WO2011037227A1 - アテローム動脈硬化抑制剤 - Google Patents

アテローム動脈硬化抑制剤 Download PDF

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atherosclerosis
antibody
monoclonal antibody
administered
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正洋 西堀
英夫 高橋
秀治 森
克約 劉
靖子 友野
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国立大学法人岡山大学
医療法人 創和会
ベイカー アイディアイ ハート アンド ダイアベーツ インスティテュート ホールディングス リミテッド
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a drug for suppressing atherosclerosis, a method for suppressing atherosclerosis, and an anti-HMGB1 monoclonal antibody used for suppressing atherosclerosis.
  • Atherosclerosis is a disease in which deposits called atherosclerotic plaque develop in the arterial vascular intima layer and blood flow is reduced or blocked. Furthermore, atherosclerotic plaques may become hard and rupture due to digestion of the fibrous capsule, accumulation of calcium ions, and the like. In ruptured atherosclerotic plaques, thrombi are frequently formed. Also, blood can flow into the ruptured atherosclerotic plaque and the plaque itself can increase. In addition, fatty contents from the ruptured atherosclerotic plaque may flow into the blood and occlude blood vessels at other locations. Thus, when atherosclerosis progresses, it causes thrombosis and organ ischemia, and causes cerebral infarction, myocardial infarction, renal failure, and the like.
  • the causes of death in Japan are malignant neoplasms such as cancer, heart disease, and cerebrovascular disease from the top.
  • heart disease and cerebrovascular disease can be caused by arteriosclerosis, and atherosclerosis is the highest cause of death because atherosclerosis has the highest ratio among arteriosclerosis. Therefore, improvement of atherosclerosis is very important.
  • antihyperlipidemic drugs such as statins and antihypertensive drugs such as angiotensin receptor blockers are used for atherosclerosis.
  • statins such as statins
  • antihypertensive drugs such as angiotensin receptor blockers
  • an atherosclerosis inhibitor having a different mechanism of action from these factors has been demanded.
  • Atherosclerosis is said to start when monocytes in the blood are activated and enter the vascular endothelial cells. Monocytes that have entered the vascular intima layer turn into macrophages, and further take up fatty substances such as cholesterol into foam cells. Such foam cells and smooth muscle cells are transformed and migrate to accumulate, and atherosclerotic plaques are formed.
  • activation of monocytes and macrophages is a phenomenon observed in inflammatory reactions. Therefore, treatment of atherosclerosis with a factor that suppresses the inflammatory response has been studied.
  • Patent Document 1 discloses that inflammation is caused by a polypeptide containing an A box constituting a part of HMG (high mobility group protein) or an antibody that specifically binds to a B box constituting a part of HMG. It has been described to inhibit the release of cytokines and treat diseases caused by the inflammatory cytokine cascade. Atherosclerosis has been described as one such disease.
  • Patent Document 2 describes that vascular diseases such as atherosclerosis are treated with an antibody that binds to an HMG box.
  • HMGB1 High Mobility Group Box 1
  • Atherosclerosis described in Patent Document 1 is only one of many diseases exemplified as being related to the inflammatory cytokine cascade. Further, in the experimental example disclosed in Patent Document 1, only basic knowledge that an antibody binding to the B box of HMGB1 inhibits the release of tumor necrosis factor (TNF) is mainly shown. Sepsis is the only disease that actually shows improvement.
  • TNF tumor necrosis factor
  • Patent Document 2 shows experimentally only that an antibody against HMGB1 inhibits smooth muscle cell (RSMC) migration and morphological change, and such antibody actually treats vascular diseases. No tests have been disclosed that demonstrate that it can be used for Furthermore, Patent Document 2 describes only in vitro tests, and does not describe results of in vivo tests or clinical tests using experimental animals. In addition, although smooth muscle cell migration is a partial phenomenon of atherosclerosis, inhibition of smooth muscle cell migration may not necessarily suppress monocyte activation or atherosclerotic plaque itself. Absent.
  • RSMC smooth muscle cell
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a drug that is effective in suppressing actual atherosclerosis and has few side effects.
  • Another object of the present invention is to provide a method for inhibiting atherosclerosis and an anti-HMGB1 monoclonal antibody used for inhibiting atherosclerosis.
  • the inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above problems. As a result, the present inventors have found that an anti-HMGB1 monoclonal antibody that binds to the C tail of HMGB1 is extremely effective in suppressing actual atherosclerosis, thereby completing the present invention.
  • HMGB1 monoclonal antibodies against HMGB1 that have mainly been bound to the A box or B box have been studied. This is thought to be due to the fact that the box site of HMGB1 is one of the binding sites for RAGE (receptor advanced glycation endproducts), which is a multiligand receptor expressed in various cells such as smooth muscle cells and neurons. It is done.
  • RAGE receptor advanced glycation endproducts
  • the present inventors proceeded with research on a monoclonal antibody that independently binds to the C tail of HMGB1, and the monoclonal antibody that binds to the HMGB1 box does not inhibit the vascular permeability enhancement by HMGB1 at all. It was found that monoclonal antibodies against the tail can significantly inhibit the enhancement.
  • a monoclonal antibody that binds to the C tail of HMGB1 can efficiently inhibit the action of HMGB1 including the promotion of monocyte entry under vascular endothelial cells. Moreover, it was proved experimentally using model animals that atherosclerosis can be comprehensively suppressed.
  • the atherosclerosis inhibitor according to the present invention comprises an anti-HMGB1 monoclonal antibody that binds to the C tail of HMGB1 as an active ingredient.
  • the method for inhibiting atherosclerosis according to the present invention is characterized by including a step of administering an anti-HMGB1 monoclonal antibody that binds to the C tail of HMGB1.
  • the anti-HMGB1 monoclonal antibody according to the present invention is used to suppress atherosclerosis and binds to the C tail of HMGB1.
  • the invention also relates to the use of anti-HMGB binding to the HMGB1 C-tail in the manufacture of a medicament for inhibiting atherosclerosis.
  • Intravenous amount of dye (Evans blue) after administration of physiological saline, HMGB1 alone, HMGB1 + anti-HMGB1 monoclonal antibody according to the present invention, or a monoclonal antibody that binds to the HMGB1 + HMGB1 B box into the back skin of experimental rats It is a graph which shows the relative ratio of. Note that “**” in the figure indicates a case where there is a significant difference at a risk rate p ⁇ 0.001 in the t-test. It is the photograph which immunostained HMGB1 which exists in the cross section of the aortic sinus slice of an atherosclerosis model mouse.
  • (1) is a photograph when an anti-HMGB1 antibody is used as a primary antibody
  • (2) is a photograph when a non-specific IgG antibody is used as a primary antibody.
  • stained the cross section of the aortic sinus slice of an atherosclerosis model mouse with Oil * Red * O is shown.
  • (1) is a photograph of a mouse administered with a Keyhole Limpet Hemocyanin antibody as a control
  • (2) is a photograph of a mouse administered with an anti-HMGB1 antibody according to the present invention (hereinafter the same as in FIGS. 4 to 10).
  • It is the photograph which immunostained CD68 which exists in the cross section of the aortic sinus slice of an atherosclerosis model mouse.
  • the atherosclerosis inhibitor of the present invention comprises an anti-HMGB1 monoclonal antibody that binds to the C tail of HMGB1 as an active ingredient.
  • the antibody according to the present invention suppresses the activation of monocytes in the blood after administration, and remarkably suppresses its invasion into the intima layer. It also suppresses foaming of macrophages on the inner wall of blood vessels and expression of factors that promote adhesion of monocytes to vascular endothelial cells. Due to these actions, the antibody according to the present invention actually reduces atherosclerotic lesions. In addition, due to the characteristics as a monoclonal antibody, it does not act on other compounds and the like, and it is considered that there is no possibility of causing side effects or very little.
  • Preparation of the anti-HMGB1 monoclonal antibody according to the present invention may be performed according to a conventional method.
  • a mouse, a rat, or the like is immunized using commercially available HMGB1, and the antibody-producing cells, spleen cells, and myeloma cells are fused to obtain hybridomas.
  • the hybridoma is cloned, and a clone producing an antibody that specifically reacts with the C tail of HMGB1 is screened.
  • This clone may be cultured and the secreted monoclonal antibody may be purified.
  • the type of anti-HMGB1 monoclonal antibody used in the present invention is not particularly limited.
  • a human type antibody or a fully human antibody can be used.
  • an antibody derived from an animal to be administered is used.
  • the dosage form of the atherosclerosis inhibitor according to the present invention is not particularly limited, but considering that the anti-HMGB1 monoclonal antibody which is an active ingredient is a peptide, it is intended to be administered as an injection, and a solution or emulsion preparation It is preferable to use a liquid preparation such as
  • an isotonic solution of plasma such as physiological saline adjusted with pH or aqueous glucose solution can be used.
  • an isotonic solution of plasma such as physiological saline adjusted with pH or aqueous glucose solution
  • the antibody is lyophilized with salts or the like
  • pure water, distilled water, sterilized water, or the like can also be used.
  • the concentration may be that of a normal antibody preparation, generally 0.1 mg / mL or more and 1 mg / mL or less, and 0.04 mg / mL or more and 0.2 mg / mL or less for infusion. be able to.
  • the osmotic pressure of the injection must be equivalent to that of plasma.
  • the atherosclerosis inhibitor of the present invention may be administered prophylactically before the onset of atherosclerosis due to an increase in the atherosclerotic exacerbation factor, or therapeutically after the onset of atherosclerosis. It may be administered.
  • the administration frequency and dose of the atherosclerosis inhibitor according to the present invention may be appropriately adjusted according to the severity, age, sex, etc. of the patient. As shown in Examples described later, when at least 400 ⁇ g of anti-HMGB1 monoclonal antibody was administered twice per week to a model mouse having a body weight of about 25 g, a remarkable effect of suppressing atherosclerosis was obtained.
  • the dose to humans can be about 0.1 mg / kg or more and 2 mg / kg or less of anti-HMGB1 monoclonal antibody per dose, and more preferably 0.2 mg / kg from the experimental results described below. It can be administered at a dose of not less than kg and not more than 2 mg / kg and administered twice a week to about 3 times a day.
  • the dosage form is not particularly limited and may be appropriately adjusted.
  • the anti-HMGB1 monoclonal antibody according to the present invention needs to act on monocytes and atherosclerotic plaques in blood, administration by injection into blood, Intravenous administration is particularly preferable. This is because the antibody can be rapidly delivered to the site of injury, and the inventors' experiments have demonstrated that atherosclerosis is significantly improved by intravenous administration of the antibody to model mice. ing.
  • Example 1 Preparation of anti-HMGB1 monoclonal antibody binding to C tail of HMGB1
  • test blood was collected from the jugular vein, and an increase in antibody titer was confirmed.
  • the swollen iliac lymph nodes were then aseptically removed 5 weeks after the injection administration. Approximately 6 ⁇ 10 7 cells could be recovered from the two lymph nodes obtained.
  • One of the obtained monoclonal antibodies was an antibody that specifically recognizes 208EEEDDDDE215 (E represents glutamic acid and D represents aspartic acid), which is an amino acid sequence in the C tail of HMGB1, as an epitope.
  • E represents glutamic acid and D represents aspartic acid
  • HMGB2 as a protein similar to HMGB1, but since HMGB2 does not have a DDDDE sequence of 211 or less, the monoclonal antibody according to the present invention does not bind to HMGB2 and specifically recognizes and binds only to HMGB1. can do.
  • Test Example 1 Determination of Antibody Binding Site The binding sites in HMGB1 of the monoclonal antibodies of Example 1 and Comparative Example 1 were determined anew.
  • peptides having 15 amino acid sequences such as 1 to 15, 6 to 20, 11 to 25, etc. from the N terminus of the amino acid sequence of HMGB1 were synthesized.
  • a 1 mg / mL solution of these peptides was added dropwise to Ultra Bind Membrane (manufactured by PALL Life Science) so as not to overlap each other by 0.5 ⁇ L.
  • 0.5 ⁇ L of a 1 mg / mL solution of purified HMG-1,2 derived from bovine thymus was also added dropwise. After dropping, the membrane was air-dried at room temperature for 1 hour. After air drying, it was blocked with a 20% skim milk / PBS solution for 1 hour.
  • the membrane was washed twice with PBS for 5 minutes each and then air-dried at room temperature for 1 hour.
  • the membrane was soaked in PBS, and each antibody solution (1 mL) diluted 1: 500 with 1% BSA / PBS solution was packed in a nylon membrane and reacted overnight at 4 ° C. Then, it was washed 3 times for 5 minutes each with 0.1% Tween20 / PBS solution.
  • the peroxidase-labeled anti-RAT antibody was diluted 1000 times with a 1% BSA / PBS solution, the solution (1 mL) was added, and the mixture was allowed to react at room temperature overnight.
  • the plate was washed 3 times for 5 minutes each with 0.1% Tween20 / PBS solution, and then colored by the chemiluminescence method.
  • Example 1 From the amino acid sequence of the spot where color development was observed, the antibody obtained in Example 1 above specifically bound to the C tail of HMGB1 (sequence: EEEDDDDE), and the antibody obtained in Comparative Example 1 was B of HMGB1. Specific binding to the box (sequence: LKEKYEKDIA) could be confirmed.
  • Vascular Permeability Test Atherosclerosis is said to start when monocytes in the blood pass through the arterial vascular endothelial cell gap and invade into the basement membrane of the endothelial cells. It is thought to be involved in activation and plasma protein leakage. Then, the inhibition test of vascular permeability enhancement by HMGB1 was conducted, and the activity of each antibody was examined.
  • the anti-HMGB1 monoclonal antibody that binds to the C tail according to the present invention can significantly reduce the leakage of plasma proteins to atherosclerotic plaques and suppress the occurrence and progression of atherosclerosis.
  • Test Example 3 Immunohistochemical Staining of HMGB1 in the Aortic Wall of Arteriosclerotic Mice
  • Atherosclerosis Model Mice Male ApoE ⁇ / ⁇ mice derived from C57BL, a general experimental mouse (6 weeks) Age) was obtained from Precinct Animal Facility (AMREP, Melbourne, Australia) and fed a high fat diet containing 0.15% cholesterol and 21% fat for 8 weeks.
  • the aortic sinus slice was fixed with acetone at ⁇ 20 ° C. for 20 minutes. Subsequently, it was incubated in a PBS solution containing 3% hydrogen peroxide, 10% serum, and biotin / avidin blocking agent (Vector Laboratories). The slices were incubated with primary antibody in serum for 1 hour.
  • the primary antibody used was a rabbit-derived anti-HMGB1 antibody (0.125 ⁇ g / mL, manufactured by BD Pharmingen, cat # 556528) or a non-specific rabbit-derived IgG antibody. The slice was then washed and incubated with the secondary antibody for 40 minutes.
  • the secondary antibody used was a biotinylated anti-rabbit antibody (Vector Laboratories, cat # BA-1000). Subsequently, it was incubated with a streptavidin-horseradish peroxidase complex (Vector ⁇ Laboratories). Antigen was visualized using 3,3-diaminobenzidine. Each slice was counterstained with hematoxylin. Both photographs are shown in FIG.
  • the portion immunostained with the anti-HMGB1 antibody was confined to the arterial vascular intima layer, and the cell nucleus and cytoplasm present in this portion were stained positively in a wide range. On the other hand, there were almost no positive cells in the vascular media layer.
  • the above results suggest that infiltrating macrophages, lymphocytes, migrating and transformed smooth muscle cells, etc. express HMGB1 in the atherosclerotic lesion, and HMGB1 is supplied extracellularly. I understand that
  • Test Example 4 Anti-Atherosclerosis Test The effect of the anti-HMGB1 antibody according to the present invention on actual atherosclerosis was tested using atherosclerosis model mice. This experiment was approved by the Alfred Medical Research Precinct (AMREP) Animal Ethics Committee.
  • mice Male ApoE ⁇ / ⁇ mice (6 weeks old) derived from C57BL, which is a general experimental mouse, were obtained from Precinct Animal Facility (AMREP, Melbourne, Australia). A high fat diet containing 15% and 21% fat was fed for 8 weeks. Further, during this period, the anti-HMGB1 antibody obtained in Example 1 or IgG2a against keyhole limpet hemocyanin, which is a kind of hemocyanin, was intravenously injected twice a week at a dose of 400 ⁇ g per mouse.
  • Atherosclerosis Model Mice Male ApoE ⁇ / ⁇ mice (6 weeks old) derived from C57BL, which is a general experimental mouse, were obtained from Precinct Animal Facility (AMREP, Melbourne, Australia). A high fat diet containing 15% and 21% fat was fed for 8 weeks. Further, during this period, the anti-HMGB1 antibody obtained in Example 1 or IgG2a against keyhole limpet hemocyanin, which is a kind of hemocyanin, was intravenously
  • the aortic sinus slice was fixed with acetone at ⁇ 20 ° C. for 20 minutes. Then, it was incubated in a PBS solution containing 3% hydrogen peroxide, 10% serum, and biotin / avidin blocking agent (Vector Laboratories). The slices were incubated with primary antibody in serum for 1 hour.
  • the primary antibodies used were rat-derived anti-mouse CD68 antibody (manufactured by Serotec, cat # MCA1957), rat-derived anti-mouse VACM-1 antibody (BD Pharmingen, cat # 550547), and rabbit-derived anti-rat MCP-1 antibody.
  • the secondary antibody used was a mouse-derived biotinylated anti-rat antibody (BD Pharmingen, cat # 550325), a mouse-derived biotinylated anti-Armenian hamster antibody (eBioscience, cat # 13-4113-85), or biotin.
  • Anti-rabbit antibody manufactured by Vector Laboratories, cat # BA-1000.
  • streptavidin-horseradish peroxidase complex manufactured by Vector Laboratories.
  • Each antigen was visualized using 3,3-diaminobenzidine. Each slice was counterstained with hematoxylin.
  • the site stained with Oil Red O and the expression status of each antigen were quantified by measuring the staining range with Optimus 6.2 VideoPro-32 or counting the corresponding cells.
  • FIG. 3 Photographs stained with Oil ⁇ ⁇ Red O are shown in FIG. 3, and photographs of CD68, VCAM-1, MCP-1, CD11c, CD83, CD4, and PCNA immunostained are shown in FIGS. 3 to 10, (1) shows the result of administration of the control IgG, and (2) shows the result of administration of the anti-HMGB1 antibody according to the present invention.
  • FIG. 3 the graph of the result of having quantified the area of the atherosclerotic lesion site, the area ratio of the positive region, or the number of positive cells is shown in FIG. In FIG.
  • the stained site in the photograph of Fig. 3 indicates an atherosclerotic lesion site.
  • FIG. 3 it can be seen that when the HMGB1 antibody according to the present invention is administered, atherosclerotic lesion sites are remarkably reduced as compared with the case where the IgG antibody is administered.
  • CD68, CD11c, CD83 and CD4 are leukocyte antigens and are highly expressed in macrophages, immature dendritic cells, mature dendritic cells and T-lymphocytes, respectively.
  • FIGS. 4, 7 to 9 and FIG. 11 when the HMGB1 antibody according to the present invention is administered, the expression of these leukocyte antigens is remarkably suppressed as compared with the case where the IgG antibody as a control is administered. It can be seen that infiltration of macrophages, dendritic cells and CD4-positive T-lymphocytes in the intima layer is remarkably suppressed.
  • VCAM-1 has an increased expression level in its plasma membrane due to the activation of vascular endothelial cells. In particular, it is thought to be involved in the formation of arteriosclerosis. Therefore, by examining the increase or decrease in the number of VCAM-1 positive cells by immunohistochemical staining, the effect of the antibody on the activation of endothelial cells can be evaluated. As shown in FIGS. 5 and 11, when the HMGB1 antibody according to the present invention was administered, the number of VCAM-1 positive cells was approximately halved compared to the control, and the vascular endothelium involved in the formation of arteriosclerosis by the antibody. It was revealed that cell activation can be suppressed.
  • MCP-1 is a migration factor for monocytes, macrophages and dendritic cells. As shown in FIG. 6, when the HMGB1 antibody according to the present invention is administered, the MCP-1 positive region is reduced to about 30% as compared with the control, so that the antibody is involved in the formation of arteriosclerosis. It was proved that migration of monocytes and the like can be suppressed.
  • PCNA is a nuclear factor involved in DNA synthesis and repair. In the blood vessel wall, it is considered that a large amount is expressed in proliferating cells of migratory smooth muscle. As shown in FIGS. 10 and 11, when the HMGB1 antibody according to the present invention is administered, the number of PCNA-positive cells is reduced by about 35% compared to the control, so that the arteriosclerosis is suppressed by the antibody. I understood.
  • the drug according to the present invention effectively suppresses atherosclerosis that causes various organ disorders such as cerebral infarction and myocardial infarction by inhibiting accumulation of activated monocytes in the intima layer. can do.
  • the atherosclerosis inhibitor of the present invention is a practical drug capable of suppressing atherosclerosis by a different mechanism of action from drugs that have been put into practical use, such as antihyperlipidemic drugs and antihypertensive drugs, Very useful.

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Abstract

　本発明は、実際のアテローム動脈硬化の抑制に有効であり、且つ副作用の少ない薬剤を提供することを目的とする。本発明に係るアテローム動脈硬化抑制剤は、ＨＭＧＢ１のＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とする。

Description

アテローム動脈硬化抑制剤
　本発明は、アテローム動脈硬化を抑制するための薬剤、アテローム動脈硬化の抑制方法、およびアテローム動脈硬化の抑制に用いる抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体に関するものである。 
　アテローム動脈硬化は、アテローム硬化プラークと呼ばれる沈着物が動脈血管内膜層で発達し、血流が減少したり遮断される疾患である。さらに、アテローム硬化プラークは、線維性被膜の消化やカルシウムイオンの蓄積などにより硬くなって破裂する場合がある。破裂したアテローム硬化プラークでは、血栓が高頻度で形成される。また、破裂したアテローム硬化プラークへは血液が流れ込み、プラーク自体が増大し得る。また、破裂したアテローム硬化プラークから脂肪性の内容物が血液中へ流入し、別の箇所で血管を閉塞することもある。このようにアテローム動脈硬化は、進行すると血栓症や臓器虚血の原因となり、脳梗塞、心筋梗塞、腎不全などを引き起こす。
　ある統計によれば、日本における死因は、上位から、がんなどの悪性新生物、心臓病、脳血管疾患となっている。しかし、心臓病と脳血管疾患は動脈硬化が原因であり得、動脈硬化の中でもアテローム動脈硬化の割合が最も高いことから、実はアテローム動脈硬化こそが死因の第一位であるともいわれている。よって、アテローム動脈硬化の改善は非常に重要である。
　アテローム動脈硬化に対しては、一般的に、スタチンなどの抗高脂血症薬や、アンギオテンシン受容体遮断薬などの抗高血圧薬が用いられる。しかし、アテローム動脈硬化の発生や進行には様々な要因が複雑に関与していることから、これらと作用機序の異なるアテローム動脈硬化抑制剤が求められていた。
　アテローム動脈硬化は、血液中の単球が活性化されて血管内皮細胞下に侵入することから始まるといわれている。血管内膜層に侵入した単球はマクロファージへと変化し、さらにコレステロールなどの脂肪性物質を取り込んで泡沫細胞へと変化する。かかる泡沫細胞や平滑筋細胞が形質転換した上で遊走して蓄積し、アテローム硬化プラークが形成される。ここで、単球やマクロファージの活性化は、炎症反応で見られる現象である。よって、炎症反応を抑制する因子によりアテローム動脈硬化を治療するということが検討されている。
　例えば特許文献１には、ＨＭＧ（高移動度群タンパク質）の一部を構成するＡボックスを含むポリペプチドや、或いはＨＭＧの一部を構成するＢボックスへ特異的に結合する抗体により起炎症性サイトカインの放出を阻害し、炎症性サイトカインカスケードを原因とする疾患を処置することが記載されている。かかる疾患の一つとして、アテローム動脈硬化が記載されている。
　また、特許文献２には、ＨＭＧのボックスに結合する抗体によりアテローム動脈硬化などの血管疾患を治療することが記載されている。
　上記特許文献において、ＨＭＧとして利用されているのは、ＨＭＧＢ１（High Mobility Group Box 1）である。 
特表２００５－５１２５０７号公報 特表２００４－５２３５７９号公報
　上述したように、ＨＭＧＢ１のボックスに結合する抗体によりアテローム動脈硬化を治療するというアイデアはあった。しかし、上記特許文献に開示されている実験結果はインビトロの基礎的なものであり、かかる抗体によりアテローム動脈硬化を実際に抑制できるかは不明である。
　具体的には、特許文献１に記載されているアテローム動脈硬化は、炎症性サイトカインカスケードに関係するものとして例示されている多数の疾患のうちの一つに過ぎない。また、特許文献１で開示されている実験例では、ＨＭＧＢ１のＢボックスに結合する抗体が腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の放出を阻害するといった基礎的な知見が主に示されているのみであって、改善結果が実際に示されている疾患は敗血症のみである。
　また、特許文献２で実験的に示されているのは、ＨＭＧＢ１に対する抗体が平滑筋細胞（ＲＳＭＣ）の移動や形態的変化を阻害することなどのみであり、かかる抗体が実際に血管疾患の治療に用い得ることを実証する試験は開示されていない。さらに、特許文献２に記載されているのはインビトロ試験のみであり、実験動物を用いたインビボ試験や臨床試験の結果は記載されていない。また、確かに平滑筋細胞の遊走はアテローム動脈硬化の部分的な現象ではあるが、平滑筋細胞の遊走を阻害したからといって単球の活性化やアテローム硬化プラークそのものを抑制できるとは限らない。
　以上の状況下、本発明が解決すべき課題は、実際のアテローム動脈硬化の抑制に有効であり、且つ副作用の少ない薬剤を提供することにある。また、本発明は、アテローム動脈硬化の抑制方法、およびアテローム動脈硬化の抑制に用いる抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を提供することも目的とする。 
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を進めた。その結果、ＨＭＧＢ１のＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体が、実際のアテローム動脈硬化の抑制に極めて有効であることを見出して、本発明を完成した。
　より詳しくは、従来、ＨＭＧＢ１に対するモノクローナル抗体としては、主にＡボックスやＢボックスに結合するものが検討されていた。これは、ＨＭＧＢ１のボックス部位が、平滑筋細胞や神経細胞など様々な細胞で発現しているマルチリガンド受容体であるＲＡＧＥ（receptor for advanced glycation endproducts）に対する結合部位の一つであることによると考えられる。一方、本発明者らは、独自にＨＭＧＢ１のＣテイルに結合するモノクローナル抗体につき研究を進め、ＨＭＧＢ１のボックスに結合するモノクローナル抗体がＨＭＧＢ１による血管透過性の亢進を全く阻害しないのに対して、Ｃテイルに対するモノクローナル抗体が有意に亢進を阻害できることを見出した。よって、ＨＭＧＢ１のＣテイルに結合するモノクローナル抗体は血管内皮細胞下への単球の侵入の促進を含む、ＨＭＧＢ１の作用を効率良く阻害でき得る。その上、アテローム動脈硬化を総合的に抑制できることを、モデル動物を用いて実験的に証明した。
　本発明に係るアテローム動脈硬化抑制剤は、ＨＭＧＢ１のＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とする。 
　本発明に係るアテローム動脈硬化の抑制方法は、ＨＭＧＢ１のＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を投与する工程を含むことを特徴とする。 
　本発明に係る抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体は、アテローム動脈硬化を抑制するために用いられ、ＨＭＧＢ１のＣテイルに結合する。また、本発明は、アテローム動脈硬化を抑制するための薬剤を製造における、ＨＭＧＢ１のＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢの使用に関する。 
実験用ラットの背部皮内に、生理食塩水、ＨＭＧＢ１のみ、ＨＭＧＢ１＋本発明に係る抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体、またはＨＭＧＢ１＋ＨＭＧＢ１のＢボックスに結合するモノクローナル抗体を投与した後における色素（エバンスブルー）の血管透過量の相対割合を示すグラフである。なお、図中の「＊＊」は、ｔ－テストで危険率ｐ＜０．００１で有意差がある場合を示す。 アテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面に存在するＨＭＧＢ１を免疫染色した写真である。（１）は一次抗体として抗ＨＭＧＢ１抗体を用いた場合の写真であり、（２）は一次抗体として非特異的ＩｇＧ抗体を用いた場合の写真である。 アテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面を、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色した写真を示す。（１）は対照としてKeyhole Limpet Hemocyanin抗体を投与したマウスの写真であり、（２）は本発明に係る抗ＨＭＧＢ１抗体を投与したマウスの写真である（以下、図４～１０において同様である）。 アテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面に存在するＣＤ６８を免疫染色した写真である。 アテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面に存在するＶＣＡＭ－１を免疫染色した写真である。 アテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面に存在するＭＣＰ－１を免疫染色した写真である。 アテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面に存在するＣＤ１１ｃを免疫染色した写真である。 アテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面に存在するＣＤ８３を免疫染色した写真である。 アテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面に存在するＣＤ４を免疫染色した写真である。 アテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面に存在するＰＣＮＡを免疫染色した写真である。 対照であるＩｇＧ抗体または本発明に係る抗ＨＭＧＢ１抗体を投与したアテローム動脈硬化モデルマウスの大動脈洞スライスの断面を、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色した場合、または抗原を免疫染色した場合における、染色部位の面積や割合、または染色された細胞数を示すグラフである。（１）はＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色した場合であり、（２）～（８）はそれぞれＣＤ６８、ＶＣＡＭ－１、ＭＣＰ－１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８３、ＣＤ４、ＰＣＮＡを免疫染色した場合の結果である。
　本発明のアテローム動脈硬化抑制剤は、ＨＭＧＢ１のＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を有効成分とする。
　本発明に係る抗体は、投与後、血液内において単球の活性化を抑制し、その血管内膜層への侵入を顕著に抑制する。また、血管内壁におけるマクロファージの泡沫化や、単球の血管内皮細胞への接着を促進する因子の発現を抑制する。これら作用により、本発明に係る抗体は、実際にアテローム動脈硬化の病巣を減少させる。その上、モノクローナル抗体としての特性から、他の化合物などには作用せず、副作用が生じる可能性は無いか、極めて少ないと考えられる。
　本発明に係る抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の調製は、常法に従えばよい。例えば、市販のＨＭＧＢ１を用いてマウスやラット等を免疫し、その抗体産生細胞や脾細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを得る。このハイブリドーマをクローニングし、ＨＭＧＢ１のＣテイルへ特異的に反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングする。このクローンを培養し、分泌されるモノクローナル抗体を精製すればよい。
　本発明で使用する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の種類は、特に制限されない。例えば、ヒト型抗体や完全ヒト抗体を用いることができる。好適には、投与対象である動物に由来する抗体を用いる。
　本発明に係るアテローム動脈硬化抑制剤の剤形は特に問わないが、有効成分である抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体がペプチドであることを考慮すれば、注射剤としての投与を志向して、溶液やエマルション製剤などの液状製剤とすることが好ましい。
　液状製剤の溶媒としては、ｐＨを調整した生理食塩水やグルコース水溶液など、血漿の等張液を用いることができる。また、抗体を塩類等と共に凍結乾燥した場合には、純水、蒸留水、滅菌水等も使用できる。その濃度も通常の抗体製剤のものとすればよく、一般的には０．１ｍｇ／ｍＬ以上、１ｍｇ／ｍＬ以下程度、点滴用では０．０２ｍｇ／ｍＬ以上、０．２ｍｇ／ｍＬ以下程度とすることができる。但し、注射剤の浸透圧は、血漿と同等にする必要がある。
　本発明における「抑制」には、アテローム動脈硬化の発生の抑制、即ち「予防」と、発生したアテローム動脈硬化の軽減や進行の抑制、即ち「治療」の両方の概念が含まれる。従って、本発明のアテローム動脈硬化抑制剤は、アテローム動脈硬化の憎悪因子の上昇から実際にアテローム動脈硬化が発生する前に予防的に投与してもよいし、アテローム動脈硬化の発生後に治療的に投与してもよい。
　本発明に係るアテローム動脈硬化抑制剤の投与頻度や投与量は、患者の重篤度、年齢、性別などに応じて適宜調整すればよい。後述する実施例で示す通り、体重約２５ｇのモデルマウスに対して１回当たり４００μｇの抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を週当たり２回投与した場合に、顕著なアテローム動脈硬化の抑制効果が得られた。斯かる結果から考えると、ヒトに対する投与量は、１回当たり抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を０．１ｍｇ／ｋｇ以上、２ｍｇ／ｋｇ以下程度とし得、後述する実験結果より、より好適には０．２ｍｇ／ｋｇ以上、２ｍｇ／ｋｇ以下とし、１週間当たり２回から一日当たり３回程度投与することができる。
　投与形態も特に制限されず、適宜調整すればよいが、本発明に係る抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体は、血液中の単球やアテローム硬化プラークに作用させる必要があることから、血中への注射投与、特に静脈注射投与が好ましい。上記抗体を障害部位へ速やかに送達できるからであり、また、本発明者らの実験によって、モデルマウスに上記抗体を静脈注射で投与することによりアテローム動脈硬化が顕著に改善されることが実証されている。 
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。 
　実施例１　ＨＭＧＢ１のＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の調製
　（ａ）ラットの免疫
　市販のウシ胸腺由来ＨＭＧＢ１とＨＭＧＢ２との混合物（和光純薬工業社製、コード番号：０８０－０７０７４１）１ｍｇ／ｍＬを２ｍＬガラス製注射筒にとり、別の２ｍＬガラス製注射筒にとった等容量のフロイント完全アジュバンドと連結管を通じて徐々に混和することによって、エマルションとした。セボフルレンにより麻酔したラットの後肢足蹠に、得られたエマルションを０．１ｍＬずつ、計０．２ｍＬ注射投与した。２週間後、頚静脈から試験採血し、抗体価の上昇を確認した。次いで、腫大した腸骨リンパ節を前記注射投与から５週間後に無菌的に取り出した。得られた２個のリンパ節から、約６×１０7個の細胞を回収することができた。
　（ｂ）細胞融合とクローニング
　上記腸骨リンパ節細胞とマウスミエローマＳＰ２／Ｏ－Ａｇ１４（ＳＰ２）細胞を、ポリエチレングリコールを用いて融合させ、得られた融合細胞を９６穴マイクロプレートに蒔いた。１週間後、最初のＥＬＩＳＡスクリーニングを行ない、陽性ウェルについて、ウェスタンブロットにより二次スクリーニングを行なった。陽性を示すウェル細胞を２４穴マイクロプレートに移し、細胞をほぼコンフルエントな状態（約２×１０5）に殖やしてから、０．５ｍＬの凍結培地（ＧＩＴ培地にウシ胎児血清を１０％とジメチルスルホキシドを１０％添加したもの）を用いて、液体窒素中で凍結保存した。この凍結保存細胞を解凍した後、９６穴マイクロプレートでクローニングした。
　（ｃ）抗体の精製
　回転培養装置（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ社製）により上記陽性細胞を２週間大量培養し、濃度２～３ｍｇ／ｍＬの抗体液を得た。中性ｐＨ下、この抗体液をアフィニティゲル（インビトロジェン社製、ＭＥＰ－ＨｙｐｅｒＣｅｌ）と混和し、抗ＨＭＧＢ１抗体をゲルへ特異的に結合させた。特異的にゲルに結合した抗体を、グリシン－塩酸バッファー（ｐＨ４）により溶出した。溶出液を限外濾過装置により濃縮した後、セファロースＣＬ６Ｂゲル濾過カラム（直径２ｃｍ×長さ９７ｃｍ）によって、得られた抗体を単離精製した。
　得られたモノクローナル抗体のうちの一つは、ＨＭＧＢ１のＣテイル中のアミノ酸配列である２０８ＥＥＥＤＤＤＤＥ２１５（Ｅはグルタミン酸を示し、Ｄはアスパラギン酸を示す）をエピトープとして特異的に認識する抗体であった。例えば、ＨＭＧＢ１に類似するタンパク質としてＨＭＧＢ２があるが、ＨＭＧＢ２には２１１以下のＤＤＤＤＥの配列が存在しないため、本発明に係るモノクローナル抗体はＨＭＧＢ２に結合せず、ＨＭＧＢ１のみを特異的に認識して結合することができる。
　比較例１　ＨＭＧＢ１のＢボックスに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体の調製
　上記実施例１と同様にして、ＨＭＧＢ１のＢボックス（配列：ＬＫＥＫＹＥＫＤＩＡ）をエピトープとして認識する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を単離精製した。
　試験例１　抗体の結合部位の決定
　上記実施例１および比較例１のモノクローナル抗体のＨＭＧＢ１における結合部位を、改めて決定した。
　具体的には、ＨＭＧＢ１のアミノ酸配列のうちＮ末端から１～１５、６～２０、１１～２５・・・といった１５個のアミノ酸配列を有する４１のペプチドを合成した。これらペプチドの１ｍｇ／ｍＬ溶液を、Ｕｌｔｒａ Ｂｉｎｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＰＡＬＬ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に、０．５μＬずつ重ならないように滴下した。また、ポジティブコントロールとして、ウシ胸腺由来の精製ＨＭＧ－１，２の１ｍｇ／ｍＬ溶液も０．５μＬ滴下した。滴下後、当該Ｍｅｍｂｒａｎｅを室温で１時間風乾した。風乾後、２０％スキムミルク／ＰＢＳ溶液で１時間ブロッキングした。次いで、ＭｅｍｂｒａｎｅをＰＢＳで５分間ずつ２回洗浄した後、室温で１時間風乾した。当該ＭｅｍｂｒａｎｅをＰＢＳに浸した後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で５００倍に希釈した各抗体溶液（１ｍＬ）をナイロン膜に入れてパッキングし、４℃で一晩反応させた。その後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液で５分間ずつ３回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識された抗ＲＡＴ抗体を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で１０００倍に希釈し、当該溶液（１ｍＬ）を加え、室温で一晩反応させた。次いで、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ溶液で５分間ずつ３回洗浄した後、ケミルミネッセンス法により発色させた。
　発色が認められたスポットのアミノ酸配列から、上記実施例１で得られた抗体はＨＭＧＢ１のＣテイル（配列：ＥＥＥＤＤＤＤＥ）へ特異的に結合し、上記比較例１で得られた抗体はＨＭＧＢ１のＢボックス（配列：ＬＫＥＫＹＥＫＤＩＡ）へ特異的に結合することを確認することができた。
　試験例２　血管透過性試験
　アテローム動脈硬化は、血液中の単球が動脈血管内皮細胞間隙を通過して、内皮細胞の基底膜下に侵入することから始まるといわれており、ＨＭＧＢ１は単球の活性化と血漿タンパク質の漏出に関与していると考えられている。そこで、ＨＭＧＢ１による血管透過性亢進の阻害試験を行い、各抗体の活性を調べた。
　８匹のウィスター系雄性ラット（体重：３００～４００ｇ）を、２％ハロタン、４９％酸素、４９％笑気ガスからなる混合ガスで麻酔した。麻酔中、ラットは自発呼吸させた。麻酔したラットをうつ伏せにして背中の毛を剃り、脊椎を中線として、１ｃｍの間隔で両側１０箇所に印を付けた。別途、昆虫細胞Ｓｆ９を用い、ヒトＨＭＧＢ１組換え体を調製した。ラットの印を付けた箇所へ、生理食塩水のみ（０．１ｍＬ）、ＨＭＧＢ１の２．５μｇ／ｍＬ溶液のみ（０．１ｍＬ）、ＨＭＧＢ１の２．５μｇ／ｍＬ溶液（０．１ｍＬ）とＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（実施例１）の２５μｇ／ｍＬ溶液（０．１ｍＬ）、またはＨＭＧＢ１の２．５μｇ／ｍＬ溶液（０．１ｍＬ）とＢボックスに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体（比較例１）の２５μｇ／ｍＬ溶液（０．１ｍＬ）を、２箇所ずつ皮下注射した。
　皮下注射から１時間後、エヴァンスブルーの２％生理食塩水溶液を、体重ｋｇ当たり２ｍＬの割合で静脈注射した。エヴァンスブルーの静脈注射から２時間後、体重ｋｇ当たり５０ｍｇの割合でペントバルビタールナトリウムを腹腔内投与して深麻酔状態とした。左心室から生理食塩水（１００ｍＬ）を還流し、右心房から脱血した。背部の皮膚を剥離し、裏面から写真撮影した。得られた写真を医療用画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ）により解析し、血液中から血管外へ漏出した色素の濃度と面積を測定し、その量を計算した。ＨＭＧＢ１を単独投与した場合における色素の血管外漏出量を１００％とした場合の割合を、図１に示す。
　図１のとおり、ＨＭＧＢ１のみを投与した場合においては、生理食塩水のみを投与した場合に比べて、血液中から血管内皮細胞を透過して漏出した色素の量は当然に増加している。しかし、ＨＭＧＢ１に加えて、Ｂボックスに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を投与した場合であっても、有意差こそないものの、血管外へ漏出した色素の量はかえって増加する傾向にあった。
　それに対して、ＨＭＧＢ１に加えて、Ｃテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を投与した場合、ＨＭＧＢ１を単独投与した場合のみならず、さらにＢボックスに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を投与した場合に比べても、ｐ＜０．００１の危険率で色素の血管透過を有意に抑制している。
　従って、本発明に係るＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体は、血漿タンパク質のアテローム硬化プラークへの漏出を顕著に低減し、アテローム動脈硬化の発生や進行を抑制できることが実証された。
　試験例３　動脈硬化症病態のマウスの大動脈壁におけるＨＭＧＢ１の免疫組織化学染色
　（１）　アテローム動脈硬化モデルマウスの作製
　一般的な実験用マウスであるＣ５７ＢＬに由来する雄性ＡｐｏＥ－／－マウス（６週齢）をＰｒｅｃｉｎｃｔ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＡＭＲＥＰ，メルボルン，オーストラリア）から入手し、コレステロール０．１５％と脂肪分２１％を含む高脂肪餌を８週間にわたり与えた。
　（２）　免疫染色
　過剰量のペントバルビタール（１２０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与することにより上記マウスを殺し、心臓と近位大動脈を切除し、ＯＣＴコンパウンド（製品名「Ｔｉｓｓｕｅ－ｔｅｋ）に包埋し、－８０℃で凍結した。大動脈洞の６μｍ厚スライスを作製した。
　当該大動脈洞スライスを、－２０℃のアセトンで２０分間固定化した。次いで、３％過酸化水素、１０％血清およびビオチン／アビジンブロッキング剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を含むＰＢＳ溶液中でインキュベートした。当該スライスを、血清中、一次抗体と１時間インキュベートした。使用した一次抗体は、ウサギ由来の抗ＨＭＧＢ１抗体（０．１２５μｇ／ｍＬ，ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製，ｃａｔ＃５５６５２８）または非特異的なウサギ由来ＩｇＧ抗体である。次いで、当該スライスを洗浄した後、二次抗体と４０分間インキュベートした。使用した二次抗体は、ビオチン化抗ウサギ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製，ｃａｔ＃ＢＡ－１０００）である。続いて、ストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）とインキュベートした。抗原を、３，３－ジアミノベンジジンを用いて可視化した。各スライスを、ヘマトキシリンで対比染色した。両写真を図２として示す。
　抗ＨＭＧＢ１抗体により免疫染色された部分は、動脈血管内膜層に限局しており、この部分に存在する細胞核と細胞質が広範囲で陽性に染色された。一方、血管中膜層には、陽性細胞はほとんどなかった。以上の結果は、アテローム動脈硬化巣において、浸潤するマクロファージ、リンパ球、遊走し形質転換した平滑筋細胞などがＨＭＧＢ１を発現していることを示唆し、ＨＭＧＢ１が細胞外へ供給される状態になっていることが分かる。
　試験例４　抗アテローム動脈硬化試験
　本発明に係る抗ＨＭＧＢ１抗体の実際のアテローム動脈硬化に対する効果を、アテローム動脈硬化モデルマウスを用いて試験した。なお、この実験は、ｔｈｅ Ａｌｆｒｅｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｅｃｉｎｃｔ（ＡＭＲＥＰ） Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに認可されたものである。
　（１）　アテローム動脈硬化モデルマウスの作製
　一般的な実験用マウスであるＣ５７ＢＬに由来する雄性ＡｐｏＥ－／－マウス（６週齢）をＰｒｅｃｉｎｃｔ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＡＭＲＥＰ，メルボルン，オーストラリア）から入手し、コレステロール０．１５％と脂肪分２１％を含む高脂肪餌を８週間にわたり与えた。また、当該期間中、実施例１で得た抗ＨＭＧＢ１抗体、または対照としてヘモシアニンの一種であるＫｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎに対するＩｇＧ２ａを、それぞれマウス１匹当たり４００μｇの用量で１週間当たり２回静脈注射した。
　（２）　Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色
　過剰量のペントバルビタール（１２０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与することにより上記マウスを殺し、心臓と近位大動脈を切除し、ＯＣＴコンパウンド（製品名「Ｔｉｓｓｕｅ－ｔｅｋ）に包埋し、－８０℃で凍結した。大動脈洞の６μｍ厚スライスを作製し、大動脈内膜断面におけるアテローム動脈硬化病巣部位を、脂肪変性部位を特定できるＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色した。各マウスの上行大動脈において、大動脈弁尖から１８０μｍの間で６０μｍごとの内膜断面において、染色されたアテローム動脈硬化病巣部位の面積を測定し、その平均値を算出した。代表的な断面写真を図３に示す。
　（３）　免疫染色
　上記の大動脈洞スライスを、－２０℃のアセトンで２０分間固定化した。次いで、３％過酸化水素、１０％血清およびビオチン／アビジンブロッキング剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を含むＰＢＳ溶液中でインキュベートした。当該スライスを、血清中、一次抗体と１時間インキュベートした。使用した一次抗体は、ラット由来の抗マウスＣＤ６８抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ製，ｃａｔ＃ＭＣＡ１９５７）、ラット由来の抗マウスＶＡＣＭ－１抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製，ｃａｔ＃５５０５４７）、ウサギ由来の抗ラットＭＣＰ－１抗体（Ａｂｃａｍ製，ｃａｔ＃ａｂ７２０２）、アルメニアンハムスター由来の抗マウスＣＤ１１ｃ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製，ｃａｔ＃１４－０１１４）、ラット由来の抗マウスＣＤ８３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製，ｃａｔ＃１４－０８３１）、ラット由来の抗マウスＣＤ４抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製，ｃａｔ＃５５０２７４）、またはウサギ由来の抗ヒトＰＣＮＡ抗体（Ａｂｃａｍ製，ｃａｔ＃ａｂ２４２６）である。次いで、当該スライスを洗浄した後、由来動物に応じた二次抗体と４０分間インキュベートした。使用した二次抗体は、マウス由来のビオチン化抗ラット抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製，ｃａｔ＃５５０３２５）、マウス由来のビオチン化抗アルメニアンハムスター抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製，ｃａｔ＃１３－４１１３－８５）、またはビオチン化抗ウサギ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製，ｃａｔ＃ＢＡ－１０００）である。続いて、ストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）とインキュベートした。各抗原を、３，３－ジアミノベンジジンを用いて可視化した。各スライスを、ヘマトキシリンで対比染色した。
　Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏによる染色部位および各抗原の発現状況を、Ｏｐｔｉｍｕｓ６．２ ＶｉｄｅｏＰｒｏ－３２により染色範囲を測定するか、或いは対応する細胞を計数することにより、定量化した。
　Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色した写真を図３に、ＣＤ６８、ＶＣＡＭ－１、ＭＣＰ－１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８３、ＣＤ４、ＰＣＮＡを免疫染色した写真を図４～１０に示す。なお、図３～１０中、（１）は対照であるＩｇＧを投与した結果であり、（２）は本発明に係る抗ＨＭＧＢ１抗体を投与した結果である。また、各例において、アテローム動脈硬化病巣部位の面積、陽性領域の面積比または陽性細胞数を定量化した結果のグラフを図１１に示す。図１１中、（１）はＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏで染色した結果であり、（２）～（８）はそれぞれＣＤ６８、ＶＣＡＭ－１、ＭＣＰ－１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８３、ＣＤ４、ＰＣＮＡを免疫染色した結果である。また、図１１において、「＊」はｔ－テストより危険率ｐ＜０．０５で有意差がある場合を示す。
　Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏは脂肪変性部位を染色できるため、図３の写真中の染色部位はアテローム動脈硬化病巣部位を示す。図３のとおり、ＩｇＧ抗体を投与した場合に比して、本発明に係るＨＭＧＢ１抗体を投与した場合には、アテローム動脈硬化病巣部位が顕著に低減されていることが分かる。
　ＣＤ６８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８３およびＣＤ４は白血球抗原であり、それぞれマクロファージ、未熟樹状細胞、成熟樹状細胞、Ｔ－リンパ球で高発現している。図４、図７～９および図１１のとおり、対照であるＩｇＧ抗体を投与した場合に比して、本発明に係るＨＭＧＢ１抗体を投与した場合にはこれら白血球抗原の発現が顕著に抑制されており、血管内膜層におけるマクロファージ、樹状細胞およびＣＤ４陽性Ｔ－リンパ球の浸潤が顕著に抑制されていることが分かる。
　ＶＣＡＭ－１は、血管内皮細胞の活性化によりその細胞形質膜における発現量が増大する。特に動脈硬化の形成に関与すると考えられている。従って、免疫組織化学染色によりＶＣＡＭ－１陽性細胞数の増減を調べることにより、内皮細胞の活性化に対する抗体の効果を評価できる。図５と図１１のとおり、本発明に係るＨＭＧＢ１抗体を投与した場合には対照に比してＶＣＡＭ－１陽性細胞数がおよそ半減しており、当該抗体により動脈硬化の形成に関与する血管内皮細胞の活性化を抑制できることが明らかにされた。
　ＭＣＰ－１は、単球、マクロファージおよび樹状細胞の遊走因子である。図６のとおり、本発明に係るＨＭＧＢ１抗体を投与した場合には対照に比してＭＣＰ－１陽性の領域が約３０％にまで低減されているので、当該抗体は動脈硬化の形成に関与する単球等の遊走を抑制できることが証明された。
　ＰＣＮＡは、ＤＮＡの合成と修復に関与する核内因子である。血管壁内では、遊走平滑筋の増殖性細胞で多く発現していると考えられる。図１０と図１１のとおり、本発明に係るＨＭＧＢ１抗体を投与した場合には対照に比してＰＣＮＡ陽性の細胞数が約３５％低下しているので、当該抗体により動脈硬化が抑制されることが分かった。 
　本発明に係る薬剤は、活性化された単球の血管内膜層への集積を阻害することなどにより、脳梗塞や心筋梗塞など様々な臓器障害の原因となるアテローム動脈硬化を効果的に抑制することができる。また、現在使用されている抗体薬剤を考慮すれば、重篤な副作用を生じる可能性は極めて少ないと考えられる。従って、本発明のアテローム動脈硬化抑制剤は、抗高脂血症薬や抗高血圧薬などこれまで実用化されている薬剤とは異なる作用機序によりアテローム動脈硬化を抑制可能な実用的薬剤として、極めて有用である。

Claims (12)

  1. 　ＨＭＧＢ１のＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とするアテローム動脈硬化抑制剤。
  2. 　抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体が、ＨＭＧＢ１のＣテイル中のアミノ酸配列であるＥＥＥＤＤＤＤＥを特異的に認識するものである請求項１に記載のアテローム動脈硬化抑制剤。
  3. 　静脈注射投与するものである請求項１または２に記載のアテローム動脈硬化抑制剤。
  4. 　抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を、１回当たり０．２ｍｇ／ｋｇ以上、２ｍｇ／ｋｇ以下投与するものである請求項３に記載のアテローム動脈硬化抑制剤。
  5. 　ＨＭＧＢ１のＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を投与する工程を含むことを特徴とするアテローム動脈硬化の抑制方法。
  6. 　抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体が、ＨＭＧＢ１のＣテイル中のアミノ酸配列であるＥＥＥＤＤＤＤＥを特異的に認識するものである請求項５に記載のアテローム動脈硬化の抑制方法。
  7. 　抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を静脈注射投与する請求項５または６に記載のアテローム動脈硬化の抑制方法。
  8. 　抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を、１回当たり０．２ｍｇ／ｋｇ以上、２ｍｇ／ｋｇ以下投与する請求項７に記載のアテローム動脈硬化の抑制方法。
  9. 　アテローム動脈硬化を抑制するために用いられ、ＨＭＧＢ１のＣテイルに結合する抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体。
  10. 　ＨＭＧＢ１のＣテイル中のアミノ酸配列であるＥＥＥＤＤＤＤＥを特異的に認識するものである請求項９に記載の抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体。
  11. 　静脈注射投与するものである請求項９または１０に記載の抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体。
  12. 　１回当たり０．２ｍｇ／ｋｇ以上、２ｍｇ／ｋｇ以下投与するものである請求項１１に記載の抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014511688A (ja) * 2011-04-05 2014-05-19 ディーアイエー ピーアールオー ダイナスティック バイオプローブス エスアールエル Ｈｍｇｂ１に特異的なモノクローナル抗体
WO2014115430A1 (ja) 2013-01-28 2014-07-31 株式会社イーベック ヒト化抗ｈｍｇｂ１抗体もしくはその抗原結合性断片

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6307080B2 (ja) * 2012-09-07 2018-04-04 インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル） 骨髄細胞に発現する誘発性受容体１（ｔｒｅｍ−１）ｔｒｅｍ様転写産物１（ｔｌｔ−１）に由来する阻害ペプチドおよびその使用
DE102017104135A1 (de) * 2017-02-28 2018-08-30 Osram Opto Semiconductors Gmbh Optoelektronisches Bauelement und Verfahren zur Herstellung eines optoelektronischen Bauelements

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004523579A (ja) 2001-03-16 2004-08-05 バイオ３ リサーチ ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ 血管疾患治療用ｈｍｇｂ１蛋白質インヒビタおよび／またはアンタゴニスト
JP2005512507A (ja) 2001-05-15 2005-05-12 ノース・ショア−ロング・アイランド・ジューイッシュ・リサーチ・インスティテュート 抗炎症剤としてのｈｍｇフラグメントの使用
WO2007135992A1 (ja) * 2006-05-19 2007-11-29 National University Corporation Okayama University 脳血管攣縮抑制剤
JP2009096739A (ja) * 2007-10-15 2009-05-07 Okayama Univ Ｂ細胞悪性リンパ腫治療薬

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2306195T3 (es) * 2004-07-02 2008-11-01 Creabilis Therapeutics S.P.A. Agentes terapeuticos para el tratamiento de patologias relacionas con hmgb1.
MX2007001155A (es) * 2004-07-29 2007-08-14 Creabilis Therapeutics Spa Uso de inhibidores de k-252a y de quinasa para la prevencion o el tratamiento de patologias asociadas con hmgb1.
JP3876325B1 (ja) * 2005-10-24 2007-01-31 国立大学法人 岡山大学 脳梗塞抑制剤
CA2663300C (en) * 2006-09-15 2014-10-07 Creabilis Therapeutics S.P.A. Polymer conjugates of box-a of hmgb1 and box-a variants of hmgb1

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004523579A (ja) 2001-03-16 2004-08-05 バイオ３ リサーチ ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ 血管疾患治療用ｈｍｇｂ１蛋白質インヒビタおよび／またはアンタゴニスト
JP2005512507A (ja) 2001-05-15 2005-05-12 ノース・ショア−ロング・アイランド・ジューイッシュ・リサーチ・インスティテュート 抗炎症剤としてのｈｍｇフラグメントの使用
WO2007135992A1 (ja) * 2006-05-19 2007-11-29 National University Corporation Okayama University 脳血管攣縮抑制剤
JP2009096739A (ja) * 2007-10-15 2009-05-07 Okayama Univ Ｂ細胞悪性リンパ腫治療薬

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIU, K. ET AL.: "Anti-high mobility group box 1 monoclonal antibody ameliorates brain infarction induced by transient ischemia in rats", FASEB J, vol. 21, no. 14, 2007, pages 3904 - 3916, XP002556545 *
See also references of EP2484379A4
WAUTIER, J.L. ET AL.: "Blood cells and vascular cell interactions in diabetes", CLIN HEMORHEOL MICROCIRC, vol. 25, no. 2, 2001, pages 49 - 53, XP008158296 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014511688A (ja) * 2011-04-05 2014-05-19 ディーアイエー ピーアールオー ダイナスティック バイオプローブス エスアールエル Ｈｍｇｂ１に特異的なモノクローナル抗体
WO2014115430A1 (ja) 2013-01-28 2014-07-31 株式会社イーベック ヒト化抗ｈｍｇｂ１抗体もしくはその抗原結合性断片
US9550825B2 (en) 2013-01-28 2017-01-24 Evec Inc. Humanized anti-HMGB1 antibody or antigen-binding fragment thereof

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