JP2010189381A - 抗ヒトオステオカルシンモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】操作が簡便で、かつ測定精度、特異性、再現性に優れたヒトオステオカルシン分別測定手段を提供する。
【解決手段】特定な配列からなるアミノ酸配列で表されるヒトオステオカルシンのＮ末端部位と反応し、上記アミノ酸配列とは異なる、別の特定な配列からなるアミノ酸配列で表されるウシオステオカルシンのＮ末端部位と反応しないことを特徴とする抗ヒトオステオカルシンモノクローナル抗体、当該抗体を含むヒトオステオカルシン測定試薬、当該抗体又は測定試薬を使用するヒトオステオカルシン測定方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヒトオステオカルシンに対して特異性を有する抗ヒトオステオカルシンモノクローナル抗体及びその使用方法に関する。

オステオカルシンは、骨芽細胞由来の骨形成に関与するカルシウム結合タンパク質である。また、オステオカルシン分子内のグルタミン酸残基のあるものはビタミンＫ依存的にγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）残基に変換されていく。オステオカルシンは一般に骨の代謝が亢進している骨疾患において血中レベルの上昇が認められ、骨代謝の生化学的な指標となるといわれている。近年、閉経後骨粗鬆症、ミエローマ、ベージェット病、慢性腎不全、副甲状腺機能亢進症等の診断に有用な指標であることが示されてきた。この目的のため、ポリクローナル抗体を用いたラジオイムノアッセイ法（例えば非特許文献１）が開発され、ヒト血中のオステオカルシン濃度を測定することが可能となった。また、モノクローナル抗体を用いるエンザイムイムノアッセイ方法も本発明者らにより先に提案されている（例えば特許文献１）。

骨芽細胞は、骨髄細胞中に存在する間葉系幹細胞から分化する。骨芽細胞の分化過程をｉｎ ｖｉｔｒｏで再現し、モニタリングすることは、前記疾病の病態モデル解明のためにも有用である。

特開平１−１６０４９３号公報

Ｐ．Ａ．Ｐｒｉｃｅら、プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンシイス オブ ザ ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ）第７７巻、第２２３４頁（１９８０）

しかしながらヒト細胞の培養時にはウシ血清が通常使用されているため、ヒト骨髄細胞の分化マーカーであるヒトオステオカルシン測定時においては、ウシ血清中に存在するウシオステオカルシンの存在が問題となる。
そこで、操作が簡便で、かつ測定精度、特異性、再現性に優れたヒトオステオカルシン分別測定手段の開発が必要である。

本発明者らは鋭意努力を重ね、従来入手されていなかった、ウシオステオカルシンと交差せず、ヒトオステオカルシンを特異的に認識する抗ヒトオステオカルシンモノクローナル抗体の創成に成功し、当該モノクローナル抗体を使用することにより、本発明が解決しようとする課題が解決されること、当該モノクローナル抗体を使用すれば、培養細胞中のヒトオステオカルシンのモニタリングにも有用であることを見出し、本発明を完成させた。

本発明の第１の発明は、配列表の配列番号１で表されるヒトオステオカルシンのＮ末端部位と反応し、配列表の配列番号２で表されるウシオステオカルシンのＮ末端部位と反応しないことを特徴とする抗ヒトオステオカルシンモノクローナル抗体に関する。本発明の第１の発明には、抗ヒトオステオカルシンモノクローナル抗体であって、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１６５５で表わされるハイブリドーマ細胞より産生され得るモノクローナル抗体ｈＯＣＮ−Ｃ５７ ５−１２Ｈ ＶＰ２が含まれる。

本発明の第２の発明は、本発明の第１の発明の抗ヒトオステオカルシンモノクローナル抗体を含むヒトオステオカルシン測定試薬に関する。本発明の第２の発明は、さらにＧｌａ残基を有するヒトオステオカルシンと反応し、当該残基がグルタミン酸残基となっているヒトオステオカルシンとは反応しない抗ヒトオステオカルシンモノクローナル抗体を含むヒトオステオカルシン測定試薬を含む。

本発明の第３の発明は、本発明の第１の発明の抗ヒトオステオカルシンモノクローナル抗体又は本発明の第２の発明のヒトオステオカルシン測定試薬を使用する被験試料中のヒトオステオカルシンの測定方法に関する。本発明の第３の発明は、ウシ血清を含有する被験試料中のヒトオステオカルシンを測定するヒトオステオカルシンの測定方法、当該被験試料が、生体由来試料又は培養細胞由来試料から選ばれる測定方法を含む。

本発明の第４の発明は、本発明の第１の発明の抗ヒトオステオカルシンモノクローナル抗体を産生する、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１６５５で表されるハイブリドーマ細胞に関する。

本発明により、操作が簡便で、測定精度が高く、特異性、再現性にも優れた抗ヒトオステオカルシンモノクローナル抗体が安定して提供される。
本発明の試薬は、被験試料中のヒトオステオカルシンの絶対量の変化を調べることができ、ヒト及びヒトの培養細胞を使用する骨代謝のモニタリング手法として用いることができる。さらに、本発明の抗体は、ウシオステオカルシンを認識しないため、濃厚なウシ血清が混在する可能性のある被験試料であっても、特異的かつ精度よくヒトオステオカルシンを測定することができ、ことに顕著な効果を有する。

本発明で「オステオカルシン」（ＯＣ）とは、骨芽細胞由来のカルシウム結合タンパク質であり、分子内にビタミンＫ依存的にＧｌａ残基に変換されうるグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基を有する。ヒトＯＣの分子量は約５９００で、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる４９のアミノ酸残基から構成されている。ヒトＯＣは通常、骨芽細胞から産生されたのち、その１７、２１、２４位のグルタミン酸がビタミンＫ依存性γ−カルボキシラーゼによりＧｌａ化されて骨基質にとどまると考えられている。

本発明で「モノクローナル抗体」とは、単一クローンの抗体生産細胞が分泌する抗体を意味し、単クローン（性）抗体ともいう。特定の抗原決定基を認識する抗体であり、アミノ酸配列の一次構造が均一である。本発明のモノクローナル抗体は、細胞融合法により調製されるハイブリドーマが産生する抗体に加えて、抗体産生細胞のｍＲＮＡ等を用いて遺伝子工学的に作製された抗体も含まれる。

本発明で、「配列表の配列番号１で表されるヒトＯＣのＮ末端部位と反応し、配列表の配列番号２で表されるウシＯＣのＮ末端部位と反応しない」とは、本発明のモノクローナル抗体が、配列番号２で表されるウシＯＣのＮ末端部位と免疫反応を強く起こさないことを意味する。特に限定はされないが、例えば、本発明のモノクローナル抗体を用いて、配列表の配列番号２で表される配列を含むウシＯＣを測定した場合、その測定値は、当該ウシＯＣと同濃度の配列表の配列番号１で表される配列を含むヒトＯＣを測定した場合の測定値に比べて極めて低値、又は実質的に測定値として意味の無い数値であり、ヒトＯＣ測定値の１％以下、好ましくは０．１％以下、特に好ましくは０．０１％以下である。最も好ましい態様において、本発明の抗体は配列表の配列番号２で表される配列を含むウシＯＣとは全く反応しないか、又はウシＯＣの測定値は検出限界以下である。

（１）本発明の抗ヒトＯＣモノクローナル抗体
本発明のモノクローナル抗体は、配列表の配列番号１で表されるヒトＯＣのＮ末端の６アミノ酸部位と反応し、配列表の配列番号２で表されるウシＯＣのＮ末端の６アミノ酸部位と反応しないモノクローナル抗体である。すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＯＣと反応し、ウシＯＣとは反応しない抗体である。ヒトおよびウシのＯＣは、分子全体でも４アミノ酸しか違わないため、これらを区別して認識する抗体を取得することは極めて困難である。本発明の抗体はヒトＯＣのＮ末端ペプチドを認識するため、Ｇｌａ残基を有するＧｌａ型ヒトＯＣ、当該Ｇｌａ残基がＧｌｕ残基となっているＧｌｕ型ヒトＯＣのいずれであっても、ヒトＯＣのＮ末端領域が存在すれば認識する。さらに、血清中に存在するＧｌｕ型ヒトＯＣの多くは、そのＮ末端を欠損する（Ｇｌｕ型Ｎ末端欠失ヒトＯＣ）が、本発明の抗体はＧｌｕ型Ｎ末端欠失ヒトＯＣと反応せず、全長ヒトＯＣに特異的に反応するので、血中のＧｌｕ型Ｎ末端欠失ヒトＯＣを区別して測定できる点で有用である。

本発明の抗体は、ウシ血清を含む試料であっても、ウシ血清に混在するウシＯＣの影響を受けることなくヒトＯＣを特異的に測定することができる。したがって、ウシの血液、血清、血漿などのウシＯＣを含む培地で培養したヒト培養細胞の抽出物や培養上清中のヒトＯＣを特異的かつ高感度に測定することができる。例えば、ヒト間葉系幹細胞などの前駆細胞から骨芽細胞への分化過程を、ヒトＯＣをマーカーとしてモニタリングする際に、ウシ血清を含む培地を使用しても細胞の分化を正確かつ高感度にモニターすることができる。

また、本発明の抗体にペプシン、パパイン等のタンパク質分解酵素を作用させ、抗体のＦｃ部分を除去して得られる、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等のフラグメントも本発明で使用する抗体に含まれる。

さらに、得られたモノクローナル抗体を基に、遺伝子工学的に製造される組換え抗体や、定常領域を他の抗体の定常領域に置換したキメラ抗体であっても良い。このような抗体は、二重特異性抗体（二価抗体）、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ_３、Ｄｉａｂｏｄｙ、Ｔｒｉａｂｏｄｙ、Ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、Ｍｉｎｉｂｏｄｙ、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２−Ｆｃ、ｉｎｔａｃｔ−ＩｇＧが例示され、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２３巻、第９号、ｐ．１１２６−３６（２００５）に詳述される。

本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合法によって作製されたハイブリドーマを使用して製造される。前記ハイブリドーマは、抗体産生細胞の集団と骨髄腫細胞と融合ハイブリドーマを形成させ、該ハイブリドーマをクローン化し、配列番号１で表わされる配列を含むヒトＯＣを認識する抗体を産生するクローンを選択し、さらに本発明の目的に好適なクローンを選別することによって樹立される。
抗体産生細胞には、配列番号１で表わされる配列を含むヒトＯＣ又はその一部によって免疫された動物の脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等が利用できる。免疫させる動物としては、マウス、ウマ、ヤギ、ウサギ等が挙げられる。免疫原として用いる前記ヒトＯＣ又はその一部を天然から得る場合は、血清画分あるいは血漿画分から塩析、透析やアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等各種クロマトグラフィーを用いて精製することが可能である。また、ヒトＯＣを産生する骨芽細胞等、適当な細胞を培養し、その培養上清から精製することも可能である。また、人工的にヒトＯＣ又はその一部のポリペプチド又はペプチドを合成して調製することができる。かくして得られたヒトＯＣ又は配列番号１のアミノ酸配列を含むその一部を、例えばＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に代表されるキャリアタンパクと結合後、又はＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）と混合後、フロイントのアジュバントと混合し、動物の免疫に使用する。又はヒトＯＣ又はその一部を直接フロイントのアジュバントと混合し、動物の免疫に使用する。免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に１回に２０〜２００μｇの抗原−アジュバント混合物を投与することにより行われる。例えば、抗原−アジュバント混合物を２〜３週間に１回の間隔で３〜７回投与することにより、最終免疫より約３〜５日後、免疫動物の脾臓から抗体産生細胞を分取することができる。また、抗原−アジュバント混合物を１回投与し、約２〜３週間後に免疫動物のリンパ節から抗体産生細胞を分取することができる

骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用される。細胞融合は例えばＧ．ケラー（Ｇ．Ｋｅｈｌｅｒ）「ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）第２５６巻、第４９５頁（１９７５）」に記載の方法、又はこれに準ずる方法により行われる。この際、３０〜５０％ポリエチレングリコール（分子量１０００〜６０００）を用い、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを３０〜４０℃の温度下、約１〜３分間程度反応させる。細胞融合により得られたハイブリドーマはスクリーニングに付される。例えば、抗原としてヒトＯＣを用いた酵素抗体法（ＥＩＡ）等により前記配列表の配列番号１で表される配列を含むヒトＯＣと反応する抗体を生産するハイブリドーマのスクリーニングが行われる。さらに、配列表の配列番号２で表される配列を含むウシＯＣと反応しない抗体を生産するハイブリドーマのスクリーニングが行われる。得られた抗体産生ハイブリドーマは、例えば限界希釈法によりクローン化される。得られたクローンは、次いで目的とする高感度、高特異性のモノクローナル抗体を産生するクローンを選択するため、例えば酵素抗体法等によるスクリーニングに供される。
こうして選ばれたクローンは、例えばあらかじめプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）やＦＩＡ（Ｆｒｅｕｎｄ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取する。この腹水からのモノクローナル抗体の回収は、イムノグロブリンの精製法として従来既知の硫安分画法、ポリエチレングリコール分画法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲルクロマトグラフ法、アフィニティークロマトグラフ法等を応用することで達成される。

本発明の一態様として、配列表の配列番号１で表されるヒトＯＣのＮ末端部位と反応し、配列表の配列番号２で表されるウシＯＣのＮ末端部位と反応しないことを特徴とする抗ヒトＯＣモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞ｈＯＣＮ−Ｃ５７ ５−１２Ｈ ＶＰ２により産生されるモノクローナル抗体ｈＯＣＮ−Ｃ５７ ５−１２Ｈ ＶＰ２である。ハイブリドーマ細胞ｈＯＣＮ−Ｃ５７ ５−１２Ｈ ＶＰ２は、平成２０年８月２０日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ Ｐ−２１６５５として寄託されている。
この抗体を含有するヒトＯＣ測定試薬は、配列表の配列番号１で表される配列を含むヒトＯＣと反応し、配列表の配列番号２で表される配列を含むウシＯＣと反応しないことから、広くウシＯＣとヒトＯＣの分別、測定に適用することができる。

本発明は前記の抗体を産生する細胞、すなわち本発明のモノクローナル抗体ｈＯＣＮ−Ｃ５７ ５−１２Ｈ ＶＰ２を産生するハイブリドーマ細胞ｈＯＣＮ−Ｃ５７ ５−１２Ｈ ＶＰ２を包含する。

（２）本発明のヒトＯＣ測定試薬
本発明のヒトＯＣ測定試薬は、被験試料中のヒトＯＣを測定する試薬において、前記（１）記載の抗ヒトＯＣモノクローナル抗体を含むことを特徴とする。
本発明の一態様として、本発明はさらにＧｌａ残基を有するヒトＯＣ（Ｇｌａ型：活性型ＯＣともいう）と反応し、Ｇｌａ残基の少なくとも一部を脱炭酸してＧｌｕ残基としたヒトＯＣ（Ｇｌｕ型：不活性型ＯＣともいう）とは反応しない抗ヒトＯＣモノクローナル抗体を含むヒトＯＣ測定試薬であってもよい。

本発明者らは前記（１）の抗ヒトＯＣモノクローナル抗体を創成し、さらに当該抗体をＧｌａ型ヒトＯＣと反応し、Ｇｌｕ型ヒトＯＣとは反応しない抗ヒトＯＣモノクローナル抗体と組み合わせ、それぞれ多数の組み合わせをさらにスクリーニングし、高感度で再現性よくヒトＯＣを測定できるモノクローナル抗体の組み合わせを決定することにより、本発明のヒトＯＣ測定試薬を初めて構築することができた。

本発明の測定試薬は、配列表の配列番号１で表されるヒトＯＣのＮ末端部位と反応し、配列表の配列番号２で表されるウシＯＣのＮ末端部位と反応しないため、配列番号２で表される配列を含むウシＯＣが混入する被験試料、例えばウシ又はウシ胎仔由来の血液、血清、血漿を含む試料であっても、ウシＯＣの影響を受けることなく、配列表の配列番号１で表される配列を含むＯＣ、例えばヒトＯＣを特異的かつ高感度に測定することが可能である。

さらに、Ｇｌａ型ヒトＯＣと反応し、Ｇｌｕ型ヒトＯＣとは反応しない抗ＯＣモノクローナル抗体を含む本発明の測定試薬は、Ｇｌｕ型ヒトＯＣを測りこむことなくＧｌａ型ヒトＯＣ特異的に反応する。ヒトＯＣは骨芽細胞で合成され、細胞内でビタミンＫ依存性カルボキシラーゼによりＧｌａ型ヒトＯＣとなる。このＧｌａ型ヒトＯＣが骨のヒドロキシアパタイトと結合し、骨基質中に蓄積して骨形成が進行するため、Ｇｌａ型ヒトＯＣは骨形成マーカーとして機能する。一方、Ｇｌａ残基を有しないＧｌｕ型ヒトＯＣは、骨基質との親和性が弱く血中に放出されるため、Ｇｌｕ型ヒトＯＣは骨吸収マーカーとして機能する。つまり、本発明の測定試薬により骨形成マーカーであるＧｌａ型ヒトＯＣを特異的かつ高感度に測定することが可能となる。したがって、この態様の測定試薬は、Ｇｌａ型ヒトＯＣとＧｌｕ型ヒトＯＣを、ヒドロキシアパタイトへの吸着などの分画操作により分画せずに測定することが可能な簡便な測定方法を提供する。同様に、本発明の抗ヒトＯＣモノクローナル抗体を、Ｇｌｕ型ヒトＯＣと反応し、Ｇｌａ型ヒトＯＣとは反応しない抗ＯＣモノクローナル抗体と組み合わせることにより、Ｇｌｕ型ヒトＯＣを特異的に測定可能な試薬も提供される。さらに、Ｎ末端を欠損するヒトＯＣとは反応しないため、例えば、血中に存在するＧｌｕ型Ｎ末端欠損ヒトＯＣと全長を有するヒトＯＣを区別して測定できる点で極めて有用である。

本発明の一態様に使用される、Ｇｌａ型ヒトＯＣと反応し、Ｇｌｕ型ヒトＯＣとは反応しない抗ＯＣモノクローナル抗体は、前記の性質を有するものであれば特に限定はないが、例えばハイブリドーマＯＣ ４−３０により産生されるモノクローナル抗体ＯＣ ４−３０が挙げられる（特開平２−２４２６９６号公報）。ハイブリドーマ細胞ＯＣ ４−３０は、平成元年２月２８日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ ＢＰ−２７２５として寄託されている。

本発明の測定試薬は、測定方法として二抗体サンドイッチ法などの固相酵素免疫検定（ＥＬＩＳＡ）法を含むエンザイムイムノアッセイに用いることができる、ヒトＯＣの測定試薬である。一態様として、被験試料は血漿、血清などの体液又は細胞抽出物等の生体由来試料及び細胞の培養上清等の培養細胞由来試料が挙げられる。前記被験試料は、本発明の測定試薬により測定可能な試料であれば特に限定はされないが、例えばヒト由来の試料が挙げられる。

本発明の測定試薬の一態様として、上記（１）に記載する抗ヒトＯＣモノクローナル抗体と、Ｇｌａ型ヒトＯＣと反応しＧｌｕ型ヒトＯＣとは反応しない抗ヒトＯＣモノクローナル抗体の２種のモノクローナル抗体を構成成分とするが、これらの抗体のうち、一方は固相抗体（１次抗体）、他方は標識抗体（２次抗体）として使用することができる。ここで、固相抗体とは適切な不溶性担体に固定化された抗体を意味し、標識抗体とは適切な標識物質により標識化された抗体を意味する。固相抗体はヒトＯＣとの抗原抗体反応によって、対象試料中の被験物質であるヒトＯＣをトラップするために使用され、トラップされた前記の被験物質を検出するために標識抗体が使用される。特に（１）に記載する抗ヒトＯＣモノクローナル抗体を固相抗体、Ｇｌａ型ヒトＯＣと反応しＧｌｕ型ヒトＯＣとは反応しない抗ヒトＯＣモノクローナル抗体を標識抗体とする測定試薬が好適に使用できる。この態様の測定試薬は、ウシＯＣを含む試料であっても、ヒトＯＣを特異的にトラップすることが可能であり、固相抗体がウシＯＣによりマスクされることなく、また、標識抗体の種交差性に影響を受けずにヒトＯＣを特異的に測定することが可能である。

本発明に使用されるモノクローナル抗体は、特に限定されるものではないが、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、タンパク質などを用いて標識化され、標識抗体が作製される。放射性同位元素としては、特に限定されるものではないが、例えば［^１２５Ｉ］、［^１３１Ｉ］、［^３Ｈ］、［^１４Ｃ］などが好ましい。酵素としては、特に限定されるものではないが、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。蛍光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばフルオレスカミン、フルオレッセインイソチオシアネートなどが挙げられる。発光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが挙げられる。さらに、ビオチンのような化合物を用いることができる。本発明の測定試薬において、標識抗体は溶液又は凍結乾燥等の各種形態で提供することができる。

固相抗体は、ビーズ、マイクロタイタープレート、試験管、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等の担体表面に、当業者には公知の方法によって、ヒトＯＣを認識する本発明の測定試薬を結合させることによって調製される。また、固相抗体を調製するための抗体、担体及び固相化に必要な試薬を、固定化する前の段階で提供しても良い。前記目的に使用される抗体も、本発明の固相抗体に含まれる。

本発明の測定試薬の態様としては、ヒトＯＣを認識する本発明のモノクローナル抗体に加えて、様々な試薬、材料、器具等を適宜含有させることができる。本発明の測定試薬を構成するモノクローナル抗体を吸着させるための吸着プレートを含んでいてもよい。また、標識した抗体を検出するための試薬、使用する際にコントロールとなる試薬を含んでいてもよい。

本発明の測定試薬の一態様である実施例２（２）記載の測定試薬は、０．１８７５ｎｇ／ｍＬの微量濃度で存在するヒトＯＣをも検出することが可能である。

（３）本発明のヒトＯＣの測定方法
本発明のヒトＯＣの測定方法は、前記（１）に記載の抗ヒトＯＣモノクローナル抗体又は前記（２）に記載のヒトＯＣ測定試薬を使用することを特徴とする方法である。例えば、本発明のモノクローナル抗体を使用して、競合的免疫検定法によりヒトＯＣを測定することができる。また、２種のモノクローナル抗体を含む態様の本発明の測定試薬を使用して、２つのモノクローナル抗体のうち、一方を固相抗体、他方を標識抗体とする二酵素サンドイッチ法の場合、被験物質と固相抗体を接触させ、これに標識抗体をさらに接触させ、これらのモノクローナル抗体と被験物質の複合体を検出することにより、ヒトＯＣを測定することができる。さらに、被験物質と接触させた後に固相抗体を洗浄する工程及び／又は被験物質と結合しなかった標識抗体を洗浄により除去する工程を含んでいてもよい。また、固相抗体及び標識抗体は、前記（２）に記載の通り固相化及び標識化の操作により調製される。本発明の一態様として、モノクローナル抗体ｈＯＣＮ−Ｃ５７ ５−１２Ｈ ＶＰ２、モノクローナル抗体ＯＣ４−３０の使用が好適であり、さらに、固相抗体としてモノクローナル抗体ｈＯＣＮ−Ｃ５７ ５−１２Ｈ ＶＰ２、標識抗体としてモノクローナル抗体ＯＣ４−３０の組み合わせの測定系が特に好適である。本発明の方法においては、定性的な測定と、定量的な測定が含まれる。一態様として、被験試料は血漿、血清などの体液又は細胞培養物等が挙げられる。

本発明の方法の一態様である実施例２（２）記載の測定方法は、０．１８７５ｎｇ／ｍＬの濃度で存在するヒトＯＣを検出することが可能である。本発明の方法は、ヒトＯＣの異なる部位を認識する２種のモノクローナル抗体を使用することにより、極めて高い特異性を有する識別が可能である。

以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。

実施例１ 抗体の作製
（１）抗原免疫・細胞融合
ヒトＯＣのＮ末端ペプチド（配列番号３のアミノ酸番号１〜６、配列番号１）を調製し、キャリアタンパク質であるＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、ピアス社製）とコンプレックスを形成させて１ｍｇ／ｍＬの抗原溶液とした。この抗原溶液を、それぞれＣ５７ＢＬ６マウス（日本クレア社製）４匹に５０μｇ／ｓｈｏｔ／ｂｏｄｙの投与量で、初回免疫ではフロイント完全アジュバントとエマルジョンを形成させてから腹腔投与し、２回目以降は市販の水溶性アジュバント（ＲＩＢＩ Ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合して、２週間隔合計４回の追加免疫を行った。その後、眼窩静脈血清中のヒトＯＣに対する抗体価の上昇を確認した上で、すべての個体に最終の追加免疫を実施した。この最終免疫３日後に、４匹のうち２個体の免疫動物の脾臓を摘出し、無血清培地で分散・洗浄して脾臓細胞とした後、細胞融合用ミエローマ（Ｐ３Ｕ１）と５：１（脾臓細胞：ミエローマ）の割合で混合し遠心上清を除いた細胞ペレットとした。この細胞混合物に適温に保温した５０％ＰＥＧ溶液１ｍＬを一定速度で、軽い振とうを加えながら混合し、合計３ｍＬまで加え、そのあとは、無血清培地７ｍＬを同様に一定速度で加え、この操作で細胞融合を実施した。約２週間の時差をつけて、残る２匹のマウスも同様の最終追加免疫をさらに１回追加して、３日後に細胞融合に供した。
２回のチャレンジで、多数の融合細胞を取得した。この幅広い母集団より抗原に特異的な抗体をスクリーニングした。

（２）ＨＡＴ選択
融合細胞のスクリーニングには、クローニング培地（三光純薬社製）にＨＡＴ（Ｈ：ヒポキサンチン、Ａ：アミノプテリン、Ｔ：チミジン）を加えたものを用意し、融合日の翌日から３回の培地交換をこのＨＡＴ培地で行った。この培地交換操作で、成長してきた細胞は、脾臓由来のｄｅ ｎｏｖｏ合成系を持ちかつ不死化した融合細胞であった。

（３）スクリーニング
免疫原のヒトＯＣのＮ末端ペプチドのＢＳＡ架橋物を、５μｇ／ｍＬ ＰＢＳ、５０μＬ／ウェルで、イムノプレート（ナルジェヌンク社製）上に添加し、４℃で一晩放置して物理吸着させた。ブランク用抗原として、ウシ骨由来天然型の全長ＯＣをブランク抗原としてスクリーニングの際の評価用のブランク用抗原とし、５μｇ／ｍＬ ＰＢＳ、５０μＬ／ウェルで、同様にコーティングした。翌日、抗原溶液を捨てて、５０％Ｂｌｏｃｋｅｒ Ｃａｓｅｉｎ（ピアス社製）を２００μＬ／ウェルになるように加えて、室温（２０〜３０℃）で１時間放置して、ブロッキング操作を行った。その後、ブロッキング溶液を捨て、上記（２）で得られた融合細胞の培養上清（原液使用）を、ナンバリングした上でイムノプレートに投入し、一次反応を室温（２０〜３０℃）で１時間行った。ＰＢＳで反応が終了した各ウェルを３回洗浄し、ペーパータオルで充分に液を切った。検出には、抗マウスＩｇＧラットモノクローナル抗体カクテル−ペルオキシダーゼ標識抗体を使用した。前記抗体を１μｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェルで添加し、室温（２０〜３０℃）で１時間反応を行った。その後、標識抗体液を捨て、ウェルをＰＢＳで４回洗浄した。ペーパータオルで、洗浄液を充分に除き、ペルオキシダーゼ基質であるＡＢＴＳ［２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）］溶液（ピアス社製）を５０μＬ／ウェルで投入し、室温で１５〜３０分発色させ、等量の１５０ｍＭ シュウ酸を加えて反応を停止させた後、肉眼及びプレートリーダーで、陽性株を確認し、強弱ある陽性株を幅広く厳格に検出した。ブランク抗原に反応せず、目的のヒトＯＣに特異的に反応する株の選抜を試みた。

（４）陽性株選抜とクローニング、株樹立
（３）に示す厳格なスクリーニングの結果、ブランク抗原に反応せず、目的のヒトＯＣに特異的に反応する株は、試験した９６０ウェルに含まれる２０００以上の融合株母集団中わずかに２株と極めて少数であった。この２株を用い、直ちに限界希釈法によりクローニングを行った。クローニングされた抗ヒトＯＣ抗体産生ハイブリドーマ２種類（ｈＯＣＮ−Ｃ５７ ５−１２Ｈ ＶＰ２及びｈＯＣＮ−Ｃ５７ ７−１０Ｅ）について、それぞれクローンを各２種（本株・亜株）確保した。

（５）マウス腹水採取
特異性の高い前記ハイブリドーマクローンは、本株・亜株ともに凍結細胞としてマスター細胞を保管後、ほぼ並行しながら、本株をＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内で大量培養し、腹水として粗精製抗体を得た。腹水は、１個体あたりおよそ３〜５ｍＬであった。

（６）抗体精製
得られた腹水は、５０％飽和硫安塩析・透析を行い、その画分をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ カラムに供した。平衡化緩衝液は、３Ｍ ＮａＣｌ、１．５Ｍ ｇｌｙｃｉｎ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．９）の高塩濃度のものを調製し、どのサブクラスのＩｇＧであっても良好に結合する条件を採用した。平衡化緩衝液で２倍希釈した腹水硫安塩析画分を腹水液量とほぼ等量の容積のＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂にアプライし、波長２８０ｎｍの吸光度がほぼゼロになるまで平衡化緩衝液でカラムを洗った。その後、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）とクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）の２段階で溶出を行った。溶出画分は、ただちに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）で中和し、硫安塩析もしくは、遠心限外ろ過濃縮を行った。最終抗体は、ＰＢＳで透析し、０．２２μｍフィルターろ過により無菌化した。その結果、１株からのみ抗体が得られ、ｈＯＣＮ−Ｃ５７ ５−１２Ｈ ＶＰ２と命名した。目的の抗原認識性を有する抗体の創成に成功した。抗体の純度は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元加熱条件）により分析し、Ｈ鎖とＬ鎖以外のものがない良好な純度の抗体であることを確認した。

実施例２ ヒトＯＣ測定系構築
（１）抗体修飾
抗ＯＣ抗体ＯＣ４−３０（特開平２−２４２６９６号公報、ＦＥＲＭ ＢＰ−２７２５）１ｍｇに、過ヨウ素酸法によるペルオキシダーゼ標識を施した。ＯＣ４−３０抗体はＧｌａ型ヒトＯＣと反応し、Ｇｌｕ型ヒトＯＣとは反応しないモノクローナル抗体である。過ヨウ素酸法は、ペルオキシダーゼの糖鎖ジオールを脱水素酸化させシッフベースを形成させ、抗体側のアミノ基と結合する方法である。同様に、モノクローナル抗体ｈＯＣＮ−Ｃ５７ ５−１２Ｈ ＶＰ２にもペルオキシダーゼ標識を施した。抗原との結合活性を保持した状態で各酵素標識体とすることができた。

（２）ヒトＯＣ測定系
固相に実施例１−（６）で得られた抗体を用い、最も高感度にヒトＯＣを定量できる系を試験した。当初、固相抗体にモノクローナル抗体ＯＣ４−３０、標識抗体にモノクローナル抗体ｈＯＣＮ−Ｃ５７ ５−１２Ｈ ＶＰ２を用いる組み合わせでは、ヒトＯＣの測定感度が低く実用レベルではないことが判明した。しかしながら、固相抗体との反応である第一反応において、ウシＯＣとヒトＯＣを厳密に区別することが特異的かつ高感度な測定に必要であるとの考えに至り、固相抗体にモノクローナル抗体ｈＯＣＮ−Ｃ５７ ５−１２Ｈ ＶＰ２、標識抗体にモノクローナル抗体ＯＣ４−３０を用いる組み合わせで初めて測定系が確立に至った。確立した測定系を使用した測定方法を以下に示す。
（Ａ）イムノプレート器材（ナルジェヌンク製）に、ＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈したモノクローナル抗体ｈＯＣＮ−Ｃ５７ ５−１２Ｈ ＶＰ２溶液を１００μＬ／ウェルで投入し、４℃で一晩放置する。
（Ｂ）翌日、抗体溶液を捨て、２５％ブロックエース＋０．３Ｍマルトース／ＰＢＳ溶液（ブロッキング溶液）を２００μＬ／ウェルで投入し、４℃一晩放置し、前記抗体が結合しなかった部分をタンパク質ブロックする。
翌日、ブロッキング溶液を捨て、以下の測定に使用する。
（Ｃ）各濃度の検体を１００μＬずつマイクロピペットで各ウェルに２連ずつ加え、室温（２０〜３０℃）で１時間反応させる。（第一反応）
（Ｄ）反応液を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、モノクローナル抗体ＯＣ４−３０酵素標識抗体液を１００μＬずつ各ウェルに加え、室温（２０〜３０℃）で一時間反応させる。（第二反応）
（Ｅ）反応液を捨て、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで４回洗浄後、ペルオキシダーゼ基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液（ＢｉｏＦＸ社製）を１００μＬずつ各ウェルに加え、室温（２０〜３０℃）で１５分反応させる。（発色反応）
（Ｆ）１Ｎ 硫酸を１００μＬずつ、ＴＭＢＺ溶液を入れた順番に各ウェルに加え、反応を停止させた後よく混和する。
蒸留水を対照としてマイクロプレートリーダーをブランク補正し、波長４５０ｎｍで吸光度を測定する。
標準曲線を作成し、検体の吸光度から対応するＯＣ濃度を読み取る。

上記測定系により、ヒト骨由来天然型ＯＣをヒトＧｌａ型ヒトＯＣ標準品として測定した結果を表１に示す。必要サンプル量は、１００μｌ／ウェルであり、０．１８７５ｎｇ／ｍＬのＧｌａ型ヒトＯＣであっても検出可能であった。

（３）同時再現性試験
実施例２−（２）記載の測定系により、Ｇｌａ型ヒトＯＣを希釈して作成した３種類の濃度コントロールを用いて同時再現性試験を行った。表２に結果を示すように、ＣＶ値は良好な同時再現性を示した。

（４）日差再現性試験
実施例２−（２）記載の測定系で、三日間にわたり３種類の濃度コントロールを定量して日差再現性試験を行った。表３に結果を示すように、良好な日差再現性を示した。

（５）添加回収試験
実施例２−（２）記載の測定系でＧｌａ型ヒトＯＣの添加回収試験を行った。各種濃度のヒトＯＣ検体２種を等量に混合したサンプルを測定し、実測値からヒトＯＣ量の理論値との差（＝回収率）を求めた。表４に結果を示すように、添加回収率９８％から１１６％（平均値１０３．０７％）と良好な結果が得られた。

（６）交差反応性
実施例２−（２）記載の測定系で交差反応性試験を行った。各種の動物由来のＯＣは、正常動物血清（コスモバイオ社製）をＯＣ含有物とした。これらのＯＣ含有物を、２倍、４倍に希釈して使用した。表５に波長４５０ｎｍの吸光度の測定結果から算出したＧｌａ型ＯＣ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。表５に示すように、Ｇｌａ型ヒトＯＣを高感度かつ特異的に検出可能であることが示された。

実施例３ ヒトＧｌａ型ＯＣの検出
（１）ヒト骨髄細胞の骨芽細胞への分化誘導の検出
ヒト骨肉腫細胞株ＭＧ６３（大日本住友製薬社製）を、１０％ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社製）で培養した。この培地には、１〜５ｎｇ／ｍＬのウシＯＣが含まれる。タカラバイオ社製の骨芽細胞誘導試薬（製品コードＭＫ４３０）を取扱説明書に従い使用した。また、対照として前記骨芽細胞誘導試薬を添加しないものを用意し、同時に５％ＣＯ_２インキュベーター内で３７℃で培養した。培養開始後、経時的に培養上清を採取し、実施例２−（２）記載の測定系によりＧｌａ型ヒトＯＣ濃度を測定した。その波長４５０ｎｍの吸光度の測定結果を表６に示す。表６に示すように、ウシ血清を含む培地による培養上清でも、Ｇｌａ型ヒトＯＣを特異的に測定することができ、骨芽細胞の誘導をモニタリングすることが可能であることが示された。

以上の結果から、本発明のモノクローナル抗体及び測定試薬を使用する検出系は、Ｇｌａ型ヒトＯＣを特異的に高感度で測定し、性能的にも安定な系であることを示している。
当該ヒトＯＣを測定して得られる結果は、骨代謝をモニタリングする上で有用な情報を提供し、病勢判断や薬剤による治療効果判定、これらの予知、診断に有用な情報を提供する。

SEQ ID NO:1: Amino acid sequence of human osteocalcin N-terminus peptide.
SEQ ID NO:2: Amino acid sequence of bovine osteocalcin N-terminus peptide.
SEQ ID NO:3: Amino acid sequence of human osteocalcin.

Claims (8)

1. 配列表の配列番号１で表されるヒトオステオカルシンのＮ末端部位と反応し、配列表の配列番号２で表されるウシオステオカルシンのＮ末端部位と反応しないことを特徴とする抗ヒトオステオカルシンモノクローナル抗体。
2. 抗ヒトオステオカルシンモノクローナル抗体が、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１６５５で表わされるハイブリドーマ細胞より産生され得るモノクローナル抗体ｈＯＣＮ−Ｃ５７ ５−１２Ｈ ＶＰ２である請求項１記載のモノクローナル抗体。
3. 請求項１記載の抗ヒトオステオカルシンモノクローナル抗体を含むヒトオステオカルシン測定試薬。
4. さらにγ−カルボキシグルタミン酸残基を有するヒトオステオカルシンと反応し、当該残基がグルタミン酸残基となっているヒトオステオカルシンとは反応しない抗オステオカルシンモノクローナル抗体を含む請求項３記載のヒトオステオカルシン測定試薬。
5. 請求項１記載の抗ヒトオステオカルシンモノクローナル抗体又は請求項３記載のヒトオステオカルシン測定試薬を使用する被験試料中のヒトオステオカルシンの測定方法。
6. ウシ血清を含有する被験試料中のヒトオステオカルシンを測定する請求項５記載のヒトオステオカルシンの測定方法。
7. 被験試料が、生体由来試料又は培養細胞由来試料から選ばれる請求項５又は６記載の測定方法。
8. 請求項１記載の抗オステオカルシンモノクローナル抗体を産生する、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２１６５５で表されるハイブリドーマ細胞。