JP5231954B2 - アルブミン測定試薬 - Google Patents
アルブミン測定試薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5231954B2 JP5231954B2 JP2008297663A JP2008297663A JP5231954B2 JP 5231954 B2 JP5231954 B2 JP 5231954B2 JP 2008297663 A JP2008297663 A JP 2008297663A JP 2008297663 A JP2008297663 A JP 2008297663A JP 5231954 B2 JP5231954 B2 JP 5231954B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- albumin
- antibody
- human
- bovine
- monoclonal antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明はヒトアルブミンとウシアルブミンを分別認識可能なモノクローナル抗体を使用する、高感度の被験試料中のアルブミンの測定試薬に関し、種々のアルブミンを使用する細胞工学分野等で有用である。
糖尿病性腎症は、糖尿病の主要な合併症の一つであり、旧来は検尿法により尿タンパク陽性で診断されている。しかし、この方法によって診断される時期には既に腎不全が進行している場合が多いため、これに代わる早期診断法の構築が望まれている。
近年、尿中タンパクの増加に先立ち、微量のアルブミンが尿中に認められることが明らかになり、糖尿病性腎症の早期診断マーカーとしてアルブミンが注目されている。又、早期診断の測定法としては、抗原であるアルブミンに特異的に結合する抗体の利用が有利である。
一方、ヒトやウシのアルブミンは血清から精製され、生化学実験、分子生物学実験、免疫学実験に、モデルタンパク質、キャリアタンパク質として多用される。またリコンビナント製剤の製造工程でもその安定化のために、ヒトやウシ血清アルブミンが添加されている。さらに動物細胞の培養工程においてもヒトやウシ血清アルブミンが添加され使用されている。
このため、近年試料中のアルブミンを簡便に分別治療する技術の提供がもとめられ、２種のポリクローナル抗体を組み合わせて使用する、ヒトアルブミンやウシアルブミン測定用のエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）試薬も市販されている（シバヤギ社製「レビス（登録商標）アルブミン−ウシ」、Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製「Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ」）。
また、特許文献１は、ヒト血清アルブミンに対する１つのモノクローナル抗体を報告している。しかしながら、特許文献１に報告されるモノクローナル抗体は、ヒト以外の動物由来のアルブミンに、ヒト由来のアルブミンの測定値の１０％を超える交差反応性を示し、抗体の特異性に問題がある。さらに、アルブミンの測定限界が不明である。
しかしながら、ポリクローナル抗体を用いてエンザイムイムノアッセイを行う場合は、ポリクローナル抗体中に夾雑抗原に対する抗体が含まれる可能性があり、特異性の面で課題がある。また、抗原吸収法により抗体の交差反応性を除去して測定試薬が調製されることから、一定品質の試薬を安定して製造し、供給する面でも課題があった。さらに近年、ヒトアルブミンに混入する血液介在性ウイルス（パルボウイルスＢ１９、プリオン、輸血伝播ウイルス［ＴＴＶ］）、ウシ血清に混入するウシ指向性ウイルスやプリオンなど混入のリスクを算出するために、ヒト及びウシアルブミンを分別定量する技術の開発の要望が高まっている。
そこで、本発明の課題は、操作が簡便で、かつ測定精度、特異性、再現性に優れたヒト及び／又はウシアルブミンの高感度測定試薬を提供することにある。
そこで、本発明の課題は、操作が簡便で、かつ測定精度、特異性、再現性に優れたヒト及び／又はウシアルブミンの高感度測定試薬を提供することにある。
本発明者らは鋭意努力を重ね、従来入手されていなかった２種の抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体及び２種の抗ウシアルブミンモノクローナル抗体の創成に成功し、これらのモノクローナル抗体を使用することにより、従来の課題が解決されることを見出し本発明を完成させた。
本発明の第１の発明は、被験試料中のアルブミンを測定する試薬において、ヒトアルブミンを認識しウシアルブミンを認識しない抗原認識部位を異にする２種のモノクローナル抗体及び／又はウシアルブミンを認識しヒトアルブミンを認識しない抗原認識部位を異にする２種のモノクローナル抗体を構成成分とすることを特徴とするアルブミン測定試薬に関する。
本発明の第１の発明において、ヒトアルブミンを認識しウシアルブミンを認識しない抗原認識部位を異にする２種のモノクローナル抗体モノクローナル抗体が寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３７１で表されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ３−７Ａ及び寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３７０で表されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ２−１０Ｄであり、ウシアルブミンを認識しヒトアルブミンを認識しない抗原認識部位を異にする２種のモノクローナル抗体モノクローナル抗体が寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３７３で表されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂ及び寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３７４で表されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ １０Ｂ−１２であってもよい。また、測定方法としてエンザイムイムノアッセイを用いてもよく、固相抗体を使用してもよい。
本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明のアルブミン測定試薬を使用する被検試料中のヒト及び／又はウシアルブミンの測定方法に関する。本発明の第２の発明において、被験試料が、生体由来試料又は細胞培養由来試料から選ばれてもよい。
本発明の第３の発明は、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３７１で表されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ３−７Ａ、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３７０で表されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ２−１０Ｄ、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３７３で表されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂ及び寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３７４で表されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ １０Ｂ−１２から選択されるヒト又はウシアルブミンを認識するモノクローナル抗体に関する。
本発明の第４の発明は、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３７１で表されるハイブリドーマ細胞、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３７０で表されるハイブリドーマ細胞、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３７３で表されるハイブリドーマ細胞及び寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３７４で表されるハイブリドーマ細胞から選択される、ヒト又はウシアルブミンを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に関する。
本発明により、操作が簡便で、測定精度が高く、特異性、再現性にも優れたヒト及び／又はウシアルブミンの測定試薬が安定して提供される。
本発明の試薬の態様としては、サンプル中のヒト及び／又はウシアルブミンの絶対量の変化を調べることができ、ヒト及び／又はウシアルブミンのモニタリングや製造工程での品質管理、定量の測定手法として用いることができる。さらに、本発明の試薬は、異種のアルブミンを認識しないため、異種のアルブミンが混在する可能性のあるサンプルであっても、特異的かつ正確にヒト及び／又はウシアルブミンを測定することができる。
本発明の試薬の態様としては、サンプル中のヒト及び／又はウシアルブミンの絶対量の変化を調べることができ、ヒト及び／又はウシアルブミンのモニタリングや製造工程での品質管理、定量の測定手法として用いることができる。さらに、本発明の試薬は、異種のアルブミンを認識しないため、異種のアルブミンが混在する可能性のあるサンプルであっても、特異的かつ正確にヒト及び／又はウシアルブミンを測定することができる。
本発明で「アルブミン」とは血中に存在する分子量約６６，０００のタンパク質であり、血中には非常に高濃度で存在しており、脂肪酸をはじめ種々の物質と複合体を形成するなどして、物質運搬に一役かっている。アルブミンは、その代謝の結果、正常な状態でも、尿中に１０〜５０μｇ／ｍＬ濃度で排出されており、そのモニタリングは、健康状態を知る上で有用である。本発明により測定されるアルブミンは、血中に存在する天然のアルブミン、生体から分離された肝細胞や膵臓細胞などのアルブミンを産生しうる細胞を人為的に培養した培養上清中に遊離されるアルブミン、さらに、肝細胞のｍＲＮＡやそのｃＤＮＡ等を用いて遺伝子工学的に作製したリコンビナントのアルブミンも含まれる。
本発明で「モノクローナル抗体」とは、単一クローンの抗体生産細胞が分泌する抗体を意味し、単クローン（性）抗体ともいう。特定の抗原決定基を認識する抗体であり、アミノ酸配列の一次構造が均一である。本発明のモノクローナル抗体は、細胞融合法により調製されるハイブリドーマが産生する抗体に加えて、抗体産生細胞のｍＲＮＡ等を用いて遺伝子工学的に作製された抗体も含まれる。
本発明で、特定の種由来の「アルブミンを認識しない」とは、本発明に使用されるモノクローナル抗体が、前記特定の種由来のアルブミンと免疫反応を強く起こさないことを意味する。特に限定はされないが、例えば、本発明に使用されるモノクローナル抗体を用いて、同濃度の当該モノクローナル抗体が認識するアルブミンと認識しないアルブミンを測定した場合、認識するアルブミンの測定値に比べて、認識しないアルブミンの測定値が、極めて低値、又は実質的に測定値として意味の無い数値であり、１％以下、好ましくは０．１％以下、特に好ましくは０．０１％以下である。最も好ましいのは、本発明に使用されるモノクローナル抗体が認識しないアルブミンの測定値が検出限界以下となることである。
（１）本発明のアルブミン測定試薬
すなわち本発明を概説すれば、本発明は被験試料中のアルブミンを測定する試薬において、ヒトアルブミンを認識しウシアルブミンを認識しない抗原認識部位を異にする２種のモノクローナル抗体及び／又はウシアルブミンを認識しヒトアルブミンを認識しない抗原認識部位を異にする２種のモノクローナル抗体を構成成分とすることを特徴とするアルブミン測定試薬に関するものである。したがって、本発明のアルブミン測定試薬は、ヒトアルブミンとウシアルブミンが混在した試料であっても、ヒトアルブミンとウシアルブミンをそれぞれ特異的に測定することができる。本発明の一態様として、前記のヒトアルブミンを認識する２種のモノクローナル抗体及びウシアルブミンを認識する２種のモノクローナル抗体を含むアルブミン測定試薬は、ヒトアルブミン及びウシアルブミンを同時に検出することができる。
すなわち本発明を概説すれば、本発明は被験試料中のアルブミンを測定する試薬において、ヒトアルブミンを認識しウシアルブミンを認識しない抗原認識部位を異にする２種のモノクローナル抗体及び／又はウシアルブミンを認識しヒトアルブミンを認識しない抗原認識部位を異にする２種のモノクローナル抗体を構成成分とすることを特徴とするアルブミン測定試薬に関するものである。したがって、本発明のアルブミン測定試薬は、ヒトアルブミンとウシアルブミンが混在した試料であっても、ヒトアルブミンとウシアルブミンをそれぞれ特異的に測定することができる。本発明の一態様として、前記のヒトアルブミンを認識する２種のモノクローナル抗体及びウシアルブミンを認識する２種のモノクローナル抗体を含むアルブミン測定試薬は、ヒトアルブミン及びウシアルブミンを同時に検出することができる。
本発明に使用されるモノクローナル抗体は、前述のヒトあるいはウシを抗原として認識し、かつそれぞれの動物種のアルブミンを特異的かつ高感度で検出できるモノクローナル抗体であればいかなるものでも良い。また、本発明に使用されるモノクローナル抗体は、ヒトあるいはウシアルブミンの異なる部位を認識する。これらの認識部位は特に限定はされないが、２種の抗体が互いに干渉しない部位であることが好ましい。本発明に使用されるモノクローナル抗体は、ヒトアルブミン及びウシアルブミンが混在した試料であっても、ヒトアルブミンとウシアルブミンをそれぞれ特異的に測定することができる。
また、ヒトあるいはウシアルブミンを認識しうる本発明の抗体にペプシン、パパイン等のタンパク質分解酵素を作用させ、抗体のＦｃ部分を除去して得られる、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等のフラグメントも本発明で使用する抗体に含まれる。
さらに、得られたモノクローナル抗体をもとに、遺伝子工学的に製造される組換え抗体や、定常領域を他の抗体の定常領域に置換したキメラ抗体であっても良い。このような抗体は、二重特異性抗体（二価抗体）、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ３、Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔｒｉａｂｏｄｙ、Ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、Ｍｉｎｉｂｏｄｙ、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２−Ｆｃ、ｉｎｔａｃｔ−ＩｇＧが例示され、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２３巻、第９号、ｐ．１１２６−３６（２００５）に詳述される。
本発明に使用されるモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合法によって作製されたハイブリドーマを使用して製造される。前記ハイブリドーマは、抗体産生細胞の集団と骨髄腫細胞と融合ハイブリドーマを形成させ、該ハイブリドーマをクローン化し、ヒト又はウシアルブミン認識する抗体を産生するクローンを取捨選択し、さらに本発明の目的に好適なクローンを選別することによって樹立される。
抗体産生細胞には、例えばヒト又はウシアルブミン又はその一部によって免疫された動物の脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等が利用できる。免疫させる動物としては、マウス、ラツト、ウマ、ヤギ、ウサギ等が挙げられる。抗原としてはウシアルブミンもしくはヒトアルブミン、及びその断片が利用可能であり、例えば次のようにして製造され、免疫に使用される。例えば免疫原として用いるウシアルブミンもしくはヒトアルブミンを天然から得る場合は、ウシアルブミンもしくはヒトアルブミンを含む血清画分あるいは血漿画分から塩析、透析やアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等各種クロマトグラフィーを用いて精製することが可能である。また、ウシアルブミンもしくはヒトアルブミンを産生する肝細胞等、適当な細胞を培養し、その培養上清から精製することも可能である。かくして得られたウシアルブミンもしくはヒトアルブミンを、例えばＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に代表されるキャリアタンパクと結合後、またはＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）と混合後、フロイントのアジュバントと混合し、動物の免疫に使用する。又はウシアルブミンもしくはヒトアルブミンを直接フロイントのアジュバントと混合し、動物の免疫に使用する。免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に１回に２０〜２００μｇの抗原−アジュバント混合物を、２〜３週間に１回、３〜７回投与することにより行われる。最終免疫より約３〜５日後、免疫動物から抗体産生細胞を分取する。
骨髄腫細胞としてはマウス、ラツト、ヒト等由来のものが使用される。細胞融合は例えばＧ．ケラー（Ｇ．Ｋｅｈｌｅｒ）「ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２５６巻、第４９５頁（１９７５）」に記載の方法、又はこれに準ずる方法により行われる。この際、３０〜５０％ポリエチレングリコール（分子量１０００〜６０００）を用い、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを３０〜４０℃の温度下、約１〜３分間程度反応させる。細胞融合により得られたハイブリドーマはスクリーニングに付される。例えば、抗原としてウシアルブミンもしくはヒトアルブミンを用いた酵素抗体法（ＥＩＡ）等により前記ウシアルブミンもしくはヒトアルブミンを認識する抗体を生産するハイブリドーマのスクリーニングが行われる。得られた抗体産生ハイブリドーマは、例えば限界希釈法によりクローン化される。得られたクローンは、次いで目的とする高感度、高特異性のモノクローナル抗体を産生するクローンを選択するため、例えば酵素抗体法等によるスクリーニングに供される。
こうして選ばれたクローンは、例えばあらかじめプリスタン（２，６，１０，１４，−テトラメチルペンタデカン）を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取する。この腹水からのモノクローナル抗体の回収は、イムノグロブリンの精製法として従来既知の硫安分画法、ポリエチレングリコール分画法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲルクロマトグラフ法、アフイニテイークロマトグラフ法等を応用することで達成される。
抗体産生細胞には、例えばヒト又はウシアルブミン又はその一部によって免疫された動物の脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等が利用できる。免疫させる動物としては、マウス、ラツト、ウマ、ヤギ、ウサギ等が挙げられる。抗原としてはウシアルブミンもしくはヒトアルブミン、及びその断片が利用可能であり、例えば次のようにして製造され、免疫に使用される。例えば免疫原として用いるウシアルブミンもしくはヒトアルブミンを天然から得る場合は、ウシアルブミンもしくはヒトアルブミンを含む血清画分あるいは血漿画分から塩析、透析やアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等各種クロマトグラフィーを用いて精製することが可能である。また、ウシアルブミンもしくはヒトアルブミンを産生する肝細胞等、適当な細胞を培養し、その培養上清から精製することも可能である。かくして得られたウシアルブミンもしくはヒトアルブミンを、例えばＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に代表されるキャリアタンパクと結合後、またはＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）と混合後、フロイントのアジュバントと混合し、動物の免疫に使用する。又はウシアルブミンもしくはヒトアルブミンを直接フロイントのアジュバントと混合し、動物の免疫に使用する。免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に１回に２０〜２００μｇの抗原−アジュバント混合物を、２〜３週間に１回、３〜７回投与することにより行われる。最終免疫より約３〜５日後、免疫動物から抗体産生細胞を分取する。
骨髄腫細胞としてはマウス、ラツト、ヒト等由来のものが使用される。細胞融合は例えばＧ．ケラー（Ｇ．Ｋｅｈｌｅｒ）「ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２５６巻、第４９５頁（１９７５）」に記載の方法、又はこれに準ずる方法により行われる。この際、３０〜５０％ポリエチレングリコール（分子量１０００〜６０００）を用い、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを３０〜４０℃の温度下、約１〜３分間程度反応させる。細胞融合により得られたハイブリドーマはスクリーニングに付される。例えば、抗原としてウシアルブミンもしくはヒトアルブミンを用いた酵素抗体法（ＥＩＡ）等により前記ウシアルブミンもしくはヒトアルブミンを認識する抗体を生産するハイブリドーマのスクリーニングが行われる。得られた抗体産生ハイブリドーマは、例えば限界希釈法によりクローン化される。得られたクローンは、次いで目的とする高感度、高特異性のモノクローナル抗体を産生するクローンを選択するため、例えば酵素抗体法等によるスクリーニングに供される。
こうして選ばれたクローンは、例えばあらかじめプリスタン（２，６，１０，１４，−テトラメチルペンタデカン）を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取する。この腹水からのモノクローナル抗体の回収は、イムノグロブリンの精製法として従来既知の硫安分画法、ポリエチレングリコール分画法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲルクロマトグラフ法、アフイニテイークロマトグラフ法等を応用することで達成される。
かくして得られた抗ウシアルブミンもしくは抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体について、それぞれ多数の組み合わせをさらにスクリーニングすることにより、高感度で再現性よくウシアルブミンもしくはヒトアルブミンを測定できるモノクローナル抗体の組み合わせが決定される。
本発明の測定試薬は、それぞれ上記のようにして得た２種のモノクローナル抗体を構成成分とする。本発明の測定試薬は、２．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在するウシアルブミンを検出することが可能である。また、２．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在するヒトアルブミンを検出することが可能である。
本発明の一態様として、これらのヒトアルブミンを認識しウシアルブミンを認識しない抗原認識部位を異にする２種のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞ｈＡｌｂ ３−７Ａにより産生されるモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ３−７Ａ及びハイブリドーマ細胞ｈＡｌｂ ２−１０Ｄにより産生されるモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ２−１０Ｄである。ハイブリドーマ細胞ｈＡｌｂ ３−７Ａは、平成１９年９月２０日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ Ｐ−２１３７１として寄託されている。ハイブリドーマ細胞ｈＡｌｂ ２−１０Ｄは、平成１９年９月２０日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ Ｐ−２１３７０として寄託されている。
また、ウシアルブミンを認識しヒトアルブミンを認識しない抗原認識部位を異にする２種のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂにより産生されるモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂ及びハイブリドーマ細胞ＦＣＳ−ＢＳＡ １０Ｂ−１２により産生されるモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ １０Ｂ−１２である。ハイブリドーマ細胞ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂは、平成１９年９月２６日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ Ｐ−２１３７３として寄託されている。ハイブリドーマ細胞ＦＣＳ−ＢＳＡ １０Ｂ−１２は、平成１９年９月２６日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ Ｐ−２１３７４として寄託されている。
これら２種の抗体を含有するヒトあるいはウシアルブミン測定試薬は、異種のアルブミンを認識しないことから、広くヒトあるいはウシアルブミンの測定に適用することができる。
本発明の一態様として、これらのヒトアルブミンを認識しウシアルブミンを認識しない抗原認識部位を異にする２種のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞ｈＡｌｂ ３−７Ａにより産生されるモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ３−７Ａ及びハイブリドーマ細胞ｈＡｌｂ ２−１０Ｄにより産生されるモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ２−１０Ｄである。ハイブリドーマ細胞ｈＡｌｂ ３−７Ａは、平成１９年９月２０日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ Ｐ−２１３７１として寄託されている。ハイブリドーマ細胞ｈＡｌｂ ２−１０Ｄは、平成１９年９月２０日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ Ｐ−２１３７０として寄託されている。
また、ウシアルブミンを認識しヒトアルブミンを認識しない抗原認識部位を異にする２種のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂにより産生されるモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂ及びハイブリドーマ細胞ＦＣＳ−ＢＳＡ １０Ｂ−１２により産生されるモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ １０Ｂ−１２である。ハイブリドーマ細胞ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂは、平成１９年９月２６日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ Ｐ−２１３７３として寄託されている。ハイブリドーマ細胞ＦＣＳ−ＢＳＡ １０Ｂ−１２は、平成１９年９月２６日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ Ｐ−２１３７４として寄託されている。
これら２種の抗体を含有するヒトあるいはウシアルブミン測定試薬は、異種のアルブミンを認識しないことから、広くヒトあるいはウシアルブミンの測定に適用することができる。
前記の抗体、すなわちモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ３−７Ａ、モノクローナル抗体ｈＡｌｂ ２−１０Ｄ、モノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂ及びモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ １０Ｂ−１２、ならびにこれらの抗体を産生するハイブリドーマハイブリドーマ細胞ｈＡｌｂ ３−７Ａ、ｈＡｌｂ ２−１０Ｄ、ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂ、ＦＣＳ−ＢＳＡ １０Ｂ−１２は、いずれも本発明に包含される。
本発明の測定試薬は、測定方法として二抗体サンドイッチ法などの固相酵素免疫検定（ＥＬＩＳＡ）法を含むエンザイムイムノアッセイに用いることができる、ヒトあるいはウシアルブミンの測定試薬である。一態様として、被験試料はヒト血漿、血清などの体液又は細胞培養物等が挙げられる。
本発明の測定試薬は、上記のようにして得たヒトあるいはウシアルブミンを認識する２種のモノクローナル抗体を構成成分とするが、これらの抗体のうち、一方は固相抗体（１次抗体）、他方は標識抗体（２次抗体）として使用することができる。ここで、固相抗体とは適切な不溶性担体に固定化された抗体を意味し、標識抗体とは適切な標識物質により標識化された抗体を意味する。固相抗体はヒトあるいはウシアルブミンとの抗原抗体反応によって、対象試料中の被検物質であるヒトあるいはウシアルブミンをトラップするために使用され、トラップされた前記の被検物質を検出するために標識抗体が使用される。本発明に使用されるモノクローナル抗体は、特に限定されるものではないが、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、タンパク質などを用いて標識化され、標識抗体が作製される。放射性同位元素としては、特に限定されるものではないが、例えば［１２５Ｉ］、［１３１Ｉ］、［３Ｈ］、［１４Ｃ］などが好ましい。酵素としては、特に限定されるものではないが、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。蛍光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばフルオレスカミン、フルオレッセインイソチオシアネートなどが挙げられる。発光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが挙げられる。さらに、ビオチンのような化合物を用いることができる。本発明の測定試薬において、標識抗体は溶液又は凍結乾燥等の各種形態で提供することができる。
固相抗体は、ビーズ、マイクロタイタープレート、試験管、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等の担体表面に、当業者には公知の方法によって、ヒトあるいはウシアルブミンの少なくとも一部を認識する本発明の抗体を結合させることによって調製される。また、固相抗体を調製するための抗体、担体及び固相化に必要な試薬を、固定化する前の段階で提供しても良い。前記目的に使用される抗体も、本発明の固相抗体に含まれる。
本発明の測定試薬は、ヒトあるいはウシアルブミンを認識する２種のモノクローナル抗体に加えて、様々な試薬、材料、器具等を適宜含有させることができる。本発明のモノクローナル抗体を吸着させるための吸着プレートを含んでいてもよい。また、標識した抗体を検出するための試薬、使用する際にコントロールとなる試薬を含んでいてもよい。
（２）ヒトあるいはウシアルブミンの測定方法
本発明のヒトあるいはウシアルブミンの測定方法は、前記（１）に記載のアルブミン質測定試薬を使用することを特徴とする方法である。例えば、本発明に使用されるヒトあるいはウシアルブミンを認識し、ヒトアルブミンを認識しない抗原認識部位を異にする２種のモノクローナル抗体を、一方を固相抗体、他方を標識抗体とする場合、被検物質と固相抗体を接触させ、これに標識抗体をさらに接触させ、これらのモノクローナル抗体と被検物質の複合体を検出することにより、ヒトあるいはウシアルブミンを測定することができる。さらに、被検物質と接触させた後に固相抗体を洗浄する工程及び／又は被検物質と結合しなかった標識抗体を洗浄により除去する工程を含んでいてもよい。また、固相抗体及び標識抗体は、前記（１）に記載の通り固相化及び標識化の操作により調製される。本発明の一態様として、モノクローナル抗体ｈＡｌｂ ３−７Ａ、ｈＡｌｂ ２−１０Ｄ、ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂ、ＦＣＳ−ＢＳＡ １０Ｂ−１２の使用が好適である。さらに、ヒトアルブミンを測定する場合、固相抗体としてモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ３−７Ａ、標識抗体としてモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ２−１０Ｄの組み合わせの測定系が特に好適である。ウシアルブミンを測定する場合、固相抗体としてモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂ、標識抗体としてモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ １０Ｂ−１２の組み合わせの測定系が特に好適である。本発明の方法においては、定性的な測定と、定量的な測定が含まれる。一態様として、被験試料はヒト血漿、血清などの体液又は細胞培養物等が挙げられる。
本発明のヒトあるいはウシアルブミンの測定方法は、前記（１）に記載のアルブミン質測定試薬を使用することを特徴とする方法である。例えば、本発明に使用されるヒトあるいはウシアルブミンを認識し、ヒトアルブミンを認識しない抗原認識部位を異にする２種のモノクローナル抗体を、一方を固相抗体、他方を標識抗体とする場合、被検物質と固相抗体を接触させ、これに標識抗体をさらに接触させ、これらのモノクローナル抗体と被検物質の複合体を検出することにより、ヒトあるいはウシアルブミンを測定することができる。さらに、被検物質と接触させた後に固相抗体を洗浄する工程及び／又は被検物質と結合しなかった標識抗体を洗浄により除去する工程を含んでいてもよい。また、固相抗体及び標識抗体は、前記（１）に記載の通り固相化及び標識化の操作により調製される。本発明の一態様として、モノクローナル抗体ｈＡｌｂ ３−７Ａ、ｈＡｌｂ ２−１０Ｄ、ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂ、ＦＣＳ−ＢＳＡ １０Ｂ−１２の使用が好適である。さらに、ヒトアルブミンを測定する場合、固相抗体としてモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ３−７Ａ、標識抗体としてモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ２−１０Ｄの組み合わせの測定系が特に好適である。ウシアルブミンを測定する場合、固相抗体としてモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂ、標識抗体としてモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ １０Ｂ−１２の組み合わせの測定系が特に好適である。本発明の方法においては、定性的な測定と、定量的な測定が含まれる。一態様として、被験試料はヒト血漿、血清などの体液又は細胞培養物等が挙げられる。
本発明の方法は、本発明のヒトアルブミン測定試薬及びウシアルブミン測定試薬でそれぞれ測定し、ヒトアルブミン及びウシアルブミンの量比を決定することができる。
本発明の方法は、２．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在するウシアルブミンを検出することが可能である。また、２．５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在するヒトアルブミンを検出することが可能である。本発明の方法は、ヒトあるいはウシアルブミンの異なる部位を認識する２種のモノクローナル抗体を使用することにより、極めて高い特異性を有する識別が可能である。
以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。
実施例１ 抗体の作製
（１） 抗原免疫・細胞融合
正常動物血清由来ウシアルブミンもしくはヒトアルブミン１ｍｇ／ｍＬ溶液を抗原とし、ＢＡＬＢｃマウス４匹に５０μｇ／ｓｈｏｔ／ｂｏｄｙの投与量で、初回免疫は、フロイント完全アジュバントとエマルジョンを形成させてから腹腔投与し、２回目以降は、市販の水溶性アジュバント（ＲＩＢＩ Ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合して、２週間隔合計４回の投与を行った。その後、眼窩静脈血清中のウシアルブミンもしくはヒトアルブミンに対する抗体価の上昇を確認した上で、すべての個体に最終免疫を実施した。最終免疫３日後に、４匹のうち２個体の免疫動物の脾臓を摘出し、無血清培地で分散・洗浄した後、細胞融合用ミエローマ（Ｐ３Ｕ１）と５：１（脾臓：ミエローマ）の割合で混合し遠心上清を除いた細胞ペレットとした。この細胞混合物に適温に保温した５０％ＰＥＧ溶液１ｍＬを一定速度で、軽い振とうを加えながら混合し、合計３ｍＬまで加え、そのあとは、無血清培地７ｍＬを同様に一定速度で加え、１０ｍＬにフィルアップし、この操作で細胞融合を実施した。約２週間の時差をつけて、残る２匹のマウスも同様の最終免疫をさらに１回追加して、３日後に細胞融合に供した。
２回のチャレンジで、多数の融合細胞を取得した。この幅広い母集団より抗原に特異的な抗体をスクリーニングした。
（１） 抗原免疫・細胞融合
正常動物血清由来ウシアルブミンもしくはヒトアルブミン１ｍｇ／ｍＬ溶液を抗原とし、ＢＡＬＢｃマウス４匹に５０μｇ／ｓｈｏｔ／ｂｏｄｙの投与量で、初回免疫は、フロイント完全アジュバントとエマルジョンを形成させてから腹腔投与し、２回目以降は、市販の水溶性アジュバント（ＲＩＢＩ Ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合して、２週間隔合計４回の投与を行った。その後、眼窩静脈血清中のウシアルブミンもしくはヒトアルブミンに対する抗体価の上昇を確認した上で、すべての個体に最終免疫を実施した。最終免疫３日後に、４匹のうち２個体の免疫動物の脾臓を摘出し、無血清培地で分散・洗浄した後、細胞融合用ミエローマ（Ｐ３Ｕ１）と５：１（脾臓：ミエローマ）の割合で混合し遠心上清を除いた細胞ペレットとした。この細胞混合物に適温に保温した５０％ＰＥＧ溶液１ｍＬを一定速度で、軽い振とうを加えながら混合し、合計３ｍＬまで加え、そのあとは、無血清培地７ｍＬを同様に一定速度で加え、１０ｍＬにフィルアップし、この操作で細胞融合を実施した。約２週間の時差をつけて、残る２匹のマウスも同様の最終免疫をさらに１回追加して、３日後に細胞融合に供した。
２回のチャレンジで、多数の融合細胞を取得した。この幅広い母集団より抗原に特異的な抗体をスクリーニングした。
（２） ＨＡＴ選択
融合細胞のスクリーニングには、クローニング培地（三光純薬社製）にＨＡＴ（Ｈ：ヒポキサンチン、Ａ：アミノプテリン、Ｔ：チミジン）を加えたものを用意し、融合日の翌日から３回の培地交換をこのＨＡＴ培地で行った。この培地交換操作で、成長してきた細胞は、脾臓由来のｄｅ ｎｏｖｏ合成系を持ちかつ不死化した融合細胞と言えた。
融合細胞のスクリーニングには、クローニング培地（三光純薬社製）にＨＡＴ（Ｈ：ヒポキサンチン、Ａ：アミノプテリン、Ｔ：チミジン）を加えたものを用意し、融合日の翌日から３回の培地交換をこのＨＡＴ培地で行った。この培地交換操作で、成長してきた細胞は、脾臓由来のｄｅ ｎｏｖｏ合成系を持ちかつ不死化した融合細胞と言えた。
（３） スクリーニング
免疫原と同様のウシアルブミンもしくはヒトアルブミンを、５μｇ／ｍＬ ＰＢＳ、５０μＬ／ｗｅｌｌで、イムノプレート（ナルジェヌンク社製）上に添加し、４℃で一晩放置して物理吸着させた。ブランク用抗原として、ウシアルブミンに対してヒトアルブミン、またヒトアルブミンに対してウシアルブミンをブランク抗原として相互にスクリーニングの際の評価用タンパクとした。５μｇ／ｍＬ ＰＢＳ、５０μＬ／ｗｅｌｌで、同様にコーティングした。翌日、抗原溶液を捨てて、５０％Ｂｌｏｃｋｅｒ Ｃａｓｅｉｎ（ピアス社製）を２００μＬ／ｗｅｌｌになるように加えて、室温（２０〜３０℃）で１時間放置して、ブロッキング操作を行った。その後、ブロッキング溶液を捨て、上記（２）で得られた融合細胞の培養上清（原液使用）を、ナンバリングした上で抗原プレートに投入し、一次反応を室温（２０〜３０℃）で１時間行った。ＰＢＳで反応が終了した各ウェルを３回洗浄し、ペーパータオルで充分に液を切った。検出には、抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体カクテル−ペルオキシダーゼ標識抗体を使用した。前記抗体を１μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温（２０〜３０℃）で１時間行った。その後、標識抗体液を捨て、ウエルをＰＢＳで４回洗浄した。ペーパータオルに打ち付けて、洗浄液を充分に除き、ペルオキシダーゼ基質であるＡＢＴＳ［２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）］溶液（ピアス社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで投入し、室温で１５〜３０分発色させ、強弱ある陽性株を幅広く検出した。等量の１５０ｍＭ シュウ酸を加えて反応を停止させた後、肉眼及びプレートリーダーで、陽性株を確認し、ブランク抗原に反応せず、目的のウシアルブミンもしくはヒトアルブミンに特異的に反応する株の選抜を試みた。
免疫原と同様のウシアルブミンもしくはヒトアルブミンを、５μｇ／ｍＬ ＰＢＳ、５０μＬ／ｗｅｌｌで、イムノプレート（ナルジェヌンク社製）上に添加し、４℃で一晩放置して物理吸着させた。ブランク用抗原として、ウシアルブミンに対してヒトアルブミン、またヒトアルブミンに対してウシアルブミンをブランク抗原として相互にスクリーニングの際の評価用タンパクとした。５μｇ／ｍＬ ＰＢＳ、５０μＬ／ｗｅｌｌで、同様にコーティングした。翌日、抗原溶液を捨てて、５０％Ｂｌｏｃｋｅｒ Ｃａｓｅｉｎ（ピアス社製）を２００μＬ／ｗｅｌｌになるように加えて、室温（２０〜３０℃）で１時間放置して、ブロッキング操作を行った。その後、ブロッキング溶液を捨て、上記（２）で得られた融合細胞の培養上清（原液使用）を、ナンバリングした上で抗原プレートに投入し、一次反応を室温（２０〜３０℃）で１時間行った。ＰＢＳで反応が終了した各ウェルを３回洗浄し、ペーパータオルで充分に液を切った。検出には、抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体カクテル−ペルオキシダーゼ標識抗体を使用した。前記抗体を１μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、室温（２０〜３０℃）で１時間行った。その後、標識抗体液を捨て、ウエルをＰＢＳで４回洗浄した。ペーパータオルに打ち付けて、洗浄液を充分に除き、ペルオキシダーゼ基質であるＡＢＴＳ［２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）］溶液（ピアス社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで投入し、室温で１５〜３０分発色させ、強弱ある陽性株を幅広く検出した。等量の１５０ｍＭ シュウ酸を加えて反応を停止させた後、肉眼及びプレートリーダーで、陽性株を確認し、ブランク抗原に反応せず、目的のウシアルブミンもしくはヒトアルブミンに特異的に反応する株の選抜を試みた。
（４） 抗ウシアルブミン抗体スクリーニング
抗ウシアルブミン抗体スクリーニングにおいて、第一回の融合−スクリーニングアッセイでは、陽性株が全く出現しなかった。抗原プレート上は、発色基質ＡＢＴＳのかすかな反応が見られるぐらいで、ウシアルブミンに強陽性を示すものはなかった。しかしながら、免疫動物の抗体価は十分な上昇が見られていたことから、本発明者らは熟考し、培地中に含まれるウシ胎児血清中のアルブミンが、ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体をことごとく高濃度でブロックしているのではないかという考えに到達した。そのため、ハイブリドーマスクリーニングを行う前日より、スクリーニング対象である９６ウェルプレート１０枚分相当の各ウェルから、培養上清を細胞存在位置ぎりぎりまで吸出し、あらたに完全無タンパク培地（Ｕｌｔｒａｄｏｍａ−ＰＦ、Ｌｏｎｚａ社製、ｃｏｄｅ．Ｂ２７２７）を加え、ウシ血清成分を極力少なくし、１日経過後に前項と同様のスクリーニングアッセイを実施し、目的のウシアルブミンに特異的に反応する株の選択に初めて成功した。
抗ウシアルブミン抗体スクリーニングにおいて、第一回の融合−スクリーニングアッセイでは、陽性株が全く出現しなかった。抗原プレート上は、発色基質ＡＢＴＳのかすかな反応が見られるぐらいで、ウシアルブミンに強陽性を示すものはなかった。しかしながら、免疫動物の抗体価は十分な上昇が見られていたことから、本発明者らは熟考し、培地中に含まれるウシ胎児血清中のアルブミンが、ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体をことごとく高濃度でブロックしているのではないかという考えに到達した。そのため、ハイブリドーマスクリーニングを行う前日より、スクリーニング対象である９６ウェルプレート１０枚分相当の各ウェルから、培養上清を細胞存在位置ぎりぎりまで吸出し、あらたに完全無タンパク培地（Ｕｌｔｒａｄｏｍａ−ＰＦ、Ｌｏｎｚａ社製、ｃｏｄｅ．Ｂ２７２７）を加え、ウシ血清成分を極力少なくし、１日経過後に前項と同様のスクリーニングアッセイを実施し、目的のウシアルブミンに特異的に反応する株の選択に初めて成功した。
（５） 抗ヒトアルブミン抗体スクリーニング
抗ヒトアルブミン抗体のスクリーニングにおいては、（４）記載のようにウシ血清培地を無タンパク培地に置き換えることなしに、（３）記載のスクリーニングアッセイで、ヒトアルブミンの陽性株を得ることができた。しかしながら、抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体のウシアルブミンへの交差反応性は、培地からのウシアルブミンでブロックされていたことが考えられ、実際に非交差として選抜したモノクローナル抗体が、後にウシ抗原へも交差する性質があることが判明した。そのため、目的の抗体の取得には、当初の予定より融合回数を増やし、一次スクリーニング前に培地を前項と同様に完全無タンパク培地に変換し、多数のモノクローナル抗体候補の選抜が必要であった。またさらにウシ抗原への交差反応の有無について、精製抗体に仕上げてから、充分な確認試験を実施した。
抗ヒトアルブミン抗体のスクリーニングにおいては、（４）記載のようにウシ血清培地を無タンパク培地に置き換えることなしに、（３）記載のスクリーニングアッセイで、ヒトアルブミンの陽性株を得ることができた。しかしながら、抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体のウシアルブミンへの交差反応性は、培地からのウシアルブミンでブロックされていたことが考えられ、実際に非交差として選抜したモノクローナル抗体が、後にウシ抗原へも交差する性質があることが判明した。そのため、目的の抗体の取得には、当初の予定より融合回数を増やし、一次スクリーニング前に培地を前項と同様に完全無タンパク培地に変換し、多数のモノクローナル抗体候補の選抜が必要であった。またさらにウシ抗原への交差反応の有無について、精製抗体に仕上げてから、充分な確認試験を実施した。
（６） 陽性株選抜とクローニング、株樹立
（４）及び（５）に示す厳格なスクリーニングの後、目的抗原に強く反応する数種類のハイブリドーマ元株を選択し、直ちに限界希釈法によりクローニングを行った。クローニングされた抗ウシアルブミン抗体産生ハイブリドーマ２種類、抗ヒトアルブミン抗体産生ハイブリドーマ８種類について、それぞれクローンを各２種（本株・亜株）確保した。
（４）及び（５）に示す厳格なスクリーニングの後、目的抗原に強く反応する数種類のハイブリドーマ元株を選択し、直ちに限界希釈法によりクローニングを行った。クローニングされた抗ウシアルブミン抗体産生ハイブリドーマ２種類、抗ヒトアルブミン抗体産生ハイブリドーマ８種類について、それぞれクローンを各２種（本株・亜株）確保した。
（７） マウス腹水採取
特異性の高い前記ハイブリドーマクローンは、本株・亜株ともに凍結細胞としてマスター細胞を保管後、ほぼ並行しながら、本株をＢＡＬＢｃマウスの腹腔内で大量培養し、腹水として粗精製抗体を得た。腹水は、１個体あたりおよそ３〜５ｍＬであった。
特異性の高い前記ハイブリドーマクローンは、本株・亜株ともに凍結細胞としてマスター細胞を保管後、ほぼ並行しながら、本株をＢＡＬＢｃマウスの腹腔内で大量培養し、腹水として粗精製抗体を得た。腹水は、１個体あたりおよそ３〜５ｍＬであった。
（８） 抗体精製
得られた腹水は、５０％飽和硫安塩析・透析を行い、その画分をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ カラムに供した。平衡化緩衝液は、３Ｍ ＮａＣｌ、１．５Ｍ ｇｌｙｃｉｎ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．９）の高塩濃度のものを調製し、どのサブクラスのＩｇＧであっても良好に結合する条件を採用した。平衡化緩衝液で２倍希釈した腹水硫安塩析画分を腹水液量とほぼ等量の容積のＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂にアプライし、吸光度Ａ２８０がほぼゼロになるまで平衡化緩衝液でカラムを洗った。その後、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）とクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）の２段階で溶出を行った。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３は主にｐＨ４．０で溶出され、ＩｇＧ２ｂは、ｐＨ３．０で溶出された。溶出画分は、ただちに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）で中和し、硫安塩析もしくは、遠心限外ろ過濃縮を行った。最終抗体は、ＰＢＳで透析し、０．２２μｍフィルターろ過により無菌化した。抗体の純度は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元加熱条件）により分析し、Ｈ鎖とＬ鎖以外のものがない良好な純度の抗体であることを確認した。
得られた腹水は、５０％飽和硫安塩析・透析を行い、その画分をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ カラムに供した。平衡化緩衝液は、３Ｍ ＮａＣｌ、１．５Ｍ ｇｌｙｃｉｎ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．９）の高塩濃度のものを調製し、どのサブクラスのＩｇＧであっても良好に結合する条件を採用した。平衡化緩衝液で２倍希釈した腹水硫安塩析画分を腹水液量とほぼ等量の容積のＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂にアプライし、吸光度Ａ２８０がほぼゼロになるまで平衡化緩衝液でカラムを洗った。その後、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）とクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）の２段階で溶出を行った。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３は主にｐＨ４．０で溶出され、ＩｇＧ２ｂは、ｐＨ３．０で溶出された。溶出画分は、ただちに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）で中和し、硫安塩析もしくは、遠心限外ろ過濃縮を行った。最終抗体は、ＰＢＳで透析し、０．２２μｍフィルターろ過により無菌化した。抗体の純度は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元加熱条件）により分析し、Ｈ鎖とＬ鎖以外のものがない良好な純度の抗体であることを確認した。
（９） 抗体修飾
得られた精製抗体のうち、一定量（試験的に各抗体１ｍｇ）を用いて、過ヨウ素酸法によるペルオキシダーゼ標識を施した。過ヨウ素酸法は、ペルオキシダーゼの糖鎖ジオールを脱水素酸化させシッフベースを形成させ、抗体側のアミノ基と結合する方法である。クローニングした１０種類の抗体は、すべてペルオキシダーゼ標識体とした。いずれの抗体も抗原との結合活性を保持した状態で酵素標識体とすることができた。
得られた精製抗体のうち、一定量（試験的に各抗体１ｍｇ）を用いて、過ヨウ素酸法によるペルオキシダーゼ標識を施した。過ヨウ素酸法は、ペルオキシダーゼの糖鎖ジオールを脱水素酸化させシッフベースを形成させ、抗体側のアミノ基と結合する方法である。クローニングした１０種類の抗体は、すべてペルオキシダーゼ標識体とした。いずれの抗体も抗原との結合活性を保持した状態で酵素標識体とすることができた。
実施例２ ウシアルブミン測定系構築
（１）ウシアルブミン測定系
固相と標識とに実施例１で得られた２種類の抗体をそれぞれ用い、最も高感度にウシアルブミンを定量できる系を試験した。その結果、固相抗体にモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂ、標識抗体にモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ １０Ｂ−１２を用いる組み合わせの測定系が確立した。以下に、サンプルとの一次反応と標識二次抗体反応とを同時に実施する１ステップＥＬＩＳＡ法とサンプル反応と標識二次抗体反応を２段階で行う２ステップＥＬＩＳＡ法を示す。
（１）ウシアルブミン測定系
固相と標識とに実施例１で得られた２種類の抗体をそれぞれ用い、最も高感度にウシアルブミンを定量できる系を試験した。その結果、固相抗体にモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂ、標識抗体にモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ １０Ｂ−１２を用いる組み合わせの測定系が確立した。以下に、サンプルとの一次反応と標識二次抗体反応とを同時に実施する１ステップＥＬＩＳＡ法とサンプル反応と標識二次抗体反応を２段階で行う２ステップＥＬＩＳＡ法を示す。
（２）１ステップＥＬＩＳＡ法
（Ａ）イムノプレート器材（ナルジェヌンク製）に、ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂ溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌで投入し、４℃で一晩放置する。
翌日、抗体溶液を捨て、２５％ブロックエース＋０．３Ｍマルトース／ＰＢＳ溶液（ブロッキング溶液）を２００μＬ／ｗｅｌｌで投入し、４℃一晩放置し、器材余剰部分をタンパク質ブロックする。
翌日、ブロッキング溶液を捨て、以下の測定に使用する。
（Ｂ）各濃度の検体を１００μＬずつマイクロピペットで各ｗｅｌｌに２連ずつ加え、モノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ １０Ｂ−１２標識抗体液を１００μＬずつ各ｗｅｌｌに加え、室温（２０〜３０℃）で一時間反応させる。（第一反応）
（Ｃ）反応液を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４回洗浄後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液（ＢｉｏＦＸ社製）を１００μＬずつ各ｗｅｌｌに加え、室温（２０〜３０℃）で１５分反応させる。（発色反応）
（Ｄ）１Ｎ 硫酸を１００μＬずつ、ＴＭＢＺ溶液を入れた順番に各ｗｅｌｌに加え、反応を停止させた後よく混和する。
蒸留水を対照としてマイクロプレートリーダーをブランク補正し、波長４５０ｎｍで吸光度を測定する。
標準曲線を作成し、検体の吸光度から対応するウシアルブミン濃度を読み取る。
（Ａ）イムノプレート器材（ナルジェヌンク製）に、ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂ溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌで投入し、４℃で一晩放置する。
翌日、抗体溶液を捨て、２５％ブロックエース＋０．３Ｍマルトース／ＰＢＳ溶液（ブロッキング溶液）を２００μＬ／ｗｅｌｌで投入し、４℃一晩放置し、器材余剰部分をタンパク質ブロックする。
翌日、ブロッキング溶液を捨て、以下の測定に使用する。
（Ｂ）各濃度の検体を１００μＬずつマイクロピペットで各ｗｅｌｌに２連ずつ加え、モノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ １０Ｂ−１２標識抗体液を１００μＬずつ各ｗｅｌｌに加え、室温（２０〜３０℃）で一時間反応させる。（第一反応）
（Ｃ）反応液を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４回洗浄後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液（ＢｉｏＦＸ社製）を１００μＬずつ各ｗｅｌｌに加え、室温（２０〜３０℃）で１５分反応させる。（発色反応）
（Ｄ）１Ｎ 硫酸を１００μＬずつ、ＴＭＢＺ溶液を入れた順番に各ｗｅｌｌに加え、反応を停止させた後よく混和する。
蒸留水を対照としてマイクロプレートリーダーをブランク補正し、波長４５０ｎｍで吸光度を測定する。
標準曲線を作成し、検体の吸光度から対応するウシアルブミン濃度を読み取る。
上記測定系により、ウシアルブミン標準品を測定した結果を表１に示す。必要サンプル量は、２０μｌ／ｗｅｌｌであり、５．０ｎｇ／ｍＬのウシアルブミンであっても検出可能であった。
（３）２ステップＥＬＩＳＡ法
サンプル中に、アジ化ナトリウムなどの防腐剤が含まれている場合、測定系を２ステップに変更することで、サンプル溶媒の影響を受けず、より高感度にウシアルブミンを検出することができる。
（Ａ）イムノプレート器材（ナルジェヌンク製）に、ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂ溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌで投入し、４℃で一晩放置する。
（Ｂ）翌日、抗体溶液を捨て、２５％ブロックエース＋０．３Ｍマルトース／ＰＢＳ溶液（ブロッキング溶液）を２００μＬ／ｗｅｌｌで投入し、４℃一晩放置し、器材余剰部分をタンパク質ブロックする。
翌日、ブロッキング溶液を捨て、以下の測定に使用する。
（Ｃ）各濃度の検体を１００μＬずつマイクロピペットで各ｗｅｌｌに２連ずつ加え、室温（２０〜３０℃）で１時間反応させる。（第一反応）
（Ｄ）反応液を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、モノクローナル抗体ｈＩｇＧ １３−９Ｈ標識抗体液を１００μＬずつ各ｗｅｌｌに加え、室温（２０〜３０℃）で一時間反応させる。（第二反応）
（Ｅ）反応液を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４回洗浄後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液（ＢｉｏＦＸ社製）を１００μＬずつ各ｗｅｌｌに加え、室温（２０〜３０℃）で１５分反応させる。（発色反応）
（Ｆ）１Ｎ 硫酸を１００μＬずつ、ＴＭＢＺ溶液を入れた順番に各ｗｅｌｌに加え、反応を停止させた後よく混和する。
蒸留水を対照としてマイクロプレートリーダーをブランク補正し、波長４５０ｎｍで吸光度を測定する。
標準曲線を作成し、検体の吸光度から対応するウシアルブミン濃度を読み取る。
サンプル中に、アジ化ナトリウムなどの防腐剤が含まれている場合、測定系を２ステップに変更することで、サンプル溶媒の影響を受けず、より高感度にウシアルブミンを検出することができる。
（Ａ）イムノプレート器材（ナルジェヌンク製）に、ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したモノクローナル抗体ＦＣＳ−ＢＳＡ ８Ｄ−３Ｂ溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌで投入し、４℃で一晩放置する。
（Ｂ）翌日、抗体溶液を捨て、２５％ブロックエース＋０．３Ｍマルトース／ＰＢＳ溶液（ブロッキング溶液）を２００μＬ／ｗｅｌｌで投入し、４℃一晩放置し、器材余剰部分をタンパク質ブロックする。
翌日、ブロッキング溶液を捨て、以下の測定に使用する。
（Ｃ）各濃度の検体を１００μＬずつマイクロピペットで各ｗｅｌｌに２連ずつ加え、室温（２０〜３０℃）で１時間反応させる。（第一反応）
（Ｄ）反応液を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、モノクローナル抗体ｈＩｇＧ １３−９Ｈ標識抗体液を１００μＬずつ各ｗｅｌｌに加え、室温（２０〜３０℃）で一時間反応させる。（第二反応）
（Ｅ）反応液を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４回洗浄後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液（ＢｉｏＦＸ社製）を１００μＬずつ各ｗｅｌｌに加え、室温（２０〜３０℃）で１５分反応させる。（発色反応）
（Ｆ）１Ｎ 硫酸を１００μＬずつ、ＴＭＢＺ溶液を入れた順番に各ｗｅｌｌに加え、反応を停止させた後よく混和する。
蒸留水を対照としてマイクロプレートリーダーをブランク補正し、波長４５０ｎｍで吸光度を測定する。
標準曲線を作成し、検体の吸光度から対応するウシアルブミン濃度を読み取る。
上記測定系により、ウシアルブミン標準品を測定した結果を表２に示す。必要サンプル量は、１００μｌ／ｗｅｌｌであり、２．５ｎｇ／ｍＬのウシアルブミンであっても検出可能であった。
（４）同時再現性試験
実施例２−（２）記載の測定系により、ウシ血清を希釈して作成した５種類の濃度コントロールを用いて同時再現性試験を行った。表３に結果を示すように、ＣＶ値は良好な同時再現性を示した。
実施例２−（２）記載の測定系により、ウシ血清を希釈して作成した５種類の濃度コントロールを用いて同時再現性試験を行った。表３に結果を示すように、ＣＶ値は良好な同時再現性を示した。
（５）日差再現性試験
実施例２−（２）記載の測定系で、三日間にわたり５種類の濃度コントロールを定量して日差再現性試験を行った。表４に結果を示すように、良好な日差再現性を示した。
実施例２−（２）記載の測定系で、三日間にわたり５種類の濃度コントロールを定量して日差再現性試験を行った。表４に結果を示すように、良好な日差再現性を示した。
（６）添加回収試験
実施例２−（２）記載の測定系でウシアルブミンの添加回収試験を行った。各種濃度のウシアルブミン検体２種を等量に混合したサンプルを測定し、実測値からウシアルブミン量の理論値との差（＝回収率）を求めた。表５に結果を示すように、添加回収率８６％から１０４％（平均値９７．９３％）と良好な結果が得られた。
実施例２−（２）記載の測定系でウシアルブミンの添加回収試験を行った。各種濃度のウシアルブミン検体２種を等量に混合したサンプルを測定し、実測値からウシアルブミン量の理論値との差（＝回収率）を求めた。表５に結果を示すように、添加回収率８６％から１０４％（平均値９７．９３％）と良好な結果が得られた。
（７）交差反応性
実施例２−（２）記載の測定系で交差反応性試験を行った。各種の動物由来のアルブミンは、正常動物血清（コスモバイオ社製）を高濃度アルブミン含有物とした。５６℃、３０分処理して非働化した胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社製）を調製した。これらのアルブミン含有物を、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５倍に希釈して使用した。表６に吸光度Ａ４５０の測定結果を示す。表６に示すように、ウシ、特異的に検出可能であることが示された。
実施例２−（２）記載の測定系で交差反応性試験を行った。各種の動物由来のアルブミンは、正常動物血清（コスモバイオ社製）を高濃度アルブミン含有物とした。５６℃、３０分処理して非働化した胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社製）を調製した。これらのアルブミン含有物を、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５倍に希釈して使用した。表６に吸光度Ａ４５０の測定結果を示す。表６に示すように、ウシ、特異的に検出可能であることが示された。
（８）加熱ウシ血清サンプルの測定
ウシ血清サンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４種類を入手し、これらのウシ血清サンプルをそれぞれ４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃で３０分加熱し、直ちに４℃で５分間冷却した。その後、各サンプルを希釈し、実施例２−（２）記載の測定系でアルブミン濃度を測定した。表７に吸光度Ａ４５０の測定結果を示す。表７に示すように、６０〜６５℃で３０分加熱したウシ血清サンプルでも、十分にアルブミン濃度を測定可能であることが示された。
ウシ血清サンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４種類を入手し、これらのウシ血清サンプルをそれぞれ４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃で３０分加熱し、直ちに４℃で５分間冷却した。その後、各サンプルを希釈し、実施例２−（２）記載の測定系でアルブミン濃度を測定した。表７に吸光度Ａ４５０の測定結果を示す。表７に示すように、６０〜６５℃で３０分加熱したウシ血清サンプルでも、十分にアルブミン濃度を測定可能であることが示された。
実施例３ ヒトアルブミン測定系構築
（１）ヒトアルブミン測定系
固相と標識とに実施例１で得られた８種類の抗体をそれぞれ用い、５６通りの組み合わせについて、非特異的な結合反応がなく、他動物のアルブミンにも交差することなく高感度にウシアルブミンを定量できる系を試験した。その結果、固相抗体にモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ３−７Ａ、標識抗体にモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ２−１０Ｄを用いる組み合わせの測定系が確立した。以下に、サンプルとの一次反応後、洗浄する工程を行い、標識二次抗体反応を実施する２ステップＥＬＩＳＡ法を示す。
（１）ヒトアルブミン測定系
固相と標識とに実施例１で得られた８種類の抗体をそれぞれ用い、５６通りの組み合わせについて、非特異的な結合反応がなく、他動物のアルブミンにも交差することなく高感度にウシアルブミンを定量できる系を試験した。その結果、固相抗体にモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ３−７Ａ、標識抗体にモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ２−１０Ｄを用いる組み合わせの測定系が確立した。以下に、サンプルとの一次反応後、洗浄する工程を行い、標識二次抗体反応を実施する２ステップＥＬＩＳＡ法を示す。
（２）２ステップＥＬＩＳＡ法
（Ａ）イムノプレート器材（ナルジェヌンク製）に、ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ３−７Ａ溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌで投入し、４℃で一晩放置する。
（Ｂ）翌日、抗体溶液を捨て、２５％ブロックエース＋０．３Ｍマルトース／ＰＢＳ溶液（ブロッキング溶液）を２００μＬ／ｗｅｌｌで投入し、４℃一晩放置し、器材余剰部分をタンパク質ブロックする。
翌日、ブロッキング溶液を捨て、以下の測定に使用する。
（Ｃ）各濃度の検体を１００μＬずつマイクロピペットで各ｗｅｌｌに２連ずつ加え、室温（２０〜３０℃）で１時間反応させる。（第一反応）
（Ｄ）反応液を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、モノクローナル抗体ｈＡｌｂ ２−１０Ｄ標識抗体液を１００μＬずつ各ｗｅｌｌに加え、室温（２０〜３０℃）で一時間反応させる。（第二反応）
（Ｅ）反応液を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４回洗浄後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液（ＢｉｏＦＸ社製）を１００μＬずつ各ｗｅｌｌに加え、室温（２０〜３０℃）で１５分反応させる。（発色反応）
（Ｆ）１Ｎ 硫酸を１００μＬずつ、ＴＭＢＺ溶液を入れた順番に各ｗｅｌｌに加え、反応を停止させた後よく混和する。
蒸留水を対照としてマイクロプレートリーダーをブランク補正し、波長４５０ｎｍで吸光度を測定する。
標準曲線を作成し、検体の吸光度から対応するヒトアルブミン濃度を読み取る。
（Ａ）イムノプレート器材（ナルジェヌンク製）に、ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ３−７Ａ溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌで投入し、４℃で一晩放置する。
（Ｂ）翌日、抗体溶液を捨て、２５％ブロックエース＋０．３Ｍマルトース／ＰＢＳ溶液（ブロッキング溶液）を２００μＬ／ｗｅｌｌで投入し、４℃一晩放置し、器材余剰部分をタンパク質ブロックする。
翌日、ブロッキング溶液を捨て、以下の測定に使用する。
（Ｃ）各濃度の検体を１００μＬずつマイクロピペットで各ｗｅｌｌに２連ずつ加え、室温（２０〜３０℃）で１時間反応させる。（第一反応）
（Ｄ）反応液を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、モノクローナル抗体ｈＡｌｂ ２−１０Ｄ標識抗体液を１００μＬずつ各ｗｅｌｌに加え、室温（２０〜３０℃）で一時間反応させる。（第二反応）
（Ｅ）反応液を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４回洗浄後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液（ＢｉｏＦＸ社製）を１００μＬずつ各ｗｅｌｌに加え、室温（２０〜３０℃）で１５分反応させる。（発色反応）
（Ｆ）１Ｎ 硫酸を１００μＬずつ、ＴＭＢＺ溶液を入れた順番に各ｗｅｌｌに加え、反応を停止させた後よく混和する。
蒸留水を対照としてマイクロプレートリーダーをブランク補正し、波長４５０ｎｍで吸光度を測定する。
標準曲線を作成し、検体の吸光度から対応するヒトアルブミン濃度を読み取る。
上記測定系により、ヒトアルブミン標準品を測定した結果を表８に示す。必要サンプル量は、１００μｌ／ｗｅｌｌであり、２．５ｎｇ／ｍＬのヒトアルブミンであっても検出可能であった。
（３）同時再現性試験
実施例３−（２）記載の測定系により、ヒト血清を希釈して作成した３種類の濃度コントロールを用いて同時再現性試験を行った。表９に結果を示すように、ＣＶ値は良好な同時再現性を示した。
（４）日差再現性試験
実施例３−（２）記載の測定系で、三日間にわたり３種類の濃度コントロールを定量して日差再現性試験を行った。表１０に結果を示すように、良好な日差再現性を示した。
実施例３−（２）記載の測定系で、三日間にわたり３種類の濃度コントロールを定量して日差再現性試験を行った。表１０に結果を示すように、良好な日差再現性を示した。
（５）添加回収試験
実施例３−（２）記載の測定系でヒトアルブミンの添加回収試験を行った。各種濃度のヒトアルブミン検体２種を等量に混合したサンプルを測定し、実測値からヒトアルブミン量の理論値との差（＝回収率）を求めた。表１１に結果を示すように、添加回収率９２．３％から１０８．８％（平均値９９．１４％）と良好な結果が得られた。
実施例３−（２）記載の測定系でヒトアルブミンの添加回収試験を行った。各種濃度のヒトアルブミン検体２種を等量に混合したサンプルを測定し、実測値からヒトアルブミン量の理論値との差（＝回収率）を求めた。表１１に結果を示すように、添加回収率９２．３％から１０８．８％（平均値９９．１４％）と良好な結果が得られた。
（６）交差反応性
実施例３−（２）記載の測定系で交差反応性試験を行った。各種の動物由来のアルブミンは、正常動物血清（コスモバイオ社製）を高濃度アルブミン含有物とし、１×１０６、１×１０７倍に希釈して使用した。表１２に吸光度Ａ４５０の測定結果を示す。表１２に示すように、ヒトアルブミン特異的に検出可能であることが示された。
実施例３−（２）記載の測定系で交差反応性試験を行った。各種の動物由来のアルブミンは、正常動物血清（コスモバイオ社製）を高濃度アルブミン含有物とし、１×１０６、１×１０７倍に希釈して使用した。表１２に吸光度Ａ４５０の測定結果を示す。表１２に示すように、ヒトアルブミン特異的に検出可能であることが示された。
（７） ヒト培養細胞上清中のヒトアルブミン検出
ヒト肝癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ、大日本住友製薬社製）を、抗生物質を含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社製）で培養した。その培養上清を直接又は５倍に希釈し、実施例３−（２）記載の測定系により、ヒトアルブミン濃度を経時的に測定した。その吸光度Ａ４５０の測定結果を表１３に示す。表１３に示すように、ヒト由来の細胞の培養上清に含まれるヒトアルブミンを測定可能であることが示された。
ヒト肝癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ、大日本住友製薬社製）を、抗生物質を含む１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社製）で培養した。その培養上清を直接又は５倍に希釈し、実施例３−（２）記載の測定系により、ヒトアルブミン濃度を経時的に測定した。その吸光度Ａ４５０の測定結果を表１３に示す。表１３に示すように、ヒト由来の細胞の培養上清に含まれるヒトアルブミンを測定可能であることが示された。
（８） ヒト尿中アルブミン検出
インフォームドコンセントの得られたヒト健常人ドナーより採尿を実施した。まず、尿中アルブミンの測定に適した希釈倍率を決定するため、尿サンプルを様々な希釈倍率で希釈し、実施例３−（２）記載の測定系によりヒトアルブミンを測定した。その吸光度Ａ４５０の測定結果を表１４に示す。表１４に示すように、尿のアルブミン測定には、尿サンプルを段階希釈することにより、検量線範囲内で定量できることが示された。
インフォームドコンセントの得られたヒト健常人ドナーより採尿を実施した。まず、尿中アルブミンの測定に適した希釈倍率を決定するため、尿サンプルを様々な希釈倍率で希釈し、実施例３−（２）記載の測定系によりヒトアルブミンを測定した。その吸光度Ａ４５０の測定結果を表１４に示す。表１４に示すように、尿のアルブミン測定には、尿サンプルを段階希釈することにより、検量線範囲内で定量できることが示された。
次に、別の４人のインフォームドコンセントの得られたヒト健常人ドナーより、１日にわたり３〜５回採尿を実施した。各尿サンプルを５倍又は２５倍に希釈し、実施例３−（２）記載の測定系により測定し、ヒトアルブミン量を算出した。その結果、表１５に示すように、尿中アルブミンを正確に測定できた。
以上の結果から、本発明の測定試薬を使用する検出系は、アルブミンを測定することにおいて高感度で性能的に安定な系であることを示している。
ウシアルブミンを測定して得られる結果は、サンプル中のウシ由来サンプルの混入履歴をモニタリングする上で、有用な情報を提供し、またヒトアルブミン測定で得られる結果は、尿中の測定においては、腎臓疾患の早期発見、病勢や薬剤による治療効果、及び予知、診断に有用な情報を提供し、また特殊培養細胞上清での検出の場合には、機能分化マーカーとして有用な情報を提供することができる。
ウシアルブミンを測定して得られる結果は、サンプル中のウシ由来サンプルの混入履歴をモニタリングする上で、有用な情報を提供し、またヒトアルブミン測定で得られる結果は、尿中の測定においては、腎臓疾患の早期発見、病勢や薬剤による治療効果、及び予知、診断に有用な情報を提供し、また特殊培養細胞上清での検出の場合には、機能分化マーカーとして有用な情報を提供することができる。
Claims (5)
- 被験試料中のヒトアルブミンを測定する試薬において、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３７１で表されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ３−７Ａ及び寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１３７０で表されるハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体ｈＡｌｂ ２−１０Ｄを構成成分とすることを特徴とするヒトアルブミン測定試薬。
- 測定方法としてエンザイムイムノアッセイを用いる、請求項１記載のヒトアルブミン測定試薬。
- 固相抗体を使用する請求項２記載のヒトアルブミン測定試薬。
- 請求項１〜３いずれか１項記載のヒトアルブミン測定試薬を使用する被検試料中のヒトアルブミンの測定方法。
- 被験試料が、生体由来試料又は細胞培養由来試料から選ばれる請求項４記載の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008297663A JP5231954B2 (ja) | 2007-11-22 | 2008-11-21 | アルブミン測定試薬 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007303048 | 2007-11-22 | ||
| JP2007303048 | 2007-11-22 | ||
| JP2008297663A JP5231954B2 (ja) | 2007-11-22 | 2008-11-21 | アルブミン測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009145329A JP2009145329A (ja) | 2009-07-02 |
| JP5231954B2 true JP5231954B2 (ja) | 2013-07-10 |
Family
ID=40916061
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008297663A Active JP5231954B2 (ja) | 2007-11-22 | 2008-11-21 | アルブミン測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5231954B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201719592D0 (en) * | 2017-11-24 | 2018-01-10 | Tedder Richard | Flavivirus diagnostic assay |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6344894A (ja) * | 1986-08-13 | 1988-02-25 | Ube Ind Ltd | 抗ヒト血清アルブミンモノクロ−ナル抗体およびその製法 |
| JPS6357597A (ja) * | 1986-08-28 | 1988-03-12 | Ube Ind Ltd | 血清アルブミンの除去または回収法 |
-
2008
- 2008-11-21 JP JP2008297663A patent/JP5231954B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2009145329A (ja) | 2009-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7382071B2 (ja) | 糖化ヘモグロビン（％）の測定方法 | |
| US20200088722A1 (en) | Pivka-ii measurement method, measurement reagent, and measurement kit | |
| WO2016104439A1 (ja) | 抗活性型ｇｉｐ抗体 | |
| US20210317232A1 (en) | Methods and compositions relating to anti-biotin antibodies | |
| JP5231954B2 (ja) | アルブミン測定試薬 | |
| JP5280916B2 (ja) | 抗ラットオステオカルシンモノクローナル抗体 | |
| WO2014147873A1 (ja) | Ｈｍｇｂ１の分解産物と特異的に結合する抗体、並びにｈｍｇｂ１の分解産物の測定方法及び測定試薬 | |
| JPH10226700A (ja) | Ｍｉａの検出のためのイムノアッセイ | |
| JP5448424B2 (ja) | ヒトＩｇＧのＦｃを含有するタンパク質の測定試薬 | |
| JP5553603B2 (ja) | 新規肝癌マーカー | |
| US20210055300A1 (en) | Monoclonal antibody against apoa4, immunological measurement method, and kit for measurement | |
| EP1213302A1 (en) | Specific antibody directed to active but not inactive hepatocyte growth factor activator (HGFA) | |
| US20190375834A1 (en) | Disulfide-type hmgb1-specific antibody, method for measuring disulfide-type hmgb1 and kit for said measurement, and measurement method capable of quantitating all of hmgb1 molecules including reduced hmgb1, disulfide-type hmgb1 and thrombin-cleavable hmgb1 and kit for said measurement | |
| JP4215462B2 (ja) | 非グリコシル化ヘモグロビン、グリコシル化ヘモグロビンに特異的に結合するモノクローナル抗体の製造方法 | |
| JP3568198B2 (ja) | 異常プリオンタンパク質の検出方法 | |
| KR20150114558A (ko) | 인독실 황산의 측정 방법 | |
| WO2017033846A1 (ja) | 免疫試験方法および免疫試験キット | |
| JP4090236B2 (ja) | 活性型肝細胞増殖因子アクティベーターに対する特異的抗体とその使用法 | |
| JP6979200B2 (ja) | レプトスピラ症の診断に用いるレプトスピラ抗原検出用抗体 | |
| JP7313659B2 (ja) | 試料中のｈｍｇｂ１の測定方法及び測定試薬 | |
| US8349569B2 (en) | Anti-fibronectin fragment monoclonal antibody | |
| JP2010189381A (ja) | 抗ヒトオステオカルシンモノクローナル抗体 | |
| JP2006265138A (ja) | ネコトリプシノーゲン及び／又はネコトリプシンに対するモノクローナル抗体 | |
| JP5585587B2 (ja) | ５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法 | |
| JP4753366B2 (ja) | ％ｃｄｔの定量方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20111004 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120720 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20120725 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120918 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130308 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130322 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160329 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5231954 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |