CN109678958A

CN109678958A - 一种人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体及其制备方法和应用

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Publication number: CN109678958A
Application number: CN201910096758.2A
Authority: CN
Inventors: 徐淞; 胡川闽; 秦意力; 范舒; 普秀琼; 刘静; 艾海燕
Original assignee: CHONGQING TANSHENG TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHONGQING TANSHENG TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2019-04-26
Anticipated expiration: 2039-01-31
Also published as: CN109678958B

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种人脑钠肽原N端肽(NT‑proBNP)特异性的重组羊单克隆抗体及其制备方法和应用，所述人NT‑proBNP特异性重组羊单克隆抗体包括羊单链抗体scFv和人IgG的Fc段；其中，所述羊单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明可以实现重组抗体的低成本、高效率、高质量的大量制备，且得到的抗体对人NT‑proBNP具有高度的亲和力，从而为制备更加质优价廉的人NT‑proBNP免疫检测试剂盒奠定核心原料基础。

Description

一种人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及人脑钠肽原N端肽(NT-proBNP)特异性的重组羊单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

心血管疾病是严重威胁人类生命和健康的重要疾病。其中，心力衰竭(HeartFailure,HF)作为严重危害人类健康的心血管疾病中的一种病理综合症，是心血管疾病发展到后期的一个阶段，即从始发危险因子(高血压、高胆固醇血症、糖尿病等)到左心室肥大、心肌细胞功能紊乱、冠心病，最后发展成为心力衰竭。由于我国冠心病和高血压发病仍呈上升趋势，人口老龄化趋势明显，心力衰竭正成为我国心血管领域的重要公共健康问题，其早期诊断和早期治疗极为重要。

目前认为，脑钠肽(BNP)和脑钠肽原N端肽(NT-proBNP)是心力衰竭的最佳生物标志物。BNP是32个氨基酸的多肽，是从前体蛋白脑钠肽原(pro-BNP)的羧基端裂解而来，同时产生76个氨基酸非活性的N末端脑钠尿肽原(NT-proBNP)。越来越多的研究发现表明血浆BNP和NT-pro BNP浓度的升高对于心衰的诊断具有很高敏感性，可作为心力衰竭诊断的敏感指标，并能评估心功能损害严重程度。NT-proBNP和BNP为等摩尔释放，因此二者在心血管系统疾病的诊断、治疗监测和预后方面有着相似的临床应用。但与BNP相比，NT-proBNP因其半衰期长(半衰期为120min)、心衰时升高幅度大而更有利于临床应用。早在2002年，国际上已经公认NT-proBNP是测定心衰的一个划时代的具有特异性的标志物。迄今，NT-proBNP的检测广泛应用于心力衰竭的诊断、鉴别诊断、疗效观察和预后判断。

目前检测样本中的NT-proBNP均采用免疫学方法，即通过特异性的抗体与样本中NT-proBNP结合才进行检测，包括固相酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金免疫层析、荧光免疫层析、免疫化学发光分析等。所有这些分析方法都会用到NT-proBNP特异性抗体。早期曾应用来源于小鼠、羊的多克隆抗体，后来更多应用小鼠单克隆抗体，也有应用兔单克隆抗体的情况。小鼠来源的NT-proBNP特异性单克隆抗体是目前NT-proBNP检测试剂中应用最为广泛的抗体。

相比多克隆抗体，单克隆抗体在特异性、稳定性等性能参数上有明显的提升，也就导致了相应的免疫检测试剂盒的检测性能有了很大程度的保障，能广泛应用于临床。但是在单克隆抗体的制备过程中，存在杂交瘤筛选比较复杂、杂交瘤细胞保存成本较高、需要喂养实验小鼠等情况。目前应用较多的小鼠腹水诱生法制备单克隆抗体存在不同程度的批间差异，从而给产品的质量控制带来更大的工作量。就此而言，基于基因工程技术制备的重组抗体相比于传统的单克隆抗体更具优势，一旦获得相应的氨基酸编码序列和表达质粒，就可以通过原核生物或真核生物进行大批量生产，从而实现抗体的低成本、高效率、高质量的大量制备。

发明内容

本发明的目的在于实现人NT-proBNP特异性单克隆抗体的低成本、高效率、高质量的大量制备，从而提供人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体及其应用。

目前，羊多克隆抗体已经广泛应用于生物医学研究、临床检测和临床治疗等诸多方面。且研究发现，羊的免疫系统与人、鼠等的免疫系统存在一定程度的差异，其本身具有更大的产生高亲和力抗体的潜力。有实验表明，基于羊的B淋巴细胞和小鼠的骨髓瘤细胞建立的异源杂交瘤细胞产生的羊单克隆抗体具有很高的亲和力。本发明的人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体正是基于羊来源的重组抗体，其既能解决传统单克隆抗体的诸多不足，又能够制备高亲和力抗体，实现对低浓度靶标的低成本、高效益准确测定。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体，所述人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体包括羊单链抗体scFv和人IgG的Fc段；其中，所述羊单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明第二方面提供了编码第一方面所述的羊单链抗体scFv的基因。

本发明第三方面提供了一种表达载体，该表达载体包括第二方面所述的基因。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，该宿主细胞转化有第三方面所述的表达载体。

本发明第五方面提供了第一方面所述的羊单克隆抗体、第二方面所述的基因、第三方面所述的载体或第四方面所述的宿主细胞在制备用于检测人NT-proBNP的产品中的应用。

本发明第六方面提供了第一方面所述的羊单克隆抗体、第二方面所述的基因、第三方面所述的载体或第四方面所述的宿主细胞在制备用于诊断心力衰竭的产品中的应用。

本发明第七方面提供了一种人NT-proBNP免疫检测用试剂盒，该试剂盒包括第一方面所述的人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体。

本发明第八方面提供了一种(非诊断目的地)检测样本中人NT-proBNP的方法，该方法包括使用第一方面所述的人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体对样本进行双抗体夹心ELISA检测。

本发明第九方面提供一种人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体的制备方法，该方法包括：

(1)将人NT-proBNP中的B细胞表位肽和BSA偶联，将偶联产物免疫羊，之后分离羊脾细胞，提取总RNA，并反转录制备cDNA；

(2)以cDNA为模板，扩增羊IgG轻链和重链可变区基因，然后将二者连接，获得羊单链抗体编码基因；

(3)将步骤(2)获得的羊单链抗体编码基因插入噬菌粒载体中，构建免疫抗体库；通过噬菌体展示和抗原特异性淘选，获得特异性结合人NT-proBNP的羊单链抗体scFv；

(4)将编码所述羊单链抗体scFv的DNA片段连接人IgG Fc段编码片段后亚克隆入真核表达载体中，构建重组质粒，将重组质粒转染宿主细胞表达，获得所述人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体。

本发明中，应用人NT-proBNP来源的B细胞表位肽偶联载体蛋白(牛血清白蛋白)后免疫波尔羊，分离羊的脾细胞，提取总RNA，构建免疫抗体库，通过噬菌体展示和淘选技术，制备了能和人NT-proBNP特异性结合的scFv。将此单链抗体的编码基因连接人IgG的Fc编码基因后，亚克隆入真核表达载体，转染宿主细胞，就可以实现重组抗体的低成本、高效率、高质量的大量制备，且得到的抗体对人NT-proBNP具有高度的亲和力，从而为制备更加质优价廉的人NT-proBNP免疫检测试剂盒奠定核心原料基础。

附图说明

图1为双抗体夹心ELISA法检测人NT-proBNP校准品的校准曲线(NT-proBNP浓度与450nm处的吸光度)；

图2为本发明检测结果与Roche公司试剂盒检测结果的比较。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供一种人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体，所述羊单克隆抗体包括羊单链抗体scFv和人IgG的Fc段；其中，所述羊单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQID NO：1所示。

SEQ ID NO：1所示的羊单链抗体scFv的氨基酸序列如下：

MALSQVRLQESGPSLVKPSQTLSLTCTVSGPSLTDYDVDWVRQAPGKALEWLGFINQGAPTGYDPALKSRLSITRDTSKSQVSLSLSSMTAEDTAVYYCARGAILGWGRGLLVTVSSQGSTSGSGKPGSGEGSTKGGQAVLTQPASVSGSPGQTVTISCTGTSGDIAGYNLVGWYQQLPNSAPKTLIYDVSTRRSGIPARFSGSKSGNTATLTISGLQAEDEADYYCSTSISANSVGFGSGTRLTVLGQPKSAPS(SEQ ID NO：1)。

根据本发明一种具体的实施方式，所述人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体由所述羊单链抗体scFv和人IgG的Fc段组成。

根据本发明，所述人IgG的Fc段的选择并没有特别的限制，可以为现有技术中公知的各种人IgG的Fc段。根据本发明一种具体的实施方式，所述人IgG的Fc段的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

SEQ ID NO：3所示的人IgG的Fc段氨基酸序列如下：

ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：3)。

第二方面，本发明还提供了编码第一方面所述的羊单链抗体scFv的基因。

本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或Trp(TGG)分别为单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989，见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性，决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，三联体密码子中第三个核苷酸的置换，往往不会改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本领域人员根据公知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，完全可以推导出能够编码它们的基因的核苷酸序列，通过生物学方法(如PCR方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核苷酸序列，因此该部分核苷酸序列都应该包括在本发明范围内。相反，也可以利用本文公开的DNA序列，通过本领域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)，通过修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述木糖异构酶活性一致的氨基酸序列。

根据本发明一种优选的实施方式，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

SEQ ID NO：2所示的羊单链抗体scFv的核苷酸序列如下：

atggctctgtcccaggtgcggctgcaggagtcgggacccagcctagtgaagccctcacagaccctctccctcacctgcacggtctctggaccctcattaaccgactatgacgtggactgggtccgccaggctccaggaaaggcgctggagtggcttggttttataaaccagggtgcacctacgggctatgacccggccctgaaatcccgtctcagcatcaccagggacacctccaagagccaagtctccctgtcactgagcagcatgacagcggaggacacggccgtgtactattgtgcaagaggtgctatattgggctggggccgaggactcctggtcaccgtctcctcacagggttccacttctggttctggtaaaccgggctctggtgaaggttccactaaaggtggccaggctgtgctaactcagcctgcctcagtgtcggggagtccaggacagacggtcaccatctcctgtactggcaccagcggtgacatcgcgggttataatctagttggctggtaccaacagctcccgaactcagcccccaaaactctgatttatgatgtcagcacgcggcgctcagggatccctgctcggttctctggctccaagtccgggaacacagccaccctgaccatctctggccttcaggccgaggacgaggccgactattactgcagcacatctataagtgctaattctgttggtttcggcagcgggaccaggctgaccgtcctgggtcagcccaagtccgcaccctcg(SEQ ID NO：2)

根据本发明，所述人IgG的Fc段的核苷酸序列并没有特别的限制，可以为现有技术中公知的各种人IgG的Fc段的核苷酸序列。根据本发明一种具体的实施方式，所述人IgG的Fc段的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

SEQ ID NO：4所示人IgG的Fc段的核苷酸序列如下：

gagtctaagtacggccctccctgcccttcttgtcctgctcctgaatttcttggcggcccttccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaactccacctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaagggcctgcccagctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgcctccaagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaaaggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctccttcttcctgtactcccgcctgaccgtggacaagtccagatggcaggaaggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgtctctgggaaag(SEQ ID NO：4)。

第三方面，本发明提供一种表达载体，该表达载体包括如上所述的基因。

根据本发明，所述表达载体可以为插入有上述基因的pcDNA3.1载体。

第四方面，本发明提供一种宿主细胞，该宿主细胞含有如上所述的表达载体。

根据本发明，所述宿主细胞可以是HEK293F细胞。

第五方面，本发明提供了第一方面所述的羊单克隆抗体、第二方面所述的基因、第三方面所述的载体或第四方面所述的宿主细胞在制备用于检测人NT-proBNP的产品中的应用。

第六方面，本发明提供了第一方面所述的羊单克隆抗体、第二方面所述的基因、第三方面所述的载体或第四方面所述的宿主细胞在制备用于诊断心力衰竭的产品中的应用。

第七方面，本发明提供了一种人NT-proBNP免疫检测用试剂盒，该试剂盒包括第一方面所述的人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体。

根据本发明，所述试剂盒可以为双抗体夹心ELISA原理的人NT-proBNP的检测用试剂盒，可以含有实施双抗体夹心ELISA所需的各种试剂，这些均是本领域技术人员所公知的，所述试剂盒例如还可以包括一种洗液、稀释液、辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗人NT-proBNP单克隆抗体、HRP的显色底物、反应终止液等。

第八方面，本发明提供了一种(非诊断目的地)检测样本中人NT-proBNP的方法，该方法包括使用第一方面所述的人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体对样本进行双抗体夹心ELISA检测。

根据本发明一种具体的实施方式，上述检测方法包括：应用本发明提供的人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体包被酶标板孔；将待测样本适当稀释后加入酶标板孔，孵育后洗涤，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗人NT-proBNP单克隆抗体；孵育后洗涤，加入HRP的显色底物(TMB)；孵育后终止反应，酶标仪450nm比色，吸光度的大小与样本中的人NT-proBNP浓度正相关。

第九方面，本发明提供一种人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体的制备方法，该方法包括：

(4)将编码所述羊单链抗体scFv的DNA片段连接人IgG Fc段编码片段后亚克隆入真核表达载体中，构建重组质粒，将重组质粒转染宿主细胞表达，获得所述人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体；

优选的，步骤(1)中，所述B细胞表位肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：5和/或SEQ IDNO：6。

根据本发明一种具体的实施方式，所述人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体的方法包括：

(1)使用化学合成的人NT-proBNP中B细胞表位肽偶联BSA后免疫波尔羊；分离羊脾细胞并提取总RNA，应用反转录技术制备cDNA；

(2)以cDNA为模板，分别合成羊IgG重链编码序列和轻链编码序列，应用重叠延伸PCR技术连接重链编码序列和轻链编码序列；

(3)将步骤(2)连接后获得的编码序列插入噬菌粒载体中，构建免疫抗体库；通过噬菌体展示和抗原特异性淘选，筛选得到特异性结合人NT-proBNP的单链抗体；

(4)将编码上述人NT-proBNP的单链抗体的DNA片段连接人IgG Fc段编码片段后亚克隆入真核表达载体中，构建重组质粒，将重组质粒转染宿主细胞表达，亲和纯化细胞培养上清即可得到人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体。

根据本发明一种更为具体的实施方式，上述制备方法包括：

(1)化学合成人NT-proBNP中的B细胞表位肽和BSA偶联，免疫波尔羊；分离羊脾细胞，提取总RNA，应用反转录技术制备cDNA；

(2)以cDNA为模板，分别应用羊IgG轻链和重链可变区特异性引物通过PCR扩增出羊IgG轻链和重链可变区基因，再通过重叠PCR将二者连接起来成为羊单链抗体编码基因；

(3)将步骤(2)连接后获得的编码序列插入噬菌粒载体中，构建免疫抗体库；通过噬菌体展示和抗原特异性淘选，获得能特异性结合人NT-proBNP的单链抗体；

(4)将编码该人NT-proBNP的单链抗体的DNA片段与编码人IgG Fc段的DNA片段连接起来并亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1中，构建质粒pcDNA3.1-NT；将质粒转染哺乳动物细胞HEK293F，对细胞培养上清亲和纯化，得到人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体。

根据本发明，以上各步骤中涉及到的具体方法均可采用本领域常规的方法，其中，羊IgG轻链和重链可变区特异性引物可以采用Journal of Immunological Methods 236(2000)133–146，Tab1中公开的引物为基础更改为如下表1中的引物，重叠延伸PCR技术的引物可以如下表2所示。扩增时，以重链扩增为例，每一条正向引物对应3条反向引物，共12个反应，轻链同理。

表1

注：序列中的冗余碱基：M＝A/C,R＝A/G,W＝A/T,S＝C/G,Y＝C/T,K＝G/T,V＝A/C/G,B＝C/G/T.

表2

正向引物	TATATATATAATTATGGCCTCCCTGGCC(SEQ ID NO：28)
		反向引物	AATGAATAAATAGGCCAGGCCGGCCGTTCT(SEQ ID NO：29)

根据本发明，所述人NT-proBNP中的B细胞表位肽的氨基酸序列优选为SEQ ID NO：5(HPLGSPGSASDLETSG)和/或SEQ ID NO：6(QRNHLQGKLSELQVE)。

此外，可以直接通过人工合成编码本发明第一方面所述羊单链抗体scFv(SEQ IDNO：1)的DNA片段(SEQ ID NO：2)，然后连接人IgG Fc段编码片段后亚克隆入真核表达载体中，构建重组质粒，将重组质粒转染宿主细胞表达，获得本发明的所述人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体。

根据本发明，羊单链抗体scFv(SEQ ID NO：1)的DNA片段(SEQ ID NO：2)连接人IgGFc段编码片段的方法可以按照本领域公知的各种方法进行，例如，可以使用scFv片段扩增引物(引物序列参见表3，SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34)扩增相应scFv片段(SEQ ID NO：2)，使用人IgG Fc段扩增引物(引物序列参见表3，SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36)扩增人IgG Fc段(SEQ ID NO：4)，应用重叠延伸PCR技术(splicing by overlap extension PCR，简称SOE PCR)将二者连接起来，引物序列采用表3中SEQ ID NO：33所示正向引物(含有EcoRI酶切位点，gaattc,SEQ ID NO：31)和SEQ ID NO：36所示反向引物(含有NotI酶切位点，gcggccgc,SEQ ID NO：32)，采用酶切位点，扩增产物经酶切回收后获得连接产物。

表3

实施例

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，室温指“～25℃”。

实施例1

该实施例用来说明人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体的制备

(1)免疫原的制备

应用在线B细胞表位预测软件(http://tools.immuneepitope.org/bcell/)，分析人NT-proBNP中潜在的B细胞表位优势抗原表位，选择2条多肽作为免疫原：肽1(氨基酸序列为HPLGSPGSASDLETSG，SEQ ID NO：5)和肽2(氨基酸序列为QRNHLQGKLSELQVE，SEQ ID NO：6)。由吉尔生化(上海)有限公司化学合成并与牛血清白蛋白(BSA)通过N端氨基偶联。

(2)免疫抗体库的制备

①将合成的表位肽-BSA偶联物与等量的弗氏完全佐剂(Sigma公司)通过双注射器互推法乳化，以双后腿皮下多点注射途径对1只成年波尔羊进行基础免疫(免疫量：0.2mg)；1月后，将表位肽-BSA偶联物与等量的弗氏不完全佐剂(Sigma公司)乳化，以双后腿皮下多点注射途径对羊进行追加免疫(免疫量：0.2mg)；再过1月左右，同法追加免疫1次；再过1月，取羊耳缘静脉血，免疫原包被酶标板，常规间接ELISA测定羊血清中的抗体效价，如效价超过1:25万，则处死羊取出脾脏，研磨法分离脾细胞，Trizol(购自Sigma公司)法制备小鼠脾细胞总RNA，并反转录成cDNA(反转录试剂购自Promega公司)。

②以cDNA为模板，分别应用羊IgG轻链特异性引物和重链特异性引物(引物序列参见表1，由上海英骏生物技术有限公司合成，扩增时，以重链扩增为例，每一条正向引物对应3条反向引物，共12个反应，轻链同理)，通过PCR分别合成羊的IgG重链可变区编码序列和轻链可变区编码序列(PCR试剂盒购自NEB公司)；应用重叠延伸PCR技术(splicing byoverlap extension PCR，简称SOE PCR，引物序列参见表2)，将二者连接起来，带上sfiI酶切位点(ggcctccctggcc/ggccaggccggcc，SEQ ID NO：30)；PCR产物电泳回收后亚克隆入噬菌粒载体pComb3xxs，电转入感受态OminiMAX中，构建羊单链抗体库；该细菌培养体系中加入辅助噬菌体M13K07(NEB公司)共培养，收集培养上清，过滤除菌后即为噬菌体抗体库。

(3)人NT-proBNP特异性羊单链抗体的淘选

①应用重组表达的人NT-proBNP(购自重庆探生科技有限公司)包被免疫管，4℃静置或振荡过夜。封闭洗涤后加入培养的噬菌体，孵育后洗涤除去未结合成分，用0.1M HCl溶解特异性结合的噬菌体，接种于感受态大肠杆菌OMNImax培养物中，37℃过夜培养，收集培养上清，应用PEG-NaCl沉淀，离心后用PBS重悬沉淀，以此为样本进行下一轮淘选，总共进行3轮淘选，淘选产物铺平板(2YT/Tet/carb)培养。

②应用人NT-proBNP(购自重庆探生科技有限公司)4℃过夜包被酶标板，封闭后洗涤，加入过夜培养的单克隆噬菌体培养物(第3轮淘选产物)孵育后洗涤，加入HRP标记的噬菌体特异性抗体(购自Abcam公司)，孵育后洗涤，加入HRP底物TMB(购自Sigma公司)显色(此为噬菌体ELISA)，H₂SO₄终止反应后450nm处比色。挑取呈强阳性反应的克隆进行DNA测序验证(上海英骏生物技术有限公司)，获得SEQ ID NO：2所示的scFv编码片段。

(4)人NT-proBNP特异性羊单克隆抗体表达载体的制备

根据测序结果，化学合成相应的scFv编码片段(SEQ ID NO：2，上海英骏生物技术有限公司)，使用scFv片段扩增引物(引物序列参见表3，SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34)扩增相应scFv片段(SEQ ID NO：2)，使用人IgG Fc段扩增引物(引物序列参见表3，SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36)扩增人IgG Fc段(SEQ ID NO：4)，应用重叠延伸PCR技术(splicing byoverlap extension PCR，简称SOE PCR)将二者连接起来，引物序列采用表3中SEQ ID NO：33所示正向引物(含有EcoRI酶切位点，gaattc,SEQ ID NO：31)和SEQ ID NO：36所示反向引物(含有NotI酶切位点，gcggccgc,SEQ ID NO：32)，采用酶切位点，扩增产物经酶切回收后获得连接产物，并亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(Invitrogen公司)中，构建真核表达质粒pcDNA3.1-NT。经DNA双酶切和DNA测序鉴定，选取正确的克隆进行蛋白的表达和纯化。(5)人NT-proBNP特异性羊单克隆抗体的表达、纯化与鉴定

应用高效真核表达系统Expi293F^TM Expression System Kit(购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司)进行人NT-proBNP特异性羊单克隆抗体的表达，按照说明书操作，简述如下：

①使用70％乙醇常规清洁细胞冻存管后，于超净工作台中，快速融化细胞，将管中293F细胞全部转入容量为125mL的细胞培养瓶中，瓶中含有29mL预温的细胞培养基(试剂盒自带的Expi293^TM Expression Medium)。

②常规细胞计数和台盼蓝拒染法判断细胞的活率，要求细胞数在0.3×106/mL，细胞活率超过90％。

③旋转培养细胞，条件为温度37℃，饱和湿度，CO2浓度8％，水平旋转速度125r/m。

④培养约3天，细胞数超过1×10⁶/mL，用细胞培养基Expi293^TM ExpressionMedium稀释，细胞密度约为0.4×10⁶/mL，容积为125mL的锥形培养瓶，培养体积不超过50mL，培养条件同上，常规培养。

⑤每3～4天，细胞密度达到4×106/mL，同上稀释细胞至约为0.4×106/mL，继续培养。

⑥进行转染时，于容积为125mL的锥形细胞培养瓶中，加入细胞培养基Expi293^TMExpression Medium 25.5mL，加入状态良好的293F细胞总量7.5×10⁷，细胞密度为2.9×10⁶/mL；用试剂盒自带的低血清培养基(I Reduced-Serum Medium)稀释30μg质粒pcDNA3.1-NT至1.5mL，混匀；用I Reduced-Serum Medium培养基稀释81μL转染试剂(试剂盒自带的ExpiFectamine^TM 293Reagent)至1.5mL，室温孵育5min；将稀释后的质粒和稀释后的转染试剂混合，混匀，室温孵育20min；将该混合物转入细胞培养瓶中，总体积为28.5mL；按照上述方法进行旋转培养。

⑦培养20小时后，往细胞培养瓶中加入150μL增强剂1(试剂盒自带的ExpiFectamine^TM 293Transfection Enhancer 1)和1.5mL增强剂2(试剂盒自带的ExpiFectamine^TM 293Transfection Enhancer 2)，总体积为30mL，按照上述方法常规培养。

⑧培养10天，收集细胞，离心，收集细胞培养上清。用protein G柱(购自GEHealthcare)常规纯化细胞培养上清中的抗体蛋白，透析至PBS缓冲液中，用BCA法(试剂购自碧云天生物)常规进行蛋白定量测定，常规SDS-PAGE加考马斯亮蓝染色鉴定抗体纯度。

⑨间接ELISA法鉴定NT-proBNP特异性单链抗体：将纯化的真核重组表达NT-proBNP(购自重庆探生科技有限公司)包被稀释液稀释至5μg/mL，往酶标板每孔加入100μL，4℃包被过夜。次日取出酶标板，弃抗原，洗板。将待鉴定羊单克隆抗体作1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000等稀释，按100μL/孔加入对应条孔中，另作空白及阴性、阳性对照孔。37℃孵育1小时，洗板，加入HRP标记山羊抗人IgG(1:3000，购自北京中杉金桥)，按100μL/孔加入对应条孔中，37℃孵育40分钟。弃液，洗板，拍干，加入TMB底物显色液(Sigma公司)100μL/孔，避光显色10分钟，加入终止液(2M H₂SO₄，分析纯)50μL/孔。在450nm处测定吸光度值，判断羊单克隆抗体的滴度(呈现阳性结果的最大稀释倍数)。

实施例2

本实施例用来说明双抗体夹心ELISA法检测样本中人NT-proBNP的方法

(1)人NT-proBNP特异性羊单克隆抗体包被酶标板

①取NT-proBNP特异性羊单克隆抗体用包被液(NaHCO₃ 2.93g，Na₂CO₃ 1.59g，双蒸水溶解，总体积1L，pH 9.6，分析纯)稀释至5μg/mL，每块酶标板准备24mL；加入到96孔酶标板中，每孔200μL；贴上封条，4℃包被过夜。

②甩掉抗原，干净自来水清洗酶标板5次，洗涤完成后在吸水纸上轻敲数下至无明显液体残留；用洗液(Na₂HPO₄ 0.14g，Tween-20 1mL，双蒸水定容至1L，分析纯)配制5％的牛血清白蛋白(购自碧云天生物)，每孔加300μL，室温放置2h；甩掉孔内溶液，洗液洗涤3次，甩干备用。

(2)人NT-proBNP的检测

往包被、封闭好的酶标板中加入待测样本，包括经过系列稀释的重组人NT-proBNP(NT-proBNP校准品，购自重庆探生科技有限公司)和临床血清样本(收自重庆新桥医院)，每孔50μL；加入HRP标记的小鼠抗NT-proBNP单克隆抗体(购自重庆探生科技有限公司，克隆号6C7)。每孔100μL；封板，37℃孵育1小时；用洗液洗板5次，拍干，加入HRP的显色底物TMB溶液(购自Sigma公司)，每孔100μL，室温孵育10min；每孔加入反应终止液(2M H₂SO₄，分析纯)50μL；450nm处，酶标仪读取并记录各孔的吸光度值(如表4所示)；建立NT-proBNP校准品的免疫检测标准曲线，如图1所示，计算样本中人NT-proBNP的浓度。

表4

NT-proBNP(ng/L)	35	17.5	8.75	4.375	2.1875	1.09375	0.546875	0.273438	0
										A450	2.84	1.64	1.065	0.494	0.242	0.162	0.103	0.09	0.086

同时采用Roche公司试剂盒检测上述临床血清样本(收自重庆新桥医院)中人NT-proBNP的浓度，并与本发明的方法检测到的NT-proBNP的浓度相比较，结果见表5，建立比较曲线(以Roche公司试剂盒的检测结果为横坐标，以本发明提供的方法的检测结果为纵坐标)，如图2所示。

表5

由图1可以看出，采用本发明的方法建立的NT-proBNP校准品的免疫检测标准曲线的相关系数R²为0.9872，由此可见线性关系良好。且由图2(R²为0.9806)可以看出，采用本发明的方法测到的NT-proBNP的浓度与采用Roche公司试剂盒检测NT-proBNP的浓度差异较小，说明本发明提供的方法可信度很高。由此可见，本发明提供了一种低成本、高效率、高质量的大量制备人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体的方法。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 重庆探生科技有限公司

<120> 一种人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体及其制备方法和应用

<130> PDP3281ZHO

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 255

<212> PRT

<213> 羊单链抗体scFv的氨基酸序列(amino acid sequence of goat single-chainantibody ScFv)

<400> 1

Met Ala Leu Ser Gln Val Arg Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val

1 5 10 15

Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Pro Ser

20 25 30

Leu Thr Asp Tyr Asp Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala

35 40 45

Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Asn Gln Gly Ala Pro Thr Gly Tyr Asp

50 55 60

Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser

65 70 75 80

Gln Val Ser Leu Ser Leu Ser Ser Met Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Ile Leu Gly Trp Gly Arg Gly Leu Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gln Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly

115 120 125

Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gly Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro

130 135 140

Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr

145 150 155 160

Gly Thr Ser Gly Asp Ile Ala Gly Tyr Asn Leu Val Gly Trp Tyr Gln

165 170 175

Gln Leu Pro Asn Ser Ala Pro Lys Thr Leu Ile Tyr Asp Val Ser Thr

180 185 190

Arg Arg Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn

195 200 205

Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp

210 215 220

Tyr Tyr Cys Ser Thr Ser Ile Ser Ala Asn Ser Val Gly Phe Gly Ser

225 230 235 240

Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ser Ala Pro Ser

245 250 255

<210> 2

<211> 765

<212> DNA

<213> 羊单链抗体scFv的核苷酸序列(nucleic acid sequence of goat single-chain antibody ScFv)

<400> 2

atggctctgt cccaggtgcg gctgcaggag tcgggaccca gcctagtgaa gccctcacag 60

accctctccc tcacctgcac ggtctctgga ccctcattaa ccgactatga cgtggactgg 120

gtccgccagg ctccaggaaa ggcgctggag tggcttggtt ttataaacca gggtgcacct 180

acgggctatg acccggccct gaaatcccgt ctcagcatca ccagggacac ctccaagagc 240

caagtctccc tgtcactgag cagcatgaca gcggaggaca cggccgtgta ctattgtgca 300

agaggtgcta tattgggctg gggccgagga ctcctggtca ccgtctcctc acagggttcc 360

acttctggtt ctggtaaacc gggctctggt gaaggttcca ctaaaggtgg ccaggctgtg 420

ctaactcagc ctgcctcagt gtcggggagt ccaggacaga cggtcaccat ctcctgtact 480

ggcaccagcg gtgacatcgc gggttataat ctagttggct ggtaccaaca gctcccgaac 540

tcagccccca aaactctgat ttatgatgtc agcacgcggc gctcagggat ccctgctcgg 600

ttctctggct ccaagtccgg gaacacagcc accctgacca tctctggcct tcaggccgag 660

gacgaggccg actattactg cagcacatct ataagtgcta attctgttgg tttcggcagc 720

gggaccaggc tgaccgtcct gggtcagccc aagtccgcac cctcg 765

<210> 3

<211> 229

<212> PRT

<213> 人IgG的Fc段氨基酸序列(amino acid sequence of Fc fragment from humanIgG)

<400> 3

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 4

<211> 687

<212> DNA

<213> 人IgG的Fc段的核苷酸序列(nucleic acid sequence of Fc fragment fromhuman IgG)

<400> 4

gagtctaagt acggccctcc ctgcccttct tgtcctgctc ctgaatttct tggcggccct 60

tccgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatctcccg gacccccgaa 120

gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccag gaagatcccg aggtgcagtt caattggtac 180

gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca gttcaactcc 240

acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag 300

tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg cccagctcca tcgaaaagac catctccaag 360

gccaagggcc agccccggga accccaggtg tacacactgc ctccaagcca ggaagagatg 420

accaagaacc aggtgtccct gacctgtctc gtgaaaggct tctacccctc cgatatcgcc 480

gtggaatggg agtccaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 540

gactccgacg gctccttctt cctgtactcc cgcctgaccg tggacaagtc cagatggcag 600

gaaggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 660

aagtccctgt ccctgtctct gggaaag 687

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工合成(artificially synthesized)

<400> 5

His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly

1 5 10 15

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工合成(artificially synthesized)

<400> 6

Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln Val Glu

1 5 10 15

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 重链可变区正特异性引物shpVH c(forward specific primershpVH c ofvariable region of heavy chain)

<400> 7

tatatatata attatggcct ccctggcctt tcggggctgt ggtggaggc 49

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 重链可变区正向特异性引物shpJH1，V=A/C/G，B=C/G/T(forward specificprimer shpJH1 of variable region of heavy chain，V=A/C/G，B=C/G/T)

<400> 8

tatatatata attatggcct ccctggcctg aggagacggt gaccagbavt c 51

<210> 9

<211> 49

<212> DNA

<213> 重链可变区正向特异性引物shpJH2，R=A/G，W=A/T，S=C/G，Y=C/T，B=C/G/T(forward specific primer shpJH2 of variable region of heavy chain，R=A/G，W=A/T，S=C/G，Y=C/T，B=C/G/T)

<400> 9

tatatatata attatggcct ccctggccyg arrrraygsw gabcaggag 49

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 重链可变区正向特异性引物shpJH1.2(forward specific primer shpJH1.2of variable region of heavy chain)

<400> 10

tatatatata attatggcct ccctggcctg aggagacggt gaccaggag 49

<210> 11

<211> 66

<212> DNA

<213> 重链可变区反向特异性引物shpVH1，R=A/G，K=G/T(reverse specific primershpVH 1 of variable region of heavy chain，R=A/G，K=G/T)

<400> 11

accttcacca gagcccggtt taccagaacc agaagtggaa ccctgcaggt kcagctkcag 60

grgtcg 66

<210> 12

<211> 67

<212> DNA

<213> 重链可变区反向特异性引物shpVH2，R=A/G，Y=C/T(reverse specific primershpVH 2 of variable region of heavy chain，R=A/G，Y=C/T)

<400> 12

accttcacca gagcccggtt taccagaacc agaagtggaa ccctgcaggt gcgrytgcag 60

grgtcgg 67

<210> 13

<211> 68

<212> DNA

<213> 重链可变区反向特异性引物shpVH3(reverse specific primer shpVH 3 ofvariable region of heavy chain)

<400> 13

accttcacca gagcccggtt taccagaacc agaagtggaa ccctgctgtc ccaggtgcgg 60

ctgcagga 68

<210> 14

<211> 62

<212> DNA

<213> 轻链Vλ正向特异性引物LBD c(forward specific primer LBD c of lightchain Vλ)

<400> 14

ctggtaaacc gggctctggt gaaggttcca ctaaaggtgg ccgagggtgc ggacttgggc 60

tg 62

<210> 15

<211> 62

<212> DNA

<213> 轻链Vλ正向特异性引物LBDj(forward specific primer LBD j of lightchain Vλ)

<400> 15

ctggtaaacc gggctctggt gaaggttcca ctaaaggtgg cgggctgacc caggacggtc 60

ag 62

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> 轻链Vλ反向特异性引物shplbd1，R=A/G，Y=C/T，V=A/C/G(reverse specificprimer shplbd1 of light chain Vλ，R=A/G，Y=C/T，V=A/C/G)

<400> 16

aatgaataaa taggccaggc cggccgttct caggcygtrc travycagcc g 51

<210> 17

<211> 52

<212> DNA

<213> 轻链Vλ反向特异性引物shplbd2(reverse specific primer shplbd2 oflight chain Vλ)

<400> 17

aatgaataaa taggccaggc cggccgttct caggctgtgc tgactcagct gt 52

<210> 18

<211> 51

<212> DNA

<213> 轻链Vλ反向特异性引物shplbd3，R=A/G，S=C/G，Y=C/T(reverse specificprimer shplbd3 of light chain Vλ，R=A/G，S=C/G，Y=C/T)

<400> 18

aatgaataaa taggccaggc cggccgttct caggcygtgs tractcagcc a 51

<210> 19

<211> 51

<212> DNA

<213> 轻链Vλ反向特异性引物shplbd4，S=C/G(reverse specific primer shplbd4of light chain Vλ，S=C/G)

<400> 19

aatgaataaa taggccaggc cggccgttct cagtctgscc tgactcagcc t 51

<210> 20

<211> 51

<212> DNA

<213> 轻链Vλ反向特异性引物shplbd5，M=A/C，R=A/G，W=A/T(reverse specificprimer shplbd5 of light chain Vλ，M=A/C，R=A/G，W=A/T)

<400> 20

aatgaataaa taggccaggc cggccgttct mrrgctrtgc wgactcarcc g 51

<210> 21

<211> 51

<212> DNA

<213> 轻链Vλ反向特异性引物shplbd6(reverse specific primer shplbd6 oflight chain Vλ)

<400> 21

aatgaataaa taggccaggc cggccgttct tcctatgaac tgacccagcc g 51

<210> 22

<211> 54

<212> DNA

<213> 轻链Vλ反向特异性引物shplbd7(reverse specific primer shplbd7 oflight chain Vλ)

<400> 22

aatgaataaa taggccaggc cggccgttct tcttctcagc tgactcagca gcct 54

<210> 23

<211> 60

<212> DNA

<213> 轻链Vk正向特异性引物shpkpj1.3，Y=C/T，B=C/G/T(forward specific primershpkpj1.3 of light chain Vk，Y=C/T，B=C/G/T)

<400> 23

ctggtaaacc gggctctggt gaaggttcca ctaaaggtgg ctttgatytc cacbytggtc 60

<210> 24

<211> 61

<212> DNA

<213> 轻链Vk正向特异性引物shpkpj2(forward specific primer shpkpj2 oflight chain Vk)

<400> 24

ctggtaaacc gggctctggt gaaggttcca ctaaaggtgg ctttgatctc tagcttggtt 60

c 61

<210> 25

<211> 52

<212> DNA

<213> 轻链Vk反向特异性引物shpkp1(reverse specific primer shpkp1 of lightchain Vk)

<400> 25

aatgaataaa taggccaggc cggccgttct atccaggtga cccagtctcc at 52

<210> 26

<211> 52

<212> DNA

<213> 轻链Vk反向特异性引物shpkp2，R=A/G，K=G/T(reverse specific primershpkp2 of light chain Vk，R=A/G，K=G/T)

<400> 26

aatgaataaa taggccaggc cggccgttct rttgtkctga cccaaactcc rc 52

<210> 27

<211> 50

<212> DNA

<213> 轻链Vk反向特异性引物shpkp3，R=A/G(reverse specific primer shpkp3 oflight chain Vk，R=A/G)

<400> 27

aatgaataaa taggccaggc cggccgttct gctgtgctct accagactcc 50

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> 重叠延伸PCR正向引物(forward primer of PCR for overlap-extension)

<400> 28

tatatatata attatggcct ccctggcc 28

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 重叠延伸PCR反向引物(reverse primer of PCR for overlap-extension)

<400> 29

aatgaataaa taggccaggc cggccgttct 30

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> sfiI酶切位点(restriction enzyme cutting site of sfiI)

<400> 30

ggcctccctg gccggccagg ccggcc 26

<210> 31

<211> 6

<212> DNA

<213> EcoRI酶切位点(restriction enzyme cutting site of EcoRI)

<400> 31

gaattc 6

<210> 32

<211> 8

<212> DNA

<213> NotI酶切位点(restriction enzyme cutting site of NotI)

<400> 32

gcggccgc 8

<210> 33

<211> 32

<212> DNA

<213> scFv片段扩增引物正向引物(forward primer for ScFv fragment)

<400> 33

aattatgaat tcatggctct gtcccaggtg cg 32

<210> 34

<211> 29

<212> DNA

<213> scFv片段扩增引物反向引物(reverse primer for ScFv fragment)

<400> 34

gccgtactta gactccgagg gtgcggact 29

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人IgG Fc段扩增引物正向引物(forward primer for Fc fragment fromhuman IgG)

<400> 35

gagtctaagt acggccctcc c 21

<210> 36

<211> 34

<212> DNA

<213> 人IgG Fc段扩增引物反向引物(reverse primer for Fc fragment fromhuman IgG)

<400> 36

aatgcggccg ctcactttcc cagagacagg gaca 34

Claims

1.一种人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体，其特征在于，所述人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体包括羊单链抗体scFv和人IgG的Fc段；其中，所述羊单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.编码权利要求1所述的羊单链抗体scFv的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种表达载体，其特征在于，该表达载体包括权利要求2或3所述的基因。

5.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体。

6.权利要求1所述的羊单克隆抗体、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的宿主细胞在制备用于检测人NT-proBNP的产品中的应用。

7.权利要求1所述的羊单克隆抗体、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的宿主细胞在制备用于诊断心力衰竭的产品中的应用。

8.一种人NT-proBNP免疫检测用试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1所述的人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体。

9.一种非诊断目的地检测样本中人NT-proBNP的方法，其特征在于，该方法包括使用权利要求1所述的人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体对样本进行双抗体夹心ELISA检测。

10.一种人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体的制备方法，该方法包括：

优选的，步骤(1)中，所述B细胞表位肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6。