JP2003500015A - モノクローナル抗体、抗原ならびに悪性疾患の診断および治療 - Google Patents

モノクローナル抗体、抗原ならびに悪性疾患の診断および治療

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、mAbが結合するリンパ芽球細胞およびペプチドに対して生じたモノクローナル抗体（mAb）の新規DNAおよびアミノ酸配列に関する。本発明はまた、高い確率で悪性疾患を有する個体を検出するために、およびその時に、特別な悪性疾患を有する個体を検出するために、該抗体またはペプチドを使用した診断アッセイに関する。さらに本発明は、種々の悪性疾患の処置に使用するための本発明のmAbまたはペプチドを含んで成る医薬組成物、ならびに本発明のmAbまたはペプチドを使用した悪性疾患の処置法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 発明の分野 本発明は、モノクローナル抗体の新規配列、モノクローナル抗体が結合する抗
原のペプチド配列、ならびにモノクローナル抗体およびペプチドを使用した診断
および治療アッセイに関する。 発明の背景 共有するPCT出願、公開番号WO 95/20605号明細書は免疫-刺激モノクローナル
抗体を開示する。このPCT出願の抗体の実体はＢリンパ芽球細胞に対して生成さ
れ、そして免疫−刺激効果を有することが示された。腫瘍を持つ動物に注入した
時、このような抗体は抗−腫瘍効果を誘導することも見いだされた。
【０００２】 現在の医学的手順の下でのガンの診断は典型的には、内科検診、種々の造影法
の使用、種々のガンマーカーの採用等が関与する多段階の方法である。当該技術
分野では、ガンの検出および検査した個体が罹患しているガンの種類の決定も可
能とするガンの診断法が長い間望まれている。 発明の一般的説明 本発明はリンパ芽球細胞に対するモノクローナル抗体の配列の知見に基づく。
本発明はさらに、ガンを有する患者のＴ-細胞に対するこれら抗体の結合レベル
が、健康な個体のＴ-細胞に対するこれら抗体の結合レベルとは異なる(高いかま
たは低い)という知見に基づく。
【０００３】 本発明の１つの観点に従い： （ａ）図１のアミノ酸配列を含んで成る重鎖可変領域を有するモノクローナル抗
体； （ｂ）図２のアミノ酸配列を含んで成るカッパ軽鎖可変領域を有するモノクロー
ナル抗体； （ｃ）図１のアミノ酸配列を含んで成る重鎖可変領域および図２のアミノ酸配列
を含んで成るカッパ軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体； （ｄ）図１のアミノ酸配列に対して少なくとも70％の同一性を有する重鎖可変領
域を有するモノクローナル抗体； （ｅ）図２の配列に対して少なくとも70％の同一性を有する軽鎖可変領域を有す
るモノクローナル抗体 から成る群から選択される可変領域を有するモノクローナル抗体を提供する。
【０００４】 本発明に従い、用語「抗体」とは任意のクラスのIgG、IgM、IgD、IgAおよびIg
Eモノクローナル抗体を称する。この用語は全抗体または抗体の抗原-結合ドメイ
ンを含んで成る抗体のフラグメント、例えばFc部分を欠く抗体、単鎖抗体、抗体
の可変抗原-結合ドメインのみから本質的に成る生成物のフラグメント等を称す
る。
【０００５】 さらにまた本発明は、上記mAbの任意の１つが特異的に結合する抗原に結合す
る抗体、すなわち上記抗体と交差反応を有する抗体に関する。
【０００６】 本発明の１つの態様では、モノクローナル抗体はキメラ ヒト-マウス抗体、す
なわちヒト起源に由来する定常領域およびマウスに由来する可変領域を持つmAb
である。この目的のために、本発明のmAbのカッパ軽および重鎖可変領域をPCRで
クローン化し、そしてそれらのDNAを配列決定した。本発明のさらに別の態様で
は、抗体は完全にヒト化された抗体、すなわち可変および定常領域の両方がヒト
の起源に由来する。
【０００７】 用語「少なくともＸパーセントの同一性を有する」という用語は、配列を最適
に整列した時に２つの比較する配列において、同一であるアミノ酸残基のパーセ
ントを指す。すなわち70％のアミノ酸配列の同一性とは、２以上の最適に整列さ
れたポリペプチド配列において、70％のアミノ酸が同一であることを意味する。
好ましくは同一性は少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも90％である。
【０００８】 本発明のさらなる観点に従い、本発明の任意のmAbを生産するマウスハイブリ
ドーマ細胞系を提供する。ハイブリドーマは当該技術分野で既知の任意の方法に
より調製することができる（例えば、Kohler,G.and Milstein,C.Nature,256:495
-497,(1975))。ハイブリドーマ細胞系の上清は典型的には、酵素結合免疫吸着ア
ッセイ（ELISA）または放射性免疫アッセイ（RIA）によるような当該技術分野に
おいて既知の任意の一つの方法により抗体結合活性についてスクリーニングする
。上清は本発明の任意のペプチド（以下に説明するような）に結合するか、また
はそれらが結合する細胞、例えばDaudi細胞またはＴ-リンパ球に結合するmAbの
生産についてスクリーニングする。
【０００９】 上記mAbの重鎖または軽鎖の任意のアミノ酸配列をコードするDNA配列も、本発
明の範囲内に包含する。当業者には疑うことなく明らかであるように、遺伝子暗
号の縮重性により、複数の核酸配列が図１または２に示す配列以外の本発明のmA
bをコードすることができる。
【００１０】 また本発明は、該DNA配列を有するプラスミドのような発現ベクターならびに
このような１以上の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１１】 本発明の別の観点に従い、本発明のmAbが結合することができるＢ-細胞抗原の
ペプチド配列を提供する。非−重複ジーンバンクデータベースに対して行った調
査およびEST部門により、これらのペプチド配列が新規であると決定された。
【００１２】 本発明のこのさらなる観点に従い： （ａ）図１０に示すアミノ酸配列を有するペプチド； （ｂ）図１１に示すアミノ酸配列を有するペプチド； （ｃ）図１２に示すアミノ酸配列を有するペプチド； （ｄ）上記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のペプチドのアミノ酸配列の任意の１つ
に対して少なくとも85％の同一性を有するペプチド；および （ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）の１以上のペプチドを含んで成るタンパク質またはペ
プチド、 から成る群から選択されるペプチドを提供する。
【００１３】 本発明のペプチドは、例えば競合免疫−アッセイのような種々の診断アッセイ
に使用することができ、ここで本発明のmAbはＴ-細胞上に存在するその天然の抗
原に対する結合レベルが測定される。さらにペプチドは免疫感作した動物におけ
る抗体の生産に使用することができ、この抗体は次いで上記および以下に記載す
る任意の１つの用途に使用され得る。
【００１４】 すべての上記ペプチドの同族体も本発明のさらなる観点を形成する。当業者に
は明らかであるように、本発明のペプチドのアミノ酸配列は、例えばペプチドの
抗体結合特性を実質的に改質することなく１以上のアミノ酸の付加、欠失または
保存的もしくは非−保存的置換により改変することができる。
【００１５】 用語「保存的置換」とは、１クラスのアミノ酸を同じクラスのアミノ酸へ置換
することを示し、ここでこのクラスを定めるならば、共通する物理化学的アミノ
酸側鎖特性および例えば標準Dayhoff頻度交換マトリックス（standard Dayhoff
frequency exchange matrix）またはBLOSUMマトリックスにより決定されるよう
な自然に見いだされるホモロガスなタンパク質中の高い置換頻度により定められ
る。［アミノ酸側鎖の６つの一般的なクラスが特性決定され、そしてそれらには
以下を含む：クラスI（Cys）；クラスII（Ser、Thr、Pro、Ala、Gly）；クラスI
II（Asn，Asp、Gln、Glu）；クラスIV（His、Arg、Lys）；クラスV（Lle、Leu、
Val、Met）；およびクラスVI（Phe、Tyr、Trp）。例えばAspを、Asn、Glnまたは
Gluのような他のクラスIII残基への置換することは保存的置換である。用語「非
−保存的置換」とは、１クラスのアミノ酸を別のクラスのアミノ酸に置換するこ
とを言い；例えばクラスII残基のAlaを、Asp、Asn、GlnまたはGluのようなクラ
スIII残基へ置換することは非−保存的置換である。
【００１６】 特別なアミノ酸（aa）を示すために上記で（および今後）使用する文字は、IU
PAC-IUB生化学命名法委員会により推薦されている１−文字アミノ酸記号に従う
。
【００１７】 本発明の範囲に入る上記ペプチドの同族体は、図１０〜１２に示すペプチドと
本発明のmAbに対する同じ結合レベルを実質的に有するものである。結合レベル
は、当該技術分野で既知の任意の様式により測定することができる。
【００１８】 本発明のペプチドおよび同族体も化学的に修飾することができ、そしてそのよ
うな化学的に修飾したペプチドおよび同族体も本発明の一部を構成する。用語「
化学的に修飾した」とは、少なくともアミノ酸残基の１つがプロセッシングもし
くは他の翻訳後修飾のような自然なプロセスにより、あるいは当該技術分野で周
知な化学的修飾法により修飾されたタンパク質を称する。多くの既知の修飾の中
でも、典型的ではあるが排他的ではない例には以下を含む：アセチル化、アシル
化、アミド化、ADP-リボシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、液体または
脂質誘導体の共有結合、メチル化、ミリスチル化、ペギレーション（pegylation
）、プレニレーション（prenylation）、リン酸化、ユビキチン化または他の同
様なプロセス。
【００１９】 本発明の基になる第２の知見は、本発明のmAbが健康な個体のＴ-細胞に対する
mAbの結合の程度と比較して、悪性疾患を有する個体から得たＴ-細胞に対して同
じmAbが異なる程度で結合できるということである。
【００２０】 このように本発明のさらなる観点により、高い確率で悪性疾患を有する検査個
体を同定するためのアッセイが提供され： （ａ）該個体からの体液サンプルを得； （ｂ）該サンプルを本発明の少なくとも１つのmAbと接触させ； （ｃ）該mAbが該サンプル中のＴ-細胞に結合する程度を測定し；そして （ｄ）（ｃ）の程度を、本発明のmAbが健康な個体から得たサンプル中のＴ-細胞
に結合する程度と比較することを含んで成り；上記の２つの結合程度間の有意差
は該検査した個体が高い確率で悪性疾患を有することを示している。
【００２１】 本発明に従い、検査する個体から得たサンプルは、検出可能な量のＴ-細胞を
含む任意の体液でよい。典型的には体液サンプルは血液またはリンパ液サンプル
である。好ましくは本発明のmAbと得られたサンプルを接触させる前に、サンプ
ル中の抹消血単核細胞（PBMC）をFicoll Hypaque密度遠心によるような当該技術
分野で既知の任意の方法により分離し、そして分離した細胞を試験抗体と接触さ
せる。
【００２２】 本発明に従い用語「悪性疾患」とは、任意の段階で当該分野で知られている任
意の種類の悪性疾患であると理解される。
【００２３】 また悪性疾患という用語は、その初期段階および未だに臨床的な症状を表して
いない悪性疾患をも包含する。好ましくは悪性疾患という用語は、充実性腫瘍を
称する。
【００２４】 用語「健康な個体」とは、悪性疾患を持たない個体を称し、そして何人かの個
体の平均レベルまたは何人かの個体に由来する体液を一緒にプールすることによ
り得られたレベルを指してもよい。いったん健康な個体の標準的な結合の程度が
確率されれば、この標準は試験毎に再度確立する必要はなく、そして確立された
数字を連続して使用してよい。本発明に従い、健康な個体では約25％のCD3+Ｔ-
細胞が本発明の抗体に結合することが見いだされた。
【００２５】 用語「高い確率」とは、本発明のアッセイが悪性疾患を有すると疑われる個体
を同定することができる初期スクリーニングアッセイであることを意味する。本
発明の方法により検出される個体が正に悪性疾患を有するという事実は、当該技
術分野で既知のさらなる技法を利用することにより後に確認されなければならな
い。
【００２６】 用語「結合の程度」とは、検査個体のＴ-細胞上に存在する抗原に対する抗体
の結合レベルを示し、この程度はELISAまたはウエスタンブロッティングのよう
な抗体の結合レベルを測定するための当該技術分野で既知の任意の方法により測
定することができる。結合の程度は、検出可能なマーカーに連結された抗-マウ
ス免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントのような任意の検出系を使用して
測定することができる。そのような検出可能なマーカーの例は、放射性基、蛍光
基、検出可能な生成物を生じる反応（発色反応のような）を触媒することができ
る酵素、アビジンにより検出することができるビオチン基等である。好適な態様
により、本発明のmAbのＴ-細胞に対する結合の程度は、二重標識により行われ、
ここで抗Ｔ-細胞抗体（例えば抗-CD3+抗体）が１種の蛍光マーカーに連結され、
そして本発明のmAbが第２種類目の蛍光マーカーに結合している。次いで結合の
程度はフルオロセイン活性化セルソーター（FACS）を使用して測定される。結合
の程度の定量は、本発明のmAbにも結合したCD3+Ｔ-細胞のパーセントを測定する
ことにより成される（それらの抗-CD3+抗体の結合により測定される）。
【００２７】 本発明に従い、悪性疾患を有する個体の血液サンプル中のCD3+細胞の総数は、
健康な個体から得たCD3+細胞の数と同様であるので、悪性患者および健康な個体
の両方でＴ-細胞に結合する総CD3+を使用することにより、mAbおよびCD3+Ｔ-細
胞の両方の結合の程度の標準化が有効である。しかし悪性疾患を有する個体にお
いて、本発明のmAbにも結合するCD3+結合Ｔ-細胞（今後「CD3+mAb細胞」と呼ぶ
）のパーセントは、健康な個体の血液中のCD3+mAb+細胞のパーセントとは有意に
異なる。悪性疾患を有する個体におけるCD3+mAb+細胞のパーセントは、悪性疾患
の種類に依り健康な個体におけるCD3+mAb+細胞のパーセントより有意に高いかま
たは有意に低いかのいずれかであり得る。
【００２８】 本発明のmAbが検査した個体から得たＴ-細胞に結合する程度は、本明細書で挙
げた実験法により得られる結果に関連して使用される当該技術分野で既知の任意
の統計的方法（例えばステューデント ｔ-試験）により測定されるように、mAb
の結合における差異が有意な程度で統計的に異なる時、健康な個体から得たＴ-
細胞に対する結合の程度よりも「有意に異なる」と考える。
【００２９】 本発明は任意の種類の悪性疾患を高い確率で有する個体を同定することができ
るだけではなく（ここで罹患した個体は健康な個体に比べて、本発明のmAbに対
して異なる程度のＴ-細胞の結合を有する）、該程度が健康な個体において対応
する程度よりも高いかまたは低いかを測定することにより、特別な種類のガンを
有する個体を同定するためにも役立つ。
【００３０】 典型的には、本発明のmAbが健康な個体から得たＴ-細胞に対する結合のパーセ
ントは、約25％の範囲であり、すなわちCD3+Ｔ-細胞マーカー（細胞への抗-CD3+ 抗体の結合により定められる）を発現している細胞の25％が本発明のmAbに結合
する。
【００３１】 本発明に従い、前立腺ガン患者から得たサンプルにおいて、本発明のmAbが結
合するCD3+Ｔ-細胞のパーセントは約50％の範囲であることが示された。
【００３２】 さらに結腸または胸部ガン患者から得たサンプルに由来するCD3+Ｔ-細胞の場
合、本発明のmAbにも結合する細胞のパーセントはそれぞれ約７％および約10％
であることが示された。
【００３３】 すなわち本発明に従い、体液サンプル中に存在するCD3+細胞に対する本発明の
mAbの結合の程度に基づく簡単な、しかも１回のアッセイを使用して、検査した
個体から採取した体液サンプル中に、特別な種類のガンが存在する確率が高いこ
とを決定することが可能になった。特定の種類のガンを有する個体を同定するた
めに、ただ１種類のmAbの使用を必要とする本発明の診断アッセイの簡易性は、
集団の広いスクリーニングに大変有用である。
【００３４】 すなわち、本発明は別の観点により特別な悪性疾患を高い確率で有する検査個
体を同定するためのアッセイを提供し： （ａ）該個体から体液サンプルを得； （ｂ）該サンプルを本発明のmAbと接触させ； （ｃ）該mAbが該サンプル中のＴ-細胞に結合する程度を測定し；そして （ｄ）細胞の結合の程度（ｃ）を、mAbが健康な個体から得たＴ-細胞に結合する
程度と比較することを含んで成り、結合の程度における有意差の存在は、該検査
した個体が悪性疾患を高い確率で有することを示し、ここで該個体からのＴ-細
胞への結合の程度が健康な個体のＴ-細胞中のmAbにおける結合レべルよりも高く
ても低くても、検査した個体が高い確率で有する特別な種類の悪性疾患を示す。
【００３５】 特に本発明のmAbに対する結合の程度が健康な個体よりも有意に高い場合、検
査個体は高い確率で前立腺ガンを有する。
【００３６】 結合の程度が健康な個体よりも有意に低い場合、検査個体は高い確率で結腸ま
たは胸部ガンを有する。
【００３７】 本発明の診断的観点に従い、本発明のmAbを含んで成る組成物は高い確率で悪
性疾患（一般的に）を有する個体を同定するための診断に、または個体が有する
と思われる特別な悪性疾患を同定するために使用することができる。したがって
本発明はその別の観点により、適当なキャリアーを一緒に含む少なくとも１つの
上記抗体に属するmAbを含んで成る診断用組成物を提供する。このキャリアーは
当該技術分野で既知の生理学的に許容され得る任意のバッファー（例えばPBS）
のような可溶性キャリアー、または例えばラテックスビーズのような個体状態の
キャリアーのいずれかでよい。
【００３８】 本発明はまたキット、例えば本発明のmAbを利用し、そして上記に開示する診
断アッセイを行うための診断用アッセイキットも提供する。１つの態様では診断
用キットは通常、少なくとも１つの上記mAbを１以上の容器に含み、mAbのための
特異的結合パートナーの結合物（例えば本発明の抗原または同族体）、検出可能
なシグナルを生成することができる標識および使用説明書を含む。標識は先験的
にモノクローナル抗体に結合できるか、またはそうではなくて標識は次いでmAb
に特異的に結合するキャリアー分子に結合してもよい。試験サンプルと診断用試
薬組成物とのインキューベーションは、モノクローナル抗体のが細胞への結合を
可能とするために十分な時間である。
【００３９】 本発明のさらに別の観点により、有効成分として１以上の本発明のmAbを一緒
に含んで成る医薬組成物を提供する。該mAbを個体における種々の悪性疾患の処
置のための医薬組成物の調製への使用も、本発明の範囲内である。
【００４０】 本発明のさらに別の観点は、必要な個体に治療に効果的な量の該mAbを投与す
ることによる悪性疾患の処置法に関する。治療に効果的な量とは悪性疾患の症状
を寛解することができる量であり、症状を軽減するかまたは症状を完全に排除す
る。
【００４１】 本発明のペプチドを含んで成る医薬組成物も、本発明の観点を構成する。その
ような組成物は、例えば個体のＴ-細胞に結合し、そして個体に免疫応答を誘導
することができる抗体を得るために、個体の能動的免疫感作に使用することがで
きる。 本発明の観点の詳細な記述 本発明の主な観点は、添付する図面を随時参考にしてこれから記載する。以下
の説明および図面では、用語「BAT抗体」は、用語「本発明のmAb」と互換可能に
使用する。 I．MABのシークエンシング （Ａ）略号 ウシ胎児血清（FCS）；リボ核酸（RNA）；メッセンジャーRNA（mRNA）；デオ
キシリボ核酸（DNA）；コピーDNA（cDNA）；ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）；分
（min）；第２（sec）；トリス−硼酸バッファー（TBE）。 （Ｂ）材料 培地成分および他のすべての組織培養材料は、ライフ テクノロジーズ（Life
Technologies）（英国）から得た。RNA単離キットはストラタジーン（Straragen
e）(米国）から得たが、第１鎖cDNA合成キットはファルマシア（英国）から購入
した。AmpliTaq(商標)DNAポリメラーゼを含めPCR-反応用のすべての成分および
装置は、パーキン エルマー（Perkin Elmer）（米国）から購入した。TA Clonin
g(商標)キットはインビトロゲン（Invitrogen）（米国）から得た。アガロース
（UltraPure(商標))は、ライフ テクノロジーズ（Life Technologies）（英国）
から得た。Thermo Sequence(商標)プレ-ミックス サイクルシークエンシングキ
ットおよびVistra 725 DNAシークエンシング装置は、両方ともアマーシャム(Ame
rsham)（英国）から購入した。すべての他の分子生物学用製品は、ニューイング
ランドバイオラボズ（New England Biolabs)（米国）から得た。 （Ｃ）実験技法：マウスBAT抗体可変領域遺伝子のPCRクローニングおよびシーク
エンシング マウスBATハイブリドーマ細胞系およびDaudi細胞系はMRC-CCに成功裏にトラン
スフェクトし、そして両方の細胞を懸濁状態で、10（容量／容量）％FCS、100単
位／mlのペニシリン、100μg／mlのストレプトマイシンおよび２mM L-グルタミ
ン、１mMのピルビン酸ナトリウムおよび12.5単位／mlのニスタチンを補充したRP
MI（グルタミンを除く）を使用して成長させた。
【００４２】 BATハイブリドーマ細胞系の約108の生きている細胞を回収し、そして108細胞
から全RNAは製造元の使用説明に従いRNA単離キットを使用して単離した。キット
はチオシアン酸グアニジニウム フェノール-クロロホルム１段階抽出法を、Chro
mczynski and Sacchi,Anal.Biochem,162:156,1987により記載されているように
使用した。また製造元の使用説明に従い、第１鎖cDNA合成キットを使用して、キ
ットに供給されているNotI-(dT)18プライマーを使用してBATハイブリドーマmRNA
の単鎖DNAコピーを生成した。約５μgの全RNAを各33μlの最終反応容量で使用し
た。完了した反応混合物は次いで90℃に５分間加熱して、RNA-cDNA二重鎖を変性
させ、そして逆転写酵素を不活性化した後に氷上で冷却した。
【００４３】 ハイブリドーマ細胞系からのマウス重鎖可変領域遺伝子（ＶH遺伝子）および
マウスカッパ軽鎖可変領域遺伝子（Ｖκ遺伝子）をPCR-増幅するために、Jones
and Bendig Bio/Technology,9:8,1987により記載された方法に従った。本質的に
は２シリーズの縮重プライマー、１つはマウス重鎖遺伝子（すなわちMHV1-12;表
１）のリーダー配列にアニールするように設計され、そして１つはマウスカッパ
軽鎖遺伝子（すなわちMKV1-11;表２）のリーダー配列にアニールするように設計
されたものを、適当な定常領域遺伝子の５'-末端にアニールするように設計した
プライマーと一緒に使用してマウス可変領域遺伝子をPCR-クローニングした。
【００４４】 別のPCR-反応は、各縮重プライマーについてそれらの適当な定常領域プライマ
ーを用いて、特別なPCR−室中で交差−混入の可能性を最小にするように設計さ
れた特別なプロトコールを使用して調製した。Amplitaq(商標)DNAポリメラーゼ
を使用して鋳型cDNAをすべての場合で増幅させた。PCR-反応試験管を次いでパー
キン エルマー（Perkin Elmer） 480 DNA熱循環器に乗せ、そして（94℃で1.5分
間、最初に融解した後）94℃で１分、そして72℃で１分を25サイクル循環させた
。最終サイクルが完了した時、最後の延長工程を72℃で10分間行った後、反応物
を４℃に冷却した。アニーリング（50℃)と延長(72℃）工程の間を除き、2.5分
のランプ延長時間を使用した時は、30秒のランプ時間をサイクルの各工程間に採
用した。
【００４５】 各PCR-反応からの10μlのアリコートを、１％のアガロース／TBE（pH8.8）ゲ
ルで泳動して、どれが正しいサイズのPCR生成物を有するかを決定した。完全長
の可変領域遺伝子を増幅することを示したこれらのPCR−反応を繰り返して、独
立したPCR-クローンを生成し、そしてこれによりPCR−エラーの影響を最小にし
た。このような正しいサイズのPCR生成物の１〜６μlのアリコートを、TA Cloni
ng(商標)キットにより提供されるpCRII（商標)ベクターに直接クローン化し、そ
してINAαF'コンピテント細胞中で製造元の使用説明書に記載されているように
形質転換した。正しいサイズの挿入物を含むプラスミドを含有するコロニーは、
以下の表３に記載するpCRII前部およびpCRII逆オリゴヌクレオチドプライマーを
使用して、Guessow and Clackson,Nucleic Acids Res.,17:4000,1989の方法に従
いコロニーをPCR-スクリーニングすることにより同定した。
【００４６】 同定したこれらの推定上の陽性クローンは、Vistra DNAシークエンシング機お
よびThermo Sequence(商標)プレ-ミックスサイクルシークエンシングキットを製
造元の使用説明書に記載されているように使用して二本鎖プラスミドDNAシーク
エンシングを行った。
【００４７】
【実施例】
実施例１：BAT抗体の重鎖可変領域のクローニングおよびシークエンシング すべてのヒト化プロジョクトのように、厳密なPCT-クローニングおよびシーク
エンシングプロトコールに従った。これはBATハイブリドーマ細胞系からのマウ
スＶH可変領域遺伝子の野生型配列へのエラー導入の可能性を最小にするために
行った。マウスBAT抗体を発現しているハイブリドーマ細胞系からの少なくとも
２つの異なるＶH遺伝子クローンからすべてのDNA配列データが 完全に合った場
合のみ、遺伝子配列は正しいと認められた。
【００４８】 各々が異なる全RNA調製物、そして引き続き第１鎖cDNA合成反応に由来する３
つの別々のPCR生成物を、PCR-クローン化し、そして両鎖を完全にDNAシークエン
シングした。12個の重鎖プライマーを試験したが（表１）、１つのMHV9プライマ
ー（MHCG3と一緒に−マウスγ3重鎖遺伝子のCH1ドメインにアニーリングするよ
うに設計した）だけをPCR−増幅し、約460bpの産物を次いでpCRII（商標）クロ
ーニングベクター中にTA-クローン化した（データは示さず）。
【００４９】 ３つのPCR生成物（各々は異なる第１鎖合成反応および続くPCR反応に由来する
）の各々から幾つかの個々のクローンのDNA配列分析により、図１に記載するよ
うなBAT抗体重鎖可変領域配列が決定された。この配列は試験したすべての３つ
のPCR-クローンについて両DNA鎖を確認した。
【００５０】 実施例２：BAT抗体のカッパ軽鎖可変領域のクローニングおよびシークエンシ
ング 第１鎖合成で生成した一本鎖cDNA鋳型を、一連のカッパ軽鎖縮重プライマー（
以下の表２）を使用してPCR-増幅した。しかし１以上の縮重プライマーから多数
のPCR-生成物の増幅からもたらされた結果は、１以上の可変領域遺伝子が少なく
ともBATハイブリドーマ細胞系により転写されたことを示唆していた。
【００５１】 最初にPCR-生成物は、MKV2プライマー（これはすべてのMKVシリーズのプライ
マーと同様に、カッパ軽鎖シグナルペプチドのDNA配列の５'末端にアニーリング
する)およびMKC（これはマウスカッパ定常領域遺伝子の５'末端にアニーリング
するように設計された)を一緒に使用した時に見られた。事前の研究室での実験
では、MKV2プライマーが異常型mRNA転写物をPCR-増幅したことが示された。この
異常型の偽遺伝子は、元のMOPC-21プラズマサイトーマ（plasmacytoma）細胞に
由来するすべての標準的融合パートナー中に存在し、そしてMOPC-21nとして知ら
れていた、Deyev,S.M.et al.,Genetica.85:45,1991。NO-0はMOPC-21系に由来す
る細胞であり、そしてこれをBATハイブリドーマを作成するための融合パートナ
ーとして使用した。その結果、PCR−生成物がMKV２プライマーを使用した時に見
られたのは驚くことではなかった。この生成物を分析し、そして非−機能的偽遺
伝子であることが示された（データは示さず）。
【００５２】 いつになく、すでに関連する細胞系NS-1により分泌されることが確認され（Ha
mlyn,P.H.et al.,Nucl.Acis Res.,9:4485,1981）、そしてMKCプライマーと一緒
にMKV7プライマーを使用した時、正常にPCR-クローン化される別の偽遺伝子は、
これまでに分析したPCR-生成物のいずれにも見られなかった。NS-1およびNS-0細
胞系は大変緊密に関連しているので、これは少しも驚くことではない。しかしBA
Tハイブリドーマ細胞系に存在したカッパ軽鎖転写の混乱させる性質も強調され
た。
【００５３】 最終的にはBAT抗体のＶκ遺伝子であると判明した別のPCR-クローンも、BATハ
イブリドーマ細胞系からプライマーMKV5およびMKCを使用して成功裏にPCR-増幅
された。約450bpの生成物のINVαF'コンピテント細胞への形質転換に続き、推定
される陽性の形質転換体をPCR-スクリーニングアッセイにより同定し、次いでDN
Aシークエンシングを行った。
【００５４】 MKV5産物からの２つの個別のクローンの配列分析から（各々が異なる第１鎖合
成反応およびその後のPCR-反応に由来する）、BAT抗体カッパ軽鎖可変領域遺伝
子のDNA配列を決定した（図２）。この配列を各クローンの両DNA鎖について再度
、確認した。
【００５５】 実施例３ マウスBAT抗体可変領域の配列分析 BAT ＶκおよびＶH領域のアミノ酸配列を、Kabat（同上）データベース中に定
められたマウス可変領域サブグループのコンセンサス配列とを比較した。この分
析から、BAT ＶH領域がマウスカッパサブグループVIのコンセンサス配列と最も
緊密に合うことが見いだされた。BAT ＶH領域をKabatデータベースと同様に比較
して、マウス重鎖サブグループの“雑多(miscellaneous)"なコンセンサス配列と
最も緊密に合うことが示されることが見いだされた。
【００５６】 上記BAT抗体可変領域配列をマウス生殖細胞系のデータベースと比較すると、B
AT ＶH遺伝子に最も緊密な生殖細胞系遺伝子はVMS/VGK4（図３）であることが見
いだされ、一方BAT Ｖκ遺伝子に最も緊密な生殖細胞系遺伝子はＨ４（図４）で
あることが分かった。図３から分かるように、BAT ＶH遺伝子とその最も緊密な
生殖細胞系の間で起こったこのような誤対合は当然、CDR2およびCDR3に主に位置
していた。わずか３つの枠組構造（framework）の変化が存在し、そしてこれら
すべてはFR3に位置していた。BAT Ｖκ遺伝子（図４）に関しては、誤対合の大
部分がCDRに位置していたことは、ここでも全く驚くべきことではない。FRに位
置する４つの差異は、FR3中の72位（Kabatの番号付け）でのシステインを除き、
すべて高度に保存的な変化であった。その位置が重要な規範的残基（71位）に隣
接することは、システインが抗原結合に鍵となる役割を果しているかもしれない
ことを示唆していた。しかしFvドメインのモデリングを通じてのみ、そのような
仮定を明らかにすることができた。
【００５７】 これにもかかわらず、このような分析によりマウスBAT可変領域のＶH領域およ
びＶκ領域の両方がマウスの可変領域に典型的に現れることが確認された。
【００５８】
【表１】
【００５９】a MHVは、マウス重鎖可変領域遺伝子のリーダー配列にハイブリダイズするプラ
イマーを示す。b MHCGは、マウス定常領域遺伝子にハイブリダイズするプライマーを示す。
【００６０】
【表２】
【００６１】a MKVは、マウスカッパ軽鎖可変領域遺伝子のリーダー配列にハイブリダイズす
るプライマーを示す。b MKCは、マウスカッパ定常領域遺伝子にハイブリダイズするプライマーを示す
。
【００６２】
【表３】
【００６３】 II．本発明のキメラ抗体の構築および発現 （Ａ）略号 以下の非-SI単位および他の略号を使用した： ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）；デオキシリボ核酸（DNA）；コピー DNA（cDNA
）；カッパ軽鎖可変領域（Ｖκ）；重鎖可変領域（ＶH）；分（min）；トリス−
硼酸バッファー（TBE）；リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）；室温（RT）；ウシ血
清アルブミン（BSA）；塩酸（HCl）；西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）；低
脂肪ミルク LFM）；時間（hr）；パーセント（％）；O-フェニレンジアミン ジ
ヒドロクロライド（OPD）；多クローニング部位（MCS）。 （Ｂ）材料 培地成分および他のすべての組織培養材料は、ライフ テクノロジーズ（Life
Technologies）（英国）から得た。AmpliTaq(商標)DNAポリメラーゼを含めPCR-
反応用のすべての成分は、パーキン エルマー（Perkin Elmer）（米国）から購
入した。しかしTA Cloning(商標)キットおよびINVαF'コンピテント細胞はイン
ビトロゲン（Invitrogen）（米国）から得た。DH5αコンピテント細胞およびア
ガロース（UltraPure(商標))は、ライフ テクノロジーズ（Life Technologies）
（英国）から得た。Thermo Sequence(商標)プレ-ミックス サイクルシークエン
シングキットおよびVistra 725 DNAシークエンシング装置は、両方ともアマーシ
ャム(Amersham)（英国）から購入した。ABI Prism 310 遺伝子分析機と使用した
Big Dye(商標)ターミネーター サイクル シークエンシング レディ リアッショ
ンキットは、PE アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems)（英国）
から購入した。記載する他のすべての分子生物学用製品は、ニューイングランド
バイオラボズ（New England Biolabs)（米国）またはプロメガ（Promega）（米
国）から得た。Nunc-Immuno Plate MaxiSorp(商標)イムノプレートは、ライフ
テクノロジーズ（Life Technologies）（英国）から得たが、コーニング(Cornin
g）簡単洗浄ELISAプレートは、コーニング ラボラトリー サイエンス社（Cornin
g Laboratory Science Company）（英国）から得た。ヤギ抗-ヒトIgG (Fcγフラ
グメント特異的）抗体、ヤギ抗-ヒトカッパ軽鎖／HPR結合物およびAffinPure ヤ
ギ抗-ヒトIgG (Fcγフラグメント特異的）／HPR結合物は、ジャクソン イムノリ
サーチラボラトリーズ社（Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.）（米国
）から得た。Ｋ-ブルー−TMB基質およびレッド停止溶液は、ネオゲン社（Neogen
Inc.）（米国）から購入した。ELISA用の他のすべての製品は、シグマ（Sigma
）（英国）から得た。Microplate Manager(商標)データ分析ソフトウェアパッケ
ージは、バイオ-ラッド(Bio-Rad)(英国)から購入した。微−容量撹拌超遠心細胞
およびPM30フィルター膜は、アミコン(Amicon) PLC（英国）から得たが、Immuno
pure(商標)(G)IgG精製キットはピアス(Pierce)PLC社(英国)から購入した。 （Ｃ）実験技法 Ｃ１ キメラγ1/κ BAT抗体の構築 キメラ マウス-ヒト抗体の一部として哺乳動物細胞中でBAT可変領域遺伝子の
発現を可能とするために、事前に単離したマウスのカッパ軽鎖可変領域（Ｖκ）
遺伝子（図１）および重鎖可変領域（ＶH）遺伝子（図２）を、特別に設計したP
CR-プライマー（表１）を使用して5'-および3'-末端で修飾した。この分離を行
うために、PCR-反応は交差混入の可能性を最小にするために設計された特別なプ
ロトコールを使用して、特別なPCR室内で各可変領域遺伝子用に調製した。プラ
スミドBATVH-pCR2.1およびBATVκ-pCR2.1を鋳型として使用し、そしてAmpliTaq(
商標)DNAポリメラーゼをこれらの鋳型をｔ増幅するために使用した。プライマー
B8814およびB8815（表４）を使用してBAT ＶH遺伝子をPCR-修飾する一方、プラ
イマーCO224およびC0225（表４）を使用してBAT Ｖκ遺伝子をPCR-変異させた。
【００６４】 PCR-反応試験管は（最初に94℃で３分間融解した後に）、94℃で50秒、72℃で
１分30秒を30回循環させた。最後のサイクルの完了時に、最終延長工程を72℃で
10分間行い、その後に反応物を氷上で冷却した。各PCR-反応からの５μlのアリ
コートを、1.2％アガロース／TBE(pH8.8)ゲルで泳動し、どれが正しいサイズのP
CR-生成物を有するかを決定した。
【００６５】 正しいサイズのPCR-生成物の１〜２μlのアリコートは、TA Cloning(商標)キ
ットにより提供されるpCR2.1(商標)ベクターに直接クローン化し、そして製造元
の使用説明に記載されているようにINVαF'コンピテント細胞に形質転換した。
正しいサイズの挿入物を持つプラスミドを含むコロニーは、GuessowおよびClack
son(同上)の方法に従い、1212および1233オリゴヌクレオチドプライマー（表５
）を使用して、PCR-スクリーニングにより同定した。同定されたこのような推定
上陽性のクローンは、Vistra DNAシークエンシング機およびABI Prism 310遺伝
子分析機の両方を使用してシークエンシングした二本鎖プラスミドDNAであった
。Thermo Sequenase(商標)プレ-ミックス サイクル シークエンシングキットお
よびBig Dye(商標)ターミネーター サイクル シークエンシング レディ リア
クション キットは、プライマー1212および1233（表５）を使用して製造元の使
用説明書に記載されているように使用した。
【００６６】 正しく適合したBAT ＶκおよびＶH遺伝子（それぞれ図５および６）を含むク
ローンはHindIII−BamHｉフラグメントとして発現ベクターpKN110（図７）およ
びpG1D110（図８）中にそれぞれサブクローン化して、哺乳動物細胞中でキメラ
の軽および重鎖を発現させた。連結した発現ベクター（すなわちpKN110-BATＶκ およびpG1D110-BATＶH)を次いでDH5αコンピテント細胞に形質転換した。正しく
構築された発現ベクターを含む陽性クローンが、制限消化分析により最終的に同
定された。 Ｃ２ COS細胞へのキメラγ1/κ BAT抗体ベクターDNAのコ-トランスフェクショ
ン（co-transfection） Kettelborough et al.の方法に従い、哺乳動物発現ベクターをCOS細胞にトラ
ンスフェクトした。簡単に説明すると、DNA（各10μgのカッパ軽鎖発現ベクター
pKN110-BATＶαおよび重鎖発現ベクターpG1D110-BATＶH)を、１×107細胞／ml(P
BS中)の0.70mlアリコートに加え、そしてバイオ-ラッドのCene Pulser装置を使
用して1900V、25μFキャパシタンスでパルスをかけた。10分後にRTで回収した後
、エレクトロポレーションした細胞を８mlのDMEM（５％FCSを含有）に加え、そ
して37℃で５％ CO2中で72hrインキューベーションした。72hrのインキューベー
ション後、培地を集め、遠心して細胞屑を除去し、そしてキメラBAT抗体生産に
ついてELISAにより分析した。 Ｃ３ キメラγ1/κ抗体のELISAを介した定量 96-ウェルのNunc-ImmunoPlate MaxiSorp(商標)イムノプレートの各ウェルを、
最初にPBSで希釈した100μlの0.4ng/μlのヤギ抗-ヒトIgG(Fcγフラグメトン特
異的）抗体で被覆し、そして４℃で一晩インキューベーションし、そして使用前
に取り出した。実験サンプル（すなわち回収したCOS細胞上清−遠心して細胞屑
を除いた）の100μl/ウェル アリコート、およびサンプル−酵素結合バッファー
（0.1M Tris-HCl(pH7.0)、0.1M NaCl、0.02（容量／容量）％TWEEN-20および0.2
（重量／容量）％BSA）で希釈した１：２サンプル希釈物を、次いでイムノプレ
ートに分配した。さらに精製したヒトγ1/κ抗体（1000ng/μl)、これは標準と
して使用し、そして連続して希釈した１：２もイムノプレートに乗せた。イムノ
プレートを37℃で１hrインキューベーションした後、200μl/ウェルの洗浄バッ
ファー（PBS／0.1(容量／容量）％TWEEN-20）で３回洗浄した。5000倍にサンプ
ル−酵素結合バッファーで希釈した100μlのヤギ抗−ヒト カッパ軽鎖／西洋ワ
サビペルオキシダーゼ結合物を各ウェルに加え、この後にイムノプレートを37℃
で１hrインキューベーションした後、使用前に洗浄した。次いでＫ-ブルー基質
の150μlのアリコートを各ウェルに加え、これに続いてイムノプレートをRTで10
分間、暗中でインキューベーションした。反応物は最終的に50μlのレッド停止
溶液を各ウェルに分配することにより止めた。655nmの光学密度は、バイオ−ラ
ッド（Bio-Rad)3550マイクロプレートリーダーをMicroplate Manager(商標)ソフ
トウェアパッケージと共に使用して測定した。 Ｃ４ キメラBAT抗体の精製 キメラBATγ1/κBAT抗体は、COS細胞上清から２段階で精製した。第１に、製
造元の使用説明に従いPM30フィルター膜を用いて微−容量撹拌超遠心細胞を使用
して、生の非精製上清を減らした。次にImmunipure(商標)(G)IgG精製キットを製
造元の使用説明に従い使用して、濃縮した上清からキメラBAT抗体をアフィニテ
ィ精製した。 Ｃ５ Daudi細胞ELISA 細胞ELISAアッセイは、Hardy博士（フェエルセンステイン メディカル リサー
チ センター、ラビン メディカル センター、ベイリンソン キャンパス、ペター
ティクヴァ、49100、イスラエル）による元のストックから培養したDaudi細胞を
使用して行った。小さな修飾を作成して、アッセイがマウスまたはマウス-ヒト
キメラBAT抗体が分析されるかどうかに依存するようにした。マウスBAT抗体の結
合親和性ををアッセイする時、ヤギ抗-マウスIgG（Fab特異的）／HRP結合物（1:
15000に希釈した）を第２抗体として使用した。逆に、キメラBAT抗体の親和性を
測定する時、AffiniPure ヤギ抗-ヒトIgG（Fcγフラグメトン特異的)／HRP結合
物（1:1000に希釈した）を使用した。
【００６７】 Daudi細胞（継代してから２日目）を、最初に96ウェルのコーニング簡易洗浄E
LISAプレートに105細胞／ウェルでまき、そして37℃で一晩、乾燥恒温器中でイ
ンキューベーションした。翌日、200μlの再水和バッファー（10％FCSおよび0.0
5％アザイドを含有するPBS）を各ウェルに加え、これを最小１時間静置した。次
いで再水和バッファーをデカントした後、精製したBAT抗体の様々な１：２連の
希釈物の50μlアリコートをプレートのウェルに加えた。プレートを再度、一晩
インキューベーションし（４℃で）、200μl／ウェルのPBS（５％のLFMを含有す
る）で２回洗浄し、そして乾燥させた。次いで50μl／ウェルのHRP結合第２抗体
を加えた後、連続して６回の異なる洗浄（すなわち５％のLFMを含有するPBSで１
回洗浄、0.05％ TWEEN-20を補充した同じバッファーで３回洗浄、続いてさらに
PBS/LFMバッファーを用いてさらに２回洗浄）を行った。0.05Mクエン酸バッファ
ー(pH5.0）中の200μl／ウェルの0.4mg/ml OPD基質および60mg/mlの過酸化水素
を加えた後、ELISAプレートを暗中およびRTで発色するまで（通常、約30分）イ
ンキューベーションした。最後に、反応は50μl/ウェルの2.5M 硫酸を添加する
ことにより停止させ、そして490nmでの光学密度はバイオ−ラッド（Bio-Rad)355
0マイクロプレートリーダーをMicroplate Manager(商標)ソフトウェアパッケー
ジと共に使用して測定した。
【００６８】 結果 実施例４ キメラγ1/κBAT抗体の構築 すべての計画のように、厳しいPCR-クローニングおよびシークエンシングプロ
トコールに従った。これはPCR-修飾工程中、マウス可変領域遺伝子の野生型の配
列にエラーが導入される可能性を最小にするために行った。プライマーC0224お
よびC0225（表１）を使用して、マウスBAT Ｖκ遺伝子（図２）をPCRを介して修
飾して、418bpのバンドを生成した（データは示さず）。このPCR生成物をpCR2.1
プラスミドに連結し、そしてINVαF'コンピテント細胞に形質転換した。同様に
、マウスBAT ＶH遺伝子（図１）はプライマーB8814およびB8815（表１）を使用
してPCR-変異させて、436bpのバンド(データは示さず)を生成した。このPCR−生
成物もpCR2.1プラスミドに連結し、そしてINVαF'コンピテント細胞に形質転換
した。
【００６９】 次いで推定上の陽性形質転換体は、PCR-スクリーニングアッセイ（データは示
さず）を使用して検出した後、最終的にABI Prism 310 遺伝子分析機でds-DNA
をシークエンシングした。図３および図４は、それぞれキメラBAT Ｖκ遺伝子お
よびBAT ＶH遺伝子のDNA配列分析の結果を表す。分析はそれらの成功裏の突然変
異誘発を確認し、そして遺伝子中に導入されたかもしれないPCR-エラーの存在も
示す両方のために行った。ただ１つのPCR-反応を各可変領域遺伝子について行い
、そしてこのような各PCR-反応からの２つのみのクローンを最終的にDNAシーク
エンシングまで行った。
【００７０】 にもかかわらず、正しい修飾DNA配列を含む各修飾可変領域遺伝子について、
少なくとも１つのクローンを単離することで十分であることが示された。
【００７１】 突然変異したＶHおよびＶκ遺伝子は、次いで適当な発現ベクターにhidIII/Ba m HIフラグメントとしてサブクローン化して、それぞれpKN110-BATVκ(7.88kb)お
よびpG1D110-BATVH(7.55kb)を作成した。構築した発現ベクターの忠実度（fidel
ity)は、制限酵素分析により確認した(データは示さず)。いったんCOS細胞にコ
ー-トランスフェクトされれば、このようなベクターはキメラBAT抗体のγ1/κ形
態(version）一過性発現を可能とする。
【００７２】 加えて、BAT抗体ヒト化計画のさらなる成分として、BATVH遺伝子もHidIII/Bam HIフラグメントとしてpG3D110およびpG4D1100重鎖発現ベクターの両方にサブク
ローン化した。このようなベクターは、cDNAコピーγ１ヒト定常領域遺伝子を３ γ 定常領域遺伝子（pG3D110の場合）のcDNAコピー、またはγ３定常領域遺伝子
（pG3D110の場合）のcDNAコピー、またはγ４定常領域遺伝子（pG3D110の場合）
のcDNAコピーのいずれかと置き換えることを除き、pG1D110と同一である。COS細
胞中のキメラBAT抗体の両γ3/κおよびγ4k形態のこのようなベクター（すなわ
ち、pG3D110−BATVκ、の構築。
【００７３】 実施例５ キメラγ1/κBAT抗体の一過性発現 ２つのベクター pKN110-BATVκおよびpG1D110-BATVHを、一連の反復一過性発
現実験においてCOS細胞中にコー-トランスフェクトした。72hr発現させた後、マ
ウス−ヒトγ1/κキメラBAT抗体をγ1/κELISAを介してCOS細胞のコー-トランス
フェクションの上清中に検出した。このようなアッセイから、培地中で検出され
るγ1/κキメラBAT抗体の平均濃度は、509±272ng/mlと算出された。
【００７４】 興味深いことには、キメラBAT抗体のγ3/κおよびγ4/κ形態が、それらの発
現COS細胞に従い有意に大量の抗体を生産するようであった。具体的にはpG3D110
-BATVHおよびpKN110BATVκをCOS細胞にコー-トランスフェクトする時、上清の最
初の分析（4.3章に記載したELISA法および標準としてヒトIgG3/カッパ抗体を使
用する）、キメラγ3/κBAT抗体の測定された発現レベルは、6.7μg/mlになった
。さらにpG4D110-BATVH pKN110BATVκをCOS細胞で発現させた時、同じELISA（標
準としてヒトIgG4/カッパ抗体を使用する）で、キメラγ4/κBAT抗体の測定され
たレベルは、8.2μg/mlになった。
【００７５】 実施例６ キメラγ1/κBAT抗体の精製 コー-トランスフェクションあたり約８mlを回収するために、200mlのCOS上清
が集まるまで連続してトランスフェクションを行った。この上清の容量は次いで
上清をPM30フィルター膜（これは30kDaの分子量カット-オフを有する）を持つ微
−容量撹拌超遠心細胞を通すことにより15mlに減少させた。
【００７６】 Immunopure(商標)IgG精製キットは、本質的に固定化プロテインＧカラムの２m
lのカラムから成っていた。抗体は６mlの溶出バッファーを用いてカラムから溶
出させ、その溶出液を１mlの画分に集めた。各画分のキメラγ1/κBAT抗体の濃
縮は、Ｃ３章に記載したELISA法を使用してアッセイした。この分析によりキメ
ラ抗体が画分３（42.05μg/ml）およびに画分４（20.05μg/ml）存在し、これは
62.1μgのキメラγ1/κBAT抗体の総回収量に相当することが分かった。これはさ
らに分析するためにCuretechに移すまで-20℃で保存した。
【００７７】 実施例７ キメラγ1/κBat抗体によるDaudi細胞結合の分析 Daudi細胞ELISAを使用して、精製されたキメラγ1/κBAT抗体がDaudi細胞に結
合することが明らかに示された。図９は１つの実験の典型的な例を表す。しかし
同じELISAでより決定的ではないのは同様な濃度のマウスBAT抗体の結合であり、
これはキメラ抗体よりも低くなるようであった。しかしDaudi細胞への抗体結合
を直接検出するために使用する結合第２抗体は、各抗体構築物で異なるので、２
つの形態の直接的な比較を正当に行うことはできない。
【００７８】
【表４】
【００７９】
【表５】
【００８０】 IV 本発明のMABが結合するDaudi Ｂ-細胞リンパ芽球細胞系抗原から採取した３
種のペプチドのアミノ酸配列 本発明のmABが結合するDaudi Ｂ-細胞リンパ芽球細胞の抗原性エピトープ内で
構成される３種のペプチドをシークエンシングした。それらの配列を図１０、１
１および１２に表す。
【００８１】 非重複遺伝子バンクデータベースおよびEST 部門に対して行った調査では、10
のEXPECT値およびマトリックスBLOSUM 62を用いてTABLASTINアルゴリズム（バー
ジョン２）を使用した質問として３種のペプチドをランした時、ヒットしなかっ
た。
【００８２】 しかし、ペプチドは小さいペプチドであるので、それらを再度、より高いEXPE
CT値でかけて調査の厳密性を下げた。フィルターも複雑性を低くするために除去
し（unmasked)、これはブラスト報告から混乱する対合の可能性を排除すること
ができ（例えば、プロリンが豊富な領域またはポリＡ−テイルに対するヒット）
、ブラスト統計が対合様式の配列の特異性を反映する領域を残す。本発明を３種
のペプチドは、たとえ低い厳密度でも遺伝子バンクデータベースおよびEST 部門
データベースにヒットをしなかった。
【００８３】 このように上記の結果に従い、上記３種のペプチドは新規ペプチドであると思
われる。 IV 本発明のMABを使用した患者の悪性疾患の診断 検査した個体の末梢血リンパ球を、抗−CD3抗体および本発明のmABの１つで二
重標識した。本発明のmABに結合するCD3+細胞のパーセントを決定した。本発明
に従い、悪性疾患の持つ個体中の多数のCD3+mAB+細胞は、健康な個体から得た血
液サンプル中のこのような細胞のパーセントとは異なっていることが分かった。
悪性疾患の持つ個体中のCD3+のパーセントの有意差が存在するという事実、およ
びこの差異が健康な個体から得たCD3+mAB+のパーセントよりも高いかまたは低い
かは、個体が悪性疾患を有するかどうか、ならびに検査した個体が高い確率で有
するかもしれない悪性疾患の具体的な種類を決定することを可能とする。
【００８４】 典型的には、ヒト末梢血リンパ球を健康な個体またはガン患者からの20mlの血
液から、Ficoll Hypaque密度遠心により得た。細胞を洗浄し、そして0.5％BSAお
よび酸として0.05％を含有するPBSに懸濁した。0.5×106細胞を含有するサンプ
ルをFACS分析に使用した。最初に細胞を本発明のmAbの標準的量と０℃で45分間
インキューベーションし、続いてそれらをFITCに結合した抗-マウスmAbと氷上で
30分間インキューベーションした。２回洗浄し、そして1200rpmで遠心した後、
細胞をPE抗体に結合した抗-ヒトCD3と氷上で30分間インキューベーションした。
このインキューベーション後、細胞を２回洗浄し、そしてサンプルをFACSスキャ
ン（ベクトン デッキンソン:Bectan Dickinson）により分析する。結果を図１３
〜１７に示す。
【００８５】 図１３ならびに図１７から分かるように、健康な個体から得た血液サンプル中
のCD3+BAT+細胞のパーセントは（全CD3+細胞に対して）、約25％の範囲である。
図１４から分かるように、結腸ガンを有する患者から得た血液サンプル中のCD3+ BAT+細胞のパーセントは実質的に低く、健康な個体と比べた時、約７％の範囲で
ある。同様に、胸部ガンを有する患者から得た血液サンプル中のCD3+BAT+細胞の
パーセントは、約10％の範囲である（図１５）。このような結果は、結腸および
胸部ガンが健康な個体と比べた時にCD3+BAT+細胞のパーセントが下がるという事
実により同定され得ることを明らかに示している。
【００８６】 図１６から分かるように、前立腺ガン患者から得た血液サンプル中のCD3+BAT+ 細胞のパーセントは、健康な個体の血液サンプル中のパーセントよりも有意に高
く、約50％の範囲である。このような結果は、前立腺ガンはCD3+BAT+細胞のパー
セントが健康な個体と比べて高いという事実により同定され得ることを明らかに
示している。図１８から分かるように、前立腺ガン患者から得たＴ−細胞上で見
いだされた本発明のmAbが結合する抗原の量は大変高いが、この抗原は胸部ガン
の患者から得たＴ−細胞では検出することができない。
【００８７】 上記の結果は、本発明のmAbが特定の種類の悪性疾患に罹患している個体を同
定するために使用できることを示している。すなわち、血液サンプルが検査した
個体から得られ、そして本発明のmAbがサンプル中のCD3+細胞に結合する程度が
有意に高い場合（約50％の範囲）、検査した個体が前立腺ガンに罹患している確
率が高い。これに対して、サンプル中のCD3+細胞のパーセントが健康な個体と比
べて有意に低い場合（約７％または10％の範囲）、検査した個体は胸部または結
腸ガンに罹患している確率が高い。明らかに、検査した個体が男性の個体ならば
、彼は結腸ガンに罹患している可能性が高い。
【００８８】 上記の実施例は限定と解釈されず、そして本発明のmAbが結合するCD3+細胞の
パーセントと他の悪性疾患との間のさらなる相関も、本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のmAbの重鎖可変領域のDNAおよびペプチド配列を表す。
【図２】 本発明のmAbのカッパ軽鎖可変領域のDNAおよびペプチド配列を表す。
【図３】 本発明の抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列の分析を表す(“BAT"と命名。“B AT "はBAT抗体ＶH領域のアミノ酸配列と定義し、一方“VMS2"は生殖細胞系VMS2/V
GK4生殖細胞系遺伝子のアミノ酸配列と定義する。BAT配列および生殖細胞系配列
が同一である場合、生殖細胞系配列はドット（.）により表示し；誤対合がある
場合は、異なる生殖細胞系残基を表す。以下の表で、続く頁の配列は特定のアミ
ノ酸が、Kabat et al.,免疫学的に興味深いタンパク質の配列（Sequences of pr oteins of immunological interest ）(1991)のマウス重鎖サブグループ雑多(mis
cellaneous)(マウス ＶH Misc.）およびより大きな既知のマウスＶH配列（すべ
てのマウスＶH)にわたる両方の中の特定の残基の位置に見いだされた頻度を記載
する。
【図４】 本発明の抗体のカッパ軽鎖可変領域のアミノ酸配列の分析を表す(図では“BAT
"と命名した）。“マウス"はBAT抗体ＫK領域のアミノ酸配列と定義し、一方“Ge rm "は生殖細胞系H4生殖細胞系遺伝子のアミノ酸配列と定義する。BAT配列および
生殖細胞系配列が同一である場合、生殖細胞系配列はドット（.）により表示し
；誤対合がある場合は、異なる生殖細胞系残基を表す。以下の表および続く頁で
は、特定のアミノ酸が、Kabatのマウス重鎖サブグループVI(マウスＶkVI）およ
びおよびより大きな既知のマウスＶH配列に（すべてのマウスＶH)にわたる両方
の中の特定の残基の位置に見いだされた頻度を記載する。
【図５】 本発明のキメラ抗体のカッパ軽鎖可変領域のDNAおよびペプチド配列を表す。
【図６】 本発明のキメラ抗体の重鎖可変領域のDNAおよびペプチド配列を表す。
【図７】 本発明のキメラ抗体のカッパ軽鎖の発現のために使用したpKN 110哺乳動物発
現ベクターの該略図を表す。
【図８】 本発明のキメラ抗体の重鎖の発現のために使用したpG1D 110哺乳動物発現ベク
ターの該略図を表す。
【図９】 本発明のマウスおよびγ1/カッパキメラ抗体のDaudi細胞に対する結合特性を
測定するELISAアッセイの結果を例示するグラフ表示を表す。
【図１０】 本発明のペプチド１のアミノ酸配列を表す。
【図１１】 本発明のペプチド２のアミノ酸配列を表す。
【図１２】 本発明のペプチド３のアミノ酸配列を表す。
【図１３】 FACS分析により測定された、健康な個体の血液サンプル中のCD3+細胞の総数に
比較して、本発明のmAb（“BAT"と同一）にも結合するCD3+細胞のパーセントを
示す概略的表示である。
【図１４】 FACS分析により測定された、結腸ガンを有する患者から採取した血液サンプル
中のCD3+細胞の総数に比較して、本発明のmAb（“BAT"と表示）にも結合するCD3 + 細胞のパーセントを表す。
【図１５】 胸部ガンを有する患者から採取した血液サンプル中のCD3+細胞の総数に比較し
て、本発明のmAb（“BAT"と表示）にも結合するCD3+細胞のパーセントを表す。
【図１６】 前立腺ガンを有する患者から採取した血液サンプル中のCD3+細胞の総数に比較
して、本発明のmAb（“BAT"と表示）にも結合するCD3+細胞のパーセントを表す
。
【図１７】 胸部ガン、結腸ガンまたは前立腺ガンを有する患者と比較して、健康な個体に
おいて本発明のmAb（“BAT"と表示）に結合するCD3+細胞の平均パーセントを示
す概略的表示である。
【図１８】 前立腺ガン、耳、鼻および喉（ENT）ガン、胸部ガンを有する個体のＴ-細胞か
ら、あるいはDaudi細胞の膜から得たペプチドのウエスタンブロットの写真であ
る。このブロットは本発明のmAbとインキューベーションされ、そして胸部ガン
を有する患者から得たＴ-細胞中の検出不可能な抗原レベルに比べて、前立腺ガ
ンを有する患者から得たＴ-細胞中の抗原量の増加を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 16/18 ４Ｃ０８４ 7/08 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｃ０８５ 16/18 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 5/10 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA26 AA40 DA36 DA37 FB03 FB07 4B024 AA01 AA12 BA46 CA04 DA02 HA15 HA17 4B063 QA01 QA19 QQ08 QQ79 QR48 QR77 QS33 QX02 4B064 AG27 CA19 DA05 DA14 4B065 AA91X AB01 AB02 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA16 BA17 BA18 CA27 CA59 NA14 ZB26 4C085 AA03 AA14 BB01 CC23 EE01 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 BA13 BA15 BA16 CA40 DA76 DA86 EA28 EA51 FA74

Claims (48)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）図１のアミノ酸配列を含んで成る重鎖可変領域を有す
    るモノクローナル抗体； （ｂ）図２のアミノ酸配列を含んで成るカッパ軽鎖可変領域を有するモノクロー
    ナル抗体； （ｃ）図１のアミノ酸配列を含んで成る重鎖可変領域および図２のアミノ酸配列
    を含んで成るカッパ軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体； （ｄ）図１のアミノ酸配列に対して少なくとも70％の同一性を有する重鎖可変領
    域を有するモノクローナル抗体； （ｅ）図２のアミノ酸配列に対して少なくとも70％の同一性を有する軽鎖可変領
    域を有するモノクローナル抗体 から成る群から選択される可変領域を有するモノクローナル抗体。
  2. 【請求項２】 図１のアミノ酸配列を含んで成る重鎖可変領域を有する請求
    項１に記載のモノクローナル抗体。
  3. 【請求項３】 図２のアミノ酸配列を含んで成るカッパ軽鎖可変領域を有す
    る請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  4. 【請求項４】 図１のアミノ酸配列を含んで成る重鎖可変領域および図２の
    アミノ酸配列を含んで成るカッパ軽鎖可変領域を有する請求項１に記載のモノク
    ローナル抗体。
  5. 【請求項５】 図１のアミノ酸配列に対して少なくとも70％の同一性を有す
    る重鎖可変領域を有する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  6. 【請求項６】 図２のアミノ酸配列に対して少なくとも70％の同一性を有す
    る軽鎖可変領域を有する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
  7. 【請求項７】 請求項１ないし６に記載のいずれか１つのmAbが特異的に結
    合する抗原に結合する抗体。
  8. 【請求項８】 キメラ ヒト−マウス抗体である、請求項１ないし７のいず
    れかに記載の抗体。
  9. 【請求項９】 請求項１ないし８のいずれかに記載のmAbのアミノ酸配列を
    コードする核酸配列。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載の核酸配列を有する発現ベクター。
  11. 【請求項１１】 プラスミドpKN110と命名された請求項１０に記載の発現ベ
    クター。
  12. 【請求項１２】 プラスミドpG1D110と命名された請求項１０に記載の発現
    ベクター。
  13. 【請求項１３】 請求項１０ないし１２に記載のいずれか１つの発現ベクタ
    ーでトランスフェクトされた細胞。
  14. 【請求項１４】 請求項１ないし８項に記載のいずれかのmAbを生産するハ
    イブリドーマ細胞系。
  15. 【請求項１５】 図１０に示すペプチドのアミノ酸配列を有するペプチド。
  16. 【請求項１６】 図１１に示すペプチドのアミノ酸配列を有するペプチド。
  17. 【請求項１７】 図１２に示すペプチドのアミノ酸配列を有するペプチド。
  18. 【請求項１８】 請求項１２ないし１４項に記載のいずれか１つのペプチド
    のアミノ酸配列に対して、少なくとも85％の同一性を有するペプチド。
  19. 【請求項１９】 請求項１２ないし１５に記載の１以上のペプチドを含んで
    成るタンパク質またはペプチド。
  20. 【請求項２０】 請求項１に記載のいずれか１つのmAbに対して同じ結合レ
    ベルを実質的に有する、請求項１２ないし１５に記載のいずれかのペプチドの同
    族体。
  21. 【請求項２１】 検査した個体が高い確率で悪性疾患を有することを同定す
    るためのアッセイであって： （ａ）該個体から体液サンプルを得； （ｂ）該サンプルを請求項１ないし８に記載の少なくとも１つのmAbと接触させ
    ； （ｃ）該mAbが該サンプル中のＴ-細胞に結合する程度を測定し；そして （ｄ）（ｃ）の程度を、mAbが健康な個体から得たサンプル中のＴ-細胞に結合す
    る程度と比較することを含んで成り、上記の２つの結合程度間の有意差は該検査
    した個体が高い確率で悪性疾患を有することを示す、 上記アッセイ。
  22. 【請求項２２】 工程（ｂ）の前に、末梢血単核細胞（PBMC）を分離し、該
    分離したPBMCを次に工程（ｃ）で該請求項１ないし８に記載の少なくとも１つの
    mAbと接触させる、請求項２１に記載のアッセイ。
  23. 【請求項２３】 該体液が血液である、請求項２１または２２に記載のアッ
    セイ。
  24. 【請求項２４】 検査した個体が高い確率で特別な悪性疾患を有することを
    同定するためのアッセイであって： （ａ）該個体から体液サンプルを得； （ｂ）該サンプルを請求項１ないし８のいずれかに記載のmAbと接触させ； （ｃ）該mAbが該サンプル中のＴ-細胞に結合する程度を測定し；そして （ｄ）（ｃ）の程度を、mAbが健康な個体から得たＴ-細胞に結合する程度と比較
    することを含んで成り、結合程度間の有意差の存在は該検査した個体が高い確率
    で悪性疾患を有することを示し、ここで該個体のＴ-細胞への結合の程度が健康
    な個体のＴ-細胞におけるmAbの結合レべルよりも高くても低くても、検査した個
    体が高い確率で特別な種類の悪性疾患を有することを示している、 上記アッセイ。
  25. 【請求項２５】 工程（ｂ）の前に、PBMCを該サンプルから分離し、該PBMC
    を次に工程（ｃ）で該mAbと接触させる、請求項２４に記載のアッセイ。
  26. 【請求項２６】 mAbが上記の検査した個体から得たＴ-細胞に結合する程度
    が、同じmAbが健康な個体のＴ-細胞に結合する程度よりも高い、請求項２４また
    は２５に記載のアッセイ。
  27. 【請求項２７】 上記の特別な悪性疾患が前立腺ガンである、請求項２６に
    記載のアッセイ。
  28. 【請求項２８】 mAbが上記の検査した個体から得たＴ-細胞に結合する程度
    が、同じmAbが健康な個体のＴ-細胞に結合する程度よりも低い、請求項２４また
    は２５に記載のアッセイ。
  29. 【請求項２９】 上記の特別な悪性疾患が胸部ガンである、請求項２８に記
    載のアッセイ。
  30. 【請求項３０】 上記の特別な悪性疾患が結腸ガンである、請求項２８に記
    載のアッセイ。
  31. 【請求項３１】 医薬的に許容され得るキャリアーと一緒に請求項１ないし
    ８に記載の１以上のmAbを含んで成る医薬組成物。
  32. 【請求項３２】 上記mAbの特異的結合パートナーの結合物、検出可能なシ
    グナルを生成することができる標識および使用説明書と一緒に請求項１ないし８
    に記載の１以上のmAbを含んで成るキット。
  33. 【請求項３３】 医薬的に許容され得るキャリアーと一緒に請求項１ないし
    ８のいずれかに記載の１以上のmAbを有効成分として含んで成る医薬組成物。
  34. 【請求項３４】 ガンの処置のための請求項３３に記載の医薬組成物。
  35. 【請求項３５】 個体の悪性疾患を処置するための医薬組成物を調製するた
    めの請求項１ないし８に記載のいずれかのmAbの使用。
  36. 【請求項３６】 治療に効果的な量の請求項１ないし８のいずれかに記載の
    １以上のmAbを必要とする個体に投与することを含んで成る、悪性疾患の処置法
    。
  37. 【請求項３７】 医薬的に許容され得るキャリアーと一緒に請求項１５ない
    し２０に記載の１以上のペプチドを有効成分として含んで成る医薬組成物。
  38. 【請求項３８】 免疫学的に許容され得るキャリアーと一緒に請求項１５な
    いし２０に記載の１以上のペプチドを有効成分として含んで成る悪性疾患に対し
    て免疫感作するためのワクチン調製物。
  39. 【請求項３９】 悪性疾患の処置のための医薬調製物を調製するための、請
    求項１５ないし２０のいずれかに記載のペプチドの使用。
  40. 【請求項４０】 治療に効果的な量の請求項１５ないし２０のいずれかに記
    載のペプチドを必要とする個体に投与することを含んで成る、悪性疾患の処置法
    。
  41. 【請求項４１】 上記ガンが充実性腫瘍である、請求項３４に記載の医薬組
    成物。
  42. 【請求項４２】 上記の充実性腫瘍が前立腺ガンである、請求項４１に記載
    の医薬組成物。
  43. 【請求項４３】 上記の充実性腫瘍が胸部ガンである、請求項４１に記載の
    医薬組成物。
  44. 【請求項４４】 上記の充実性腫瘍が結腸ガンである、請求項４２に記載の
    医薬組成物。
  45. 【請求項４５】 上記の悪性腫瘍が充実性腫瘍である、請求項４０に記載の
    方法。
  46. 【請求項４６】 上記の充実性腫瘍が前立腺ガンである、請求項４５に記載
    の方法。
  47. 【請求項４７】 上記の充実性腫瘍が胸部ガンである、請求項４５に記載の
    方法。
  48. 【請求項４８】 上記の充実性腫瘍が結腸ガンである、請求項４５に記載の
    方法。
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