JP2010254682A

JP2010254682A - 抗フィブロネクチンフラグメントモノクローナル抗体

Info

Publication number: JP2010254682A
Application number: JP2010080085A
Authority: JP
Inventors: Chika Kato; 千加加藤; Yuka Sano; 結花佐野; Kyoko Kamihagi; 京子上萩; Ikunoshin Kato; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2010-03-31
Publication date: 2010-11-11
Also published as: EP2236517A1; US8349569B2; CN101974087A; US20100248262A1

Abstract

【課題】操作が簡便で、かつ測定精度、特異性、再現性に優れたフィブロネクチンフラグメントの測定手段を提供すること。
【解決手段】ヒトフィブロネクチンフラグメントと反応し、ヒトフィブロネクチンと反応しないことを特徴とする抗フィブロネクチンフラグメントモノクローナル抗体、当該モノクローナル抗体を含有する測定試薬、当該モノクローナル抗体を使用するフィブロネクチンフラグメントの測定方法、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヒトフィブロネクチンフラグメントに対して特異性を有する抗フィブロネクチンフラグメントモノクローナル抗体及びその使用方法に関する。

フィブロネクチン（以下ＦＮと記載する）は動物の血液中、培養細胞表面、組織の細胞外マトリックスに存在する分子量約２５万の巨大な糖タンパク質であり、多彩な機能を持つことが知られている。そのドメイン構造は７つに分けられており、またそのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれており、これら各配列の繰返しで全体が構成されている。３種類の類似の配列はＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型と呼ばれ、このうち、ＩＩＩ型はアミノ酸残基７１〜９６個のアミノ酸残基で構成されており、これらのアミノ酸残基の一致率は１７〜４０％である。ＦＮ中には１４のＩＩＩ型の配列が存在するが、そのうち、８番目、９番目、１０番目（以下、それぞれＩＩＩ−８、ＩＩＩ−９、ＩＩＩ−１０と称する）は細胞結合ドメインに、また１２番目、１３番目、１４番目（以下、それぞれＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４と称する）はヘパリン結合ドメインに含有されている。また、ＩＩＩ−１０にはＶＬＡ（ｖｅｒｙｌａｔｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｔｉｇｅｎ）−５結合領域が含まれており、このコア配列はＲＧＤＳである。また、ヘパリン結合ドメインのＣ末端側にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳには２５アミノ酸からなるＶＬＡ−４に対して結合活性を有するＣＳ−１と呼ばれる領域が存在する。

ＦＮは上記のとおり細胞への接着、シグナル伝達など様々な生理活性を有する。これらの生理活性に関する研究には、一般の生理活性物質と同様にその特異的抗体を使用することが有利である。ＦＮと反応するモノクローナル抗体は既に報告されている（特許文献１）。

一方、ＦＮの機能性ドメイン又はその一部からなるＦＮフラグメントが作製されている（非特許文献１）。ＦＮフラグメントのあるものは、レトロウイルスベクターを用いた造血幹細胞への遺伝子導入効率を向上させることが知られている（非特許文献２、３）。さらに、ＦＮフラグメントを免疫細胞の培地に添加する培養方法が報告されている（特許文献２）。このように、ＦＮフラグメントは、細胞培養培地への添加、細胞培養容器への固相化などに使用されている。

特公平６−４４８７７号公報国際公開第０３／０１６５１１号パンフレット

Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１年，Ｖｏｌ．１１０，Ｎｏ．２，ｐ２８４−２９１．ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，１９９７年，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．１８，ｐ２１９３−２２０６．ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，１９９６年，Ｖｏｌ．２，ｐ８７６−８８２．

ＦＮフラグメントはＦＮの一部分のポリペプチドであるため、ＦＮフラグメントと反応する抗体はＦＮとも交差反応する。またＦＮは血清等の血液成分中に多量に含まれるため、血清や血清を含む被験試料の場合には当該試料中に含まれるＦＮフラグメントをＦＮと区別して特異的に測定することは実施不能であった。
しかしながら、操作が簡便で、かつ測定精度、特異性、再現性に優れたＦＮフラグメントの測定手段の開発が望まれていた。

本発明者らは鋭意努力を重ね、従来入手されていなかった、ＦＮフラグメントを特異的に認識し、ＦＮを認識しない抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体の創成に成功し、当該モノクローナル抗体を使用することにより、従来の課題が解決されること、すなわち当該モノクローナル抗体を使用すれば、培養細胞培地中や細胞培養容器の洗浄液中、更には血液試料中のＦＮフラグメントのモニタリングにも有用であることを見出し本発明を完成させた。

本発明を概説すれば、
［１］ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）フラグメントと反応し、ヒトＦＮと反応しないことを特徴とする抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体、
［２］配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するヒトＦＮフラグメントと反応する［１］の抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体。
［３］抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞ＲＮＩＩＣ５７Ｚ７１−３Ａ（ＦＥＲＭＢＰ−１１２０２）より産生され得るモノクローナル抗体ＲＮＩＩＣ５７Ｚ７１−３Ａである［１］の抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体。
［４］被験試料中のＦＮフラグメントを測定する試薬において、［１］の抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体を含むＦＮフラグメント測定試薬。
［５］さらにヒトＦＮフラグメントと反応する抗体を含む［４］のＦＮフラグメント測定試薬。
［６］［１］の抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体又は［４］のＦＮフラグメント測定試薬を使用する被験試料中のＦＮフラグメントの測定方法。
［７］ヒトＦＮを含有する被験試料中のヒトＦＮフラグメントを測定する［６］のＦＮフラグメントの測定方法。
［８］被験試料が、生体由来試料又は培養細胞由来試料から選ばれる［６］又は［７］の測定方法。
［９］請求項１記載の抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体を産生する、寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１２０２で表されるハイブリドーマ細胞。

本発明により、操作が簡便で、かつ測定精度が高く、特異性並びに再現性にも優れた抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体が安定して提供される。
本発明の試薬は、被験試料中のＦＮフラグメントの量を調べることができる。さらに、本発明の抗体は、全長のＦＮを認識しないため、血清等のＦＮが混在する可能性のあるサンプルであっても、特異的かつ正確にＦＮフラグメントを測定することができることに顕著な効果を有する。

本発明において「フィブロネクチン」（ＦＮ）とは、血液中、培養細胞表面、組織の細胞外マトリックスに存在する分子量約２５万の巨大な糖タンパク質であり、２０００を超えるアミノ酸残基から構成される。ＦＮは多くのスプライシングバリアントの存在が知られている。例えば、血漿由来のＦＮの場合、細胞結合ドメインの上流に存在するＥＤ−Ｂと呼ばれる領域、細胞結合ドメインとヘパリン結合ドメインの間に存在するＥＤ−Ａと呼ばれる領域が欠失していることが知られているが、このような血漿由来のＦＮも、天然に存在する全長のＦＮであれば本発明におけるＦＮに含まれる。ＦＮをコードする核酸配列及びＦＮのアミノ酸配列については、ＧｅｎｂａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７に開示されている。

本発明において「フィブロネクチンフラグメント」（ＦＮフラグメント）とは、ＦＮの一部を含有するポリペプチドを意味する。ＦＮがフィブロネクチンの全長を有するのに対し、ＦＮフラグメントはＦＮの一部の配列を有するポリペプチドであり、例えば特定のドメイン領域又はその一部を有する組換えポリペプチド、すなわち組換えＦＮフラグメントであってもよい。さらに、同一もしくは異なる複数のＦＮフラグメントが結合した形態の組換えポリペプチドも本発明におけるＦＮフラグメントに包含される。

本発明において「モノクローナル抗体」とは、単一クローンの抗体生産細胞が分泌する抗体を意味し、単クローン（性）抗体ともいう。特定の抗原決定基を認識する抗体であり、アミノ酸配列の一次構造が均一である。本発明のモノクローナル抗体は、細胞融合法により調製されるハイブリドーマが産生する抗体に加えて、抗体産生細胞のｍＲＮＡ等を用いて遺伝子工学的に作製された抗体も含まれる。

本発明において「ＦＮフラグメントと反応し、ヒトＦＮと反応しない」とは、本発明のモノクローナル抗体が、ヒトＦＮと免疫反応を強く起こさないことを意味する。特に限定はされないが、例えば、本発明のモノクローナル抗体を用いて、ヒトＦＮを測定した場合、その測定値は、当該ＦＮと同濃度又は同分子数のＦＮフラグメントを測定した場合の測定値に比べて極めて低値、又は実質的に測定値として意味の無い数値であり、１％以下、好ましくは０．１％以下、特に好ましくは０．０１％以下である。最も好ましい態様において、ＦＮの測定値は検出限界以下である。

（１）本発明の抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体
すなわち本発明を概説すれば、本発明はＦＮフラグメントと反応し、ＦＮと反応しないモノクローナル抗体に関するものである。本発明の抗体はＦＮフラグメントを認識するため、血液成分、例えば血清中に存在する天然のＦＮと反応しない、すなわち全長のＦＮに反応しないので、この点で極めて有用である。

本発明の抗体は、例えば血清を含む被験試料であっても、血清に混在するヒトＦＮの影響を受けることなくＦＮフラグメントを特異的に測定することができる。したがって、ヒトの血液、血清、血漿などの血液成分由来のヒトＦＮを含む培地で培養したヒト培養細胞の抽出物や培養上清中のＦＮフラグメントを特異的かつ高感度に測定することができる。例えば、ＦＮフラグメントを使用した細胞への遺伝子導入や細胞培養の際に、ヒト血清を含む培地を使用してもＦＮフラグメントの濃度をモニターすることができる。更に血液試料等の生体被験試料中のＦＮフラグメントの高感度測定及びモニタリングにも有用である。また、ＦＮフラグメントを使用して遺伝子導入又は培養した細胞を生体内に導入する際に、細胞とともに混入した生体内のＦＮフラグメントをモニターすることができる。

さらに、本発明の抗体は、生体内におけるＦＮフラグメントに対する抗体産生のモニタリングに使用することができる。例えば、ＦＮフラグメントを固定化したプレートを用意し、ヒト血清などの生体由来の試料と本発明の抗体とを競合させることにより、生体内に産生されたＦＮフラグメントに対する抗体を検出することができる。生体は免疫系の異常等のためにＦＮに対する自己抗体を産生する場合がある。このような場合に、ＦＮフラグメントに対する抗体の産生を特異的に見出すためには、ＦＮフラグメントと特異的に反応する抗体を使用する検出系が有効である。

本発明の一例の抗体が反応するＦＮフラグメントは、ＦＮの７つのドメインの１つである細胞結合ドメインを含むポリペプチドである。すなわち、本発明の抗体が反応するＦＮフラグメントは、ＦＮのＩＩＩ−８、９、１０から構成される細胞接着ドメインの少なくとも一部を含むフラグメントである。このＦＮフラグメントの鎖長としては、例えば５０〜１５００アミノ酸残基、好ましくは１００〜１０００アミノ酸残基、より好ましくは２００〜８００アミノ酸残基、特に好ましくは２５０〜６００アミノ酸残基の鎖長である。例えば前記非特許文献１に記載されたＣＨ−２９６及びＣ−２７４、特許文献２に記載されたＣＨＶ−８９、ＣＨＶ−９２及びＣＨＶ−１８１が例示される。前記のＣＨ−２９６はレトロネクチン（登録商標）の名称で市販されている。ＣＨ−２９６のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に、Ｃ−２７４のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に、ＣＨＶ−８９のアミノ酸配列を配列表の配列番号４に、ＣＨＶ−９２のアミノ酸配列を配列表の配列番号５に、ＣＨＶ−１８１のアミノ酸配列を配列表の配列番号６にそれぞれ示す。
本発明の抗体は、前記ＦＮフラグメントの少なくとも１つに反応し、ＦＮとは反応しない。

また、本発明の抗体にペプシン、パパイン等のタンパク質分解酵素を作用させ、抗体のＦｃ部分を除去して得られる、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等のフラグメントも本発明で使用する抗体に含まれる。

さらに、得られたモノクローナル抗体を基に、遺伝子工学的に製造される組換え抗体や、定常領域を他の抗体の定常領域に置換したキメラ抗体であっても良い。このような抗体は、二重特異性抗体（二価抗体）、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ_３、Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔｒｉａｂｏｄｙ、Ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、Ｍｉｎｉｂｏｄｙ、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２−Ｆｃ、ｉｎｔａｃｔ−ＩｇＧが例示され、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２３巻、第９号、ｐ．１１２６−３６（２００５）に詳述される。

本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合法によって作製されたハイブリドーマを使用して製造され得る。前記ハイブリドーマは、抗体産生細胞の集団と骨髄腫細胞と融合ハイブリドーマを形成させ、該ハイブリドーマをクローン化し、ＦＮフラグメントを認識する抗体を産生するクローンを取捨選択し、さらに本発明の目的に好適なクローンを選別することによって初めて樹立される。
抗体産生細胞には、ＦＮフラグメント又はその一部によって免疫された動物の脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等が利用できる。免疫させる動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、ヤギ、ウサギ等が挙げられる。免疫原として用いる前記ＦＮフラグメントは、ＦＮフラグメントをコードする遺伝子を使用して遺伝子工学的に組換えタンパク質として調製することができる。また、人工的にＦＮフラグメント又はその一部のポリペプチドを合成して調製することができる。かくして得られたＦＮフラグメント又はその一部を、そのまま単独で動物の免疫に使用する。また、例えばＫＬＨ（ＫｅｙｈｏｌｅＬｉｍｐｅｔＨｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に代表されるキャリアタンパクと結合後、又はＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）と混合後、フロイントのアジュバントと混合し、動物の免疫に使用する。あるいはＦＮフラグメント又はその一部を直接フロイントのアジュバントと混合し、動物の免疫に使用する。免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に１回に２０〜２００μｇの抗原−アジュバント混合物を投与することにより行われる。例えば、抗原−アジュバント混合物を２〜３週間に１回の間隔で３〜７回投与することにより、最終免疫より約３〜５日後、免疫動物の脾臓から抗体産生細胞を分取することができる。また、抗原−アジュバント混合物を１回投与し、約２〜３週間後に免疫動物のリンパ節から抗体産生細胞を分取することができる。

骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用される。細胞融合は例えばＧ．ケラー（Ｇ．Ｋｅｈｌｅｒ）、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２５６巻、第４９５頁（１９７５）に記載の方法、又はこれに準ずる方法により行われる。この際、３０〜５０％ポリエチレングリコール（分子量１０００〜６０００）を用い、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを３０〜４０℃の温度下、約１〜３分間程度反応させる。細胞融合により得られたハイブリドーマはスクリーニングに付される。例えば、抗原としてヒトＦＮフラグメントを用いた酵素抗体法（ＥＩＡ）等により前記配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＦＮフラグメントＣＨ−２９６と反応する抗体を生産するハイブリドーマのスクリーニングが行われる。さらに、全長のＦＮと反応しない抗体を生産するハイブリドーマのスクリーニングが行われる。得られた抗体産生ハイブリドーマは、例えば限界希釈法によりクローン化される。得られたクローンは、次いで目的とする高感度、高特異性のモノクローナル抗体を産生するクローンを選択するため、例えば酵素抗体法等によるスクリーニングに供される。
こうして選ばれたクローンは、例えばあらかじめプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）やＦＩＡ（Ｆｒｅｕｎｄｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｊｕｖａｎｔ）を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取する。この腹水からのモノクローナル抗体の回収は、イムノグロブリンの精製法として従来既知の硫安分画法、ポリエチレングリコール分画法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲルクロマトグラフ法、アフィニティークロマトグラフ法等を応用することで達成される。

例えば、本発明の一態様として、ヒトＦＮフラグメントと反応し、ＦＮと反応しないことを特徴とする抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞ＲＮＩＩＣ５７Ｚ７１−３Ａにより産生されるモノクローナル抗体ＲＮＩＩＣ５７Ｚ７１−３Ａが挙げられる。ハイブリドーマ細胞ＲＮＩＩＣ５７Ｚ７１−３Ａは、平成２０年１２月１０日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭＰ−２１７４７として寄託され、平成２１年１２月９日（国際移管日）よりＦＥＲＭＢＰ−１１２０２として寄託されている。
前記モノクローナル抗体は、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するＦＮフラグメントを認識するにもかかわらず、同一のアミノ酸配列を含有するＦＮ（天然型ＦＮ）を認識しないという、驚くべき機能を有している。この抗体を含有するＦＮフラグメント測定試薬は、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するヒトＦＮフラグメントであるＣＨ−２９６、Ｃ−２７４、ＣＨＶ−８９、ＣＨＶ−９２、ＣＨＶ−１８１の各ＦＮフラグメントと反応し、前記アミノ酸配列を有するＦＮと反応しないという顕著な特性を有することから、広くＦＮフラグメントとＦＮの分別、測定に適用することが可能になる。

本発明は前記の抗体を産生する細胞、すなわち本発明のモノクローナル抗体ＲＮＩＩＣ５７Ｚ７１−３Ａを産生するハイブリドーマ細胞ＲＮＩＩＣ５７Ｚ７１−３Ａを包含する。

（２）本発明のＦＮフラグメント測定試薬
本発明のＦＮフラグメント測定試薬は、被験試料中のＦＮフラグメントを測定する試薬において、前記（１）記載の抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体を含むことを特徴とする。

本発明の測定試薬は、全長のＦＮと反応しないため、ＦＮが混入する被験試料、例えばヒト血液、血清、血漿等の血液成分や尿を含む被験試料であっても、混在するＦＮの影響を受けることなく、ＦＮフラグメントを特異的かつ高感度に測定することが可能である。したがって、ヒトの血液、血清、血漿などのヒトＦＮを含む培地で培養したヒト培養細胞の抽出物や培養上清中のＦＮフラグメントを特異的かつ高感度に測定することができる。本発明の測定方法の一態様として、１μｇ／ｍＬ以上の高濃度のＦＮを含む試料であってもＦＮフラグメントを特異的に測定することができる。従って、例えば、ＦＮフラグメントを使用した細胞への遺伝子導入や細胞培養の際に、ヒト血清を含む培地を使用してもＦＮフラグメントの濃度をモニターすることができる。

本発明の好適な態様において、本発明の測定試薬は配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するヒトＦＮフラグメント（例えばＣＨ−２９６、Ｃ−２７４、ＣＨＶ−８９、ＣＨＶ−９２、ＣＨＶ−１８１等）を、ＦＮとは区別して測定することができる。

本発明の一態様として、本発明はさらにヒトＦＮフラグメントと反応する他の抗体を含む測定試薬を提供する。前記のヒトＦＮフラグメントと反応する他の抗体は、当該フラグメントに反応するものであればポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のどちらでもよく、抗ヒトＦＮポリクローナル抗体や公知の抗ヒトＦＮモノクローナル抗体より選択される適当な抗体でもよい。例えばハイブリドーマ細胞ＦＮ３０−８より産生されるモノクローナル抗体ＦＮ３０−８が好適に使用される。モノクローナル抗体ＦＮ３０−８は、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈ，１９８９年，Ｖｏｌ．１８５，ｐ２２９−２３６．に記載の方法により、ハイブリドーマＦＮ３０−８から調製でき、Ｃ−２７４及びＦＮに結合性を有するモノクローナル抗体の一例である。モノクローナル抗体ＦＮ３０−８はタカラバイオより発売されている（製品コード：Ｍ０１０）。なお、モノクローナル抗体ＦＮ３０−８を産生するハイブリドーマＦＮ３０−８Ｂは、平成２０年１２月１０日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭＰ−２１７４６として寄託されている。

本発明の測定試薬は、３ｎｇ／ｍＬ程度の低濃度で存在するＦＮフラグメントを検出することが可能である。

本発明の測定試薬が測定対象とする被験試料には特に限定はなく、血漿、血清、尿などの体液、細胞、細胞抽出物及び細胞の培養上清等が例示される。前記被験試料は、本発明の測定試薬により測定可能な試料であれば特に限定はされないが、例えばヒト由来の試料が挙げられる。

本発明の測定試薬の好適な態様は、測定方法として固相酵素免疫検定（ＥＬＩＳＡ）法を含むエンザイムイムノアッセイに用いることができる、ＦＮフラグメントの測定試薬である。その一態様として、ＦＮフラグメントを認識する２種の抗体を使用する二抗体サンドイッチ法によりＦＮフラグメントの検出を行う測定試薬が例示される。このような試薬の一例として、上記（１）に記載する抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体と、モノクローナル抗体ＦＮ３０−８の２種を構成成分とする測定試薬が挙げられる。これらの抗体のうち、一方は固相抗体（１次抗体）、他方は標識抗体（２次抗体）として使用することができる。ここで、固相抗体とは適切な不溶性担体に固定化された抗体を意味し、標識抗体とは適切な標識物質により標識化された抗体を意味する。固相抗体はＦＮフラグメントとの抗原抗体反応によって、対象試料中の被験物質であるＦＮフラグメントをトラップするために使用され、トラップされた前記の被験物質を検出するために標識抗体が使用される。特に（１）に記載する抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体を固相抗体、モノクローナル抗体ＦＮ３０−８を標識抗体とする測定試薬が好適に使用できる。この態様の測定試薬は、全長のヒトＦＮを含む試料であっても、配列番号２記載のアミノ酸配列を有するヒトＦＮフラグメントを特異的にトラップすることが可能であり、固相抗体が全長のＦＮによりマスクされることなく、また、標識抗体の種交差性に影響を受けずに前記のヒトＦＮフラグメントを特異的に測定することが可能である。

前記二抗体サンドイッチ法に使用される、ＦＮフラグメントと反応し、ＦＮと反応しない本発明の測定試薬は、２種類の抗体を構成成分とする測定試薬であるが、これらの抗体はいずれもＦＮフラグメントとＦＮの僅かな差を認識することから、特異性が極めて近接するものであり、二抗体サンドイッチ法に使用可能な測定試薬を構築することは至難の業である。固相抗体と標識抗体の組み合わせは、度重なる交差反応、添加回収試験を行っても、必ず見出せるわけではない。

本発明に使用されるモノクローナル抗体は、特に限定されるものではないが、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、タンパク質などを用いて標識化され、標識抗体が作製される。放射性同位元素としては、特に限定されるものではないが、例えば［^１２５Ｉ］、［^１３１Ｉ］、［^３Ｈ］、［^１４Ｃ］などが好ましい。酵素としては、特に限定されるものではないが、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。蛍光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばフルオレスカミン、フルオレッセインイソチオシアネートなどが挙げられる。発光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが挙げられる。さらに、ビオチンのような化合物を用いることができる。本発明の測定試薬において、標識抗体は溶液又は凍結乾燥等の各種形態で提供することができる。

固相抗体は、ビーズ、マイクロタイタープレート、試験管、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等の担体表面に、当業者には公知の方法によって、ＦＮフラグメントを認識する本発明の測定試薬を結合させることによって調製される。また、固相抗体を調製するための抗体、担体及び固相化に必要な試薬を、固定化する前の段階で提供しても良い。前記目的に使用される抗体も、本発明の固相抗体に含まれる。

本発明の測定試薬は、さらに保護剤［例えばカゼイン又はＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ）］を含みうる。また、本発明の測定試薬は、さらに防腐剤（例えばアジ化ナトリウム又はプロクリン）を含みうる。本発明の測定試薬の態様としては、様々な試薬、材料、器具等を適宜含有させることができる。本発明の測定試薬を構成するモノクローナル抗体又はヒトＦＮフラグメントと反応する抗体を吸着させるための吸着プレートを含んでいてもよい。また、標識した抗体を検出するための試薬（例えば、ＴＭＢＺ等の基質）、使用する際にコントロールとなる試薬（例えば濃度基準となるスタンダードＦＮフラグメント）を含んでいてもよい。

（３）本発明のＦＮフラグメントの測定方法
本発明のＦＮフラグメントの測定方法は、前記（１）に記載の抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体又は前記（２）に記載のＦＮフラグメント測定試薬を使用することを特徴とする方法である。例えば、本発明のモノクローナル抗体を使用して、競合的免疫検定法によりＦＮフラグメントを測定することができる。また、２種のモノクローナル抗体を含む態様の本発明の測定試薬を使用して、２つのモノクローナル抗体のうち、一方を固相抗体、他方を標識抗体とする二酵素サンドイッチ法の場合、被験物質と固相抗体を接触させ、これに標識抗体をさらに接触させ、これらのモノクローナル抗体と被験物質の複合体を検出することにより、ＦＮフラグメントを測定することができる。さらに、被験物質と接触させた後に固相抗体を洗浄する工程及び／又は被験物質と結合しなかった標識抗体を洗浄により除去する工程を含んでいてもよい。また、固相抗体及び標識抗体は、前記（２）に記載の通り固相化及び標識化の操作により調製される。本発明の一態様として、モノクローナル抗体ＲＮＩＩＣ５７Ｚ７１−３Ａ、モノクローナル抗体ＦＮ３０−８の使用が好適であり、さらに、固相抗体としてモノクローナル抗体ＲＮＩＩＣ５７Ｚ７１−３Ａ、標識抗体としてモノクローナル抗体ＦＮ３０−８の組み合わせの測定系が特に好適である。本発明の方法においては、定性的な測定と、定量的な測定が含まれる。一態様として、被験試料は血漿、血清などの体液又は細胞培養物等が挙げられる。

本発明の方法は、例えば３ｎｇ／ｍＬ程度の低濃度で存在するＦＮフラグメント、ＣＨ−２９６を検出することが可能である。本発明の方法は、ＦＮフラグメントの異なる部位を認識する２種のモノクローナル抗体を使用することにより、極めて高い特異性を有する識別が可能である。

以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。

実施例１抗体の作製と選抜［１］
（１）抗原免疫・細胞融合
非特許文献１の記載に従ってＦＮフラグメントＣＨ−２９６（配列表の配列番号１）を調製し、１ｍｇ／ｍＬの抗原溶液とした。抗原溶液をＣ５７ＢＬ６マウス２匹に１００μｇ／ｓｈｏｔ／ｂｏｄｙの投与量で、初回免疫ではフロイント完全アジュバントとエマルジョンを形成させてから腹腔投与し、２回目以降は市販の水溶性アジュバント（ＲＩＢＩＡｄｊｕｖａｎｔ）と混合して、２週間隔合計４回の追加免疫を行った。その後、眼窩静脈血清中の各ＦＮフラグメントに対する抗体価の上昇を確認した上で、すべての個体に最終追加免疫を実施した。この最終免疫３日後に、２匹のマウスの脾臓を摘出し、無血清培地で分散・洗浄し脾臓細胞とした後、細胞融合用ミエローマ（Ｐ３Ｕ１）と５：１（脾臓細胞：ミエローマ）の割合で混合し遠心上清を除いた細胞ペレットとした。この細胞混合物に適温に保温した５０％ＰＥＧ溶液１ｍＬを一定速度で、軽い振とうを加えながら混合し、合計３ｍＬまで加え、そのあとは、無血清培地７ｍＬを同様に一定速度で加え、この操作で細胞融合を実施した。
上記操作により多数の融合細胞を取得した。この幅広い母集団より抗原に特異的な抗体をスクリーニングした。

（２）ＨＡＴ選択
融合細胞のスクリーニングには、クローニング培地（三光純薬社製）にＨＡＴ（Ｈ：ヒポキサンチン、Ａ：アミノプテリン、Ｔ：チミジン）を加えたものを用意し、融合日の翌日から３回の培地交換をこのＨＡＴ培地で行った。この培地交換操作で、成長してきた細胞は、脾臓由来のｄｅｎｏｖｏ合成系を持ちかつ不死化した融合細胞であった。

（３）スクリーニング
免疫原のＦＮフラグメントＣＨ−２９６を１０μｇ／ｍＬリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の濃度で調製し、５０μＬ／ウェルで、イムノプレート（ナルジェヌンク社製）上に添加して、４℃で一晩放置して物理吸着させた。ブランク用抗原として、正常ヒト血漿よりゼラチンカラム吸着分画によりゲル濾過し精製したＦＮをブランク抗原としてスクリーニングの際の評価用のブランク抗原とし、２０μｇ／ｍＬＰＢＳ、５０μＬ／ウェルで、同様にコーティングした。翌日、抗原溶液を捨てて、２５％ブロッカーカゼイン（ピアス社製）を２００μＬ／ウェルになるように加えて、室温（２０〜３０℃）で一晩放置して、ブロッキング操作を行った。その後、ブロッキング溶液を捨て、上記（２）で得られた融合細胞の培養上清（原液使用）を、ナンバリングした上でイムノプレートに投入し、一次反応を室温（２０〜３０℃）で１時間行った。０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで反応が終了した各ウェルを３回洗浄し、ペーパータオルで充分に液を切った。検出には、抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体カクテル−ペルオキシダーゼ標識抗体を使用した。前記抗体を１μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェルで添加し、室温（２０〜３０℃）で１時間反応を行った。その後、標識抗体液を捨て、ウェルをＰＢＳで４回洗浄した。ペーパータオルで、洗浄液を充分に除き、ペルオキシダーゼ基質であるＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液（ＢｉｏＦＸ社製）を５０μＬ／ウェルで投入し、室温で１５〜３０分発色させ、等量の１Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた後、肉眼及びプレートリーダーで陽性株を確認し、ＦＮに反応せず、目的のＦＮフラグメントに特異的に反応する株の選抜を試みた。

（４）陽性株選抜とクローニング、株樹立
（３）に示す厳格なスクリーニングの結果、ＦＮ抗原に反応せず、目的のＦＮフラグメントに特異的に反応する株は、試験した９６０ウェルに含まれる１０，０００以上のコロニー（株）中わずかに８株であった。この８株を用い、直ちに限界希釈法によりクローニングを行った。クローニングされた抗ＦＮフラグメント抗体産生ハイブリドーマ８種類について、それぞれクローンを各２種（本株・亜株）確保した。

（５）マウス腹水採取
特異性の高い前記ハイブリドーマクローンは、本株・亜株ともに凍結細胞としてマスター細胞を保管後、ほぼ並行しながら、本株をｓｃｉｄ（Ｔ、Ｂ細胞欠損型）マウスの腹腔内で大量培養し、腹水として粗精製抗体を得た。腹水は、１個体あたりおよそ３〜５ｍＬであった。

（６）抗体精製
得られた腹水は、５０％飽和硫安塩析・透析を行い、その画分をＰｒｏｔｅｉｎＡカラムに供した。平衡化緩衝液は、３ＭＮａＣｌ、１．５Ｍｇｌｙｃｉｎ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．９）の高塩濃度のものを調製し、どのサブクラスのＩｇＧであっても良好に結合する条件を採用した。平衡化緩衝液で２倍希釈した腹水硫安塩析画分を腹水液量とほぼ等量の容積のＰｒｏｔｅｉｎＡ樹脂にアプライし、波長２８０ｎｍの吸光度がほぼゼロになるまで平衡化緩衝液でカラムを洗った。その後、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）とクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）の２段階で溶出を行った。溶出画分は、ただちに１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）で中和し、硫安塩析もしくは、遠心限外ろ過濃縮を行った。最終抗体は、ＰＢＳで透析し、０．２２μｍフィルターろ過により無菌化した。抗体の純度は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元加熱条件）により分析し、Ｈ鎖とＬ鎖以外のものがない良好な純度の抗体であることを確認した。

（７）異なる手法による抗体の作製
実施例１で確立された８種類の抗体に加え、更に選択肢を広げるために特公平６−４４８７７号公報（特許文献１）の抗ヒト・ＦＮモノクローナル抗体の調製方法に従い、非特許文献１に記載のＦＮフラグメントＣ−２７４又はＨ−２９６に結合するモノクローナル抗体３種類も調製した。

（８）測定系構築のための抗体の選抜
上記（１）〜（６）の操作で得られた８種類の抗体、上記（７）で得られた３種類の抗体の合計１１種類の抗体に過ヨウ素酸法によってペルオキシダーゼ標識を施した。過ヨウ素酸法は、ペルオキシダーゼの糖鎖ジオールを脱水素酸化させシッフベースを形成させ、抗体側のアミノ基と結合する方法である。すべての抗体について抗原との結合活性を保持した状態で酵素標識抗体とすることができた。これらの標識抗体を、同じ１１種類の固相抗体と組みあわて、合計１２１通りの組合わせで、ＦＮフラグメントを定量できる系をスクリーニングした。しかしながら、試験した種々の組み合わせの中には１０００ｎｇ／ｍＬ未満の濃度のＦＮには反応しないものは存在したが、いずれも１０００ｎｇ／ｍＬ以上、すなわち１μｇ／ｍＬ以上の高濃度のＦＮには反応した。抗原特異性が極めて類似したＦＮとＦＮフラグメントを識別する抗体の取得は通常の場合と比べて極めて困難であった。ＦＮとＦＮフラグメントの構造の差は極めて僅かであり、類似のエピトープに反応するＦＮフラグメント特異抗体が取得されている可能性が示唆された。

実施例２抗体の作製と選抜［２］
（１）新たな抗体の作製
実施例１、（１）のＦＮフラグメントＣＨ−２９６に加えて、非特許文献１の記載に従ってＦＮフラグメントＣ−２７４（配列表の配列番号２）及びＦＮフラグメントＨ−２９６を調製した。実施例１、（１）〜（６）と同様の方法により、これらのＦＮフラグメントと特異的に反応する抗体の作製を試みた。抗体のスクリーニングには、ＦＮフラグメントＣＨ−２９６、Ｃ−２７４、Ｈ−２９６を、それぞれ２μｇ／ｍＬＰＢＳの濃度で混合して固定化したイムノプレートを使用した。スクリーニングの結果、ＦＮ抗原に反応せず、ＦＮフラグメントＣＨ−２９６、Ｃ−２７４、Ｈ−２９６のいずれかに特異的に反応する株は、試験した１０，０００以上の融合細胞株中わずかに６株であった。この６株についても実施例１と同様に、それぞれクローンを各２種（本株・亜株）確保した後、ｓｃｉｄマウスを用いて腹水化して、精製抗体を調製した。さらに実施例１−（８）と同様の操作でペルオキシダーゼ標識抗体を作製した。

（２）測定系構築のための抗体の選抜
１度目のスクリーニングに使用した１１種類の抗体と、２度目のスクリーニングで確立された６種類の抗体、合計１７種類の抗体をそれぞれ標識抗体、固相抗体とする組みあわせ、合計２８９通りもの組合わせで、ＦＮフラグメントを定量できる系をスクリーニングした。本スクリーニングによって、１μｇ／ｍＬ以上という非常に高濃度のＦＮに交差することなく高感度にＦＮフラグメントを測りこむことのできる測定系をようやく１種類得ることに成功した。その組合せは、固相抗体として抗体ＲＮＩＩＣ５７Ｚ７１−３Ａ（ＦＥＲＭＢＰ−１１２０２）、標識抗体として抗体ＦＮ３０−８（タカラバイオ社製）を使用するものであった。

（３）ＦＮフラグメント測定系
確立した測定系を使用した測定方法を以下に示す。
（Ａ）イムノプレート器材（ナルジェヌンク製）に、ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したモノクローナル抗体ＲＮＩＩＣ５７Ｚ７１−３Ａ溶液を１００μＬ／ウェルで投入し、４℃で一晩放置する。
（Ｂ）翌日、抗体溶液を捨て、２５％ブロッカーカゼイン／ＰＢＳ溶液（ブロッキング溶液）を２００μＬ／ウェルで投入し、４℃一晩放置し、前記抗体が結合しなかった部分をタンパク質ブロックする。
翌日、ブロッキング溶液を捨て、以下の測定に使用する。
（Ｃ）各濃度の検体を１００μＬずつマイクロピペットで各ウェルに２連ずつ加え、室温（２０〜３０℃）で１時間反応させる。（第一反応）
（Ｄ）反応液を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、モノクローナル抗体ＦＮ３０−８酵素標識抗体液を１００μＬずつ各ウェルに加え、室温（２０〜３０℃）で一時間反応させる。（第二反応）
（Ｅ）反応液を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４回洗浄後、ＴＭＢＺ溶液を１００μＬずつ各ウェルに加え、室温（２０〜３０℃）で２０分反応させる。（発色反応）
（Ｆ）１Ｎ硫酸を１００μＬずつ、ＴＭＢＺ溶液を入れた順番に各ウェルに加え、反応を停止させた後よく混和する。
蒸留水を対照としてマイクロプレートリーダーをブランク補正し、波長４５０ｎｍで吸光度を測定する。
標準曲線を作成し、検体の吸光度から対応するＦＮフラグメント濃度を読み取る。

上記測定系により、ＦＮフラグメントＣＨ−２９６をＦＮフラグメント標準品として測定した結果を表１に示す。必要サンプル量は、１００μｌ／ウェルであり、３．１２５ｎｇ／ｍＬのＦＮフラグメントであっても検出可能であった。

（４）血清中ＦＮの影響測定
実施例２−（２）記載の測定系により、各種溶媒中のＦＮフラグメントＣＨ−２９６を測定した。溶媒は、２５％ブロッカーカゼイン／ＰＢＳ溶液、１０％ウシ胎仔血清（Ｌｏｎｚａ社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ社製）、ヒト血清を試験した。表２に波長４５０ｎｍにおける吸光度の測定値を示す。表２の結果から、上記測定系はヒト血清、血清培地による阻害を受けないこと、また血清中に含まれるＦＮに反応することなくＦＮフラグメントを測定すること可能であることが示された。

（５）ＦＮへの反応測定
実施例２−（２）記載の測定系により、ＦＮへの反応を測定した。ＦＮはヒト血清中のＦＮ、ヒト血漿から精製した天然のＦＮ、市販のＦＮ（シグマ社製）を試験した。表３に血清中のＦＮとの反応、表４に天然及び組換え体のＦＮとの反応を、波長４５０ｎｍにおける吸光度の測定値として示す。表３及び表４に結果を示すように、上記測定系はヒト血清中のＦＮとは反応せず、さらに極めて高濃度のＦＮとも反応しないことが示された。

（６）ＦＮフラグメントへの反応測定
実施例２−（２）記載の測定系により、各種ＦＮフラグメントへの反応を測定した。ＦＮフラグメントは、ＣＨ−２９６（配列表の配列番号１）、Ｃ−２７４（配列表の配列番号２）、Ｈ−２９６（配列表の配列番号３）、ＣＨＶ−８９（配列表の配列番号４）、ＣＨＶ−９２（配列表の配列番号５）、ＣＨＶ−１８１（配列表の配列番号６）を調製した。また、溶媒は２５％ブロッカーカゼイン／ＰＢＳ溶液、保存液［５０％ＲＰＭＩ−１６４０培地、４％ヒト血清アルブミン（シグマ社製）、６％ＨＥＳ（Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｓｔａｒｃｈ）、５％ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）／生理食塩水］、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する保存液を使用した。ＦＮフラグメントを各溶媒で２００ｎｇ／ｍＬとなるように調製した。表５に波長４５０ｎｍにおける吸光度の測定値を示す。表５の結果から、上記測定系は、配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列からなるＦＮの細胞接着ドメインを含むＦＮフラグメント（２７４〜５７４アミノ酸）を測定することが可能であること、各種溶媒中のＦＮフラグメントを測定することが可能であることが示された。

実施例３ＦＮフラグメントコーティングディッシュ洗浄液のＦＮフラグメント測定
ＦＮフラグメントＣＨ−２９６をコーティングしたディッシュは、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）Ｄｉｓｈ（タカラバイオ社製）を使用した。このディッシュを下記Ａ、Ｂの２種類の洗浄条件で洗浄した。
洗浄条件Ａ：１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍＬをディッシュに添加し、３０分間静置。この操作を３回繰り返す。
洗浄条件Ｂ：ＰＢＳ１ｍＬをディッシュに添加し、３０分間静置。この操作を３回繰り返す。
各洗浄条件の洗浄液を回収し、実施例２−（２）記載の測定系によりＦＮフラグメントの濃度を測定した。表６にＦＮフラグメントの濃度を示す。上記測定系は、ＦＮフラグメントコーティングディッシュの洗浄液に含まれるＦＮフラグメントの濃度測定に利用できることが示された。

以上の結果は、本発明の抗ＦＮフラグメント抗体及び測定試薬を使用する検出系は、ヒトＦＮフラグメントを特異的に高感度で測定し、性能的にも安定な系であることを示している。
当該ＦＮフラグメントを測定して得られる結果は、ＦＮフラグメントを使用する遺伝子導入方法、細胞培養方法において有用な情報を提供する。

SEQ ID NO:1 ; Fibronectin fragment named CH-296.
SEQ ID NO:2 ; Fibronectin fragment named C-274.
SEQ ID NO:3 ; Fibronectin fragment named H-296.
SEQ ID NO:4 ; Fibronectin fragment named CHV-89.
SEQ ID NO:5 ; Fibronectin fragment named CHV-92.
SEQ ID NO:6 ; Fibronectin fragment named CHV-181.

Claims

ヒトフィブロネクチン（ＦＮ）フラグメントと反応し、ヒトＦＮと反応しないことを特徴とする抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体。
配列表の配列番号２記載のアミノ酸配列を有するヒトＦＮフラグメントと反応する請求項１記載の抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体。
抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞ＲＮＩＩＣ５７Ｚ７１−３Ａ（ＦＥＲＭＢＰ−１１２０２）より産生され得るモノクローナル抗体ＲＮＩＩＣ５７Ｚ７１−３Ａである請求項１記載の抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体。
被験試料中のＦＮフラグメントを測定する試薬において、請求項１記載の抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体を含むＦＮフラグメント測定試薬。
さらにヒトＦＮフラグメントと反応する抗体を含む請求項４記載のＦＮフラグメント測定試薬。
請求項１記載の抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体又は請求項４記載のＦＮフラグメント測定試薬を使用する被験試料中のＦＮフラグメントの測定方法。
ヒトＦＮを含有する被験試料中のヒトＦＮフラグメントを測定する請求項６記載のＦＮフラグメントの測定方法。
被験試料が、生体由来試料又は培養細胞由来試料から選ばれる請求項６又は７記載の測定方法。
請求項１記載の抗ＦＮフラグメントモノクローナル抗体を産生する、寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−１１２０２で表されるハイブリドーマ細胞。