钠肽(BNP)兔单克隆抗体的应用，其特征在于:用于人脑利钠肽(BNP)免疫检测试剂盒的制备，包括但不限于双抗体夹心ELISA法和化学发光免疫检测试剂盒。
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