JP2003096099A - ヒトｈｍｇ−１に特異的に結合する抗体並びにこの抗体を用いるヒトｈｍｇ−１の免疫学的測定方法及び免疫学的測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ
−２には結合しない抗体、並びにＨＭＧ−２を測り込む
ことがなく、誤差を含まない正確なＨＭＧ−１の測定値
を得ることができ、かつ測定の操作が簡便で、自動化も
可能な、ヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬及び免疫学
的測定方法を提供する。 【解決手段】 ヒト・ハイモビリティーグループプロテ
イン−１には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグル
ーププロテイン−２には結合しない抗体；並びに該抗体
を使用することにより、試料に含まれるヒト・ハイモビ
リティーグループプロテイン−１を抗原抗体反応を利用
して測定するための方法及び試薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、敗血症等の疾患の
マーカーとなりうるヒト・ハイモビリティーグループプ
ロテイン−１に特異的に結合する抗体、並びにこの抗体
を使用するヒト・ハイモビリティーグループプロテイン
−１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法に関する
ものである。

【０００２】本発明は、臨床検査、臨床病理学、免疫学
及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化
学分野等において有用なものである。

【０００３】

【従来の技術】ハイモビリティーグループプロテイン
（Ｈｉｇｈ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｇｒｏｕｐ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ）（以下「ＨＭＧ」と略すことがある。）は、ク
ロマチン構造に含まれる大量の非ヒストンタンパク質と
して１９６４年に発見され、すべての高等動植物に普遍
的に含まれるタンパク質であり、種族間で一次構造の保
存性は極めて高い。また、核内ばかりではなく、細胞質
内にも豊富に存在することが分かっている。生理作用は
はっきりとは分かっていないが、ＨＭＧはＤＮＡと結合
する際に二重螺旋構造を緩めることから、転写反応の際
にＤＮＡの高次構造を最適構造に変化させて転写活性を
高めるという、極めて広範囲の転写促進因子及びヌクレ
オソーム弛緩因子として機能すると考えられている。

【０００４】ＨＭＧには、いくつかの種類が存在する。
例えば、ハイモビリティーグループプロテイン−１（Ｈ
ＭＧ−１）、ハイモビリティーグループプロテイン−２
（ＨＭＧ−２）、ハイモビリティーグループプロテイン
−３（ＨＭＧ−３）、ハイモビリティーグループプロテ
イン−８（ＨＭＧ−８）、ハイモビリティーグループプ
ロテイン−１７（ＨＭＧ−１７）、ハイモビリティーグ
ループプロテイン−Ｉ（ＨＭＧ−Ｉ）、ハイモビリティ
ーグループプロテイン−Ｙ（ＨＭＧ−Ｙ）、ハイモビリ
ティーグループプロテイン−Ｉ（Ｙ）（ＨＭＧ−Ｉ
（Ｙ））、ハイモビリティーグループプロテイン Ｉ−
Ｃ（ＨＭＧ Ｉ−Ｃ）等を挙げることができる。

【０００５】なお、本発明者らが、遺伝情報処理ソフト
ウェア「ＧＥＮＥＴＹＸ」（Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ社）を使用してアミノ酸配列の相同性
の解析を行ったところ、ヒトのＨＭＧ−１に対して、ウ
シのＨＭＧ−１の相同性は９８．６％であり、ブタのＨ
ＭＧ−１の相同性は９９．１％であった。また、同様
に、ヒトのＨＭＧ−１に対して、ヒトのＨＭＧ−２の相
同性は８１．２％であり、ウシのＨＭＧ−２の相同性は
７２．３％であり、ブタのＨＭＧ−２の相同性は７９．
４％であった。

【０００６】ワングらは１９９９年に、ＨＭＧ−１自体
を免疫原として調製したポリクローナル抗体を使用した
ウエスタンブロット法により、初めて血清中（血液中）
のＨＭＧ−１の定量測定を行った。その結果、ワングら
は、ＨＭＧ−１が敗血症のマーカーとなりうることを示
した。そして、敗血症の患者において、生き残る患者
と、死に至る患者を判別することが、精密に血液中のＨ
ＭＧ−１を測定することによって可能であることを示し
た。即ち、ただ単に血液中でのＨＭＧ−１の存在を確認
するだけではなく、精密に定量することの有用性が明ら
かにされた（Ｈ．Ｗａｎｇら，ＳＣＩＥＮＣＥ，２８５
巻，９号，２４８〜２５１頁，１９９９年発行）。

【０００７】なお、先に、ＨＭＧ−１の測定に用いる抗
体、即ちＨＭＧ−１に結合する抗体については、パーキ
ネンらや、レップらによって調製可能なことが示されて
いた（Ｊ．Ｐａｒｋｋｉｎｅｎら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，２６８巻，２６号，１９７２６〜１９７３８頁，１
９９３年発行；Ｗ．Ａ．Ｌｅｐｐら，Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，１０巻，４号，４４９
〜４６５頁，１９８９年発行）。この抗体を用いてレッ
プらはＨＭＧ−１に関して固相酵素免疫測定法（Ｓｏｌ
ｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓ
ａｙ）が可能であることを述べている。（なお、この固
相酵素免疫測定法は、精製したＨＭＧ−１をマイクロプ
レート（マイクロタイタープレート）のウェルに固相化
し、これに酵素標識したＨＭＧ−１に結合する抗体を接
触させ、作用させて、ＨＭＧ−１に結合する抗体が精製
したＨＭＧ−１に結合することを確かめたものであ
る。）しかしながら、これらの抗体は、ＨＭＧ−１自体
を免疫原として調製したポリクローナル抗体であるの
で、そのアミノ酸配列がＨＭＧ−１と相同性の高い(８
１．２％)、ＨＭＧ−２にも結合してしまうものであっ
た。

【０００８】即ち、レップら又はワングらが示したＨＭ
Ｇ−１の測定方法は、ＨＭＧ−１だけではなく、ＨＭＧ
−２をも測り込んでしまう測定方法であった。

【０００９】また、ルーヒアイネンらは２０００年に、
遺伝子工学によって組換えＤＮＡより調製したラットの
ＨＭＧ−１自体を免疫原として調製したポリクローナル
抗体と、ＨＭＧ−１のアミノ酸配列の一部「Lys Phe Ly
s Asp Pro Asn Ala Pro LysArg Pro Pro Ser Ala」より
なるペプチドを免疫原として調製したポリクローナル抗
体を各々使用して、ＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法によ
り、ヒト血液中のＨＭＧ−１を測定した（Ａ．Ｒｏｕｈ
ｉａｉｎｅｎら，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ，８４
巻，１０８７〜１０９４頁，２０００年発行）。

【００１０】しかしながら、ここで使用されたラットの
ＨＭＧ−１自体を免疫原として調製したポリクローナル
抗体は、前記した理由により、ＨＭＧ−１だけではな
く、ＨＭＧ−２にも結合してしまうものであった。

【００１１】また、ＨＭＧ−１のアミノ酸配列の一部
「Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala ProLys Arg Pro Pro S
er Ala」よりなるペプチドを免疫原として調製したポリ
クローナル抗体は、免疫原とした前記のペプチドのアミ
ノ酸配列が、ＨＭＧ−２のアミノ酸配列の一部を含むこ
と、及びポリクローナル抗体であることより、やはりＨ
ＭＧ−１だけではなく、ＨＭＧ−２にも結合してしまう
ものであった。

【００１２】よって、ルーヒアイネンらが開示した測定
方法は、これも、ＨＭＧ−１だけではなく、ＨＭＧ−２
をも測り込んでしまう測定方法であった。

【００１３】従って、今までは、ＨＭＧ−１には結合す
るが、ＨＭＧ−２には結合しない抗体は、知られておら
ず存在しなかった。

【００１４】それゆえ、前記のワングらのウエスタンブ
ロット法での測定方法以外に、ＨＭＧ−２を測り込むこ
となしにＨＭＧ−１のみを測ることができる測定方法は
存在しなかった。（なお、このウエスタンブロット法
は、ＨＭＧ−１、ＨＭＧ−２等を電気泳動し、この担体
又はこれを転写した担体に、抗体を接触させ、結合させ
て、ＨＭＧ−１、ＨＭＧ−２と抗体との結合を確かめる
ものである。よって、ＨＭＧ−１とＨＭＧ−２の泳動位
置（分子量の違いによる易動度）は異なるので、ＨＭＧ
−１、ＨＭＧ−２を分別することができる。）

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】前述したように、ＨＭ
Ｇ−１には結合するが、ＨＭＧ−２には結合しない抗体
は、知られておらず存在しなかった。このため、前記の
ワングらのウエスタンブロット法での方法を除くと、敗
血症等の疾患のマーカーとなりうるＨＭＧ−１だけを測
ることができ、ＨＭＧ−２を測り込むことのない免疫学
的測定方法、免疫学的測定試薬は存在しなかった。即
ち、ウエスタンブロット法以外の免疫学的測定方法、免
疫学的測定試薬では、試料中のＨＭＧ−１を測定しよう
としても、試料中に含まれるＨＭＧ−２をも測り込んで
しまい、そのため正の誤差を含んだＨＭＧ−１の測定値
が得られてしまう。このＨＭＧ−２をも測り込んでしま
い、正の誤差を含んだＨＭＧ−１の測定値は、敗血症等
の疾患の診断を誤らせる可能性のあるものであった。

【００１６】なお、ウエスタンブロット法は、操作が繁
雑であり、手技に熟練を要する測定方法であるので、実
施することができる測定者、測定施設は限られたもので
ある。そして、ウエスタンブロット法は、その測定の自
動化が困難なものである。

【００１７】従って、ＨＭＧ−２を測り込むことなく、
ＨＭＧ−１のみを正確に測定することができる測定方
法、測定試薬であって、かつ、操作が簡便であり、又は
自動化が可能な測定方法、測定試薬が求められていた。

【００１８】これに対して、本発明の第一の課題は、ヒ
トＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合
しない抗体を提供することである。

【００１９】また、本発明の第二の課題は、ＨＭＧ−２
を測り込むことがなく、誤差を含まない正確なＨＭＧ−
１の測定値を得ることができ、かつ測定の操作が簡便
で、自動化も可能な、ヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試
薬を提供することである。

【００２０】そして、本発明の第三の課題は、ＨＭＧ−
２を測り込むことがなく、誤差を含まない正確なＨＭＧ
−１の測定値を得ることができ、かつ操作が簡便で、自
動化も可能な、ヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定方法を提
供することである。

【００２１】

【課題を解決するための手段】本発明は、以下の発明を
包含する。 （１）ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−１
には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロ
テイン−２には結合しない抗体。 （２）次式（Ｉ）： Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys （Ｉ） で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原とし
て調製される前記（１）に記載の抗体。 （３）下記の及びの特徴： 次式（Ｉ）： Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys （Ｉ） で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基
の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施すこと
により得られるアミノ酸配列からなる、 当該ペプチドを免疫原として抗体を調製した時に、ヒ
ト・ハイモビリティーグループプロテイン−１には結合
するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−
２には結合しない抗体を得ることができる、を有するペ
プチドを免疫原として調製される前記（１）に記載の抗
体。 （４）下記の及びの特徴： 次式（Ｉ）： Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys （Ｉ） で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基
の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施すこと
により得られるアミノ酸配列からなる、 前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチ
ドを免疫原として調製された抗体と結合することができ
る、を有するペプチドを免疫原として調製される前記
（１）に記載の抗体。 （５）モノクローナル抗体である前記（１）〜（４）の
いずれかに記載の抗体。 （６）試料に含まれるヒト・ハイモビリティーグループ
プロテイン−１を抗原抗体反応を利用して測定を行う免
疫学的測定方法において、前記（１）〜（５）のいずれ
かに記載の抗体を使用することを特徴とする免疫学的測
定方法。 （７）試料に含まれるヒト・ハイモビリティーグループ
プロテイン−１を抗原抗体反応を利用して測定を行うた
めの免疫学的測定試薬において、前記（１）〜（５）の
いずれかに記載の抗体を含むことを特徴とする免疫学的
測定試薬。

【００２２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。 １．ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２に
は結合しない抗体 （１）総論 本発明の、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン
−１（ヒトＨＭＧ−１）には結合するが、ヒト・ハイモ
ビリティーグループプロテイン−２（ヒトＨＭＧ−２）
には結合しない抗体（以下「本発明の抗体」ということ
がある。）は、ヒトＨＭＧ−１に結合し、かつヒトＨＭ
Ｇ−２に結合しない抗体であれば、いかなるものでもよ
い。

【００２３】本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、ポ
リクローナル抗体よりなる抗血清又はモノクローナル抗
体のいずれのタイプのものをも含み、また、これらの抗
体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂又はＦａ
ｂ’等）をも含むものである。なお、本発明の抗体は、
モノクローナル抗体であることが、その調製操作におい
て吸収操作などを省略できること等から好ましい。

【００２４】本発明の抗体を取得する方法は、特に限定
されないものの、下記の方法等が挙げられる。 ＨＭＧ−１のアミノ酸配列とＨＭＧ−２のアミノ酸配
列を比較対照して、ＨＭＧ−１とＨＭＧ−２との間で相
同性の低いＨＭＧ−１のアミノ酸配列を選択する。次
に、このアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を
調製、取得し、これを免疫原として動物に免疫し、産生
された抗体を取得する。そして、ヒトＨＭＧ−１に結合
し、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体であることを確
認するか、又はそのような抗体を選択して、本発明の抗
体を取得する。

【００２５】なお、前記アミノ酸配列は、親水性が高い
部分のものであることが好ましい。それは、親水性が高
い程、そのアミノ酸配列がＨＭＧ−１分子の表面に存在
する可能性が高いので、これを免疫原として産生された
抗体がＨＭＧ−１に結合できる可能性も高いからであ
る。

【００２６】ＨＭＧ−１のアミノ酸配列の全部又は一
部を含むペプチド又はタンパク質を調製、取得し、これ
を免疫原として動物に免疫し、産生された抗体を取得す
る。固相に固定化したＨＭＧ−２と前記産生された抗体
を含む溶液を接触させ、ＨＭＧ−２に結合する抗体を、
固定化されたＨＭＧ−２を介して固相に結合させる。次
に、前記担体と前記溶液を分離することにより、溶液中
からＨＭＧ−２に結合する抗体を除去して、ヒトＨＭＧ
−１に結合し、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体を取
得する。

【００２７】ＨＭＧ−１のアミノ酸配列とＨＭＧ−２
のアミノ酸配列を比較対照して、ＨＭＧ−１とＨＭＧ−
２との間で相同性の低いＨＭＧ−１のアミノ酸配列を選
択する。次に、このアミノ酸配列を含むペプチド又はタ
ンパク質を調製、取得し、これを免疫原として動物に免
疫し、産生された抗体を取得する。固相に固定化したＨ
ＭＧ−２と前記産生された抗体を含む溶液を接触させ、
ＨＭＧ−２に結合する抗体を、固定化されたＨＭＧ−２
を介して固相に結合させる。次に、前記担体と前記溶液
を分離することにより、溶液中からＨＭＧ−２に結合す
る抗体を除去して、ヒトＨＭＧ−１に結合し、ヒトＨＭ
Ｇ−２には結合しない抗体を取得する。

【００２８】なお、この場合も、前記アミノ酸配列は、
親水性が高い部分のものであることが好ましい。それ
は、親水性が高い程、そのアミノ酸配列がＨＭＧ−１分
子の表面に存在する可能性が高いので、これを免疫原と
して産生された抗体がＨＭＧ−１に結合できる可能性も
高いからである。

【００２９】前記の方法は、モノクローナル抗体の取
得において適した方法であり、前記及びの方法はポ
リクローナル抗体又は抗血清の取得において適した方法
である。そして、前記の方法に比べて前記の方法の
方が操作がより繁雑であり、また、前記の方法に比べ
て前記の方法の方が操作がより繁雑であるので、操作
の面からは前記の方法がより好ましい。

【００３０】（２）免疫原 本発明の抗体を産生させるための免疫原について、以下
説明を行う。前記した通り、本発明の抗体を産生させる
ための免疫原として、ＨＭＧ−１のアミノ酸配列の全部
又は一部を含むペプチド又はタンパク質、あるいはＨＭ
Ｇ−１とＨＭＧ−２との間で相同性の低いＨＭＧ−１の
アミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等を用いる
ことができる。

【００３１】なお、前記アミノ酸配列は、親水性が高い
部分のものであることが好ましい。それは、親水性が高
い程、そのアミノ酸配列がＨＭＧ−１分子の表面に存在
する可能性が高いので、これを免疫原として産生された
抗体がＨＭＧ−１に結合できる可能性も高いからであ
る。

【００３２】このアミノ酸配列の各アミノ酸残基の親水
性の高さの推定は、ホップらの方法（Ｔ．Ｐ．Ｈｏｐｐ
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．，７８巻，３８２４〜３８２８頁，１９８１年発
行）又はパーカーらの方法（Ｐａｒｋｅｒら，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５巻，５４２５〜５４３２頁，１
９８６年発行）等により行うことができる。

【００３３】本発明者らは、ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸
配列（Ｌ．Ｗｅｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，１７巻，１１９７〜１２１４頁，１９８９年発
行）の全てについて、前記のホップらの方法により、各
アミノ酸残基の親水性の高さの推定を行った。この結果
を図１に示した。

【００３４】この図において、横軸はヒトＨＭＧ−１の
各アミノ酸残基のＮ末端からの順番を示している。ま
た、縦軸は値がプラス側に大きい程、疎水性が高いこと
を示し、逆に値がマイナス側に大きい程、親水性が高い
ことを示す。

【００３５】次に、本発明者らは、このヒトＨＭＧ−１
のアミノ酸配列のうち親水性の高い配列をヒトＨＭＧ−
２のアミノ酸配列（Ｍ．Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７巻，６６４１〜６６４５頁，１
９９２年発行）と比較した。そして、この親水性の高い
アミノ酸配列の中から、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−
２との間で相同性の低いヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列
を選択した。

【００３６】この本発明者らが選択したアミノ酸配列
は、ヒトＨＭＧ−１のＮ末端のアミノ酸残基（グリシ
ン）より１１番目のアミノ酸残基（リシン）までの、
「Gly LysGly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」であ
る。

【００３７】後述するように、このアミノ酸配列「Gly
Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro ArgGly Lys」よりなるペ
プチドを免疫原として調製された抗体は、ヒトＨＭＧ−
１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体
（本発明の抗体）である。

【００３８】この「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro
Arg Gly Lys」で表されるアミノ酸配列からなるペプチ
ドを免疫原として調製することにより、本発明の抗体を
取得することができるのであるが、本発明の抗体を産生
させるための免疫原としては、「Gly Lys Gly Asp Pro
Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるアミノ酸配列に
１ないし数個（通常１〜８個、好ましくは１〜６個）の
アミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修
飾を施すことにより得られるアミノ酸配列からなるペプ
チドであってもよい。

【００３９】なお、ヒトＨＭＧ−１の前記アミノ酸配列
に相当するヒトＨＭＧ−２のアミノ酸配列は「Gly Lys
Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys」であり、これ
はＮ末端から６番目のアミノ酸残基が「Lys」（ＨＭＧ
−１）から「Asn」（ＨＭＧ−２）に入れ替わっただけ
のものであり、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の前記
アミノ酸配列における違いはこの箇所だけであるので、
ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結
合しない抗体（本発明の抗体）の免疫原のうち、前記ア
ミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gl
y Lys」に由来する免疫原のアミノ酸配列としては、こ
のヒトＨＭＧ−１のＮ末端から６番目のアミノ酸残基
「Lys」を含むことが必須であると考える。

【００４０】そして、抗体は、３個のアミノ酸からなる
アミノ酸配列を認識できるとの報告（Ｆ．Ｈｕｄｅｃｚ
ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４７巻，
２０１〜２１０頁，１９９２年発行）があるので、本発
明の抗体の免疫原のうち、前記アミノ酸配列に由来する
免疫原の最小単位としては、「Pro Lys Lys」、「AspPr
o Lys」又は「Lys Lys Pro」を規定（考える）すること
ができる。そして更に、これらのトリペプチドに他のア
ミノ酸、又はペプチドが付加したものを、本発明の抗体
の免疫原として考えることができる。

【００４１】なお、前記の本発明の抗体を産生させるた
めの免疫原としての、「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys
Pro Arg Gly Lys」で表されるアミノ酸配列に１ないし
数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付加、
又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列からな
るペプチドは、以下のいずれかの条件を満たすものであ
る。 （Ａ）当該ペプチドを免疫原として抗体を調製した時
に、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２に
は結合しない抗体を得ることができるペプチド、又は、
（Ｂ）「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Ly
s」で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原
として調製された抗体と結合することができるペプチ
ド。

【００４２】なお、前記（１）のの方法に従う場合、
ＨＭＧ−１のアミノ酸配列の全部又は一部を含むペプチ
ド又はタンパク質を調製、取得し、これを免疫原とする
こともできる。

【００４３】前記の免疫原としての、「Gly Lys Gly As
p Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるアミノ酸
配列からなるペプチド、「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Ly
s Pro Arg Gly Lys」で表されるアミノ酸配列に１ない
し数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入もしくは付
加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列か
らなるペプチド、又はＨＭＧ−１のアミノ酸配列の全部
又は一部を含むペプチド又はタンパク質は、ヒト又は他
の動物の体液、細胞、組織もしくは臓器等より、公知の
方法等により抽出、精製し、取得することができる。

【００４４】なお、ＨＭＧ−１又はＨＭＧ−２のヒト胸
腺、ブタ胸腺、ウシ胸腺、ヒト胎盤、好中球、ＨＬ−６
０細胞株等からの取得の方法は、以下の文献等に記載さ
れている（Ｈ．Ｇｏｏｄｗｉｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａ ＢｉｏｐｈｉｓｉｃａＡｃｔａ，４０５巻，２８０
〜２９１頁，１９７５年発行；Ｍ．Ｙｏｓｈｉｄａら，
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９５巻，１１７〜１２４頁，１
９８０年発行；Ｙ．Ａｄａｃｈｉら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒ，５３０巻，３９〜４６巻，１９９２年発
行）。

【００４５】そして、ウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−
２の混合物が、和光純薬工業社より販売されているの
で、これよりウシＨＭＧ−１のみを精製し取得すること
もできる。

【００４６】また、前記の各々の免疫原は、液相法及び
固相法等のペプチド合成の方法により合成することがで
き、更にペプチド自動合成装置を用いてもよく、日本生
化学会編「生化学実験講座１ タンパク質の化学IV」，
東京化学同人，１９７５年、泉屋ら「ペプチド合成の基
礎と実験」，丸善，１９８５年、日本生化学会編「続生
化学実験講座２ タンパク質の化学 下」，東京化学同
人，１９８７年等に記載された方法に従い合成すること
ができ、前記のアミノ酸配列に、欠失、置換、挿入又は
付加を施した変異体を作製することも容易である。ま
た、非天然型アミノ酸の導入、各アミノ酸残基の化学修
飾やシステイン残基を導入することにより分子内を環化
させて構造を安定化させる等の修飾を施してもよい。

【００４７】更に、前記の各々の免疫原は、対応する核
酸塩基配列を持つＤＮＡ又はＲＮＡより遺伝子工学技術
を用いて調製してもよく、日本生化学会編「続生化学実
験講座１ 遺伝子研究法Ｉ」，東京化学同人，１９８６
年、日本生化学会編「続生化学講座１ 遺伝子研究法I
I」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続
生化学実験講座１ 遺伝子研究法III」，東京化学同人，
１９８７年等を参照して調製すればよい。

【００４８】ところで、免疫原が低分子物質の場合に
は、免疫原に担体を結合させたものを動物等に免疫する
のが一般的ではあるが、アミノ酸数５のペプチドを免疫
原としてこれに対する特異抗体を産生させたとの報告
（木山ら，「日本薬学会第１１２回年会講演要旨集
３」，１２２頁，１９９２年発行）もあるので、担体を
使用することは必須ではない。

【００４９】なお、抗体を産生させる際に担体を使用す
る場合の担体としては、スカシガイのヘモシアニン（Ｋ
ＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アル
ブミン（ＨＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ
−リシン、ポリアラニルリシン、ジパルミチルリシン、
破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なもの
を用いることができる。

【００５０】免疫原と担体の結合法は、グルタルアルデ
ヒド法、1−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒ
ドロキシサクシニミドエステル法、ビスジアゾ化ペンジ
ジン法又はＮ−サクシミジル−３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオン酸法等の公知の結合法を用いることがで
きる。また、ニトロセルロース粒子、ポリビニルピロリ
ドン又はリポソーム等の担体に免疫原を吸着させたもの
を免疫原とすることもできる。

【００５１】（３）抗体の取得方法 ポリクローナル抗体、抗血清 本発明の抗体において、ポリクローナル抗体又は抗血清
は、以下の操作により取得することができる。

【００５２】まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と
担体の結合物を哺乳動物(マウス、ウサギ、ラット、ヒ
ツジ、ヤギ、ウマ等)又は鳥類(ニワトリ等)等に免疫す
る。この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合
物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により
決められるものであるが、マウスの場合には約５〜１０
週齢のマウス一匹当り一回につき０．１μｇ〜数ｍｇ、
好ましくは５０μｇ〜１ｍｇの前記免疫原、又は前記免
疫原と担体の結合物を免疫注射する。また、ウサギの場
合はウサギ一匹当り一回につき１０μｇ〜数十ｍｇの前
記免疫原、又は前記免疫原と担体の結合物を免疫注射す
る。

【００５３】なお、この前記の免疫原、又は前記の免疫
原と担体の結合物は、アジュバントと添加混合して免疫
注射することが好ましい。アジュバントとしては、フロ
イント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバン
ト、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジ
ュバント等の公知のものを用いることができる。

【００５４】免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背
部等の部位に行えばよい。初回免疫後、２〜３週間間隔
で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免
疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射
する。この場合も、前記の免疫原、又は前記の免疫原と
担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫
注射することが好ましい。

【００５５】初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価
の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価が
プラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して本発
明の抗体を含む抗血清を得る。

【００５６】この抗血清を、硫酸アンモニウム、硫酸ナ
トリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィー
等の方法、あるいはこれらの方法を組み合わせて抗体の
精製を行い、ポリクローナル抗体を得る。

【００５７】ここで得られたポリクローナル抗体は、Ｈ
ＭＧ−１には結合するが、ＨＭＧ−２には結合しないポ
リクローナル抗体と、ＨＭＧ−１及びＨＭＧ−２のいず
れにも結合するポリクローナル抗体の両方よりなるもの
であるので、更に、これをＨＭＧ−２をリガンドとして
固相に固定化したアフィニティークロマトグラフィーの
カラムに通し接触させる。ＨＭＧ−１及びＨＭＧ−２の
いずれにも結合するポリクローナル抗体は、このカラム
のリガンド（ＨＭＧ−２）を介して固相に結合し、捕集
される。これに対して、ＨＭＧ−１には結合するが、Ｈ
ＭＧ−２には結合しないポリクローナル抗体は、このカ
ラムのリガンド（ＨＭＧ−２）に結合することなく、こ
のカラムを素通りするので、素通りした画分を得ること
により、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−
２には結合しないポリクローナル抗体を取得することが
できる。

【００５８】なお、免疫原と担体の結合物を用いて動物
等に免疫した場合には、得られた抗血清又はポリクロー
ナル抗体中に、この担体に対する抗体が存在するので、
このような担体に対する抗体の除去処理を行うことが好
ましい。この除去処理方法としては、担体を、得られた
ポリクローナル抗体又は抗血清の溶液中に添加して生成
した凝集物を取り除くか、担体を不溶化固相に固定化し
てアフィニティークロマトグラフィーにより除去する方
法等を用いることができる。

【００５９】モノクローナル抗体 本発明の抗体において、モノクローナル抗体は、以下の
操作により取得することができる。モノクローナル抗体
は、ケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎ
ａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁，１９７５年
発行）によるハイブリドーマ、又はエプスタン−バーウ
イルス等のウイルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞
により得ることができる。

【００６０】細胞融合法によるモノクローナル抗体の調
製は、以下の操作により行うことができる。まず、前記
の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を、哺乳動
物（マウス、ヌードマウス、ラットなど、例えば近交系
マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥類（ニワトリなど）等に
免疫する。この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体
の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等
により適宜決められるものであるが、例えば、マウスの
場合には一匹当り一回につき０．１μｇ〜５ｍｇの前記
の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫注射
するのが好ましい。

【００６１】なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と
担体の結合物は、アジュバントを添加混合して免疫注射
することが好ましい。アジュバントとしては、フロイン
ト完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、
水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバ
ント等の公知なものを用いることができる。

【００６２】免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背
部等の部位に行えばよい。初回免疫後、１〜２週間間隔
で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免
疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射
する。この追加免疫注射の回数としては２〜６回が一般
的である。この場合も前記の免疫原、又は前記の免疫原
と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免
疫注射することが好ましい。

【００６３】初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価
の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価が
プラトーに達したら、前記の免疫原、又は前記の免疫原
と担体の結合物を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム
水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、
最終免疫とする。この最終免疫の３〜５日後に、免疫動
物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産
生能を有する細胞を取得する。

【００６４】この免疫動物より得られた抗体産生能を有
する細胞と哺乳動物等（マウス、ヌードマウス、ラット
など）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合さ
せるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチ
ン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ
（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素
を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ
／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−
Ｘ６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク（Ｊ
ＣＲＢ）９０８５）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１株
（ＪＣＲＢ ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５
３株（ＪＣＲＢ ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１
４株（ＪＣＲＢ ００２９）等を用いることができる。

【００６５】細胞融合は、各種分子量のポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）、リポソームもしくはセンダイウイ
ルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電
気融合法により行うことができる。

【００６６】ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴ
Ｋ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミ
ノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）
を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエロ
ーマ細胞の融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に
培養し、増殖させることができる。

【００６７】このようにして得られたハイブリドーマの
培養上清を、前記の免疫原、前記の免疫原と担体の結合
物、又はヒトＨＭＧ−１等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエ
スタンブロット法等の免疫学的測定法により測定するこ
とにより、ヒトＨＭＧ−１等に結合する抗体を産生する
ハイブリドーマを選択することができる。

【００６８】また、前記のハイブリドーマの培養上清
を、ヒトＨＭＧ−２等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタ
ンブロット法等の免疫学的測定法により測定することに
より、ヒトＨＭＧ−２等には結合しない抗体を産生する
ハイブリドーマを選択することができる。

【００６９】この２種類のハイブリドーマ選択方法と限
界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて
行うことにより、本発明の抗体（モノクローナル抗
体）、即ちヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ
−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）の産生
細胞株を単離して得ることができる。

【００７０】このモノクローナル抗体産生細胞株を適当
な培地で培養して、その培養上清から本発明の抗体（モ
ノクローナル抗体）を得ることができるが、培地として
は無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、こ
の場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥ
Ｍ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等
の培地を用いることができる。

【００７１】また、モノクローナル抗体産生細胞株を、
これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した
哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたま
った腹水より本発明の抗体（モノクローナル抗体）を得
ることもできる。

【００７２】このようにして得られたモノクローナル抗
体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩
析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又は
アフィニティークロマトグラフィーなどの方法、あるい
はこれらの方法を組み合わせること等により、精製され
た本発明の抗体（モノクローナル抗体）を得ることがで
きる。

【００７３】２．ヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定方法 （１）総論 本発明のヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定方法（以下「本
発明の免疫学的測定方法」又は「本発明の測定方法」と
いうことがある。）は、試料に含まれるヒトＨＭＧ−１
を抗原抗体反応を利用して測定を行う免疫学的測定方法
において、「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭ
Ｇ−２には結合しない抗体」を使用することを特徴とす
るものである。

【００７４】即ち、ヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定方法
において、測定対象物質であるヒトＨＭＧ−１に結合す
る抗体として、「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒト
ＨＭＧ−２には結合しない抗体」を使用することを特徴
とする測定方法である。これにより、本発明の測定方法
では、ＨＭＧ−２を測り込むことがなく、誤差を含まな
い正確なＨＭＧ−１の測定値を得ることができるのであ
る。

【００７５】この「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒ
トＨＭＧ−２には結合しない抗体」は、このような性質
を有するものであれば特に制限なく使用することがで
き、前記の効果を得ることができる。

【００７６】なお、ヒトＨＭＧ−１に結合する抗体とし
て２つの抗体を使用する免疫学的測定法においては、そ
の２つの抗体のうち少なくとも１つが、この「ヒトＨＭ
Ｇ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない
抗体」であればよい。そして、他方は「ヒトＨＭＧ−１
に結合する抗体」であれば如何なるものでもよい。ま
た、両方の抗体とも、この「ヒトＨＭＧ−１には結合す
るが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」であっても
よい。

【００７７】例えば、ＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法に
おいては、酵素標識抗体及び固相化抗体のいずれか一方
又は両方が、この「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒ
トＨＭＧ−２には結合しない抗体」であればよい。

【００７８】この「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒ
トＨＭＧ−２には結合しない抗体」は、１種類のものだ
けではなく、複数種類のものを同時に使用してもよい。
なお、この「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭ
Ｇ−２には結合しない抗体」の詳細については、前記の
「１．ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２
には結合しない抗体」の項に記載したとおりである。

【００７９】（２）免疫学的測定方法 本発明の測定方法は、試料に含まれるヒトＨＭＧ−１を
抗原抗体反応を利用して測定を行う免疫学的測定方法に
おいて、測定対象物質であるヒトＨＭＧ−１に結合する
抗体として、「ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨ
ＭＧ−２には結合しない抗体」を使用するものであれ
ば、特にその測定原理は限定されるものではなく、所期
の効果を奏するものである。

【００８０】この免疫学的測定方法としては、例えば、
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定
法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測
定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロ
マトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラ
テックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集
反応法、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０
−１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質
（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これ
で被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検
物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用い
る測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ
法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｌｉｇａｎｄｓｏｒ
ｂｅｎｔＡｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓ
ｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年発行；Ｗ
Ｏ９８／２３９６３）等を挙げることができる。

【００８１】そして、前記の免疫学的測定方法において
は、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニア
ス系法）等のいずれの手法においても、本発明の測定方
法を適用することができる。また、本発明の測定方法に
おける測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析
装置等の装置を用いて行ってもよい。

【００８２】（３）測定試料 本発明の測定方法における試料としては、血液、血清、
血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水もしくは羊
水などの体液；大便；血管もしくは肝臓などの臓器；組
織；細胞；又は大便、臓器、組織もしくは細胞などの抽
出液等、ＨＭＧ−１が含まれる可能性のある生体試料で
あれば対象となる。

【００８３】（４）標識抗体を用いた免疫学的測定方法 本発明の測定方法を酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、
放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用い
た免疫学的測定方法により実施する場合には、サンドイ
ッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンド
イッチ法により実施する時には、固相化抗体及び標識抗
体のいずれか一方の抗体が「ヒトＨＭＧ−１には結合す
るが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体」であればよ
く、また固相化抗体及び標識抗体の両方が「ヒトＨＭＧ
−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗
体」であってもよい。

【００８４】前記測定方法に用いる固相担体としては、
ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエ
ン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、
ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、
ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セル
ロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又
は磁性体等の材質よりなるマイクロカプセル、ビーズ、
マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験
管、スティック又は試験片等の形状の固相担体を用いる
ことができる。

【００８５】固相化抗体は、本発明の抗体等の抗体と固
相担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併
用等の公知の方法により吸着、結合させて調製すること
ができる。

【００８６】物理的吸着法による場合は、公知の方法に
従い、抗体と固相担体を緩衝液などの溶液中で混合し接
触させたり、又は緩衝液などに溶解した抗体と固相担体
を接触させること等により行うことができる。また、化
学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨
床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノ
アッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３
年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパ
ク質IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公
知の方法に従い、抗体と固相担体をグルタルアルデヒ
ド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等
の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と固相担体
のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、
アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行
うことができる。

【００８７】また、更に非特異的反応や固相担体の自然
凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗体
を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アル
ブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又
は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法
により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキ
ング処理）を行ってもよい。

【００８８】標識物質としては、酵素免疫測定法の場合
には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファ
ターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアー
ゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素
酵素又はアミラーゼ等を用いることができる。また、蛍
光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシア
ネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、
置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリア
ジンイソチオシアネート等を用いることができる。そし
て、放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素１
２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。また、
発光免疫測定法においては、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ₂−ル
シフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、
アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等
を用いることができる。

【００８９】本発明の抗体等の抗体と酵素等の標識物質
との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊
特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術
と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生
化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質IV」，東京
化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従
い、抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイ
ミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋
試薬と混合、接触させ、抗体と標識物質のそれぞれのア
ミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又
は水酸基等と反応させることにより結合を行うことがで
きる。

【００９０】測定の操作法は公知の方法等（日本臨床病
理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査の
ためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行
会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定
法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら
編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１ 酵素免疫測定
法」，共立出版，１９８７年発行）により行うことがで
きる。

【００９１】例えば、固相化抗体と試料を反応させ、同
時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体
を反応させることにより、「固相担体＝固相化抗体＝ヒ
トＨＭＧ−１＝標識抗体」の複合体を形成させる。そし
て、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相化抗体＝
ヒトＨＭＧ−１」を介して固相担体に結合した標識抗体
の量又は未結合の標識抗体の量より試料中に含まれてい
たＨＭＧ−１の量（濃度）のみを測定することができ
る。

【００９２】具体的には、酵素免疫測定法の場合は、抗
体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応さ
せ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定
する。また、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識に
よる蛍光強度を、放射免疫測定法の場合には放射性物質
標識による放射線量を測定する。そして、発光免疫測定
法の場合は発光反応系による発光量を測定する。

【００９３】（５）凝集反応法による免疫学的測定方法 本発明の測定方法を、免疫比濁法、ラテックス比濁法、
ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集
反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散
乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定
法により実施する場合には、溶媒としてリン酸緩衝液、
グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用
いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応
促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。

【００９４】本発明の抗体等の抗体を固相担体に感作さ
せて用いる場合には、固相担体としては、ポリスチレ
ン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリ
ロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニ
ル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリ
ル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリ
ル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル
酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリ
ル酸重合体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチ
ン、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、シリカ、
アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラ
ミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用するこ
とができる。

【００９５】本発明の抗体等の抗体を固相担体に感作さ
せる方法としては、物理的吸着法、化学的結合法又はこ
れらの併用等の公知の方法により行うことができる。

【００９６】物理的吸着法による場合は、公知の方法に
従い、抗体と固相担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触
させたり、又は緩衝液等に溶解した抗体と固相担体を接
触させること等により行うことができる。また、化学的
結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病
理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッ
セイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発
行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質
IV」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の
方法に従い、抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カ
ルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価
性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と固相担体のそれ
ぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデ
ヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うこと
ができる。

【００９７】また、更に非特異的反応や固相担体の自然
凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗体
を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アル
ブミンもしくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又
は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法
により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキ
ング処理）を行ってもよい。

【００９８】なお、ラテックス比濁法を測定原理とする
場合、固相担体として用いるラテックス粒子の粒径につ
いては、特に制限はないものの、ラテックス粒子が測定
対象物質（ＨＭＧ−１）を介して結合し、凝集塊を生成
する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の
理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、
０．０４〜１μｍであることが好ましい。

【００９９】また、ラテックス比濁法を測定原理とする
場合、本発明の抗体を固相化させたラテックス粒子を含
ませる濃度については、試料中のＨＭＧ−１の濃度、本
発明の抗体のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテ
ックス粒子の粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種
条件により最適な濃度は異なるので一概にいうことはで
きない。

【０１００】しかし、通常は、試料と測定試薬が混合さ
れ、ラテックス粒子に固相化された「本発明の抗体」と
試料中に含まれていた「ＨＭＧ−１」との抗原抗体反応
が行われる測定反応時に、本発明の抗体を固相化させた
ラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において０．０
０５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であ
り、この場合、反応混合液中においてこのような濃度に
なるような濃度の「本発明の抗体を固相化させたラテッ
クス粒子」を測定試薬に含ませる。

【０１０１】また、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集
反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原
理とする場合、固相担体として用いる粒子の粒径につい
ては、特に制限はないものの、その平均粒子径が０．０
１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．５
〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。そし
て、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にあるこ
とが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好まし
い。

【０１０２】なお、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集
反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原
理とする場合の測定に使用する容器としては、例えば、
ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタク
リレートなどからなる、試験管、マイクロプレート（マ
イクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げることが
できる。これらの容器の溶液収容部分（マイクロプレー
トのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底
面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好
ましい。

【０１０３】測定の操作法は公知の方法等により行うこ
とができるが、例えば、光学的方法により測定する場合
には、試料と抗体、又は試料と固相担体に感作させた抗
体を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、
透過光や散乱光を測定する。また、目視的に測定する場
合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中
で、試料と固相担体に感作させた抗体を反応させ、凝集
の状態を目視的に判定する。なお、この目視的に測定す
る代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて
測定を行ってもよい。

【０１０４】３．ヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬 （１）総論 本発明のヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬（以下「本
発明の免疫学的測定試薬」又は「本発明の測定試薬」と
いうことがある。）は、試料に含まれるヒトＨＭＧ−１
を抗原抗体反応を利用して測定を行うための免疫学的測
定試薬において、前述した本発明の抗体を使用すること
を特徴とするものであり、前述した本発明の測定方法に
使用することができるものである。従って、本発明の測
定試薬に使用する抗体、測定原理等については、前述し
た本発明の測定方法と同様である。

【０１０５】（２）その他の試薬成分 本発明の測定試薬において、溶媒としては、各種の水系
溶媒を用いることができる。この水系溶媒としては、例
えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス緩衝液、リン
酸緩衝液もしくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝
液等を挙げることができる。この緩衝液のｐＨについて
は、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限
はないものの、通常は、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを
選択して用いることが一般的である。

【０１０６】また、本発明の測定試薬には、前記の本発
明の抗体などの抗体を固相化した固相担体、前記の本発
明の抗体などの抗体を感作した固相担体、及び／又は前
記の本発明の抗体などの抗体と酵素などの標識物質を結
合させた標識抗体等の試薬成分の他に、ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼ
インもしくはその塩などのタンパク質；各種塩類；各種
糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；
アジ化ナトリウムもしくは抗生物質などの各種防腐剤；
活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールな
どの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イ
オン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性
界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上
を適宜含有させてもよい。そして、これらを測定試薬に
含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、
０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０
１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。

【０１０７】なお、前記の界面活性剤としては、例え
ば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エス
テル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチ
レンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレング
リセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪
酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポ
リオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノー
ル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキル
エーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテ
ル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油もしく
はポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活
性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリ
オキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩もしくはポリオ
キシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性
界面活性剤等を挙げることができる。

【０１０８】（３）測定試薬の構成 本発明の測定試薬は、そのもの単独にて、試料中のＨＭ
Ｇ−１の測定に使用することができる。そして、そのも
の単独にて、販売することができる。また、本発明の測
定試薬は、他の試薬と組み合わせて、試料中のＨＭＧ−
１の測定に使用することもできる。そして、他の試薬と
組み合わせて、販売することもできる。前記の他の試薬
としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、
標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成す
る物質を含有する試薬、発色などのシグナルの生成に関
与する物質を含有する試薬、校正（キャリブレーショ
ン）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を
行うための物質を含有する試薬等を挙げることができ
る。そして、前記の他の試薬を第１試薬とし、本発明の
測定試薬を第２試薬としたり、又は本発明の測定試薬を
第１試薬とし、前記の他の試薬を第２試薬としたりし
て、適宜様々な組合せにて使用、及び販売を行うことが
できる。

【０１０９】

【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に詳
述するが、本発明はこれらの実施例によって限定される
ものではない。 〔実施例１〕（ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列におけ
る、親水性が高く、ヒトＨＭＧ−２との間で相同性の低
いアミノ酸配列の選択） 親水性が高く、ヒトＨＭＧ−２との間で相同性の低いア
ミノ酸配列を、ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列より選択
した。

【０１１０】（１） ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列
は、前記のウエンらのデータの通りである。〔Ｗｅｎ
ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７巻，
１１９７〜１２１４頁，１９８９年発行〕

【０１１１】（２） このヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配
列の各アミノ酸残基の親水性の高さの推定を、前記のホ
ップらの方法〔Ｔ．Ｐ．Ｈｏｐｐら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８巻，３８２
４〜３８２８頁，１９８１年発行〕により行った。この
結果は、前記の図１の通りである。

【０１１２】（３） 次に、このヒトＨＭＧ−１のアミ
ノ酸配列のうち親水性の高い配列を、ヒトＨＭＧ−２の
アミノ酸配列〔Ｍ．Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，２６７巻，６６４１〜６６４５頁，１９９
２年発行〕と比較した。そして、この親水性の高いアミ
ノ酸配列の中から、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２と
の間で相同性の低いヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列を選
択した。

【０１１３】（４） ここで本発明者らが選択したアミ
ノ酸配列の第１番目は、ヒトＨＭＧ−１のＮ末端のアミ
ノ酸残基（グリシン）より１１番目のアミノ酸残基（リ
シン）までの、「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Ar
g Gly Lys」である。なお、このヒトＨＭＧ−１のアミ
ノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg GlyL
ys」は、これに相当するヒトＨＭＧ−２のアミノ酸配列
「Gly Lys Gly Asp ProAsn Lys Pro Arg Gly Lys」と、
Ｎ末端から６番目のアミノ酸残基が異なっている。〔ヒ
トＨＭＧ−１では「Lys」であり、これに対してヒトＨ
ＭＧ−２では「Asn」である。〕

【０１１４】（５） 次に、本発明者らが選択したアミ
ノ酸配列の第２番目は、ヒトＨＭＧ−１のＮ末端から８
７番目のアミノ酸残基（リシン）より１００番目のアミ
ノ酸残基（アラニン）までの、「Lys Phe Lys Asp Pro
Asn Ala Pro Lys Arg Pro ProSer Ala」である。なお、
このヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列「Lys Phe Lys AspP
ro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」は、これに
相当するヒトＨＭＧ−２のアミノ酸配列「Lys Lys Lys
Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」と、
Ｎ末端から８８番目のアミノ酸残基が異なっている。
〔ヒトＨＭＧ−１では「Phe」であり、これに対してヒ
トＨＭＧ−２では「Lys」である。〕

【０１１５】〔実施例２〕（ペプチドの合成） 実施例１で選択した２種類のアミノ酸配列の各々のＮ末
端に、担体に結合させるためにシステインを結合させた
アミノ酸配列「Cys Gly Lys Gly Asp Pro LysLys Pro A
rg Gly Lys」及び「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala
Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」のペプチドをそれぞれ
合成した。

【０１１６】まず、アプライドバイオシステムズ社（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のモデル４３０
Ａペプチド自動合成装置（Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａ ｐｅ
ｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）により、取扱説
明書に従って、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ酸固相法
でアミノ酸配列「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys LysPro
Arg Gly Lys」のペプチドの合成を行った。

【０１１７】副反応を抑制するためにスカベンジャーと
して、ジメチルスルファイド、ｐ−チオクレゾール、ｍ
−クレゾール及びアニソールの存在下でフッ化水素法に
より樹脂から合成したペプチドの脱離を行った。その
後、ジメチルエーテルによりスカベンジャーを抽出し、
そして２Ｎ酢酸により合成したペプチドの抽出を行っ
た。

【０１１８】陰イオン交換樹脂であるダウエックス１−
Ｘ２（ＤＯＷＥＸ １−Ｘ２）により陰イオン交換カラ
ムクロマトグラフィーを行い精製をして、オクタデシル
（ＯＤＳ）カラムでの高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）により、メインピークのパターンの確認を行っ
た。

【０１１９】そして、エバポレーターにより凍結乾燥を
して濃縮を行った後、ＨＰＬＣにより精製を行い分取し
た。なお、このＨＰＬＣ精製時の装置及び条件は、山村
化学研究所社の逆相ＯＤＳカラムＹＭＣ−Ｄ−ＯＤＳ−
５（２０ｍｍ×３００ｍｍ）を用い、日本分光工業社の
ＴＷＩＮＣＬＥポンプ及び日本分光工業社のＧＰ−Ａ４
０型グラジエンターで０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）中アセトニトリルの０％から７０％のグラジエント
を流速７．０ｍＬ／分で行い、日本分光工業社製ＵＶＩ
ＤＥＣ−１００Ｖ型検出器（２１０ｎｍ、１．２８ＡＵ
ＦＳ）で検出を行った。

【０１２０】ここで精製分取した合成ペプチドをエバポ
レーターで凍結乾燥して濃縮した。得られた合成ペプチ
ドの純度をＨＰＬＣで分析した。装置及び条件は、山村
化学研究所社の逆相ＯＤＳカラムＹＭＣ−Ｒ−ＯＤＳ−
５（４．９ｍｍ×３００ｍｍ）を用い、日本分光工業社
のＴＷＩＮＣＬＥポンプ及び日本分光工業社のＧＰ−Ａ
４０型グラジエンターで０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）中アセトニトリルの０％から７０％のグラジエン
トを流速１．０ｍＬ／分、２５分間で行い、日本分光工
業社製ＵＶＩＤＥＣ−１００Ｖ型検出器（２１０ｎｍ、
１．２８ＡＵＦＳ）で検出を行った。これより得られた
合成ペプチドの純度がほぼ１００％であることが分かっ
た。

【０１２１】また、前記と同様にして、アミノ酸配列
「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn AlaPro Lys Arg Pro P
ro Ser Ala」のペプチドの合成を行った。そして、得ら
れた合成ペプチドの純度を前記と同様にＨＰＬＣで分析
したところ、これも純度はほぼ１００％であることが分
かった。

【０１２２】〔実施例３〕（免疫原の調製） 担体であるスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）〔カル
ビオケム社製〕又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）〔生
化学工業社製〕の１０ｍｇを１０ｍＭリン酸二水素カリ
ウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶
解し、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解して
いる２．５％マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサ
クシニミドエステル（ＭＢＳ）〔ピアース社製〕溶液１
５０μＬを加え室温で撹拌しながら３０分間反応させ
た。

【０１２３】これを４℃中においてある１０ｍＭリン酸
二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化しておいたゲル濾過カラムであるセフ
ァデックスＧ−２５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５）カ
ラム〔ファルマシア−エルケービー社製〕にかけ、２８
０ｎｍにおける吸光度でモニターして、ＭＢＳ−担体結
合成分を分取した。

【０１２４】このＭＢＳ−担体結合成分をリン酸三ナト
リウムでｐＨ７．０に調整し、これに実施例２で合成し
たペプチド「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Ar
g Gly Lys」を添加混合して１５０分間反応させた。

【０１２５】反応後、水に対して３回透析した後、凍結
乾燥を行って前記ペプチドと結合した担体よりなる免疫
原を得た。また、実施例２で合成したペプチド「Cys Ly
s Phe Lys Asp Pro Asn Ala ProLys Arg Pro Pro Ser A
la」についても、前記の通り操作を行って、前記ペプチ
ドと結合した担体よりなる免疫原を得た。

【０１２６】〔実施例４〕（モノクローナル抗体の調
製） 実施例３で調製した免疫原を用いてモノクローナル抗体
の調製を下記のようにして行った。 〔１〕 動物への免疫 （１） 実施例３で得た免疫原（「Cys Gly Lys Gly As
p Pro Lys Lys Pro ArgGly Lys」で表されるペプチドに
ＫＬＨを結合させたもの）を１００μｇ／ｍＬになるよ
うに生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）で溶
解し、これをフロイント完全アジュバントと等量ずつ混
合してエマルジョンとして、８週齢のメスのＢＡＬＢ／
ｃマウス（日本チャールズリバー社）の腹部皮下に０．
５ｍＬを免疫注射した。

【０１２７】（２） 初回免疫から２週間後に、前記の
免疫原を５０μｇ／ｍＬになるように生理食塩水で溶解
し、これをフロイント不完全アジュバントと等量ずつ混
合してエマルジョンとして、その０．５ｍＬにより追加
免疫注射を行った。この追加免疫注射は２週間おきに行
った。

【０１２８】（３） 免疫動物であるこのマウスの血清
中の抗体価を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）
にて、初回免疫から６週間目より１週間ごとに測定し
た。このＥＬＩＳＡ法の操作を以下に示した。 実施例３で得た「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Ly
s Pro Arg Gly Lys」で表されるペプチドに担体として
ＢＳＡを結合させた免疫原を５μｇ／ｍＬになるように
生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解
し、これを９６ウェル−マイクロプレート（ヌンク社
製）に１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時
間静置してこの免疫原の固相化を行った。 このマイクロプレートを洗浄液（０．０５％ツイー
ン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水
（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭ
リン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、
２．６８ｍＭ塩化カリウム（ｐＨ７．２））で洗浄した
後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−
リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウェル
当り３００μＬずつ加えて、３７℃で２時間静置してブ
ロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。 このマイクロプレートのウェルに、抗体の産生を検
査すべき前記マウスの血清を試料として１００μＬずつ
加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせ、その後洗
浄液で洗浄した。 また対照として、前記のマイクロプレートのウェ
ルに、ＨＡＴ培地を１００μＬずつ加え、３７℃で２時
間静置して、その後洗浄液で洗浄した。 パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗マウスＩｇＧ抗
体（アマシャム社製）を３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生
理食塩水で２，０００倍に希釈した後、及びのマイ
クロプレートに１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７
℃で２時間静置して反応を行わせた。 これを洗浄液で洗浄した後、パーオキシダーゼ反応
液（３ｍＭ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベン
ズチアゾリン−６−スルホン酸）〔ＡＢＴＳ〕を含む５
０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−２４ｍＭクエン酸緩衝
液の１ｍＬに対して２μＬの１．７％過酸化水素を使用
直前に添加したもの）を１ウェル当り１００μＬずつ加
え、室温で反応させた。１５分後に１ウェル当り５０μ
Ｌの６Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた。 これをＥＩＡプレートリーダー（バイオラッド社
製）にて４１５ｎｍにおける吸光度の測定を行った。

【０１２９】（４） 初回免疫から１８週間目以降、抗
体価がプラトーに達したと認められたので、この免疫動
物であるマウスの腹部皮下に、生理食塩水で８００μｇ
／ｍＬとした実施例３で得た免疫原（「Cys Gly Lys Gl
y Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるペプ
チドにＫＬＨを結合させたもの）の０．５ｍＬを注射し
た。その後３日目に、この免疫動物のマウスより脾臓を
取得した。

【０１３０】以上の（１）〜（４）の操作を、もう一方
の実施例３で得た免疫原（「Cys Lys Phe Lys Asp Pro
Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されるペ
プチドにＫＬＨを結合させたもの）についても同様に行
い、免疫動物のマウスより脾臓を取得した。

【０１３１】〔２〕 骨髄腫細胞の増殖 ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のヒポキサンチン・グアニン・
ホスホリボシル・トランスフェラーゼ欠損の骨髄腫細胞
株であるＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサー
チソースバンク ９０８５）を、胎生ウシ血清を１０％
含有しグルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン
を補ったＲＰＭＩ１６４０組織培養培地（バイオセル社
製）で増殖を行った。

【０１３２】これは、この骨髄腫細胞を細胞培養用中型
ボトル（ヌンク社製、２００ｍＬ容）内で、ボトルの底
面の約８割を細胞が占めるまで増殖させた。なお、細胞
数は、トリパン青染料排除法及び血球計で計数を行っ
た。

【０１３３】〔３〕 細胞融合 （１） 前記〔１〕で免疫動物のマウスより取得した脾
臓を、ステンレススチールメッシュ＃２００を使用して
充分にほぐし、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地液
で洗浄しながら濾過した。その後、２００ｇで遠心分離
を行い、脾臓細胞を分離した。更に、再度血清を含まな
いＲＰＭＩ１６４０培地液で３回脾臓細胞を洗浄した。

【０１３４】（２） この脾臓細胞と前記の増殖させた
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株骨髄腫細胞を５対１の割
合で混合した後、遠心分離を行った。混合した細胞を、
ポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ１５００、ロ
シュ・ダイアグノスティック社製）を５０％含むＲＰＭ
Ｉ１６４０培地液にゆっくりと懸濁した。そして、最終
的にポリエチレングリコール濃度が５％となるように、
これをＲＰＭＩ１６４０培地液で徐々に希釈した。

【０１３５】（３） これより細胞を遠心分離で分離
し、５％のハイブリドーマクローニングファクター（オ
リゲン社製）を含んだＳ−クローン培地（三光純薬社
製）よりなる増殖培地に徐々に分散させた。そして、平
底の９６穴マイクロプレート（ヌンク社製）のウェル
に、１ウェル当り１０⁶個／１００μＬの細胞数の細胞
を植え、５％の二酸化炭素中３７℃で培養した。

【０１３６】（４） 細胞融合後１日目に、各ウェルに
１００μＬのＨＡＴ培地（前記の増殖培地に０．０１ｍ
Ｍヒポキサンチン、１．６μＭチミジン及び０．０４μ
Ｍアミノプテリンとなるようにそれぞれを補充したも
の、いずれも東京化成社製）を加えた。その後３日間
は、毎日、約半分のＨＡＴ培地を新しいＨＡＴ培地と交
換し、更にその後は、２〜３日ごとに同様の交換を行っ
た。

【０１３７】（５） 細胞は、顕微鏡で観察を行った。
ハイブリドーマ（融合細胞）のクローンは１０日以降よ
り出現し、１４日以降に「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Ly
s ProArg Gly Lys」で示されるアミノ酸配列を認識する
抗体の産生を検査するため、ウェルの上澄み液をＥＬＩ
ＳＡ法でスクリーニングした。なお、このＥＬＩＳＡ法
の操作は、前記の〔１〕の（３）と同様にして行った。

【０１３８】（６） 前記（５）のスクリーニングにお
いて、アミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pr
o Arg Gly Lys」を認識する抗体を産生していることが
判明したウェルのハイブリドーマを、２４穴のウェルが
あるプレートに拡げて培養し、細胞密度が高くなるに従
い、小型ボトル、中型ボトルとスケールを大きくして培
養した。

【０１３９】（７） そして、ハイブリドーマはＨＴ培
地（アミノプテリン及びハイブリドーマクローニングフ
ァクターを含まないＨＡＴ培地）で培養、保持した。

【０１４０】（８） アミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp
Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys」を認識する抗体の産生
をＥＬＩＳＡ法により前記（５）と同様にして調べたと
ころ、アミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pr
o Arg Gly Lys」を含む「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys
Lys Pro Arg Gly Lys」で表されるペプチドよりなる実
施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、
かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生するハイブリドー
マを３個確認した。

【０１４１】以上の（１）〜（８）の操作を、もう一方
の実施例３で得た免疫原（「Cys Lys Phe Lys Asp Pro
Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されるペ
プチドにＫＬＨを結合させたもの）を免疫して得た前記
のマウス脾臓についても同様に行い、アミノ酸配列「Ly
s Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser
Ala」を含む「Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro L
ys Arg Pro Pro Ser Ala」で表されるペプチドよりなる
実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合
し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生するハイブリ
ドーマを６個確認した。

【０１４２】〔４〕 ハイブリドーマサブクローニング （Ａ） 免疫原が「Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys
Pro Arg Gly Lys」で表されたペプチドと担体の結合物
の場合 （１） 前記〔３〕で得られた、「Cys Gly Lys Gly As
p Pro Lys Lys Pro ArgGly Lys」で表されたペプチドよ
りなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と
結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生する前記
ハイブリドーマの各々を、限界希釈法にてサブクローニ
ングした。これらのハイブリドーマの細胞数を、トリパ
ン青染料排除法及び血球計により計数を行った。そし
て、これらのハイブリドーマを、１００μＬのＨＴ培地
当り、０．５個の生育細胞数の割合と１個の生育細胞数
の割合の２種類の割合で懸濁し、９６穴の平底マイクロ
プレートの１ウェル当り１００μＬずつ分注した。これ
を２〜３日ごとに培地を交換して、ハイブリドーマを増
殖させた。

【０１４３】（２） ２週間後、顕微鏡下で各ウェルの
コロニー数を調べ、そして、「Cys Gly Lys Gly Asp Pr
o Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されたペプチドより
なる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結
合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産生するハイブ
リドーマについて前記と同様にしてＥＬＩＳＡ法で調べ
た。１ウェル中に１コロニーが存在し、そしてこのよう
な抗体を産生するハイブリドーマ（ウェル）を２個得る
ことができた。

【０１４４】（３） これを、２４穴のプレートに移
し、細胞生育が良好となるまで２週間培養を行った。

【０１４５】（４） 次に、これらのハイブリドーマが
産生する抗体の、参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１と
の反応性をＥＬＩＳＡ法で調べた。なお、このＥＬＩＳ
Ａ法の操作は、９６ウェル−マイクロプレートに固相化
するものを参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１に替える
ことと、試料を各ハイブリドーマ（各ウェル）の培養上
清に替えること以外は、前記の〔１〕の（３）と同様に
して行った。この結果、前記のハイブリドーマのうち、
１個のハイブリドーマが、前記ヒトＨＭＧ−１に結合す
る抗体を産生する細胞株であることが判明した。

【０１４６】（５） このハイブリドーマを、再度、前
記（１）及び（２）と同様にしてクローニングを行い、
それぞれのウェルについて抗体の産生を調べたところ、
１ウェル中に１コロニーのハイブリドーマが存在し、そ
して、アミノ酸配列「Gly LysGly Asp Pro Lys Lys Pro
Arg Gly Lys」を含む「Cys Gly Lys Gly Asp Pro LysL
ys Pro Arg Gly Lys」で表されるペプチドよりなる実施
例３で得た免疫原（担体がＢＳＡのもの）と結合し、か
つＢＳＡとは結合しない抗体を産生するハイブリドーマ
を１個得た。

【０１４７】（６） このハイブリドーマのクローンが
産生する抗体の前記ヒトＨＭＧ−１との反応性を、再
度、前記（４）と同様にＥＬＩＳＡ法で調べた。この検
討の結果、このハイブリドーマのクローンが産生する抗
体（モノクローナル抗体）が、前記ヒトＨＭＧ−１に結
合する抗体（モノクローナル抗体）であることが確かめ
られた。

【０１４８】（７） 次に、このハイブリドーマが産生
する抗体の、参考例３で調製したウシＨＭＧ−１、ウシ
ＨＭＧ−２の各々との反応性をＥＬＩＳＡ法で調べた。
なお、このＥＬＩＳＡ法の操作は、９６ウェル−マイク
ロプレートに固相化するものを参考例３で調製したウシ
ＨＭＧ−１又はウシＨＭＧ−２に替えることと、試料を
このハイブリドーマ（このウェル）の培養上清に替える
こと以外は、前記の〔１〕の（３）と同様にして行っ
た。

【０１４９】この検討の結果、このハイブリドーマが産
生する抗体は、ウシＨＭＧ−１には結合するが、ウシＨ
ＭＧ−２には結合しないことが確かめられた。なお、免
疫原のペプチドのアミノ酸配列として採用したＨＭＧ−
１のアミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro
Arg Gly Lys」、及びこの配列に対応するＨＭＧ−２の
アミノ酸配列「Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg
Gly Lys」は、いずれもヒトでもウシでも全く同じ配列
である。

【０１５０】従って、以上のことより、このハイブリド
ーマが産生する抗体（モノクローナル抗体）が、ヒトＨ
ＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しな
い抗体（モノクローナル抗体）であることが明らかにな
った。

【０１５１】このハイブリドーマは、ＭＤ７７と命名さ
れ、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン
ター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第
６）にＦＥＲＭ Ｐ−１８４０４として平成１３年７月
４日付けにて寄託されている。

【０１５２】（Ｂ） 免疫原が「Cys Lys Phe Lys Asp
Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表され
たペプチドと担体の結合物の場合 （１） 前記〔３〕で得られた、「Cys Lys Phe Lys As
p Pro Asn Ala Pro LysArg Pro Pro Ser Ala」で表され
たペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳ
Ａのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を
産生する前記ハイブリドーマの各々を、限界希釈法にて
サブクローニングした。これらのハイブリドーマの細胞
数を、トリパン青染料排除法及び血球計により計数を行
った。

【０１５３】そして、これらのハイブリドーマを、１０
０μＬのＨＴ培地当り、０．５個の生育細胞数の割合と
１個の生育細胞数の割合の２種類の割合で懸濁し、９６
穴の平底マイクロプレートの１ウェル当り１００μＬず
つ分注した。これを２〜３日ごとに培地を交換して、ハ
イブリドーマを増殖させた。

【０１５４】（２） ２週間後、顕微鏡下で各ウェルの
コロニー数を調べ、そして、「Cys Lys Phe Lys Asp Pr
o Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表された
ペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢＳＡ
のもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体を産
生するハイブリドーマについて前記と同様にしてＥＬＩ
ＳＡ法で調べた。１ウェル中に１コロニーが存在し、そ
してこのような抗体を産生するハイブリドーマ（ウェ
ル）を４個得ることができた。

【０１５５】（３） これを、２４穴のプレートに移
し、細胞生育が良好となるまで２週間培養を行った。

【０１５６】（４） 次に、これらのハイブリドーマが
産生する抗体の、参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１と
の反応性をＥＬＩＳＡ法で調べた。なお、このＥＬＩＳ
Ａ法の操作は、９６ウェル−マイクロプレートに固相化
するものを参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１に替える
ことと、試料を各ハイブリドーマ（各ウェル）の培養上
清に替えること以外は、前記の〔１〕の（３）と同様に
して行った。この結果、前記のハイブリドーマのうち、
１個のハイブリドーマが、前記ヒトＨＭＧ−１に結合す
る抗体を産生する細胞株であることが判明した。

【０１５７】（５） このハイブリドーマを、再度、前
記（１）及び（２）と同様にしてクローニングを行い、
それぞれのウェルについて抗体の産生を調べたところ、
１ウェル中に１コロニーのハイブリドーマが存在し、そ
して、アミノ酸配列「Lys PheLys Asp Pro Asn Ala Pro
Lys Arg Pro Pro Ser Ala」を含む「Cys Lys Phe LysA
sp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表さ
れるペプチドよりなる実施例３で得た免疫原（担体がＢ
ＳＡのもの）と結合し、かつＢＳＡとは結合しない抗体
を産生するハイブリドーマを２個得た。

【０１５８】（６） これらの２個のハイブリドーマの
クローンが産生する各々の抗体の前記ヒトＨＭＧ−１と
の反応性を、再度、前記（４）と同様にＥＬＩＳＡ法で
調べた。この検討の結果、これらの２個のハイブリドー
マのクローンが産生する各々の抗体（モノクローナル抗
体）が、前記ヒトＨＭＧ−１に結合する抗体（モノクロ
ーナル抗体）であることが確かめられた。

【０１５９】（７） 次に、これらの２個のハイブリド
ーマが産生する各々の抗体の、参考例３で調製したウシ
ＨＭＧ−１、ウシＨＭＧ−２の各々との反応性をＥＬＩ
ＳＡ法で調べた。なお、このＥＬＩＳＡ法の操作は、９
６ウェル−マイクロプレートに固相化するものを参考例
３で調製したウシＨＭＧ−１又はウシＨＭＧ−２に替え
ることと、試料をこれらのハイブリドーマ（このウェ
ル）の培養上清に替えること以外は、前記の〔１〕の
（３）と同様にして行った。この検討の結果、これらの
２個のハイブリドーマが産生する各々の抗体は、ウシＨ
ＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２の両方に結合することが確
かめられた。

【０１６０】なお、免疫原のペプチドのアミノ酸配列と
して採用したＨＭＧ−１のアミノ酸配列「Lys Phe Lys
Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」、及
びこの配列に対応するＨＭＧ−２のアミノ酸配列「Lys
Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Al
a」は、いずれもヒトでもウシでも全く同じ配列であ
る。

【０１６１】従って、以上のことより、これらの２個の
ハイブリドーマが産生する各々の抗体（モノクローナル
抗体）が、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結
合する抗体（モノクローナル抗体）であることが明らか
になった。

【０１６２】これらのハイブリドーマは、ＭＤ７８と命
名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託
センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央
第６）に、それぞれＦＥＲＭ Ｐ−１８４０５として平
成１３年７月４日付けにて寄託されている。

【０１６３】〔５〕 モノクローナル抗体の産生 （１） 前記〔４〕で得た各々のモノクローナル抗体産
生細胞株（ハイブリドーマ）を、それぞれ中型ボトル
（ヌンク社製）の中に１つずつ入れ、底面の約８割を細
胞が占めるまでＨＴ培地中で培養を行った。 （２） その後、これらのハイブリドーマを掻き取り、
そして２００ｇ、５分間の遠心分離を行い集めた。次
に、これを血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地液で３
回洗浄した後、２ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地液に懸濁
した。 （３） 前もって、２，６，１０，１４−テトラメチル
ペンタデカンで処置しておいたオスのＢＡＬＢ／ｃマウ
ス（日本チャールズリバー社）の腹腔に、前記（２）で
得たハイブリドーマ懸濁液１ｍＬを注射した。注射から
２週間以内に腹部の膨張が認められなかった場合には、
再度これを繰り返し行った。 （４） このマウスの腹部の膨張が認められた時に腹水
を採取した。これを２００ｇ、５分間の遠心分離にか
け、ハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体
を含む上澄み液を、ハイブリドーマから分離して取得し
た。

【０１６４】〔６〕 モノクローナル抗体の精製 （１） 前記〔５〕で得た、ハイブリドーマから産生さ
れたモノクローナル抗体を含む上澄み液の各々の１０ｍ
Ｌに、２２℃で硫酸ナトリウム１．８ｇを撹拌しながら
加え、硫酸ナトリウムが完全に溶けてから更に１時間撹
拌を続けて塩析を行った。 （２） これを２２℃で遠心分離（７０００ｇ、１５分
間）を行い、上澄み液と分離して得た沈殿を、３０ｍＭ
塩化ナトリウムを含む４０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ８．０）２ｍＬに溶解した。 （３） 次に、これを３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に対して
充分に透析した後、１０００ｇで２０分間遠心分離し不
溶性のものを除去した。 （４） これを３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む４０ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化してお
いたＤＥＡＥ−セルロースイオン交換カラム（セルバ社
製）〔１×１０ｃｍ〕に流速０．４ｍＬ／分で通して、
溶出液を２ｍＬずつ集めた。 （５） 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が溶出液の素通り
画分に含まれていることを２８０ｎｍの吸光度より確認
し、これを集めて２ｍＬに濃縮した。 （６） 更に、これをプロテインＡ−セファロースＣＬ
−４Ｂアフィニティークロマトグラフィー（ファルマシ
ア−エルケービー社製）にかけて精製を行い、精製した
モノクローナル抗体を得た。

【０１６５】なお、免疫原が「Cys Gly Lys Gly Asp Pr
o Lys Lys Pro Arg Gly Lys」で表されたペプチドと担
体の結合物の場合の、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、
ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗
体）の得られた量は、タンパク質量として０．５ｍｇで
あった。

【０１６６】また、免疫原が「Cys Lys Phe Lys Asp Pr
o Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表された
ペプチドと担体の結合物の場合の、ヒトＨＭＧ−１とヒ
トＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗
体）の得られた量は、タンパク質量として０．４ｍｇで
あった。

【０１６７】〔実施例５〕（パーオキシダーゼ標識抗体
の調製） 実施例４で得たヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨ
ＭＧ−２には結合しない抗体にパーオキシダーゼを標識
化して、パーオキシダーゼ標識抗体を調製した。 （１）パーオキシダーゼへのマレイミド基の導入 パーオキシダーゼ（西洋ワサビ由来）４ｍｇを０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．３ｍＬに溶解後、Ｎ
−サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シク
ロヘキサン−１−カルボン酸の１．０ｍｇをＮ，Ｎ’−
ジメチルホルムアミドの６０μＬに溶解したものを添加
して、３０℃で６０分間反応させた。その後、０．１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で一夜透析を行った。以上
の操作により、前記のパーオキシダーゼに、マレイミド
基を導入した。

【０１６８】（２）抗体へのチオール基の導入 実施例４で得た、免疫原が「Cys Gly Lys Gly Asp Pro
Lys Lys Pro Arg GlyLys」で表されたペプチドと担体の
結合物の場合の、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒト
ＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗体）
を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する０．１Ｍリン酸緩
衝液溶液（ｐＨ６．５）の０．５ｍＬに、Ｓ−アセチル
メルカプト無水コハク酸の０．６ｍｇをＮ，Ｎ’−ジメ
チルホルムアミドの１０μＬに溶解したものを添加し
て、室温で３０分間反応させた。

【０１６９】その後これに、０．１ＭのＥＤＴＡの２０
μＬ、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の
０．１ｍＬ、及び１Ｍのヒドロキシルアミン塩酸塩（ｐ
Ｈ７．０）の０．１ｍＬをそれぞれ添加して、３０℃で
５分間放置した。

【０１７０】次にこれを、５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいたセ
ファデックスＧ−２５のカラムに通し、単純ゲル濾過ク
ロマトグラフィーを行い、過剰のＳ−アセチルメルカプ
ト無水コハク酸を取り除き、抗体画分を集めた。以上の
操作により、前記のヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒ
トＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗
体）に、チオール基を導入した。

【０１７１】（３）標識抗体の調製 前記（１）で調製したマレイミド基を導入したパーオキ
シダーゼ及び前記（２）で調製したチオール基を導入し
た抗体を一対一で混合し、３０℃で２０時間反応させ
て、前記抗体へのパーオキシダーゼの導入（標識化）を
行った。その後これを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６．５）で平衡化しておいたウルトラゲルＡｃＡ３４の
カラムに通し、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。
このゲル濾過クロマトグラフィーの各画分を、１０％ポ
リアクリルアミド電気泳動にかけて確認を行い、未結合
のパーオキシダーゼが混入しないように、パーオキシダ
ーゼが結合した抗体の画分だけを集めた。このパーオキ
シダーゼが結合した抗体の画分を濃縮して、パーオキシ
ダーゼが結合した抗体、即ちパーオキシダーゼ標識抗体
を得た。そして、このパーオキシダーゼ標識抗体を含む
溶液のタンパク質濃度を測定した。

【０１７２】〔実施例６〕（マイクロプレート固相化抗
体） 実施例４で得たヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方
に結合する抗体をマイクロプレートに固相化して、マイ
クロプレート固相化抗体を調製した。 （１） 実施例４で得た、免疫原が「Cys Lys Phe Lys
Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala」で表
されたペプチドと担体の結合物の場合の、ヒトＨＭＧ−
１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクロー
ナル抗体）を、リン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリ
ン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリ
ウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カ
リウム（ｐＨ７．２））により１５μｇ／ｍＬとした
後、９６ウェル−マイクロプレート（ヌンク社製）に１
ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置し
て、前記抗体を前記マイクロプレートの各ウェルに吸着
させ、固相化した。 （２） この抗体が固相化されたマイクロプレートを洗
浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含
むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２））で洗浄した
後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−
リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウェル
当り３００μＬずつ加えて、３７℃で２時間静置してブ
ロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。

【０１７３】以上の操作により、ヒトＨＭＧ−１とヒト
ＨＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗
体）をマイクロプレートに固相化した、マイクロプレー
ト固相化抗体を調製した。

【０１７４】〔実施例７〕（ヒトＨＭＧ−１には結合す
るが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体を使用するヒ
トＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方
法） 実施例５で調製したパーオキシダーゼ標識抗体及び実施
例６で調製したマイクロプレート固相化抗体を免疫学的
測定試薬として使用し、参考例２で調製したヒトＨＭＧ
−１及び参考例３で調製したウシＨＭＧ−１の酵素免疫
測定法（サンドイッチ法）による測定を行った。そし
て、この免疫学的測定方法における検量線を作成した。

【０１７５】１．測定試薬 パーオキシダーゼ標識抗体 実施例５で調製した、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、
ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体にパーオキシダーゼ
を結合させたパーオキシダーゼ標識抗体を、酵素免疫測
定法のサンドイッチ法における酵素標識抗体として使用
した。 マイクロプレート固相化抗体 実施例６で調製した、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２
の両方に結合する抗体をマイクロプレートの各ウェルに
固相化したマイクロプレート固相化抗体を、酵素免疫測
定法のサンドイッチ法における固相化抗体として使用し
た。 洗浄液 ０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン
酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）を調製し、洗浄液とし
た。 パーオキシダーゼ基質液 ３ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン
（ＴＭＢＺ）を含む５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−
２４ｍＭクエン酸緩衝液の１ｍＬに対して２μＬの１．
７％過酸化水素を使用直前に添加したものを調製して、
標識としたパーオキシダーゼの基質、即ちパーオキシダ
ーゼ基質液とした。 反応停止液 ６Ｎ硫酸水溶液を調製して、反応停止液とした。

【０１７６】２．試料 ヒトＨＭＧ−１を含む試料 参考例２において調製したヒトＨＭＧ−１を含む溶液
を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸
二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ
７．４）で充分に透析した。この透析後の前記ヒトＨＭ
Ｇ−１を含む溶液のタンパク質濃度をプロテインアッセ
イ（バイオラッド社製）で求めた。そして、この前記ヒ
トＨＭＧ−１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウ
ムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二
カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈して、前記ヒトＨ
ＭＧ−１濃度が、３６０ｎｇ／ｍＬ、７２０ｎｇ／ｍＬ
又は１，０８０ｎｇ／ｍＬの試料をそれぞれ調製した。 ウシＨＭＧ−１を含む試料 参考例３において調製したウシＨＭＧ−１を含む溶液
を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸
二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ
７．４）で充分に透析した。この透析後のウシＨＭＧ−
１を含む溶液のタンパク質濃度をプロテインアッセイ
（バイオラッド社製）で求めた。そして、このウシＨＭ
Ｇ−１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含
む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈して、ウシＨＭＧ−１濃
度が、１０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／
ｍＬ又は５００ｎｇ／ｍＬの試料をそれぞれ調製した。 ０ｎｇ／ｍＬの試料 前記の０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン
酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ
７．４）を、ヒトＨＭＧ−１濃度及びウシＨＭＧ−１濃
度が０ｎｇ／ｍＬの試料とした。

【０１７７】３．酵素免疫測定法（サンドイッチ法）に
よる測定 前記２で調製した、３種類の前記ヒトＨＭＧ−１を
含む試料、４種類の前記ウシＨＭＧ−１を含む試料、及
び０ｎｇ／ｍＬの試料をそれぞれ、生理食塩水で２倍に
希釈した。 前記で希釈した各試料を、前記１のマイクロプレ
ート固相化抗体のウェルに１００μＬを添加して、３７
℃で２時間静置して、マイクロプレートに固相化した抗
体と試料に含まれていたＨＭＧ−１との抗原抗体反応を
行わせた。 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェ
ルを前記１の洗浄液で洗浄した。 前記１のパーオキシダーゼ標識抗体を、３％ＢＳＡ
を含むリン酸緩衝生理食塩水で１，０００倍希釈した。
次にこれを、前記の洗浄操作を行ったマイクロプレー
ト固相化抗体の各ウェルに、１００μＬずつ添加した
後、３７℃で２時間静置した。これにより、マイクロプ
レートに固相化した抗体に結合したＨＭＧ−１に、パー
オキシダーゼ標識抗体を結合させる反応を行わせた。 その後、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウ
ェルを前記１の洗浄液で洗浄した。 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェ
ルに、前記１のパーオキシダーゼ基質液を１００μＬず
つ添加した。そして、室温で反応させた。 前記のパーオキシダーゼ基質液の添加１５分後に、
前記１の反応停止液を、前記のマイクロプレート固相化
抗体の各ウェルに１００μＬずつ添加して、標識パーオ
キシダーゼの反応を停止させた。 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェ
ル中の溶液の吸光度（４５０ｎｍ）をマイクロプレート
リーダー（バイオラッド社製）により測定した。 以上の操作により得られた、前記各試料の測定値、
即ち検量線を図に示した。前記のヒトＨＭＧ−１を含む
試料、及び０ｎｇ／ｍＬの試料の測定値、即ち検量線
を、図２に示した。また、前記のウシＨＭＧ−１を含む
試料、及び０ｎｇ／ｍＬの試料の測定値、即ち検量線
を、図３に示した。

【０１７８】なお、これらの図において、横軸は試料中
に含まれる前記ヒトＨＭＧ−１又は前記ウシＨＭＧ−１
の濃度、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度の測定値を表
す。但し、吸光度の測定値は、３％ＢＳＡを含むリン酸
緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）の吸光度を盲検値として
差し引いたものを表した。

【０１７９】４．まとめ 図２より、前記ヒトＨＭＧ−１を含む試料においては、
含まれる前記ヒトＨＭＧ−１濃度に比例して得られる吸
光度が増加しており、試料に含まれる前記ヒトＨＭＧ−
１濃度に比例した測定値を得ることができることが分か
った。よって、本発明の測定試薬及び測定方法により、
試料中に含まれる前記ヒトＨＭＧ−１を正確に測定する
ことができることが確かめられた。

【０１８０】図３より、前記ウシＨＭＧ−１を含む試料
においては、含まれる前記ウシＨＭＧ−１濃度に比例し
て得られる吸光度が増加しており、試料に含まれる前記
ウシＨＭＧ−１濃度に比例した測定値を得ることができ
ることが分かった。

【０１８１】〔実施例８〕（本発明のヒトＨＭＧ−１の
免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法による血清試料
の測定） 本発明のヒトＨＭＧ−１の免疫学的測定試薬及び免疫学
的測定方法について、血清試料に含まれるＨＭＧ−１を
測定して、血清試料の測定時の正確性を確かめた。

【０１８２】１．測定試薬 実施例７の「１．測定試薬」の「 パーオキシダーゼ
標識抗体」、「 マイクロプレート固相化抗体」、
「 洗浄液」、「 パーオキシダーゼ基質液」及び
「 反応停止液」をそれぞれ使用した。

【０１８３】２．試料 参考例３において調製したウシＨＭＧ−１を含む溶
液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン
酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ
７．４）で充分に透析した。この透析後のウシＨＭＧ−
１を含む溶液のタンパク質濃度をプロテインアッセイ
（バイオラッド社製）で求めた。

【０１８４】そして、このウシＨＭＧ−１を含む溶液
を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸
二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ
７．４）で希釈して、ウシＨＭＧ−１濃度が、４０ｎｇ
／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ又は４００ｎｇ／ｍＬの溶液
をそれぞれ調製した。

【０１８５】 前記で調製した３種類の溶液をそれ
ぞれ生理食塩水で２倍に希釈した。そして、ウシＨＭＧ
−１濃度が、２０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ又は２
００ｎｇ／ｍＬの血清を含まない試料をそれぞれ調製し
た。 また、前記で調製した３種類の溶液をそれぞれヒ
ト血清で２倍に希釈した。そして、ウシＨＭＧ−１濃度
が、２０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ又は２００ｎｇ
／ｍＬの血清試料をそれぞれ調製した。

【０１８６】３．酵素免疫測定法（サンドイッチ法）に
よる測定 前記２で希釈した各試料を、前記１のマイクロプレ
ート固相化抗体のウェルに１００μＬを添加して、３７
℃で２時間静置して、マイクロプレートに固相化した抗
体と試料に含まれていたＨＭＧ−１との抗原抗体反応を
行わせた。 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェ
ルを前記１の洗浄液で洗浄した。 前記１のパーオキシダーゼ標識抗体を、３％ＢＳＡ
を含むリン酸緩衝生理食塩水で１，０００倍希釈した。
次にこれを、前記の洗浄操作を行ったマイクロプレー
ト固相化抗体の各ウェルに、１００μＬずつ添加した
後、３７℃で２時間静置した。これにより、マイクロプ
レートに固相化した抗体に結合したＨＭＧ−１に、パー
オキシダーゼ標識抗体を結合させる反応を行わせた。 その後、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウ
ェルを前記１の洗浄液で洗浄した。 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェ
ルに、前記１のパーオキシダーゼ基質液を１００μＬず
つ添加した。そして、室温で反応させた。 前記のパーオキシダーゼ基質液の添加１５分後に、
前記１の反応停止液を前記のマイクロプレート固相化抗
体の各ウェルに１００μＬずつ添加して、標識パーオキ
シダーゼの反応を停止させた。 次に、前記のマイクロプレート固相化抗体の各ウェ
ル中の溶液の吸光度（４５０ｎｍ）をマイクロプレート
リーダー（バイオラッド社製）により測定した。 以上の操作により得られた、前記各試料の測定値を
表に示した。なお、吸光度の測定値は、３％ＢＳＡを含
むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）の吸光度を盲検
値として差し引いたものを表した。

【０１８７】

【表１】

【０１８８】４．まとめ 前記の表より、各々のウシＨＭＧ−１濃度において、生
理食塩水で希釈した血清を含まない試料の測定値（吸光
度）と、ヒト血清で希釈した血清試料の測定値（吸光
度）は、ほとんど同じであることが分かる。

【０１８９】血清は種々の成分を含み複雑な組成のもの
であるが、本発明の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定
方法は、このような血清又は血清を含む試料において
も、ＨＭＧ−１の濃度を正確に測定することができるも
のであることが確かめられた。

【０１９０】なお、先に述べたように、前記測定を行っ
た本発明の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法に使
用した抗体はいずれも、ヒトとウシとで全くアミノ酸配
列が同一な箇所を免疫原に使用して作成したものであ
り、そして、実施例７において本発明の免疫学的測定試
薬及び免疫学的測定方法は、前記ヒトＨＭＧ−１も前記
ウシＨＭＧ−１も正確に測定できることが確かめられて
いるので、例え、試料としてウシＨＭＧ−１の代わりに
ヒトＨＭＧ−１を血清で希釈したものを用いたとして
も、同じ結果が得られることは明白である。

【０１９１】〔実施例９〕（抗体のヒトＨＭＧ−１及び
ヒトＨＭＧ−２との反応性の確認） 実施例４で調製したヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒ
トＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗
体）、実施例４で調製したヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ
−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）、及
び参考例４で調製したヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２
の両方に結合する抗体（ポリクローナル抗体）のそれぞ
れについて、ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２の各々
との反応性をウエスタンブロット法により確かめた。

【０１９２】１．ウエスタンブロット法 （１）ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２
には結合しない抗体（実施例４で調製したモノクローナ
ル抗体） ヒト血清を、タイタン・ジェル・リポタンパク質電
気泳動キット（ヘレナ研究所社製）を用いて電気泳動を
行った。なお、支持体はアガロースゲルであり、これに
前記のヒト血清の２μＬを接触させた。 そして、泳動緩衝液としてバルビタール緩衝液（ｐ
Ｈ８．８）を使用して、電圧９０Ｖで７５分間通電して
電気泳動を行った。なお、この電気泳動は、同じものを
２セット用意して行い、以下の操作も同様に行った。 前記の電気泳動の後の転写は、ノバ・ブロット・
エレクトロフォレティック・トランスファー・キット
（ファルマシア−エルケービー社製）を用いて、その使
用説明書に従い、ドライ方式で行った。

【０１９３】まず、前記において電気泳動を行ったア
ガロースゲルを転写用装置上に置いた。次に、このアガ
ロースゲルの上に、９ｃｍ×９ｃｍのニトロセルロース
膜（バイオラッド社製）を重ね、４８ｍＭトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン、３９ｍＭグリシン、０．
０３７５％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）及び２０％（Ｖ／Ｖ）メタノールよりなる転写用緩
衝液を用いて、電流６５ｍＡで２時間転写を行った。 この転写を行ったニトロセルロース膜を、１％ＢＳ
Ａを含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水
素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、
１３７ｍＭ塩化ナトリウム及び２．６８ｍＭ塩化カリウ
ムを含む水溶液（ｐＨ７．２））の２０ｍＬに４℃で１
晩浸漬して、ブロッキングを行った。 次に、これを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔ
ｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水）の２０ｍ
Ｌ中で１０分間振とう洗浄を行った。この操作を３回行
った。 実施例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１には結合する
が、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナ
ル抗体）を２０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水に８０μｇ
溶解し、この溶液に前記の操作を行ったニトロセルロ
ース膜を室温で２時間浸漬して反応させた。 前記の操作を行ったニトロセルロース膜を、２０
ｍＬの洗浄液中で１０分間振とう洗浄を行った。これを
３回行った。 次に、パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体
（ダコ社製）を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩
水で５００倍希釈をして、２０ｍＬの溶液を調製し、こ
れに前記のニトロセルロース膜を室温で２時間浸漬し
て反応させた。 このニトロセルロース膜を、２０ｍＬの洗浄液中で
１０分間振とう洗浄を行った。この操作を３回行った。 [10] ０．０２５％の３，３’−ジアミノベンジジン四
塩酸塩及び０．０１％過酸化水素を含むリン酸緩衝生理
食塩水の２０ｍＬに、前記のニトロセルロース膜を室
温で１５分間浸漬して発色させた。

【０１９４】以上の操作により、実施例４で調製した、
ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結
合しない抗体（モノクローナル抗体）におけるウエスタ
ンブロット法の結果を得た。

【０１９５】（２）ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の
両方に結合する抗体（実施例４で調製したモノクローナ
ル抗体） 前記（１）のにおける「実施例４で調製した、ヒトＨ
ＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しな
い抗体（モノクローナル抗体）」を、「実施例４で調製
した、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合す
る抗体（モノクローナル抗体）」に変えること以外は、
前記（１）の〜[10]の通りに操作を行い、実施例４で
調製した、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結
合する抗体（モノクローナル抗体）におけるウエスタン
ブロット法の結果を得た。

【０１９６】（３）ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の
両方に結合する抗体（参考例４で調製したポリクローナ
ル抗体） 前記（１）のにおける「実施例４で調製した、ヒトＨ
ＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しな
い抗体（モノクローナル抗体）」を、「参考例４で調製
した、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合す
る抗体（ポリクローナル抗体）」に変えること以外は、
前記（１）の〜[10]の通りに操作を行い、参考例４で
調製した、ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結
合する抗体（ポリクローナル抗体）におけるウエスタン
ブロット法の結果を得た。

【０１９７】２．実験結果 （１）ウエスタンブロット法の結果 前記１の（１）、（２）及び（３）におけるウエスタン
ブロット法の結果を図４に示した。なお、この図におい
て、「ＭＡ１」はヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒト
ＨＭＧ−２には結合しない抗体（実施例４で調製したモ
ノクローナル抗体）における結果であり、「ＭＡ２」は
ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体
（実施例４で調製したモノクローナル抗体）における結
果であり、「ＰＡ」はヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２
の両方に結合する抗体（参考例４で調製したポリクロー
ナル抗体）における結果である。

【０１９８】そして、この図において、「１」のバンド
はヒト血清に含まれていたヒトＨＭＧ−１によるバンド
であり、「２」のバンドはヒト血清に含まれていたヒト
ＨＭＧ−２によるバンドである。〔これは、別途、ヒト
血清の替わりに、精製して得たウシＨＭＧ−１及びウシ
ＨＭＧ−２をそれぞれ電気泳動して、ウエスタンブロッ
ト法を行い、得られたバンドの位置より確かめておい
た。（ヒトＨＭＧ−１とウシＨＭＧ−１、そしてヒトＨ
ＭＧ−２とウシＨＭＧ−２のアミノ酸配列の相同性は、
それぞれ非常に高いので、電気泳動においてほぼ同じ位
置に泳動される。）〕

【０１９９】（２）対照（コントロール） 前記１の（１）、（２）及び（３）における（１）の
の操作までを行ったもう一枚の各ニトロセルロース膜に
ついて、前記（１）のの操作は行わず、しかし前記
（１）の以下の操作は同様に行って、これを対照（コ
ントロール）とした。

【０２００】この、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒ
トＨＭＧ−２には結合しない抗体も、ヒトＨＭＧ−１と
ヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体をも作用させてい
ない対照（コントロール）においては、ヒトＨＭＧ−１
のバンドが現れる位置及びヒトＨＭＧ−２のバンドが現
れる位置のいずれにおいても何ら発色は認められなかっ
た。このことより、前記の各ウエスタンブロット法にお
いては、非特異的な発色が起きていないことが確かめら
れた。

【０２０１】３．まとめ 図４より、実施例４で調製したヒトＨＭＧ−１とヒトＨ
ＭＧ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗
体）、及び参考例４で調製したヒトＨＭＧ−１とヒトＨ
ＭＧ−２の両方に結合する抗体（ポリクローナル抗体）
では、ヒトＨＭＧ−１が泳動される位置とヒトＨＭＧ−
２が泳動される位置の両方において発色が見られること
が分かる。このことより、ヒト血清中には、ヒトＨＭＧ
−１とヒトＨＭＧ−２の両方が存在することが確かめら
れた。

【０２０２】そして、前記のヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭ
Ｇ−２の両方に結合する抗体（モノクローナル抗体）と
ヒトＨＭＧ−１とヒトＨＭＧ−２の両方に結合する抗体
（ポリクローナル抗体）は、確かにヒトＨＭＧ−１及び
ヒトＨＭＧ−２の両方に結合することが、このウエスタ
ンブロット法の結果より確認できた。

【０２０３】また、図４より、実施例４で調製したヒト
ＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合し
ない抗体（モノクローナル抗体）では、ヒトＨＭＧ−１
が泳動される位置には発色が見られるものの、ヒトＨＭ
Ｇ−２が泳動される位置には発色が見られないことが分
かる。

【０２０４】このことより、前記のヒトＨＭＧ−１には
結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体は、確
かにヒトＨＭＧ−１には結合するものの、ヒトＨＭＧ−
２には結合しないことが、このウエスタンブロット法の
結果より確認できた。

【０２０５】〔参考例１〕（ヒトＨＭＧ−１遺伝子の調
製） ヒトＨＭＧ−１をヒト脳ｃＤＮＡからＤＮＡ増幅を行い
クローン化した。ＰＣＲ産物は、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄ
IIIで修飾し、シークエンス・ベクターのｐＣＡＬ−ｎ
ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、カリフォルニア
州、アメリカ合衆国）のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIサイ
トにサブクローン化し、ＤＮＡ配列の確認を行った。

【０２０６】〔参考例２〕（ＤＮＡ組換え法によるヒト
ＨＭＧ−１の調製） このＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIで修飾されたＰＣＲ産物
をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タン
パク質として発現させるために、ｐＥＸ発現ベクターの
ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIIIサイトにサブクローン化し
た。

【０２０７】次に、このリコンビナントプラスミドを
Ｅ．ｃｏｌｉ・ＪＭ１に、トランスフォームした。トラ
ンスフォームされた細胞を１Ｌ程で培養を行った後、Ｉ
ＰＴＧの誘導をかけ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェ
ラーゼ・ヒトＨＭＧ−１融合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ・ＪＭ１で発現させた。

【０２０８】この発現させたＥ．ｃｏｌｉ・ＪＭ１を集
菌後、３０ｍＬ程度のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
〔１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウ
ム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム及び５．５９ｍ
Ｍリン酸水素二ナトリウムを含む水溶液（ｐＨ７．
２）〕に分散させた。

【０２０９】そして、これを超音波処理により破砕し、
遠心分離後、上澄み液を回収した。この上澄み液中に含
まれるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ・ヒトＨ
ＭＧ−１融合タンパク質をグルタチオン・カラム（ファ
ルマシア社）により精製した。

【０２１０】次に、この精製したグルタチオン−Ｓ−ト
ランスフェラーゼ・ヒトＨＭＧ−１融合タンパク質か
ら、第Ｘａ因子を作用させて、ヒトＨＭＧ−１を切り出
した。以上のＤＮＡ組換え操作により、ヒトＨＭＧ−１
を取得、調製した。

【０２１１】〔参考例３〕（ウシＨＭＧ−１及びウシＨ
ＭＧ−２の調製） ウシの胸腺より、ウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２を
サンダースらの方法〔Ｃ．Ｓａｎｄｅｒｓら，Ｂ．Ｂ．
Ｒ．Ｃ．，７８巻，１０３４〜１０４２頁，１９７７年
発行〕に従って調製した。 まず、ウシの胸腺５００ｇを、１４０ｍＭの塩化ナ
トリウム及び０．５ｍＭのＰＭＳＦを含む６００ｍＬの
緩衝液中で破砕を行った。 次に、この破砕物を遠心分離機で遠心分離を行い、
その上澄み液を除去した。 これに、１４０ｍＭの塩化ナトリウム及び０．５ｍ
ＭのＰＭＳＦを含む緩衝液を加えて撹拌した後、遠心分
離機で遠心分離を行い、その上澄み液を除去した。この
洗浄操作を２回繰り返して行った。 次に、得られた沈殿物に、０．７５Ｍの過塩素酸の
３００ｍＬを加えた。そして、遠心分離機で遠心分離し
た後、上澄み液を分取した。残った沈殿物に０．７５Ｍ
の過塩素酸の４００ｍＬを加えた。これについても、遠
心分離機で遠心分離した後、上澄み液を分取した。この
上澄み液と先に分取した上澄み液とを合わせた。なお、
沈殿物は廃棄した。 前記の合わせた上澄み液に０．７５Ｍの過塩素酸を
加えて、全体の容量を１，０００ｍＬとした。次に、遠
心分離機で遠心分離した後、上澄み液をグラスフィルタ
ー（グレード４）で濾過した。 前記の濾過の濾液に、３，５００ｍＬのアセトンと
２１ｍＬの濃塩酸の混合液を加えた。濁りが生じてくる
ので、遠心分離機で遠心分離して、上澄み液を分取し
た。この上澄み液に、アセトン２，５００ｍＬを加え
た。そして、再度、濁りが生じてくるので、これを遠心
分離機で遠心分離して、上澄み液を分離し、残った沈殿
物を集めた。 この集めた沈殿物を室温で自然乾燥させた。

【０２１２】以上の操作により、ＨＭＧ−１及びＨＭＧ
−２を含むタンパク質画分が、およそ２００ｍｇ得られ
た。 前記のＨＭＧ−１及びＨＭＧ−２を含むタンパク質
画分を、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホ
ウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）の１０ｍＬに溶解
した後、この２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５ｍ
Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で充分に透析
を行った。 この透析の後、７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ９．０）で平衡化しておいたＣＭ−セファデック
スＣ２５のカラムに添加した。

【０２１３】そしてその後、２００ｍＭ塩化ナトリウム
を含む７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．
０）により溶出させて、陽イオン交換クロマトグラフィ
ーを行った。この溶出パターンを図５に示した。なお、
この図において、縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度を示
し、横軸は溶出画分の番号を示す。

【０２１４】[10] そして、２０％ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド電気泳動の結果、その易動度より、図５におい
て「Ａ」で示した溶出画分及び「Ｂ」で示した溶出画分
はウシＨＭＧ−１を含む画分であり、更に「Ｃ」で示し
た溶出画分及び「Ｄ」で示した溶出画分はウシＨＭＧ−
２を含む画分であることが確かめられた。

【０２１５】よって、図５において「Ａ」で示した溶出
画分及び「Ｂ」で示した溶出画分を混合して集め、更に
「Ｃ」で示した溶出画分及び「Ｄ」で示した溶出画分を
混合して集めた。

【０２１６】〔参考例４〕（ポリクローナル抗体の調
製） 参考例３で調製したウシＨＭＧ−１を用いてポリクロー
ナル抗体の調製を下記のようにして行った。 〔１〕 動物への免疫 （１） 前記の参考例３で得たウシＨＭＧ−１を４００
μｇ／ｍＬになるように生理食塩水（０．９％塩化ナト
リウム水溶液）で溶解し、これをフロイント完全アジュ
バントと等量ずつ混合してエマルジョンとして、ウサギ
（北山ラベス社）の腹部皮下に０．５ｍＬを免疫注射し
た。

【０２１７】（２） 初回免疫から２週間後に、前記の
免疫原を３００μｇ／ｍＬになるように生理食塩水で溶
解し、これをフロイント不完全アジュバントと等量ずつ
混合してエマルジョンとして、その０．５ｍＬにより追
加免疫注射を行った。この追加免疫注射は２週間おきに
行った。

【０２１８】（３） 免疫動物であるこのウサギの血清
中の抗体価を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）
にて、初回免疫から６週間目より１週間ごとに測定し
た。このＥＬＩＳＡ法の操作を以下に示した。 参考例３で得たウシＨＭＧ−１を５μｇ／ｍＬにな
るように生理食塩水に溶解し、これを９６ウェル−マイ
クロプレート（ヌンク社製）に１ウェル当り１００μＬ
ずつ加え、３７℃で２時間静置してこのウシＨＭＧ−１
の固相化を行った。 このマイクロプレートを洗浄液（０．０５％ツイー
ン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水
（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭ
リン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム及び
２．６８ｍＭ塩化カリウムを含む水溶液（ｐＨ７．
２）））で洗浄した後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン
酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ
７．２）を１ウェル当り３００μＬずつ加えて、３７℃
で２時間静置してブロッキングを行い、その後再び洗浄
液で洗浄した。 抗体の産生を検査すべき前記ウサギの血清を、生理
食塩水で１，０００倍、１０，０００倍、そして１０
０，０００倍と希釈し、これらをマイクロプレートのウ
ェルに１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して反
応を行わせ、その後洗浄液で洗浄した。 また対照として、前記のマイクロプレートのウェ
ルに、１％ＢＳＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水
を１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して、その
後洗浄液で洗浄した。 パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗ウサギＩｇＧ抗
体（アマシャム社製）を３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生
理食塩水で５，０００倍に希釈した後、及びのマイ
クロプレートに１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７
℃で２時間静置して反応を行わせた。 これを洗浄液で洗浄した後、パーオキシダーゼ反応
液（３ｍＭ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベン
ズチアゾリン−６−スルホン酸）〔ＡＢＴＳ〕を含む５
０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−２４ｍＭクエン酸緩衝
液の１ｍＬに対して２μＬの１．７％過酸化水素を使用
直前に添加したもの）を１ウェル当り１００μＬずつ加
え、室温で反応させた。１５分後に１ウェル当り５０μ
Ｌの６Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた。 これをＥＩＡプレートリーダー（バイオラッド社
製）にて４１５ｎｍにおける吸光度の測定を行った。

【０２１９】（４） 初回免疫から１２週間目以降、抗
体価がプラトーに達したと認められたので、この免疫動
物であるウサギの全採血を行った。そして、このウサギ
の血液より抗血清を得た。 （５） 前記（４）で得た抗血清について、２２〜２５
℃において、この抗血清１ｍＬに対して０．１８ｇの比
率で硫酸ナトリウムを撹拌しながら加え、硫酸ナトリウ
ムが完全に溶けてから更に３０分間撹拌を続けて塩析を
行った。 （６） これを２２〜２５℃で、遠心分離（７０００
ｇ、１５分間）を行い、上澄み液と分離して得た沈殿を
リン酸緩衝生理食塩水の１ｍＬに溶解した。 （７） 次に、これをリン酸緩衝生理食塩水に対して充
分に透析した後、１０００ｇで２０分間遠心分離し不溶
性のものを除去した。 （８） これをリン酸緩衝生理食塩水で平衡化しておい
たＤＥＡＥ−セルロースイオン交換カラム（セルバ社
製）〔１×２．５ｃｍ〕に通して、溶出液を集めた。 （９） 免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が溶出液の素通り
画分に含まれていることを２８０ｎｍの吸光度より確認
し、これを集めて濃縮した。

【０２２０】（１０） 次に、これを参考例２で調製し
たヒトＨＭＧ−１を固定化したカラムに通して、アフィ
ニティークロマトグラフィーを行った。この操作を以下
に示した。 参考例２で調製したヒトＨＭＧ−１の２ｍｇに対し
て１ｇのＣＮＢｒ−セファロース（ファルマシアバイオ
テック社製）をその取扱説明書に従って反応させ、前記
のＨＭＧ−１を固定化したアフィニティークロマトグラ
フィー用のカラムを調製した。 このカラムをリン酸緩衝生理食塩水で平衡化してお
き、その後、前記（９）にて濃縮した成分（ポリクロー
ナル抗体）を通した。 これにリン酸緩衝生理食塩水を充分に通して洗浄し
た後、０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）を通した。 これにより溶出した画分を集め、リン酸緩衝生理食
塩水で透析を行い、その後、濃縮を行った。

【０２２１】以上のアフィニティークロマトグラフィー
の操作により、ヒトＨＭＧ−１に結合するポリクローナ
ル抗体を分取した。

【０２２２】（１１） 以上の操作により得られたウサ
ギのポリクローナル抗体は、ヒトＨＭＧ−１に結合する
ことができるものである。また、ヒトＨＭＧ−１と相同
性の高いヒトＨＭＧ−２とも結合することができるもの
である。

【０２２３】〔実施例１０〕（抗体のヒトＨＭＧ−１及
びヒトＨＭＧ−２との反応性の確認） 実施例４で調製したヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒ
トＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗
体）について、ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２の各
々との反応性をウエスタンブロット法により確かめた。

【０２２４】なお、前記実施例９においては、ヒト血清
に含まれていたヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２と各
抗体との反応性を確かめたが、本実施例においては、ヒ
ト細胞より調製したヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２
と前記抗体との反応性の確認を行った。

【０２２５】１．ウエスタンブロット法 （１）ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を電気泳動し
て転写したものへ、ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒ
トＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗
体）を反応させたウエスタンブロット法 後述する参考例５においてヒト細胞（ＨＬ６０細
胞）より調製したヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を
タイタン・ジェル・リポタンパク質電気泳動キット（ヘ
レナ研究所社製）を用いて電気泳動を行った。なお、支
持体はアガロースゲルであり、これに前記のヒトＨＭＧ
−１及びヒトＨＭＧ−２を各々０．５ｍｇ／ｍＬとなる
ように溶解した２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む７．５
ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）の２μＬを接触させ
た。 そして、泳動緩衝液としてバルビタール緩衝液（ｐ
Ｈ８．８）を使用して、電圧９０Ｖで７５分間通電して
電気泳動を行った。なお、この電気泳動は、同じものを
２セット用意して行い、以下の操作も同様に行った。 前記の電気泳動の後の転写は、ノバ・ブロット・
エレクトロフォレティック・トランスファー・キット
（ファルマシア−エルケービー社製）を用いて、その使
用説明書に従い、ドライ方式で行った。

【０２２６】まず、前記において電気泳動を行ったア
ガロースゲルを転写用装置上に置いた。次に、このアガ
ロースゲルの上に、９ｃｍ×９ｃｍのニトロセルロース
膜（バイオラッド社製）を重ね、４８ｍＭトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン、３９ｍＭグリシン、０．
０３７５％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）及び２０％（Ｖ／Ｖ）メタノールよりなる転写用緩
衝液を用いて、電流６５ｍＡで２時間転写を行った。

【０２２７】 この転写を行ったニトロセルロース膜
を、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９
ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水
素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム及び２．６８ｍ
Ｍ塩化カリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２））の２０ｍ
Ｌに４℃で１晩浸漬して、ブロッキングを行った。 次に、これを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔ
ｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水）の２０ｍ
Ｌ中で１０分間振とう洗浄を行った。この操作を３回行
った。 実施例４で調製した、ヒトＨＭＧ−１には結合する
が、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナ
ル抗体）を２０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水に８０μｇ
溶解し、この溶液に前記の操作を行ったニトロセルロ
ース膜を室温で２時間浸漬して反応させた。 前記の操作を行ったニトロセルロース膜を、２０
ｍＬの洗浄液中で１０分間振とう洗浄を行った。これを
３回行った。 次に、パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体
（ダコ社製）を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩
水で５００倍希釈をして、２０ｍＬの溶液を調製し、こ
れに前記のニトロセルロース膜を室温で２時間浸漬し
て反応させた。 このニトロセルロース膜を、２０ｍＬの洗浄液中で
１０分間振とう洗浄を行った。この操作を３回行った。 [10] ０．０２５％の３，３’−ジアミノベンジジン四
塩酸塩及び０．０１％過酸化水素を含むリン酸緩衝生理
食塩水の２０ｍＬに、前記のニトロセルロース膜を室
温で１５分間浸漬して発色させた。

【０２２８】以上の操作により、実施例４で調製した、
ヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒトＨＭＧ−２には結
合しない抗体（モノクローナル抗体）の、ヒトＨＭＧ−
１及びヒトＨＭＧ−２との反応性に関するウエスタンブ
ロット法の結果を得た。

【０２２９】（２）ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２
を電気泳動して転写したものへ、ヒトＨＭＧ−２に結合
する抗体（ポリクローナル抗体）を反応させたウエスタ
ンブロット法 参考として、前記のヒトＨＭＧ−１には結合するが、ヒ
トＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノクローナル抗
体）に替えて、市販のヒトＨＭＧ−２に結合する抗体
（ポリクローナル抗体）〔品名：Ａｎｔｉ ＨＭＧ−２
（Ｃ−１９），Human、品番：SC-8758、メーカー：サン
タクルズ社（米国）、販売：コスモ・バイオ社〕を前記
（１）のにおいて用いること以外は、前記（１）の
〜[10]の通りに操作を行い、バンドを得て、本ウエスタ
ンブロット法におけるヒトＨＭＧ−２のバンドの位置の
確認に用いた。

【０２３０】（３）ウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２
を電気泳動して転写したものへ、ヒトＨＭＧ−１には結
合するが、ヒトＨＭＧ−２には結合しない抗体（モノク
ローナル抗体）を反応させたウエスタンブロット法 参考として、前記のヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２
に替えて、参考例３においてウシ胸腺より調製したウシ
ＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２の等量混合液を用いるこ
と以外は、前記（１）の〜[10]の通りに操作を行い、
バンドを得て、本ウエスタンブロット法におけるウシＨ
ＭＧ−１のバンドの位置の確認に用いた。

【０２３１】２．実験結果 （１）ウエスタンブロット法の結果 前記１におけるウエスタンブロット法の結果を図６に示
した。なお、この図において、「Ｈ」のレーンは前記
１の（１）のウエスタンブロット法のレーンであり、
「Ｈ」のレーンは前記１の（２）のウエスタンブロッ
ト法のレーンであり、そして、「Ｂ」のレーンは前記
１の（３）のウエスタンブロット法のレーンである。

【０２３２】この図６より、以下のことが分かる。 ・ 「Ｈ」のレーンにおいては、ただ一本のバンドだ
けが認められる。 ・ 「Ｈ」のレーンにおいては、「Ｈ」のレーンに
おけるバンドの位置にはバンドが認められない。 ・ 「Ｈ」のレーンと「Ｂ」のレーンは、同じ位置
にバンドが認められる。

【０２３３】すなわち、 ヒトＨＭＧ−２に結合する抗体（ポリクローナル抗
体）を反応させた「Ｈ」のレーンのバンドの位置に、
「Ｈ」のレーンではバンドが認められないことが分か
る。 ヒト細胞より調製したヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭ
Ｇ−２を泳動させた「Ｈ」のレーンにおいて、ただ一
本のバンドだけが認められ、そのバンドの位置が、ヒト
ＨＭＧ−１と非常に相同性の高いウシＨＭＧ−１及びヒ
トＨＭＧ−２と非常に相同性の高いウシＨＭＧ−２を泳
動させた「Ｂ」のレーンの唯一のバンドの位置と同じ
であることが分かる。

【０２３４】以上のことより、実施例４で調製された抗
体（モノクローナル抗体）は、ヒト細胞より調製したヒ
トＨＭＧ−１に結合し、かつ、ヒト細胞より調製したヒ
トＨＭＧ−２には結合しないことが確かめられた。

【０２３５】（２）対照（コントロール） 前記１の（１）のの操作までを行ったもう一枚のニト
ロセルロース膜について、前記の操作は行わず、しか
し前記以下の操作は同様に行って、これを対照（コン
トロール）とした。前記１の（２）及び（３）において
も、同様に対照（コントロール）を作成した。

【０２３６】これらのいずれの抗体も作用させていない
対照（コントロール）においては、何ら発色は認められ
なかった。このことより、前記の各ウエスタンブロット
法においては、非特異的な発色が起きていないことが確
かめられた。

【０２３７】〔参考例５〕（ヒト細胞よりのヒトＨＭＧ
−１及びヒトＨＭＧ−２の調製） ヒト細胞（ＨＬ６０細胞）より、ヒトＨＭＧ−１及びヒ
トＨＭＧ−２を調製した。 まず、ＲＰＭＩ１６４０にて培養したヒト細胞（Ｈ
Ｌ６０細胞）の培養液の上清の３Ｌを、約２５０ｍＬに
濃縮した。 次に、終濃度が２００ｍＭとなるように、塩化ナト
リウムを添加した。 これを遠心分離機で遠心分離を行い（１０，０００
ｒｐｍ、３０分間）、その上清を分取して、ポアサイズ
０．４５μｍのフィルターで濾過を行った。 この濾液を、ハイトラップ・ヘパリン・カラム（ア
マシャムファルマシア社製）に通した。 このカラムに、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を流して
洗った。 次に、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）にお
いて、塩化ナトリウム濃度が２００ｍＭから２，０００
ｍＭまでのグラジエントをかけて前記カラムより溶出さ
せた。 前記の各溶出画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動にかけ、その易動度よりヒトＨＭＧ−１及びヒト
ＨＭＧ−２を含む画分を同定した。この画分は、塩化ナ
トリウム濃度が５００ｍＭから１，０００ｍＭにあると
きに溶出した画分であった。 前記のヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ−２を含む
画分を、７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．
０）で平衡化しておいたＣＭ−セファデックスＣ２５の
カラムに通した。そしてその後、２００ｍＭ塩化ナトリ
ウムを含む７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９．０）により溶出させて、陽イオン交換クロマトグラ
フィーを行った。 ここで溶出した各画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミド電気泳動にかけ、その易動度よりヒトＨＭＧ−１を
含む画分、及びヒトＨＭＧ−２を含む画分を各々同定し
た。以上の操作により、ヒト細胞（ＨＬ６０細胞）よ
り、ヒトＨＭＧ−１を調製し、また、ヒトＨＭＧ−２を
も調製した

【０２３８】

【発明の効果】本発明の抗体は、ヒトＨＭＧ−１には結
合するが、ヒトＨＭＧ−１と非常に相同性の高いヒトＨ
ＭＧ−２には結合しない抗体である。

【０２３９】また、本発明のヒトＨＭＧ−１の免疫学的
測定試薬は、ＨＭＧ−２を測り込むことがなく、ＨＭＧ
−１だけを測定することができ、かつ測定の操作が簡便
で自動化することも可能な測定試薬である。これによ
り、誤差を含まない正確なＨＭＧ−１の測定値を得るこ
とができ、敗血症等の疾患の診断において、診断を誤ら
せることを防ぐことができるものである。

【０２４０】そして、本発明のヒトＨＭＧ−１の免疫学
的測定方法は、ＨＭＧ−２を測り込むことがなく、ＨＭ
Ｇ−１だけを測定することができ、かつ測定の操作が簡
便で自動化することも可能な測定方法である。これによ
り、誤差を含まない正確なＨＭＧ−１の測定値を得るこ
とができ、敗血症等の疾患の診断において、診断を誤ら
せることを防ぐことができるものである。

【０２４１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SHINO-TEST CORPORATION <120> ANTIBODIES SPECIFICALLY BINDING HUMAN HMG-1 AS WELL AS IMMUNOLOGIC AL METHOD AND REAGENT FOR ASSAYING HUMAN HMG-1 WITH THESE ANTIBODIES <130> P02-0479 <160> 6 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on the amino acid sequence of human HMG-1 <400> 1 Cys Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys 1 5 10 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed peptide based on the amino acid sequence of human HMG-1 <400> 2 Cys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala 1 5 10 15 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala 1 5 10

【０２４２】

【配列表フリーテキスト】配列番号１：ヒトＨＭＧ−１
のアミノ酸配列に基づいて合成したペプチド 配列番号２：ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列に基づいて
合成したペプチド

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＨＭＧ−１のアミノ酸配列の全てについ
て、ホップらの方法により、各アミノ酸残基の親水性の
高さの推定を行った結果を示した図である。

【図２】本発明の免疫学的測定試薬、及び免疫学的測定
方法により、ヒトＨＭＧ−１を含む試料を測定して作成
した検量線を示した図である。

【図３】本発明の免疫学的測定試薬、及び免疫学的測定
方法により、ウシＨＭＧ−１を含む試料を測定して作成
した検量線を示した図である。

【図４】各々の抗体の、ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ
−２との反応性を確かめたウエスタンブロット法の結果
を示した図である。

【図５】ウシＨＭＧ−１及びウシＨＭＧ−２の調製にお
ける陽イオン交換クロマトグラフィーの溶出パターンを
示した図である。

【図６】各々の抗体の、ヒトＨＭＧ−１及びヒトＨＭＧ
−２との反応性を確かめたウエスタンブロット法の結果
を示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 矢ヶ部 恵子 神奈川県相模原市大野台２−29−14 株式 会社シノテスト相模原事業所内 (72)発明者 川原 幸一 鹿児島県鹿児島市桜ケ丘８−35−１ 鹿児 島大学医学部 臨床検査医学講座内 (72)発明者 丸山 征郎 鹿児島県鹿児島市桜ケ丘８−35−１ 鹿児 島大学医学部 臨床検査医学講座内 Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA20 CE04 CE06 CE11 CE12 DA13 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 EA50 FA74 GA06 GA15 GA23 GA26

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト・ハイモビリティーグループプロテ
   イン−１には結合するが、ヒト・ハイモビリティーグル
   ーププロテイン−２には結合しない抗体。
2. 【請求項２】 次式（Ｉ）： Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys （Ｉ） で表されるアミノ酸配列からなるペプチドを免疫原とし
   て調製される請求項１記載の抗体。
3. 【請求項３】 下記の及びの特徴： 次式（Ｉ）： Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys （Ｉ） で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基
   の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施すこと
   により得られるアミノ酸配列からなる、 当該ペプチドを免疫原として抗体を調製した時に、ヒ
   ト・ハイモビリティーグループプロテイン−１には結合
   するが、ヒト・ハイモビリティーグループプロテイン−
   ２には結合しない抗体を得ることができる、を有するペ
   プチドを免疫原として調製される請求項１記載の抗体。
4. 【請求項４】 下記の及びの特徴： 次式（Ｉ）： Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys （Ｉ） で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基
   の欠失、置換、挿入もしくは付加、又は修飾を施すこと
   により得られるアミノ酸配列からなる、 前記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチ
   ドを免疫原として調製された抗体と結合することができ
   る、を有するペプチドを免疫原として調製される請求項
   １記載の抗体。
5. 【請求項５】 モノクローナル抗体である請求項１〜４
   のいずれか１項に記載の抗体。
6. 【請求項６】 試料に含まれるヒト・ハイモビリティー
   グループプロテイン−１を抗原抗体反応を利用して測定
   を行う免疫学的測定方法において、請求項１〜５のいず
   れか１項に記載の抗体を使用することを特徴とする免疫
   学的測定方法。
7. 【請求項７】 試料に含まれるヒト・ハイモビリティー
   グループプロテイン−１を抗原抗体反応を利用して測定
   を行うための免疫学的測定試薬において、請求項１〜５
   のいずれか１項に記載の抗体を含むことを特徴とする免
   疫学的測定試薬。