JP5382570B2 - ヒトｈｍｇｂ１と特異的に結合する鳥類由来の抗体、ヒトｈｍｇｂ１の免疫学的測定方法及びヒトｈｍｇｂ１の免疫学的測定試薬 - Google Patents

Description

本発明は、敗血症等の疾患のマーカーとなりうるヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する鳥類由来の抗体、当該抗体を使用する試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法、当該抗体を含む試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬、鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法、及び抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法に関するものである。
本発明は、臨床検査、臨床病理学、免疫学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。

ＨＭＧＢ（ハイ モビリティー グループ ボックス プロテイン；Ｈｉｇｈ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｇｒｏｕｐ Ｂｏｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、以前、ＨＭＧ（ハイ モビリティー グループ プロテイン；Ｈｉｇｈ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ Ｇｒｏｕｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれていたが、これはクロマチン構造に含まれる大量の非ヒストンタンパク質として１９６４年に発見され、すべての高等動植物に普遍的に含まれるタンパク質であり、種族間で一次構造の保存性は極めて高い。
また、核内ばかりではなく、細胞質内にも豊富に存在することが分かっている。
生理作用ははっきりとは分かっていないが、ＨＭＧＢはＤＮＡと結合する際に二重らせん構造を緩めることから、転写反応の際にＤＮＡの高次構造を最適構造に変化させて転写活性を高めるという、極めて広範囲の転写促進因子及びヌクレオソーム弛緩因子として機能すると考えられている。
ＨＭＧＢには、いくつかの種類が存在する。
例えば、ＨＭＧＢ１（ハイ モビリティー グループ ボックス プロテイン１）、ＨＭＧＢ２（ハイモビリティー グループ ボックス プロテイン２）、ＨＭＧＢ３（ハイモビリティー グループ ボックス プロテイン３）、ＨＭＧＢ８（ハイモビリティー グループ ボックス プロテイン８）、ＨＭＧＢ１７（ハイモビリティー グループ ボックス プロテイン１７）、ＨＭＧＢ Ｉ（ハイモビリティー グループ ボックス プロテイン Ｉ）、ＨＭＧＢ Ｙ（ハイモビリティー グループ ボックス プロテイン Ｙ）、ＨＭＧＢ Ｉ（Ｙ）（ハイモビリティー グループ ボックス プロテイン Ｉ（Ｙ））、ＨＭＧＢ Ｉ−Ｃ（ハイモビリティー グループ ボックス プロテイン Ｉ−Ｃ）等を挙げることができる。
なお、本発明者らが、遺伝情報処理ソフトウェア「ＧＥＮＥＴＹＸ」（ＳＯＦＴＷＡＲＥ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ社）を使用してアミノ酸配列の相同性の解析を行ったところ、ヒトのＨＭＧＢ１に対して、ウシＨＭＧＢ１の相同性は９８．６％であり、ブタＨＭＧＢ１の相同性は９９．１％であった。
また、同様に、ヒトのＨＭＧＢ１に対して、ヒトのＨＭＧＢ２の相同性は８１．２％であり、ウシＨＭＧＢ２との相同性は７２．３％であり、ブタのＨＭＧＢ２との相同性は７９．４％であった。
ワング（Ｗａｎｇ）らは１９９９年に、ＨＭＧＢ１自体を免疫原として調製したポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロット法により、初めて血清中（血液中）のＨＭＧＢ１の定量測定を行った。
その結果、ワングらは、ＨＭＧＢ１が敗血症のマーカーとなりうることを示した。
そして、敗血症の患者において、生き残る患者と、死に至る患者を判別することが、精密に血液中のＨＭＧＢ１を測定することによって可能であることを示した（非特許文献１参照。）。
なお、先に、ＨＭＧＢ１の測定に用いる抗体、即ちＨＭＧＢ１に結合する抗体については、パーキネン（Ｐａｒｋｋｉｎｅｎ）らや、レップ（Ｌｅｐｐ）らによって調製可能なことが示されていた（非特許文献２参照。非特許文献３参照。）。
この抗体を用いてレップらはＨＭＧＢ１に関して固相酵素免疫測定法（Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が可能であることを述べている。
また、カバート（Ｃａｂａｒｔ）らにより、ヒトＨＭＧＢ１及びヒトＨＭＧＢ２の調製方法が示されていた（非特許文献４参照。）。
また、ＨＭＧＢ１は、炎症でも誘導され、このことが各種サイトカインの大量分泌の原因と考えられるという文献も発表されている（非特許文献５参照。非特許文献６参照。非特許文献７参照。）。
これらのことより、ただ単に血液中にＨＭＧＢ１が存在するか否かを定性的に確認することよりも、正確かつ精密に、ＨＭＧＢ１を定量的に測定することの有用性は明らかである。
なお、本発明者らは、先に、ヒトＨＭＧＢ１には結合するが、ヒトＨＭＧＢ２には結合しない抗体、及びＨＭＧＢ２を測り込むことなく、誤差を含まない正確な測定値を得ることができるヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法を開発した（特許文献１参照。）。
特開２００３−９６０９９号公報 Ｈ．Ｗａｎｇら，ＳＣＩＥＮＣＥ，２８５巻，９号，２４８〜２５１頁，１９９９年発行 Ｊ．Ｐａｒｋｋｉｎｅｎら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８巻，２６号，１９７２６〜１９７３８頁，１９９３年発行 Ｗ．Ａ．Ｌｅｐｐら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，１０巻，４号，４４９〜４６５頁，１９８９年発行 Ｐ．Ｃａｂａｒｔら，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ １３，１２５〜１３３頁，１９９５年発行 Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｕら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９２巻，５６５〜５７０頁，２０００年発行 Ｓｃａｆｆｉｄｌら，Ｎａｔｕｒｅ，４１８巻，１９１〜１９５頁，２００２年発行 Ｐａｒｋら，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７９巻，２７号，２００４年発行

上述のように、試料中のヒトＨＭＧＢ１を正確かつ精密に定量測定することが求められてきているが、しかしながら、この正確かつ精密なヒトＨＭＧＢ１の定量測定に耐えうる抗ヒトＨＭＧＢ１抗体、すなわちヒトＨＭＧＢ１との結合能力（力価）が高い抗体を得ることは容易なことではなかった。
この理由について、以下記載する。
測定を行おうとする測定対象物質に特異的に結合する抗体を調製する場合、通常、飼育し易い動物（ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス又はラット等）に、この測定対象物質の全部又は一部、或いはこれらに担体（キャリア）を結合したものを、前記動物に注射等をして免疫を行う。
また、この測定対象物質、又はこの測定対象物質と担体の結合物を、動物に免疫する際に、通常、測定対象物質との結合能力が高い抗体を誘導して取得する為に、アジュバントを前記測定対象物質等に混合するなど、種々の工夫がなされている。
ところで、本発明者らは、ウサギ、マウス又はウシ等の哺乳類動物に、ヒトＨＭＧＢ１又はその一部を注射し免疫して、ヒトＨＭＧＢ１と特異的に結合する抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を取得しようとしたが、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い抗体はごく僅かしか得ることができなかった。
例えば、ウサギ４羽それぞれにヒトＨＭＧＢ１を注射し免疫した場合、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を得ることはできず、これらのウサギ４羽から得られた抗体は、いずれも結合能力が低い、低力価のものであった。
また、例えば、ウサギ１０羽それぞれにヒトＨＭＧＢ１の一部を注射し免疫した場合、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が得られたのは、これらのウサギ１０羽の内、わずか１羽だけであり、あとの９羽から得られた抗体は、いずれも結合能力が低い、低力価のものであった。
これらのことより、本発明者らは、通常、抗体の取得のために免疫動物として使用されるウサギ、マウス又はウシ等の哺乳類動物に、ヒトＨＭＧＢ１の全部又は一部を免疫した場合、得られる抗体のほとんどは、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が低い、低力価のものであり、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗体が得られる確率は、非常に小さいものであることを確認するに至った。
そこで、本発明者らは、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗体を、高い確率で取得すべく検討を重ねたところ、免疫動物として鳥類を用い、かつ特定のアミノ酸配列を含むペプチドを免疫原として用いることにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

ウサギ、マウス又はウシ等の動物にヒトＨＭＧＢ１の全部又は一部を免疫した場合、得られる抗体のほとんどがヒトＨＭＧＢ１との結合能力が低い低力価のものであるのは何故なのか、更にヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗体を得られる確率が非常に低いのは何故なのか、ということについて、本発明者らは継続的に検討した。
その結果、本発明者らは、ウサギ、マウス又はウシ等の動物に、ヒトＨＭＧＢ１又はその一部を注射し免疫した場合、これらの動物の体内に当該動物のＨＭＧＢ１が生成されることを見出した。
これは、ヒトＨＭＧＢ１は、これを注射され免疫される動物にとっては異物であり、この異物を体内に入れられることは当該動物にとっては大きなストレスとなり、このストレスに対する反応として、当該動物の生体内に当該動物のＨＭＧＢ１が反応物質として生成してくるものと推察される。
そして、通常、抗体の産生及び取得に用いられるウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス及びラット等の動物においては、これらの動物のＨＭＧＢ１のアミノ酸配列（一次構造）が、ヒトのＨＭＧＢ１のアミノ酸配列（一次構造）と、２〜３のアミノ酸残基でしか相違しない。
よって、「ヒトＨＭＧＢ１をこれらの動物に注射し免疫したことにより反応物質としてこれらの動物の体内に生成したこれらの動物のＨＭＧＢ１」は、ヒトＨＭＧＢ１との相同性が極めて高いため、「ヒトＨＭＧＢ１をこれらの動物に注射し免疫することによりこれらの動物の体内に産生した抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」と、これらの動物の体内で結合してしまうことになる。
従い、これらの動物の体内に産生した抗ヒトＨＭＧＢ１抗体は、これらの動物の体内において、これらの動物の体内で産生されたＨＭＧＢ１と結合してしまっているため（又は結合してしまっているものが多いため）、更にヒトのＨＭＧＢ１と結合することができず（又は結合できるものが少なく）、このため、この抗ヒトＨＭＧＢ１抗体は、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が低く低力価であり、更にヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗体が得られる確率が非常に小さいものであると推察される。
上述の通り、ウサギ、マウス又はウシ等の動物に、ヒトＨＭＧＢ１又はその一部を注射し免疫した場合に、これらの動物の体内に当該動物のＨＭＧＢ１が生成されるということを、本発明者らが初めて見出し、そして、このため、この生成した当該動物のＨＭＧＢ１が、産生された抗ヒトＨＭＧＢ１抗体と当該動物の体内で結合してしまうことにより、得られた抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が低力価のものとなり、そして高力価の抗体が得られる確率が非常に小さいものとなることに、本発明者らが初めて想到するに至った。
この本発明者らが見出した知見を土台として、本発明者らは、ＨＭＧＢ１のアミノ酸配列（一次構造）がヒトとは相同性が高くない鳥類に注目し、免疫動物として鳥類を用い、かつ免疫原として鳥類のＨＭＧＢ１のアミノ酸配列と相同性が低いヒトのＨＭＧＢ１のアミノ酸配列の部分を含むペプチドを使用することにより、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗体を、高い確率で取得することができることを初めて見出した。
すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
（１） ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys
Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に特異的に結合する鳥類由来の抗体よりなる、鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体。
（２） 鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を免疫原とし、当該免疫原を鳥類に免疫して得たものである、前記（１）記載の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体。
（３） １〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことが、１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことである、前記（２）記載の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体。
（４） 鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高くかつその生産性が高いものである、前記（１）〜（３）のいずれかに記載の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体。
（５） 鳥類がニワトリである、前記（１）〜（４）のいずれかに記載の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体。
（６） 試料中のヒトＨＭＧＢ１を当該ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体との抗原抗体反応を利用して測定を行う免疫学的測定方法において、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に特異的に結合する鳥類由来の抗体である鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を使用することを特徴とする、試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法。
（７） 鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro
Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を免疫原とし、当該免疫原を鳥類に免疫して得たものである、前記（６）記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法。
（８） １〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことが、１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことである、前記（７）記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法。
（９） 鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高くかつその生産性が高いものである、前記（６）〜（８）のいずれかに記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法。
（１０） 高感度にヒトＨＭＧＢ１の測定を行うことができる高感度免疫学的測定方法であることを特徴とする、前記（６）〜（９）のいずれかに記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法。
（１１） 鳥類がニワトリである、前記（６）〜（１０）のいずれかに記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法。
（１２） 試料中のヒトＨＭＧＢ１を当該ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体との抗原抗体反応を利用して測定を行う免疫学的測定試薬において、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に特異的に結合する鳥類由来の抗体である鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を含むことを特徴とする、試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬。
（１３） 鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro
Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を免疫原とし、当該免疫原を鳥類に免疫して得たものである、前記（１２）記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬。
（１４） １〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことが、１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことである、前記（１３）記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬。
（１５） 鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高くかつその生産性が高いものである、前記（１２）〜（１４）のいずれかに記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬。
（１６） 高感度にヒトＨＭＧＢ１の測定を行うことができる高感度免疫学的測定試薬であることを特徴とする、前記（１２）〜（１５）のいずれかに記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬。
（１７） 当該免疫学的測定試薬の生産性を向上させた免疫学的測定試薬であることを特徴とする、前記（１２）〜（１６）のいずれかに記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬。
（１８） 鳥類がニワトリである、前記（１２）〜（１７）のいずれかに記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬。
（１９） ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys
Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を免疫原とし、当該免疫原を鳥類に免疫することを特徴とする、鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法。
（２０） １〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことが、１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことである、前記（１９）記載の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法。
（２１） 鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro
Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に特異的に結合することができるものである、前記（１９）又は（２０）のいずれかに記載の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法。
（２２） 鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高くかつその生産性が高いものである、前記（１９）〜（２１）のいずれかに記載の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法。
（２３） 鳥類がニワトリである、前記（１９）〜（２２）のいずれかに記載の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法。
（２４） ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro Asp Ala Ala Lys
Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を免疫原とし、当該免疫原を鳥類に免疫することを特徴とする、抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法。
（２５） １〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことが、１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことである、前記（２４）記載の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法。
（２６） 抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro Asp
Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に特異的に結合することができるものである、前記（２４）又は（２５）のいずれかに記載の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法。
（２７） 抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高いものである、前記（２４）〜（２６）のいずれかに記載の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法。
（２８） 鳥類がニワトリである、前記（２４）〜（２７）のいずれかに記載の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法。

本発明の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体は、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い、高力価の抗体である。
また、本発明の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体は、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗体を高い確率で取得し得る、その生産性が高いものである。
本発明の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法は、試料中にごく微量に含まれるヒトＨＭＧＢ１までも正確に測定することができる、高感度な免疫学的測定方法である。
本発明の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬は、試料中にごく微量に含まれるヒトＨＭＧＢ１までも正確に測定することができる、高感度な免疫学的測定試薬である。
また、本発明の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬は、測定の感度が低い不合格品（不良品）を生産する可能性が小さく、当該免疫学的測定試薬の生産の歩留まりが良いものであり、当該免疫学的測定試薬の生産性を向上させた免疫学的測定試薬である。
本発明の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法は、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を取得することができる方法である。
また、本発明の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法は、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を高い確率で得ることができる、生産性が高い方法である。
本発明の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法は、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を高い確率で得ることができる、抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得の生産性を向上させることができる方法である。

図１は、本発明の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の、ヒトＨＭＧＢ１及びヒトＨＭＧＢ２との反応性を確かめたウエスタンブロット法の結果を示した図である。
図２は、本発明の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法により、ヒトＨＭＧＢ１を含む試料を測定して作成した検量線を示した図である。

〔Ｉ〕鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体
（１）本発明の抗体
本発明の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」は、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に特異的に結合する鳥類由来の抗体である。
この本発明の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」は、鳥類由来であって、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に特異的に結合することができる抗体であれば、いかなるものでもよい。
本発明の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」においては、その由来が鳥類由来であればよい。
この鳥類としては、例えば、ニワトリ、ウズラ、キジ、ダチョウ又はアヒル等を挙げることができる。
この鳥類としては、キジ科の鳥が好ましく、特にニワトリが好ましい。
なお、本発明の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」は、ポリクローナル抗体、ポリクローナル抗体を含む抗血清、モノクローナル抗体、又はこれらの抗体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２又はＦａｂ’など）等のいずれのものであってもよい。
（２）免疫原
本発明の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を取得するために、鳥類に免疫する免疫原について、以下説明を行う。
本発明の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を取得するための免疫原としては、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を挙げることができる。
なお、前記の数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾における数個であるが、通常１〜４個、好ましくは１〜３個、更に好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個である。
この本発明の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を取得するための免疫原としては、次式（Ｉ）：Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチドと担体との結合物が好ましく、特に前記の式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチドと担体との結合物が好ましい。
免疫原として、前記の式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を用い、これを鳥類に免疫した場合、得られる「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」は、前記の式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に特異的に結合することができるものである。
この場合、前記の式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列は、鳥類のＨＭＧＢ１のアミノ酸配列と相同性が低いヒトのＨＭＧＢ１のアミノ酸配列の部分であるので、前記の免疫原を鳥類に免疫して得られる「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」は、次の２つの特徴を有するものである。
（ａ） ヒトのＨＭＧＢ１と特異的に結合することができるものである。
（ｂ） 前記免疫原の免疫により前記鳥類の体内に生成するＨＭＧＢ１とは結合できないもの（又は結合し難いもの）であるので、この前記鳥類の体内に生成したＨＭＧＢ１とは結合しておらず（又は結合するものが少なく）、このため、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗体であって、かつこれが高い確率で得られるものである。
なお、前記の式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列は、ヒトのＨＭＧＢ２のアミノ酸配列と相同性が低いヒトのＨＭＧＢ１のアミノ酸配列の部分でもあるので、免疫原として、前記の式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を用いた場合、得られる「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」は、ＨＭＧＢ１に特異的に結合するが、ＨＭＧＢ２には結合しないという特徴も有するものである。
よって、この点においても、免疫原として、前記の式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を用いて、取得される「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」は、ヒトＨＭＧＢ１に特異的なものとして有用なものである。
（３）結合特異性及び生産性
本発明の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」は、上述の通り、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い、高力価の抗体である。
更に、本発明の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」は、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗体を高い確率で取得し得る、その生産性が高いものである。
（４）本発明の抗体の免疫原の取得方法
本発明の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を取得するために、鳥類に免疫する免疫原の取得方法について、以下説明を行う。
前記の免疫原として、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１ないし数個（通常１〜４個、好ましくは１〜３個、更に好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個）のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を挙げることができるが、これはヒト又はヒトのＨＭＧＢ１のアミノ酸配列と相同性が高いヒト以外の哺乳類動物（ブタ、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス又はラット等）の体液、細胞、組織又は臓器等より、公知の方法等により抽出、精製等して、取得することができる。
また、前記の免疫原は、液相法及び固相法等のペプチド合成の方法により合成することができ、更にペプチド自動合成装置を用いてもよい。
例えば、日本生化学会編「生化学実験講座１ タンパク質の化学ＩＶ」，東京化学同人，１９７５年；泉屋ら「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，１９８５年；又は日本生化学会編「続生化学実験講座２ タンパク質の化学 下」，東京化学同人，１９８７年等に記載された方法に従い合成することができる。
更に、前記の免疫原は、対応する核酸塩基配列を持つＤＮＡ又はＲＮＡより遺伝子工学技術を用いて調製してもよく、日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法Ｉ」，東京化学同人，１９８６年；日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法ＩＩ」，東京化学同人，１９８６年；又は日本生化学会編「続生化学実験講座１ 遺伝子研究法ＩＩＩ」，東京化学同人，１９８７年等を参照して調製すればよい。
例えば、ヒトＨＭＧＢ１の前記の式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に対応する遺伝子をクローニングし、得られた遺伝子をプラスミド等の発現ベクターへ組み込む。
次に、この発現ベクターを大腸菌等の宿主細胞に導入し、得られた形質変換体を培養することにより前記の式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチドを発現させることができる。
なお、遺伝子の塩基配列をクローニングする方法としては、例えば、ＰＣＲ法、リコンビナントＰＣＲ法、ライゲーション法、又はリンカーライゲーション法等を挙げることができる。
ところで、免疫原が低分子物質の場合には、免疫原に担体（キャリア）を結合させたものを動物等に免疫するのが一般的ではあるが、アミノ酸数５のペプチドを免疫原としてこれに対する特異抗体を産生させたとの報告（木山ら，「日本薬学会第１１２回年会講演要旨集３」，１２２頁，１９９２年発行）もあるので、担体を使用することは必須ではない。
なお、免疫原として、前記の式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチドと担体との結合物、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチドと担体との結合物を用いる場合の担体としては、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ニワトリ血清アルブミン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリアラニルリシン、ジパルミチルリシン、破傷風トキソイド又は多糖類等の担体として公知なものを用いることができる。
前記のペプチドと担体との結合法は、グルタルアルデヒド法、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド法、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル法、ビスジアゾ化ペンジジン法又はＮ−サクシミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸法等の公知の結合法を用いることができる。
また、ニトロセルロース粒子、ポリビニルピロリドン又はリポソーム等の担体に前記のペプチドを吸着させたものも本発明の免疫原とすることができる。
（５）本発明の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体（ポリクローナル抗体）の取得方法
（イ）ポリクローナル抗体の血清からの取得
本発明の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」において、ポリクローナル抗体又は抗血清は、以下の操作により、免疫原を免疫した鳥類の血清から取得することができる。
まず、前記の免疫原をニワトリ等の鳥類に免疫する。
この前記の免疫原を免疫する量は、免疫する鳥類の種類、又は免疫注射部位等により決められるものであるが、ニワトリの場合にはニワトリ一羽当り一回につき１０μｇ〜１ｍｇの前記免疫原を免疫注射することが好ましい。
なお、この前記の免疫原は、アジュバントと添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知のものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
初回免疫後、２〜３週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原を追加免疫注射する。
この場合も、前記の免疫原は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
初回免疫の後、免疫した鳥類の血清中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら全採血を行い、血清を分離して本発明の抗体を含む抗血清を得る。
この抗血清を、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法若しくはアフィニティークロマトグラフィー等の方法、又はこれらの方法を組み合わせて抗体の精製を行い、ポリクローナル抗体を得る。
（ロ）ポリクローナル抗体の卵からの取得
本発明の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」において、ポリクローナル抗体は、以下の操作により、免疫原を免疫した鳥類の卵から取得することができる。
まず、前記の免疫原をニワトリ等の鳥類のメスに免疫する。
この前記の免疫原を免疫する量は、免疫する鳥類の種類、免疫注射部位等により決められるものであるが、ニワトリの場合にはニワトリのメス一羽当り一回につき１０μｇ〜１ｍｇの前記免疫原を免疫注射することが好ましい。
なお、この前記の免疫原は、アジュバントと添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日菌アジュバント等の公知のものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
初回免疫後、２〜３週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原を追加免疫注射する。
この場合も、前記の免疫原は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
初回免疫の後、免疫した鳥類が産卵した卵中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、この時以降に産卵する卵より卵黄を得る。
この卵黄を、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム等による塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法若しくはアフィニティークロマトグラフィー等の方法、又はこれらの方法を組み合わせて抗体の精製を行い、ポリクローナル抗体を得る。
（ハ）担体に対する抗体の吸収除去操作
免疫原として前記のペプチドと担体との結合物を用いて鳥類に免疫した場合には、得られた抗血清又はポリクローナル抗体中に、この担体に対する抗体（即ち、当該担体に結合する抗体）が存在するので、このような担体に対する抗体の吸収除去処理を行うことが好ましい。
この除去処理方法としては、担体を、得られたポリクローナル抗体又は抗血清の溶液中に添加して生成した凝集物を取り除くか、又は担体を不溶化固相に固定化してアフィニティークロマトグラフィーにより除去する方法等を用いることができる。
以上、前記（イ）、（ロ）、及び（ハ）に記載したようにして、本発明の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」のポリクローナル抗体、即ちヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する鳥類由来のポリクローナル抗体を単離して得ることができる。
（６）本発明の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体（モノクローナル抗体）の取得方法
本発明の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」において、モノクローナル抗体は、以下の操作により取得することができる。
モノクローナル抗体は、ケラーらの細胞融合法（Ｇ．Ｋｏｅｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５〜４９７頁，１９７５年発行）によるハイブリドーマ、又はエプスタン−バーウイルス等のウイルスによる腫瘍化細胞等の抗体産生細胞により得ることができる。
細胞融合法によるモノクローナル抗体の調製は、以下の操作により行うことができる。
まず、前記の免疫原をニワトリ等の鳥類に免疫する。
この前記の免疫原を免疫する量は、免疫する鳥類の種類、又は免疫注射部位等により決められるものであるが、ニワトリの場合にはニワトリ一羽当り一回につき１０μｇ〜１ｍｇの前記免疫原を免疫注射することが好ましい。
なお、前記の免疫原は、アジュバントを添加混合して免疫注射することが好ましい。
アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント又は百日咳菌アジュバント等の公知なものを用いることができる。
免疫注射は、皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に行えばよい。
初回免疫後、１〜２週間間隔で皮下、静脈内、腹腔内又は背部等の部位に、前記の免疫原を追加免疫注射する。
この追加免疫注射の回数としては２〜６回が一般的である。この場合も前記の免疫原は、アジュバントを添加混合して追加免疫注射することが好ましい。
初回免疫の後、免疫した鳥類の血清中又は産卵した卵中の抗体価の測定をＥＬＩＳＡ法等により繰り返し行い、抗体価がプラトーに達したら、前記の免疫原を生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解したものを静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とする。
この最終免疫の３〜５日後に、免疫した鳥類の脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等の抗体産生能を有する細胞を取得する。
この免疫した鳥類より得られた抗体産生能を有する細胞（脾細胞、リンパ節細胞又は末梢リンパ球等）と、鳥類又は哺乳動物等の骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）又はＢ細胞とを細胞融合させるのであるが、ミエローマ細胞としてはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又はチミジンキナーゼ（ＴＫ）等の酵素を欠損した細胞株のものが好ましく、例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＨＧＰＲＴ欠損細胞株である、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１株（癌研究リサーチソースバンク（ＪＣＲＢ）９０８５）、Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１株（ＪＣＲＢ ０００９）、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３株（ＪＣＲＢ ００２８）又はＳＰ２／Ｏ−Ａｇ−１４株（ＪＣＲＢ ００２９）等を用いることができる。
細胞融合は、各種分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リポソーム若しくはセンダイウイルス（ＨＶＪ）等の融合促進剤を用いて行うか、又は電気融合法等により行うことができる。
ミエローマ細胞がＨＧＰＲＴ欠損株又はＴＫ欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを含む選別用培地（ＨＡＴ培地）を用いることにより、抗体産生能を有する細胞とミエローマ細胞の融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択的に培養し、増殖させることができる。
このようにして得られたハイブリドーマの培養上清を、前記の免疫原、又はヒトのＨＭＧＢ１等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免疫学的測定法により測定することにより、ヒトＨＭＧＢ１等に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
また、前記のハイブリドーマの培養上清を、ヒトのＨＭＧＢ２等を用いてＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法等の免疫学的測定法により測定することにより、ヒトＨＭＧＢ２等には結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選択することができる。
この２種類のハイブリドーマ選択方法と限界希釈法等の公知のクローニングの方法を組み合わせて行うことにより、本発明の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」のモノクローナル抗体、即ちヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する鳥類由来のモノクローナル抗体の産生細胞株を単離して得ることができる。
このモノクローナル抗体産生細胞株を適当な培地で培養して、その培養上清から本発明の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」のモノクローナル抗体を得ることができるが、培地としては無血清培地又は低濃度血清培地等を用いてもよく、この場合は抗体の精製が容易となる点で好ましく、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地又はＡＳＦ培地１０３等の培地を用いることができる。
このようにして得られたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過法又はアフィニティークロマトグラフィーなどの方法、あるいはこれらの方法を組み合わせること等により、精製された本発明の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」のモノクローナル抗体を得ることができる。
〔ＩＩ〕試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法
（１）総論
本発明の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法（以下「本発明の免疫学的測定方法」又は「本発明の測定方法」ということがある。）は、試料中のヒトＨＭＧＢ１を当該ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体との抗原抗体反応を利用して測定を行う免疫学的測定方法において、「ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に特異的に結合する鳥類由来の抗体よりなる鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」（『鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体』）を使用することを特徴とするものである。
即ち、試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法において、測定対象物質であるヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体として、前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を使用することを特徴とする免疫学的測定方法である。
本発明の免疫学的測定方法は、前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」、即ちヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗体を使用することにより、試料中にごく微量に含まれるヒトＨＭＧＢ１までも正確に測定することができる、高感度な免疫学的測定方法である。
この「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」は、このような抗体であれば特に制限なく使用することができ、前記の効果を得ることができる。
なお、ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体として２つ又はそれ以上の抗体を使用する免疫学的測定方法においては、その２つ又はそれ以上の抗体のうち少なくとも１つが、前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」であればよい。
そして、他の抗体は「ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体」であれば如何なるものでもよい。
なお、２つ又はそれ以上の抗体が、前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」であってもよく、また、用いる全ての抗体が前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」であってもよい。
例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光免疫測定法又は発光免疫測定法等のサンドイッチ法においては、酵素等により標識された抗体及び固相化抗体のいずれか一方又は両方が、前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」であればよく、また、両方の抗体とも前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」であってもよい。
この「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」は、１種類のものだけではなく、複数種類のものを同時に使用してもよい。
前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」は、その由来が鳥類由来であればよい。
この鳥類としては、例えば、ニワトリ、ウズラ、キジ、ダチョウ又はアヒル等を挙げることができる。キジ科の鳥が好ましく、特にニワトリが好ましい。
なお、この「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」の詳細については、前記の「〔Ｉ〕鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」の項等に記載した通りである。
（２）免疫学的測定方法
本発明の免疫学的測定方法は、試料中のヒトＨＭＧＢ１を当該ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体との抗原抗体反応を利用して測定を行う免疫学的測定方法において、前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を使用するものであれば、特にその測定原理は限定されるものではなく、所期の効果を奏するものである。
この免疫学的測定方法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、酵素抗体法、蛍光抗体法、イムノクロマトグラフィー法、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応測定法、赤血球凝集反応法、粒子凝集反応法、特開平９−２２９９３６号公報及び特開平１０−１３２８１９号公報などに記載された測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定され、これで被覆された面を有する担体、及び測定対象物質（被検物質）に対する特異的結合物質が固定された粒子を用いる測定法、又はＤａｈｌｂｅａｃｋらが示したＥＬＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｌｉｇａｎｄｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７９巻，７６７〜７７２頁，１９９８年発行；ＷＯ９８／２３９６３）等を挙げることができる。
そして、前記の免疫学的測定方法においては、サンドイッチ法、競合法又は均一系法（ホモジニアス系法）等のいずれの手法においても、本発明の免疫学的測定方法を適用することができる。
また、本発明の免疫学的測定方法における測定は、用手法により行ってもよいし、又は分析装置等の装置を用いて行ってもよい。
（３）試料
本発明の免疫学的測定方法における試料としては、ヒトの血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水若しくは羊水などの体液；大便；血管若しくは肝臓などの臓器；組織；細胞；又は大便、臓器、組織若しくは細胞などの抽出液等、ヒトのＨＭＧＢ１が含まれる可能性のある生体試料等の試料であれば対象となる。
（４）標識抗体を用いた免疫学的測定方法
本発明の免疫学的測定方法を、標識物質を抗体（若しくは抗原）に結合した標識抗体（若しくは標識抗原）、及び抗体（若しくは抗原）を固相担体に固相化した固相化抗体（若しくは固相化抗原）を用いる、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の免疫学的測定方法により実施する場合には、サンドイッチ法又は競合法等により行うことができるが、サンドイッチ法により実施することが好ましい。
本発明の免疫学的測定方法を、前記のサンドイッチ法により実施する時には、標識抗体及び固相化抗体のいずれか一方の抗体が前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」であればよく、また、標識抗体及び固相化抗体の両方が前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」であってもよい。
前記の免疫学的測定方法に用いる固相化抗体（若しくは固相化抗原）に使用する固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ラテックス、リポソーム、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、セラミックス、金属又は磁性体等の材質よりなる、マイクロカプセル、ビーズ、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）、試験管、スティック又は試験片等の形状の固相担体を使用することができる。
固相化抗体（若しくは固相化抗原）は、前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」等の抗体と固相担体とを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により吸着、結合させて調製することができる。
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗体（若しくは抗原）と固相担体を緩衝液などの溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液などに溶解した抗体（若しくは抗原）と固相担体を接触させること等により行うことができる。
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体（若しくは抗原）と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体（若しくは抗原）と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基などと反応させること等により行うことができる。
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、抗体（若しくは抗原）を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
標識物質としては、酵素免疫測定法の場合には、例えば、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素又はアミラーゼ等を用いることができる。
また、蛍光免疫測定法の場合には、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、置換ローダミシイソチオシアネート又はジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。
そして、放射免疫測定法の場合には、例えば、トリチウム、ヨウ素１２５又はヨウ素１３１等を用いることができる。
また、発光免疫測定法においては、例えば、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ_２−ルシフェラーゼ反応系、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ反応系、アクリジニウムエステル反応系、又はジオキセタン化合物反応系などの反応系に係わる物質等を用いることができる。
前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」等の抗体（若しくは抗原）と酵素等の標識物質との結合法は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体（若しくは抗原）と標識物質をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体（若しくは抗原）と標識物質のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させることにより結合を行うことができる。
前記の酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の免疫学的測定方法における測定の操作法は公知の方法（日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；石川榮治ら編「酵素免疫測定法」，第３版，医学書院，１９８７年発行；北川常廣ら編「蛋白質核酸酵素別冊Ｎｏ．３１ 酵素免疫測定法」，共立出版，１９８７年発行）等により行うことができる。
例えば、固相化抗体（「固相担体−抗体」）と試料を反応させ、同時に標識抗体（「抗体−標識物質」）を反応させるか、又は洗浄の後に標識抗体を反応させることにより、「固相担体−抗体」＝「ヒトＨＭＧＢ１」＝「抗体−標識物質」の複合体を形成させる。
そして、未結合の標識抗体を洗浄分離して、「固相担体−抗体」＝「ヒトＨＭＧＢ１」＝「抗体−標識物質」の結合により固相担体に間接的に結合した標識抗体の量又は未結合の標識抗体の量を測ることにより試料中に含まれていたヒトＨＭＧＢ１の量（濃度）を測定することができる。
具体的には、酵素免疫測定法の場合は、抗体に標識した酵素に、その至適条件下等で基質を反応させ、その酵素反応生成物の量を光学的方法等により測定する。
また、蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による蛍光強度を測定する。
そして、放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量を測定する。
更に、発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測定する。
（５）凝集反応法による免疫学的測定方法
本発明の免疫学的測定方法を、免疫複合体凝集物の生成を、その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、又は目視的に測ることにより、試料中に含まれていたヒトＨＭＧＢ１の量（濃度）を測定する、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫学的測定方法によっても実施することができる。
前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を固相担体に固相化させて用いる場合には、固相担体としては、例えば、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸共重合体、ポリアクロレイン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル（メタ）アクリル酸共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、ラテックス、ゼラチン、リポソーム、マイクロカプセル、赤血球、シリカ、アルミナ、カーボンブラック、金属化合物、セラミックス、金属又は磁性体等の材質よりなる粒子を使用することができる。
前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を固相担体に固相化させる方法としては、物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法により行うことができる。
物理的吸着法による場合は、公知の方法に従い、抗体と固相担体を緩衝液等の溶液中で混合し接触させたり、又は緩衝液等に溶解した抗体と固相担体を接触させること等により行うことができる。
また、化学的結合法により行う場合は、日本臨床病理学会編「臨床病理臨時増刊特集第５３号 臨床検査のためのイムノアッセイ−技術と応用−」，臨床病理刊行会，１９８３年発行；日本生化学会編「新生化学実験講座１ タンパク質ＩＶ」，東京化学同人，１９９１年発行等に記載の公知の方法に従い、抗体と固相担体をグルタルアルデヒド、カルボジイミド、イミドエステル又はマレイミド等の二価性の架橋試薬と混合、接触させ、抗体と固相担体のそれぞれのアミノ基、カルボキシル基、チオール基、アルデヒド基又は水酸基等と反応させること等により行うことができる。
また、更に非特異的反応や固相担体の自然凝集等を抑制するために処理を行う必要があれば、前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を固相化させた固相担体の表面又は内壁面に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチン若しくはその塩などのタンパク質、界面活性剤又は脱脂粉乳等を接触させ被覆させること等の公知の方法により処理して、固相担体のブロッキング処理（マスキング処理）を行ってもよい。
なお、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、固相担体として用いるラテックス粒子の粒径については、特に制限はないものの、ラテックス粒子が前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」及び測定対象物質（ヒトＨＭＧＢ１）を介して結合し、凝集塊を生成する程度、及びこの生成した凝集塊の測定の容易さ等の理由より、ラテックス粒子の粒径は、その平均粒径が、０．０４〜１μｍであることが好ましい。
また、ラテックス比濁法を測定原理とする場合、前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を固相化させたラテックス粒子を含ませる濃度については、試料中に含まれるヒトＨＭＧＢ１の濃度、前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」のラテックス粒子表面上での分布密度、ラテックス粒子の粒径、試料と測定試薬の混合比率等の各種条件により最適な濃度は異なるので一概に言うことはできない。
しかし、通常は、試料と測定試薬が混合され、ラテックス粒子に固相化された前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」と試料中に含まれていた「ヒトＨＭＧＢ１」との抗原抗体反応が行われる測定反応時に、前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を固相化させたラテックス粒子の濃度が、反応混合液中において０．００５〜１％（ｗ／ｖ）となるようにするのが一般的であり、この場合、反応混合液中においてこのような濃度になるような濃度の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を固相化させたラテックス粒子」を測定試薬に含ませる。
また、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合、固相担体として用いる粒子の粒径については、特に制限はないものの、その平均粒子径が０．０１〜１００μｍの範囲内にあることが好ましく、０．５〜１０μｍの範囲内にあることがより好ましい。
そして、これらの粒子の比重は、１〜１０の範囲内にあることが好ましく、１〜２の範囲内にあることがより好ましい。
なお、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の間接凝集反応法を測定原理とする場合の測定に使用する容器としては、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリメタクリレートなどからなる、試験管、マイクロプレート（マイクロタイタープレート）又はトレイ等を挙げることができる。
これらの容器の溶液収容部分（マイクロプレートのウェル等）の底面は、Ｕ型、Ｖ型又はＵＶ型等の底面中央から周辺にかけて傾斜を持つ形状であることが好ましい。
本発明の免疫学的測定方法を、免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫学的測定方法により実施する場合には、溶媒として、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液又はグッド緩衝液等を用いることができ、更にポリエチレングリコール等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
前記の免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等の免疫学的測定方法における測定の操作法は、公知の方法等により行うことができるが、例えば、光学的方法により測定する場合には、試料と前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」、又は試料と固相担体に固相化させた前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を反応させ、エンドポイント法又はレート法により、透過光や散乱光を測定する。
また、目視的に測定する場合には、プレートやマイクロプレート等の前記容器中で、試料と固相担体に固相化させた前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を反応させ、凝集の状態を目視的に判定する。
なお、この目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器を用いて測定を行ってもよい。
なお、本発明の免疫学的測定方法を前記の免疫複合体凝集物の生成を測定する方法により実施する場合、ＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体として前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を使用することは必須であるが、この抗体に加えて更に、他のＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体を用いてもよい。
〔ＩＩＩ〕試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬
（１）総論
本発明の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬（以下「本発明の免疫学的測定試薬」又は「本発明の測定試薬」ということがある。）は、試料中のヒトＨＭＧＢ１を当該ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体との抗原抗体反応を利用して測定を行う免疫学的測定試薬において、「ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に特異的に結合する鳥類由来の抗体よりなる鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」（『鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体』）を含むことを特徴とするものである。
即ち、試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬において、測定対象物質であるヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体として、前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を使用し、これを当該免疫学的測定試薬に含むことを特徴とする免疫学的測定試薬である。
本発明の免疫学的測定試薬は、前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」、即ちヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗体を含むものであるので、試料中にごく微量に含まれるヒトＨＭＧＢ１までも正確に測定することができる、高感度な免疫学的測定試薬である。
また、本発明の免疫学的測定試薬は、前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」、即ちヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価のものが得られる確率が大きい抗体を使用しこれを含むものであるので、測定の感度が低い不合格品（不良品）を生産する可能性が小さく、当該免疫学的測定試薬の生産の歩留まりが良いものであるので、当該免疫学的測定試薬の生産性を向上させた免疫学的測定試薬である。
この「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」は、このような抗体であれば特に制限なく使用することができ、前記の効果を得ることができる。
なお、ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体として２種類以上の抗体を含む免疫学的測定試薬においては、その２つ又はそれ以上の抗体のうち少なくとも１つが、この「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」であればよい。
そして、他の抗体は「ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体」であれば如何なるものでもよい。
なお、この２種類以上の抗体のうち、２つ又はそれ以上の抗体が「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」であってもよく、また、用いる全ての抗体がこの「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」であってもよい。
本発明の免疫学的測定試薬においては、その測定原理として、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法若しくは発光免疫測定法などの標識物質を用いる免疫学的測定方法（サンドイッチ法又は競合法等）のもの、又は免疫比濁法、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法若しくは粒子凝集反応法などの免疫複合体凝集物の生成を測定する免疫学的測定方法のもの等、特に制限なく適用することができる。
例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光免疫測定法又は発光免疫測定法等におけるサンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定試薬においては、標識物質を抗体に結合した標識抗体、及び抗体を固相担体に固相化した固相化抗体のいずれか一方又は両方が、前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」であればよく、両方の抗体ともこの前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」であってもよい。
例えば、ラテックス比濁法、ラテックス凝集反応法、赤血球凝集反応法又は粒子凝集反応法等を測定原理とする免疫学的測定試薬においては、ラテックス粒子等の固相担体に固相化させる抗体が前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」であればよく、また、免疫比濁法を測定原理とする測定試薬においては、抗体として前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を用いればよい。
前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」は、その由来が鳥類由来であればよい。
この鳥類としては、例えば、ニワトリ、ウズラ、キジ、ダチョウ又はアヒル等を挙げることができる。キジ科の鳥が好ましく、特にニワトリが好ましい。
なお、本発明の免疫学的測定試薬は、前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を含むことを特徴とするものであるので、本発明の免疫学的測定試薬に含む「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」の詳細は前記の「〔Ｉ〕鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」の項等に記載した通りであり、また本発明の免疫学的測定試薬の測定原理などの詳細は前記の「〔ＩＩ〕試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法」の項等に記載した通りである。
（２）その他の試薬成分
本発明の免疫学的測定試薬において、溶媒としては、各種の水系溶媒を用いることができる。
この水系溶媒としては、例えば、精製水、生理食塩水、又は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液若しくはリン酸緩衝生理食塩水などの各種緩衝液等を挙げることができる。
この緩衝液のｐＨについては、適宜適当なｐＨを選択して用いればよく、特に制限はないものの、通常は、ｐＨ３〜１２の範囲内のｐＨを選択して用いることが一般的である。
また、本発明の免疫学的測定試薬には、前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」などの抗体を固相担体に固相化した「固相化抗体」、及び／又は前記の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」などの抗体と酵素などの標識物質を結合させた「標識抗体」等の試薬成分の他に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、卵白アルブミン、カゼイン、ゼラチン若しくはその塩などのタンパク質；各種塩類；各種糖類；脱脂粉乳；正常ウサギ血清などの各種動物血清；アジ化ナトリウム若しくは抗生物質などの各種防腐剤；活性化物質；反応促進物質；ポリエチレングリコールなどの感度増加物質；非特異的反応抑制物質；又は、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤もしくは陰イオン性界面活性剤などの各種界面活性剤等の１種又は２種以上を適宜含有させてもよい。
そして、これらを測定試薬に含有させる際の濃度は特に限定されるものではないが、０．００１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、特に０．０１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。
なお、前記の界面活性剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、フィトスタノール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油若しくはポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤；酢酸ベタインなどの両性界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
（３）測定試薬の構成
本発明の免疫学的測定試薬は、そのもの単独にて、試料中のヒトＨＭＧＢ１の測定に使用することができる。そして、そのもの単独にて、販売することができる。
また、本発明の免疫学的測定試薬は、他の試薬と組み合わせて、試料中のヒトＨＭＧＢ１の測定に使用することもできる。そして、他の試薬と組み合わせて、販売することもできる。
前記の他の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、標識物質を含有する試薬、発色などのシグナルを生成する物質を含有する試薬、発色などのシグナルの生成に関与する物質を含有する試薬、校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
そして、前記の他の試薬を第１試薬とし、本発明の免疫学的測定試薬を第２試薬としたり、又は本発明の免疫学的測定試薬を第１試薬とし、前記の他の試薬を第２試薬としたりして、適宜様々な組合せにて使用、及び販売を行うことができる。
〔ＩＶ〕鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法
本発明の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法は、鳥類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得に当たり、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を免疫原とし、当該免疫原を鳥類に免疫することを特徴とするものである。
なお、前記の数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾における数個であるが、これは通常は１〜４個、好ましくは１〜３個、更に好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個である。
免疫原として、前記の式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を用い、これを鳥類に免疫することを特徴とする本発明の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法においては、これにより得られる「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」は、前記の式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に特異的に結合することができるものである。
本発明の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法において、前記の式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列は、鳥類のＨＭＧＢ１のアミノ酸配列と相同性が低いヒトのＨＭＧＢ１のアミノ酸配列の部分であるので、前記の免疫原を鳥類に免疫して得られる「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」は、次の２つの特徴を有するものである。
（ａ） ヒトのＨＭＧＢ１と特異的に結合することができるものである。
（ｂ） 前記免疫原の免疫により前記鳥類の体内に生成するＨＭＧＢ１とは結合できないもの（又は結合し難いもの）であるので、この前記鳥類の体内に生成したＨＭＧＢ１とは結合しておらず（又は結合するものが少なく）、このため、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗体であって、かつこれが高い確率で得られるものである。
従って、本発明の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法においては、得られる「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」はヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗体であり、この鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を高い確率で取得し得るものであり、よって、鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の生産性が高いものである。
なお、この本発明の「鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を取得するための免疫原としては、次式（Ｉ）：Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチドと担体との結合物が好ましく、特に前記の式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチドと担体との結合物が好ましい。
本発明の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法においては、前記の免疫原を免疫する動物は鳥類であればよい。
この鳥類としては、例えば、ニワトリ、ウズラ、キジ、ダチョウ又はアヒル等を挙げることができる。キジ科の鳥が好ましく、特にニワトリが好ましい。
なお、本発明の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法において、鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体、その免疫原、及び鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法などの詳細については、前記の「〔Ｉ〕鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」の項等に記載した通りである。
〔Ｖ〕抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法
本発明の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法は、抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得に当たり、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を免疫原とし、当該免疫原を鳥類に免疫することを特徴とするものである。
なお、前記の数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾における数個であるが、これは通常は１〜４個、好ましくは１〜３個、更に好ましくは１〜２個、特に好ましくは１個である。
免疫原として、前記の式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１ないし数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を用い、これを鳥類に免疫することを特徴とする本発明の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法においては、これにより得られる鳥類由来の「抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」は、前記の式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に特異的に結合することができるものである。
本発明の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法において、前記の式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列は、鳥類のＨＭＧＢ１のアミノ酸配列と相同性が低いヒトのＨＭＧＢ１のアミノ酸配列の部分であるので、前記の免疫原を鳥類に免疫して得られる「抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」は、次の２つの特徴を有するものである。
（ａ） ヒトのＨＭＧＢ１と特異的に結合することができるものである。
（ｂ） 前記免疫原の免疫により前記鳥類の体内に生成するＨＭＧＢ１とは結合できないもの（又は結合し難いもの）であるので、この前記鳥類の体内に生成したＨＭＧＢ１とは結合しておらず（又は結合するものが少なく）、このため、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗体であって、かつこれが高い確率で得られるものである。
従って、本発明の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法においては、得られる鳥類由来の「抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」はヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高い高力価の抗体であり、この抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を高い確率で取得し得るものである。
すなわち、本発明においては、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が低い低力価の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が産生される可能性が極めて小さく、高力価の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の生産の歩留まりを著しく向上させることができるものである。
なお、本発明における「抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」を取得するための免疫原としては、次式（Ｉ）：Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチドと担体との結合物が好ましく、特に前記の式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチドと担体との結合物が好ましい。
本発明の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法においては、前記の免疫原を免疫する動物は鳥類であればよい。
この鳥類としては、例えば、ニワトリ、ウズラ、キジ、ダチョウ又はアヒル等を挙げることができる。キジ科の鳥が好ましく、特にニワトリが好ましい。
なお、本発明の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法において、鳥類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体、その免疫原、及び鳥類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法などの詳細については、前記の「〔Ｉ〕鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」の項等に記載した通りである。

以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
〔実施例１〕（ニワトリのＨＭＧＢ１のアミノ酸配列と相同性が低いヒトのＨＭＧＢ１のアミノ酸配列の選択）
鳥類であるニワトリのＨＭＧＢ１のアミノ酸配列と相同性の低いアミノ酸配列を、ヒトのＨＭＧＢ１のアミノ酸配列より選択した。
（１） ウエンらによるヒトのＨＭＧＢ１のアミノ酸配列〔Ｗｅｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７巻，１１９７〜１２１４頁，１９８９年発行〕と、コールドウェルら、リューら、及びリーらによる鳥類であるニワトリのＨＭＧＢ１のアミノ酸配列〔Ｃａｌｄｗｅｌｌら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．，６巻，１号，Ｒ５，２００５年発行；Ｌｕｗら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１４９３巻，１〜２号，６４〜７２頁，２０００年発行；Ｌｅｅら，Ｇｅｎｅ，２２５巻，１〜２号，９７〜１０５頁，１９９８年発行〕を比較した。
（２） 前記の比較の結果、ニワトリのＨＭＧＢ１のアミノ酸配列と相同性が低いヒトのＨＭＧＢ１のアミノ酸配列として、ヒトのＨＭＧＢ１のＮ末端から１６６番目ののアミノ酸残基（リシン）から１８０番目のアミノ酸残基（セリン）までの、「Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」〔式（Ｉ）〕を選択した。なお、この式（Ｉ）のアミノ酸配列
「Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」〔式（Ｉ）〕は、この箇所に相当するヒトのＨＭＧＢ２のアミノ酸配列「Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ」とは、計１５個のアミノ酸残基の内、計９個のアミノ酸残基において相違していた。
〔実施例２〕（選択したアミノ酸配列の部分のペプチドの合成）
実施例１で選択したアミノ酸配列「Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」〔式（Ｉ）〕のＮ末端に、担体（キャリア）に結合させるためのシステインを結合させたアミノ酸配列「Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」〔式（ＩＩ）〕のペプチドを合成した。
まず、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のモデル４３０Ａペプチド自動合成装置（Ｍｏｄｅｌ ４３０Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）により、取扱説明書に従って、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ酸固相法でアミノ酸配列「Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」〔式（ＩＩ）〕のペプチドの合成を行った。
副反応を抑制するためにスカベンジャーとして、ジメチルスルファイド、ｐ−チオクレゾール、ｍ−クレゾール及びアニソールの存在下でフッ化水素法により樹脂から合成したペプチドの脱離を行った。
その後、ジメチルエーテルによりスカベンジャーを抽出し、そして２Ｎ酢酸により合成したペプチドの抽出を行った。
陰イオン交換樹脂であるダウエックス１−Ｘ２（ＤＯＷＥＸ １−Ｘ２）により陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行い精製をして、オクタデシル（ＯＤＳ）カラムでの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、メインピークのパターンの確認を行った。
そして、エバポレーターにより凍結乾燥をして濃縮を行った後、ＨＰＬＣにより精製を行い分取した。
なお、このＨＰＬＣ精製時の装置及び条件は、山村化学研究所社の逆相ＯＤＳカラムＹＭＣ−Ｄ−ＯＤＳ−５（２０ｍｍ×３００ｍｍ）を用い、日本分光工業社のＴＷＩＮＣＬＥポンプ及び日本分光工業社のＧＰ−Ａ４０型グラジエンターで０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中アセトニトリルの０％から７０％のグラジエントを流速７．０ｍＬ／分で行い、日本分光工業社のＵＶＩＤＥＣ−１００Ｖ型検出器（２１０ｎｍ、１．２８ＡＵＦＳ）で検出を行った。
ここで精製分取した合成ペプチドをエバポレーターで凍結乾燥して濃縮した。
次に、得られた合成ペプチドの純度をＨＰＬＣで分析した。
この分析に用いた装置及び条件は、山村化学研究所社の逆相ＯＤＳカラムＹＭＣ−Ｒ−ＯＤＳ−５（４．９ｍｍ×３００ｍｍ）を用い、日本分光工業社のＴＷＩＮＣＬＥポンプ及び日本分光工業社のＧＰ−Ａ４０型グラジエンターで０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中アセトニトリルの０％から７０％のグラジエントを流速１．０ｍＬ／分、２５分間で行い、日本分光工業社のＵＶＩＤＥＣ−１００Ｖ型検出器（２１０ｎｍ、１．２８ＡＵＦＳ）で検出を行った。
この分析の結果、得られた合成ペプチドの純度がほぼ１００％であることが分かった。
〔実施例３〕（選択したアミノ酸配列よりなるペプチドと担体との結合物の調製）
実施例２で合成したアミノ酸配列「Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」〔式（ＩＩ）〕のペプチドに、２種類の担体（キャリア）を各々結合させた、前記ペプチドと担体との結合物（２種類）をそれぞれ調製した。
（１）ウシ血清アルブミンを担体とする合成ペプチドとの結合物の調製
担体（キャリア）としてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）〔生化学工業社〕の１０ｍｇを１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解している２．５％マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ＭＢＳ）〔ピアース社〕溶液１５０μＬを加え室温で撹拌しながら３０分間反応させた。
これを４℃中においてある１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化しておいたゲルろ過カラムであるセファデックスＧ−２５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５）カラム〔ファルマシア−エルケービー社〕にかけ、２８０ｎｍにおける吸光度でモニターして、ＭＢＳ−担体結合成分を分取した。
このＭＢＳ−担体結合成分をリン酸三ナトリウムでｐＨ７．０に調整し、これに実施例２で合成した式（ＩＩ）のアミノ酸配列「Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」のペプチドを添加混合して１５０分間反応させた。
反応後、水に対して３回透析した後、凍結乾燥を行って前記ペプチドと結合した担体よりなる、式（ＩＩ）のアミノ酸配列「Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」のペプチドと担体であるＢＳＡとの結合物を得た。
（２）スカシガイのヘモシアニンを担体とする合成ペプチドとの結合物の調製
担体（キャリア）としてのスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）〔カルビオケム社〕の１０ｍｇを１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解している２．５％マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル（ＭＢＳ）〔ピアース社〕溶液１５０μＬを加え室温で撹拌しながら３０分間反応させた。
これを４℃中においてある１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化しておいたゲルろ過カラムであるセファデックスＧ−２５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５）カラム〔ファルマシア−エルケービー社〕にかけ、２８０ｎｍにおける吸光度でモニターして、ＭＢＳ−担体結合成分を分取した。
このＭＢＳ−担体結合成分をリン酸三ナトリウムでｐＨ７．０に調整し、これに実施例２で合成した式（ＩＩ）のアミノ酸配列「Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」のペプチドを添加混合して１５０分間反応させた。
反応後、水に対して３回透析した後、凍結乾燥を行って前記ペプチドと結合した担体よりなる、式（ＩＩ）のアミノ酸配列「Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」のペプチドと担体であるＫＬＨとの結合物を得た。
〔実施例４〕（ヒトＨＭＧＢ１の調製及びヒトＨＭＧＢ２の調製）
ヒトのＨＭＧＢ１及びＨＭＧＢ２のそれぞれを、カバートらの方法〔Ｐ．Ｃａｂａｒｔら，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ １３，１２５〜１３３頁，１９９５年〕に従い、ＨＬ６０細胞より調製した。
（１） まず、ＨＬ６０細胞を、１０％の非動化したウシ胎児血清（ＦＣＳ）〔ギブコ社〕を含むＲＰＭＩ１６４０培地液〔ギブコ社〕の３００ｍＬにより、１週間培養した。
（２） 次に、培養したＨＬ６０細胞をかき集め、ＲＰＭＩ１６４０培地液にて洗浄した後、３ＬのＰＦＨＭ−ＩＩ無血清・無タンパク質培地（インビトロゲン社）にて、２週間培養を行った。
（３） その後、培養上清を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により平衡化されたヘパリン−セファロースカラム（シグマ社）に通した。
次にＰＢＳにより、よく洗浄した後、０．５Ｍの塩化ナトリウムを含むＰＢＳを流して溶出を行った。
この溶出の状況を、２８０ｎｍにおける吸光度の測定により追跡し、この２８０ｎｍに吸収を持つ溶出画分を分取した。
（４） この２８０ｎｍに吸収を持つ溶出画分、即ちタンパク質を含有する溶出画分を、０．２Ｍの塩化ナトリウムを含む５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）により、よく透析を行った。
（５） 次に、これを、７．５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）により平衡化されたＣＭ−セファデックスＧ２５カラム（ファルマシア−エルケービー社）に通した。
次に、７．５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）により、よく洗浄した後、２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む７．５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を流して溶出をさせ、陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。
（６） ここで溶出した各画分を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけ、その易動度よりヒトのＨＭＧＢ１を含む溶出画分、及びヒトのＨＭＧＢ２を含む溶出画分をそれぞれ同定した。
以上の操作により、ヒト細胞（ＨＬ６０細胞）より、ヒトのＨＭＧＢ１、及びヒトのＨＭＧＢ２を、各々調製した。
〔実施例５〕（合成したペプチドと担体の結合物を免疫原とする鳥類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体及び哺乳類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の調製）
実施例３で調製した「合成したペプチドと担体の結合物」を免疫原として、鳥類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を調製した。
また、対照として、実施例３で調製した「合成したペプチドと担体の結合物」を免疫原として、哺乳類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を調製した。
〔１〕鳥類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の調製
実施例３で調製した「合成したペプチドと担体の結合物」を免疫原として鳥類であるニワトリに免疫し、このニワトリより抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を取得した。
（１） 実施例３において調製した、式（ＩＩ）のアミノ酸配列「Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」のペプチドと担体であるＢＳＡとの結合物を、１００μｇ／ｍＬになるように生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解した。
次に、これをフロイント完全アジュバントと等量ずつ混合しエマルジョンとし、次にこれを免疫原として、１０羽のメスのニワトリ（旭テクノグラス社）の羽の付け根に、それぞれ０．５ｍＬを注射して免疫した。
（２） この初回免疫から２週間後に、前記の免疫原を１００μｇ／ｍＬになるように生理食塩水で溶解し、これをフロイント不完全アジュバントと等量ずつ混合してエマルジョンとして、その０．５ｍＬにより追加免疫注射を行った。
この追加免疫注射は２週間おきに継続して行った。
（３） そして、免疫動物であるこれら１０羽のニワトリが産んだ卵について、卵黄中の抗体の力価を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）にて、初回免疫から６週間目より１週間ごとに測定した。
このＥＬＩＳＡ法の操作は、下記の（イ）〜（ヘ）の記載の通りに行った。
（イ） 実施例３において調製した、式（ＩＩ）のアミノ酸配列「Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」のペプチドと担体であるＫＬＨとの結合物を、１μｇ／ｍＬになるように生理食塩水に溶解し、これを９６ウェル−マイクロプレート（ヌンク社）に１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して、式（ＩＩ）のアミノ酸配列のペプチドと担体であるＫＬＨとの結合物をこのマイクロプレートのウェルに固相化した。
（ロ） 次に、このマイクロプレートの各ウェルを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム及び２．６８ｍＭ塩化カリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）））で洗浄した後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウェル当り３００μＬずつ加えて、３７℃で２時間静置してブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
（ハ） 次に、ヒトＨＭＧＢ１に対する抗体の産生を検査すべき前記１０羽のニワトリの卵について、その卵黄１００μＬを生理食塩水９００μＬに溶解し１０倍希釈し、更にそれを生理食塩水で１，０００倍、１０，０００倍、そして１００，０００倍にそれぞれ希釈した。
これらの卵黄の希釈液を各々、前記（ロ）のマイクロプレートのウェルに１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせ、その後洗浄液で洗浄した。
（ニ） また、対照として、前記の卵黄の希釈液に替えて、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水を１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置し、その後洗浄液で洗浄した。
（ホ） パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を標識した抗ニワトリＩｇＹ抗体（Ｕｐ−Ｄａｔｅ社）を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で５，０００倍に希釈した後、これを前記（ハ）及び前記（ニ）のマイクロプレートに１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせた。
（ヘ） 次に、このマイクロプレートの各ウェルを洗浄液で洗浄した後、パーオキシダーゼ反応液（３ｍＭの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）〔ＡＢＴＳ〕を含む５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−２４ｍＭクエン酸緩衝液の１ｍＬに対して２μＬの１．７％過酸化水素を使用直前に添加して調製したもの）を１ウェル当り１００μＬずつ加え、室温で反応させた。
そして、１５分後に１ウェル当たり１５０μＬの６Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた。
これをＥＩＡプレートリーダー（バイオラッド社）にて４１５ｎｍにおける各ウェルの吸光度の測定を行った。
（４） 前記（３）における卵黄中の抗体の力価の測定の結果、初回免疫から１．５〜２ヶ月後に抗体価がプラトーに達したと認められたので、免疫した１０羽のニワトリそれぞれの卵の卵黄より抗体（ＩｇＹ）を得た。
（５） 卵黄の１０ｍＬに、１４０ｍＭ塩化ナトリウム及び０．０１％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）の４０ｍＬを加え、よく撹拌後、遠心分離を行い上清を得た。
（６） 次に、この上清に、１Ｍ塩化カルシウムを含む前記（５）のトリス塩酸緩衝液の７．５ｍＬ、及び１０％（Ｗ／Ｖ）デキストラン硫酸を含む前記（５）のトリス塩酸緩衝液の３ｍＬを加え、３０分間撹拌した後、遠心分離を行い上清と沈殿を得た。
上清はそのままにして、沈殿を再度前記（５）のトリス塩酸緩衝液にて再抽出し、遠心分離を行った。
この沈殿からの再抽出及び遠心分離により得られた上清を、沈殿再抽出前の上清と合わせ、前記（５）のトリス塩酸緩衝液により１００ｍＬとした。
（７） これに無水硫酸ナトリウム２０ｇを添加し、３０分間撹拌した後、遠心分離を行い沈殿をデカンテーションにより上清から分離し、この沈殿をリン酸緩衝生理食塩水の１０ｍＬに溶解した。
次に、これをリン酸緩衝生理食塩水により透析を行い、その後濃縮を行ってグロブリン画分を得た。
（８） 次に、このグロブリン画分を、実施例２で合成したペプチドを固定化したカラムに通して、アフィニティークロマトグラフィーを行った。
このアフィニティークロマトグラフィーは、下記の（イ）〜（ニ）の記載の通りに行った。
（イ） 実施例２において合成した、式（ＩＩ）のアミノ酸配列「Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」のペプチドの１０ｍｇに対して、２ｇのＣＮＢｒ−セファロース（ファルマシアバイオテック社）を、その取扱説明書に従って反応させ、前記の合成ペプチドを固定化したアフィニティークロマトグラフィー用のカラムを調製した。
（ロ） このカラムをリン酸緩衝生理食塩水で平衡化しておき、その後、前記（７）にて得たグロブリン分画をこのカラムに通した。
（ハ） その後、このカラムにリン酸緩衝生理食塩水を充分に通して洗浄した後、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）を通した。
（ニ） これにより溶出した画分を集め、リン酸緩衝生理食塩水で透析を行い、その後、濃縮を行った。
以上のアフィニティークロマトグラフィーの操作により、免疫を行った計１０羽のニワトリのそれぞれから、式（ＩＩ）のアミノ酸配列「Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」のペプチドに結合する抗体（ポリクローナル抗体）を分取した。
（９） 前記（８）にて得た、計１０羽のニワトリからの抗体（ポリクローナル抗体）のそれぞれについて、ヒトＨＭＧＢ１と結合する能力、即ち抗体の力価の高さを確かめた。
この抗体の力価の測定は、ＥＬＩＳＡ法により、下記の（イ）〜（ト）の記載の通りに行った。
（イ） 実施例４において取得したヒトのＨＭＧＢ１を、１μｇ／ｍＬになるように生理食塩水に溶解し、これを９６ウェル−マイクロプレート（ヌンク社）に１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して、ヒトのＨＭＧＢ１をこのマイクロプレートのウェルに固相化した。
（ロ） 次に、このマイクロプレートの各ウェルを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム及び２．６８ｍＭ塩化カリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）））で洗浄した後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウェル当り３００μＬずつ加えて、３７℃で２時間静置してブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
（ハ） 次に、前記（８）にて得た計１０羽のニワトリからの抗体のそれぞれについて、その濃度が０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、そして１μｇ／ｍＬとなるように各々、リン酸緩衝生理食塩水により希釈した。
これらの抗体の希釈液を各々、前記（ロ）のマイクロプレートのウェルに１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせ、その後洗浄液で洗浄した。
（ニ） また、対照として、前記の抗体の希釈液に替えて、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水を１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置し、その後洗浄液で洗浄した。
（ホ） パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を標識した抗ニワトリＩｇＹ抗体（Ｕｐ−Ｄａｔｅ社）を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で５，０００倍に希釈した後、これを前記（ハ）及び前記（ニ）のマイクロプレートに１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせた。
（ヘ） 次に、このマイクロプレートの各ウェルを洗浄液で洗浄した後、パーオキシダーゼ反応液（３ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン〔ＴＭＢＺ〕を含む５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−２４ｍＭクエン酸緩衝液の１ｍＬに対して２μＬの１．７％過酸化水素を使用直前に添加して調製したもの）を１ウェル当り１００μＬずつ加え、室温で反応させた。
そして、１５分後に１ウェル当たり１５０μＬの６Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた。
これをＥＩＡプレートリーダー（バイオラッド社）にて４５０ｎｍにおける各ウェルの吸光度の測定を行った。
（ト） この計１０羽のニワトリから得た各々の抗体の測定結果（吸光度）を表１に示した。
この表１より、例えば測定を行った抗体の濃度が１μｇ／ｍＬの場合、これらの計１０羽のニワトリから得た抗体の内、計９羽の抗体は、測定により得られた吸光度がいずれも２．７以上という大変高い吸光度が得られており、ヒトＨＭＧＢ１と結合する能力が非常に高い抗体であることが分かる。
即ち、鳥類であるニワトリに免疫原を免疫して得た鳥類由来抗ＨＭＧＢ１抗体は、免疫したニワトリ計１０羽中、計９羽という高い確率で、ヒトＨＭＧＢ１と結合する能力が高い、高力価の抗体を取得できることが確かめられた。
〔２〕哺乳類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の調製
対照として、実施例３で調製した「合成したペプチドと担体の結合物」を免疫原として哺乳類であるウサギに免疫し、このウサギより抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を取得した。
（１） 実施例３において調製した、式（ＩＩ）のアミノ酸配列「Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」のペプチドと担体であるＢＳＡとの結合物を、１００μｇ／ｍＬになるように生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム水溶液）に溶解した。
次に、これをフロイント完全アジュバントと等量ずつ混合しエマルジョンとし、次にこれを免疫原として、１０羽のウサギの腹部皮下に、それぞれ０．５ｍＬを注射して免疫した。
（２） この初回免疫から２週間後に、前記の免疫原を１００μｇ／ｍＬとなるように生理食塩水で溶解し、これをフロイント不完全アジュバントと等量ずつ混合してエマルジョンとして、その０．５ｍＬにより追加免疫注射を行った。
この追加免疫注射は２週間おきに継続して行った。
（３） そして、免疫動物であるこれら１０羽のウサギの血清中の抗体の力価を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）にて、初回免疫から６週間目より１週間ごとに測定した。
このＥＬＩＳＡ法の操作は、下記の（イ）〜（ヘ）の記載の通りに行った。
（イ） 実施例３において調製した、式（ＩＩ）のアミノ酸配列「Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」のペプチドと担体であるＫＬＨとの結合物を、１μｇ／ｍＬになるように生理食塩水に溶解し、これを９６ウェル−マイクロプレート（ヌンク社）に１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して、式（ＩＩ）のアミノ酸配列のペプチドと担体であるＫＬＨとの結合物をこのマイクロプレートのウェルに固相化した。
（ロ） 次に、このマイクロプレートの各ウェルを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム及び２．６８ｍＭ塩化カリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）））で洗浄した後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウェル当り３００μＬずつ加えて、３７℃で２時間静置してブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
（ハ） 次に、ＨＭＧＢ１に対する抗体の産生を検査すべき前記１０羽のウサギの血清について、その血清１００μＬを生理食塩水９００μＬに溶解し１０倍希釈し、更にそれを生理食塩水で１，０００倍、１０，０００倍、そして１００，０００倍にそれぞれ希釈した。
これらの血清の希釈液を各々、前記（ロ）のマイクロプレートのウェルに１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせ、その後洗浄液で洗浄した。
（ニ） また、対照として、前記の血清の希釈液に替えて、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水を１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置し、その後洗浄液で洗浄した。
（ホ） パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を標識した抗ウサギＩｇＧ抗体（ダコ社）を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で５，０００倍に希釈した後、これを前記（ハ）及び前記（ニ）のマイクロプレートに１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせた。
（ヘ） 次に、このマイクロプレートの各ウェルを洗浄液で洗浄した後、パーオキシダーゼ反応液（３ｍＭの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）〔ＡＢＴＳ〕を含む５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−２４ｍＭクエン酸緩衝液の１ｍＬに対して２μＬの１．７％過酸化水素を使用直前に添加して調製したもの）を１ウェル当り１００μＬずつ加え、室温で反応させた。
そして、１５分後に１ウェル当たり１５０μＬの６Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた。
これをＥＩＡプレートリーダー（バイオラッド社）にて４１５ｎｍにおける各ウェルの吸光度の測定を行った。
（４） 前記（３）における血清中の抗体の力価の測定の結果、初回免疫から１．５〜２ヶ月後に抗体価がプラトーに達したと認められたので、免疫した１０羽のウサギそれぞれより血清（抗血清）を得た。
（５） このウサギの血清（抗血清）の１ｍＬを、２２〜２５℃の温度に保ちながら、そして撹拌しつつ、０．１８ｇの無水硫酸ナトリウムを添加した。
この無水硫酸ナトリウムが溶解してからも３０分間、２２〜２５℃での撹拌を継続した。
（６） 次に、これを、２２〜２５℃において、７，０００ｇで１０分間、遠心分離した。
この遠心分離で得られた沈殿を、１７．５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）の１ｍＬに溶解した。
次に、これを、１７．５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）にて充分に透析を行った後、濃縮した。
（７） その後、これを、１７．５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）で平衡化しておいたＤＥＡＥ−セルロースカラムに通した。
２８０ｎｍにおける吸光度を測定しておき、素通りした画分の内、２８０ｎｍに吸収を持つ画分を、グロブリン画分として分取した。
（８） 次に、このグロブリン画分を、実施例２で合成したペプチドを固定化したカラムに通して、アフィニティークロマトグラフィーを行った。
このアフィニティークロマトグラフィーは、下記の（イ）〜（ニ）の記載の通りに行った。
（イ） 実施例２において合成した、式（ＩＩ）のアミノ酸配列「Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」のペプチドの１０ｍｇに対して、２ｇのＣＮＢｒ−セファロース（ファルマシアバイオテック社）を、その取扱説明書に従って反応させ、前記の合成ペプチドを固定化したアフィニティークロマトグラフィー用のカラムを調製した。
（ロ） このカラムをリン酸緩衝生理食塩水で平衡化しておき、その後、前記（７）にて得たグロブリン画分をこのカラムに通した。
（ハ） その後、このカラムにリン酸緩衝生理食塩水を充分に通して洗浄した後、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）を通した。
（ニ） これにより溶出した画分を集め、リン酸緩衝生理食塩水で透析を行い、その後、濃縮を行った。
以上のアフィニティークロマトグラフィーの操作により、免疫を行った計１０羽のウサギのそれぞれから、式（ＩＩ）のアミノ酸配列「Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ」のペプチドに結合する抗体（ポリクローナル抗体）を分取した。
（９） 前記（８）にて得た、計１０羽のウサギからの抗体（ポリクローナル抗体）のそれぞれについて、ヒトＨＭＧＢ１と結合する能力、即ち抗体の力価の高さを確かめた。
この抗体の力価の測定は、ＥＬＩＳＡ法により、下記の（イ）〜（ト）の記載の通りに行った。
（イ） 実施例４において取得したヒトのＨＭＧＢ１を、１μｇ／ｍＬになるように生理食塩水に溶解し、これを９６ウェル−マイクロプレート（ヌンク社）に１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して、ヒトのＨＭＧＢ１をこのマイクロプレートのウェルに固相化した。
（ロ） 次に、このマイクロプレートの各ウェルを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム及び２．６８ｍＭ塩化カリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２）））で洗浄した後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウェル当り３００μＬずつ加えて、３７℃で２時間静置してブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
（ハ） 次に、前記（８）にて得た計１０羽のウサギからの抗体のそれぞれについて、その濃度が０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、そして１μｇ／ｍＬとなるように各々、リン酸緩衝生理食塩水により希釈した。
これらの抗体の希釈液を各々、前記（ロ）のマイクロプレートのウェルに１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせ、その後洗浄液で洗浄した。
（ニ） また、対照として、前記の抗体の希釈液に替えて、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水を１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置し、その後洗浄液で洗浄した。
（ホ） パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を標識した抗ウサギＩｇＧ抗体（ダコ社）を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で５，０００倍に希釈した後、これを前記（ハ）及び前記（ニ）のマイクロプレートに１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して反応を行わせた。
（ヘ） 次に、このマイクロプレートの各ウェルを洗浄液で洗浄した後、パーオキシダーゼ反応液（３ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン〔ＴＭＢＺ〕を含む５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−２４ｍＭクエン酸緩衝液の１ｍＬに対して２μＬの１．７％過酸化水素を使用直前に添加して調製したもの）を１ウェル当り１００μＬずつ加え、室温で反応させた。
そして、１５分後に１ウェル当たり１５０μＬの６Ｎ硫酸を加えて反応を停止させた。
これをＥＩＡプレートリーダー（バイオラッド社）にて４５０ｎｍにおける各ウェルの吸光度の測定を行った。
（ト） この計１０羽のウサギから得た各々の抗体の測定結果（吸光度）を表２に示した。
この表２より、例えば測定を行った抗体の濃度が１μｇ／ｍＬの場合、これらの計１０羽のウサギから得た抗体の内、測定により得られた吸光度が１．９５２というものが一つあるが、他の９羽の抗体はいずれも吸光度が０．３２〜０．９１１という低いものであり、先の１羽以外の計９羽の抗体は、ヒトＨＭＧＢ１と結合する能力が低い抗体であることが分かる。
即ち、哺乳類であるウサギに免疫原を免疫して得た抗ヒトＨＭＧＢ１抗体は、免疫したウサギ計１０羽の内、計９羽までが、ヒトＨＭＧＢ１と結合する能力が低い、低力価の抗体であった。
このことより、哺乳類であるウサギに免疫原を免疫して得た哺乳類由来抗ＨＭＧＢ１抗体においては、ヒトＨＭＧＢ１と結合する能力が高い高力価の抗体を取得できる確率が、非常に低いものであることが確かめられた。
〔実施例６〕（鳥類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体のヒトＨＭＧＢ１及びヒトＨＭＧＢ２との反応性の確認）
実施例５で調製した鳥類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の、ヒトＨＭＧＢ１及びヒトＨＭＧＢ２に対する反応性をウエスタンブロット法により確かめた。
（１） 実施例４で調製したヒトＨＭＧＢ１（１ｍｇ／ｍＬ）及びＨＭＧＢ２（１ｍｇ／ｍＬ）を等量混合し、更にこれを、４％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、２０％（ｗ／ｖ）グリセリン及び適量のブロムフェノールブルーを含む１２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８）と等量混合した。
（２） 次に、これを、１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行った。
そして、泳動緩衝液としてバルビタール緩衝液（ｐＨ８．８）を使用して、電流２０ｍＡで１８０分間通電して電気泳動を行った。
（３） 前記（２）の電気泳動の後の転写は、ノバ・ブロット・エレクトロフォレティック・トランスファー・キット（ファルマシア−エルケービー社）を用いて、その使用説明書に従い、ドライ方式で行った。
まず、前記（２）において電気泳動を行ったゲルを転写用装置上に置いた。
次に、このゲルの上に、９ｃｍ×９ｃｍのニトロセルロース膜（バイオラッド社）を重ね、４８ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、３９ｍＭグリシン、０．０３５７％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び２０％（Ｖ／Ｖ）メタノールよりなる転写用緩衝液を用いて、電流６０ｍＡで２時間転写を行った。
（４） この転写を行ったニトロセルロース膜を、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム及び２．６８ｍＭ塩化カリウムを含む水溶液（ｐＨ７．２））の２０ｍＬに４℃で１晩浸漬して、ブロッキングを行った。
次に、これを洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水）の２０ｍＬ中で１０分間振とう洗浄を行った。
この洗浄操作を３回行った。
（５） 実施例５で調製した鳥類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の８０μｇを、１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水の２０ｍＬに溶解した。
この溶液に前記（４）の操作を行ったニトロセルロース膜を室温で２時間浸漬して反応させた。
次に、このニトロセルロース膜を、２０ｍＬの洗浄液中で１０分間振とうし、洗浄を行った。
この洗浄操作を３回行った。
（６） 次に、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）で標識した抗ニワトリＩｇＹ抗体（Ｕｐ−Ｄａｔａ社）を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で５００倍希釈をして、２０ｍＬの溶液を調製し、これに前記（５）のニトロセルロース膜を室温で２時間浸漬して反応させた。
その後、このニトロセルロース膜を、２０ｍＬの洗浄液中で１０分間振とうし、洗浄を行った。
この洗浄操作を３回行った。
（７） 次に、０．０２５％の３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩及び０．０１％過酸化水素を含むリン酸緩衝生理食塩水の２０ｍＬに、前記（６）のニトロセルロース膜を室温で１５分間浸漬して発色させた。
（８） 別に、前記（５）において、「実施例５で調製した鳥類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」に替え、ヒトＨＭＧＢ１及びヒトＨＭＧＢ２のいずれにも結合する「マウス由来抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体（モノクローナル抗体）」を使用すること、及び前記（６）において、「パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）で標識した抗ニワトリＩｇＹ抗体」に替え、「パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）で標識した抗マウスＩｇＧ抗体」（ダコ社）を使用すること以外は、前記（１）〜（７）の記載の通りに操作を行ったものを陽性対照とした。
なお、前記のマウス由来抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体（モノクローナル抗体）は、本発明者らが先に調製した抗体産生細胞（ハイブリドーマ）より産生されるものである。
この抗体産生細胞（ハイブリドーマ）は、ＭＤ７８と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ Ｐ−１８４０５として２００１年７月４日付にて寄託されている。
そして、本発明者らによる前記の抗体産生細胞（ハイブリドーマ）及び前記のマウス由来抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体（モノクローナル抗体）の調製方法は、特開２００３−９６０９９号公報（前記の特許文献１）に記載されている。
（９） また別に、前記（１）〜（４）の操作を行い、次にパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）で標識した抗ニワトリＩｇＹ抗体とパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）で標識した抗マウスＩｇＧ抗体の等量混合物を用いて前記（６）の操作を行い、その次に前記（７）の操作を行って、前記の実施例５で調製した鳥類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体も、前記のマウス由来抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体（モノクローナル抗体）も、使用（接触）しなかったものを陰性対照とした。
（１０） 以上の操作により、実施例５で調製した鳥類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体のウエスタンブロット法の結果を得た。
このウエスタンブロット法の結果を図１に示した。
なお、この図において、「１」は陰性対照、「２」は実施例５で調製した鳥類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体のもの、「３」は陽性対照である。
この図で、ヒトＨＭＧＢ１及びヒトＨＭＧＢ２のいずれにも結合するマウス由来抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体（モノクローナル抗体）を用いた陽性対照の「３」においては、ヒトＨＭＧＢ１及びヒトＨＭＧＢ２それぞれの発色のバンドが現れている。
なお、この「３」の２本のバンドにおいて、上側のバンドはヒトＨＭＧＢ１による発色のバンドであり、下側のバンドはヒトＨＭＧＢ２による発色のバンドである。（これは、別途、ヒトＨＭＧＢ１、ヒトＨＭＧＢ２を別々に電気泳動し、ウエスタンブロット法を行い、得られたバンドの位置より確かめておいた。）
次に、実施例５で調製した鳥類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を用いた「２」では、ヒトＨＭＧＢ１が泳動される位置に発色のバンドが見られるものの、ヒトＨＭＧＢ２が泳動される位置には発色が見られないことが分かる。
このことより、実施例５で調製した鳥類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体は、確かにヒトのＨＭＧＢ１には結合するが、ヒトのＨＭＧＢ２には結合しないことが、このウエスタンブロット法の結果より確認することができた。
なお、前記の実施例５で調製した鳥類由来の抗ＨＭＧＢ１抗体も、前記のマウス由来抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体（モノクローナル抗体）も使用（接触）しなかった陰性対照の「１」においては、ヒトＨＭＧＢ１が泳動される位置、及びヒトＨＭＧＢ２が泳動される位置のいずれにおいても何ら発色は認められなかった。
このことより、前記の各ウエスタンブロット法においては、非特異的な発色が起きていないことが確かめられた。
〔実施例７〕（パーオキシダーゼ標識抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体の調製）
ヒトのＨＭＧＢ１及びヒトＨＭＧＢ２のいずれにも結合する抗体（モノクローナル抗体）にパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を標識化して、パーオキシダーゼ標識抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体を調製した。
（１）パーオキシダーゼへのマレイミド基の導入
パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）〔西洋ワサビ由来〕の４ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．３ｍＬに溶解後、Ｎ−サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸の１．０ｍｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドの６０μＬに溶解したものを添加して、３０℃で６０分間反応させた。
その後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で一夜透析を行った。
以上の操作により、前記のパーオキシダーゼに、マレイミド基を導入した。
（２）抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体へのチオール基の導入
前記実施例６の（８）に記載した、本発明者らが調製したマウス由来抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体（モノクローナル抗体）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する０．１Ｍリン酸緩衝液溶液（ｐＨ６．５）の０．５ｍＬに、Ｓ−アセチルメルカプト無水コハク酸の０．６ｍｇをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドの１０μＬに溶解したものを添加して、室温で３０分間反応させた。
その後これに、０．１ＭのＥＤＴＡの２０μＬ、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬ、及び１Ｍのヒドロキシルアミン塩酸塩（ｐＨ７．０）の０．１ｍＬをそれぞれ添加して、３０℃で５分間放置した。
次にこれを、５ｍＭのＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５のカラムに通し、単純ゲルろ過クロマトグラフィーを行い、過剰のＳ−アセチルメルカプト無水コハク酸を取り除き、抗体画分を集めた。
以上の操作により、前記のマウス由来抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体（モノクローナル抗体）に、チオール基を導入した。
（３）パーオキシダーゼ標識抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体の調製
前記（１）で調製したマレイミド基を導入したパーオキシダーゼ、及び前記（２）で調製したチオール基を導入したマウス由来抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体（モノクローナル抗体）を、等量ずつ混合し、３０℃で２０時間反応させて、前記抗体へのパーオキシダーゼの導入（標識化）を行った。
その後これを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化しておいたウルトラゲルＡｃＡ３４のカラムに通し、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。
このゲルろ過クロマトグラフィーの各画分を、１０％ポリアクリルアミド電気泳動にかけて確認を行い、未結合のパーオキシダーゼが混入しないように、パーオキシダーゼが結合した抗体の画分だけを集めた。
このパーオキシダーゼが結合した抗体の画分を濃縮して、パーオキシダーゼが結合したマウス由来抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体（モノクローナル抗体）、即ちパーオキシダーゼ標識抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体を得た。
そして、このパーオキシダーゼ標識抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体を含む溶液のタンパク質濃度を測定した。
〔実施例８〕（マイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体）
実施例５で調製した鳥類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体（ポリクローナル抗体）を、マイクロプレートに固相化して、マイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を調製した。
（１） 実施例５で調製した鳥類由来の抗ＨＭＧＢ１抗体（ポリクローナル抗体）を、リン酸緩衝生理食塩水（５．５９ｍＭリン酸水素二ナトリウム、１．４７ｍＭリン酸二水素カリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．６８ｍＭ塩化カリウム（ｐＨ７．２））により５μｇ／ｍＬとした後、９６ウェル−マイクロプレート（ヌンク社）に１ウェル当り１００μＬずつ加え、３７℃で２時間静置して、前記抗体を前記マイクロプレートの各ウェルに吸着させ、固相化した。
（２） この抗体を固相化したマイクロプレートを、洗浄液（０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２））で洗浄した後、１％ＢＳＡを含む１０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を１ウェル当り３００μＬずつ加えて、３７℃で２時間静置してブロッキングを行い、その後再び洗浄液で洗浄した。
以上の操作により、実施例５で調製した鳥類由来の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体（ポリクローナル抗体）をマイクロプレートに固相化した、マイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を調製した。
〔実施例９〕（試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法）
実施例７で調製したパーオキシダーゼ標識抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体、及び実施例８で調製したマイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を、免疫学的測定試薬として使用し、実施例４で調製したヒトＨＭＧＢ１を、酵素免疫測定法（サンドイッチ法）により測定した。
そして、この免疫学的測定方法における検量線を作成した。
１．測定試薬
（１）パーオキシダーゼ標識抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体
実施例７で調製したパーオキシダーゼ標識抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体を、酵素免疫測定法のサンドイッチ法における酵素標識抗体として使用した。
（２）マイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体
実施例８で調製したマイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を、酵素免疫測定法のサンドイッチ法における固相化抗体として使用した。
（３）洗浄液
０．０５％ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）を調製し、洗浄液とした。
（４）パーオキシダーゼ基質液
３ｍＭの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）を含む５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム−２４ｍＭクエン酸緩衝液の１ｍＬに対して２μＬの１．７％過酸化水素を使用直前に添加したものを調製して、標識としたパーオキシダーゼの基質、即ちパーオキシダーゼ基質液とした。
（５）反応停止液
６Ｎ硫酸水溶液を調製して、反応停止液とした。
２．試料
（１）ヒトＨＭＧＢ１を含む試料
実施例４において調製したヒトＨＭＧＢ１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で充分に透析した。
この透析後の前記ヒトＨＭＧＢ１を含む溶液のタンパク質濃度をプロテインアッセイ（バイオラッド社）で求めた。
そして、この前記ヒトＨＭＧＢ１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈して、前記ヒトＨＭＧＢ１濃度が、８０ｎｇ／ｍＬ、及び１６０ｎｇ／ｍＬの試料をそれぞれ調製した。
（２）０ｎｇ／ｍＬの試料
前記の０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を、ヒトＨＭＧＢ１を含まないヒトＨＭＧＢ１濃度０ｎｇ／ｍＬの試料とした。
３．酵素免疫測定法（サンドイッチ法）による測定
（１） 前記２で調製した、ヒトＨＭＧＢ１を含む２種類の試料、及びヒトＨＭＧＢ１を含まない０ｎｇ／ｍＬの試料をそれぞれ、生理食塩水で２倍に希釈した。
（２） 前記（１）で希釈した各試料を、前記１の（２）のマイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体のウェルに１００μＬを添加して、３７℃で１２時間静置して、マイクロプレートに固相化した抗体と試料に含まれていたヒトＨＭＧＢ１との抗原抗体反応を行わせた。
（３） 次に、前記のマイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の各ウェルを前記１の（３）の洗浄液で洗浄した。
（４） 前記１の（１）のパーオキシダーゼ標識抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で１，０００倍希釈した。
次にこれを、前記（３）の洗浄操作を行ったマイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の各ウェルに、１００μＬずつ添加した後、３７℃で２時間静置した。
これにより、マイクロプレートに固相化した抗ヒトＨＭＧＢ１抗体に結合したヒトＨＭＧＢ１に、パーオキシダーゼ標識抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体を結合させる反応を行わせた。
（５） その後、前記（４）のマイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の各ウェルを前記１の（３）の洗浄液で洗浄した。
（６） 次に、前記（５）のマイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の各ウェルに、前記１の（４）のパーオキシダーゼ基質液を１００μＬずつ添加した。
そして、室温で反応を行わせた。
（７） 前記（６）におけるパーオキシダーゼ基質液の添加１５分後に、前記１の（５）の反応停止液を、前記のマイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の各ウェルに１００μＬずつ添加して、標識パーオキシダーゼの反応を停止させた。
（８） 次に、前記（７）のマイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の各ウェル中の溶液の４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（バイオラッド社）により測定した。
（９） 以上の操作により得られた、前記のヒトＨＭＧＢ１を含む試料、及び０ｎｇ／ｍＬの試料の測定値、即ち検量線を、図２に示した。
なお、これらの図において、横軸は試料中に含まれるヒトＨＭＧＢ１の濃度、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度の測定値を表す。
但し、吸光度の測定値は、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）の吸光度を盲検値（ブランク）として差し引いたものを表した。
４．まとめ
図２より、前記のヒトＨＭＧＢ１を含む試料においては、含まれるヒトＨＭＧＢ１の濃度に比例して、得られる吸光度が増加しており、試料に含まれるヒトＨＭＧＢ１濃度に比例した測定値が得られることが分かった。
これより、本発明の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法により、試料中に含まれるヒトＨＭＧＢ１濃度を正確かつ定量的に測定できることが確かめられた。
〔実施例１０〕（本発明のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法による血清を含む試料の測定）
本発明のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法について、血清を含む試料に含まれるヒトＨＭＧＢ１を測定して、血清を含む試料の測定時の正確性を確かめた。
１．測定試薬
実施例９の「１．測定試薬」の「（１）パーオキシダーゼ標識抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体」、「（２）マイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体」、「（３）洗浄液」、「（４）パーオキシダーゼ基質液」及び「（５）反応停止液」をそれぞれ使用した。
２．試料
（１） 実施例４において調製したヒトＨＭＧＢ１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で充分に透析した。この透析後の前記ヒトＨＭＧＢ１を含む溶液のタンパク質濃度をプロテインアッセイ（バイオラッド社製）で求めた。
そして、この前記ヒトＨＭＧＢ１を含む溶液を、０．０１％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸二水素カリウム−リン酸水素二カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈して、ヒトＨＭＧＢ１濃度が、８０ｎｇ／ｍＬの溶液、及び１６０ｎｇ／ｍＬの溶液をそれぞれ調製した。
（２） 前記（１）で調製した２種類の溶液をそれぞれ生理食塩水で２倍に希釈した。
そして、ヒトＨＭＧＢ１濃度が、４０ｎｇ／ｍＬ、及び８０ｎｇ／ｍＬの血清を含まない試料をそれぞれ調製した。
（３） また、前記（１）で調製した２種類の溶液をそれぞれ、ヒトＨＭＧＢ１濃度が０ｎｇ／ｍＬであることが分かっているヒト血清で２倍に希釈した。
そして、ヒトＨＭＧＢ１濃度が、４０ｎｇ／ｍＬ、及び８０ｎｇ／ｍＬの血清を含む試料をそれぞれ調製した。
３．酵素免疫測定法（サンドイッチ法）による測定
（１） 前記２で調製した各試料を、前記１の（２）のマイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体のウェルに１００μＬ添加し、３７℃で１２時間静置して、マイクロプレートに固相化した抗体と試料に含まれていたヒトＨＭＧＢ１との抗原抗体反応を行わせた。
（２） 次に、前記（１）のマイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の各ウェルを前記１の（３）の洗浄液で洗浄した。
（３） 前記１の（１）のパーオキシダーゼ標識抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体を、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水で１，０００倍希釈した。
次にこれを、前記（２）の洗浄操作を行ったマイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の各ウェルに、１００μＬずつ添加した後、３７℃で２時間静置した。
これにより、マイクロプレートに固相化した抗体に結合したヒトＨＭＧＢ１に、パーオキシダーゼ標識抗ヒトＨＭＧＢ１・ＨＭＧＢ２抗体を結合させる反応を行わせた。
（４） その後、前記（３）のマイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の各ウェルを前記１の（３）の洗浄液で洗浄した。
（５） 次に、前記（４）のマイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の各ウェルに、前記１の（４）のパーオキシダーゼ基質液を１００μＬずつ添加した。
そして、室温で反応させた。
（６） 前記（５）のパーオキシダーゼ基質液の添加１５分後に、前記１の（５）の反応停止液を前記のマイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＢＧ１抗体の各ウェルに１００μＬずつ添加して、標識パーオキシダーゼの反応を停止させた。
（７） 次に、前記（６）のマイクロプレート固相化抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の各ウェル中の溶液の４５０ｎｍにおける吸光度を、マイクロプレートリーダー（バイオラッド社）により測定した。
（８）以上の操作により得られた、前記各試料の測定値（吸光度）、及び血清を含む試料の測定値（吸光度）〔Ｂ〕を血清を含まない試料の測定値（吸光度）〔Ａ〕で除した比率〔Ｂ／Ａ〕（％）を、表３に示した。
なお、吸光度の測定値は、３％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）の吸光度を盲検値（ブランク）として差し引いたものを表した。
４．まとめ
この表３より、血清を含む試料の測定値（吸光度）〔Ｂ〕を血清を含まない試料の測定値（吸光度）〔Ａ〕で除した比率〔Ｂ／Ａ〕は、ヒトＨＭＧＢ１濃度が４０ｎｇ／ｍＬの試料においては９９％であり、ヒトＨＭＧＢ１濃度が８０ｎｇ／ｍＬの試料においては９６％であったことが分かる。
つまり、血清を含む試料の測定値（吸光度）は、血清を含まない試料の測定値（吸光度）と、ほとんど同一である。
血清は種々の成分を含み複雑な組成（マトリックス）のものであるが、本発明の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法は、このような血清を含む試料においても、ヒトＨＭＧＢ１の濃度を正確に測定できるものであることが確かめられた。
即ち、本発明の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬及び免疫学的測定方法は、血清等の生体試料に含まれるヒトＨＭＧＢ１の濃度を正確に測定できるものであることが確認できた。
［配列表］

Claims (28)

1. ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に特異的に結合する鳥類由来の抗体よりなる、鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体。
2. 鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を免疫原とし、当該免疫原を鳥類に免疫して得たものである、請求項１記載の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体。
3. １〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことが、１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことである、請求項２記載の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体。
4. 鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高くかつその生産性が高いものである、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体。
5. 鳥類がニワトリである、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体。
6. 試料中のヒトＨＭＧＢ１を当該ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体との抗原抗体反応を利用して測定を行う免疫学的測定方法において、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に特異的に結合する鳥類由来の抗体である鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を使用することを特徴とする、試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法。
7. 鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を免疫原とし、当該免疫原を鳥類に免疫して得たものである、請求項６記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法。
8. １〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことが、１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことである、請求項７記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法。
9. 鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高くかつその生産性が高いものである、請求項６〜請求項８のいずれか１項に記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法。
10. 高感度にヒトＨＭＧＢ１の測定を行うことができる高感度免疫学的測定方法であることを特徴とする、請求項６〜請求項９のいずれか１項に記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法。
11. 鳥類がニワトリである、請求項６〜請求項１０のいずれか１項に記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定方法。
12. 試料中のヒトＨＭＧＢ１を当該ヒトＨＭＧＢ１に特異的に結合する抗体との抗原抗体反応を利用して測定を行う免疫学的測定試薬において、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に特異的に結合する鳥類由来の抗体である鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体を含むことを特徴とする、試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬。
13. 鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro Asp Ala
    Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を免疫原とし、当該免疫原を鳥類に免疫して得たものである、請求項１２記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬。
14. １〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことが、１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことである、請求項１３記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬。
15. 鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高くかつその生産性が高いものである、請求項１２〜請求項１４のいずれか１項に記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬。
16. 高感度にヒトＨＭＧＢ１の測定を行うことができる高感度免疫学的測定試薬であることを特徴とする、請求項１２〜請求項１５のいずれか１項に記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬。
17. 当該免疫学的測定試薬の生産性を向上させた免疫学的測定試薬であることを特徴とする、請求項１２〜請求項１６のいずれか１項に記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬。
18. 鳥類がニワトリである、請求項１２〜請求項１７のいずれか１項に記載の試料中のヒトＨＭＧＢ１の免疫学的測定試薬。
19. ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を免疫原とし、当該免疫原を鳥類に免疫することを特徴とする、鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法。
20. １〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことが、１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことである、請求項１９記載の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法。
21. 鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro Asp Ala
    Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に特異的に結合することができるものである、請求項１９又は請求項２０記載の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法。
22. 鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高くかつその生産性が高いものである、請求項１９〜請求項２１のいずれか１項に記載の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法。
23. 鳥類がニワトリである、請求項１９〜請求項２２のいずれか１項に記載の鳥類由来抗ヒトＨＭＧＢ１抗体の取得方法。
24. ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列よりなるペプチド、又はこの式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に１〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことにより得られるアミノ酸配列よりなるペプチド、あるいはこれらのペプチドと担体との結合物を免疫原とし、当該免疫原を鳥類に免疫することを特徴とする、抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法。
25. １〜２個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことが、１個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、付加若しくは修飾を施すことである、請求項２４記載の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法。
26. 抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１の次式（Ｉ）：Lys Pro Asp Ala Ala
    Lys Lys Gly Val Val Lys Ala Glu Lys Ser（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に特異的に結合することができるものである、請求項２４又は請求項２５のいずれか１項に記載の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法。
27. 抗ヒトＨＭＧＢ１抗体が、ヒトＨＭＧＢ１との結合能力が高いものである、請求項２４〜請求項２６のいずれか１項に記載の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法。
28. 鳥類がニワトリである、請求項２４〜請求項２７のいずれか１項に記載の抗ヒトＨＭＧＢ１抗体取得の生産性向上方法。