JP2020186175A - 免疫グロブリンaに結合しているペリオスチン並びに免疫グロブリンaに結合しているペリオスチンに結合する抗体、ペリオスチンの測定方法、ペリオスチンの測定試薬及びペリオスチン測定の正確性の改善方法 - Google Patents
免疫グロブリンaに結合しているペリオスチン並びに免疫グロブリンaに結合しているペリオスチンに結合する抗体、ペリオスチンの測定方法、ペリオスチンの測定試薬及びペリオスチン測定の正確性の改善方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、臨床検査、臨床病理学、免疫学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
また、出原は、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定が特発性間質性肺炎の検査方法としても有用であることを見出した(特許文献2参照。)。
更に、出原らは、ペリオスチンのEMI領域、R1領域、R2領域及びR3領域からなる群から選ばれる少なくとも一つの領域を検出することにより、肺線維症又は間質性肺炎を精度よく検査できることを見出した(特許文献3参照。)。
このため、試料に含まれるペリオスチンの測定値を疾患の検査に利用しようとする場合、この疾患の診断を誤らせる可能性があった。
従って、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定においては、健常者や他の疾患の罹患者との鑑別のため、更なる正確性の改善が望まれていた。
これに対して、本発明の課題は、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンの提供、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体の提供、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応等を利用した測定における、正確性が改善された測定方法及び測定試薬を提供すること、並びに測定の正確性の改善方法を提供することである。
そして、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンと、遊離のペリオスチンとを同程度の親和性で測定するには、この免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を用いることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
(1) 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチン。
(2) 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体。
(3) ペリオスチンのR3領域からR4領域にかけてのいずれかに結合する、前記(2)に記載の抗体。
(4) ペリオスチンのR4領域に結合する、前記(2)又は(3)に記載の抗体。
(5) 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができる、前記(2)〜(4)のいずれかに記載の抗体。
(6) モノクローナル抗体である、前記(2)〜(5)のいずれかに記載の抗体。
(7) 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を用いることを特徴とする、ペリオスチンの測定方法。
(8) 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのR3領域からR4領域にかけてのいずれかに結合する、前記(7)に記載のペリオスチンの測定方法。
(9) 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのR4領域に結合する、前記(7)又は(8)に記載のペリオスチンの測定方法。
(10) 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができる、前記(7)〜(9)のいずれかに記載のペリオスチンの測定方法。
(11) モノクローナル抗体である、前記(7)〜前記(10)のいずれかに記載のペリオスチンの測定方法。
(12) 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を含有することを特徴とする、ペリオスチンの測定試薬。
(13) 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのR3領域からR4領域にかけてのいずれかに結合する、前記(12)に記載のペリオスチンの測定試薬。
(14) 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのR4領域に結合する、前記(12)又は(13)に記載のペリオスチンの測定試薬。
(15) 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができる、前記(12)〜(14)のいずれかに記載のペリオスチンの測定試薬。
(16) モノクローナル抗体である、前記(12)〜(15)のいずれかに記載のペリオスチンの測定試薬。
(17) 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を用いることを特徴とする、ペリオスチン測定の正確性の改善方法。
(18) 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのR3領域からR4領域にかけてのいずれかに結合する、前記(17)に記載のペリオスチン測定の正確性の改善方法。
(19) 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのR4領域に結合する、前記(17)又は(18)のいずれかに記載のペリオスチン測定の正確性の改善方法。
(20) 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができる、前記(17)〜(19)のいずれかに記載のペリオスチン測定の正確性の改善方法。
(21) モノクローナル抗体である、前記(17)〜(20)のいずれかに記載のペリオスチン測定の正確性の改善方法。
これにより、試料中のペリオスチンを正確に測定することができる。
[1]総論
本発明者らは、ヒト血液(血液、血清、血漿)中において、ペリオスチン(分子量:約80KDa)と免疫グロブリンA(分子量:約160KDa)との結合体を初めて見い出した。この免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンは疾患のマーカーとなる可能性がある。
免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンは、ヒトの体液、臓器、又は組織等から調製して得ることができる。
(1) ヒト健常者のプール血清に、1Mリン酸緩衝液(pH7.2)を最終濃度50mMになるように加え、低温庫(5℃)にて撹拌する。
NHS−activated Sepharose 4 Fast Flow 1mLに対し、コントロールラットIgG1mgの割合で結合させる。
・カップリングバッファー:0.2M NaHCO3(pH8.3)
・ブロッキングバッファー:0.1M Tris−HCl(pH8.5)
・洗浄バッファーA:0.1M Tris−HCl(pH8.5)
・洗浄バッファーB:0.5M NaClを含む0.1M CH3COONa(pH4.0)
・検体希釈液:100mM NaCl、0.5% カゼインナトリウム及び0.095%NaN3を含む50mM Tris−HCl(pH8.0)
(1) コントロールラットIgG溶液を限外ろ過フィルターを用いて前記(a)のカップリングバッファーに置換する。
(1) 前記(A)において作成したコントロールラットIgG結合ビーズ1mLを新しい15mLチューブに分取し、更に前記2で取得したアルブミン及び免疫グロブリンGを除去した免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンの粗精製品の全量を加える。
免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンは、抗ペリオスチン抗体(SS18A)結合ビーズを用いて、免疫沈降法により取得する。
(1) 前記(A)の(17)で取得した抗ペリオスチン抗体(SS18A)結合ビーズ1mLを、新しい15mLチューブに分取し、更に前記3の(B)の(4)において取得したアルブミン、IgG及び非特異成分を除去した免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンの粗精製品の全量を加える。
前記(B)の(7)において取得した免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンの精製品を、非還元条件又は還元条件下でSDS−PAGEを行う。そのタンパク染色の結果から、前記精製品の純度は90%であり、そのほとんど全てが免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンであることを確認した。
前記(B)の(7)において取得した免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンの精製品を、非還元条件又は還元条件下でSDS−PAGEを行った。その後、ゲルをPVDF膜へ転写し、抗ペリオスチン抗体(SS17B)又は抗免疫グロブリンA抗体を用いて免疫染色を行う。その結果、非還元条件下において240KDaにペリオスチン及び免疫グロブリンAが検出された。
前記(B)の(7)において取得した免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンの精製品を、非還元条件又は還元条件下でSDS−PAGEを行い、タンパク染色で認められる240KDaのバンドを切り出し、LC/MSにてこのバンド中に含まれるタンパク質を同定する。検出されたタンパク質はペリオスチン及び免疫グロブリンAに由来するペプチドのみであり、この240KDaの複合体は免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンであることを確認した。
本発明における、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンは、ペリオスチンと免疫グロブリンAとが結合したものであれば、特に限定はない。
[1]総論
本発明における抗体は、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体である。
1.免疫原
本発明における免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を産生させるための免疫原について、以下説明を行う。
免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を産生させるための免疫原として、ペリオスチンの全部又は一部を用いることができる。
すなわち、ヒト等由来のペリオスチン、又は遺伝子組み換え操作により得たペリオスチン等のペリオスチンの全部又は一部を用いることができる。
なお、この免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を産生させるための免疫原は、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部又は一部のアミノ酸配列に1ないし数個(通常1〜10個、より好ましくは1〜8個、更に好ましくは1〜6個、特に好ましくは1〜4個、特別に好ましくは1〜2個)のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等であってもよい。
よって、本発明における免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体の免疫原のアミノ酸配列の最小単位としては、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に1ないし数個(通常1〜10個、より好ましくは1〜8個、更に好ましくは1〜6個、特に好ましくは1〜4個、特別に好ましくは1〜2個)のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列の内、連続する3つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を考えることができるので、これらの連続する3つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列からなるトリペプチド、又はこれに他のアミノ酸若しくはペプチドが付加したもの等を、本発明における免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体の免疫原の最小単位として考えることができる。
(a) まず、ペリオスチン(ヌクレオチド配列:核酸データベースGenBankのAccession NumberD13666のヌクレオチド配列;アミノ酸配列:核酸データベースGenBankのAccession NumberBAA02837のアミノ酸配列)にV5/Hisタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるS2細胞において発現させた上で精製する。
pMT/Bip/V5−HisAプラスミド(Invitrogen社、米国カリフォルニア州Carlsbad)にペリオスチンの上記部分をコードするcDNAを挿入して、これをpMT/Bip/periostin−V5−HisAとする。
S2細胞にpMT/Bip/periostin−V5−HisA及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるpAcHygro[Invitrogen社(米国)]を公知の方法で共導入し、形質転換させる。
ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得る。
そして、S2細胞の形質転換体では、カルボキシ末端にV5エピトープ/Hisタグの結合したペリオスチンを発現させる。
ペリオスチン遺伝子安定形質転換体S2細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、S2リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導する。
これにより、S2リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌される。
この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に透析した後、ニッケルレジン(Ni−NTA Agarose)[Qiagen社(ドイツ国)]と混合して、S2リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させる。
レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてS2リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出させる。
溶出されたS2リコンビナントペリオスチンタンパク質をPBS等に透析し、精製されたペリオスチンタンパク質を取得する。
すなわち、ペリオスチンのcDNAを、GEX−KGベクター(“KL.Guanら,Anal.Biochem.,192巻,262〜267頁,1991年発行”)に組み込んで、大腸菌BL21にトランスフェクションする。
これをアンピシリン入りLB培地にて培養し、菌体よりグルタチオンセファロース4B[GE Healthcare社(英国)]により、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)を付加したペリオスチンを精製する。
これにトロンビンにてGSTを切断し、GSTを付加しないペリオスチンを取得する。
これをブラッドフォード法にて定量して、その量(濃度)が明確となったペリオスチンを取得することができる。
また、非天然型アミノ酸の導入、各アミノ酸残基の化学修飾やシステイン残基を導入することにより分子内を環化させて構造を安定化させる等の修飾を施してもよい。
また、ニトロセルロース粒子、ポリビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に免疫原を吸着させたものを免疫原とすることもできる。
免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、以下の操作により調製することができる。
(マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ロバ、若しくはラクダなど)又は鳥類(ニワトリ、アヒル、若しくはダチョウなど)等に免疫する。
また、前記のノックアウト動物においては、その動物の体内でペリオスチンが生産されないため、免疫されたペリオスチンを異物と認識し易く、よって抗体の産生が高くなるためである。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、化学合成アジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知のものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
この追加免疫注射の回数としては、2〜6回が一般的である。
この場合も、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をELISA法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して抗体を含む抗血清を得る。
免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体、すなわち、モノクローナル抗体である免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、以下の操作により調製することができる。
また、前記のノックアウト動物においては、その動物の体内でペリオスチンが生産されないため、免疫されたペリオスチンを異物と認識し易く、よって抗体の産生が高くなるためである。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、化学合成アジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内、足蹠又は背部等の部位に行えばよい。
この追加免疫注射の回数としては2〜6回が一般的である。
この場合も前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
ミエローマ細胞がHGPRT欠損株又はTK欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地(HAT培地)を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞の融合細胞(ハイブリドーマ)のみを選択的に培養し、増殖させることができる。
また、このモノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より本発明における、モノクローナル抗体である免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を得ることもできる。
1.総論
本発明のペリオスチンの測定方法は、ペリオスチンの測定方法であって、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を用いることを特徴とするものである。これにより、試料中に含まれるペリオスチンの存在又は存在量を測定することができる。
本発明のペリオスチンの測定方法は、試料に含まれるペリオスチンを抗原抗体反応を利用して測定する測定方法であって、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を用いることを特徴とするものであれば、特にその測定原理に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。
また、本発明のペリオスチンの測定方法における測定は、用手法により行ってもよく、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
本発明における試料としては、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、腹水若しくは羊水などの体液;あるいは血管若しくは肝臓などの臓器、組織又は細胞などの抽出液等、ペリオスチンが含まれる可能性のある生体試料等の試料であれば対象となる。
例えば、試料を免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体と接触させ、結合させる前に、試料に希釈液を添加することにより希釈処理を行ってもよい。
この希釈液として、各種水系溶媒を用いることができる。
例えば、水、生理食塩水又はトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液〔Tris緩衝液〕、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。
なお、この緩衝液のpHについては、pH5〜pH10の範囲にあることが好ましい。
本発明において、測定対象物質はペリオスチンである。
このペリオスチンには、ペリオスチンの一量体、ペリオスチンの二量体、三量体、四量体、・・・などのペリオスチンの多量体、又はペリオスチンの分解物(例えば、分子量約40KDaのペリオスチンの分解物など)等が含まれるが、いずれも本発明における測定対象物質となるものである。
本発明のペリオスチンの測定方法における測定を、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法、すなわち標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施するときには、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる固相化抗体及び標識抗体の少なくともいずれか一方が、この免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体であればよい。
なお、前記の免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体と固相担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により吸着、結合させて抗体を固相担体に固定化することができる。
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第53号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」,臨床病理刊行会,1983年発行;日本生化学会編「新生化学実験講座1 タンパク質IV」,東京化学同人,1991年発行等に記載の公知の方法に従い、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
また、蛍光免疫測定法の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。
そして、放射免疫測定法の場合には、トリチウム、ヨウ素125又はヨウ素131等を用いることができる。
また、発光免疫測定法においては、NADH−FMNH2−ルシフェラーゼ系、ルミノール−過酸化水素−POD系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相化抗体=ペリオスチン」を介して固相担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料に含まれていたペリオスチンの量(濃度)のみを測定することができる。
また、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度等を、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量等を測定する。
そして、発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量等を測定する。
本発明のペリオスチンの測定方法における測定を、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定方法により実施する場合には、すなわち、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法(凝集反応法)により実施する場合には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる抗体が免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体である必要がある。
これらの容器の溶液収容部分(マイクロプレートのウェル等)の底面は、U型、V型又はUV型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。
また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と「固相担体に固定化させた免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体等の抗体」を反応させ、凝集の状態を目視的に測定する。
なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。
例えば、まず、「免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を固定化した固相担体」を含有する測定試薬、又は「免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を固定化した固相担体」を含有する測定試薬及び「水系溶媒」を含有する測定試薬等を調製し、準備する。
なお、測定波長は、340nmから1,000nmの中から選ばれるのが一般的である。
測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置(専用機)であってもよい。
第1試薬:
緩衝液(水系溶媒)
第2試薬:
「免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を固定化したラテックス粒子」を含有する緩衝液
なお、試料と第1試薬の混合比率(量比)は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温(1℃〜30℃)又は微温(30℃〜40℃)の範囲内の一定温度であることが好ましい。(例えば、37℃等)
これにより、「免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を固定化したラテックス粒子」と試料とを接触させる。
なお、第2試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
また、前記の静置時の温度は、室温(1℃〜30℃)又は微温(30℃〜40℃)の範囲内の一定温度であることが好ましい。(例えば、37℃等)
そして、前記の静置の時間は、1分以上、かつ10分以下の一定時間であることが好ましく、3分以上、かつ5分以下の一定時間であることがより好ましい。
本発明のペリオスチンの測定方法においては、溶媒として、各種の水系溶媒を用いることができる。
この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液〔Tris緩衝液〕、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。
この緩衝液のpHについては、適宜適当なpHを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、pH3〜pH12の範囲内のpHを選択して用いることが一般的である。
そして、これらを測定に用いる際の濃度は特に限定されるものではないが、0.001〜10%(W/V)が好ましく、特に0.01〜5%(W/V)が好ましい。
1.総論
本発明のペリオスチンの測定試薬は、ペリオスチンの測定試薬であって、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を含有することを特徴とするものである。これにより、試料中に含まれるペリオスチンの存在又は存在量を測定することができる。
本発明における試料については、前記「〔3〕ペリオスチンの測定方法」の「3.試料」に記載した通りである。
本発明における測定対象物質については、前記「〔3〕ペリオスチンの測定方法」の「4.測定対象物質」に記載した通りである。
本発明のペリオスチンの測定試薬は、試料に含まれるペリオスチンを抗原抗体反応を利用して測定する測定試薬であって、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を含有するものであれば、特にそのペリオスチン測定の測定原理に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。
また、本発明のペリオスチンの測定試薬による測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
この場合、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、その一つの測定試薬に含有される。
この場合、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、二つ以上の測定試薬の内の一つの測定試薬に含有されるものであってもよく、また、二つ以上の測定試薬に含有されるものであってもよい。
また、本発明のペリオスチンの測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料に含まれるペリオスチンの測定に使用することもできる。
本発明のペリオスチンの測定試薬が、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法、すなわち標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法を測定原理とする場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施する時には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる固相化抗体及び標識抗体の少なくともいずれか一方の抗体が免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体である必要がある。
本発明のペリオスチンの測定試薬が、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定方法により実施する場合には、すなわち、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法(凝集反応法)を測定原理とする場合には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる抗体が免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体である必要がある。
これらの容器の溶液収容部分(マイクロプレートのウェル等)の底面は、U型、V型又はUV型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。
1.総論
本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法は、ペリオスチンの測定において、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を用いることを特徴とするものである。
本発明における試料については、前記「〔3〕ペリオスチンの測定方法」の「3.試料」に記載した通りである。
本発明における測定対象物質については、前記「〔3〕ペリオスチンの測定方法」の「4.測定対象物質」に記載した通りである。
本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法としては、試料に含まれるペリオスチンの抗原抗体反応を利用した測定において、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を使用するものが好ましいが、この免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を使用するものであれば、特にその測定原理に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。
また、本発明のペリオスチン測定の正確性の改善方法におけるペリオスチン測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
この場合、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、その一つの測定試薬に含有される。
この場合、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体は、二つ以上の測定試薬の内の一つの測定試薬に含有されるものであってもよく、また、二つ以上の測定試薬に含有されるものであってもよい。
ペリオスチンを調製した。
ペリオスチン(ヌクレオチド配列:核酸データベースGenBankのAccession NumberD13666のヌクレオチド配列、アミノ酸配列:核酸データベースGenBankのAccession NumberBAA02837のアミノ酸配列)にV5/Hisタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるS2細胞において発現させた上で精製した。
pMT/Bip/V5−HisAプラスミド[Invitrogen社(米国)]にペリオスチンの上記部分をコードするcDNAを挿入して、これをpMT/Bip/periostin−V5−HisAとした。
そして、S2細胞の形質転換体では、カルボキシ末端にV5/Hisタグの結合したペリオスチンを発現させた。
まず、ペリオスチン遺伝子安定形質転換体S2細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、S2リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導した。
これにより、S2リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌された。
次に、レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてS2リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出することにより、ペリオスチンを取得した。
なお、作成したプラスミドのDNAの配列を確認し、組み込まれた配列が目的通りのものであることを確認した。
免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンは、健常者(N=22)のプール血清(300mL)を用いて調製した。
図1に示した方法により、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンの調製及びその同定を行った。
(1) ヒト健常者のプール血清300mLをビーカーに移し、スターラーバーを入れ、1Mのリン酸緩衝液(pH7.2)を最終濃度が50mMになるように加え、低温庫(5℃)にて撹拌した。
NHS−activated Sepharose 4 Fast Flow 1mLに対し、コントロールラットIgG1mgの割合で結合させた。
・カップリングバッファー:0.2M NaHCO3(pH8.3)
・ブロッキングバッファー:0.1M Tris−HCl(pH8.5)
・洗浄バッファーA:0.1M Tris−HCl(pH8.5)
・洗浄バッファーB:0.5M NaClを含む0.1M CH3COONa(pH4.0)
・検体希釈液:100mM NaCl、0.5% カゼインナトリウム及び0.095%NaN3を含む50mM Tris−HCl(pH8.0)
(1) コントロールラットIgG溶液を限外ろ過フィルターを用いて前記(a)のカップリングバッファーに置換した。
(1) 前記(A)において作成したコントロールラットIgG結合ビーズ1mLを新しい15mLチューブに分取し、更に前記2で取得したアルブミン及び免疫グロブリンGを除去した免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンの粗精製品の全量を加えた。
免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンは、抗ペリオスチン抗体(SS18A)結合ビーズを用いて、免疫沈降法により取得する。
(1) 前記(A)の(17)で取得したF(ab’)2化した抗ペリオスチン抗体(SS18A)結合ビーズ1mLを、新しい15mLチューブに分取し、更に前記3の(B)の(4)において取得したアルブミン、IgG及び非特異成分を除去した免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンの粗精製品の全量を加えた。
この回収率は元のペリオスチン量に対して約80%であり、十分な回収率を示した。
前記(B)の(7)において取得した免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンの精製品を、非還元条件又は還元条件下でSDS−PAGEを行った。
このSDS−PAGEのタンパク染色の結果を図2に示した。
このタンパク染色の結果から、前記精製品の純度は90%であり、そのほとんど全てが免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンであることを確認した。
前記(B)の(7)において取得した免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンの精製品を、非還元条件又は還元条件下でSDS−PAGEを行った。
その後、ゲルをPVDF膜へ転写し、抗ペリオスチン抗体(SS19C)又は抗免疫グロブリンA抗体を用いて免疫染色を行った。
このウエスタンブロッティングの結果も図2に示した。
その結果、非還元条件下において240KDaにペリオスチン及び免疫グロブリンAが検出された。
前記(B)の(7)において取得した免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンの精製品を、非還元条件下でSDS−PAGEを行い、タンパク染色で認められる240KDaのバンドを切り出し、液体クロマトグラフィー−質量分析法にてこのバンド中に含まれるタンパク質を同定した。
検出されたタンパク質は、ペリオスチン及び免疫グロブリンAに由来するペプチドのみであり、この240KDaの複合体は免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンであることを確認した。
免疫グロブリンAに結合しているペリオスチン(240KDa)中のタンパク質を、以下の手順に従って、液体クロマトグラフィー−質量分析法(LC−MS)を用いて同定した。
(1) 前記実施例1で取得した、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチン(240KDa)の精製品に、終濃度で20mMになるように100mMジチオトレイトール(DTT)溶液を添加し、95 ℃で10 分間加温した。
(1) 前記1で調製した精製試料から抽出されたペプチドを、液体クロマトグラフィーシステム Prominence UFLC[島津製作所社(日本国)]を用いて分析した。
移動相A:移動相B = 99.5:0.5(0分)→ 移動相A:移動相B = 50:50(70分)→ 移動相A:移動相B = 0:100(75分)→ 移動相A:移動相B = 0:100(80分)
(1) 質量分析は、Triple TOF 5600+システム(m/z100−2000[AB SCIEX社(米国)]を、液体クロマトグラフィーシステムに接続し実施した。
液体クロマトグラフィー−質量分析法(LC−MS)による測定の結果、複数のペプチド由来のピークが得られた。
ペプチドの質量情報を基にタンパク質検索を行った結果、ペリオスチン及び免疫グロブリンAに由来するタンパク質のみが検出された。
これを表2に示す。
各抗ペリオスチンモノクローナル抗体の遊離ペリオスチン及び免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンそれぞれに対する親和性を、Biacore X−100[GE Healthcare社(英国)]を用いて、表面プラズモン共鳴法により検証した。
この検証には、表3に示した13種類の抗ペリオスチンモノクローナル抗体を用いた。
前記1の13種類の抗ペリオスチンモノクローナル抗体の遊離ペリオスチン及び免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンそれぞれに対する親和性を以下に示す方法で測定した。
また、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンは、前記実施例1で取得したものを用いた。
前記1の13種類の抗ペリオスチンモノクローナル抗体の遊離ペリオスチン(リコンビナントペリオスチンモノマー)又は免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに対する結合速度定数(ka)及び解離速度定数(kd)並びに解離定数(KD)を表4に示した。
抗ペリオスチン抗体(SS18A)[R1領域を認識]、抗ペリオスチン抗体(SS17B)[R4領域を認識]、抗ペリオスチン抗体(SS19A)[R4領域を認識]、及び抗ペリオスチン抗体(SS16A)[R3領域を認識]をそれぞれ固相化したペリオスチン測定ELISAキットを各々作製し、遊離ペリオスチン及び免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンを測定した。
(a)試料1:前記実施例1で取得した免疫グロブリンAに結合しているペリオスチン
(b)試料2:前記(a)の試料1に終濃度1mMになるようにジチオトレイトール(DTT)を加えて還元して作製した、前記試料1と同濃度の遊離ペリオスチン
(a)従来発明による測定[SS18A×SS19C]
(1) 抗ペリオスチンモノクローナル抗体(SS18A)[ペリオスチンのR1領域を認識し結合する抗体]を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)[137mMの塩化ナトリウム、2.68mMの塩化カリウム、1.47mMのリン酸二水素カリウム、及び8.04mMのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液(pH7.4)]により2μg/mLとなるように希釈し、これを96穴マイクロタイタープレートの各ウェルに100μLずつ注入した後、25℃で18時間静置し、抗ペリオスチンモノクローナル抗体(SS18A)をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。
前記(a)の(1)における抗ペリオスチンモノクローナル抗体(SS18A)[ペリオスチンのR1領域を認識し結合する抗体]を、抗ペリオスチンモノクローナル抗体(SS17B)[ペリオスチンのR4領域を認識し結合する抗体]に替えること以外は、前記(a)の(1)〜(12)の測定操作の通り操作を行って、前記1の(a)の試料1及び前記1の(b)の試料2に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。
前記(a)の(1)における抗ペリオスチンモノクローナル抗体(SS18A)[ペリオスチンのR1領域を認識し結合する抗体]を、抗ペリオスチンモノクローナル抗体(SS19A)[ペリオスチンのR4領域を認識し結合する抗体]に替えること以外は、前記(a)の(1)〜(12)の測定操作の通り操作を行って、前記1の(a)の試料1及び前記1の(b)の試料2に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。
前記(a)の(1)における抗ペリオスチンモノクローナル抗体(SS18A)[ペリオスチンのR1領域を認識し結合する抗体]を、抗ペリオスチンモノクローナル抗体(SS16A)[ペリオスチンのR3領域を認識し結合する抗体]に替えること以外は、前記(a)の(1)〜(12)の測定操作の通り操作を行って、前記1の(a)の試料1及び前記1の(b)の試料2に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。
測定結果を表6に示した。
これにより試料中のペリオスチンを正確に測定することができる。
これにより試料中のペリオスチンを正確に測定することができる。
免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンにおけるペリオスチンと免疫グロブリンAとの結合様式を検証した。
また、ジャカリン結合ビーズはPierce Jacalin Agarose[Thermo Fisher Scientific社(米国)]を用いた。
(1) 抗ペリオスチン抗体(SS18A)溶液、抗ペリオスチンモノマー抗体(SS19D)溶液、抗免疫グロブリンG(IgG)抗体溶液[Abcam社(英国)]、抗免疫グロブリンM(IgM)抗体溶液[Abcam社(英国)]、及び抗免疫グロブリンA(IgA)抗体溶液[Abcam社(英国)]を、限外ろ過フィルターを用いてカップリングバッファー[0.2M NaHCO3(pH8.3)]に置換した。
(1) 1mLの検体希釈液[100mM NaCl、0.5% カゼインナトリウム及び0.095%NaN3を含む50mM Tris−HCl(pH8.0)]を、1.5mLマイクロテストチューブに分注した。
免疫沈降処理前後の上清中のペリオスチン濃度は、Periostin ELISA Kit(Human)[シノテスト社(日本国)]を用いて測定した。
免疫沈降後のペリオスチン濃度又は免疫グロブリンA濃度を、免疫沈降前のペリオスチン濃度又は免疫グロブリンA濃度でそれぞれ除することで、特異抗体による回収率を算出した。
それぞれの特異抗体によって結合した、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンの回収率を図3に示す。
また、免疫グロブリンAも80%以上が除去されたことから、ペリオスチンは免疫グロブリンAと結合していることが確認された。
この抗体を用いた場合は、ペリオスチン及び免疫グロブリンAともに回収率が低かった。
Claims (21)
- 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチン。
- 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体。
- ペリオスチンのR3領域からR4領域にかけてのいずれかに結合する、請求項2に記載の抗体。
- ペリオスチンのR4領域に結合する、請求項2又は請求項3に記載の抗体。
- 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができる、請求項2〜請求項4のいずれかに記載の抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項2〜請求項5のいずれかに記載の抗体。
- 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を用いることを特徴とする、ペリオスチンの測定方法。
- 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのR3領域からR4領域にかけてのいずれかに結合する、請求項7に記載のペリオスチンの測定方法。
- 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのR4領域に結合する、請求項7又は請求項8に記載のペリオスチンの測定方法。
- 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができる、請求項7〜請求項9のいずれかに記載のペリオスチンの測定方法。
- モノクローナル抗体である、請求項7〜請求項10のいずれかに記載のペリオスチンの測定方法。
- 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を含有することを特徴とする、ペリオスチンの測定試薬。
- 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのR3領域からR4領域にかけてのいずれかに結合する、請求項12に記載のペリオスチンの測定試薬。
- 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのR4領域に結合する、請求項12又は請求項13に記載のペリオスチンの測定試薬。
- 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができる、請求項12〜請求項14のいずれかに記載のペリオスチンの測定試薬。
- モノクローナル抗体である、請求項12〜請求項15のいずれかに記載のペリオスチンの測定試薬。
- 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体を用いることを特徴とする、ペリオスチン測定の正確性の改善方法。
- 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのR3領域からR4領域にかけてのいずれかに結合する、請求項17に記載のペリオスチン測定の正確性の改善方法。
- 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、ペリオスチンのR4領域に結合する、請求項17又は請求項18のいずれかに記載のペリオスチン測定の正確性の改善方法。
- 免疫グロブリンAに結合しているペリオスチンに結合する抗体が、免疫グロブリンAに結合しているペリオスチン、及び遊離のペリオスチンのそれぞれに対して同程度の親和性で結合することができる、請求項17〜請求項19のいずれかに記載のペリオスチン測定の正確性の改善方法。
- モノクローナル抗体である、請求項17〜請求項20のいずれかに記載のペリオスチン測定の正確性の改善方法。
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JP2019089607A JP7475584B2 (ja) | 2019-05-10 | 2019-05-10 | 免疫グロブリンaに結合しているペリオスチン並びに免疫グロブリンaに結合しているペリオスチンに結合する抗体、ペリオスチンの測定方法、ペリオスチンの測定試薬及びペリオスチン測定の正確性の改善方法 |
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PLOS ONE, vol. Vol.12, No.3, e0174547, JPN6023009375, 29 March 2017 (2017-03-29), pages 1 - 17, ISSN: 0005026729 * |
アレルギー, vol. Vol.68, No.4/5, JPN6023009376, 5 May 2019 (2019-05-05), pages 528, ISSN: 0005026728 * |
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