WO2018194134A1 - 抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチン測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗体の安定化方法 - Google Patents

抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチン測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗体の安定化方法 Download PDF

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antibody
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immobilized
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雅之 ▲高▼井
純也 小野
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株式会社シノテスト
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals

Definitions

  • the present invention relates to an anti-periostin antibody immobilization carrier, a periostin measurement reagent, and an anti-periostin antibody immobilization used for measurement of periostin (also referred to as osteoblast-specific factor 2 or OSF2) that can be a marker for allergic diseases and other diseases.
  • periostin also referred to as osteoblast-specific factor 2 or OSF2
  • the present invention relates to a method for stabilizing a carrier.
  • the present invention is useful in the field of life science such as clinical examination, clinical pathology, immunology and medicine, and in the field of chemistry such as analytical chemistry.
  • Periostin is an extracellular matrix protein, and is composed of an EMI region, an R1 region, an R2 region, an R3 region, an R4 region, and a C-terminal region in this order from the N-terminal side to the C-terminal side. It has been disclosed that measurement of the expression level is useful as a test method for allergic diseases, and an invention of a test method for allergic diseases has been disclosed (see Patent Document 1 and Non-Patent Document 1). It has also been disclosed that measurement of the expression level of the periostin gene is useful as a test method for idiopathic interstitial pneumonia (see Patent Document 2).
  • a polyclonal antibody, a monoclonal antibody against OSF2 (periostin), a diagnostic method using these antibodies, etc. are disclosed (see Patent Document 5), and a novel osteoblast-specific transcription factor named Osf2 / Cbfa1
  • An immunoassay using an anti-OSF2 (periostin) antibody is disclosed (see Patent Document 6)
  • a purified antibody that specifically binds to human periostin, and breast cancer bone using this antibody A diagnostic assay method for examining metastasis and the like is disclosed (see Patent Document 7), and an antibody against periostin having anti-cell adhesion activity and a method for quantifying periostin using this antibody are disclosed (see Patent Document 8). .
  • the periostin measurement reagent used for the measurement of periostin useful for the examination of various diseases as described above is not always stable, and its stabilization has been desired.
  • the anti-periostin antibody in the periostin measurement reagent is in a dry state, it becomes extremely unstable, and its stabilization has been desired.
  • the problems of the present invention are to provide a stabilized anti-periostin antibody immobilization carrier, to provide a stabilized periostin measurement reagent, and to stabilize an antibody in an anti-periostin antibody immobilization carrier. Is to provide a method. In particular, it is to provide a method for stabilizing an anti-periostin antibody in an anti-periostin antibody immobilization carrier placed in a dry state.
  • the inventors of the present invention have studied the anti-periostin antibody-immobilized carrier, the periostin measurement reagent, and the stabilization method of the anti-periostin antibody used in the anti-periostin antibody.
  • the present inventors have found that the above problems can be solved by bringing a surfactant and arginine or a salt thereof, or a surfactant, sugar and arginine or a salt thereof into contact with each other, and have completed the present invention.
  • this invention consists of the following invention.
  • An anti-periostin antibody-immobilized carrier in which an anti-periostin antibody is immobilized on a carrier, and the anti-periostin antibody immobilized on the carrier is contacted with a stabilizing substance selected from the following (1) to (3) An anti-periostin antibody-immobilized carrier characterized by being made.
  • (1) Surfactant and sugar (2) Surfactant and arginine or salt thereof (3) Surfactant, sugar and arginine or salt thereof
  • Periostin comprising the anti-periostin antibody immobilization carrier according to [1] above Measuring reagent.
  • a method for stabilizing an anti-periostin antibody in an anti-periostin antibody-immobilized carrier in which an anti-periostin antibody is immobilized on a carrier, wherein the anti-periostin antibody immobilized on this carrier includes the following (1) to (3) A method for stabilizing an anti-periostin antibody in an anti-periostin antibody-immobilized carrier, characterized by contacting a selected stabilizing substance.
  • (1) Surfactant and sugar (2) Surfactant and arginine or salt thereof
  • Surfactant, sugar and arginine or salt thereof Surfactant, sugar and arginine or salt thereof
  • Anti-periostin antibody immobilization carrier of the present invention periostin measurement reagent, and anti-periostin antibody immobilization method in anti-periostin antibody immobilization carrier, anti-periostin antibody immobilization carrier, periostin measurement reagent, and anti-periostin antibody immobilization
  • An anti-periostin antibody in a carrier is stabilized.
  • it is suitable for stabilizing the anti-periostin antibody in the carrier for immobilizing the anti-periostin antibody in a dry state.
  • the anti-periostin antibody-immobilized carrier, the periostin measurement reagent, and the anti-periostin antibody in the anti-periostin antibody-immobilized carrier can be used for a long period of time, and the periostin is accurate for a long period of time.
  • a measurement can be provided.
  • the anti-periostin antibody-immobilized carrier in the present invention is an anti-periostin antibody-immobilized carrier in which an anti-periostin antibody is immobilized on a carrier.
  • the present invention is characterized in that a stabilizing substance selected from the following (1) to (3) is contacted. (1) Surfactant and sugar (2) Surfactant and arginine or salt thereof (3) Surfactant, sugar and arginine or salt thereof
  • the anti-periostin antibody-immobilized carrier of the present invention is stabilized by the above configuration.
  • Anti-periostin antibody Antibody The anti-periostin antibody in the present invention is an antibody that specifically binds to periostin.
  • the anti-periostin antibody is not particularly limited as long as it can specifically bind to periostin.
  • anti-periostin antibody examples include monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, antisera, antibody fragments (such as Fab and F (ab ′) 2 ) that can bind to periostin, single-chain antibodies (scFv), and the like. Can be mentioned.
  • This anti-periostin antibody is an antibody (such as a chimeric antibody, humanized antibody, or fully humanized antibody) that has been changed to an amino acid sequence of an animal species different from the animal that immunizes the immunogen by genetic recombination technology or the like. Also good.
  • the anti-periostin antibody is preferably a monoclonal antibody.
  • two or more kinds of anti-periostin antibodies may be used.
  • immunogen for producing the anti-periostin antibody in the present invention will be described below.
  • an immunogen for producing an anti-periostin antibody in the present invention all or a part of periostin can be used. That is, all or part of periostin such as periostin derived from humans or mammals such as cows, pigs, dogs, cats, mice or rats, or birds such as chickens, or periostin obtained by gene recombination can be used. .
  • the anti-periostin antibody in the present invention can be obtained.
  • the immunogen for producing this anti-periostin antibody is 1 to several (usually 1 to 8, preferably 1 to 6, more preferably 1 to the whole or a part of the amino acid sequence of periostin). It may be a peptide or protein containing an amino acid sequence obtained by performing deletion, substitution, insertion, addition or modification of ⁇ 4 (particularly preferably 1 to 2) amino acid residues.
  • the minimum unit of the amino acid sequence of the immunogen of the anti-periostin antibody in the present invention is 1 to several in the whole or part of the amino acid sequence of periostin, or in the whole or part of the amino acid sequence of these amino acid sequences.
  • amino acid residues By deletion, substitution, insertion, addition or modification of 1 (usually 1 to 8, preferably 1 to 6, more preferably 1 to 4, particularly preferably 1 to 2) amino acid residues Since an amino acid sequence consisting of three consecutive amino acid residues can be considered in the obtained amino acid sequence, a tripeptide consisting of an amino acid sequence consisting of these three consecutive amino acid residues, or another amino acid or A peptide added, etc. can be considered as the minimum immunogen unit of the anti-periostin antibody in the present invention. .
  • a peptide comprising an amino acid sequence obtained by performing deletion, substitution, insertion, addition or modification of amino acid residues preferably 1 to 6, more preferably 1 to 4, particularly preferably 1 to 2
  • proteins and the like can be obtained by extracting, purifying, and the like from body fluids such as humans, cells, tissues, or organs by a known method.
  • the method for obtaining a peptide or protein containing all or part of the amino acid sequence of periostin is not particularly limited, and any method may be used, for example, obtaining by a known method. Can do.
  • periostin a recombinant periostin protein obtained by adding a V5 / His tag to periostin (base sequence of polynucleotide: Accession Number D13666 of nucleic acid database GenBank; amino acid sequence: Accession Number BAA02837 of nucleic acid database GenBank) in S2 cells which are insect cells Purify after expression.
  • a transformant of S2 cells is prepared as follows.
  • a cDNA encoding the above-mentioned part of periostin is inserted into the pMT / Bip / V5-HisA plasmid (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA), and this is designated as pMT / Bip / periostin-V5-HisA.
  • PAcHygro Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA
  • a transformant is selected with hygromycin to obtain a stable transformant.
  • periostin in which V5 epitope / His tag is bound is expressed at the carboxy terminus.
  • S2 recombinant periostin protein Purification of the S2 recombinant periostin protein is performed as follows. The expression of S2 recombinant periostin protein is induced by adding copper sulfate to the medium of periostin gene stable transformant S2 cells. As a result, the S2 recombinant periostin protein is expressed and secreted into the culture supernatant. The culture supernatant is dialyzed against phosphate buffered saline (PBS) and then mixed with nickel resin (Ni-NTA Agarose, Qiagen, Hilden, Germany) to bind S2 recombinant periostin protein to the resin.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the resin is washed to remove impurities, and the S2 recombinant periostin protein is eluted with an imidazole-containing buffer.
  • the eluted S2 recombinant periostin protein is dialyzed against PBS or the like to obtain purified human periostin protein.
  • Human periostin can also be obtained by the following method. That is, periostin cDNA is incorporated into a GEX-KG vector (“KL. Guan et al., Anal. Biochem., 192, 262-267, published in 1991”) and transfected into E. coli BL21. This is cultured in an LB medium containing ampicillin, and periostin to which glutathione S-transferase (GST) has been added is purified from the cells by glutathione sepharose 4B (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). To this, GST is cleaved with thrombin, and periostin without GST is obtained. This can be quantified by the Bradford method to obtain human periostin whose amount (concentration) has been clarified.
  • GST glutathione S-transferase
  • human periostin can also be obtained, for example, by the method described in “I. Takayama et al., J. Biochem., 146, 5, 713-723, 2009”.
  • the EMI region of human periostin is, for example, “I. Kii et al., J. Biol. Chem., 285, No. 3, pp. 2028-2039, 2010” or “T. Maruhashi et al., J. Biol. Biol. Chem., 285, No. 17, 13294-13303, published in 2010 ”and the like.
  • the R1 region, R2 region or R3 region of human periostin is obtained by the method described in “I. Takayama et al., J. Biochem, Vol. 146, No. 5, pages 713 to 723, issued in 2009”, etc. Can be acquired.
  • amino acid sequences of the R4 region and C-terminal region of human periostin are described in “I. Takayama et al., J. Biochem, Vol. 146, No. 5, pages 713 to 723, published in 2009” and the like, respectively. It can be obtained by.
  • the immunogen can be synthesized by a peptide synthesis method such as a liquid phase method and a solid phase method, and an automatic peptide synthesizer may also be used.
  • Chemistry IV Tokyo Kagaku Doujin, 1975, Izumiya et al.“ Peptide Synthesis Fundamentals and Experiments ”, Maruzen, 1985, edited by the Japanese Biochemical Society,“ Sequel Biochemistry Laboratory 2 Under Protein Chemistry ”, Tokyo Kagaku Doujin, 1987 It can be synthesized according to the method described in the year etc., and it is also easy to produce a mutant in which the amino acid sequence is deleted, substituted, inserted or added.
  • modifications such as introduction of unnatural amino acids, chemical modification of each amino acid residue, or cyclization of the interior of the molecule by introduction of cysteine residues to stabilize the structure may be performed.
  • the immunogen may be prepared from DNA or RNA having a corresponding nucleobase sequence by using genetic engineering technology, edited by the Japanese Biochemical Society, “Second Life Chemistry Experiment Course 1 Gene Research Method I”, Tokyo Chemical. Doujin, 1986, Japan Biochemical Society, “Sequential Biochemistry Experiment Course 1 Gene Research Method II”, Tokyo Chemical Doujin, 1986, Japan Biochemical Society, “Sequence Biochemistry Experiment Course 1 Gene Research Method III”, Tokyo Chemistry Doujin, What is necessary is just to prepare with reference to 1987 grade
  • the immunogen when the immunogen is a low-molecular substance, it is common to immunize an animal or the like with a carrier (carrier) bound to the immunogen, but a peptide having 5 amino acids is used as an immunogen. Since there is also a report (Kiyama et al., “Abstract 3 of the 112th Annual Meeting of the Japanese Pharmaceutical Society”, page 122, published in 1992) that a specific antibody was produced, it is not essential to use a carrier.
  • the carriers include mussel hemocyanin (KLH), bovine serum albumin (BSA), chicken serum albumin, poly-L-lysine, polyalanyl lysine, Known carriers such as dipalmityl lysine, tetanus toxoid or polysaccharide can be used.
  • the immunogen and carrier binding methods include glutaraldehyde method, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide method, maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester method, bisdiazotized benzidine method or N-succimidyl- Known coupling methods such as the 3- (2-pyridyldithio) propionic acid method can be used.
  • suck to carriers such as a nitrocellulose particle
  • a polyclonal antibody which can specifically bind to periostin that is, an anti-periostin antibody which is a polyclonal antibody can be prepared by the following operation.
  • the immunogen for producing this polyclonal antibody anti-periostin antibody
  • the above-mentioned immunogen can be used.
  • the immunogen or the conjugate of the immunogen and a carrier can be used for mammals (mouse, guinea pig, hamster, rabbit, rat, sheep, goat, cow, horse, donkey, camel, etc.) or birds ( Immunize chicken, duck or ostrich).
  • a gene related to periostin production in the body is inactivated or deleted, that is, related to periostin production. More preferred are animals that have knocked out the gene.
  • periostin produced in the animal's body binds to anti-periostin antibody produced in the body by immunization with an immunogen such as periostin, thereby reducing the antibody activity of the anti-periostin antibody. This is because the possibility is low in the knockout animals. In the knockout animal, since periostin is not produced in the body of the animal, it is easy to recognize the immunized periostin as a foreign substance, and thus the production of antibodies is increased.
  • mice in which a gene involved in periostin production is inactivated or deleted include, for example, knockout mice for periostin (“H. Rios et al., Molecular and Cellular Biology, Vol. 25, No. 24, 11131-11144, 2005”. Year issue ").
  • the immunization amount of the immunogen or the conjugate of the immunogen and the carrier is determined by the immunogen, the carrier, the type of the immunized animal, the immunization injection site, and the like.
  • 0.1 ⁇ g to 5 mg of the immunogen or a combination of the immunogen and a carrier is injected once per animal.
  • the immunogen or the combined immunogen and carrier is preferably added and mixed with an adjuvant for immunization injection.
  • an adjuvant known ones such as Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, aluminum hydroxide adjuvant, chemical synthesis adjuvant or pertussis adjuvant can be used. Immunization may be performed at a site such as subcutaneous, intravenous, intraperitoneal or back.
  • booster injections of the immunogen or the conjugate of the immunogen and the carrier are given at sites such as subcutaneous, intravenous, intraperitoneal or back at intervals of 1 to 2 weeks.
  • the number of booster injections is generally 2 to 6 times.
  • the immunogen or the conjugate of the immunogen and the carrier is preferably boosted by adding an adjuvant and mixing.
  • the antibody titer in the serum of the immunized animal is repeatedly measured by ELISA or the like. When the antibody titer reaches a plateau, whole blood is collected, and the serum is separated to obtain an antiserum containing the antibody.
  • the antiserum is subjected to antibody purification by a salting-out method using ammonium sulfate, sodium sulfate or the like, ion exchange chromatography, gel filtration method or affinity chromatography, or a combination of these methods to obtain a polyclonal antibody.
  • a polyclonal antibody (anti-periostin antibody which is a polyclonal antibody) capable of binding to periostin can be obtained.
  • a carrier is added to the obtained polyclonal antibody solution to remove aggregates generated, or the carrier is immobilized on an insolubilized solid phase and removed by affinity chromatography. Can do.
  • a monoclonal antibody that can bind to periostin that is, an anti-periostin antibody that is a monoclonal antibody can be prepared by the following procedure.
  • This monoclonal antibody can be used to produce antibodies such as hybridomas by the cell fusion method of Keller et al. (G. Koehler et al., Nature, Vol. 256, pages 495-497, issued in 1975) or tumorigenic cells by viruses such as Epstan-Barr virus. It can be obtained by cells.
  • preparation of a monoclonal antibody by a cell fusion method can be performed by the following operation.
  • the immunogen or the combined immunogen and carrier is used for mammals (mouse, hamster, rat, rabbit, etc., for example, inbred mouse BALB / c) or birds (chicken, etc.) Immunize).
  • a gene related to periostin production in the body is inactivated or deleted, that is, related to periostin production. More preferred are animals in which the gene has been knocked out.
  • periostin produced in the animal's body binds to anti-periostin antibody produced in the body by immunization with an immunogen such as periostin, thereby reducing the antibody activity of the anti-periostin antibody. This is because the possibility is low in the knockout animals. In the knockout animal, since periostin is not produced in the body of the animal, it is easy to recognize the immunized periostin as a foreign substance, and thus the production of antibodies is increased.
  • mice in which the gene involved in periostin production is inactivated or deleted include, for example, knockout mice for periostin (“H. Rios et al., Mol. Cell. Biol., 25, 24, 11131-11144). , 2005 ”)).
  • the immunity of the immunogen or the conjugate of the immunogen and the carrier is appropriately determined according to the type of immunized animal, the site of immunization, etc.
  • 0.1 ⁇ g to 5 mg of the immunogen or a combination of the immunogen and a carrier is immunized at a time.
  • the immunogen or the conjugate of the immunogen and the carrier is preferably immunized by adding an adjuvant and mixing.
  • adjuvants such as Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, aluminum hydroxide adjuvant, chemical synthesis adjuvant, and pertussis adjuvant can be used as the adjuvant. Immunization may be carried out at sites such as subcutaneous, intravenous, intraperitoneal, footpad or back.
  • booster injections of the immunogen or the conjugate of the immunogen and the carrier are given to sites such as subcutaneous, intravenous, intraperitoneal, footpad or back at intervals of 1 to 2 weeks. .
  • the number of booster injections is generally 2 to 6 times.
  • the immunogen or the combined immunogen and carrier is preferably boosted by adding an adjuvant and mixing.
  • the antibody titer in the serum of the immunized animal is repeatedly measured by ELISA, etc.
  • the immunogen or the combined immunogen and carrier A solution dissolved in physiological saline (0.9% sodium chloride aqueous solution) is injected intravenously or intraperitoneally to obtain final immunization.
  • Cell fusion can be performed using a fusion promoter such as polyethylene glycol (PEG) of various molecular weights, liposomes or Sendai virus (HVJ), or by electrofusion.
  • a fusion promoter such as polyethylene glycol (PEG) of various molecular weights, liposomes or Sendai virus (HVJ)
  • PEG polyethylene glycol
  • HVJ Sendai virus
  • the hybridoma culture supernatant thus obtained is used for humans or animals such as cows, pigs, dogs, cats, mice, rats or chickens (for example, humans when used for measurement of human periostin) Derived from bovine periostin, preferably bovine derived, and preferably used from dog periostin, preferably derived from dog periostin)
  • bovine periostin preferably bovine derived, and preferably used from dog periostin, preferably derived from dog periostin
  • a hybridoma that produces a “monoclonal antibody capable of binding to periostin is measured by an immunoassay such as an ELISA method or a Western blot method using a peptide or the like. Can be selected.
  • the production cell line of the anti-periostin antibody that is a monoclonal antibody in the present invention can be isolated and obtained.
  • the monoclonal antibody-producing cell line can be cultured in an appropriate medium, and the antiperiostin antibody, which is a monoclonal antibody in the present invention, can be obtained from the culture supernatant.
  • a serum medium or the like may be used, and in this case, it is preferable in that the antibody can be easily purified, and a medium such as DMEM medium, RPMI 1640 medium, or ASF medium 103 can be used.
  • this monoclonal antibody-producing cell line is a monoclonal antibody according to the present invention, which is injected into the abdominal cavity of a mammal that is compatible therewith and previously stimulated with pristane, etc. Anti-periostin antibodies can also be obtained.
  • the thus obtained anti-periostin antibody which is a monoclonal antibody, is obtained by methods such as salting out using ammonium sulfate, sodium sulfate, etc., ion exchange chromatography, gel filtration or affinity chromatography, or these methods.
  • the anti-periostin antibody which is a purified monoclonal antibody can be obtained by combining, for example.
  • the culture supernatant of the obtained hybridoma is subjected to ELISA or Western blotting using a protein or peptide comprising all or part of periostin of an animal such as human or dog.
  • the hybridoma which produces the anti-periostin antibody which is a monoclonal antibody can be selected by measuring by immunological measuring methods, such as.
  • anti-periostin antibody that is a monoclonal antibody is an antibody that can specifically bind to periostin.
  • Anti-periostin antibody immobilization carrier Carrier The carrier in the present invention immobilizes an anti-periostin antibody.
  • the carrier is not particularly limited as long as it can immobilize the anti-periostin antibody.
  • Examples of the carrier include polystyrene, polycarbonate, polyvinyl toluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, polyacrylamide, latex, liposome, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, glass, metal, ceramics, or magnetic substance.
  • Examples of the carrier include a microcapsule, a bead, a microplate (microtiter plate), a test tube, a stick, and a test piece made of the above materials.
  • the carrier examples include polystyrene, styrene-styrene sulfonate copolymer, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer, vinyl chloride-acrylate copolymer, vinyl acetate-acrylic acid copolymer, Acrolein, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth) acrylic acid copolymer, styrene-butadiene copolymer, methacrylic acid polymer, acrylic acid polymer, latex, gelatin, liposome, microcapsule, red blood cell, Examples thereof include a carrier such as particles made of a material such as silica, alumina, carbon black, metal compound, metal, ceramics or magnetic material.
  • Immobilization of anti-periostin antibody to carrier There is no particular limitation on the immobilization of anti-periostin antibody to the carrier in the present invention as long as it can be immobilized.
  • the anti-periostin antibody can be immobilized on the carrier by adsorbing and binding the anti-periostin antibody and the carrier by a known method such as physical adsorption, chemical binding, or a combination thereof.
  • the anti-periostin antibody and the carrier are mixed and brought into contact with a solution such as a buffer solution, or the anti-periostin antibody dissolved in the buffer solution is brought into contact with the carrier. Etc.
  • the anti-periostin antibody and carrier are divalent cross-linking reagents such as glutaraldehyde, carbodiimide, imide ester or maleimide. And contact with each other, and reacting with the amino group, carboxyl group, thiol group, aldehyde group, hydroxyl group, etc. of the anti-periostin antibody and the carrier, respectively.
  • bovine serum albumin human is immobilized on the surface or inner wall of the carrier on which the anti-periostin antibody is immobilized.
  • Serum albumin (HSA) casein, gelatin, egg white albumin or a salt thereof, or a known method such as contact with a non-fat dry milk powder or the like, and a carrier blocking treatment (masking treatment) Also good.
  • the anti-periostin antibody-immobilized carrier in the present invention is an anti-periostin antibody-immobilized carrier in which an anti-periostin antibody is immobilized on a carrier, and the anti-periostin antibody immobilized on this carrier includes the following (1) to (3) A stabilizing substance selected from the group consisting of: (1) Surfactant and sugar (2) Surfactant and arginine or salt thereof (3) Surfactant, sugar and arginine or salt thereof
  • the method of contacting the stabilizing substance of the present invention with the anti-periostin antibody immobilized on a carrier is not limited. Well, there is no particular limitation.
  • the solution containing the stabilizing substance in the present invention is contacted by pouring it onto the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, or the solution containing the stabilizing substance in the present invention is immobilized on the carrier.
  • the contact method for example, the solution containing the stabilizing substance in the present invention is contacted by pouring it onto the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, or the solution containing the stabilizing substance in the present invention is immobilized on the carrier.
  • Examples thereof include a method in which the antiperiostin antibody is brought into contact with the antiperiostin antibody, or the antiperiostin antibody immobilized on the carrier is impregnated with the solution containing the stabilizing substance in the present invention and brought into contact.
  • the sugar in bringing the surfactant and sugar into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, the sugar is used after contacting the surfactant with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier.
  • the antiperiostin antibody immobilized on the carrier may be contacted with the saccharide and then the surfactant may be contacted, or the antiperiostin antibody immobilized on the carrier may be contacted with the surfactant and the saccharide simultaneously. May be.
  • the surfactant and the sugar are simultaneously contacted with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, or the surfactant is contacted after the sugar is contacted with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier. More preferably, the antiperiostin antibody immobilized on the carrier is brought into contact with the saccharide and then the surfactant is brought into contact therewith.
  • a surfactant in bringing a surfactant and arginine or a salt thereof into contact with an anti-periostin antibody immobilized on a carrier, a surfactant is added to the anti-periostin antibody immobilized on a carrier.
  • Arginine or a salt thereof may be contacted after contact, an anti-periostin antibody immobilized on a carrier may be contacted with a surfactant after contact with arginine or a salt thereof, or anti-periostin immobilized on a carrier.
  • a surfactant and arginine or a salt thereof may be simultaneously contacted with the periostin antibody.
  • the surfactant and arginine or a salt thereof are simultaneously contacted with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier, or the sugar is contacted with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier and then the surfactant is contacted. It is preferable that the antiperiostin antibody immobilized on the carrier is contacted with arginine or a salt thereof, and more preferably the surfactant is contacted.
  • the order of contacting the surfactant, sugar and arginine or salt thereof with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier is not limited. Then, two or more stabilizing substances according to the present invention selected from a surfactant, sugar and arginine or a salt thereof may be brought into contact with an anti-periostin antibody immobilized on a carrier at the same time.
  • a surfactant with an anti-periostin antibody immobilized on a carrier after contacting sugar and arginine or a salt thereof simultaneously or separately.
  • surfactant surfactant examples of the surfactant in the present invention include nonionic surfactants, anionic surfactants, cationic surfactants, and amphoteric surfactants.
  • nonionic surfactant examples include the following.
  • (D) Amides or amine compounds such as fatty acid diethanolamide, N, N-bis-2-hydroxyalkylamine, polyoxyethylene alkylamine, triethanolamine fatty acid ester, or trialkylamine oxide.
  • anionic surfactant examples include the following.
  • Aliphatic compound carboxylates such as aliphatic monocarboxylates, N-acyloylsarcosine salts, N-acyloyl- ⁇ -alanine salts, or N-acyloyl glutamates; or cyclics such as abietic acid salts Compound carboxylate.
  • Aliphatic compound sulfonates such as dialkylsulfosuccinate, alkanesulfonate, or hydroxyalkanesulfonate; linear alkylbenzenesulfonate, alkyl (branched) benzenesulfonate, alkylnaphthalenesulfonate , Cyclic sulfonates such as alkylphenoxy polyoxyethylene propyl sulfonate, polyoxyethylene alkyl phenol sulfonate, or naphthalene sulfonate-formaldehyde condensate; or N-methyl-N-oleyl taurine sodium, or N -Nitrogen-containing sulfonates such as disodium alkylsulfosuccinic acid monoamide.
  • An aliphatic compound sulfate such as a polyoxyethylene alkylphenyl ether sulfate, or a cyclic compound sulfate such as a polyoxyethylene styryl phenyl ether sulfate.
  • Aliphatic phosphate salts such as alkyl phosphate salts or polyoxyethylene alkyl ether phosphate salts; or cyclic compound phosphate salts such as polyoxyethylene alkyl phenyl ether phosphate salts.
  • cationic surfactant examples include the following.
  • Aliphatic compound amine salts such as monoalkylamine salts, dialkylamine salts, or trialkylamine salts.
  • Aliphatic compound quaternary ammonium salt such as tetraalkylammonium salt; or trialkylbenzylammonium salt, alkylpyridinium salt, 2-alkyl-1-alkyl-1-hydroxyethylimidazolinium salt, or N, N -Quaternary ammonium salts of cyclic compounds such as dialkylmorpholinium salts.
  • Polyethylene polyamine derivatives such as polyethylene polyamine aliphatic amide salts, salts of polyethylene polyamine aliphatic amide urea condensates, or quaternary ammonium salts of polyethylene polyamine aliphatic amide urea condensates.
  • amphoteric surfactants include the following.
  • Carboxybetaine compounds such as N, N-dimethyl-N-alkyl-N-carboxyalkylene ammonium betaine.
  • aminocarboxylic acid compounds such as N, N-dialkylaminoalkylenecarboxylates.
  • a sulfobetaine compound such as N, N, N-trialkyl-N-sulfoalkyleneammonium betaine.
  • Imidazoline compounds such as 2-alkyl-1-hydroxyethyl-1-carboxymethylimidazolinium salts.
  • surfactant only one type of surfactant may be used, or two or more types of surfactants may be used in combination.
  • a nonionic surfactant is preferable, polyoxyethylene sorbitan fatty acid partial ester is more preferable, and polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate is particularly preferable.
  • the concentration of the surfactant when the surfactant is brought into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier is not particularly limited, but is 0.001% (w / v) or more at the time of the contact. It is preferable.
  • the lower limit of the preferable concentration of the surfactant during the contact is more preferably 0.005% (w / v) or more, still more preferably 0.01% (w / v) or more, and particularly preferably. Is 0.05% (w / v) or more.
  • the upper limit of the preferable concentration of the surfactant during the contact is more preferably 1% (w / v) or less, and particularly preferably 0.5% (w / v) or less.
  • a surfactant When a surfactant is brought into contact with an anti-periostin antibody immobilized on a carrier, when a solution (reagent) containing the surfactant is used, the anti-periostin antibody immobilized on the carrier is brought into contact with the surfactant. Sometimes, it is preferable to contain the surfactant in the solution (reagent) so that the concentration of the surfactant becomes the above-mentioned concentration.
  • the temperature at the time of this contact is a temperature above the temperature at which the solution containing the surfactant freezes, and may be any suitable temperature.
  • the temperature at the time of contact is preferably 2 to 40 ° C, more preferably 2 to 30 ° C, further preferably 2 to 20 ° C, and particularly preferably 2 to 10 ° C.
  • the contact time may be appropriately set for a suitable time, but is usually preferably 6 hours or longer, more preferably 12 hours or longer, and particularly preferably 18 hours or longer.
  • the contact time is preferably within 20 days, more preferably within 15 days, and more preferably within 10 days, from the viewpoint that the cost increases due to longer work time. It is particularly preferable to do this.
  • Examples of the method for bringing the anti-periostin antibody into a dry state include freeze-drying, vacuum drying, drying with air, and natural drying, and natural drying is preferable.
  • sugar in the present invention examples include monosaccharides, disaccharides, trisaccharides, tetrasaccharides, and oligosaccharides.
  • examples of the saccharide in the present invention include those containing, for example, tricarbon sugar, tetracarbon sugar, pentose sugar, hexose sugar or the like as a constituent component.
  • sugar in the present invention more specifically, for example, glucose, galactose, arabinose, xylose, erythrose, fructose, ribulose, fucose, mannose, rhamnose, ribose, xylose, sucrose (saccharose), trehalose, isotrehalose, Examples thereof include lactose, maltose, cellobiose, isomaltose, fructooligosaccharide, galactooligosaccharide, and dairy oligosaccharide.
  • sucrose and trehalose are more preferable, and sucrose is particularly preferable.
  • the concentration of sugar when bringing the sugar into contact with the anti-periostin antibody immobilized on the carrier is not particularly limited, but it is preferably 0.1% (w / v) or more at the time of contact.
  • concentration of the sugar at the time of the said contact becomes like this. More preferably, it is 0.5% (w / v) or more, More preferably, it is 1% (w / v) or more, Most preferably, it is 5% ( w / v) or more.
  • the upper limit of the preferable concentration of the sugar at the time of the contact is more preferably 15% (w / v) or less, and particularly preferably 10% (w / v) or less.
  • the temperature at the time of the contact may be a temperature that is higher than the temperature at which the solution containing sugar freezes, and may be any suitable temperature.
  • the temperature at the time of contact is preferably 2 to 40 ° C, more preferably 2 to 30 ° C, further preferably 2 to 20 ° C, and particularly preferably 2 to 10 ° C.
  • the contact time may be suitably set for a suitable time, but is usually preferably 6 hours or longer, more preferably 12 hours or longer, and particularly preferably 18 hours or longer. There is no particular upper limit on the contact time. However, if it is forcibly cited, the contact time is preferably within 20 days, more preferably within 15 days, and more preferably within 10 days, from the viewpoint that the cost increases due to longer work time. It is particularly preferable to do this.
  • Examples of the method for bringing the anti-periostin antibody into a dry state include freeze-drying, vacuum drying, drying with air, and natural drying, and natural drying is preferable.
  • arginine may be either L-arginine or D-arginine.
  • examples of the arginine salt include hydrochloride.
  • the concentration of arginine or a salt thereof when contacting arginine or a salt thereof with an anti-periostin antibody immobilized on a carrier is not particularly limited, but is preferably 10 mM or more at the time of the contact.
  • concentration of the arginine or its salt at the time of the said contact becomes like this. More preferably, it is 50 mM or more, More preferably, it is 100 mM or more, Especially preferably, it is 200 mM or more.
  • arginine or a salt thereof at the time of the contact, there is no particular upper limit, but considering the cost and the like, 850 mM is sufficient.
  • the upper limit of the preferred concentration of arginine or a salt thereof at the time of contact is more preferably 700 mM or less, and particularly preferably 500 mM or less.
  • arginine or a salt thereof is brought into contact with an anti-periostin antibody immobilized on a carrier
  • a solution (reagent) containing arginine or a salt thereof is used, the anti-periostin antibody and arginine or a salt thereof immobilized on the carrier are used.
  • the temperature at the time of this contact is a temperature higher than the temperature at which the solution containing arginine or a salt thereof freezes, and may be any suitable temperature.
  • the temperature at the time of contact is preferably 2 to 40 ° C, more preferably 2 to 30 ° C, further preferably 2 to 20 ° C, and particularly preferably 2 to 10 ° C.
  • the contact time may be appropriately set for a suitable time, but is usually preferably 6 hours or longer, more preferably 12 hours or longer, and particularly preferably 18 hours or longer.
  • the contact time is preferably within 20 days, more preferably within 15 days, and more preferably within 10 days, from the viewpoint that the cost increases due to longer work time. It is particularly preferable to do this.
  • Examples of the method for bringing the anti-periostin antibody into a dry state include freeze-drying, vacuum drying, drying with air, and natural drying, and natural drying is preferable.
  • the measurement reagent for periostin of the present invention comprises the above-mentioned carrier for immobilizing an anti-periostin antibody.
  • the periostin measurement reagent of the present invention is stabilized by the above-described configuration.
  • the Periostin Measuring Reagent of the present invention includes the above-described anti-periostin antibody-immobilized carrier. However, as long as it is such, the measuring principle is not particularly limited, and the expected effect It plays.
  • the measurement reagent for periostin of the present invention is a measurement reagent for measuring periostin contained in a sample using an antigen-antibody reaction with an anti-periostin antibody.
  • a measurement reagent for measuring periostin contained in this sample using an antigen-antibody reaction with an anti-periostin antibody for example, enzyme immunoassay (ELISA, EIA), fluorescence immunoassay (FIA), radiation Immunoassay (RIA), Luminescent immunoassay (LIA), Enzyme antibody method, Fluorescent antibody method, Immunochromatography method, Immunoturbidimetric method, Latex turbidimetric method, Latex agglutination method, Red blood cell agglutination method, Particle aggregation
  • a method Enzyme-linked Ligandsorbent Assay
  • any method such as a sandwich method, a competitive method, or a homogeneous method (homogeneous method) can be applied to the measurement using the measurement reagent of periostin of the present invention.
  • the measurement of the periostin measurement reagent of the present invention may be performed by a method, or may be performed using an apparatus such as an analyzer.
  • the periostin measurement reagent of the present invention may be composed of two or more measurement reagents.
  • aqueous solvents can be used as the solvent for the measurement reagent for periostin of the present invention.
  • aqueous solvent examples include water, physiological saline and the like, or tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer [Tris buffer], phosphate buffer, or phosphate buffered saline. And various buffer solutions.
  • an appropriate pH may be selected and used as appropriate. Although there is no particular limitation, it is general to select and use a pH within the range of pH 5 to pH 10.
  • the periostin measurement reagent of the present invention includes proteins such as bovine serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA), casein or a salt thereof, and various metals such as calcium ions. Ions; Various salts such as calcium salts; Nonfat dry milk; Various animal sera such as normal rabbit serum; Various preservatives such as sodium azide or antibiotics; Activating substances; Reaction promoting substances; Sensitivity increasing substances such as polyethylene glycol; or In addition, one kind or two or more kinds such as a nonspecific reaction inhibitor may be appropriately contained.
  • proteins such as bovine serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA), casein or a salt thereof, and various metals such as calcium ions. Ions; Various salts such as calcium salts; Nonfat dry milk; Various animal sera such as normal rabbit serum; Various preservatives such as sodium azide or antibiotics; Activating substances; Reaction promoting substances; Sensitivity increasing substances such as polyethylene glycol; or In
  • the concentration of these in the periostin measurement reagent of the present invention is not particularly limited, but is preferably 0.001 to 10% (w / v), particularly 0.01 to 5% (w / V) is preferred.
  • the periostin measuring reagent of the present invention can be sold alone or used for measuring periostin contained in a sample.
  • the measurement reagent for periostin of the present invention can be sold in combination with other reagents, or used for measurement of periostin contained in a sample.
  • Examples of the other reagent include a buffer solution, a sample diluent, a reagent diluent, a reagent containing a labeling substance, a reagent containing a substance that generates a signal such as color development, or calibration (calibration). And reagents containing these substances.
  • the measurement reagent for periostin of the present invention is preferably a measurement reagent kit.
  • Anti-periostin antibody in the measurement reagent for periostin of the present invention, in addition to the anti-periostin antibody in the anti-periostin antibody-immobilized carrier, the antibody described in the above section "[1] Anti-periostin antibody” can be used, for example, the following antibodies can be used.
  • an antibody capable of specifically binding to periostin ii) a polyclonal antibody capable of specifically binding to periostin
  • both of these antibodies need to be anti-periostin antibodies.
  • the immobilized antibody is an anti-periostin antibody immobilized on the carrier.
  • the anti-periostin antibody described above may contain not only one type but also a plurality of types.
  • Measurement reagent based on immunological measurement method using labeled antibody as measurement principle includes enzyme immunoassay, fluorescence immunoassay, radioimmunoassay, luminescence immunoassay, immunochromatography, etc.
  • the measurement principle is an immunological measurement method using a labeled antibody of the above, that is, a measurement method using an antigen-antibody reaction using a labeled antibody, the sandwich method or the competitive method can be used.
  • the immobilized antibody anti-periostin antibody immobilized on the carrier
  • the labeled antibody are anti-periostin antibodies.
  • peroxidase POD
  • alkaline phosphatase ALP
  • ⁇ -galactosidase urease
  • catalase glucose oxidase
  • lactate dehydrogenase or amylase should be used in the case of enzyme immunoassay.
  • fluorescein isothiocyanate fluorescein isothiocyanate, tetramethylrhodamine isothiocyanate, substituted rhodamine isothiocyanate, dichlorotriazine isothiocyanate, or the like can be used.
  • a measurement reagent for radioimmunoassay tritium, iodine 125, iodine 131, or the like can be used.
  • NADH-FMNH 2 -luciferase system, luminol-hydrogen peroxide-POD system, acridinium ester system, dioxetane compound system, etc. can be used as a measuring reagent for luminescence immunoassay.
  • colloidal gold particles can be used.
  • anti-periostin antibody and labeling substances such as enzymes
  • the binding method of anti-periostin antibody and labeling substances is published in 1983 by the Japanese Society of Clinical Pathology, Special Issue on Clinical Pathology No. 53, Immunoassay for Clinical Examination -Technology and Applications, published in 1983.
  • the anti-periostin antibody and the labeling substance are selected from two types such as glutaraldehyde, carbodiimide, imide ester or maleimide.
  • the binding can be carried out by mixing and bringing into contact with a valent crosslinking reagent and reacting with the amino group, carboxyl group, thiol group, aldehyde group or hydroxyl group of the anti-periostin antibody and the labeling substance.
  • the operation method of the measurement is a known method or the like (Japan Clinical Pathology Society, “Special Issue on Extraordinary Clinical Pathology No. 53, Immunoassay for Clinical Examination -Technology and Applications”, published by Clinical Pathology, 1983; edited by Yuji Ishikawa et al. "Enzyme Immunoassay", 3rd edition, Medical School, published in 1987; Kitagawa Tsuneki et al., Edited by "Protein Nucleic Acid Enzyme Volume No.31, Enzyme Immunoassay", Kyoritsu Shuppan, published in 1987) .
  • This anti-periostin antibody-immobilized carrier has been obtained by subjecting an anti-periostin antibody immobilized on a carrier to contact with a stabilizing substance selected from the following (1) to (3).
  • a stabilizing substance selected from the following (1) to (3).
  • a measurement reagent for enzyme immunoassay for example, an enzyme labeled with an antibody is reacted with a substrate under the optimum conditions, and the amount of the enzyme reaction product is measured by an optical method or the like.
  • the fluorescence intensity or the like by a fluorescent substance label is measured
  • the radioimmunoassay measurement reagent the radiation dose or the like by a radioactive substance label is measured.
  • the amount of luminescence by the luminescence reaction system is measured.
  • the anti-periostin antibody described above may be used not only in one type but also in a plurality of types.
  • the measurement reagent for periostin of the present invention is immune complex aggregation such as latex turbidimetric method, latex agglutination method, erythrocyte agglutination method or particle agglutination method.
  • immune complex aggregation such as latex turbidimetric method, latex agglutination method, erythrocyte agglutination method or particle agglutination method.
  • a phosphate buffer, glycine buffer, tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (Tris buffer), Good buffer, or the like can be used as a solvent.
  • a reaction accelerator such as polyethylene glycol or a nonspecific reaction inhibitor may be included.
  • the particle size of the latex particles used as a carrier is not particularly limited, but the latex particles are bonded via a measurement target substance (periostin) and aggregated.
  • the average particle size of the latex particles is preferably 0.04 to 1 ⁇ m for reasons such as the degree of formation of the particles and the ease of measurement of the generated aggregates.
  • the concentration of the latex particles to which the anti-periostin antibody is immobilized includes the concentration of periostin in the sample and the anti-periostin antibody on the latex particle surface. Since the optimum concentration differs depending on various conditions such as the distribution density, the particle size of latex particles, and the mixing ratio of the sample and the measuring reagent, it cannot be generally stated.
  • the concentration of latex particles on which the “periostin antibody” is immobilized is 0.005 to 1% (w / v) in the reaction mixture. It is preferable to include “latex particles on which anti-periostin antibody is immobilized” at such a concentration as described above in the measurement reagent.
  • the particle size of the particles used as the carrier is not particularly limited, but the average particle size is It is preferably in the range of 0.01 to 100 ⁇ m, more preferably in the range of 0.5 to 10 ⁇ m.
  • the specific gravity of these particles is preferably in the range of 1 to 10, and more preferably in the range of 1 to 2.
  • a container used for the measurement when an indirect agglutination reaction method such as a latex agglutination reaction method an erythrocyte agglutination reaction method or a particle agglutination reaction method is used as a measurement principle, for example, glass, polystyrene, polyvinyl chloride, polymethacrylate, etc.
  • a test tube, a microplate (microtiter plate), a tray, and the like for example, glass, polystyrene, polyvinyl chloride, polymethacrylate, etc.
  • a test tube, a microplate (microtiter plate), a tray, and the like a test tube, a microplate (microtiter plate), a tray, and the like.
  • the bottom surface of the solution storage portion (such as a well of a microplate) of these containers preferably has a shape having an inclination from the center to the periphery of the bottom, such as U-type, V-type, or
  • the measuring operation can be performed by a known method.
  • the sample is reacted with an “anti-periostin antibody immobilized on a carrier”, and the endpoint method or rate method is used.
  • the endpoint method or rate method is used.
  • transmitted light and scattered light In the case of visual measurement, the sample and the “anti-periostin antibody immobilized on a carrier” are reacted in the container such as a plate or a microplate, and the state of aggregation is visually measured.
  • a periostin measurement reagent containing the “anti-periostin antibody immobilization carrier” of the present invention is prepared and prepared.
  • This anti-periostin antibody-immobilized carrier has been obtained by subjecting an anti-periostin antibody immobilized on a carrier to contact with a stabilizing substance selected from the following (1) to (3).
  • a stabilizing substance selected from the following (1) to (3) (1) Surfactant and sugar (2) Surfactant and arginine or salt thereof (3) Surfactant, sugar and arginine or salt thereof
  • a periostin measurement reagent containing an “anti-periostin antibody-immobilized carrier” and a sample are mixed, thereby bringing the anti-periostin antibody of the “anti-periostin antibody-immobilized carrier” into contact with the sample.
  • the measurement of the generated complex aggregate should be performed by measuring the absorbance of the reaction mixture, such as transmitted light or scattered light, in the measurement reaction in which the complex aggregate is present by the endpoint method or the rate method. To implement.
  • the measured value such as absorbance obtained by measuring the sample was compared with the measured value such as absorbance obtained by measuring the standard substance (sample with known periostin concentration), and was included in the sample.
  • concentration (quantitative value) of periostin is calculated.
  • the measurement of absorbance such as transmitted light or scattered light may be performed by measuring transmitted light or scattered light, and may be one-wavelength measurement or two-wavelength measurement (two It may be a difference or ratio depending on the wavelength.
  • the measurement wavelength is generally selected from 340 nm to 1,000 nm.
  • the measurement of periostin in the present invention may be performed by a method, or may be performed using an apparatus such as a measuring apparatus.
  • the measuring device may be a general-purpose automatic analyzer or a dedicated measuring device (dedicated machine).
  • the measurement of periostin in the present invention may be performed by a one-step method (one-reagent method) or a method performed by a plurality of operation steps such as a two-step method (two-reagent method).
  • periostin In the measurement of periostin in the present invention, not only one type of anti-periostin antibody but also a plurality of types may be used.
  • Second reagent Buffer solution (aqueous solvent)
  • Second reagent Buffer containing the “anti-periostin antibody-immobilized latex particles” of the present invention.
  • the anti-periostin antibody-immobilized latex particles are added to the anti-periostin antibody immobilized on latex particles (carriers) by the following (a ) To (c) have been subjected to treatment with a stabilizing substance selected.
  • (A) Surfactant and sugar (b) Surfactant and arginine or a salt thereof (c) Surfactant, sugar and arginine or a salt thereof
  • a certain amount of a sample such as serum and a certain amount of the first reagent are mixed and allowed to stand at a certain temperature for a certain time.
  • the temperature at the time of standing is preferably a constant temperature within a range of room temperature (1 ° C. to 30 ° C.) or low temperature (30 ° C. to 40 ° C.). (For example, 37 ° C.)
  • the temperature at the time of standing is preferably a constant temperature within a range of room temperature (1 ° C. to 30 ° C.) or low temperature (30 ° C. to 40 ° C.). (For example, 37 ° C.)
  • the standing time is preferably a fixed time of 1 minute or more and 10 minutes or less, and more preferably a fixed time of 3 minutes or more and 5 minutes or less.
  • the antigen-antibody reaction between the anti-periostin antibody immobilized on the latex particles and the periostin contained in the sample is performed by adding and mixing the second reagent to the mixed solution of the sample and the first reagent.
  • the reaction mixture is irradiated with light, and a decrease in transmitted light intensity at an appropriate wavelength, which is a signal generated by complex aggregates of latex particles generated (absorbance) Or the increase in scattered light intensity, the amount of the complex aggregate produced, that is, the amount of periostin contained in the sample is determined.
  • samples in the anti-periostin antibody-immobilized carrier of the present invention, the periostin measurement reagent, and the anti-periostin antibody-immobilized carrier stabilization method include blood, serum, plasma, urine, semen, spinal fluid, saliva, tears, Samples such as nasal discharge, nasal lavage fluid, alveolar lavage fluid, body fluids such as feces, ascites or amniotic fluid; or biological fluids that may contain periostin, such as extracts from organs, tissues, or cells such as blood vessels or liver It becomes a target.
  • the form of the sample used for the measurement is a liquid
  • a process such as an extraction process or a solubilization process may be performed according to a known method to form a liquid sample.
  • the sample may be subjected to concentration treatment as necessary.
  • the sample may be diluted by adding a diluent before the measurement.
  • a dilution treatment may be performed by adding a diluent to the sample.
  • a dilution treatment may be performed by adding a diluent to the sample.
  • Various aqueous solvents can be used as the diluent.
  • an aqueous solvent such as water, physiological saline, or various buffers such as tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer [Tris buffer], phosphate buffer, or phosphate buffered saline can be used.
  • Tris buffer tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer
  • phosphate buffer phosphate buffered saline
  • the pH of this buffer is preferably in the range of pH 5 to pH 10.
  • the whole blood sample is mixed with a hypotonic solution such as water or an aqueous solvent containing a surfactant, and a treatment for rupturing red blood cells is performed. It is preferable for performing the measurement without hindrance.
  • a measurement reagent for periostin, and an anti-periostin antibody-immobilized carrier the substance to be measured is periostin.
  • periostin as a substance to be measured in the present invention is not particularly limited, and examples include periostin derived from humans or mammals such as cows, pigs, dogs, cats, mice or rats, or birds such as chickens. .
  • periostin As the periostin as the measurement target substance, human periostin is particularly preferable.
  • Anti-periostin antibody stabilization method in anti-periostin antibody immobilization carrier of the present invention is an anti-periostin antibody immobilization carrier in which anti-periostin antibody is immobilized on a carrier.
  • a method for stabilizing a periostin antibody characterized in that a stabilizing substance selected from the following (1) to (3) is brought into contact with an anti-periostin antibody immobilized on a carrier.
  • a stabilizing substance selected from the following (1) to (3) is brought into contact with an anti-periostin antibody immobilized on a carrier.
  • the stabilization method of the anti-periostin antibody in the anti-periostin antibody immobilization carrier of the present invention can stabilize the anti-periostin antibody in the anti-periostin antibody immobilization carrier by the above-described configuration.
  • the details of the anti-periostin antibody, the anti-periostin antibody immobilization carrier, the sugar, the surfactant, arginine and the contacting method thereof in the present invention are as described above.
  • Example 1 (Confirmation of effect of the present invention-1) Periostin in human serum was measured to confirm the effect of the anti-periostin antibody immobilization carrier of the present invention, the periostin measurement reagent, and the anti-periostin antibody stabilization method in the anti-periostin antibody immobilization carrier.
  • Periostin S2 cells which are recombinant periostin proteins obtained by adding V5 / His tag to periostin (nucleotide sequence: nucleotide sequence of Accession Number D13666 of Nucleic Acid Database GenBank, amino acid sequence: amino acid sequence of Accession Number BAA02837 of Nucleic Acid Database GenBank) And then purified.
  • S2 cell transformants were prepared as follows. A cDNA encoding the above-mentioned portion of periostin was inserted into pMT / Bip / V5-HisA plasmid (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA), and this was designated as pMT / Bip / periostin-V5-HisA.
  • pAcHygro (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA), which is a plasmid expressing the pMT / Bip / peristin-V5-HisA and hygromycin resistance gene, was co-introduced into S2 cells by a known method and transformed.
  • S2 recombinant periostin protein which 6 histidine couple
  • the culture supernatant was then added to phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM potassium dihydrogen phosphate, and 8.04 mM disodium hydrogen phosphate.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Ni-NTA Agarose, Qiagen, Hilden, Germany nickel resin
  • periostin was obtained by eluting the S2 recombinant periostin protein with an imidazole-containing buffer.
  • the DNA sequence of the prepared plasmid was confirmed, and it was confirmed that the incorporated sequence was as intended.
  • Anti-periostin monoclonal antibody Preparation of anti-periostin monoclonal antibody-1st time An anti-periostin monoclonal antibody was prepared according to the following procedure. (First time)
  • cell fusion was performed as follows.
  • the mixed lymph node cells and myeloma cells (Sp2 / O cells) were centrifuged to remove the supernatant, suspended in 1 mL of polyethylene glycol (PEG 1500, Roche, Switzerland) at room temperature for 1 minute, and then at 37 ° C. Stir for 1 minute.
  • 1 mL of serum-free medium was added over 1 minute, and then 10 mL of serum-free medium was added over 1 minute.
  • the cells were washed several times, suspended in a medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine, dispensed into a 96-well microtiter plate, and cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
  • an ELISA using the above-described periostin used as an immunogen immobilized 7 to 14 days after cell fusion and using the fused cell culture supernatant as a primary antibody I went in the legal system.
  • this ELISA method was performed as follows. 1 ⁇ g / mL of the above periostin was dispensed into a 96-well microtiter plate and immobilized for several hours. After this immobilization solution was washed, the fusion cell culture supernatant was added to each well and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the fused cell culture supernatant was washed, and a peroxidase-labeled goat anti-rat IgG antibody (GE Healthcare, Little Charlotte, UK) was added as a secondary antibody and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • a peroxidase-labeled goat anti-rat IgG antibody GE Healthcare, Little Charlotte, UK
  • ABTS peroxidase substrate KPL, Gaithersburg, MD, USA
  • IgG was purified from the selected monoclonal antibody-producing cell line as follows. This monoclonal antibody-producing cell line was cultured at 37 ° C. in a CO 2 incubator using GIT medium (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan).
  • the IgG in the supernatant was bound to a protein G column (GE Healthcare, Little Charlotte, UK).
  • the bound IgG was eluted with 50 mM aqueous citric acid solution (pH 2.6).
  • Tris buffer 1M tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer [Tris buffer] was added to 4 volumes of the eluate, and rat anti-periostin monoclonal antibody was obtained from the aforementioned monoclonal antibody-producing cell line as purified IgG.
  • anti-periostin monoclonal antibody a rat anti-periostin monoclonal antibody (hereinafter referred to as “anti-periostin monoclonal antibody (SS18A)”) was obtained from the SS18A strain monoclonal antibody-producing cell line.
  • anti-periostin monoclonal antibody (SS17B)”) was obtained from the SS17B monoclonal antibody-producing cell line.
  • Samples Five types of human serum samples were used as samples. These were designated as serum 1, serum 2, serum 3, serum 4 and serum 5, respectively.
  • Antibody-immobilized carrier reagent Five types of antibody-immobilized carrier reagents were prepared as follows. [1] Antibody-immobilized carrier reagent (Control 1) (1) The “anti-periostin monoclonal antibody (SS18A)” of [2] above is added to phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM diphosphate.
  • PBS phosphate buffered saline
  • SS18A anti-periostin monoclonal antibody
  • each well of the microtiter plate of (2) above is phosphate buffer containing 0.05% (w / v) polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20]. After washing with physiological saline [PBS] three times, this solution was sucked out and removed, and then vacuum-dried to prepare an antibody-immobilized carrier reagent (Control 1).
  • Antibody-immobilized carrier reagent (Control 2) (1) The “anti-periostin monoclonal antibody (SS18A)” of [2] above is added to phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM diphosphate. Aqueous solution containing potassium hydrogen and 8.04 mM disodium hydrogen phosphate (pH 7.4)] was diluted to 2 ⁇ g / mL, and this was diluted to 96-well microtiter plate (Thermo Fisher Scientific Inc, Illinois) , USA), and 100 ⁇ L was injected into each well and allowed to stand at 25 ° C. for 18 to 24 hours to immobilize “anti-periostin monoclonal antibody (SS18A)” in each well of the microtiter plate.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Aqueous solution containing potassium hydrogen and 8.04 mM disodium hydrogen phosphate (pH 7.4)] was
  • PBS physiological saline
  • Antibody-immobilized carrier reagent (Invention 1) 0.05% (w / v) polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] in (4) of [2] above was converted to 0.05% (w / v) polyoxyethylene. (20) The above-mentioned [2] (1) to (5) except that sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] and 100 mM phosphate buffer containing 10% (w / v) sucrose are used. The operation was performed as described above to prepare an antibody-immobilized carrier reagent (Invention 1).
  • Antibody-immobilized carrier reagent (Invention 2) 0.05% (w / v) polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] in (4) of [2] above was converted to 0.05% (w / v) polyoxyethylene. (20) Except for changing to 100 mM phosphate buffer containing sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] and 500 mM arginine hydrochloride, the operation is performed as in (1) to (5) of [2] above. The antibody-immobilized carrier reagent (Invention 2) was prepared.
  • Antibody-immobilized carrier reagent (Invention 3) 0.05% (w / v) polyoxyethylene
  • sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] in (4) of [2] above was converted to 0.05% (w / v) polyoxyethylene.
  • Sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] (1) in the above [2], except that it is replaced with a 100 mM phosphate buffer containing 10% (w / v) sucrose and 500 mM arginine hydrochloride.
  • POD-labeled anti-periostin monoclonal antibody was prepared by binding peroxidase (POD) to the “anti-periostin monoclonal antibody (SS17B)” in [2] above by a known method. This was used as a labeled antibody reagent.
  • each well of the microtiter plate according to (1) above is phosphate-buffered saline containing 0.05% polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] [PBS. ] washed 5 times.
  • anti-periostin monoclonal antibody (SS17B) labeled with POD was bound to periostin bound to the immobilized “anti-periostin monoclonal antibody (SS18A)”.
  • each well of the microtiter plate of (3) above is phosphate-buffered saline containing 0.05% polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] [PBS. ] washed 5 times.
  • POD substrate solution [containing 0.8 mM 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMBZ), 2.5 mM hydrogen peroxide, and 30 mM disodium hydrogen phosphate 100 ⁇ L of 20 mM citrate buffer (pH 3.9)] was injected into each well of the microtiter plate of (4) above, and allowed to stand at 25 ° C. for 10 minutes to cause the reaction to develop color.
  • TMBZ 5,5′-tetramethylbenzidine
  • disodium hydrogen phosphate 100 ⁇ L of 20 mM citrate buffer (pH 3.9)
  • the value of the absorbance difference is based on the concentration of periostin contained in the sample.
  • periostin measurement value (ng / mL) when using an antibody-immobilized carrier reagent stored at 2 to 8 ° C.
  • periostin measurement when using an antibody-immobilized carrier reagent stored at 37 ° C.
  • the value (ng / mL) and “periostin measurement value when using an antibody-immobilized carrier reagent stored at 37 ° C.” is “periostin measurement when using an antibody-immobilized carrier reagent stored at 2 to 8 ° C.”
  • Percentage (%) when divided by “value” [hereinafter referred to as “37 ° C./2-8° C. ratio”].
  • Example 2 (Confirmation of effect of the present invention-2) Periostin in human serum was measured to confirm again the effect of the anti-periostin antibody immobilization carrier of the present invention, the periostin measurement reagent, and the anti-periostin antibody stabilization method in the anti-periostin antibody immobilization carrier.
  • Sample One type of human serum sample was used as the sample.
  • Antibody-immobilized carrier reagent Two types of antibody-immobilized carrier reagents were prepared as follows. [1] Antibody-immobilized carrier reagent (control) (1) “Anti-periostin monoclonal antibody (SS18A)” in 2 [1] of Example 1 was added to phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM.
  • PBS phosphate buffered saline
  • SS18A anti-periostin monoclonal antibody
  • each well of the microtiter plate of (2) above is phosphate buffer containing 0.05% (w / v) polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20]. After washing with physiological saline [PBS] three times, this solution was sucked out, removed, and then vacuum-dried to prepare an antibody-immobilized carrier reagent (control).
  • PBS physiological saline
  • Antibody-immobilized carrier reagent (the present invention)
  • PBS phosphate buffered saline
  • each well of the microtiter plate according to (1) above is phosphate-buffered saline containing 0.05% polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] [PBS. ] washed 5 times.
  • anti-periostin monoclonal antibody (SS17B) labeled with POD was bound to periostin bound to the immobilized “anti-periostin monoclonal antibody (SS18A)”.
  • each well of the microtiter plate of (3) above is phosphate-buffered saline containing 0.05% polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] [PBS. ] washed 5 times.
  • POD substrate solution [containing 0.8 mM 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMBZ), 2.5 mM hydrogen peroxide, and 30 mM disodium hydrogen phosphate 100 ⁇ L of 20 mM citrate buffer (pH 3.9)] was injected into each well of the microtiter plate of (4) above, and allowed to stand at 25 ° C. for 10 minutes to cause the reaction to develop color.
  • TMBZ 5,5′-tetramethylbenzidine
  • disodium hydrogen phosphate 100 ⁇ L of 20 mM citrate buffer (pH 3.9)
  • the value of the absorbance difference is based on the concentration of periostin contained in the sample.
  • Periostin prepared in 1 of Example 1 was used as a sample diluent [50 mM tris (hydroxymethyl) amino containing 0.5% casein, 100 mM sodium chloride, and 0.1% sodium azide. Diluted with methane buffer [Tris buffer] (pH 8.0)] to prepare a dilution series of periostin, which was used as a standard sample.
  • the values in parentheses indicate the percentage (%) when the measured value of periostin after storage at 5 ° C. is divided by the measured value of periostin at the start of storage.
  • Example 3 (Confirmation of effect of the present invention-3) Periostin in human serum was measured to confirm again the effect of the anti-periostin antibody immobilization carrier of the present invention, the periostin measurement reagent, and the anti-periostin antibody stabilization method in the anti-periostin antibody immobilization carrier.
  • Anti-periostin monoclonal antibody [1] Preparation of anti-periostin monoclonal antibody-3rd time As described in (1) to (4) of [1] of Example 1 at a time different from 2 of Example 1 The anti-periostin monoclonal antibody was prepared again. (3rd)
  • anti-periostin monoclonal antibody (hereinafter referred to as “anti-periostin monoclonal antibody (SS20A)”) could be obtained from the SS20A monoclonal antibody-producing cell line.
  • anti-periostin monoclonal antibody (SS19D)”) was obtained from the SS19D strain monoclonal antibody-producing cell line.
  • Sample One type of human serum sample was used as the sample.
  • Antibody-immobilized carrier reagent Two types of antibody-immobilized carrier reagents were prepared as follows. [1] Antibody-immobilized carrier reagent (control) (1) “Anti-periostin monoclonal antibody (SS20A)” of [1] in 1 above is added to phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM diphosphate.
  • PBS phosphate buffered saline
  • SS20A anti-periostin monoclonal antibody
  • each well of the microtiter plate of (2) above is phosphate buffer containing 0.05% (w / v) polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20]. After washing with physiological saline [PBS] three times, this solution was sucked out, removed, and then vacuum-dried to prepare an antibody-immobilized carrier reagent (control).
  • PBS physiological saline
  • Antibody-immobilized carrier reagent (the present invention)
  • PBS phosphate buffered saline
  • POD-labeled anti-periostin monoclonal antibody was prepared by binding peroxidase (POD) to the “anti-periostin monoclonal antibody (SS19D)” of [1] in 1 above by a known method. This was used as a labeled antibody reagent.
  • each well of the microtiter plate according to (1) above is phosphate-buffered saline containing 0.05% polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] [PBS. ] washed 5 times.
  • anti-periostin monoclonal antibody (SS19D) labeled with POD was bound to periostin bound to the above-mentioned immobilized “anti-periostin monoclonal antibody (SS20A)”.
  • each well of the microtiter plate of (3) above is phosphate-buffered saline containing 0.05% polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate [trade name: Tween 20] [PBS. ] washed 5 times.
  • POD substrate solution [containing 0.8 mM 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine (TMBZ), 2.5 mM hydrogen peroxide, and 30 mM disodium hydrogen phosphate 100 ⁇ L of 20 mM citrate buffer (pH 3.9)] was injected into each well of the microtiter plate of (4) above, and allowed to stand at 25 ° C. for 10 minutes to cause the reaction to develop color.
  • TMBZ 5,5′-tetramethylbenzidine
  • disodium hydrogen phosphate 100 ⁇ L of 20 mM citrate buffer (pH 3.9)
  • the value of the absorbance difference is based on the concentration of periostin contained in the sample.
  • Periostin prepared in 1 of Example 1 was used as a sample diluent [50 mM tris (hydroxymethyl) amino containing 0.5% casein, 100 mM sodium chloride, and 0.1% sodium azide. Diluted with methane buffer [Tris buffer] (pH 8.0)] to prepare a dilution series of periostin, which was used as a standard sample.
  • the values in parentheses indicate percentages (%) when the periostin measurement value after storage is divided by the periostin measurement value on the storage start date.
  • Example 4 (Confirmation of effect of the present invention-4) The effects of the anti-periostin antibody immobilization carrier of the present invention, the periostin measurement reagent, and the anti-periostin antibody stabilization method in the anti-periostin antibody immobilization carrier were confirmed again.
  • Antibody-immobilized carrier reagents for measurement were prepared as follows. [1] Antibody-immobilized carrier reagent (control) (1) “Anti-periostin monoclonal antibody (SS18A)” in 2 [1] of Example 1 was added to phosphate buffered saline (PBS) [137 mM sodium chloride, 2.68 mM potassium chloride, 1.47 mM. In aqueous solution containing potassium dihydrogen phosphate and 8.04 mM disodium hydrogen phosphate (pH 7.4)] and diluted to a concentration of 2 ⁇ g / mL, and this was diluted with a 96-well microtiter plate (Thermo Fisher Scientific Inc.
  • PBS phosphate buffered saline
  • pH 7.4 disodium hydrogen phosphate
  • Antibody-immobilized carrier reagent (the present invention)
  • PBS phosphate buffered saline
  • FIG. 1 which is the measurement result of this example, in the well of the “antibody-immobilized carrier reagent (control) microtiter plate”, the antibody-immobilized layer becomes convex due to crystallization after the drying treatment. In contrast, in the wells of the “antibody-immobilized carrier reagent (invention) microtiter plate”, the antibody-immobilized layer does not crystallize after the drying treatment and is smooth.

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Abstract

【課題】安定化された抗ペリオスチン抗体固定化担体を提供すること、安定化されたペリオスチン測定試薬を提供すること、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗体の安定化方法を提供する。 【解決手段】担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、界面活性剤及び糖、界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩、又は界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩を接触させたことを特徴とするものである。

Description

抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチン測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗体の安定化方法
　本発明は、アレルギー疾患や他の疾患のマーカーとなりうるペリオスチン（骨芽細胞特異因子２又はＯＳＦ２とも呼ばれる）の測定に使用される抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチン測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体の安定化方法に関するものである。
　本発明は、臨床検査、臨床病理学、免疫学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
　ペリオスチンは、細胞外マトリックスタンパク質であり、そのＮ末端側よりＣ末端側にかけて順に、ＥＭＩ領域、Ｒ１領域、Ｒ２領域、Ｒ３領域、Ｒ４領域及びＣ末端領域よりなるものであるが、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定がアレルギー性疾患の検査方法として有用であることが開示され、そして、アレルギー疾患の検査方法の発明が開示された（特許文献１及び非特許文献１参照。）。
　また、このペリオスチン遺伝子の発現レベルの測定が特発性間質性肺炎の検査方法としても有用であることが開示された（特許文献２参照。）。
　そして、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の使用により、ペリオスチン測定の正確性が改善されることが開示され（特許文献３参照。）、更に、ペリオスチンの特定領域を検出することによる正確性の改善された肺線維症又は間質性肺炎の検査方法等が開示された（特許文献４参照。）。
　なお、他に、ＯＳＦ２（ペリオスチン）に対するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及びこれらの抗体を用いる診断方法等が開示され（特許文献５参照。）、Ｏｓｆ２／Ｃｂｆａ１と命名される新規造骨細胞特異的転写因子を測定するのに抗ＯＳＦ２（ペリオスチン）抗体を用いた免疫測定法が開示され（特許文献６参照。）、ヒトペリオスチンに対して特異的に結合する精製抗体及びこの抗体を用いる乳癌の骨への転移等を調べる診断アッセイ法等が開示され（特許文献７参照。）、そして、抗細胞接着活性を有するペリオスチンに対する抗体及びこの抗体を用いるペリオスチンの定量方法等が開示されている（特許文献８参照。）。
　しかしながら、このように種々の疾患の検査に有用なペリオスチンの測定に使用するペリオスチン測定試薬は必ずしも安定なものではなく、その安定化が望まれていた。
　特に、ペリオスチン測定試薬における抗ペリオスチン抗体が乾燥状態におかれた場合には、著しく不安定となり、その安定化が切望されていた。
国際公開第０２／０５２００６号パンフレット 国際公開第０９／１４８１８４号パンフレット 特開２０１２－５８０４８号公報 国際公開第１３／０３５７９９号パンフレット 特開平５－２６８９８２号公報 特表２００２－５０２２５０号公報 特表２００５－５０００５９号公報 国際公開第０７／０７７９３４号パンフレット
Ｇ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１８巻，９８～１０４頁，２００６年発行
　前述した通り、ペリオスチンの測定に使用されるペリオスチン測定試薬は必ずしも安定なものではなく、その安定化が望まれていた。
　これに対して、本発明の課題は、安定化された抗ペリオスチン抗体固定化担体を提供すること、安定化されたペリオスチン測定試薬を提供すること、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗体の安定化方法を提供することである。
　特に、乾燥状態におかれた抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法等を提供することである。
　本発明者らは、抗ペリオスチン抗体固定化担体及びペリオスチン測定試薬並びにこれらに用いる抗ペリオスチン抗体の安定化方法について検討を重ねたところ、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、界面活性剤及び糖、界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩、又は界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩を接触させることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
［１］抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）～（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とする抗ペリオスチン抗体固定化担体。
　（１）界面活性剤及び糖
　（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
　（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
［２］前記［１］記載の抗ペリオスチン抗体固定化担体を含むペリオスチンの測定試薬。
［３］抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）～（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とする抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法。
　（１）界面活性剤及び糖
　（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
　（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
　本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチン測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法は、その抗ペリオスチン抗体固定化担体、及びペリオスチン測定試薬、並びに抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体が安定化されたものである。
　特に、乾燥状態におかれた抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化に好適である。
　以上のことより、本発明においては、抗ペリオスチン抗体固定化担体、及びペリオスチン測定試薬、並びに抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体は、長期間使用することができ、そして、長期間正確なペリオスチン測定値を提供することができるものである。
抗体固定化担体試薬の乾燥処理後のマイクロタイタープレートのウェルの観察結果の画像を示した図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
　本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
Ｉ．抗ペリオスチン抗体固定化担体
〔１〕総論
　本発明における抗ペリオスチン抗体固定化担体は、抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）～（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とするものである。
　（１）界面活性剤及び糖
　（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
　（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
　本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体は、上記の構成により安定化されたものである。
〔２〕抗ペリオスチン抗体
１．抗体
　本発明における抗ペリオスチン抗体は、ペリオスチンに特異的に結合する抗体である。
　本発明において、抗ペリオスチン抗体は、ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体であればよく、特に限定はない。
　この抗ペリオスチン抗体としては、例えば、ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗血清、抗体の断片〔Ｆａｂ及びＦ(ａｂ’)２など〕、又は一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等を挙げることができる。
　なお、この抗ペリオスチン抗体は、遺伝子組み換え技術等により免疫原を免疫する動物とは異なる動物種のアミノ酸配列に変化させた抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト化抗体等）であってもよい。
　そして、抗ペリオスチン抗体としては、モノクローナル抗体であることが好ましい。
　また、本発明においては、２種以上の、抗ペリオスチン抗体を用いてもよい。
　２．免疫原
　本発明における抗ペリオスチン抗体を産生させるための免疫原について、以下説明を行う。
　本発明における抗ペリオスチン抗体を産生させるための免疫原として、ペリオスチンの全部又は一部を用いることができる。
　すなわち、ヒト又はウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス若しくはラットなどの哺乳動物又はニワトリなどの鳥類等由来のペリオスチン、又は遺伝子組み換え操作により得たペリオスチン等のペリオスチンの全部又は一部を用いることができる。
　前記のペリオスチンの全部又は一部を免疫原とすることにより、本発明における抗ペリオスチン抗体を取得することができる。
　なお、この抗ペリオスチン抗体を産生させるための免疫原は、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部又は一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１～８個、好ましくは１～６個、より好ましくは１～４個、特に好ましくは１～２個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加、又は修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等であってもよい。
　また、抗体は、３個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を認識できるとの報告（Ｆ．Ｈｕｄｅｃｚら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１４７巻，２０１～２１０頁，１９９２年発行）がある。
　よって、本発明における抗ペリオスチン抗体の免疫原のアミノ酸配列の最小単位としては、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１～８個、好ましくは１～６個、より好ましくは１～４個、特に好ましくは１～２個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列の内、連続する３つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列を考えることができるので、これらの連続する３つのアミノ酸残基よりなるアミノ酸配列からなるトリペプチド、又はこれに他のアミノ酸若しくはペプチドが付加したもの等を、本発明における抗ペリオスチン抗体の免疫原の最小単位として考えることができる。
　前記の免疫原としての、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等、又はペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列に１ないし数個（通常１～８個、好ましくは１～６個、より好ましくは１～４個、特に好ましくは１～２個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質等は、ヒト等の体液、細胞、組織もしくは臓器等より、公知の方法等により抽出、精製等して、取得することができる。
　なお、本発明において、ペリオスチンのアミノ酸配列の全部若しくは一部のアミノ酸配列を含むペプチド又はタンパク質を取得する方法としては特に限定はなく、如何なる方法によるものでもよく、例えば、公知の方法により取得することができる。
　例えば、ヒトのペリオスチンを取得する方法として、次の方法（“Ｇ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１８巻，１号，７１３～７２３頁，２００６年発行”）等を挙げることができる。
（ａ）　まず、ペリオスチン（ポリヌクレオチドの塩基配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　ＮｕｍｂｅｒＤ１３６６６；アミノ酸配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　ＮｕｍｂｅｒＢＡＡ０２８３７）にＶ５／Ｈｉｓタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるＳ２細胞において発現させた上で精製する。
（ｂ）　すなわち、具体的には、Ｓ２細胞の形質転換体は次のように調製する。
　ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５－ＨｉｓＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）にペリオスチンの上記部分をコードするｃＤＮＡを挿入して、これをｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ－Ｖ５－ＨｉｓＡとする。
　Ｓ２細胞にｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ－Ｖ５－ＨｉｓＡ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるｐＡｃＨｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を公知の方法で共導入し、形質転換させる。
　ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得る。
　そして、Ｓ２細胞の形質転換体では、カルボキシ末端にＶ５エピトープ／Ｈｉｓタグの結合したペリオスチンを発現させる。
（ｃ）　Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の精製は次のように行う。
　ペリオスチン遺伝子安定形質転換体Ｓ２細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導する。
　これにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌される。
　この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に透析した後、ニッケルレジン（Ｎｉ－ＮＴＡ　Ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国Ｈｉｌｄｅｎ）と混合して、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させる。
　レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出させる。
　溶出されたＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をＰＢＳ等に透析し、精製されたヒトのペリオスチンタンパク質を取得する。
　また、ヒトのペリオスチンは、次の方法によっても取得することができる。
　すなわち、ペリオスチンのｃＤＮＡを、ＧＥＸ－ＫＧベクター（“ＫＬ．Ｇｕａｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９２巻，２６２～２６７頁，１９９１年発行”）に組み込んで、大腸菌ＢＬ２１にトランスフェクションする。
　これをアンピシリン入りＬＢ培地にて培養し、菌体よりグルタチオンセファロース４Ｂ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｌｉｔｔｌｅ　Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）により、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を付加したペリオスチンを精製する。
　これにトロンビンにてＧＳＴを切断し、ＧＳＴを付加しないペリオスチンを取得する。
　これをブラッドフォード法にて定量して、その量（濃度）が明確となったヒトのペリオスチンを取得することができる。
　更に、ヒトのペリオスチンは、例えば、“Ｉ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４６巻，５号，７１３～７２３頁，２００９年発行”などに記載された方法等によっても取得することができる。
　なお、ヒトのペリオスチンのＥＭＩ領域は、例えば、“Ｉ．Ｋｉｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８５巻，３号，２０２８～２０３９頁，２０１０年発行”、又は“Ｔ．Ｍａｒｕｈａｓｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８５巻，１７号，１３２９４～１３３０３頁，２０１０年発行”などに記載された方法等により取得することができる。
　また、ヒトのペリオスチンのＲ１領域、Ｒ２領域又はＲ３領域はそれぞれ、“Ｉ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１４６巻，５号，７１３～７２３頁，２００９年発行”などに記載された方法等により取得することができる。
　また、ヒトのペリオスチンのＲ４領域及びＣ末端領域のアミノ酸配列はそれぞれ、“Ｉ．Ｔａｋａｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１４６巻，５号，７１３～７２３頁，２００９年発行”などに記載された方法等により取得することができる。
　なお、前記の免疫原は、液相法及び固相法等のペプチド合成の方法により合成することができ、更にペプチド自動合成装置を用いてもよく、日本生化学会編「生化学実験講座１　タンパク質の化学ＩＶ」，東京化学同人，１９７５年、泉屋ら「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，１９８５年、日本生化学会編「続生化学実験講座２　タンパク質の化学　下」，東京化学同人，１９８７年等に記載された方法に従い合成することができ、前記のアミノ酸配列に、欠失、置換、挿入又は付加を施した変異体を作製することも容易である。
　また、非天然型アミノ酸の導入、各アミノ酸残基の化学修飾やシステイン残基を導入することにより分子内を環化させて構造を安定化させる等の修飾を施してもよい。
　更に、前記の免疫原は、対応する核酸塩基配列を持つＤＮＡ又はＲＮＡより遺伝子工学技術を用いて調製してもよく、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法Ｉ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法ＩＩ」，東京化学同人，１９８６年、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法ＩＩＩ」，東京化学同人，１９８７年等を参照して調製すればよい。
　ところで、免疫原が低分子物質の場合には、免疫原に担体（キャリア）を結合させたものを動物等に免疫するのが一般的ではあるが、アミノ酸数５のペプチドを免疫原としてこれに対する特異抗体を産生させたとの報告（木山ら，「日本薬学会第１１２回年会講演要旨集３」，１２２頁，１９９２年発行）もあるので、担体を使用することは必須ではない。
　なお、抗体を産生させる際に担体（キャリア）を使用する場合の担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリアラニルリシン、ジパルミチルリシン、破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを用いることができる。
　免疫原と担体の結合法は、グルタルアルデヒド法、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド法、マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシサクシニミドエステル法、ビスジアゾ化ベンジジン法又はＮ－サクシミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸法等の公知の結合法を用いることができる。
　また、ニトロセルロース粒子、ポリビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に免疫原を吸着させたものを免疫原とすることもできる。
３．ポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の調製方法
　ペリオスチンに特異的に結合することができるポリクローナル抗体、すなわち、ポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体は、以下の操作により調製することができる。
　このポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の産生用の免疫原としては、前記の免疫原を用いることができる。
　前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体（キャリア）の結合物を、哺乳動物（マウス、モルモット、ハムスター、ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ロバ、若しくはラクダなど）又は鳥類（ニワトリ、アヒル、若しくはダチョウなど）等に免疫する。
　なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫する免疫動物としては、その体内でのペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた、すなわちペリオスチンの生産に関わる遺伝子をノックアウトした動物がより好ましい。
　その理由は、その動物の体内で生産されたペリオスチンが、ペリオスチンなどの免疫原等の免疫により体内に産生した抗ペリオスチン抗体と結合してしまうことにより、抗ペリオスチン抗体の抗体活性が低下してしまう可能性が、前記のノックアウト動物においては低いからである。
　また、前記のノックアウト動物においては、その動物の体内でペリオスチンが生産されないため、免疫されたペリオスチンを異物と認識し易く、よって抗体の産生が高くなるためである。
　このペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた動物としては、例えば、ペリオスチンについてのノックアウトマウス（“Ｈ．Ｒｉｏｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５巻，２４号，１１１３１～１１１４４頁，２００５年発行”）等を挙げることができる。
　ところで、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫原、担体、免疫動物の種類、免疫注射部位等により決められるものであるが、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ～５ｍｇの前記免疫原、又は前記免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。
　なお、この前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントと添加混合して免疫注射することが好ましい。
　アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、化学合成アジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知のものを用いることができる。
　免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
　初回免疫後、１～２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。
　この追加免疫注射の回数としては、２～６回が一般的である。
　この場合も、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
　初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して抗体を含む抗血清を得る。
　この抗血清を、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィー等の方法、あるいはこれらの方法を組み合わせて抗体の精製を行い、ポリクローナル抗体を得る。
　以上の操作により、ペリオスチンに結合することができるポリクローナル抗体（ポリクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体）を得ることができる。
　ところで、免疫原と担体の結合物を用いて動物等に免疫した場合には、得られたポリクローナル抗体中に、この担体に対する抗体が存在するので、このような担体に対する抗体の除去処理を行うことが好ましい。
　この除去処理方法としては、担体を、得られたポリクローナル抗体の溶液中に添加して生成した凝集物を取り除くか、担体を不溶化固相に固定化してアフィニティークロマトグラフィーにより除去する方法等を用いることができる。
４．モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の調製方法
　ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体、すなわち、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体は、以下の操作により調製することができる。
　このモノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５～４９７頁，１９７５年発行）によるハイブリドーマ、又はエプスタン－バーウイルス等のウイルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができる。
　更に、抗体遺伝子のｃＤＮＡライブラリーから、マカフェティーらのファージディスプレイ法（Ｍ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８巻，５５２～５５４頁，１９９０年発行）を用いてモノクローナル抗体を作製することも可能である。
　なお、例えば、細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製は、下記の操作により行うことができる。
（１）　まず、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を、哺乳動物（マウス、ハムスター、ラット、又はラビットなど、例えば近交系マウスのＢＡＬＢ／ｃ）又は鳥類（ニワトリなど）等に免疫する。
　なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫する免疫動物としては、その体内でのペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた、すなわちペリオスチンの生産に関わる遺伝子をノックアウトした動物がより好ましい。
　その理由は、その動物の体内で生産されたペリオスチンが、ペリオスチンなどの免疫原等の免疫により体内に産生した抗ペリオスチン抗体と結合してしまうことにより、抗ペリオスチン抗体の抗体活性が低下してしまう可能性が、前記のノックアウト動物においては低いからである。
　また、前記のノックアウト動物においては、その動物の体内でペリオスチンが生産されないため、免疫されたペリオスチンを異物と認識し易く、よって抗体の産生が高くなるためである。
　このペリオスチンの生産に関わる遺伝子を不活性化又は欠損させた動物としては、例えば、ペリオスチンについてのノックアウトマウス（“Ｈ．Ｒｉｏｓら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２５巻，２４号，１１１３１～１１１４４頁，２００５年発行”）等を挙げることができる。
　ところで、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物の免疫量は、免疫動物の種類、免疫注射部位等により適宜決められるものであるが、例えば、マウスの場合には一匹当り一回につき０．１μｇ～５ｍｇの前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を免疫注射するのが好ましい。
　なお、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して免疫注射することが好ましい。
　アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、化学合成アジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いることができる。
　免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内、足蹠又は背部等の部位に行えばよい。
（２）　初回免疫後、１～２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内、足蹠又は背部等の部位に、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を追加免疫注射する。
　この追加免疫注射の回数としては２～６回が一般的である。
　この場合も前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
（３）　初回免疫の後、免疫動物の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、前記の免疫原、又は前記の免疫原と担体の結合物を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。
（４）　この最終免疫の３～５日後に、免疫動物の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。
（５）　この免疫動物より得られた抗体産生能を有する細胞と哺乳動物等（マウス、ヌードマウス、ラットなど）の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを細胞融合させるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８株（ＡＴＣＣ　ＴＩＢ９）、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８－Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク〔ＪＣＲＢ〕９０８５）、Ｐ３－ＮＳ１－１－Ａｇ４－１株（ＪＣＲＢ　０００９）、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ　００２８）又はＳＰ２／Ｏ－Ａｇ－１４株（ＪＣＲＢ　００２９）等を用いることができる。
　細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リポソームもしくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法により行うことができる。
　ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞との融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。
（６）　このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を、ヒト又はウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス、ラット若しくはニワトリなどの動物等（例えば、ヒトのペリオスチンの測定に用いる場合にはヒト由来のものが好ましく、ウシのペリオスチンの測定に用いる場合にはウシ由来のものが好ましく、イヌのペリオスチンの測定に用いる場合にはイヌ由来のものが好ましい）のペリオスチンの全部又は一部よりなるタンパク質又はペプチド等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などの免疫学的測定法等により測定することにより、「ペリオスチンに結合することができるモノクローナル抗体（モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体）」を産生するハイブリドーマを選択することができる。
（７）　このハイブリドーマ選択方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うことにより、本発明における、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体の産生細胞株を単離して得ることができる。
（８）　このモノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清から本発明における、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を得ることができるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。
　また、このモノクローナル抗体産生細胞株を、これに適合性がありプリスタン等であらかじめ刺激した哺乳動物の腹腔内に注入し、一定期間の後、腹腔にたまった腹水より本発明における、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を得ることもできる。
（９）　このようにして得られた、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法を組み合わせること等により、精製された、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を得ることができる。
（１０）なお、前記（６）の通り、得られたハイブリドーマの培養上清を、ヒト又はイヌ等の動物のペリオスチンの全部又は一部よりなるタンパク質又はペプチド等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などの免疫学的測定法等により測定することにより、モノクローナル抗体である抗ペリオスチン抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
（１１）　この「モノクローナル抗体である、抗ペリオスチン抗体」を産生するハイブリドーマより、前記（７）～（９）のようにして、「モノクローナル抗体である、抗ペリオスチン抗体」を得ることができる。
　なお、得られた「モノクローナル抗体である、抗ペリオスチン抗体」は、ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体である。
〔３〕抗ペリオスチン抗体固定化担体
１．担体
　本発明における担体は、抗ペリオスチン抗体を固定化するものである。
　本発明において担体は、抗ペリオスチン抗体を固定化することができるものであればよく、特に限定はない。
　この担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるマイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の担体を挙げることができる。
　また、この担体としては、例えば、ポリスチレン、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル－アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン－メタクリル酸共重合体、スチレン－グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン－ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなる粒子等の担体を挙げることができる。
２．抗ペリオスチン抗体の担体への固定化
　本発明における抗ペリオスチン抗体の担体への固定化は、固定化をすることができるのであればよく、特に限定はない。
　本発明においては、抗ペリオスチン抗体と担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により吸着、結合させて抗ペリオスチン抗体を担体に固定化することができる。
　物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液などに溶解した抗ペリオスチン抗体と担体を接触させたりすること等により行うことができる。
　また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号　臨床検査のためのイムノアッセイ－技術と応用－」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１　タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗ペリオスチン抗体と担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
　また、更に非特異的反応や担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗ペリオスチン抗体を固定化させた担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン、ゼラチン、卵白アルブミン若しくはその塩などのタンパク質、又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
〔４〕安定化物質
１．総論
　本発明における抗ペリオスチン抗体固定化担体は、抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）～（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とするものである。
　（１）界面活性剤及び糖
　（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
　（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
２．担体に固定化した抗ペリオスチン抗体への安定化物質の接触
　本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に本発明における安定化物質を接触させる方法は、当該接触を行うことができるのであればよく、特に限定はない。
　当該接触の方法としては、例えば、本発明における安定化物質を含む溶液を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に注ぐことにより接触させたり、本発明における安定化物質を含む溶液を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に塗布することにより接触させたり、又は担体に固定化した抗ペリオスチン抗体を本発明における安定化物質を含む溶液に含浸させて接触させたりする方法等を挙げることができる。
３．界面活性剤及び糖の接触
　本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤及び糖を接触させるに当たっては、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させた後に糖を接触させてもよく、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させた後に界面活性剤を接触させてもよく、又は担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤と糖を同時に接触させてもよい。
　本発明においては、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤と糖を同時に接触させること、又は担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させた後に界面活性剤を接触させることが好ましく、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させた後に界面活性剤を接触させることがより好ましい。
４．界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩の接触
　本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩を接触させるに当たっては、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させた後にアルギニン若しくはその塩を接触させてもよく、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体にアルギニン若しくはその塩を接触させた後に界面活性剤を接触させてもよく、又は担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤とアルギニン若しくはその塩を同時に接触させてもよい。
　本発明においては、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤とアルギニン若しくはその塩を同時に接触させること、又は担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させた後に界面活性剤を接触させることが好ましく、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体にアルギニン若しくはその塩を接触させた後に界面活性剤を接触させることがより好ましい。
５．界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
の接触
　本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩を接触させるに当たっては、その順序は問わない。
　そして、界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩から選ばれる二つ以上の本発明における安定化物質を、同時に担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に接触させてもよい。
　本発明においては、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖とアルギニン若しくはその塩を同時又は別々に接触させた後に、界面活性剤を接触させることが好ましい。
〔５〕界面活性剤
１．界面活性剤
　本発明における界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤等を挙げることができる。
（１）非イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）　ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリスチリルフェニルエーテル、又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレンエーテル化合物。
（ｂ）　グリセリン脂肪酸部分エステル、ソルビタン脂肪酸部分エステル、ペンタエリスリトール脂肪酸部分エステル、プロピレングリコールモノ脂肪酸エステル、又はショ糖脂肪酸部分エステルなどの多価アルコール部分エステル化合物。
（ｃ）　ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸部分エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸部分エステル、又はポリオキシエチレン化ひまし油などのポリオキシエチレン化多価アルコール脂肪酸エステル。
（ｄ）　脂肪酸ジエタノールアミド、Ｎ，Ｎ－ビス－２－ヒドロキシアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルキルアミン、トリエタノールアミン脂肪酸エステル、又はトリアルキルアミンオキシドなどのアミド若しくはアミン化合物。
（２）陰イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）　脂肪族モノカルボン酸塩、Ｎ－アシロイルサルコシン塩、Ｎ－アシロイル－β－アラニン塩、若しくはＮ－アシロイルグルタミン酸塩などの脂肪族化合物カルボン酸塩；又はアビエチン酸塩などの環式化合物カルボン酸塩。
（ｂ）　ジアルキルスルホコハク酸塩、アルカンスルホン酸塩、若しくはヒドロキシアルカンスルホン酸塩などの脂肪族化合物スルホン酸塩；直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキルフェノキシポリオキシエチレンプロピルスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェノールスルホン酸塩、若しくはナフタレンスルホン酸塩－ホルムアルデヒド縮合物などの環式化合物スルホン酸塩；又はＮ－メチル－Ｎ－オレイルタウリンナトリウム、若しくはＮ－アルキルスルホコハク酸モノアミド二ナトリウム塩などの含窒素化合物スルホン酸塩。
（ｃ）　硫酸化ひまし油、硫酸化牛脚油、脂肪酸アルキルエステル・硫酸エステル塩、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、脂肪酸モノグリセリド硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキロイルアミド硫酸塩などの脂肪族化合物硫酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル硫酸エステル塩などの環式化合物硫酸エステル塩。
（ｄ）　アルキルリン酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル塩などの脂肪族化合物リン酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸エステル塩などの環式化合物リン酸エステル塩。
（ｅ）　スチレン－無水マレイン酸共重合物の部分けん化物、又はオレフィン－無水マレイン酸共重合物の部分けん化物などの重合型高分子化合物のけん化物。
（ｆ）　ナフタレンスルホン酸塩－ホルマリン縮合物などの重縮合型高分子化合物。
（３）陽イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）　モノアルキルアミン塩、ジアルキルアミン塩、又はトリアルキルアミン塩などの脂肪族化合物アミン塩。
（ｂ）　テトラアルキルアンモニウム塩などの脂肪族化合物第四級アンモニウム塩；又はトリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２－アルキル－１－アルキル－１－ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、若しくはＮ，Ｎ－ジアルキルモルホリニウム塩などの環状化合物第四級アンモニウム塩。
（ｃ）　ポリエチレンポリアミン脂肪族アミド塩、ポリエチレンポリアミン脂肪族アミドの尿素縮合物の塩、又はポリエチレンポリアミン脂肪族アミド尿素縮合物の第四級アンモニウム塩などのポリエチレンポリアミン誘導体。
（４）両性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ）　Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－アルキル－Ｎ－カルボキシアルキレンアンモニウムベタインなどのカルボキシベタイン化合物。
（ｂ）　Ｎ，Ｎ－ジアルキルアミノアルキレンカルボン酸塩などのアミノカルボン酸化合物。
（ｃ）　Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリアルキル－Ｎ－スルホアルキレンアンモニウムベタインなどのスルホベタイン化合物。
（ｄ）　Ｎ－アルキル－Ｎ，Ｎ－ビスポリオキシエチレン硫酸エステル塩などのアミノ硫酸エステル化合物。
（ｅ）　２－アルキル－１－ヒドロキシエチル－１－カルボキシメチルイミダゾリニウム塩などのイミダゾリン化合物。
　本発明においては、１種類の界面活性剤だけを用いてもよく、又は２種類以上の界面活性剤を組み合わせて用いてもよい。
　本発明における界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸部分エステルがより好ましく、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートが特に好ましい。
２．濃度
　本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させる際の界面活性剤の濃度は、特に限定されないが、当該接触時に、０．００１％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。
　なお、当該接触時の界面活性剤の好ましい濃度の下限は、より好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）以上であり、更に好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上である。
　また、当該接触時の界面活性剤の好ましい濃度であるが、上限は特にはないが、コスト等のことを考えると５％（ｗ／ｖ）迄で十分である。
　なお、当該接触時の界面活性剤の好ましい濃度の上限は、より好ましくは１％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下である。
　なお、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させる場合、界面活性剤を含有する溶液（試薬）を用いるときは、当該担体に固定化した抗ペリオスチン抗体と界面活性剤との接触時に、当該界面活性剤の濃度が前記の濃度となるよう、当該界面活性剤を当該溶液（試薬）に含有させることが好ましい。
３．温度及び時間
　担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させる場合、その際の温度及び時間は、適宜選択すればよい。
　なお、この接触時の温度は、界面活性剤を含有する溶液が凍結する温度より上の温度であって、適宜適した温度であればよい。
　また、この接触時の温度が高すぎると抗ペリオスチン抗体等の成分が変性、失活してしまうので、当該接触時の温度は、関係する成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
　この接触時の温度は、２～４０℃が好ましく、２～３０℃がより好ましく、２～２０℃が更に好ましく、２～１０℃が特に好ましい。
　そして、前記接触の時間は、適宜適した時間接触させればよいが、通常、６時間以上が好ましく、１２時間以上がより好ましく、１８時間以上が特に好ましい。
　なお、この接触時間の上限は特にはない。
　但し、強いて挙げるとすると、作業時間が長くなることによりコストが上昇するとの観点に立てば、接触時間は２０日以内とすることが好ましく、１５日以内とすることがより好ましく、１０日以内とすることが特に好ましい。
４．乾燥
　担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させた後、当該抗ペリオスチン抗体を乾燥状態とすることが、抗ペリオスチン抗体固定化担体の運搬等の取扱い上都合が良い。
　当該抗ペリオスチン抗体を乾燥状態とする方法としては、例えば、凍結乾燥、真空乾燥、風を当てての乾燥、又は自然乾燥等を挙げることができるが、自然乾燥が好ましい。
〔６〕糖
１．糖
　本発明における糖としては、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、又はオリゴ糖等を挙げることができる。
　また、本発明における糖としては、例えば、三炭糖、四炭糖、五炭糖、又は六炭糖等を構成成分とするものを挙げることができる。
　そして、本発明における糖として、より具体的には、例えば、グルコース、ガラクトース、アラビノース、キシロース、エリトロース、フルクトース、リブロース、フコース、マンノース、ラムノース、リボース、キシロース、スクロース（サッカロース）、トレハロース、イソトレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、イソマルトース、フルクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、又は乳果オリゴ糖等を挙げることができる。
　本発明における糖としては、二糖が好ましく、スクロース及びトレハロースがより好ましく、スクロースが特に好ましい。
２．濃度
　本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させる際の糖の濃度は、特に限定されないが、当該接触時に、０．１％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。
　なお、当該接触時の糖の好ましい濃度の下限は、より好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以上であり、更に好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）以上である。
　また、当該接触時の糖の好ましい濃度であるが、上限は特にはないが、コスト等のことを考えると２０％（ｗ／ｖ）迄で十分である。
　なお、当該接触時の糖の好ましい濃度の上限は、より好ましくは１５％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下である。
　なお、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させる場合、糖を含有する溶液（試薬）を用いるときは、当該担体に固定化した抗ペリオスチン抗体と糖との接触時に、当該糖の濃度が前記の濃度となるよう、当該糖を当該溶液（試薬）に含有させることが好ましい。
３．温度及び時間
　担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させる場合、その際の温度及び時間は、適宜選択すればよい。
　なお、この接触時の温度は、糖を含有する溶液が凍結する温度より上の温度であって、適宜適した温度であればよい。
　また、この接触時の温度が高すぎると抗ペリオスチン抗体等の成分が変性、失活してしまうので、当該接触時の温度は、関係する成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
　この接触時の温度は、２～４０℃が好ましく、２～３０℃がより好ましく、２～２０℃が更に好ましく、２～１０℃が特に好ましい。
　そして、前記接触の時間は、適宜適した時間接触させればよいが、通常、６時間以上が好ましく、１２時間以上がより好ましく、１８時間以上が特に好ましい。
　なお、この接触時間の上限は特にはない。
　但し、強いて挙げるとすると、作業時間が長くなることによりコストが上昇するとの観点に立てば、接触時間は２０日以内とすることが好ましく、１５日以内とすることがより好ましく、１０日以内とすることが特に好ましい。
４．乾燥
　担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に糖を接触させた後、当該抗ペリオスチン抗体を乾燥状態とすることが、抗ペリオスチン抗体固定化担体の運搬等の取扱い上都合が良い。
　当該抗ペリオスチン抗体を乾燥状態とする方法としては、例えば、凍結乾燥、真空乾燥、風を当てての乾燥、又は自然乾燥等を挙げることができるが、自然乾燥が好ましい。
〔７〕アルギニン又はその塩
１．アルギニンの塩
　本発明において、アルギニンとしては、Ｌ－アルギニン又はＤ－アルギニンのいずれでもよい。
　また、本発明において、アルギニンの塩としては、例えば、塩酸塩等を挙げることができる。
２．濃度
　本発明において、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体にアルギニン又はその塩を接触させる際のアルギニン又はその塩の濃度は、特に限定されないが、当該接触時に、１０ｍＭ以上であることが好ましい。
　なお、当該接触時のアルギニン又はその塩の好ましい濃度の下限は、より好ましくは５０ｍＭ以上であり、更に好ましくは１００ｍＭ以上であり、特に好ましくは２００ｍＭ以上である。
　また、当該接触時のアルギニン又はその塩の好ましい濃度であるが、上限は特にはないが、コスト等のことを考えると８５０ｍＭ迄で十分である。
　なお、当該接触時のアルギニン又はその塩の好ましい濃度の上限は、より好ましくは７００ｍＭ以下であり、特に好ましくは５００ｍＭ以下である。
　なお、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体にアルギニン又はその塩を接触させる場合、アルギニン又はその塩を含有する溶液（試薬）を用いるときは、当該担体に固定化した抗ペリオスチン抗体とアルギニン又はその塩との接触時に、当該アルギニン又はその塩の濃度が前記の濃度となるよう、当該アルギニン又はその塩を当該溶液（試薬）に含有させることが好ましい。
３．温度及び時間
　担体に固定化した抗ペリオスチン抗体にアルギニン又はその塩を接触させる場合、その際の温度及び時間は、適宜選択すればよい。
　なお、この接触時の温度は、アルギニン又はその塩を含有する溶液が凍結する温度より上の温度であって、適宜適した温度であればよい。
　また、この接触時の温度が高すぎると抗ペリオスチン抗体等の成分が変性、失活してしまうので、当該接触時の温度は、関係する成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。
　この接触時の温度は、２～４０℃が好ましく、２～３０℃がより好ましく、２～２０℃が更に好ましく、２～１０℃が特に好ましい。
　そして、前記接触の時間は、適宜適した時間接触させればよいが、通常、６時間以上が好ましく、１２時間以上がより好ましく、１８時間以上が特に好ましい。
　なお、この接触時間の上限は特にはない。
　但し、強いて挙げるとすると、作業時間が長くなることによりコストが上昇するとの観点に立てば、接触時間は２０日以内とすることが好ましく、１５日以内とすることがより好ましく、１０日以内とすることが特に好ましい。
４．乾燥
　担体に固定化した抗ペリオスチン抗体にアルギニン又はその塩を接触させた後、当該抗ペリオスチン抗体を乾燥状態とすることが、抗ペリオスチン抗体固定化担体の運搬等の取扱い上都合が良い。
　当該抗ペリオスチン抗体を乾燥状態とする方法としては、例えば、凍結乾燥、真空乾燥、風を当てての乾燥、又は自然乾燥等を挙げることができるが、自然乾燥が好ましい。
〔８〕．ペリオスチンの測定試薬
１．総論
　本発明のペリオスチンの測定試薬は、前記の抗ペリオスチン抗体固定化担体を含むものである。
　本発明のペリオスチンの測定試薬は、上記の構成により安定化されたものである。
２．ペリオスチンの測定試薬
　本発明のペリオスチンの測定試薬は、前記の抗ペリオスチン抗体固定化担体を含むものであるが、このようなものであれば、特にその測定原理に限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。
　本発明のペリオスチンの測定試薬は、試料に含まれるペリオスチンを抗ペリオスチン抗体との抗原抗体反応を利用して測定する測定試薬である。
　この試料に含まれるペリオスチンを抗ペリオスチン抗体との抗原抗体反応を利用して測定する測定試薬の測定原理としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９－２２９９３６号公報及び特開平１０－１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ　Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７～７７２頁，１９９８年発行；国際公開第９８／２３９６３号パンフレット）等を挙げることができる。
　そして、本発明のペリオスチンの測定試薬による測定は、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法をも、適用することができる。
　また、本発明のペリオスチンの測定試薬による測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
　本発明のペリオスチンの測定試薬は、二つ以上の測定試薬より構成されるものであってよい。
　なお、本発明のペリオスチンの測定試薬の溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。
　この水系溶媒としては、例えば、水、若しくは生理食塩水等を挙げることができ、又は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕、リン酸緩衝液、若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。
　この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ５～ｐＨ１０の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
　また、本発明のペリオスチンの測定試薬には、抗ペリオスチン抗体固定化担体の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、カゼイン若しくはその塩などのタンパク質；カルシウムイオンなどの各種金属イオン；カルシウム塩などの各種塩類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；又は、非特異的反応抑制物質等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。
　なお、これらを本発明のペリオスチンの測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１～１０％（ｗ／ｖ）が好ましく、特に０．０１～５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
　なお、本発明のペリオスチンの測定試薬は、そのもの単独にて、販売し、又は試料に含まれるペリオスチンの測定に使用することができる。
　また、本発明のペリオスチンの測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料に含まれるペリオスチンの測定に使用することもできる。
　前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、又は校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
　なお、本発明のペリオスチンの測定試薬は、測定試薬キットであることが好ましい。
３．抗ペリオスチン抗体
　本発明のペリオスチンの測定試薬においては、抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体とは別に、上記「〔１〕抗ペリオスチン抗体」の項に記載された抗体を使用することができ、例えば、以下の抗体を使用することができる。
（ｉ）　ペリオスチンに特異的に結合することができる抗体
（ｉｉ）　ペリオスチンに特異的に結合することができるポリクローナル抗体
（ｉｉｉ）　ペリオスチンに特異的に結合することができるモノクローナル抗体
　なお、本発明のペリオスチンの測定試薬において、例えば、ペリオスチン一分子に二分子の抗体を抗原抗体反応させる場合、これらの抗体のいずれもが抗ペリオスチン抗体である必要がある。
　例えば、酵素標識抗体と固定化抗体を用いるＥＬＩＳＡ法のサンドイッチ法の測定試薬においては、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる酵素標識抗体及び固定化抗体のいずれもが、この抗ペリオスチン抗体である必要がある。
　なお、この場合、この固定化抗体は、前記の担体に固定化した抗ペリオスチン抗体である。
　ところで、前記の抗ペリオスチン抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを含有してもよい。
　なお、この抗ペリオスチン抗体の詳細については、前記の「〔１〕抗ペリオスチン抗体」の項に記載した通りである。
４．標識抗体を用いた免疫学的測定方法を測定原理とする測定試薬
　本発明のペリオスチンの測定試薬が、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、発光免疫測定法又はイムノクロマトグラフィー法等の標識抗体を用いた免疫学的測定方法、すなわち標識抗体を用いる抗原抗体反応を利用した測定方法を測定原理とする場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施する時には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる固定化抗体（担体に固定化した抗ペリオスチン抗体）及び標識抗体のいずれもの抗体が抗ペリオスチン抗体である必要がある。
　標識物質としては、酵素免疫測定法の測定試薬の場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β－ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を用いることができる。
　また、蛍光免疫測定法の測定試薬の場合には、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミンイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。
　そして、放射免疫測定法の測定試薬の場合には、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。
　また、発光免疫測定法の測定試薬においては、ＮＡＤＨ－ＦＭＮＨ２－ルシフェラーゼ系、ルミノール－過酸化水素－ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系又はジオキセタン化合物系等を用いることができる。
　また、イムノクロマトグラフィー法の測定試薬の場合には、金コロイド粒子等を用いることができる。
　抗ペリオスチン抗体と酵素等の標識物質との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号　臨床検査のためのイムノアッセイ－技術と応用－」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１　タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗ペリオスチン抗体と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗ペリオスチン抗体と標識物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
　測定の操作法は公知の方法等（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号　臨床検査のためのイムノアッセイ－技術と応用－」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１　酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年発行）等により行うことができる。
　例えば、抗ペリオスチン抗体固定化担体（担体＝抗ペリオスチン抗体）と試料を反応させ、同時に標識抗体を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「担体＝抗ペリオスチン抗体＝ペリオスチン＝標識抗体」の複合体を抗原抗体反応により形成させる。
　なお、この抗ペリオスチン抗体固定化担体は、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）～（３）から選択される安定化物質を接触させる処理を行っておいたものである。
　（１）界面活性剤及び糖
　（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
　（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
　そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「担体＝抗ペリオスチン抗体＝ペリオスチン」を介して担体に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量より試料に含まれていたペリオスチンの量（濃度）のみを測定することができる。
　具体的には、酵素免疫測定法の測定試薬の場合は、例えば抗体に標識した酵素に、その至適条件下で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。
　また、蛍光免疫測定法の測定試薬の場合には蛍光物質標識による蛍光強度等を、放射免疫測定法の測定試薬の場合には放射性物質標識による放射線量等を測定する。
　そして、発光免疫測定法の測定試薬の場合は発光反応系による発光量等を測定する。
　なお、前記の抗ペリオスチン抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを使用してもよい。
５．凝集反応法による免疫学的測定方法を測定原理とする測定試薬
　本発明のペリオスチンの測定試薬が、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測る測定方法により実施する場合には、すなわち、抗原抗体反応による複合体の凝集物の生成を測る測定方法（凝集反応法）を測定原理とする場合には、試料に含まれていたペリオスチンに結合させる抗体が「担体に固定化した抗ペリオスチン抗体」である必要がある。
　なお、前記の凝集反応法による測定試薬においては、溶媒として、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
　なお、ラテックス比濁法を測定原理とする測定試薬の場合、担体として用いるラテックス粒子の粒径については、特に制限はないものの、ラテックス粒子が測定対象物質（ペリオスチン）を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、０．０４～１μｍであることが好ましい。
　また、ラテックス比濁法を測定原理とする測定試薬の場合、抗ペリオスチン抗体を固定化させたラテックス粒子を含ませる濃度については、試料中のペリオスチンの濃度、抗ペリオスチン抗体のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概にいうことはできない。
　しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固定化された「抗ペリオスチン抗体」と試料に含まれていた「ペリオスチン」との抗原抗体反応時（測定反応時）に、「抗ペリオスチン抗体」を固定化させたラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において０．００５～１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の「抗ペリオスチン抗体を固定化させたラテックス粒子」を測定試薬に含ませることが好ましい。
　また、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合、担体として用いる粒子の粒径については、特に制限はないものの、その平均粒子径が０．０１～１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．５～１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。そして、これらの粒子の比重は、１～１０の範囲内にあることが好ましく、１～２の範囲内にあることがより好ましい。
　なお、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合の測定に使用する容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる、試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げることができる。
　これらの容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。
　測定の操作法は公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と「担体に固定化した抗ペリオスチン抗体」を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。
　また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と「担体に固定化した抗ペリオスチン抗体」を反応させ、凝集の状態を目視的に測定する。
　なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。
　測定の操作法の例を以下挙げる。
　例えば、まず、本発明の「抗ペリオスチン抗体固定化担体」を含むペリオスチン測定試薬等を調製し、準備する。
　なお、この抗ペリオスチン抗体固定化担体は、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）～（３）から選択される安定化物質を接触させる処理を行っておいたものである。
　（１）界面活性剤及び糖
　（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
　（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
　次に、例えば、「抗ペリオスチン抗体固定化担体」を含むペリオスチン測定試薬と、試料とを混合し、これにより、「抗ペリオスチン抗体固定化担体」の抗ペリオスチン抗体と試料とを接触させる。
　これにより、「抗ペリオスチン抗体固定化担体」の「抗ペリオスチン抗体」と、試料に含まれていた「ペリオスチン」との、抗原抗体反応を行わせる。
　そして、これより生成した、「抗ペリオスチン抗体固定化担体」（抗ペリオスチン抗体＝担体＝抗ペリオスチン抗体）と「ペリオスチン」との複合体凝集物（…〔ペリオスチン〕－〔抗ペリオスチン抗体＝担体＝抗ペリオスチン抗体〕－〔ペリオスチン〕－〔抗ペリオスチン抗体＝担体＝抗ペリオスチン抗体〕－〔ペリオスチン〕…）を測定する。
　この生成した複合体凝集物の測定は、この複合体凝集物が存在する測定反応時の反応混合液の透過光又は散乱光などの吸光度等の測定を、エンドポイント法又はレート法等により行うことにより、実施する。
　そして、試料を測定して得た吸光度等の測定値を、標準物質（ペリオスチンの濃度が既知の試料）を測定して得た吸光度等の測定値と比較して、試料中に含まれていたペリオスチンの濃度（定量値）を算出する。
　なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、透過光を測定しても、又は散乱光を測定してもよく、そして、１波長測定であっても、又は２波長測定（２つの波長による差又は比）であってもよい。
　なお、測定波長は、３４０ｎｍから１，０００ｎｍの中から選ばれるのが一般的である。
　なお、本発明におけるペリオスチンの測定は、用手法により行ってもよいし、又は測定装置等の装置を用いて行ってもよい。
　測定装置は、汎用自動分析装置であっても、専用の測定装置（専用機）であってもよい。
　また、本発明におけるペリオスチンの測定は、１ステップ法（１試薬法）により行ってもよいし、又は２ステップ法（２試薬法）等の複数の操作ステップにより行う方法によって実施してもよい。
　なお、本発明におけるペリオスチンの測定において、抗ペリオスチン抗体は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを使用してもよい。
　なお、以下、ラテックス比濁法を測定原理とする方法によりペリオスチンの測定を行う場合を例にとって、より具体的に説明を行う。
（１）　まず、ペリオスチンの測定試薬として、以下のものを調製し、準備する。
第１試薬：緩衝液（水系溶媒）
第２試薬：本発明の「抗ペリオスチン抗体固定化ラテックス粒子」を含有する緩衝液
　なお、この抗ペリオスチン抗体固定化ラテックス粒子は、ラテックス粒子（担体）に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（ａ）～（ｃ）から選択される安定化物質を接触させる処理を行っておいたものである。
　（ａ）界面活性剤及び糖
　（ｂ）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
　（ｃ）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
（２）　血清等の試料の一定量と前記の第１試薬の一定量を混合し、一定温度下で一定時間静置する。
　なお、試料と第１試薬の混合比率（量比）は、適宜選択すればよい。
　また、前記の静置時の温度は、室温（１℃～３０℃）又は微温（３０℃～４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）
（３）　一定時間後、前記の試料と第１試薬との混合液に、前記の第２試薬の一定量を添加、混合し、反応混合液として、一定温度下で一定時間静置する。
　これにより、「抗ペリオスチン抗体固定化ラテックス粒子」と試料とを接触させる。
　なお、第２試薬の添加量は、適宜選択すればよい。
　また、前記の静置時の温度は、室温（１℃～３０℃）又は微温（３０℃～４０℃）の範囲内の一定温度であることが好ましい。（例えば、３７℃等）
　そして、前記の静置の時間は、１分間以上、かつ１０分間以下の一定時間であることが好ましく、３分間以上、かつ５分間以下の一定時間であることがより好ましい。
　試料と第１試薬との混合液への第２試薬の添加、混合により、ラテックス粒子に固定化した抗ペリオスチン抗体と、試料に含まれていたペリオスチンとの抗原抗体反応を行わせる。
　そして、この抗原抗体反応により、「…〔ペリオスチン〕－〔抗ペリオスチン抗体＝ラテックス粒子＝抗ペリオスチン抗体〕－〔ペリオスチン〕－〔抗ペリオスチン抗体＝ラテックス粒子＝抗ペリオスチン抗体〕－〔ペリオスチン〕…」等の架橋が形成され、ペリオスチンを介した、「抗ペリオスチン抗体を固定化したラテックス粒子」同士の複合体凝集物が生成する。
（４）　そして、分析装置又は分光光度計等において、反応混合液に光を照射して、生成したラテックス粒子同士の複合体凝集物により生じるシグナルである適当な波長の透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加を測定することにより、生成した前記複合体凝集物の量、すなわち、試料に含まれていたペリオスチンの量を求める。
（５）　そして、「試料の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値〕」と、「標準液又は標準血清等の標準物質〔濃度既知のペリオスチンを含む試料〕の測定を行って得た測定値〔透過光強度の減少（吸光度の増加）又は散乱光強度の増加の値〕」とを比較することにより、測定を行った試料に含まれるペリオスチンの量（濃度）の算出を行う。
〔９〕．試料
　本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチンの測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体の安定化方法における試料としては、血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、涙液、鼻汁、鼻腔洗浄液、肺胞洗浄液、糞便、腹水若しくは羊水などの体液；あるいは血管若しくは肝臓などの臓器、組織又は細胞などの抽出液等、ペリオスチンが含まれる可能性のある生体試料等の試料であれば対象となる。
　なお、測定に用いる試料の形態は、液体であることが好ましいので、もし試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の処理を既知の方法に従って行い、液体試料としてもよい。
　また、必要に応じて、試料は濃縮処理を行ってもよい。
　また、試料は、その測定の前に、希釈液を添加することにより希釈処理を行ってもよい。
　例えば、試料を抗ペリオスチン抗体固定化担体と接触させ、結合させる前に、試料に希釈液を添加することにより希釈処理を行ってもよい。
　この希釈液として、各種水系溶媒を用いることができる。
　例えば、水、生理食塩水又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等の水系溶媒を用いることができる。
　なお、この緩衝液のｐＨについては、ｐＨ５～ｐＨ１０の範囲にあることが好ましい。
　また、試料が血液（全血）である場合、この全血試料を、水又は界面活性剤を含有する水系溶媒等の低張液と混合し、赤血球を破裂させる処理を行うことが、その後の測定を支障なく行う上で、好ましい。
〔１０〕．測定対象物質
　本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチンの測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体の安定化方法における測定対象物質はペリオスチンである。
　この本発明における測定対象物質としてのペリオスチンとしては、特に限定はなく、ヒト又はウシ、ブタ、イヌ、ネコ、マウス若しくはラットなどの哺乳動物又はニワトリなどの鳥類等由来のペリオスチン等を挙げることができる。
　この測定対象物質としてのペリオスチンとしては、ヒトのペリオスチンが特に好ましい。
〔１１〕．抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法
　本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法は、抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）～（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とするものである。
　（１）界面活性剤及び糖
　（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
　（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
　本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法は、上記の構成により、抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体を安定化することができるものである。
　なお、本発明における抗ペリオスチン抗体、抗ペリオスチン抗体固定化担体、糖、界面活性剤、アルギニン及びその接触方法等の詳細は、前記の通りである。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
〔実施例１〕（本発明の効果の確認－１）
　ヒト血清中のペリオスチンの測定を行い、本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチンの測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法の効果を確かめた。
１．ペリオスチンの調製
　ペリオスチン（ヌクレオチド配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　ＮｕｍｂｅｒＤ１３６６６のヌクレオチド配列、アミノ酸配列：核酸データベースＧｅｎＢａｎｋのＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　ＮｕｍｂｅｒＢＡＡ０２８３７のアミノ酸配列）にＶ５／Ｈｉｓタグを付加させたリコンビナントペリオスチンタンパク質を昆虫細胞であるＳ２細胞において発現させた上で精製した。
　具体的には、Ｓ２細胞の形質転換体は次のように調製した。
　ｐＭＴ／Ｂｉｐ／Ｖ５－ＨｉｓＡプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）にペリオスチンの上記部分をコードするｃＤＮＡを挿入して、これをｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ－Ｖ５－ＨｉｓＡとした。
　次に、Ｓ２細胞にこのｐＭＴ／Ｂｉｐ／ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ－Ｖ５－ＨｉｓＡ及びハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドであるｐＡｃＨｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を公知の方法で共導入し、形質転換した。
　次に、ハイグロマイシンにより形質転換体を選択し、安定形質転換体を得た。
　そして、Ｓ２細胞の形質転換体では、カルボキシ末端にＶ５／Ｈｉｓタグの結合したペリオスチンを発現させた。
　そして、このＣ末端に６個のヒスチジンが結合したＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の精製は次のように行った。
　まず、ペリオスチン遺伝子安定形質転換体Ｓ２細胞の培地に硫酸銅を加えることにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質の発現を誘導した。
　これにより、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質は培養上清中に発現分泌された。
　次に、この培養上清をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕に透析した後、ニッケルレジン（Ｎｉ－ＮＴＡ　Ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国Ｈｉｌｄｅｎ）と混合して、Ｓ２リコンビナントペリオスチンタンパク質をレジンに結合させた。
　次に、レジンを洗浄して夾雑物を取り除き、イミダゾール含有緩衝液にてＳ２リコンビナントペリオスチンタンパク質を溶出することにより、ペリオスチンを取得した。
　なお、作成したプラスミドのＤＮＡの配列を確認し、組み込まれた配列が目的通りのものであることを確認した。
２．抗ペリオスチンモノクローナル抗体
〔１〕抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製－１回目
　以下の手順により、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製を行った。（１回目）
（１）　前記１で調製したペリオスチン溶液１容量に対して、化学合成アジュバントとしてのＴｉｔｅｒ　Ｍａｘ　Ｇｏｌｄ（フナコシ社、日本国東京都）を１容量の割合で混合した。
（２）　次に、雌ラットの足蹠に免疫原として、１０～５０μｇの前記のペリオスチン溶液とＴｉｔｅｒ　Ｍａｘ　Ｇｏｌｄとの混合物を皮下注射し、１０日～２週間後、再度ラットの足蹠に免疫原として、１０～５０μｇの前記のペリオスチン溶液とＴｉｔｅｒ　Ｍａｘ　Ｇｏｌｄとの混合物を皮下注射した。
　なお、ここで、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット〔雌、６～８週齢〕（日本チャールズリバー社、日本国神奈川県横浜市）を用いた。
（３）　最終免疫より３～４日後に、免疫したラットの膝窩、鼠径、腸骨リンパ節内の細胞と、ミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ細胞）を１対１から１０対１の割合で混合し、一般的な方法でポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００、Ｒｏｃｈｅ社、スイス国）を加えて細胞融合させ、生育したハイブリドーマコロニーを選別した。
　具体的には、細胞融合は次のように行った。
　混合した前記リンパ節細胞とミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ細胞）を遠心して上清を除き、室温でポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００、Ｒｏｃｈｅ社、スイス国）１ｍＬに１分間かけて懸濁した後、３７℃で１分間撹拌した。
　血清不含培地１ｍＬを１分間かけて加え、その後、血清不含培地１０ｍＬを１分間かけて加えた。
　細胞を数回洗浄した後、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン含有培地に懸濁して９６穴マイクロタイタープレートに分注して、３７℃において５％ＣＯ２存在下で培養した。
　生育したモノクローナル抗体産生細胞株（融合細胞株）の選別の方法としては、細胞融合から７～１４日後、免疫原に使用した前記のペリオスチンを固定化し、融合細胞培養上清を一次抗体としたＥＬＩＳＡ法の系にて行った。
　このＥＬＩＳＡ法は具体的には、次のように行った。
　１μｇ／ｍＬの前記のペリオスチンを９６穴マイクロタイタープレートに分注し、数時間固定化させた。
　この固定化溶液を洗浄した後、融合細胞培養上清を各ウェルに加え、１時間室温にて静置した。
　融合細胞培養上清を洗浄して、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｌｉｔｔｌｅ　Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）を加え１時間室温に静置した。
　この二次抗体を洗浄後、ＡＢＴＳペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社、メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、米国）を加えて発色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
　生育した融合細胞株の中から一つのクローンを確立し、ＳＳ１８Ａ株と命名した。
（４）　この選別したモノクローナル抗体産生細胞株からＩｇＧを次のように精製した。
　このモノクローナル抗体産生細胞株を、ＧＩＴ培地（日本製薬社、日本国東京都）を用いてＣＯ２インキュベータ内３７℃で培養した。
　培養後、上清中のＩｇＧをプロテインＧカラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、Ｌｉｔｔｌｅ　Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国）に結合させた。
　結合させたＩｇＧを、５０ｍＭクエン酸水溶液（ｐＨ２．６）で溶出した。
　溶出液４容量に対して、１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液〔Ｔｒｉｓ緩衝液〕１容量を添加し、精製ＩｇＧとして、ラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体を前記のモノクローナル抗体産生細胞株より取得した。
　すなわち、ＳＳ１８Ａ株のモノクローナル抗体産生細胞株からラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体（以下、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」という）を得ることができた。
〔２〕抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製－２回目
　前記〔１〕とは別の時に、前記〔１〕の（１）～（４）の記載の通りに操作を行い、再度、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製を行った。（２回目）
　その結果、生育した融合細胞株の中から一つのクローンを確立し、ＳＳ１７Ｂ株と命名した。
　そして、ＳＳ１７Ｂ株のモノクローナル抗体産生細胞株からラット抗ペリオスチンモノクローナル抗体（以下、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」という）を得ることができた。
３．試料
　５種類のヒトの血清試料を各々試料として用いた。
　これらをそれぞれ、血清１、血清２、血清３、血清４及び血清５とした。
４．測定試薬
〔１〕抗体固定化担体試薬
　５種類の抗体固定化担体試薬を、下記の通り調製した。
［１］抗体固定化担体試薬（対照１）
（１）　前記２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８～２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。
（２）　次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８～２４時間静置した。
（３）　次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で３回洗浄した後、この液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（対照１）を調製した。
［２］抗体固定化担体試薬（対照２）
（１）　前記２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８～２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。
（２）　次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８～２４時間静置した。
（３）　次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルよりブロッキング液を吸い出し、除去した。
（４）　次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］の３００μＬを注入し、４℃で１８～２４時間静置した。
（５）　次に、前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェル中の溶液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（対照２）を調製した。
［３］抗体固定化担体試薬（本発明１）
　前記［２］の（４）における０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を、０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］及び１０％（ｗ／ｖ）のスクロースを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液に替えること以外は、前記［２］の（１）～（５）の通りに操作を行い、抗体固定化担体試薬（本発明１）を調製した。
［４］抗体固定化担体試薬（本発明２）
　前記［２］の（４）における０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を、０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］及び５００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液に替えること以外は、前記［２］の（１）～（５）の通りに操作を行い、抗体固定化担体試薬（本発明２）を調製した。
［５］抗体固定化担体試薬（本発明３）
　前記［２］の（４）における０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を、０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び５００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液に替えること以外は、前記［２］の（１）～（５）の通りに操作を行い、抗体固定化担体試薬（本発明３）を調製した。
〔２〕標識抗体試薬
　前記２の〔２〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」にパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を公知の方法により結合させてＰＯＤ標識抗ペリオスチンモノクローナル抗体を調製した。
　これを標識抗体試薬とした。
５．抗体固定化担体試薬の保存
〔１〕２～８℃保存
　前記４の〔１〕の［１］～［５］のそれぞれの抗体固定化担体試薬について２～８℃で１週間保存した。
〔２〕３７℃保存
　前記４の〔１〕の［１］～［５］のそれぞれの抗体固定化担体試薬について３７℃で１週間保存した。
６．測定
（１）　前記３の試料それぞれについて、その１００μＬを前記５の〔１〕の２～８℃で１週間保存した各々の抗体固定化担体試薬のマイクロタイタープレートのウェルに注入し、２５℃にて１８～２４時間静置し、反応を行わせた。
　これにより、試料に含まれるペリオスチンを、前記のウェルに固定化した「抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）」に結合させた。
（２）　次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で５回洗浄した。
（３）　前記４の〔２〕の標識抗体試薬を、０．５％のカゼイン及び１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）で５０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、その１００μＬを前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて９０分間静置し、反応を行わせた。
　これにより、前記の固定化した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」に結合しているペリオスチンに、ＰＯＤを標識した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」を結合させた。
（４）　次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で５回洗浄した。
（５）　次に、ＰＯＤの基質液〔０．８ｍＭの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、２．５ｍＭの過酸化水素、及び３０ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．９）〕の１００μＬを前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて１０分間静置し、反応を行わせ、発色させた。
（６）　その後、前記（５）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．７Ｎの硫酸を注入し、この反応を停止させた。
（７）　次に、分光光度計を用いて、前記（６）のマイクロタイタープレートの各ウェルについて、４５０ｎｍ（主波長）及び５５０ｎｍ（副波長）それぞれにおける吸光度の測定を行った。
　そして、測定した４５０ｎｍ（主波長）における吸光度から５５０ｎｍ（副波長）における吸光度を差し引いた吸光度差の値を求めた。
　なお、この吸光度差の値は、試料に含まれていたペリオスチンの濃度に基づくものである。
（８）　前記１で調製したペリオスチンを試料希釈液〔０．５％のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕で希釈して、ペリオスチンの希釈系列を作成し、これらを標準試料とした。
　次に、これらの標準試料のそれぞれについて、前記（１）～（７）の記載の通りに測定を行い、前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）における「ペリオスチン濃度－吸光度差」の標準曲線（検量線）を作成した。
（９）　前記（７）において測定したマイクロタイタープレートの各ウェルの吸光度差の値を、前記（８）で作成した「ペリオスチン濃度－吸光度差」の標準曲線（検量線）に当てはめ、各試料に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。
（１０）　また、前記（１）における「２～８℃で１週間保存した各々の抗体固定化担体試薬のマイクロタイタープレート」に替えて、前記５の〔２〕の「３７℃で１週間保存した各々の抗体固定化担体試薬のマイクロタイタープレート」を用いること以外は、前記（１）～（９）の記載の通りに操作を行い、各試料に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。
７．測定結果
　前記６における試料に含まれていたペリオスチンの測定結果を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　この表において、左側より、２～８℃で保存した抗体固定化担体試薬を使用した場合のペリオスチン測定値（ｎｇ／ｍＬ）、３７℃で保存した抗体固定化担体試薬を使用した場合のペリオスチン測定値（ｎｇ／ｍＬ）、そして、「３７℃で保存した抗体固定化担体試薬を使用した場合のペリオスチン測定値」を「２～８℃で保存した抗体固定化担体試薬を使用した場合のペリオスチン測定値」で除したときの百分率（％）［以下、「３７℃／２～８℃比率」という］をそれぞれ示す。
８．考察
　本実施例の測定結果である、表１の「３７℃／２～８℃比率」より、次のことが分かる。
（１）　抗体固定化担体試薬（対照１）の使用時に比べて、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させた抗体固定化担体試薬（対照２）の使用時は、「３７℃／２～８℃比率」は下がっている。
（２）　抗体固定化担体試薬（対照１）の使用時に比べて、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤及び糖を接触させた抗体固定化担体試薬（本発明１）の使用時は、「３７℃／２～８℃比率」は大幅に上がっている。
（３）　抗体固定化担体試薬（対照１）の使用時に比べて、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤及びアルギニン塩酸塩を接触させた抗体固定化担体試薬（本発明２）の使用時は、「３７℃／２～８℃比率」は大幅に上がっている。
（４）　抗体固定化担体試薬（対照１）の使用時に比べて、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤、糖及びアルギニン塩酸塩を接触させた抗体固定化担体試薬（本発明３）の使用時は、「３７℃／２～８℃比率」は大幅に上がっている。
　以上のことより、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤及び糖を接触させた場合、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤及びアルギニン塩酸塩を接触させた場合、並びに担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤、糖及びアルギニン塩酸塩を接触させた場合は、抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体が安定化されることが確かめられた。
〔実施例２〕（本発明の効果の確認－２）
　ヒト血清中のペリオスチンの測定を行い、本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチンの測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法の効果を再度確かめた。
１．試料
　１種類のヒトの血清試料を試料として用いた。
２．測定試薬
〔１〕抗体固定化担体試薬
　２種類の抗体固定化担体試薬を、下記の通り調製した。
［１］抗体固定化担体試薬（対照）
（１）　前記実施例１の２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８～２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固定化した。
（２）　次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８～２４時間静置した。
（３）　次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で３回洗浄した後、この液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（対照）を調製した。
［２］抗体固定化担体試薬（本発明）
（１）　前記実施例１の２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８～２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。
（２）　次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８～２４時間静置した。
（３）　次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルよりブロッキング液を吸い出し、除去した。
（４）　次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び５００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液の３００μＬを注入し、４℃で１８～２４時間静置した。
（５）　次に、前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェル中の溶液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（本発明）を調製した。
〔２〕標識抗体試薬
　前記実施例１の２の〔２〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」にパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を公知の方法により結合させてＰＯＤ標識抗ペリオスチンモノクローナル抗体を調製した。
　これを標識抗体試薬とした。
３．抗体固定化担体試薬の保存
　前記２の〔１〕の［１］及び［２］のそれぞれの抗体固定化担体試薬について５℃で１２０日間保存した。
４．測定
　前記２の〔１〕の［１］の抗体固定化担体試薬（対照）については、５℃保存１９日目に以下の測定を行った。
　また、前記２の〔１〕の［２］の抗体固定化担体試薬（本発明）については、５℃保存１９日目、７７日目及び１２０日目にそれぞれ以下の測定を行った。
（１）　前記１の試料について、その１００μＬを前記２の〔１〕の［１］の抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレートのウェルに注入し、２５℃にて１８～２４時間静置し、反応を行わせた。
　これにより、試料に含まれるペリオスチンを、前記のウェルに固定化した「抗ペリオスチン抗体（ＳＳ１８Ａ）」に結合させた。
（２）　次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で５回洗浄した。
（３）　前記２の〔２〕の標識抗体試薬を、０．５％のカゼイン及び１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）で５０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、その１００μＬを前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて９０分間静置し、反応を行わせた。
　これにより、前記の固定化した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」に結合しているペリオスチンに、ＰＯＤを標識した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１７Ｂ）」を結合させた。
（４）　次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で５回洗浄した。
（５）　次に、ＰＯＤの基質液〔０．８ｍＭの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、２．５ｍＭの過酸化水素、及び３０ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．９）〕の１００μＬを前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて１０分間静置し、反応を行わせ、発色させた。
（６）　その後、前記（５）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．７Ｎの硫酸を注入し、この反応を停止させた。
（７）　次に、分光光度計を用いて、前記（６）のマイクロタイタープレートの各ウェルについて、４５０ｎｍ（主波長）及び５５０ｎｍ（副波長）それぞれにおける吸光度の測定を行った。
　そして、測定した４５０ｎｍ（主波長）における吸光度から５５０ｎｍ（副波長）における吸光度を差し引いた吸光度差の値を求めた。
　なお、この吸光度差の値は、試料に含まれていたペリオスチンの濃度に基づくものである。
（８）　前記実施例１の１で調製したペリオスチンを試料希釈液〔０．５％のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕で希釈して、ペリオスチンの希釈系列を作成し、これらを標準試料とした。
　次に、これらの標準試料のそれぞれについて、前記（１）～（７）の記載の通りに測定を行い、前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）における「ペリオスチン濃度－吸光度差」の標準曲線（検量線）を作成した。
（９）　前記（７）において測定したマイクロタイタープレートの各ウェルの吸光度差の値を、前記（８）で作成した「ペリオスチン濃度－吸光度差」の標準曲線（検量線）に当てはめ、各試料に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。
（１０）　また、前記（１）における「抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレート」に替えて、前記２の〔１〕の［２］の「抗体固定化担体試薬（本発明）のマイクロタイタープレート」を用いること以外は、前記（１）～（９）の記載の通りに操作を行い、試料に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。
５．測定結果
　前記４における試料に含まれていたペリオスチンの測定結果を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　なお、この表において、（カッコ）内の数値は、５℃保存後のペリオスチン測定値を保存開始時のペリオスチン測定値で除したときの百分率（％）をそれぞれ示す。
６．考察
　この表より、「抗体固定化担体試薬（本発明）のマイクロタイタープレート」を用いる本発明の場合は、５℃保存１２０日目迄、ペリオスチンの測定値に変化がないことが分かる。
　これに対して、「抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレート」を用いる対照の場合は、５℃保存１９日目で、ペリオスチンの測定値が大幅に低下してしまっていることが分かる。
　以上のことより、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤、糖及びアルギニンを接触させた場合は、抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体が安定化されることが再度確かめられた。
〔実施例３〕（本発明の効果の確認－３）
　ヒト血清中のペリオスチンの測定を行い、本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチンの測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法の効果を再度確かめた。
１．抗ペリオスチンモノクローナル抗体
〔１〕抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製－３回目
　前記実施例１の２とは別の時に、前記実施例１の２の〔１〕の（１）～（４）の記載の通りに操作を行い、再度、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製を行った。（３回目）
　その結果、生育した融合細胞株の中から一つのクローンを確立し、ＳＳ２０Ａ株と命名した。
　そして、ＳＳ２０Ａ株のモノクローナル抗体産生細胞株からマウス抗ペリオスチンモノクローナル抗体（以下、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２０Ａ）」という）を得ることができた。
〔２〕抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製－４回目
　前記実施例１の２及び前記〔１〕とは別の時に、前記実施例１の２の〔１〕の（１）～（４）の記載の通りに操作を行い、再度、抗ペリオスチンモノクローナル抗体の調製を行った。（４回目）
　その結果、生育した融合細胞株の中から一つのクローンを確立し、ＳＳ１９Ｄ株と命名した。
　そして、ＳＳ１９Ｄ株のモノクローナル抗体産生細胞株からマウス抗ペリオスチンモノクローナル抗体（以下、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１９Ｄ）」という）を得ることができた。
２．試料
　１種類のヒトの血清試料を試料として用いた。
３．測定試薬
〔１〕抗体固定化担体試薬
　２種類の抗体固定化担体試薬を、下記の通り調製した。
［１］抗体固定化担体試薬（対照）
（１）　前記１の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２０Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８～２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２０Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固定化した。
（２）　次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８～２４時間静置した。
（３）　次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で３回洗浄した後、この液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（対照）を調製した。
［２］抗体固定化担体試薬（本発明）
（１）　前記１の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２０Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８～２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２０Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。
（２）　次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８～２４時間静置した。
（３）　次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルよりブロッキング液を吸い出し、除去した。
（４）　次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び５００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液の３００μＬを注入し、４℃で１８～２４時間静置した。
（５）　次に、前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェル中の溶液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（本発明）を調製した。
〔２〕標識抗体試薬
　前記１の〔２〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１９Ｄ）」にパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を公知の方法により結合させてＰＯＤ標識抗ペリオスチンモノクローナル抗体を調製した。
　これを標識抗体試薬とした。
３．抗体固定化担体試薬の保存
　前記３の〔１〕の［１］及び［２］のそれぞれの抗体固定化担体試薬について５℃及び３０℃各々の温度で１５０日間保存した。
４．測定
　前記３の〔１〕の［１］の抗体固定化担体試薬（対照）については、保存開始日、保存３０日目及び１５０日目にそれぞれ以下の測定を行った。
　また、前記３の〔１〕の［２］の抗体固定化担体試薬（本発明）については、保存開始日、保存３０日目、５５日目及び１５０日目にそれぞれ以下の測定を行った。
（１）　前記２の試料について、その１００μＬを前記３の〔１〕の［１］の抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレートのウェルに注入し、２５℃にて１８～２４時間静置し、反応を行わせた。
　これにより、試料に含まれるペリオスチンを、前記のウェルに固定化した「抗ペリオスチン抗体（ＳＳ２０Ａ）」に結合させた。
（２）　次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で５回洗浄した。
（３）　前記３の〔２〕の標識抗体試薬を、０．５％のカゼイン及び１００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）で５０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、その１００μＬを前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて９０分間静置し、反応を行わせた。
　これにより、前記の固定化した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ２０Ａ）」に結合しているペリオスチンに、ＰＯＤを標識した「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１９Ｄ）」を結合させた。
（４）　次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルを０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］を含有するリン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］で５回洗浄した。
（５）　次に、ＰＯＤの基質液〔０．８ｍＭの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、２．５ｍＭの過酸化水素、及び３０ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．９）〕の１００μＬを前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェルに注入し、２５℃にて１０分間静置し、反応を行わせ、発色させた。
（６）　その後、前記（５）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．７Ｎの硫酸を注入し、この反応を停止させた。
（７）　次に、分光光度計を用いて、前記（６）のマイクロタイタープレートの各ウェルについて、４５０ｎｍ（主波長）及び５５０ｎｍ（副波長）それぞれにおける吸光度の測定を行った。
　そして、測定した４５０ｎｍ（主波長）における吸光度から５５０ｎｍ（副波長）における吸光度を差し引いた吸光度差の値を求めた。
　なお、この吸光度差の値は、試料に含まれていたペリオスチンの濃度に基づくものである。
（８）　前記実施例１の１で調製したペリオスチンを試料希釈液〔０．５％のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕で希釈して、ペリオスチンの希釈系列を作成し、これらを標準試料とした。
　次に、これらの標準試料のそれぞれについて、前記（１）～（７）の記載の通りに測定を行い、前記の抗ペリオスチンモノクローナル抗体を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）における「ペリオスチン濃度－吸光度差」の標準曲線（検量線）を作成した。
（９）　前記（７）において測定したマイクロタイタープレートの各ウェルの吸光度差の値を、前記（８）で作成した「ペリオスチン濃度－吸光度差」の標準曲線（検量線）に当てはめ、各試料に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。
（１０）　また、前記（１）における「抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレート」に替えて、前記３の〔１〕の［２］の「抗体固定化担体試薬（本発明）のマイクロタイタープレート」を用いること以外は、前記（１）～（９）の記載の通りに操作を行い、試料に含まれていたペリオスチンの濃度を求めた。
５．測定結果
　前記４における試料に含まれていたペリオスチンの測定結果を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　なお、この表において、（カッコ）内の数値は、保存後のペリオスチン測定値を保存開始日のペリオスチン測定値で除したときの百分率（％）をそれぞれ示す。
６．考察
　この表より、「抗体固定化担体試薬（本発明）のマイクロタイタープレート」を用いる本発明の場合は、５℃保存１５０日目迄、ペリオスチンの測定値にほとんど変化がないことが分かる。
　また、この表より、「抗体固定化担体試薬（本発明）のマイクロタイタープレート」を用いる本発明の場合は、３０℃保存１５０日目迄、ペリオスチンの測定値の低下を抑制できていることが分かる。
　これに対して、「抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレート」を用いる対照の場合は、５℃保存時及び３０℃保存時とも１５０日目で、ペリオスチンの測定値が大幅に低下してしまっていることが分かる。
　以上のことより、本発明の場合は、抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体が安定化されることが再度確かめられた。
〔実施例４〕（本発明の効果の確認－４）
　本発明の抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチンの測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体の安定化方法の効果を再度確かめた。
１．測定試薬
２種類の抗体固定化担体試薬を、下記の通り調製した。
［１］抗体固定化担体試薬（対照）
（１）　前記実施例１の２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８～２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固定化した。
（２）　次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８～２４時間静置した。
（３）　次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルよりブロッキング液を吸い出し、除去した。
（４）　次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び５００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液の３００μＬを注入し、４℃で２４時間静置した。
（５）　次に、前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェル中の溶液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（対照１）を調製した。
［２］抗体固定化担体試薬（本発明）
（１）　前記実施例１の２の〔１〕の「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〔１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．６８ｍＭの塩化カリウム、１．４７ｍＭのリン酸二水素カリウム、及び８．０４ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含有する水溶液（ｐＨ７．４）〕により２μｇ／ｍＬとなるように希釈し、これを９６穴マイクロタイタープレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ社、イリノイ州、米国）の各ウェルに１００μＬずつ注入した後、２５℃で１８～２４時間静置し、「抗ペリオスチンモノクローナル抗体（ＳＳ１８Ａ）」をこのマイクロタイタープレートの各ウェルに固相化した。
（２）　次に、前記（１）のマイクロタイタープレートの各ウェルに、ブロッキング液〔０．５％（ｗ／ｖ）のカゼイン、１００ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液［Ｔｒｉｓ緩衝液］（ｐＨ８．０）〕を各ウェルに２００μＬ注入し、４℃で１８～２４時間静置した。
（３）　次に、前記（２）のマイクロタイタープレートの各ウェルよりブロッキング液を吸い出し、除去した。
（４）　次に、前記（３）のマイクロタイタープレートの各ウェルに０．０５％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート［商品名：Ｔｗｅｅｎ２０］、１０％（ｗ／ｖ）のスクロース及び５００ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液の３００μＬを注入し、４℃で１８～２４時間静置した。
（５）　次に、前記（４）のマイクロタイタープレートの各ウェル中の溶液を吸い出し、除去し、その後真空乾燥して、抗体固定化担体試薬（本発明）を調製した。
２．抗体固定化担体試薬の乾燥
　前記１の［１］及び［２］のそれぞれの抗体固定化担体試薬について、室温で２４時間、真空乾燥により乾燥処理を行った。
３．観察
　前記１の［１］及び［２］のそれぞれの抗体固定化担体試薬について、前記２において乾燥処理を行った後のマイクロタイタープレートのウェルを観察した。
４．測定結果
　前記３における観察結果であるそれぞれの画像を図１に示した。
５．考察
　本実施例の測定結果である図１より、「抗体固定化担体試薬（対照）のマイクロタイタープレート」のウェルにおいては乾燥処理後に抗体固定化層が結晶化により凸状となってしまっているのに対して、「抗体固定化担体試薬（本発明）のマイクロタイタープレート」のウェルにおいては乾燥処理後に抗体固定化層が結晶化せず平滑であることが分かる。
　以上のことより、担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に界面活性剤を接触させた場合は、抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗ペリオスチン抗体が結晶化されず平滑に固定化されることが確かめられた。

 

Claims (3)

  1. 　抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）～（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とする抗ペリオスチン抗体固定化担体。
    　（１）界面活性剤及び糖
    　（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
    　（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩
  2. 　請求項１記載の抗ペリオスチン抗体固定化担体を含むペリオスチンの測定試薬。
  3. 　抗ペリオスチン抗体を担体に固定化した抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗体の安定化方法であって、この担体に固定化した抗ペリオスチン抗体に、下記（１）～（３）から選択される安定化物質を接触させたことを特徴とする抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗体の安定化方法。
    　（１）界面活性剤及び糖
    　（２）界面活性剤及びアルギニン若しくはその塩
    　（３）界面活性剤、糖及びアルギニン若しくはその塩

     
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