JPH08507063A

JPH08507063A - Ｐｄｇｆレセプタに対する抗体を使用した脈管内膜過形成の阻害

Info

Publication number: JPH08507063A
Application number: JP6519074A
Authority: JP
Inventors: イー．ハート，チャールズ; ディー．ケナギー，リチャード; ダブリュ．クロウズ，アレクサンダー
Original assignee: University of Washington
Current assignee: University of Washington
Priority date: 1993-02-25
Filing date: 1994-02-17
Publication date: 1996-07-30
Anticipated expiration: 2014-08-30
Also published as: CA2156825C; WO1994019016A1; DK0686044T3; CA2156825A1; DE69413009D1; EP0686044A1; DE69413009T2; EP0686044B1; JP2944218B2; ES2122248T3; ATE170402T1

Abstract

(57)【要約】霊長類を含む哺乳動物の脈管構造における脈管内膜過形成を阻害する方法を開示する。本法は、哺乳動物に、抗−PDGFレセプタ抗体、例えば、抗−PDGF−アルファ・レセプタ抗体又は抗−PDGF−ベータ・レセプタ抗体を投与することを含んで成る。本法は、例えば血管形成術、動脈内膜切除術、整復アテローム切除又は血管移植の吻合術から生じる損傷による脈管内膜過形成の減少において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 PDGFレセプタに対する抗体を使用した脈管内膜過形成の阻害技術分野本発明は、血管損傷後の哺乳動物における再狭窄（restenosis）を含む脈管内膜過形成（intimal hyperplasia）阻害のための方法、及びこれらの方法において有用な組成物に関する。発明の背景血管壁内の平滑筋細胞（SMCs）の増殖は、血管再構築後のアテローム性硬化症（atherosclerosis）における血管病変の形成において、又は他の血管損傷に対する応答において重要な事件である。例えば、アテローム性硬化症の治療は、しばしば、血管形成術（angioplasty）動脈内膜切除術（endarterectomy）又は整復アテローム切除（atherectomy）による、又はバイパス移植、アテローム性硬化症斑がカテーテル法（血管形成術）を通じて狭まれ又は除去され、切除（動脈内膜切除術）を通じて動脈壁からはがされ又は天然の又は合成の移植片によりバイパスされるような外科手順による、閉塞した血管からのクリアリングを含む。これらの手順は、血管内皮を除去し、下にある脈管内膜層を侵し、そして内側（ midial）SMCsの死をもたらす。この損傷の後に、内側SMCの増殖、そしてその脈管内膜への転移が続き、これは特徴的には、損傷後最初の数週間〜６ケ月以内に生じ、そして重層内皮層が再確立されたとき停止する。ヒトにおいては、これらの病変は、約20％の細胞と80％の細胞外マトリックスから成る。血管形成術により治療された患者の約30％以上において、動脈内膜切除術又はバイパス移植、血栓症及び／又は脈管内膜中のSMC増殖は、血管の再閉塞及び再構築外科手術のその後の失敗を引き起こす。外科手術後のこの血管閉塞は、再狭窄として知られている。 SMC増殖の同様の過程も、臓器移植において観察され、そして移植アテローム性硬化症及び臓器不全に寄与することができる。この過程における脈管内膜の肥厚は移植された臓器だけを含む。血小板マイトゲン、例えば、血小板誘導成長因子（platelet derived growth factor（PDGF））は、アテローム性硬化症の顕出において役割を演じると仮定されている（Ross et al.，Cell 46：155-169，1986；Harker，Am.J.Cardiol. 6 0： 20B-28B，1987参照）。斑形成についての１つの提案された機構は、SMC成長を剌激する成長因子の、内皮露出の部位における、血小板による放出である（Ro ss and Glomset，N.Eng.J.Med． 295：369-377，420-425，1976；Ross，Arteri osclerosis １：293-311，1981）。内在するカテーテル損傷モデルを使用して、Moore et al．（Thrombos.Haemostas.（Stuttg.） 35：70，1976）及びFried man et al.（J.Clin.Invest. 60：1191-1201，1977）は、抗−血小板血清の投与により誘導される遅延化された血小板減少症（thrombocytopenia）によるウサギ動脈内の、実験的に誘導された脈管内膜病変形成の阻害について報告した。SM C_sがそれ自体オートクライン（autocrine）機構を通じて病変顕出を剌激するPDG Fを作り出すことができるということも仮定されている（Ross et al.，ibid；Wa lker et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：7311-7315，1986）。Fingerle et al.（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8412-8416，1989）は、血小板減少症ラットにおける脈管内膜病変形成について調査し、そして血小板はバルーン損傷後の初期SMC増殖において役割をもたないがその脈管内膜へのSMC転移を調節することができると結論付けた。現在、血小板は、PDGF、上皮増殖因子（EGF）、トランスフォーミング増殖因子アルファ及びベータ（TGFα及びTGFβ）、インシュリン−様成長因子Ｉ（IGF−Ｉ）及び血小板誘導内皮細胞成長因子、並びにいくつかの化学誘引物質分子を含む多数の増殖因子を放出することが知られている。特定の研究が病変顕出に関係する過程におけるPDGFを含意するけれども、霊長類におけるこれらの過程におけるPDGFの関与を示す研究はない。血管形成術又は動脈内膜切除術によるアテローム性硬化症斑の除去は、限られた効果をもち、そして治療された血管の再狭窄又はバイパス移植の狭窄についての有効な治療法は全く開発されていない。それ故、本分野において、血管損傷、例えば、バルーン・カテーテル法、動脈内膜切除術又は整復atherectomy後の血管の狭窄を含む血管壁において、並びに血管移植、臓器移植及びカテーテル挿入において、SMC−豊富病変の顕出を減少させ又は妨ぐ方法についての必要性が存在する。本発明は、このような方法を提供し、そして他の関連する要求を達成する。本発明の開示本発明は、哺乳類、特に霊長類の脈管構造（vasculature）における脈管内膜過形成を阻害するための方法を提供する。脈管内膜過形成の例は、血管形成術、動脈内膜切除術又はアテローム性硬化症斑が血管が除去される他の手順の後の再狭窄を含む。これらの方法は、一般的に、哺乳動物に、抗−血小板誘導増殖因子（PDGF）レセプタ抗体を、平滑筋細胞の有糸分裂誘発及び／又は転移を阻害するのに充分な量において、投与することを含んで成る。本発明の１つの態様においては、脈管内膜過形成は、哺乳動物に、有効量の、抗−PDGFレセプタ抗体、例えば抗−PDGF−アルファ・レセプタ抗体、抗−PDGF− ベータ・レセプタ抗体、又は１パネルの抗−PDGFレセプタ抗体を投与することにより阻害される。１の態様においては、このパネルの抗体が、PDGFレセブタへのAA，AB及びBBイソ形態の結合を中和することができる。本発明の他の態様においては、抗−PDGFレセプタ抗体が、哺乳動物における急性血管損傷の発生に先立って哺乳動物に投与される。急性血管損傷の例は、血管再構築手順、例えば、血管形成術、動脈内膜切除術、整復（reduction）atherec tomy及び血管移植の吻合（anastomosis）を含む。関連態様においては、抗体は、血管移植に先立って又は組合せにおいて投与される。本発明の他の態様においては、抗体は、血管移植又は移植臓器内で生じる脈管内膜過形成を阻害するために使用される。本発明において有用な抗体は、モノクローナル抗体及び遺伝子操作された抗体を含み、後者は、一本鎖抗体、キメラ抗体、２価抗体及び免疫結合体を含む。本発明の上記及び他の態様は、以下の詳細な説明及び添付図面を参照して明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１は、組換え体PDGF−ベータ・レセプタを発現する細胞への、抗−PDGFレセプタ・モノクローナル抗体の結合を示している。結果は、３連測定についての¹² ⁵ Ｉ−ウサギ抗−マウスIgGの平均cpm結合として表されている。バーは、標準偏差を示す。図２は、組換え体PDGF−アルファ・レセプタを発現する細胞への、抗−PDGFレセプタ・モノクローナル抗体の結合を示している。結果は、３連測定について¹² ⁵ Ｉ−ウサギ抗−マウスIgGの平均cpm結合として表されている。バーは、標準偏差を示す。図３Ａ−３Ｃは、抗−PDGFレセプタ・モノクローナル抗体によるヒト皮膚繊維芽細胞に対するPDGF有糸分裂誘発活性の中和について示している。これらの結果は、PDGFリガンド・テスト条件のそれぞれについての〔³Ｈ〕チミジン取込みの平均レベルとして表されている。標準偏差を、各バーの上にＴにより示す。各パネルは、PDGFリガンド単独についての標準線を示す。Ａ）PDGF-AA 剌激、Ｂ）PDGF-AB刺激、Ｃ）PDGF-BB剌激。図４は、抗−PDGFレセプタ・モノクローナル抗体によるヒヒ平滑筋細胞に対するPDGF-AA有糸分裂誘発活性の中和について示している。リガンド単独についての標準曲線を左側に示す。結果は、〔³Ｈ〕チミジンの取込みの平均レベルとして表される。標準偏差を、各バーの上にＴにより示す。図５は、抗−PDGFレセプタ・モノクローナル抗体によるヒヒ平滑筋細胞に対するPDGF-AB有糸分裂誘発活性の中和について示している。リガンド単独についての標準曲線を、左側に示す。結果を図４中に表す。図６は、抗−PDGFレセプタ・モノクローナル抗体によるヒヒ平滑筋細胞に対するPDGF-BB有糸分裂誘発活性の中和について示す。リガンド単独についての標準曲線を、左側に示す。結果を図４中に表す。図７ＡとＢは、ヒヒ平滑筋細胞に対するPDGF-AAの有糸分裂誘発活性の中和のための、代表的なモノクローナル抗体の滴定について示す。結果を、PDGF-AAテスト条件のそれぞれについての〔³Ｈ〕チミジン取込みの平均レベルとして表す。標準偏差を、PDGF-AA標準曲線サンプルについてＴにより示す。（Ａ）PDGF-AA 有糸分裂誘発活性、（Ｂ）〔³Ｈ〕チミジンの取込みのレベルにおける減少により示されるようなPDGF-AA有糸分裂誘発活性についてのMAbs 169.14と169.31の阻害効果。図８は、抗−PDGFレセプタ・モノクローナル抗体によるヒヒ平滑筋細胞に対するヒヒ血清の有糸分裂誘発活性の中和について示している。血清単独についての標準曲線を左側に示す。結果を、〔³Ｈ〕チミジンの平均レベルとして表す。標準偏差を各バーの上にＴにより示す。図９は、ヒヒ平滑筋細胞に対するモノクローナル抗体169.31の存在中での、ヒヒ血清の有糸分裂誘発活性について示している。発明の詳細な説明先に記載したように、血管の再狭窄は、血管形成術又は動脈内膜切除術を経験した患者において共通の問題である。再狭窄は、脈管内膜過形成の一つの例であり、これは、外科手術により、及び細胞外マトリックスの生産により損傷を受けた領域内の血管平滑筋細胞の増殖（有糸分裂）と転移の両方を含む過程を介して進行すると信じられている。この増殖過程は、血管移植（自己及び同種を含む天然、と合成の両方）の閉塞において、そして移植臓器内において現われる。この増殖過程は、平滑筋細胞内で豊富な病変の顕出をもたらし、そして本明細書中、脈管内膜過形成といわれる。本発明は、PDGFレセプタに対する抗体の使用を通じてSMC−豊富病変の顕出を阻害するための方法を提供する。このような病変は、脈管内膜肥厚（過形成）を通じこの血管の部分的又は完全な遮断をもたらす。脈管内膜過形成の阻害は、細胞転移、細胞の有糸分裂、及び細胞外マトリックス形成の中の１以上を減少させ又は防止することによりその増殖を妨害することを含むと理解されるであろう。 PDGFとそのレセプタとの相互作用の妨害を通しての有糸分裂及び／又は転移の遮断により、SMC増殖及びその後のマトリックス沈着が減少される。本発明において有用な抗体は、免疫感作と精製の慣用の手順により作られることができる。簡単に言えば、好ましくは精製された、PDGFレセプタ、レセプタ断片又はレセプタ・ポリペプチドを含んで成る融合タンパク質を、免疫応答を引き起こすのに充分な量において、動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ又はヤギに投与する。その免疫応答を強化するために、アジュバント、例えば、Freund' ｓアジュバントと共に上記成長因子レセプタを投与することが好ましい。抗原の単一注射が上記動物における抗体産生を誘導するのに充分であることができるけれども、数週間〜数カ月の期間にわたり、大量の開始の注射の後に１回以上のブースター注射を投与することが一般的には好ましい。例えば、Hurrell，J.G.R. ，ed.，Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications，CRC Press Inc.，Boca Raton，FL，1982（これを引用により本明細書中に取り込む）を参照のこと。次に、血液をその動物から採取し、そして凝固させ、そして抗体を、慣用の技術、例えば、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー又は高速液体クロマトグラフィーを使用してその血清から単離する。本発明の１態様においては、モノクローナル抗体が使用される。モノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体に比べて、より容易な産生及びより低い治療的投与量の利点を提供する。なぜなら、所望の特異性の抗体だけが使用されるからである。モノクローナル抗体の産生方法は、本分野においてよく知られており、そして、例えば、Kohler and Milstein（Nature 256：495，1975；E ur.J.Immunol．6 ：511-519，1976）により開示されている。また、Hurrell，J.G .R.，ed.，Monoclonal Hybridoma Antibodies：Technique and Applications，C RC Press Inc.，Boca Raton，FL，1982及びHart，米国特許第5,094,941号を参照のこと。当業者には自明であろうが、抗体断片、例えば、Fabフラグメントも使用できる。患者と同系であり又は同系の定常領域を含む抗体を使用することが一般的には好ましい。この理由のために、遺伝子操作された抗体が、ヒトの治療において一般的に使用されるであろう。組換えヒト抗体又はヒト化非−ヒト（すなわち、キメラ）抗体を産生する方法は、Cabilly et al．（米国特許第4,816,567号）、Ro binson et al．（WO 87／02671）及びNeumaier（WO 90／00616）（これらを引用により本明細書中に取り込む）により開示されている。簡単に言えば、ヒト定常領域遺伝子を、適当なヒト又は非−ヒト可変領域遺伝子に結合させる。例えば、親ネズミ・モノクローナル抗体の抗原結合部位（CDRs、又は相補性決定部位（co mplementarity-determining regions））を提示するアミノ酸配列を、そのDNAレベルにおいてヒト可変領域のフレームワーク配列上に移植する。この工程は、“ ヒト化（humanization）”として知られる。この技術の方法は、本分野において公知であり、そして例えば、Jones et al．（Nature 326：522-525，1986），Ri echmann et al（Nature 322：323-327，1988）及びQueen et al．（Proc.Natl.A cad.Sci.USA 86：10029-10033，1989）により開示されている。次に、結合された遺伝子を宿主細胞内にトランスフェクトし、そして慣用の手順に従って培養する。他の方法においては、モノクローナル抗体産生細胞を、クローン化されたヒト定常領域遺伝子、及び相同的組換えにより作られたキメラ抗体遺伝子により、トランスフェクトすることができる。従って、その構造のかなりの部分がヒトであるモノクローナル抗体を組み立て、それにより、ヒト患者への多数投与により好適である抗体を提供することが可能である。あるいは、一本鎖抗体を、典型的にはリンカー・ポリペプチドを介して可変重鎖配列に結合された可変軽鎖配列から一般的に成る組換えポリペプチドの発現を通して開発することができる。一本鎖抗体を作り出す方法は、本分野において公知であり、そして、例えば、David et al．（BioTech nology 9 ：165-169，1991）により開示されている。本発明においては、中和抗体を使用することが好ましい。“中和抗体（Neutra lizing antibody）”は、本明細書中、インビトロにおけるテスト系における抗原の生物学的活性、例えば、１以上のPDGFとPDGFレセプタ（単数又は複数）との相互作用を遮断する能力の全てを本質的に遮断するのに充分な抗体の量を指すために使用される。好適なインビトロにおけるテスト系は、とりわけ、有糸分裂誘発検定及びレセプタ結合性検定を含む。例えば、25μｇ／mlの、本明細書中に記載するモノクローナル抗−PDGF−アルファ・レセプタ MAbは、10ng／mlの PDGF -AAの有糸分裂誘発活性を遮断することができる。当業者に理解されるように、所定量の抗原を中和するのに必要な抗体の量は、抗体特異性と、アフィニティーのような要因に依存するであろう。２つのPDGFレセプタ・ポリペプチドが、記載されている。これらは、“アルファ・レセプタ（alpha receptor）”（Kelly et al.，WO 90／14425；Claesson-W elsh et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：4917-4921，1989）と“ベータ・レセプタ（beta receptor）”（Claesson-Welsh et al.，Mol.Cell.Biol．8：3476 -3486，1988；Gronwald et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：3435-3439，198 8）と言われる。PDGFリガンドの存在中、これらのレセプタ・ポリペプチドは、２量体となる。それ故、３つのレセプタ・サブタイプ：αα，αβ及びββが可能である。このβレセプタは、PDGFのＢ−鎖に特異的であり、一方、このαレセプタは、そのＡ−鎖とＢ−鎖に結合する。本発明において使用される抗−PDGFレセプタ抗体は、好ましくは、３つのPDGFレセプタ・イソ形態（αα，ββ及びαβ）のすべてを中和することができる抗体のパネルあろう。本明細書中に使用するとき、用語“パネル（panel）”とは、異なる特異性をもつ２以上の抗体の組合せをいう。これらの抗体は、異なる抗原に又は単一抗原上の異なるエピトープに特異的であることができる。モノクローナル抗体（MAbs）が好ましい。抗−レセプタ・モノクローナル抗体を、治療的に重要な化合物のデリバリーのための標的化剤として使用することもできる。このような化合物は、非限定的に、毒素（toxins）、細胞増殖抑制性化合物、又はその潜在的機能が内因性プロ酵素を活性化し、外来源から添加されたプロ酵素を活性化し、又はプロドラッグ上の酵素解裂部位を活性化することができるであろうプロ酵素を含む。抗−レセプタ抗体は、画像形成剤としての使用のための、放射性核種、染料、蛍光化合物等により標識されることもできる。上記の例は、例えば、細胞−表面レセプタを発現する血管平滑筋細胞の露出が存在する血管損傷の部位又は血栓症の部位を画像形成することを含む。モノクローナル抗体を、それぞれの免疫グロブリン分子上に２つの独立した抗原結合が存在する２価抗体を開発するために使用することもできる。この技術は、本分野において公知であり、そして文献（Thromb.Res.Suppl.X：83，1990）中に開示されている。さらに、２特異的抗体も一本鎖抗体から構築することができる。この技術は本分野において公知であり、そして例えば、George（The Second Annual IBC International Conference on Antibody Engineering ，Dec．16-18 ，1991，San Diego CA）により開示されている。抗−PDGFレセプタ抗体は、外科手術前（一般的に外科手術前２４時間以内に）、そして場合により１〜２週間以上の経過にわたり数時間〜数日間の間隔で外科手術後継続して、ボーラス注射（静脈内、筋中、腹膜内又は皮下）により投与されることができる。多くの場合、入院中毎日の投与量を、退院治療の期間の間より頻度の少ないボーラス注射を投与することが好ましいであろう。抗体は、遅延放出デリバリー・システム、例えば、血管移植片又はステント（stents）内に取り込まれ又は潅流又は２バルーン・カテーテルによるシステムを含むものによりデリバリーされることもできる。本発明の方法は、急性血管損傷による脈管内膜過形成の治療において特に有用である。急性血管損傷は、生涯にわたり顕出する慣性血管損傷（例えば、アテローム性硬化症）に対して、急速に（すなわち、数日〜数カ月にわたり）生じるものである。急性血管損傷は、しばしば、血管形成術、動脈内膜切除術、atherect omy、血管移植片据え付け等が使用される外科手術、例えば血管再構築から生じる。過形成は、例えば、移植片据え付け又は臓器移植に応答する遅延化された応答として生じることもできる。抗体の投与量は、先に記載したような中和基準に基づいて選択されるであろう。投与量レベルは、血液からの抗体のクリアランスを測定した後の中和データから計算される。一般的に、投与量は、放出されたPDGFのいずれをも中和するのに充分な抗体の循環レベルを維持する目標をもって選択される。一般的に、投与量は、１日当り患者の体重１kg当り約20μｇ〜500mg以上の抗体の、好ましくは約0 .1mg〜20mg／kg／日、より好ましくは約１mg〜10mg／kg／日のレンジ内にあるであろう。いくぶん高い投与量が、２以上の抗体が組み合わされて投与される場合に、要求されることができる。治療は、最初の損傷の６カ月後までにわたり続けられることができる。抗−PDGFレセプタ抗体の“有効量”は、血管平滑筋細胞の有糸分裂誘発及び／又は転移を有意に阻害するのに充分な量として定められる。“有意な（signific ant）”減少は、インビトロ検定において有糸分裂誘発又は転移の50％以上の減少である。実際の量は、特定抗体の特異性及び結合アフィニティーのような要因に一部依存するであろうけれども、有効量は、本分野において公知であり、そして本明細書中に開示するインビトロ及びエクスビボ（生体外）手続により経験的に決定されることができる。一般的に、治療用途のための抗体の量は、インビトロ又はエクスビボにおいて有効であることが示されるものに少なくとも等しい血流中又は作用部位における濃度を提供するのに充分なものであろう。しかしながら、大きさの増加のオーダーまでの又はこれを超える、インビボにおけるより高い量を使用することが好ましい。本発明における使用のために、抗−PDGFレセプタ抗体が、慣用の手順に従って注射可能な組成物中に配合され、そして無菌容器内に包装される。抗体は、好適な希釈剤、例えば、滅菌生理食塩水又は滅菌水と併合されることができる。抗体組成物は、さらに担体、安定剤及び賦形剤、例えば糖（例えば、マンニトール）又はアルブミンを含むことができる。変種においては、抗体は、凍結乾燥形態で提供され、そして使用に先立って好適な希釈剤中で再構築されることができる。これらの組成物は、例えば、シールされたアンプル又はバイアル中で、単一又は多投与形態において包装されることができる。血管移植における狭窄の阻害のために、抗−PDGFレセプタ抗体が、それらの定常領域を通してその移植片に共有結合により付着され又は遅延放出配合物中の移植片内に取り込まれることができる。以下の実施例を、限定によらず説明により提供する。実施例実施例１は、PDGFレセプタ・アルファ及びベータ・ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの調製について開示する。実施例２，３及び４は、抗−PDGF−ベータ・レセプタ・モノクローナル抗体の同定及び特徴付けについて開示する。実施例５は、抗−PDGF−アルファ・レセプタ・モノクローナル抗体の同定及び特徴付けについて開示する。実施例６は、特定の代表的モノクローナル抗体の結合特異性の決定について開示する。実施例７は、抗−PDGFレセプタ・モノクローナル抗体を使用したヒト皮膚繊維芽細胞上のPDGF有糸分裂誘発活性の中和について立証する。実施例８は、抗− PDGFレセプタ・モノクローナル抗体を使用したヒヒ平滑筋細胞上のPDGF有糸分裂活性の中和について立証する。実施例９と10は、ヒヒ血清有糸分裂誘発活性を中和するための抗−PDGFレセプタ・モノクローナル抗体の使用について開示する。実施例11は、抗−PDGFレセプタ・モノクローナル抗体によるヒヒ大動脈平滑筋細胞転移の阻害について立証する。実施例12は、リガンドがレセプタに結合した後８時間までの、抗−PDGFレセプタMAbsがPDGFを中和する能力について立証する。実施例13は、抗−PDGFレセプタMAbsによるヒト骨肉腫細胞からのレセプタ結合PD GFの置換について開示する。組換え体PDGF AA及びBBは、米国特許第4,889,919号；第4,845,075号及び第5,0 37,743号（これらを全体として引用により本明細書中に取り込む）中に本質的に開示されているように酵母内で生産され、そしてカチオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過及び（NH₄）₂SO₄分別の組合せにより濃縮細胞培養基から同質まで精製された。PDGF ABは、Hart et al.，（Biochemist ry 29：166-172，1991）（これを引用により本明細書中に取り込む）により開示されるように旧ヒト血小板から調製した。PDGF-AA，AB及びBBを、先に記載したように（Hart et al．ibid.）ヨードビーズ（Iodo beads）（Pierce Chemical Co.，Rockford，IL）の使用により¹²⁵Ｉにより標識付けした。フェニルアラニンの代わりにその成熟コーディング配列の23位においてチロシン残基をもつBBtyr’といわれるＢ−鎖の突然変異形態を、PDGF-BBのヨウ素化のために使用した。ウサギ抗−マウスIgGを、ヨウ素ビーズを使用して¹²⁵Ｉにより同様に標識付けした。 PDGF−アルファ・レセプタ又はPDGF−ベータ・レセプタのいずれかの細胞外ドメインに結合されたヒトIgG重又は軽鎖を含んで成る融合タンパク質を、米国特許第5,155,027号；米国特許出願逐次番号第07／634,510号及び欧州特許第325,22 4号（これらを全体として引用により本明細書中に取り込む）中に本質的に開示されているように調製した。１の場合においては、マウス・ミエローマ細胞は、重鎖及び軽鎖／PDGFレセプタ細胞外ドメイン融合タンパク質の両方のためのcDNA sによりトランスフェクトさせた。これらの細胞は、それが２つの軽鎖と２つの重鎖の融合タンパク質から成るヒトIgGに類似する分子を、それらの培養基中に分泌する。この化合物は、テトラマーIgG／PDGFrと命名される。他の場合においては、軽鎖／PDGFレセプタ細胞外ドメイン融合タンパク質のためのcDNAを、その細胞単独内にトランスフェクトした。これらの細胞は、モノマー軽鎖融合タンパク質を、それらを培養基中に分泌する。これをモノマーIgG／PDGFrという。このアルファー及びベータ−レセプタ融合タンパク質は、それぞれ、IgG／PDGFr−アルファ（テトラマー）及びIgG／PDGFr−ベータ（モノマー及びテトラマー）と命名される。これらの融合タンパク質は、抗−PDGFレセプタ・モノクローナル抗体を使用した免疫アフィニティー精製、又はタンパク質Ａ−セファロース・クロマトグラフィーのいずれかにより精製された。実施例１ PDGFレセプタ・モノクローナル抗体の調製 PDGF−アルファ・レセプタ又はPDGF−ベータ・レセプタのいずれかの細胞外ドメインに結合したIgG定常領域を含んで成る融合タンパク質を、米国特許第5,155 ,027号（これを全体として引用により本明細書中に取り込む）中に本質的に開示したように調製した。このアルファとベータ・レセプタ融合物を、それぞれ、Ig G／PDGFr−アルファとIgG／PDGFr−ベータと名付けた。モノマーIgG／PDGFr−ベータは、ヒト・カッパ軽鎖定常領域とPDGF−ベータ・レセプタ細胞外ドメインとの融合物として発現された。このテトラマーIgG／PDGFr−ベータは、上記モノマー構築物と、細胞外ドメインと融合したヒトIgG重鎖定常領域プラス、ヒンジ配列との同時発現により調製された。アルファ・レセプタ融合物を、同様の手段により調製した。８週齢のBalb／ｃマウスを、精製されたモノマー又はテトラマーIgG／PDGFr− ベータ又は精製されたテトラマーIgG／PDGFr−アルファのいずれかにより免疫感作させた。マウスに、完全Freund'ｓアジュバントと混合した約10μｇの精製IgG ／PDGFrの腹膜内（ip）注射を与えた。約２週間の間隔で、マウスは、不完全Fre und'sアジュバントと混合したIgG／PDGFr−ベータ又はIgG／PDGFr−アルファの追加のip注射を受容した。ハイブリドーマを、米国特許第5,094,941号（これを全体として引用により本明細書中に取り込む）中に本質的に開示されているように免疫感作されたマウスから調製した。簡単に言えば、脾臓細胞を、そのマウスから単離し、そして洗浄する。汚染赤血球を、蒸留水により溶解することにより除去し、そしてその脾臓細胞を洗浄する。残りの汚染組織材料のいずれをも遠心分離により除去する。 NS−１マウス・ミエローマ細胞系（ATCC TIB 18）を、融合のために使用した。融合効率を最適化するために、細胞を、融合効率について検定し、そして高融合効率をもつクローンを選択した。このNS−１細胞を、37℃、７％ C O₂においてNS-１培地（表Ｉ）中で増殖させた。赤ちゃんマウスから得た胸腺細胞を、その細胞融合のための培養基をならすためのフィーダー（feeder）層として使用した。胸腺を、３−〜４−週齢のBalb／ cマウスから得て、そして胸腺細胞を、米国特許第5,094,941号中に開示されたように単離した。 NS−１細胞を、調製された免疫感作マウス脾臓細胞に添加し、そして融合を、米国特許第5,094,941号中に本質的に開示されたように行った。これらの細胞を、１ml当り１×HAT（表Ｉ）及び2.5×10⁶胸腺細胞を含むNS−１培地中で培養した。ハイブリドーマを、特異的抗体の産生について９〜14日間にわたり、テストした。実施例２ PDGFベータ・レセプタに対する抗体の同定及び特徴付け細胞融合162からのハイブリドーマを、PDGF−ベータ・レセプタに対する抗体の産生についてテストした。陽性ハイブリドーマの同定のために使用した検定法は、酵素結合イムノソルベント検定（ELISA）、IgG／PDGFr−ベータへの¹²⁵Ｉ-P DGF-BB結合の中和、及びヒト皮膚繊維芽細胞への¹²⁵Ｉ-PDGF-BB結合の中和を包含した。 ELISA検定は、モノマーIgG／PDGFr−ベータによりコートされた96−ウェル・マイクロタイター・プレート内で行われた。これらのウェルをコートするために、IgG／PDGFr−ベータを、ELISA Aバッファー（表Ｉ）中200ng／mlに希釈し、そして100μｌを各ウェルに添加した。これらのプレートを、37℃において２時間インキュベートした。インキュベーション後、これらのプレートを、ELISA Cバッファー（表Ｉ）で洗浄した。次にこれらのプレートを、37℃において150μｌ／ウェルのELISA Bバッファー（表Ｉ）と共にインキュベートして、非特異的結合部位を遮断した。このバッファーを除去し、そしてウェルをELISA Cバッファーで洗浄した。テスト・ハイブリドーマ上清を２群にプールし、そして100μｌのプールされたサンプルを、各マイクロタイター・ウェルに添加した。これらのプレートを、ELISA Cバッファーで洗浄し、次に、ビオチン−結合ウサギ抗−マウスIgG（Vector Labs，Burlingame，CA）と共に37℃において1.5 時間インキュベートした。各ウェルを、100μｌ／ウェルのストレプトアビジン −ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Amersham International，Amersham ，U.K.）と共に37℃において30分間インキュベートした。各ウェルを、ELISA C バッファーで再び洗浄し、次に反応バッファー（表Ｉ）と共にインキュベートした。反応を、１Ｎ H₂SO₄の添加により停止させ、そしてプレートを、490nmにおける吸光度をモニターするためのフィルターを使用してDynatech ELISAプレート・リーダー（Dynatech Laboratories，Inc．Alexandria，VA）内で読んだ。0.2 よりも大きいＡ₄₉₀の読みをもつウェルを陽性とした。陽性候補を先に記載したようにELISAにより再検定して、IgG／PDGFr−ベータに対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を含む個々の培養ウェルを決定する。細胞融合物162からのハイブリドーマを、IgG／PDGFr−ベータへの¹²⁵Ｉ-PDGF- BB結合の中和についてもスクリーニングした。ヤギ抗−ヒトIgG（Cappel Labs， Malvern，PA）を、ELISA Aバッファーにより、２μｇ／mlの最終濃度に希釈した。次にこの混合物を、96−ウェル・マイクロタイター・プレート、100μｌ／ウェルに添加し、そしてそれらのプレートを、37℃において1.5時間インキュベートした。これらのウェルを、ELISA Cバッファーで洗浄し、次に、ウェル当り200 μｌのELISA Bバッファーと共にインキュベートして、非特異的結合部位を遮断した。これらのプレートを、ELISA Cバッファーで洗浄し、次にテトラマーIgG／ PDGFr−ベータと共に1.5時間インキュベートして、25ng／mlの最終濃度にELISA Bバッファー中で希釈した。これらのウェルを、ELISA Cバッファーで洗浄して、非結合IgG／PDGFr−ベータを除去した。ハイブリドーマ上清を、２群にプールし、そして100μｌのプールされたサンプルを、マイクロタイター・ウェルのそれぞれに添加した。これらのウェルを、 37℃において１時間インキュベートした。次に、各ウェルに、50μｌの¹²⁵Ｉ-PD GF-BB（ウェル当り約50,000cpm）を添加した。37℃における１時間のインキュベーションの後、これらのウェルを、結合培地（表Ｉ）で３回洗浄した。100μｌの0.1Ｍクエン酸Na、pH 2.5を、室温において５分間それらのウェルに添加し、その溶液を、収穫し、そして12×75mm管に移し、そしてそれらの管を、¹²⁵Ｉ-PD GF-BB結合のレベルを測定するためにガンマ線カウンタ内でカウントした。IgG／ PDGFr−ベータに結合し、そして¹²⁵Ｉ-PDGF-BB結合を遮断する抗体を、培養基に対する、¹²⁵Ｉ-PDGF-BB結合のレベルにおける減少により検出した。 IgG／PDGFr−ベータ中和抗体について陽性であると決定された培地のプールを、その中和抗体を産生するハイブリドーマを含む個々のウェルを同定するため先に記載したものと同様の検定形式を使用して再スクリーニングした。 ELISA又は¹²⁵Ｉ-PDGF-BB結合の中和のいずれかにより陽性であった培養ウェルを、その後、ヒト皮膚繊維芽細胞に対するPDGF−ベータ・レセプタの能力についてダウン−レギュレーション検定形式（Hart et al.，J.Biol.Chem． 262：107 80-10785，1987）において、検定した。37℃におけるPDGF−ベータ・レセプタへのPDGF-BBの結合は、その細胞表面からのレセプタのインターナリゼーション（i nternalization）、及び細胞−表面レセプタの数におけるその後の減少、ダウン −レギュレーションといわれる現象を導く。繊維芽細胞を、ウェル当り10,000細胞において96−ウェル培養皿内にプレートし、そして使用に先立ち１−２日間、培養基中で維持した。１セットのウェルに、その細胞に対し、100ng／mlの最終濃度においてPDGF-BBを添加した。これらの細胞を、37℃において1.5時間インキュベートした。培養基を細胞から除去し、そして細胞を、ホスフェート・バッファー生理食塩水（PBS）で洗浄した。次に、ハイブリドーマ細胞からのテスト培養基を、上記PDGF-BB処理を受けたか又は、未処理のままにされたかのいずれかの細胞の２連ウェルに添加した。その後これらの細胞を、４℃において２時間インキュベートし、次にPBS で洗浄した。100μｌ／ウェルの¹²⁵Ｉ−ウサギ抗マウスIgG（100,000cpm／ウェル）を、これらのウェルに添加し、そしてそれらの細胞を、４℃においてさらに 1.5時間インキュベートした。これらの細胞を、PBSで洗浄し、次に、室温において５分間、100μｌ／ウェルの抽出バッファー（表Ｉ）と共にインキュベートした。抽出物を、収穫し、12×75mm管に移し、そして¹²⁵Ｉ−ウサギ抗−マウスIgG 結合のレベルを測定するためにガンマ線カウンタ内でカウントした。細胞−表面 PDGF−ベータ・レセプタを認識することができるハイブリドーマ培養上清中に抗体が存在する場合、そのレセプタをダウン−レギュレートするためにPDGF-BBにより処理された細胞への、¹²⁵Ｉ−ウサギ抗−マウスIgG結合のレベルにおける減少が存在するであろう。いくつかのハイブリドーマを、PDGF−ベータ・レセプタに対する抗体を作るような融合物162から同定した。同定されたハイブリドーマを、モノクローナル抗体を作る個々のクローンを得るために限界希釈法により２回クローン化した。これらのクローンを、先に記載した検定法により抗体産生についてスクリーニングした。162.62と名付けられた１つのハイブリドーマを、さらなる特徴付けのために選択した。実施例３抗−PDGFベータ・レセプタ抗体を産生するハイブリドーマの同定及び特徴付け細胞融合物163からのハイブリドーマを、組合せELISA／PDGF結合競合検定によりPDGF−ベータ・レセプタに対する抗体の産生についてテストした。これらの検定を、96−ウェル・マイクロタイター・プレート内で行った。これらのプレートを、37℃において２時間、ELISA Aバッファー中の２μｇ／mlの、ヤギ抗−ヒトI gGにより最初にコートした。これらのプレートを、ELISA Cバッファーで洗浄し、次にELISA Bバッファーで37℃において１1/2時間インキュベートして、非特異的結合部位を遮断した。これらのプレートを、ELISA Cバッファーで洗浄し、次に直ちに使用するか又は使用まで４℃において１−４日間放置するかのいずれかとした。この検定の時に、これらのプレートを、ELISA Cバッファーで１回洗浄し、次に、結合培地中25ng／mlに希釈されたテトラマーIgG／PDGFr−ベータと共に37℃において１1/2時間インキュベートした。次にこれらのプレートを、ELISA Cバッファーで洗浄して、未結合IgG／PDGFr−ベータを除去した。ハイブリドーマ上清を、２群のウェル内にプールし、そして100μｌのプールされたサンプルを、マイクロタイター・ウェルのそれぞれに添加した。これらのプレートを、37℃において１時間インキュベートし、次に結合培地で洗浄した。それらのウェルに、結合培地により１：1000希釈されたホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗−マウスIgG（Tago，Burlingame，CA）を添加した。これらのウェルを、37℃において１時間インキュベートし、次に結合培地で洗浄して、未結合HRP−結合ヤギ抗−マウスIgGで洗浄した。次に、¹²⁵Ｉ-PDGF-BB 、約26,000cpm／ウェルを、37℃においてさらに１時間、それらのウェルに添加した。これらのウェルを、結合培地で洗浄し、次にELISAの顕出のために、反応バッファーと共にインキュベートした。反応を、100μｌ／ウェルの１Ｎ H₂SO₄の添加により停止させ、そしてそれらのプレートを、フィルターを使用してDynatech ELISAプレート・リーダー内で読んで、490nmにおける吸光度をモニターした。次に、これらのウェルの内容物を、12×75mm試験管に移し、そしてそれらのサンプルをガンマ・カウンタ内でカウントして、 ¹²⁵Ｉ-PDGF-BB結合のレベルを測定した。先に記載した検定は、ELISAにより、並びにテトラマーIgG／PDGFr−ベータの¹ ²⁵ Ｉ-PDGF-BBの結合を遮断する能力により、IgG／PDGFr−ベータに対する抗体を産生するハイブリドーマ・カルチャーを同定した。陽性であったこれらのプールされたサンプルを、その後、IgG／PDGFr−ベータに対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を含む個々のカルチャー・ウェルを測定するために先に記載したようなものと同じプロトコールを使用して再検定した。 IgG／PDGFr−ベータへの結合について陽性であると判明した個々のウェルを、その後、ヒト皮膚繊維芽細胞への¹²⁵Ｉ-PDGF-BB結合を中和する能力について検定した。ヒト皮膚繊維芽細胞を、ウェル当り約20,000細胞において24−ウェル培養皿内にプレートした。培養基を、細胞から除去し、そしてハイブリドーマ・テスト培養基、ウェル当り0.5mlを、２連ウェルに添加した。陰性対照として、NS −１培地だけを、１セットのウェルに添加した。第２セットのウェルに、NS−１培地中20ng／mlの最終濃度においてPDGF-BBを添加して、 ¹²⁵Ｉ-PDGF-BBの非特異的結合について測定した。これらの細胞を、４℃において１時間インキュベートし、次に¹²⁵Ｉ-PDGF-BB、100μｌ／ウェル（約26,000cpm）を各ウェルに添加した。これらの細胞を、４℃においてさらに１時間インキュベートし、PBSで洗浄し、次に抽出バッファーと共にインキュベートした。抽出物を、12×75mm管に収穫し、そしてガンマ・カウンタ内でカウントした。NS−１培地サンプルに対して¹²⁵Ｉ-PDGF-BB結合における減少を引き起こしたテスト・サンプルを、ヒト皮膚繊維芽細胞の単層上の生来のPDGF−ベータ・レセプタへのPDGF-BB結合を阻害する能力について陽性として検定した。 PDGF−ベータ・レセプタに対する抗体を作るであろういくつかのハイブリドーマを、融合物163から同定した。同定されたハイブリドーマを、限界希釈法により２回クローン化して、モノクローナル抗体を作る個々のクローンを得た。これらのクローンを、先に記載した検定法により抗体産生についてスクリーニングした。163.31と名付けられた１のハイブリドーマを、さらなる特徴付けのために選択した。実施例４抗−PDGFベータ・レセプタMAbs 162.62及び163.31の特徴付け MAbs 162.62と163.31を、テトラマーIgG／PDGFr−ベータ又はヒト皮膚繊維芽細胞上のPDGF−ベータ・レセプタのいずれかへの¹²⁵Ｉ-PDGF-BBの結合を遮断する能力について比較した。IgG／PDGFr−ベータへの¹²⁵Ｉ-PDGF-BB結合の中和を、融合物163の最初のスクリーニングについて本質的に先に記載したように行った。ならし培養基を添加する代わりに、NS−１培地中に希釈された既知量の抗体を、¹²⁵Ｉ-PDGF-BBと同時に、IgG／PDGFr−ベータ・コート・ウェルに添加した。NS−１培地単独を、陰性対照として使用した。PDGF-BB、500ng/mlの、NS-１培地への添加を、 ¹²⁵Ｉ-PDGF-BBによる非特異的結合のレベルを測定するために使用した。これらのウェルを、４℃において２1/2時間インキュベートし、次にP BSで洗浄した。100μｌの0.1Ｍクエン酸塩pH2.5を、各ウェルに添加して、結合された¹²⁵Ｉ-PDGF-BBを除去し、それらのサンプルを、12×75mm管に移し、そしてそれらの管を次にガンマ・カウンタ内でカウントした。ヒト皮膚繊維芽細胞への結合を検定するために、繊維芽細胞を、24−ウェル培養皿内で約20,000細胞／ウェルにおいてプレートした。これらの細胞を、プレーティング後２−７日間、検定のために使用した。抗体を、表II中に示す濃度まで結合培地中で希釈し、次に¹²⁵Ｉ-PDGF-BBと混合し、そして、0.5mlアリコートを、繊維芽細胞の２連ウェルに添加した。結合培地単独を、陰性対照として使用し、そして500ng／mlのPDGF-BBの添加を、¹²⁵Ｉ-PDGF-BBについての非特異的結合を測定するために使用した。これらの細胞を、４℃において２1/2時間インキュベートし、次に結合培地で洗浄して、未結合リガンドを除去した。次にこれらの細胞を、抽出バッファーと共にインキュベートし、そして抽出物を、収穫し、そしてガンマ・カウンタ内でカウントした。結合試験の結果を、表II中に示す。¹²⁵Ｉ-PDGF-BBについての比cpm結合して表す。500mg／mlの非標識PDGF-BBの添加により測定された非特異的結合は、IgG／P DGFr−ベータ・ウェルについて260cpm、そしてヒト皮膚繊維芽細胞について105c pmであり、そして提示されたデータから差し引きされた。％CB＝パーセント対照結合これらの結果は、MAb 162.62と163.31の両方が、IgG／PDGFr−ベータへのPDGF -BB結合の有効な阻害剤であることを立証する。これに対し、MAb 162.62は、ヒト皮膚繊維芽細胞へのPDGF-BB結合について、MAb 163.31よりも有効な阻害剤である。 MAb 162.62は、ヒト皮膚繊維芽細胞の単層上のレセプタに結合した¹²⁵Ｉ-PDGF を置換する能力についても分析された。¹²⁵Ｉ-PDGF-BBを、24−ウェル培養プレート内でヒト皮膚繊維芽細胞の単層と最初にインキュベートした。これらの細胞を、PBSで洗浄し、次に引き続き、MAb 162.62、５μｇ／ml、又は結合培地単独のいずれかと４℃において１時間、インキュベートした。これらの細胞を、洗浄し、抽出バッファーと共にインキュベートし、そして抽出物を、ガンマ・カウンタ内でカウントして、¹²⁵Ｉ-PDGF-BB結合のレベルについて測定した。非特異的結合を測定するために、500ng／mlの非標識PDGF-BBを、その最初のインキュベーション段階の間に添加した。表III中に表す結果は、MAb 162.62の添加が、前結合した¹²⁵Ｉ-PDGF-BBの 47％置換を導いたことを示している。従って、MAb 162.62は、ヒト皮膚繊維芽細胞の表面からレセプタ結合PDGF-BBを置換することができる。 MAb 162.62と163.31についてのサブクラスを、IgG／PDGFr−ベータ・コート・ウェル及びサブクラス特異的２次抗体を使用するELISAにより測定した。MAb 162 .62は、IgG2bイソタイプであることが発見され、一方、MAb 163.31は、IgG1イソタイプであることが発見された。実施例５抗−PDGFアルファ・レセプタ抗体を産生するハイブリドーマの同定及び特徴付け細胞融合物169からのハイブリドーマを、組合せELISA／PDGF結合競合検定により、PDGF−アルファ・レセプタに対する抗体の産生についてテストした。これらの検定を、96−ウェル・マイクロタイター・プレート内で行った。これらのプレートを、４℃において一夜、ELISA Aバッファー中のヤギ抗−ヒトIgG、２μｇ／ mlにより最初にコートした。これらのプレートを、ELISA Cバッファーで洗浄し、次にELISA Bバッファーと共にインキュベートして、非特異的部位を遮断した。これらのプレートを、ELISA Cバッファーで洗浄し、次に、結合培地中25ng／mlに希釈したテトラマーIgG／PDGFr−アルファと共に４℃において一夜インキュベートした。次に、これらのプレートを、ELISA Cバッファーで洗浄して、未結合IgG／PDGFrを除去した。ハイブリドーマ上清を、２群においてプールし、そして75μｌのプールされたサンプルを、マイクロタイター・ウェルのそれぞれに添加した。これらのプレートを、37℃において１時間インキュベートし、次にELISA Cバッファーで洗浄した。これらのウェルに、結合培地により１：1000希釈したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗−マウスIgG（Tago）を添加した。これらのウェルを、37℃において１時間インキュベートし、次にELISA Cバッファーで洗浄して、未結合抗体を除去した。次に、¹²⁵Ｉ-PDGF-AA、約25,000cpm／ウェルを、37 ℃においてさらに１時間それらのウェルに添加した。これらのウェルを、結合培地で洗浄し、次にELISAの顕色のために反応バッファーと共にインキュベートした。反応を、100μｌ／ウェルの１ＮＨ₂SO₄の添加により停止させ、そしてそれらのプレートを、フィルターを使用してDynatech ELISAプレート・リーダー内で読んで、490nmにおける吸光度をモニターした。次に、それらのウェルの内容物を、12×75mm試験管に移し、そしてそれらのサンプルを、ガンマ・カウンタ内でカウントして、¹²⁵Ｉ-PDGF-AA結合のレベルを測定した。この検定は、ELISAによりIgG／PDGFr−アルファに対する抗体を産生するハイブリドーマ・カルチャーを同定し、そしてテトラマーIgG／PDGFr−アルファへの¹²⁵ Ｉ-PDGF-AAの結合を遮断することができた抗体についてモニターした。この最初の検定において陽性であった上記のプールされた細胞を、先に記載したものと同じプロトコールを使用して再検定して、IgG／PDGFr−アルファのための抗体を産生するハイブリドーマ細胞を含む個々の培養ウェルを決定した。いくつかのウェルが、IgG／PDGFr−アルファに対して向けられた抗体の存在について同定された。これらの中で、２つ、169.14と169.31が、さらなる分析のために選択された。これらのウェルからのハイブリドーマを、PDGF−アルファ・レセプタに対するモノクローナル抗体を産生する単一クローンを得るために限界希釈法により２回クローン化した。これらのクローンを、本質的に先に記載したように、組合せELISA／¹ ²⁵ Ｉ-PDGF-AA結合競合検定を使用してスクリーニングした。 MAb 169.14と169.31が哺乳動物細胞の単層上の生来のPDGF−アルファ・レセプタを認識するかどうかを確認するために、上記２抗体を、アルファＴ−７細胞への¹²⁵Ｉ-PDGF-AA結合を遮断する能力について分析した。これらの細胞は、自然にはPDGF−アルファ・レセプタを発現しないが、完全長PDGF−アルファ・レセプタをコーディングしているcDNAによりトランスフェクトされているイヌ腎臓上皮細胞である（米国特許出願逐次番号第07／355,018号；PCT公開WO 90／14425）。これらの細胞は、細胞当り約100,000の組換え体レセプタを発現する。アルファＴ−７細胞を、約95％の集密まで96−ウェル・プレート内で培養した。この培養基を、除去し、そしてMAb 169.14と169.31の希釈物を、それらの細胞に添加した。対照は、NS−１培地、及び¹²⁵Ｉ-PDGF-AAについての非特異的結合成分を測定するために500ng/mlのPDGF-BBを含むNS−１培地であった。各ウェルに、100μｌのテスト・サンプル、加えて、10μｌの¹²⁵Ｉ-PDGF-AA（ウェル当り約22,000cpm ）を添加した。これらの細胞を、４℃において２時間、上記サンプルと共にインキュベートし、PBSで洗浄し、次に100μｌ／ウェルの抽出バッファーにより抽出した。抽出物を、収穫し、そしてガンマ・カウンタ内でカウントした。結果を、表IV 中に示す。これらの結果は、これらの２つのMAbsが、IgG／PDGFr−アルファに加えて哺乳動物細胞内の膜−結合PDGF−アルファ・レセプタを認識することを立証している。 MAb 169.14と169.31についてのサブクラスを、IgG／PDGFr−アルファ・コート・ウェル及びサブクラス特異的２次抗体を使用したELISAにより測定した。MAb 1 69.14と169.31の両方は、 IgG2aイソタイプについて陽性と検定された。実施例６抗−PDGFレセプタMAbの結合特異性 PDGF−レセプタ・サブユニット結合特異性を証明するために、MA b 162.62，163.31，169.14及び169.31を、クローン８細胞及びアルファ１−10細胞への結合について分析した。クローン８細胞は、完全長ヒトPDGF−ベータ・レセプタをコードしている遺伝子によりトランスフェクトされているBHK 570（ATC C CRL 10314）細胞である（Gronwald et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：343 5-3439，1988）。これらの細胞は、細胞当り約500,000のヒトPDGF−ベータ・レセプタを発現する。アルファ１−10細胞は、完全長ヒトPDGF−アルファ・レセプタをコードしているcDNAによりトランスフェクトされているBHK 570細胞である（米国特許出願逐次番号第07／355,018号；PCT公開WO 90／14425）。これらの細胞は、細胞当り約1,000,000のヒトPDGF−アルファ・レセプタを発現する。PDGF −アルファ又はベータ・レセプタのいずれかについての結合特異性を証明するために、抗−PDGFレセプタMAbを使用した細胞表面結合試験を、これらの２細胞系を用いて行った。上記クローン８とアルファ１−10細胞の両方を、24−ウェル・プレート内で集密まで培養した。PDGF-BB（200ng／ml）を、PDGFレセプタのダウン・レギュレーションを刺激するために、上記細胞の1/2に添加し、そして媒質対照（10mm酢酸、0.25％ウサギ血清アルブミン）を、他の半分に添加した。これらの細胞を、37 ℃において１−２時間インキュベートし、次に４℃に冷却されたPBSで洗浄した。結合培地中５μｇ／mlに希釈した精製MAb 162.62，163.31，169.14、及び169. 31を、PDGF-BB処理と非処理対照細胞の３連ウェルに添加した。これらの細胞を、氷上で約２時間インキュベートし、次に冷PBSで洗浄して、未結合抗体を除去した。次に、テスト・ウェルを、約400,000cpm／ウェルまで結合培地中で希釈した¹²⁵Ｉ−標識ウサギ抗−マウスIgGと共に30分間氷上でインキュベートした。これらのウェルを、PBSで洗浄し、次に抽出バッファーと共にインキュベートした。抽出物を収穫し、そしてガンマ・カウンタ内でカウントした。図１中に示す結果は、MAb 162.62と163.31だけが、非処理対照と比較したときに PDGF-BB処理クローン８細胞への結合における有意な減少により立証されるように、PDGF−ベータ・レセプタに特異的に結合することを、立証した。MAb 169.14 による高レベルの結合は、この抗体による上昇レベルの非特異的結合による。なぜなら、PDGF-BB処理細胞への¹²⁵Ｉ−ウサギ抗−マウスIgG結合において有意な減少が存在しないからである。これに対して、MAb 169.14と169.31だけが、アルファ１−10細胞への特異的結合により立証されるように、PDGF−アルファ・レセプタへの結合を示した（図２）。その抗体が細胞表面PDGFレセプタに結合する能力のために、これらの結果は、これらの抗体がPDGFレセプタ上の細胞外エピトープを認識することを確信させた。実施例７ヒト皮膚繊維芽細胞に対するPDGF有糸分裂活性の中和ヒト皮膚繊維芽細胞を、24−ウェル培養皿内でウェル当り約20,000細胞においてプレートし、そして２％胎児ウシ血清を含むDMEM（GIBCO BRL）中、静止（qui escent）まで増殖させた。これらの細胞を、PDGF-AA，AB又はBBのいずれかで剌激した。標準曲線を、それらの細胞について、５，1.25，0.31及び０ng/mlの最終濃度の濃度を用いて走らせた。ストックPDGF希釈を、0.25％ウサギ血清アルブミンを含む10mM酢酸により行い、そして50μｌの保存サンプル、又は媒質単独を、培養ウェルに添加して、所望の最終濃度を得た。３つのPDGFリガンドのそれぞれの有糸分裂活性を中和する、MAb 162.62と169.14の能力を分析するために、５ ng／mlのPDGFを、20μｇ／ml（細胞に対する最終濃度）のMAb 162.62と169.14単独、又は20μｇ／mlの上記２抗体のプールと一緒にウェルに添加した。これらの細胞を、37℃において約20時間上記テスト・サンプルと共にインキュベートした。培地を吸収し、次に５％胎児ウシ血清を含む１mlのDMEMにより置換し、そして１μCi／mlの〔³ Ｈ〕チミジンを補った。これらの細胞を、37℃において４時間インキュベートし、PBSで洗浄し、次にトリプシンにより収穫し、そしてWallac（Turku，Finlan d）Betaplateベータ・カウンタ内で〔³Ｈ〕チミジンの取込みについてカウントした。図３Ａ中に表す結果は、PDGF-AA有糸分裂活性がMAb 169.14及びそのプールにより中和されたが、MAb 162.62によっては中和されなかったということを立証している。PDGF-AB有糸分裂誘発活性（mitogenic activity）は、MAb 162.62 により約80％阻害され、そしてMAb 169.14又はその抗体プールにより92％以上阻害された（図３Ｂ）。これに対し、PDGF-BBは、MAb 169.14によりほんのわずかに阻害されたが、MAb 162.62により約80％、そしてその抗体プールにより92％以上阻害された（図３Ｃ）。これらの結果は、PDGF-AAがPDGF−アルファ／アルファ・レセプタ・ダイマーに結合し、PDGF-ABがPDGF−アルファ／アルファ及び−アルファ／ベータ・レセプタ・ダイマーに結合し、そしてPDGF-BBが３つのPDGFレセプタ・ダイマーのすべて；−アルファ／アルファ、−アルファ／ベータ及び−ベ−タ／ベータに結合することについて記載するPDGFリガンド結合のモデルと矛盾しない（Hart et al .，J.Invest.Derm．94：535-575，1990中にレビューされている）。従って、MAb 169.14がアルファ・レセプタに結合し、そしてこれに結合するPDGFを中和する場合には、PDGF-AA及びABの有糸分裂活性の本質的に100％を中和すると予想されるであろう。なぜなら、アルファ・レセプタ結合がこれらのリガンドの両方について必要とされるからである。このモデルは、先に記載した結果と矛盾しない。MAb 162.62によるPDGF−ベータ・レセプタへの結合及びその中和は、次に、PD GF-AAと矛盾しないレベルまでPDGF-AB及びBBの有糸分裂誘発性の量を限定すると予想されるであろう。なぜなら、AB及びBBは、アルファ／アルファ・ダイマーに結合することができるだけであるからである。再び、これは、先に記載した研究の発見と矛盾しない。簡単に言えば、抗−PDGF−レセプタMAb 162.62及び169.14は、上記３PDGFリガンドによるPDGFレセプタ結合に関する最近の仮説と矛盾しないやり方でPDGFのこの３形態の有糸分裂活性を阻害することができる。さらに、結合した２抗体の使用は、ヒト皮膚繊維芽細胞に対するPDGF有糸分裂活性の本質的に100％を阻害することができる。実施例８ヒヒ平滑筋細胞に対するPDGF有糸分裂誘発活性の中和抗−PDGFレセプタMAbを、ヒヒ平滑筋細胞上でPDGF−刺激有糸分裂誘発活性を中和する能力について分析した。ヒヒ平滑筋細胞上で行ったすべての有糸分裂誘発検定を、培養中３〜７継代の間の細胞の１次カルチャー上で行った。最初のカルチャーを、大動脈組織体外移植片を生長物から樹立した。ヒヒ平滑筋細胞を、 24−ウェル培養皿内へ、10％胎児ウシ血清を補ったDMEM中でウェル当り約30,000 細胞においてプレートした。使用２日前に、その培養基を除去し、そして１mlの Mito Media（表Ｉ）を、各ウェルに添加して、それらの細胞が静止することを許容した。本実験時に、細胞を、PDGF-AA，AB又はBBのいずれかにより刺激した。標準曲線を、図４−６中に示す最終濃度を使用して上記３リガンドのそれぞれについて走らせた。20倍保存溶液を、0.25％アルブミンを含む10mM酢酸中の希釈によりPDGF濃度のそれぞれについて行い、そして50μｌのPDGF又は希釈媒質単独を、それらの培養ウェルに添加した。上記抗体中和試験のために、10 ，２及び1.25ng/mlの最終PDGF濃度を、それぞれ、PDGF-AA，AB及びBBのために使用した。MAb 163.31と169.31を、25μｇ／mlの最終濃度において、PDGF含有ウェルに添加した。この２抗体のプールについて、細胞上の抗体の最終濃度は、全体として25μｇ／ml、又は、MAbのそれぞれについて、12.5μｇ／mlであった。これらの細胞を、37℃において20〜24時間の間、インキュベートした。PDGF-AAとA B試験のために、50μｌの、〔³Ｈ〕チミジンの40μCi／ml溶液を、各ウェルに添加した。PDGF-BB試験のために、培地を吸収し、次に、５％胎児ウシ血清を含む0 .5mlのDMEMにより置換し、そして２μCi／mlの〔³Ｈ〕チミジンを補った。これらの細胞を、37℃において２〜４時間の間、インキュベートし、PBSで洗浄し、次にトリプシンにより収穫し、そしてWallac Betaplateベータ・アウンタ内での〔³Ｈ〕チミジンの取込みについてカウントした。図４中に示すように、PDGF-AA 有糸分裂誘発活性は、MAb 169.31及びその抗体プールにより100％中和されたが、MAb 163.31により中和されなかった。PDGF-AB有糸分裂誘発活性は、個々のMAb とその抗体プールの両方により完全に阻害された（図５）。MAbの存在中〔³Ｈ〕チミジンの取込みレベルが、媒質対照だけの添加により得られたレベルよりも下であったということに留意すべきである。これは、PDGF-AAプーレート上のMAb 1 69.31によっても同様に見られた（図４）。PDGF-BB剌激細胞について、MAb 169. 31とMAb 163.31は、個々に、50％未満の中和を支え、一方、この２抗体のプールは、その有糸分裂活性の約75％を中和することができた（図６）。ヒヒ平滑筋細胞上のPDGFの有糸分裂誘発応答を中和する、これらの抗体の阻害能力をさらに証明するために、２つの抗-PDGF-アルファ・レセプタMAb 169.14と169.31を、PDGF-AA有糸分裂誘発活性を阻害する能力について分析した。ヒヒ平滑筋細胞を、本質的に先に記載したようにプレートし、そして処理した。１セットのウェルに、PDGF-AA有糸分裂誘発活性の標準曲線を作るためにPDGF-AAの増加濃度を添加した（図７Ａ）。このPDGF-AAサンプルは、10ng／mlから0.31ng／mlまでのレンジにあった。第２セットのウェルに、PDGF -AAの標準希釈物を、添加して、10ng／mlの最終濃度を得た。MAb 169.14と169.3 1の減少濃度を、次に、それらのウェルに添加して、〔³Ｈ〕チミジンのレベルにおける減少により測定されるような、MAbのそれぞれについての中和能力について測定した（図７Ｂ）。この発見は、８ng／mlの抗体においても、PDGF-AAの10n g／ml溶液の90％を上廻る阻害が存在した。実施例９ヒヒ平滑筋細胞に対するヒヒ血清有糸分裂誘発活性の中和抗−PDGFレセプタMAbを、ヒヒ平滑筋細胞に対するヒヒ血清の有糸分裂誘発能力を中和するその能力について分析した。ヒヒ平滑筋細胞を、24−ウェル培養血内に、10％胎児ウシ血清を補ったDMEM中、ウェル当り約30,000細胞においてプレートした。使用３日前に、その培養基を除去し、そして１mlのMito Media（表１）を、各ウェルに添加して、それらの細胞が静止するようになることを許容した。この実験の時に、それらの細胞を、さまざまな量のヒヒ血清により刺激した。標準曲線を、上記血清サンプルについて作った。20倍の保存溶液を、その血清濃度のそれぞれについて調製し、そして50μｌの上記血清希釈物又は希釈媒質、PB Sを、それらの培養ウェルに添加して、2.5％〜0.15％のレンジにある細胞上の最終血清濃度を得た。MAb 169.31と163.31を、ヒヒ血清有糸分裂誘発活性を中和する能力について分析した。2.5％の最終血清濃度を、上記抗体中和試験のために使用した。MAb 169.31と163.31を、25μｇ／mlの最終濃度において上記血清含有ウェルに添加した。これら２抗体のプールについて、それらの細胞上の抗体の最終濃度は、全体について25μｇ／ml、又はMAbのそれぞれについて12.5μｇ／mlであった。これらの細胞を、37℃において約20時間、上記血清サンプルと共にインキュベートした。この時、培地を細胞から吸引し、次に５％胎児ウシ血清を含む0.5mlのDMEMにより置換し、そして２μCi／mlの〔³Ｈ〕チミジンを補った。これらの細胞を、37℃において約３時間インキュベートし、PBSで洗浄し、次にトリプシンにより収穫し、そしてWallac Betaplateベーター・カウンタ内で〔³Ｈ〕チミジンの取込みについてカウントした。表８に表す結果は、ヒヒ血清有糸分裂誘発活性が、MAb 169.31により最小に中和されたが、MAb 163. 31により50％を上廻る程中和されたことを立証している。これらの２抗体のプールは、その血清有糸分裂誘発活性の75％以上を阻害した。これらの結果は、その有糸分裂誘発活性の大部分が、抗−PDGFレセプタ・モノクロナール抗体の使用を通して阻害されることができるということを立証した。本発明者らによる試験は、ヒヒ血小板内のPDGFの優位形態がPDGF-BBであることを示している。ヒヒ平滑筋細胞上のPDGFベータ・レセプタの大きなパーセンテージのために、抗−PDGF−ベータ・レセプタMAbが、ヒヒ血清に向っての最大の阻害活性をもつであろう。実施例10 ヒヒ血清有糸分裂誘発活性に対する循環MAb 169.31の効果ヒヒ内への25mg静脈内ボーラス注射の投与後のMAb 169.31の循環レベルをモニターするための試験を行った。血清を、抗体注射後さまざまな間隔において得て、そして循環抗体のレベルを、ELISAにより測定した。ヒツジ抗−マウスIgGを、２μｇ／mlの濃度においてELISAバッファ−Ａ中、96−ウェル・マイクロタイター皿に添加した。これらのプレートを４ ℃において一夜インキュベートし、ELISA Cバッファーで洗浄し、次にELISA Bバッファーと共にインキュベートして、非特異的結合部位を遮断した。これらのプレートを、ELISA Cバッファーで洗浄し、次に100μｌ／ウェルのテスト・サンプルと共にインキュベートした。モノクロナール抗体169.31を含むヒヒ血漿又は血清を、ELISA Bバッファーにより１：1000希釈し、そしてそれらのテスト・ウェルに添加した。対照ヒヒ血漿又は血清中にスパイクされた精製MAb 169.31から成る標準を、そのテスト血漿／血清サンプルと同様に、１：1000希釈し、次にそれらのテスト・ウェルに添加した。標準は、テスト・ウェル内で100ng／ml〜1.56n g／mlの最終濃度のレンジ内にあった。これらの血漿／血清サンプルを、37℃において１〜２時間ウェル内でインキュベートし、それらのウェルをELISA Cバッファーで洗浄し、次にホースラディッシュ・ペルオキシダーゼと結合したヤギ抗 −マウスIgGを添加した。これらのウェルを、37℃において１時間インキュベートし、ELISA Cバッファーで洗浄し、次に反応バッファーと共にインキュベートした。この反応を、ＩＮ H₂SO₄の添加により停止させ、そしてこれらのプレートを、490nmにおいてELISA プレート・リーダー内で読んださらに、注射１時間及び18時間後に得られた血清サンプルの比有糸分裂誘能力を、測定した。この時に、ヒヒ内の抗体の循環レベルは、それぞれ、46μｇ／ml と21μｇ／mlであると測定された。次にこの１時間と18時間の血清サンプルを、比有糸分裂誘発活性について対照血清サンプルと比較した。血清サンプルの希釈物を、先に提示したヒヒ血清試験において本質的に記載したように培養されたヒヒ平滑筋細胞に添加した。平滑筋細胞上の最終血清濃度は、1.25％〜0.15％のレンジにあった。ヒヒ平滑筋細胞を、平均として、〔³Ｈ〕チミジンの取込みのレベルについてモニターして、本質的に先に記載したように、有糸分裂誘発活性を測定した。表９に表す結果は、対照サンプルと比べて、上記１時間と18時間血清サンプルの両方についてその比有糸分裂誘発能力において有意な減少があり、その18時間サンプルが、対照と１時間サンプルとの間に有糸分裂誘発活性において中間にあるということを示している。18時間血清サンプル中に存在したMAb 169.31による中和のレベルは、この抗体がエクスビボにおいて対照ヒヒ血清に添加されるときに得られた中和のレベルと矛盾しない（図８）。従って、これらの結果は、ヒヒ血液中の少なくとも18時間にわたり循環するMAb 169.31が、ヒヒ平滑筋細胞上、ヒヒ有糸分裂誘発活性を中和するためのその生物学的能力の本質的に全てを保持しているということを立証している。実施例11 ヒヒ大動脈体外移植片からの細胞生長物の中和抗−PDGFレセプタ・モノクロナール抗体を、ヒヒ大動脈組織の体外移植片からの平滑筋細胞の外への移動の速度を減少させる能力についてテストした。ヒヒの胸部大動脈の内部媒質を、10mM Hepesを含むDMEM培養基中で切開した。この大動脈組織を、１平方mmセクションに分け、そしてその体外移植片を、組織培養フラスコ上に置いた。その体外移植片がそのフラスコに接着するための時間を与える 10分間のインキュベーション後、培養基、DMEMプラス６μｇ／mlインシュリン、５μｇ／mlトランスフェリン及び10mM Hepesを、その体外移植片に添加し、そしてそれらのサンプルを、５％CO₂と共に 37℃においてインキュベートした。全部で15体外移植片を、各培養フラスコ内に設置した。体外移植片の樹立後さまざまな時間に、それらの体外移植片を高倍率の顕微鏡下で検査して、その培養皿上の可視細胞生長をもった体外移植片の数をカウントした。体外移植片は、少なくとも１の細胞がその培養皿表面上でその体外移植片組織から外に移動する場合に陽性としてカウントされた。体外移植片は、少なくとも７日間続いた。実験番号１において、体外移植片を、以下のテスト・サンプルを含むインシュリン及びトランスフェリンを補ったDMEM培養基中で培養した：１）50μｇ／mlにおける抗−PDGFアルファ・レセプタMAb（169.31）；２）50μｇ／mlにおける抗−PDGFベータ・レセプタMAb（163.31）；又は３）DME M培地単独（対照）。実験番号２においては、抽出物を、DMEMプラス、インシュリン及びトランスフェリン、並びに１）各25μｇ／mlにおける抗−PDGFアルファとベータ・レセプタMAb（169.31と163.31）のプール；又は２）DMEM培地単独（対照）のいずれかの中で培養した。各テスト条件について細胞生長について陽性な体外移植片の平均パーセンテージ＋／−SEMとして表した結果（表Ｖ）は、個々の、そしてプールにおける抗−P DGFレセプタ・モノクロナール抗体が、４及び７日目において測定された時ヒヒ大動脈体外移植片からの平滑筋細胞生長のレベルを減少させることができるということを立証している。これらの発見は、これらの抗体が、現存血管組織を通して脈管内膜過形成の部位へ向って細胞が移動するのに必要とされるであろうような、固体マトリックスを通しての細胞転移に必要な過程を阻害するとができるということを示している。実施例12 抗−PDGFレセプタ・モンクロナール抗体の遅い添加によるヒト皮膚繊維芽細胞上の、PDGF有糸分裂誘発活性の中和ヒト皮膚繊維芽細胞を、12−ウェル培養皿内でウエル当り約20,000細胞においてプレートし、そして２％胎児ウシ血清を含むDMEM中に静止まで増殖させた。これらの細胞を、PDGF-AA，AB又はBBのいずれかにより剌激した。PDGFリガンドのそれぞれの増加濃度を、細胞に添加して、上記３つのPDGFイソ形態について有糸分裂誘発能力の標準曲線を作った。標準のために使用した最終PDGF濃度は、５， 2.5，1.25，0.62，0.31，0.15及び0.0ng／mlであった。PDGFの50倍保存溶液を、 0.25％ウサギ血清アルブミンを含む10mM酢酸中で調製した。25μｌの各保存溶液を、３連テスト・ウェルに添加した。 MAb 162.62と169.14による中和活性を見るために、繊維芽細胞を含むウェルを、５ng／mlのPDGF、最終濃度をもってインキュベートした。PDGFサンプルの添加後のさまざまな時間間隔（１，２，４，６及び８時間）において、MAb 162.62とMA b 169.14のプールされたサンプル、各MAbについて25μｇ／mlの最終濃度を、５n g／mlのPDGFにより処理した。PDGFサンプルの添加９時間後に、１％胎児ウシ血清を含むDMEM中20μCi／mlの、5Oμｌの〔³Ｈ〕チミジンを、各ウェルに添加した。これらのサンプルを、37℃においてさらに13−15時間インキュベートした。これらの細胞を、PBSで洗浄し、次にトリプシンにより収穫し、そしてBetaプレート・カウンタ内でカウントした。表VI中に表す結果を、３連測定についての、取込み〔³Ｈ〕チミジンの平均cpm ，＋／−標準偏差として与えた。これらのデータは、PDGF標準曲線と、抗体添加の時間経過の両方のために与えられる。これらの結果は、抗−PDGFレセプタ抗体がPDGFリガンドの添加遅くとも８時間後にそれらの細胞に添加された時にPDGF-A Aについての有糸分裂誘発活性において75％減少が存在したことを立証している。PDGF-ABとBBの両方について、PDGFリガンドの添加の８時間後の抗PDGFレセプタの添加が、PDGF有糸分裂誘発活性において90％以上の減少を引き起こした。これらの試験は、抗−PDGFレセプタ・モノクロナール抗体が、PDGFリガンドの存在後延長された時間において細胞に添加されることができ、そして未だ、PDGF有糸分裂誘発活性に対する有効な中和効果をもつことを証明した。実施例13 抗−PDGFレセプタMAbによるヒト骨肉腫細胞からのレセプタ−結合¹²⁵I-PDGFの置換４つのMAb 162.62，163.31，169.14及び169.31を、ヒト骨肉腫細胞（ATCC CRL 1427）の単層上のPDGFレセプタに結合した¹²⁵I-PDGF-AA及び¹²⁵I- PDGF-BBを置換する能力について分析した。24−ウェル培養プレート内で増殖させたヒト骨肉腫細胞の単層を、結合培地中で希釈した¹²⁵I-PDGF-AA又は¹²⁵I-PDG F-BBと共に４℃において１時間インキュベートした。これらの細胞を、PBSで洗浄し、次に１mlの、いずれかの結合培地単独、MAb 169.14，169.31，162.62，16 3.31，又は169.31と162.62のプールを、各ウェルに添加した。これらの抗体を、結合培地中で希釈し、そして５μｇ／mlの濃度、１mg／ウェルにおいてそれらの細胞に添加した。これらの細胞を、４℃において１時間洗浄し、次にPBSで洗浄し、抽出バッファーと共にインキュベートし、次に収穫し、そしてガンマ・カウンタ内でカウントして、¹²⁵I-PDGF結合のレベルをモニターした。100 ng／mlのP DGF-BBを、¹²⁵I-PDGF-AA及び¹²⁵I-PDGF-BBを含む３連ウェルに添加して、非特異的結合のレベルを測定した。表VII中に表す結果を、列記したテスト化合物による第２インキュベーション後、¹²⁵I-PDGF-AA及び¹²⁵I-PDGF-BBについての比cpm 結合（標準偏差）として示す。％置換値を、結合培地単独ウェル中で結合したcp mに対して、テストサンプルについての結合したcpmを比較することにより決定した。これらの結果は、抗−PDGFアルファ・レセプタMAb，169.14及び169.31が、前結合した¹²⁵I-PDGF-AAの約63％を置換することができたことを立証している。これに対して、抗−PDGFベータ・レセプタMAb 162.62及び163.31は、本質的に効果を全くもたず、それらのカウントの10％未満を置換する。¹²⁵I-PDGF-BB結合については、MAb 169.14と169.31は、前結合カウントの22−25％の間を置換することができ、一方、MAb 162.62は、それらのカウントの34％を置換することができた。169.31と162.62のプールは、前結合¹²⁵I-PDGF-BBの44％を置換した。これらの結果は、PDGF結合を遮断することができることに加えて、抗−PDGFレセプタMAbが、細胞−表面レセプタから前結合PDG F-AA及びBBを置換することもできることを示している。これまで、本発明を、理解の明確さを目的として説明及び実施例によりいくぶん詳細に説明してきたけれども、特定の変更及び修正が添付のクレームの範囲内で行われることができるということは自明であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ // Ｃ０７Ｋ 16/22 8318−4Ｈ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ケナギー，リチャードディー. アメリカ合衆国，ワシントン 98125，シアトル，ワンハンドレッドサードストリートノースイースト 3018―ビー (72)発明者クロウズ，アレクサンダーダブリュ. アメリカ合衆国，ワシントン 98122，シアトル，フラートンアベニュ 702

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳動物の脈管構造における脈管内膜過形成を阻害する方法であって、その哺乳動物に、有効量の抗−血小板誘導増殖因子（PDGF）レセプタ抗体を投与することを特徴とする方法。２．哺乳動物が霊長類である、請求項１に記載の方法。３．抗体がモノクロナール抗体である、請求項１に記載の方法。４．抗体が抗−PDGF−アルファ・レセプタ抗体である、請求項１に記載の方法。５．抗体が抗−PDGF−ベータ・レセプタ抗体である、請求項１に記載の方法。６．抗体か急性血管損傷に先立って投与される、請求項１に記載の方法。７．損傷が血管再構築によるものである、請求項６に記載の方法。８．血管再構築が血管形成術、動脈内膜切除術、atherectomy（アテローム切除術）、又は血管移植エンプレースメントを含んで成る、請求項７に記載の方法。９．抗体が血管移植のエンプレースメントに先立って又は共に投与される、請求項１に記載の方法。 10．抗体が急性血管損傷の後に投与される、請求項１に記載の方法。 11．損傷が血管再構築によるものである、請求項10に記載の方法。 12．血管再構築が、血管形成術、動脈内膜切除術、atherectomy（アテローム切除術）又は血管移植エンプレースメントを含んで成る、請求項11に記載の方法。 13．抗−PDGFレセプタ抗体のパネルが哺乳動物に投与される、請求項１に記載の方法。 14．抗−PDGFレセプタ抗体のパネルが、PDGFレセプタにPDGFのAA，AB及びBBイソ形態の結合を中和することができる、請求項13に記載の方法。 15．抗−PDGFレセプタ抗体のパネルが、抗−PDGF−アルファ・レセプタ抗体及び抗−PDGF−ベーターレセプタ抗体を含んで成る、請求項13に記載の方法。 16．抗体がヒト化モノクロナール抗体である、請求項１に記載の方法。 17．抗体が一本鎖抗体である、請求項１に記載の方法。 18．抗体がキメラ抗体である、請求項１に記載の方法。 19．抗体がヒト−マウス・キメラ抗体である、請求項15に記載の方法。 20．キメラ抗体がヒト定常ドメインに作用可能な状態で結合されたマウス可変ドメインを含んで成る、請求項19に記載の方法。 21．脈管内膜過形成が血管移植又は移植臓器内で生じる、請求項１に記載の方法。 22．哺乳動物の血管損傷の部位において平滑筋細胞増殖を阻害する方法であって、その損傷部位において血管平滑筋細胞の有糸分裂誘発及び／又は転移を阻害するのに充分な量において抗−増殖因子レセプタ抗体をその哺乳動物に投与することを含んで成り、その抗体が、抗−PDGF−アルファ・レセプタ抗体及び抗−PD GF−ベータ・レセプタ抗体から成る群から選ばれている、ことを特徴とする方法。 23．哺乳動物が霊長類である、請求項21に記載の方法。