JP2011068627A - アテローム動脈硬化抑制剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】HMGB1(High Mobility Group Box 1、高移動度群タンパク質のBボックス1)のCテイルに結合する抗HMGB1モノクローナル抗体を有効成分とするアテローム動脈硬化抑制剤。該アテローム動脈硬化抑制剤は、静脈注射投与が好ましく、1回当たり0.2mg/kg以上、2mg/kg以下投与することが好ましい。
【選択図】なし
Description
(a)ラットの免疫
市販のウシ胸腺由来HMGB1とHMGB2との混合物(和光純薬工業社製、コード番号:080−070741)1mg/mLを2mLガラス製注射筒にとり、別の2mLガラス製注射筒にとった等容量のフロイント完全アジュバンドと連結管を通じて徐々に混和することによって、エマルションとした。セボフルレンにより麻酔したラットの後肢足蹠に、得られたエマルションを0.1mLずつ、計0.2mL注射投与した。2週間後、頚静脈から試験採血し、抗体価の上昇を確認した。次いで、腫大した腸骨リンパ節を前記注射投与から5週間後に無菌的に取り出した。得られた2個のリンパ節から、約6×107個の細胞を回収することができた。
上記腸骨リンパ節細胞とマウスミエローマSP2/O−Ag14(SP2)細胞を、ポリエチレングリコールを用いて融合させ、得られた融合細胞を96穴マイクロプレートに蒔いた。1週間後、最初のELISAスクリーニングを行ない、陽性ウェルについて、ウェスタンブロットにより二次スクリーニングを行なった。陽性を示すウェル細胞を24穴マイクロプレートに移し、細胞をほぼコンフルエントな状態(約2×105)に殖やしてから、0.5mLの凍結培地(GIT培地にウシ胎児血清を10%とジメチルスルホキシドを10%添加したもの)を用いて、液体窒素中で凍結保存した。この凍結保存細胞を解凍した後、96穴マイクロプレートでクローニングした。
回転培養装置(Vivascience社製)により上記陽性細胞を2週間大量培養し、濃度2〜3mg/mLの抗体液を得た。中性pH下、この抗体液をアフィニティゲル(インビトロジェン社製、MEP−HyperCel)と混和し、抗HMGB1抗体をゲルへ特異的に結合させた。特異的にゲルに結合した抗体を、グリシン−塩酸バッファー(pH4)により溶出した。溶出液を限外濾過装置により濃縮した後、セファロースCL6Bゲル濾過カラム(直径2cm×長さ97cm)によって、得られた抗体を単離精製した。
上記実施例1と同様にして、HMGB1のBボックス(配列:LKEKYEKDIA)をエピトープとして認識する抗HMGB1モノクローナル抗体を単離精製した。
上記実施例1および比較例1のモノクローナル抗体のHMGB1における結合部位を、改めて決定した。
アテローム動脈硬化は、血液中の単球が動脈血管内皮細胞間隙を通過して、内皮細胞の基底膜下に侵入することから始まるといわれており、HMGB1は単球の活性化と血漿タンパク質の漏出に関与していると考えられている。そこで、HMGB1による血管透過性亢進の阻害試験を行い、各抗体の活性を調べた。
(1) アテローム動脈硬化モデルマウスの作製
一般的な実験用マウスであるC57BLに由来する雄性ApoE−/−マウス(6週齢)をPrecinct Animal Facility(AMREP,メルボルン,オーストラリア)から入手し、コレステロール0.15%と脂肪分21%を含む高脂肪餌を8週間にわたり与えた。
過剰量のペントバルビタール(120mg/kg)を腹腔内投与することにより上記マウスを殺し、心臓と近位大動脈を切除し、OCTコンパウンド(製品名「Tissue−tek)に包埋し、−80℃で凍結した。大動脈洞の6μm厚スライスを作製した。
本発明に係る抗HMGB1抗体の実際のアテローム動脈硬化に対する効果を、アテローム動脈硬化モデルマウスを用いて試験した。なお、この実験は、the Alfred Medical Research Education Precinct(AMREP)Animal Ethics Committeeに認可されたものである。
一般的な実験用マウスであるC57BLに由来する雄性ApoE−/−マウス(6週齢)をPrecinct Animal Facility(AMREP,メルボルン,オーストラリア)から入手し、コレステロール0.15%と脂肪分21%を含む高脂肪餌を8週間にわたり与えた。また、当該期間中、実施例1で得た抗HMGB1抗体、または
対照としてヘモシアニンの一種であるKeyhole Limpet hemocyaninに対するIgG2aを、それぞれマウス1匹当たり400μgの用量で1週間当たり2回静脈注射した。
過剰量のペントバルビタール(120mg/kg)を腹腔内投与することにより上記マウスを殺し、心臓と近位大動脈を切除し、OCTコンパウンド(製品名「Tissue−tek)に包埋し、−80℃で凍結した。大動脈洞の6μm厚スライスを作製し、大動脈内膜断面におけるアテローム動脈硬化病巣部位を、脂肪変性部位を特定できるOil Red Oで染色した。各マウスの上行大動脈において、大動脈弁尖から180μmの間で60μmごとの内膜断面において、染色されたアテローム動脈硬化病巣部位の面積を測定し、その平均値を算出した。代表的な断面写真を図3に示す。
上記の大動脈洞スライスを、−20℃のアセトンで20分間固定化した。次いで、3%過酸化水素、10%血清およびビオチン/アビジンブロッキング剤(Vector Laboratories製)を含むPBS溶液中でインキュベートした。当該スライスを、血清中、一次抗体と1時間インキュベートした。使用した一次抗体は、ラット由来の抗マウスCD68抗体(Serotec製,cat#MCA1957)、ラット由来の抗マウスVACM−1抗体(BD Pharmingen製,cat#550547)、ウサギ由来の抗ラットMCP−1抗体(Abcam製,cat#ab7202)、アルメニアンハムスター由来の抗マウスCD11c抗体(eBioscience製,cat#14−0114)、ラット由来の抗マウスCD83抗体(eBioscience製,cat#14−0831)、ラット由来の抗マウスCD4抗体(BD Pharmingen製,cat#550274)、またはウサギ由来の抗ヒトPCNA抗体(Abcam製,cat#ab2426)である。次いで、当該スライスを洗浄した後、由来動物に応じた二次抗体と40分間インキュベートした。使用した二次抗体は、マウス由来のビオチン化抗ラット抗体(BD Pharmingen製,cat#550325)、マウス由来のビオチン化抗アルメニアンハムスター抗体(eBioscience製,cat#13−4113−85)、またはビオチン化抗ウサギ抗体(Vector Laboratories製,cat#BA−1000)である。続いて、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(Vector Laboratories製)とインキュベートした。各抗原を、3,3−ジアミノベンジジンを用いて可視化した。各スライスを、ヘマトキシリンで対比染色した。
Claims (3)
- HMGB1のCテイルに結合する抗HMGB1モノクローナル抗体を有効成分とすることを特徴とするアテローム動脈硬化抑制剤。
- 静脈注射投与するものである請求項1に記載のアテローム動脈硬化抑制剤。
- 抗HMGB1モノクローナル抗体を、1回当たり0.2mg/kg以上、2mg/kg以下投与するものである請求項2に記載のアテローム動脈硬化抑制剤。
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