JP2014511688A - Ｈｍｇｂ１に特異的なモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトＨＭＧＢ１タンパク質、およびさらには哺乳動物由来のＨＭＧＢ１タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体に関し、そしてまたそれらのフラグメント、このような抗体またはそのフラグメントをコードする核酸、さらに、この抗体または核酸を含むベクター、細胞および組成物、ならびにそれらの使用に関する。

Description

本発明は、ヒトＨＭＧＢ１タンパク質およびさらに哺乳動物由来のＨＭＧＢ１タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体に関し、またそれらのフラグメント、このような抗体またはそのフラグメントをコードする核酸、さらに、この抗体または核酸を含むベクター、細胞および組成物、ならびにそれらの使用に関する。

高移動度群タンパク質Ｂ１（ＨＭＧＢ１）はまた、高移動度群タンパク質１（ＨＭＧ−１）およびアンフォテリンとしても公知であり、ヒトにおいて、ＨＭＧＢ１遺伝子によってコードされるタンパク質である（非特許文献１）。

活性化マクロファージおよび単球は、ＨＭＧＢ１を、炎症のメディエーターとして分泌する（非特許文献２）。さらに、ＨＭＧＢ１は、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ＩＬ−１ｂ、ＤＮＡ、ヌクレオソームなどを含む、いくつかの他の分子または複合体構造との複合体を形成する（非特許文献３）。ＨＭＧＢ１は、単独で、またはパートナーと複合して、ＴＬＲ４（非特許文献４、非特許文献５）に、ＲＡＧＥ（終末糖化産物（ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）のレセプター）に、ＴＬＲ２および他のレセプター（非特許文献３）に結合する。このシグナル伝達は、組織損傷の部位への炎症性細胞の補充、樹状細胞活性化、サイトカイン分泌を生じる（非特許文献６）。これによって、ＨＭＧＢ１は、無菌と感染性の炎症性応答の交差に位置付けられる。

さらに、ＨＭＧＢ１はまた、外傷または感染後の損傷された組織の再構成を促進する（非特許文献６）。ＨＭＧＢ１を中和する個々のモノクローナル抗体は、関節炎、結腸炎、虚血、敗血症、内毒血症および全身性エリテマトーデスの間の損傷および組織傷害に対する防御を付与し得るが、必ずしも同時にこれら全ての条件に対して付与するのではなく、必ずしも同じ安全性プロフィールを有し、かつ望ましくない影響を欠くのでもない。従って、ＨＭＧＢ１に特異的なだけでなく、そのタンパク質上の十分確定した表面に対して実際に特異的でもあり、ＨＭＧＢ１がそのパートナーのサブセットに対する結合を妨害する能力を与える、モノクローナル抗体の特定をすることの必要性および重要性がますます感じられている。

フェラーリ・エス（Ｆｅｒｒａｒｉ Ｓ）ら、ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）１９９６年７月、第３５巻（第２号）：第３６７〜７１頁。 ワン・エイチ（Ｗａｎｇ Ｈ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９年７月）２８５（５４２５）：第２４８〜５１頁 ビアンキ・エムイー（Ｂｉａｎｃｈｉ ＭＥ）、ジャーナル・オブ・リューコサイト・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（２００９）８６：第５７３〜６頁 ヤン・エイチ（Ｙａｎｇ Ｈ）、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）（２０１０年６月）第１０７巻（第２６号）：第１１９４２〜７頁。 ヤン・エイチ（Ｙａｎｇ Ｈ）、トレイシー・ケージェイ（Ｔｒａｃｅｙ ＫＪ）、バイオケミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）（２０１０）１７９９（１〜２）：第１４９〜５６頁。 ビアンキ・エムイー（Ｂｉａｎｃｈｉ ＭＥ）およびマンフレーディー・エーエー（Ｍａｎｆｒｅｄｉ ＡＡ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２３：第１６８３〜４頁。

従って、本発明の目的は、ＨＭＧＢ１に特異的であり、具体的には、炎症性細胞に向かうその化学走化性活性を妨害し得る、新規なモノクローナル抗体の開発である。

本発明は、細胞株およびハイブリドーマに関する国際寄託機関（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）「Ｉｎｔｅｒｌａｂ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」（ＩＣＬＣ）（ジェノバ（イタリア）のＩｓｔｉｔｕｔｏ Ｎａｚｉｏｎａｌｅ ｐｅｒ ｌａ Ｒｉｃｅｒｃａ ｓｕｌ Ｃａｎｃｒｏのコア施設である）に、寄託アクセッション番号ＰＤ１０００２として、２０１０年１２月２２日に寄託されたハイブリドーマに関する。

本発明によって生成されるハイブリドーマ（ＨＧ−ＨＭＧＢ１）は、ＤＰＨ１．１としても規定されるマウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生する。

本発明のさらなる態様は、ＨＧ−ＨＭＧＢ１ハイブリドーマから産生されるマウス（ネズミ科（ｍｕｒｉｎｅ））抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体、またはそのフラグメントおよび誘導体である。

本発明はまた、マウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の配列を提供する。

本発明のなおさらなる態様は、ＨＧ−ＨＭＧＢ１ハイブリドーマから産生されるマウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を含む細胞またはベクターである。

本発明によるマウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の重鎖の可変領域は、配列番号２に対応するヌクレオチド配列、および配列番号４に対応するアミノ酸配列を有する。

本発明によるマウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の軽鎖の可変ドメインは、配列番号３に対応するヌクレオチド配列、および配列番号５に対応するアミノ酸配列を有する。

本発明はさらに、診断剤としての使用のためのマウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体に関する。

本発明はなおさらに、治療剤としての使用のためのマウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体に関する。

さらなる態様は、活性成分および薬学的に生理活性の賦形剤として、本発明のマウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を含む薬学的組成物である。

本発明の詳細な説明にさらに記載されるように、本発明の薬学的組成物は、ＨＭＧＢ１の化学走化性活性の阻害に特異的であるという利点を有する。

本発明の特徴および利点は、下に報告される詳細な説明から、例示的かつ非限定的な目的で示される実施例から、および添付の図１〜６から明らかである。

実施例３に記載のように、抗ＨＭＧＢ１ ｍＡｂ ＤＰＨ１．１（頂部パネル）またはコントロールの抗Ｂｏｘ−Ａサブユニット Ａｂコントロール（底部パネル）のいずれかとともにインキュベートした、ＨＭＧＢ１の組み換えＢｏｘＡフラグメント（陰性コントロール）の５００ｎｇ（レーン１）または１００ｎｇ（レーン２）および組み換えＨＭＧＢ１の５００ｎｇ（レーン３）または１００ｎｇ（レーン４）の代表的なウエスタンブロットを示す。 抗ＨＭＧＢ１ ｍＡｂ ＤＰＨ１．１での免疫蛍光によって染色された野性型（ｗｔ）マウスまたはＨｍｇｂ１−／−マウスのいずれかに由来するマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）の代表的な顕微鏡写真を示す。スケールバーは、実施例３に記載のように、２０μｍである。 改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバアッセイを用いて試験した、抗ＨＭＧＢ１ ｍＡｂの示した濃度の存在下におけるＨＭＧＢ１へ向かう３Ｔ３細胞の遊走を示す。各々のバーは、実施例４に記載されるように、遊走した細胞の平均数±三連のサンプルの標準偏差である。 実施例５に記載されるような、炎症性細胞補充のインビボ実験の結果を示す。 実施例５に記載されるように、１０７ＨＢＶ特異的ＣＴＬの静脈内投与２日後、ＨＢＶトランスジェニックマウス由来のＣｌｏ−Ｌ−処理した（図５Ｂ）肝臓、またはコントロール（図５Ａ）の代表的な免疫組織化学顕微鏡写真の結果を示す。具体的には：ＨＭＧＢ１染色は褐色に染色される。ＰＭＮに囲まれる肝細胞中のＨＭＧＢ１の核から細胞質への転位に注意のこと（矢印）。スケールバーは、１５０μｍである。実験は三連で繰り返した。エラーバーは標準偏差を示す。^＊ｐ＜０．０５および^＊＊ｐ＜０．０１（ＤＰＨ１．１とアイソタイプの適合した無関係な抗体との間）（ＡＮＯＶＡに加えてボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）補正をともなうｔ検定）。 実施例５に記載されるようなインビトロ実験の結果の代表的なグラフである。具体的には、１０^７個のＨＢＶ特異的ＣＴＬの静脈内注射とともに、ＮａＣｌ（白四角）、Ｃｌｏ−Ｌおよび無関係（Ｉｒｒ）のＩｇＧ１ ｍＡｂ（黒三角）またはＣｌｏ−Ｌおよび抗ＨＭＧＢ１ ｍＡｂ ＤＰＨ１．１（黒丸）を投与された６匹のＨＢＶトランスジェニックマウスの血液中のｓＡＬＴレベル（図６Ａ）および肝臓から回収したＧｒ−１^ｈｉｇｈＣＤ１１ｂ^＋好中球（ＰＭＮｓ）の絶対数（図６Ｂ）。エラーバーは標準偏差を示す。^＊ｐ＜０．０５および^＊＊ｐ＜０．０１（ＤＰＨ１．１とアイソタイプの適合した無関係な抗体との間）（ＡＮＯＶＡに加えてボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）補正をともなうｔ検定）。

本発明は、細胞株およびハイブリドーマに関する国際寄託機関（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）「Ｉｎｔｅｒｌａｂ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」（ＩＣＬＣ）（ジェノバ（イタリア）のＩｓｔｉｔｕｔｏ Ｎａｚｉｏｎａｌｅ ｐｅｒ ｌａ Ｒｉｃｅｒｃａ ｓｕｌ Ｃａｎｃｒｏのコア施設である）に、寄託アクセッション番号ＰＤ１０００２として、２０１０年１２月２２日に国際的に寄託されたハイブリドーマＨＢ−ＨＭＧＢ１に関する。本発明によって生成されるハイブリドーマ（ＨＧ−ＨＭＧＢ１）は、マウス（ネズミ科）抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生する。

このハイブリドーマを調製するために用いられる免疫動物の種類としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギおよびウマを挙げることが可能で、なかでもマウスを用いることが好ましい。マウスが用いられる場合、その株は、特に限定されないが、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いることが好ましい。

本発明のさらなる態様は、ＨＧ−ＨＭＧＢ１ハイブリドーマから産生されるマウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（またＤＰＨ１．１としても規定される）、またはそのフラグメントおよび誘導体である。

本明細書に用いられる規定のモノクローナル抗体としては、モノクローナル抗体のフラグメントおよび誘導体、または任意のヒト化抗ＨＭＧＢ１（その配列はＤＰＨ１．１に由来するか、またはＨＧ−ＨＭＧＢ１ハイブリドーマから産生される任意の抗体に由来する）が挙げられる。具体的には、このモノクローナル抗体のフラグメントおよび誘導体は、Ｆａｂ，Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２およびｓＦｖフラグメントによって例示され、本発明の抗体における配列は、ＩｇＧサブクラスに限定はしないが、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどを含む、ヒト由来、または他の哺乳動物種由来の抗体の配列を置き換えている。

本発明の実施形態におけるモノクローナル抗体は、公知の免疫学的方法によって抗原としてＨＭＧＢ１Ａｇを用いて動物を免疫すること、次いで、免疫された動物の細胞を用いてハイブリドーマを調製することによって得ることができる。本発明のＤＰＨ１．１モノクローナル抗体は、ハイブリドーマＨＢ−ＨＭＧＢ１によって産生される。

本発明はまた、マウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の配列を提供する。

各々の重鎖は、２つの領域、定常領域および可変領域を有する。重鎖の定常領域は、第１２染色体ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００５８３８．１上のＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ免疫グロブリン重鎖複合体（Ｉｇｈ）に相当する。

本発明によるマウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の重鎖の可変領域は、配列番号２に相当するヌクレオチド配列および配列番号４に相当するアミノ酸配列を有する。

軽鎖は、２つの連続するドメインを有する：１つの定常ドメインおよび１つの可変ドメイン。この定常ドメインは、第６染色体ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００５６１２上のＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ免疫グロブリンκ鎖複合体（Ｉｇｋ）に相当する。

本発明によるマウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の軽鎖の可変ドメインは、配列番号３に相当するヌクレオチド配列、および配列番号５に相当するアミノ酸配列を有する。

本発明の目的に関して、ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、以下のような対応する配列番号を有する：
配列番号１は、ＨＭＧＢ１由来の１７マーのペプチドＰ１のアミノ酸配列（ＫＧＫＰＤＡＡＫＫＧＶＶＫＡＥＫＳ）に相当する；
配列番号２は、ＤＰＨ１．１［ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ］の重鎖の可変領域のｃＤＮＡのヌクレオチド配列に相当する；

ここで：「太字」の配列は、ＶＨＳＭ７マウス生殖細胞系列ゲノム遺伝子座中のＶ重鎖エキソンに相当し、「イタリック体」の配列は、多様性領域に相当し、「下線を付された」配列は、マウス生殖細胞系列ＩＧＨＪ４ゲノム遺伝子座に相当する。

ｃＤＮＡとゲノム遺伝子座との間の対応は、期待どおり、ほぼＢ細胞成熟の間に導入された変位に起因する。

配列番号３は、ＤＰＨ１．１，［ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ］の軽鎖の可変ドメインのｃＤＮＡのヌクレオチド配列に相当する；

ここで：「太字」の配列は、マウス生殖細胞系列ゲノム遺伝子座におけるＩｇｋｖ８−２７κ軽鎖Ｖエキソンに相当し、「イタリック体」の配列は、マウス生殖細胞系列ＩＧＫＪ５ゲノム遺伝子座に相当する。

配列番号４は、ＤＰＨ１．１，［ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ］の重鎖の可変領域のアミノ酸配列に相当する；

ここで「太字」配列は、ＶＢＡＳＥ２のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ／）を通じて特定されるとおり、それぞれＣＤＲ領域１、２および３に相当する。

配列番号５は、ＤＰＨ１．１，［ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ］の軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列に相当する；

ここで「太字」配列は、ＶＢＡＳＥ２のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ／）を通じて特定されるとおり、それぞれ、ＣＤＲ領域１、２および３に相当する。

本発明によるマウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体は、マウス、ヒトおよびほとんどの他の哺乳動物で同一である、配列ＫＧＫＰＤＡＡＫＫＧＶＶＫＡＥＫＳによって提示される、ＨＭＧＢ１の公知のエピトープに特異的であり、ＨＭＧＢ１に対して配列中で８０％同一であるＨＭＧＢ２を含む他のタンパク質と示す交差反応性が最小である。

抗ＨＭＧＢ１ ｍＡｂの特異性は、実際は、以下の哺乳動物ＨＭＧＢ１遺伝子に関して見られるが、ただしこれには限定されない：
−Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ，ここでＨＭＧＢ１は、以下の参照配列（Ｒｅｆ Ｓｅｑ）を有する：ＮＭ＿００２１２８．４→ＮＰ＿００２１１９．１；
−Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＨＭＧＢ１：ＮＭ＿０１０４３９．３→ＮＰ＿０３４５６９．１；
−Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ＨＭＧＢ１ ＮＭ＿０１２９６３．２→ＮＰ＿０３７０９５．１；
−Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＨＭＧＢ１：ＮＭ＿１７６６１２．１→ＮＰ＿７８８７８５．１；
−Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ ＨＭＧＢ１：ＮＭ＿００１０８１８３５．１→ＮＰ＿００１０７５３０４．１。

従って、本発明によるマウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の利点は、多くの哺乳動物種で同一であるＨＭＧＢ１のエピトープに特異的であるということである。

本発明によるマウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体のさらなる利点は、ＨＭＧＢ１に対して配列中で８０％同一であるＨＭＧＢ２を含めむ他のタンパク質と示す交差反応性が最小であるということである。

マウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体ＤＰＨ１．１のなおさらなる利点は、ＨＭＧＢ１−誘発性細胞遊走をブロックできるということである。この予期されない利点は、重要である。なぜなら組織損傷の部位に対する炎症性細胞の補充は、急性および慢性の炎症の原因および持続における重要な要素であるからである。

幹細胞からのＨＭＧＢ１放出は、肝臓中へＰＭＮを補充することに寄与するということ、およびＤＰＨ１．１ｍＡｂでのＨＭＧＢ１の中和は、ＰＭＮの補充を低減することがこの実施例で示される。

本発明によるＤＰＨ１．１ ｍＡｂは有利には、細胞遊走をブロックし、特に、インビボにおいて、同様にインビトロにおいて、多形核白血球の補充を低減することが示された。従って、肝炎の重篤度（血中のｓＡＬＴ値で測定）は低減される。

本発明のなおさらなる態様は、ＨＧ−ＨＭＧＢ１ハイブリドーマから産生されるマウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を含む細胞またはベクターである。

本発明はさらに、診断剤としての使用のためのモノクローナル抗体に関する。

主な診断剤は、Ｘ線造影調製物、放射性同位体および色素である。診断剤は、多くの異なる身体部分の画像を作製するために用いられ得る。

本発明のモノクローナル抗体は、ＨＭＧＢ１の検出および／または定量のためにイムノアッセイで用いてもよい。なぜなら、モノクローナル抗体は、例えば、ＨＭＧＢ１タンパク質（未修飾または翻訳後修飾されるかのいずれか）を含有すると疑われるサンプル中で、マウス、ヒトおよび他の哺乳動物において同一であるエピトープを認識するという利点を有するからである。このようなイムノアッセイは、外傷、組織損傷、急性および慢性の炎症、自己免疫疾患（全身性紅斑性狼瘡を含む）に関連する病原体の臨床診断において、ならびに血液生成物のスクリーニングにおいて用いられてもよい。

本発明はなおさらに、治療剤としての使用のためのモノクローナル抗体に関する。

標的療法は、医薬の多くの研究の中心である。病理学的に関連する抗原を標的する生物学的治療では、多くの種類の病気における生存の改善の期待がもたらされる。腫瘍特異的な抗原は、癌治療に関する期待で例えば、広範に研究された。

本発明によるｍＡｂは、ＨＭＧＢ１の化学走化性活性の阻害がかかわる、これには限定されないが、肝炎、外傷、感染、関節炎、虚血、臓器移植を含む病理の治療において有用である。

さらなる態様は、活性成分および薬学的に生物活性の賦形剤として本発明のモノクローナル抗体を含む薬学的組成物である。

本発明の薬学的組成物は、ＨＭＧＢ１の化学走化性活性の阻害に特異的であるという利点を有する。

実施例１
モノクローナル抗体の調製：マウスの免疫およびハイブリドーマ生成
マウスＨＭＧＢ１に特異的なマウスモノクローナルＩｇＧ１ ＤＰＨ１．１ Ａｂは、ＨＭＧＢ１由来の１７マーのペプチドＰ１（ＫＧＫＰＤＡＡＫＫＧＶＶＫＡＥＫＳ）（配列番号１）の３回の皮下用量（０．２ｍｇ／マウス）によって２週の間隔で、Ｃ５７ＢＬ／６ ６週齢の雌性マウスに注射することによって生成した。

本発明によるハイブリドーマ（ＨＧ−ＨＭＧＢ１）を、標準的な技術によって、脾細胞から、およびヒポキサンチン−アミノプテリン−チミン（ＨＡＴ）感受性骨髄腫Ｐ３／ＮＳＩ／１−ＡＧ４−１細胞から生成して、免疫原に対してＥＬＩＳＡによって試験した。

実施例２
モノクローナル抗体の調製：ハイブリドーマの培養
ハイブリドーマコロニーを、１５％ＦＣＳおよびＨＡＴを添加したＲＰＭＩ １６４０培地中で１０日間増殖させて、顕微鏡分析後に手動で選択する。

コロニーのＨＭＧＢ１陽性を、コロニー上清のＥＬＩＳＡ分析によってモニターした。

陽性のコロニーを、より大きいウェルに移して、２回の限界希釈に供した。

安定かつ不死化されたＤＰＨ１．１ハイブリドーマクローンを得た。

ＤＰＨ１．１クローンを、標準的な技術を用いて、効率的なタンパク質発現のために使い捨てのバイオリアクター中で３か月間増殖させ、上清を収集した。

モノクローナル抗体を得るための上清の精製を、ＰＲＯＴ Ａクロマトグラフィーカラムで行った。

従って、モノクローナル抗体抗ＨＭＧＢ１を、９５％の純度の割合で得た。モノクローナル抗体抗ＨＭＧＢ１をさらに、クロマトグラフィー精製継代によって１００％の純度までさらに精製した。

実施例３
免疫蛍光による抗−ＨＭＧＢ１ Ａｂ（ＤＰＨ１．１ ｍＡｂ）の特性評価および特異性試験
ＤＰＨ１．１ ｍＡｂの特異性は、ウエスタンブロット分析（図１）および免疫蛍光（図２）の両方によってモニターした。

抗ＨＭＧＢ−１ Ａｂ（ＤＰＨ１．１ Ａｂ）の特性評価およびウエスタンブロットによる特異性試験
抗ＨＭＧＢ−１ ｍＡｂ ＤＰＨ１．１またはコントロールの抗ＢｏｘＡ ｍＡｂコントロールのいずれかとともにインキュベートした、ＨＭＧＢ１の組み換えＢｏｘＡドメイン（陰性コントロール）のウエスタンブロットを行った。

要するに、５００ｎｇまたは１００ｎｇの組み換えＨＭＧＢ１および（陰性コントロール）ＨＭＧＢ１の組み換えＢｏｘＡドメイン（ＨＭＧＢｉｏｔｅｃｈ，イタリア、ミラノ（Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ））を、記載どおりゲル電気泳動膜によって分離して、膜に移した（Ｓｃａｆｆｉｄｉら、２００２）。

結果
図１で明らかなように、本発明による抗ＨＭＧＢ１ ｍＡｂ ＤＰＨ１．１は、組み換えＨＭＧＢ１に特異的に結合するが、ＢｏｘＡドメインには結合しない。

免疫蛍光
ＤＰＨ１．１ ｍＡｂ、抗ＢｏｘＡ ｍＡｂ（ＨＭＧＢｉｏｔｅｃｈ，イタリア、ミラノ（Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ））およびヤギ抗マウスＩｇＧ１ Ａｂ（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を、１μｇ／ｍｌの希釈で適用した。免疫蛍光は、野性型マウスまたはＨｍｇｂ１^−／−マウスのいずれかに由来するマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）で、記載されたとおり（Ｓｃａｆｆｉｄｉら、２００２）行った。ＤＰＨ１．１ ｍＡｂおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６３３−標識ヤギ抗マウスＩｇＧ１ Ａｂ（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を、５０μｇ／ｍｌの希釈で適用した。

結果
図２で明らかなように：Ｈｍｇｂ１−／−マウス由来のマウス胚性線維芽細胞のみを、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体 ＤＰＨ１．１で染色した。

実施例４
遊出アッセイ
ＤＰＨ１．１ ｍＡｂのインビトロ活性を、記載のようなトランスウェル遊走アッセイでモニターした（Ｐａｌｕｍｂｏら、２００９）。

要するに、組み換えＨＭＧＢ１を、３０ｎｇ／ｍｌの濃度で下のチャンバに添加した。ＤＰＨ１．１ ｍＡｂの（または無関係のアイソタイプの適合したｍＡｂの）漸増濃度を、５万個の３Ｔ３細胞に添加した。細胞遊走を、改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバアッセイによって評価した。

Ｂｏｙｄｅｎチャンバを、３７℃で、５％ＣＯ_２中で３時間インキュベートした。フィルターの上部に残っている細胞を、機械的に除去した。フィルター下部に遊走した細胞を、エタノールで固定して、Ｇｉｅｍｓａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色し、１フィルターあたり１０個の無作為のフィールドでカウントした。各々のアッセイを、二連で行い、独立して少なくとも３回繰り返した。

結果：
図３で明らかなように、漸増濃度のＤＰＨ１．１ ｍＡｂは予期せぬことに、細胞遊走を阻害する。これらの結果によって、ＨＭＧＢ１の惹起する細胞遊走をブロックするＤＰＨ１．１ ｍＡｂの驚くべき効果が示される。

実施例５
インビボ実験：炎症性細胞の補充
本発明者らは、ＨＭＧＢ１タンパク質の放出によって炎症性細胞が肝臓中に補充されることを以前に示した（Ｓｉｔｉａら、１９９７）。

炎症性細胞の補充は、クロドロネート（Ｃｌｏ−Ｌ）でのマウスの処理によって得ることができる、肝臓からのクッパー細胞（ＫＣ）の除去によって増幅され得る。

ＨＭＧＢ１の効果を増幅するために、本発明者らは、ＨＢＶトランスジェニックマウスからクッパー細胞（ＫＣ）を取り出し、本発明者らは、ＨＢＶ（これは、マウスで急性肝炎を生じる）に対して免疫されたマウス由来のＣＤ８Ｔ細胞をそれらに注射した。これらのマウスでは、本発明者らは、クロドロネートで処理していないマウスよりもかなり多数の肝臓内のＰＭＮを見出した（図４）。本発明者らはまた、クロドロネートで処理してないマウスと比較して、多形核白血球（ＰＭＮ）に隣接しているかまたはそれによって囲まれる細胞質ＨＭＧＢ１を発現するより多くの肝細胞を見出した（図５Ａおよび図５Ｂ）。

結果
ＫＣの除去によって、ＫＣが除去されなかった場合にマウスで通常みられたものを上回って肝細胞中の細胞質ＨＭＧＢ１の蓄積および肝臓内ＰＭＮ浸潤が促進された。

ＤＰＨ１．１投与の効果
本発明者らは、ＤＰＨ１．１ ｍＡｂの投与の効果を試験した。
ＤＰＨ１．１ ｍＡｂで処理したマウスの肝臓が、細胞質ＨＭＧＢ１を発現する幹細胞をより多く含むほど（示さず）、ｓＡＬＴ値はより高くなるが（図６Ａ）、浸潤性のＰＭＮの数は減った（図６Ｂ）。

結果
これらの結果によって、肝細胞からのＨＭＧＢ１の遊離は、肝臓へのＰＭＮ補充に寄与すること、およびＤＰＨ１．１でのＨＭＧＢ１の中和は、ＰＭＮの補充および肝炎を低減することが示される。

本発明によるＤＰＨ１．１ ｍＡｂは、インビボで、またインビトロでも同様にＨＭＧＢ１へ向かう細胞遊走をブロックする。

方法：
マウス。ＨＢＶ複製コンピテントなトランスジェニックマウス（系統１．３．３２）は、以前に記載されている（Ｇｕｉｄｏｔｔｉら、１９９５）。系統１．３．３２（近交系Ｃ５７ＢＬ／６，Ｈ−２ｂ）を、Ｂ１０．Ｄ２マウス（Ｈ−２ｄ）と交配して、Ｈ−２ｄ−制限Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）−特異的ＣＤ８ Ｔ細胞株の注射の前にＨ−２ｂｘｄ Ｆ１ハイブリッドを作製した。Ｃ５７ＢＬ／６およびＢ６．ＰＬ−Ｔｈｙ１ａ／ＣｙＪ（Ｔｈｙ−１．１）マウスは、Ｔｈｅ Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの繁殖コロニーから、またはＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｌｃｏ，Ｉｔａｌｙ）から購入した。ＨＢＶを複製する、骨髄キメラホスホグリセラートキナーゼ（ＰＧＫ）−ＧＦＰマウスは、ＰＧＫ−ＧＦＰ由来のＢＭ細胞（Ｈ−２ｂｘｄＦ１ハイブリッド，Ｍｉｃｈｅｌｅ Ｄｅ Ｐａｌｍａ，Ｓａｎ Ｒａｆｆａｅｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙより贈呈）を、照射した１．３．３２ ＨＢＶマウスに移植することによって創出した。Ｔｈｙ−１．１マウスを、前に記載のように（Ｉａｎｎａｃｏｎｅら、２００５）、一旦、Ｂ１０．Ｄ２マウスと交配して、その後にプラスミドＤＮＡ−コードの、およびワクシニアウイルス−コードのＨＢｓＡｇで免疫した。全ての実験で、マウスは、年齢（８週）、性別（雄性）について適合されており、および系列１．３．３２の場合は、実験操作前の血清の肝炎Ｂｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）レベルについて適合されていた。全ての動物は、厳密な遮蔽条件下で、無菌室で飼育した。これらの研究は、サンラファエロ科学研究所（Ｓａｎ Ｒａｆｆａｅｌｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の動物審査委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）が承認した。

ＨＢＶ−特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の注入。ＨＢＶ特異的なＣＤ８ Ｔ細胞株は、記載されたように、免疫された非トランスジェニックＴｈｙ−１．１×Ｂ１０．Ｄ２雄性マウスの脾臓細胞由来であった（Ｉａｎｎａｃｏｎｅら、２００５）。インビトロの刺激の３週間後、細胞を、フローサイトメトリーによって抗原特異性について試験した。ＨＢｓＡｇのイムノドミナントなペプチドエピトープＥｎｖ２８−３９に対して９５％を上回って特異的なＣＤ８＋細胞（Ａｎｄｏら、１９９４）を、種々の用量（０．５×１０^７細胞／マウス，１０^７細胞／マウスまたは５×１０^７個の細胞／マウス）で、１．３．３２マウス中に静脈内注射した。１、２、３または５日後、マウスを殺傷して、その肝臓を灌流させて、組織学的分析およびフローサイトメトリー分析のために回収するか、またはそれらを液体窒素中で急速凍結して、その後の分子分析のために−８０℃で保管した。

ＫＣの枯渇。ＫＣ枯渇は、ＣＤ８Ｔ細胞移入の３日前にクロドロネート含有リポソーム（Ｃｌｏ−Ｌ，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙから贈呈）の２００μｌの静脈内注入によって達成した。

上記の説明および上で注記された実施例から、記載の生成物によって獲得され、本発明によって得られる利点は明白である。

参考文献
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Ｉａｎｎａｃｏｎｅ，Ｍ．、Ｇ．Ｓｉｔｉａ、Ｍ．Ｉｓｏｇａｗａ、Ｐ．Ｍａｒｃｈｅｓｅ、Ｍ．Ｇ．Ｃａｓｔｒｏ、Ｐ．Ｒ．Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ、Ｆ．Ｖ．Ｃｈｉｓａｒｉ、Ｚ．Ｍ．Ｒｕｇｇｅｒｉ、およびＬ．Ｇ．Ｇｕｉｄｏｔｔｉ．２００５．「血小板は細胞傷害性Ｔリンパ球誘導性の肝障害を媒介する（Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｖｅｒ ｄａｍａｇｅ）」．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１：１１６７〜１１６９

Ｐａｌｕｍｂｏ，Ｒ．、Ｆ．Ｄｅ Ｍａｒｃｈｉｓ、Ｔ．Ｐｕｓｔｅｒｌａ、Ａ．Ｃｏｎｔｉ，Ｍ．Ａｌｅｓｓｉｏ、およびＭ．Ｅ．Ｂｉａｎｃｈｉ．２００９．「Ｓｒｃ ｆａｍｉｌｙ ｋｉｎａｓｅｓ ａｒｅ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＨＭＧＢ１．」Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ８６：６１７〜６２３。

Ｓｃａｆｆｉｄｉ，Ｐ．、Ｔ．Ｍｉｓｔｅｌｉ、およびＭ．Ｅ．Ｂｉａｎｃｈｉ．２００２．「壊死細胞によるクロマチンタンパク質ＨＭＧＢ１の放出は、炎症を誘発する（Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ＨＭＧＢ１ ｂｙ ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）」、Ｎａｔｕｒｅ ４１８：１９１〜１９５。

Ｓｉｔｉａ Ｇ、Ｉａｎｎａｃｏｎｅ Ｍ、Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｓ、Ｂｉａｎｃｈｉ ＭＥおよびＧｕｉｄｏｔｔｉ ＬＧ（２００７）「ＨＭＧＢ１インヒビターでの処理は、ＨＢＶトランスジェニックマウスにおいてＣＴＬ誘発性の肝疾患を低減する（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＨＭＧＢ１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｄｉｍｉｎｉｓｈｅｓ ＣＴＬ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ＨＢＶ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ）」．Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ８１：１００〜７

Ｗａｎｇ Ｈ、Ｂｌｏｏｍ Ｏ、Ｚｈａｎｇ Ｍ、Ｖｉｓｈｎｕｂｈａｋａｔ ＪＭ、Ｏｍｂｒｅｌｌｉｎｏ Ｍ、Ｃｈｅ Ｊ、Ｆｒａｚｉｅｒ Ａ、Ｙａｎｇ Ｈ、Ｉｖａｎｏｖａ Ｓ、Ｂｏｒｏｖｉｋｏｖａ Ｌ、Ｍａｎｏｇｕｅ ＫＲ、Ｆａｉｓｔ Ｅ、Ａｂｒａｈａｍ Ｅ、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｊ、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｕ、Ｍｏｌｉｎａ ＰＥ、Ａｂｕｍｒａｄ ＮＮ、Ｓａｍａ Ａ、Ｔｒａｃｅｙ ＫＪ（Ｊｕｌｙ １９９９）．「マウスでのエンドトキシン死亡率の後期メディエーターとしてのＨＭＧ−１（ＨＭＧ−１ ａｓ ａ ｌａｔｅ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｏｆ ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ）」。Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５（５４２５）：２４８〜５１。

Ｙａｎｇ Ｈ、Ｈｒｅｇｇｖｉｄｓｄｏｔｔｉｒ ＨＳ、Ｐａｌｍｂｌａｄ Ｋ、Ｗａｎｇ Ｈ、Ｏｃｈａｎｉ Ｍ、Ｌｉ Ｊ、Ｌｕ Ｂ、Ｃｈａｖａｎ Ｓ、Ｒｏｓａｓ−Ｂａｌｌｉｎａ Ｍ、Ａｌ−Ａｂｅｄ Ｙ、Ａｋｉｒａ Ｓ、Ｂｉｅｒｈａｕｓ Ａ、Ｅｒｌａｎｄｓｓｏｎ−Ｈａｒｒｉｓ Ｈ、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ Ｕ、Ｔｒａｃｅｙ ＫＪ（Ｊｕｎｅ ２０１０）．「トール様レセプター４にＨＭＧＢ１が結合するためおよびマクロファージサイトカイン放出の活性化のために重要なシステインが必要である（Ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＨＭＧＢ１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ）」。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７ （２６）：１１９４２〜７。

Ｙａｎｇ Ｈ，Ｔｒａｃｅｙ ＫＪ （２０１０）．「炎症におけるＨＭＧＢ１標的（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＨＭＧＢ１ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）」．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７９９（１−２）：１４９〜５６。

Claims (7)

1. Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ Ｉｎｔｅｒｌａｂ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（イタリア、ジェノバ）に、寄託アクセッション番号ＰＤ１０００２として寄託されるハイブリドーマ。
2. 請求項１に記載のハイブリドーマによって産生されるマウス抗−ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体、またはそのフラグメントおよび誘導体。
3. 重鎖の可変領域が、配列番号２に対応するヌクレオチド配列、および配列番号４に対応するアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントおよび誘導体を有する請求項２に記載のマウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体。
4. 軽鎖の可変ドメインが、配列番号３に対応するヌクレオチド配列、および配列番号５に対応するアミノ酸配列、またはそれらのフラグメントおよび誘導体を有する請求項２に記載のマウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体。
5. 診断剤としての使用のための、請求項２〜４のいずれか１項に記載のマウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体。
6. 治療剤としての使用のための、請求項２〜４のいずれか１項に記載のマウス抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体。
7. 活性成分および薬学的に生理活性の賦形剤として、請求項２〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む薬学的組成物。