DE69233125T2

DE69233125T2 - Inhibitorische immunglobulin-polypeptide gegen den pdgf beta-rezeptor

Info

Publication number: DE69233125T2
Application number: DE69233125T
Authority: DE
Inventors: Vanitha Ramakrishnan; A. Maria ESCOBEDO; J. Larry FRETTO
Original assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1991-12-02
Filing date: 1992-12-01
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2012-12-02
Also published as: RU2194760C2; PL171920B1; EP1350799A3; EP1350799A2; JP2000355548A; JPH07501806A; AU3232893A; CA2124958A1; DE69233125D1; JP3455743B2; EP0619738A4; JP2000355600A; RU94031472A; WO1993010805A1; ATE244571T1; NZ246242A; SG72635A1; CA2124958C; AU672377B2; EP0619738B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Produktion und Verwendung von Immunglobulin-Polypeptiden, die die PDGF-vermittelte Proliferation von Zellen inhibieren, die den humanen β-Blutplättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor-Rezeptor (humanen β-platelet-derived growth factor-Rezeptor (humanen β-PDGF-Rezeptor)) aufweisen.
Hintergrund der Erfindung
Der platelet-derived growth factor (PDGF) ist ein potentes Proliferationsmittel in Zellen von mesenchymalem Ursprung (H. N. Antoniades et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1809–1813; D. F. Bowen-Pope und R. Ross, (1982) J. Biol. Chem., 257: 5161–5171; D. -H. Heldin et al., (1983) J.. Biol. Chem., 258: 10054-10059).
PDGF (M. W. 30 kDa) ist ein über Disulfid-Brücken verbundenes Dimer, das aus zwei homologen Ketten besteht, die mit A oder B bezeichnet werden (A. Johnsson et al., (1982) Biochim. Biophys. Res. Commun., 104: 66–74).
Die Ketten können mit Ketten desselben oder des anderen Typs kombinieren, wodurch die drei Isoformen AA, BB oder AB erhalten werden (C. H. Heldin et al., (1986) Nature, 319: 511–514). Der mitogene PDGF wurde zuerst identifiziert (H. N. Antoniades, (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 1809–1813; E. W. Raines und R. Ross, (1982) J. Biol. Chem., 257: 5154–5160) und aus humanen Blutplättchen gereinigt (Raines, ibid.), obwohl nachfolgende Untersuchungen gezeigt haben, dass verschiedene Zelltypen, einschließlich vaskulärer Endothelzellen, vaskulärer glatter Muskelzellen, Makrophagen und sogar Fibroblasten PDGF synthetisieren (R. Ross et al., (1986) Cell, 46: 155–169).
Die zelluläre Proliferation, die durch alle Isoformen von PDGF induziert wird, wird durch Ligandenbindung an den PDGF-Rezeptor vermittelt (C. -H. Heldin, (1983) ibid., B. Ek et al. (1982) Nature, 295: 419–420; K. Glenn et al., (1982) J. Biol. Chem., 257: 5172–5176; A. R. Frackelton et al., (1984) J. Biol. Chem., 259: 7909-7915; L. T. Williams et al.. (1984) J. Biol. Chem., 259: 5287–5294).
Der PDGF-Rezeptor (M. W. 180 kDa) gehört zur Familie der Tyrosinkinasen und besteht aus zwei Rezeptorsubtypen, die mit Typ A (oder Typ a) (T. Matsui et al., (1989) Science, 243: 800–804 und L. Claesson-Welsh, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 4917–4921) und Typ B (oder Typ β) (Y. Yarden et al., (1986) Nature, 323: 226–232 und J. A. Escobedo et al., (1988) Science, 240: 1532–1534) bezeichnet werden.
An die Hochaffinitätsbindung von PDGF an den Rezeptor schließt sich Rezeptor-Dimerisierung (S. Bishavee et al., (1989) J. Biol. Chem., 264: 11699–11705 und C. -H. Heldin et al., (1989) J. Biol. Chem., 264: 8905–8912) und Autophosphorylierung an (Frackelton et al., ibid.) und führt zu einer komplizierten Reihe von intrazellulären Signalereignissen, die in der DNA-Synthese gipfeln. PDGF-β-Rezeptorund PDGF-α-Rezeptorgene von Maus und Mensch sind kloniert worden (Matsui et al., ibid., Claesson-Welsh et al., ibid., Yarden et al., ibid. und Escobedo et al., ibid.). Wenn hier auf die PDGF-Rezeptoren Bezug genommen wird, werden Typ A und Typ a ebenso wie Typ B und Typ β austauschbar verwendet.
Die beiden Rezeptorisaformen können durch ihre deutlich verschiedenen Ligandbindungs-Spezifitäten unterschieden werden. Der PDGF-β-Rezeptor bindet nur die B-Kette (Isoformen BB und AB), während der PDGF-α-Rezeptor alle Formen von PDGF binden kann (die Isoformen, die eine A- und/oder B-Kette enthalten (Matsui et al. ibid., Claesson-Welsh et al., ibid. und R. A. Seifert et al., (1989) J. Biol. Chem., 264: 8771–8778)). Der PDGF-Rezeptor zeigt einen hohen Grad an struktureller Homologie zum Rezeptor des Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (L. Coussens et al., (1986) Nature, 320: 277–280) und zum c-Kit-Protoonkogenprodukt (Yarden et al., ibid.).
Die PDGF-Rezeptoren sind durch eine extrazelluläre Domäne gekennzeichnet, welche in fünf Ig-ähnliche Domänen (Domänen 1–5), bezogen auf ihre β-Faltblattreiche Struktur, abgegrenzt werden können. Diese Ig-Wiederholungen von ungefähr 100 Aminosäuren haben jeweils mit regelmäßigem Zwischenraum angeordnete Cysteinreste (ausgenommen in der vierten Wiederholung). Der Rezeptor hat eine einzelne Transmembran-Domäne und eine zytoplasmatische Tyrosinkinase-Domäne (L. T. Williams, (1989) Science, 243: 1564–1570).
PDGF spielt während normaler physiologischer Prozesse, wie der Gewebereparatur und Embryogenese, eine wichtige Rolle (R. Ross et al., ibid.). Jedoch bringen Studien dieses potente Mitogen jetzt in Zusammenhang mit pathologischen Proliferationskrankheiten und mit der Entwicklung bestimmter Karzinome (R. Ross et al., ibid.). Die Expression der PDGF-A-Kette und des PDGF-β-Rezeptors ist in humanen atherosklerotischen Plaques durch in situ-Hybridisierung entdeckt worden (J. N. Wilcox et al., (1988) J. Clin. Invest., 82: 1134–1143). Vor kurzem haben Ferns et al. ((1991) Science, 253: 1129–1132) berichtet, dass ein polyklonaler Antikörper gegen PDGF die Erzeugung von Intimaläsionen in Karotidarterien mit geschädigtem Endothel bei nackten Ratten ohne Thymus erheblich verringerte. PDGF ist in Zusammenhang mit der Pathologie von Proliferationskrankheiten in Zellen mesenchymalen Ursprungs gebracht worden (M. Nister et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 926–930 und M. Nisten et al., (1987) Cancer Res., 47: 4953–4961, welche hier beide durch Inbezugnahme eingeführt werden). Golden et al. haben berichtet, dass die PDGF-A-Kette-Botschaft in Bereichen von Intimahyperplasie in einem Pavianmodell für Gefäßtransplantationen erhöht wurde ((1990) J. Vasc. Surq., 11: 580–585). PDGF ist auch chemotaktisch für glatten Muskel (B. Westermark et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 128–132), und platelet-PDGF kann das verursachende Mittel für die Migration und Proliferation von glatten Muskelzellen in der mit Ballon versehenen Rattenkarotidarterie sein, was zu einer erheblichen Stenose führt.
Die Studie anderer Wachstumsfaktoren und ihrer Rezeptoren ist durch die Erfindung von Antikörpern gegen die Rezeptoren unterstützt worden. Zum Beispiel haben sich Antikörper, die den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor erkennen, als leistungsfähige Werkzeuge bei der Beurteilung des Mechanismus der Rezeptoraktivierung erwiesen (M. Spaargaren et al., (1991) J. Biol. Chem., 266: 1733-1739).
Antikörper gegen Rezeptoren für Interleukin-2(IL-2) inhibieren die IL-2-Einschleusung und inhibieren folglich die nachfolgende Induktion der Proliferation von antwortenden Zellen (V. Duprez et al., (1991) J. Biol. Chem., 1497–1501).
Ähnlich inhibiert ein monoklonaler Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktor(EGF)-Rezeptor das östrogen-stimulierte Wachstum der humanen Mammaadenokarzinomzelllinie MCF-7 (D. A. Eppstein, (1989) J. Cell. Physiol., 141: 420-430). Derartige Antikörper können von großem therapeutischem Wert beim Behandeln von Wachstumsfaktor-vermittelten Krankheiten sein.
Mehrere Gruppen haben Antikörper gegen PDGF-Rezeptoren isoliert, aber diese Antikörper haben beschränkten Nutzen (siehe zum Beispiel R. S. Kawahara et al., (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun., 147: 839–845).
Zusätzliche monoklonale Antikörper sind gegen die extrazelluläre PDGF-Bindungsdomäne eines PDGF-Rezeptors aus der Gebärmutter des Schweins hervorgebracht worden (L. Ronnestrand und L. Terracio, (1988) J. Biol. Chem., 263: 10429–10435), aber diese Antikörper inhibierten nicht die Bindung von ¹²⁵I-markiertem PDGF an humane Fibroblasten. Von zahlreichen Antikörpern gegen einen PDGF-Rezeptor, der nicht die PDGF-Aktivität inhibierte, ist auch von P. S. Kanakaraj et al., (1991) Biochemistry, 30: 1761–1767; L. Claesson-Welsh et al., (1989) J. Biol. Chem., 264: 1742–1747; R. A. Seifen et al., (1989) J. Biol. Chem., 264: 8771–8778; D. A. Kumjian et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 8232-8236; S. Bishayee et al., (1988) Mol. Cell. Biol., 8: 3696–3702; C. E. Hart et al., (1987) J. Biol. Chem., 262: 10780–10785; J. A. Escobedo et al., (1988) J. Biol. Chem., 263: 1482–1487; T. O. Daniel et al., (1987) J. Biol. Chem., 262: 9778–9784; M. T. Keating und L. T. Williams, (1987) J. Biol. Chem., 262: 7932–7937; A. Kazlauskas und J. A. Copper, (1990) EMBO J. 9: 3279–3286 berichtet worden.
Folglich besteht ein Bedarf für ein Immunglobulin und andere Mittel, die in der Lage sind, die Aktivierung des humanen Rezeptors und/oder die Proliferation der Zelten spezifisch zu inhibieren, die den humanen β-PDGF-Rezeptor aufweisen. Derartige Mittel würden bei der Kartierung der verschiedenen funktionellen Domänen des Rezeptors und der Analyse der Rolle des PDGF und seiner Rezeptoren in normalen und Krankheitsprozessen nützlich sein. Außerdem haben derartige Mittel therapeutischen Wert bei der Behandlung von PDGF-vermittelten Proliferationskrankheiten und auch von Krankheiten, die mit PDGF-vermittelter Chemotaxis und Migration in Beziehung stehen. Derartige Krankheiten schließen ein:

a) Restenose, einschließlich Koronarrestenose nach Angioplastie, Atherektomie oder andere invasive Verfahren zur Plaqueentfernung und Nierenoder periphere Arterienrestenose nach denselben Verfahren;
b) vaskuläre proliferative Phänomene und Fibrose, die mit anderen Formen akuter Verletzung verbunden sind, wie: Lungenfibrose, verbunden mit Adult respiratory distress syndrome, Nierenfibrose, verbunden mit Nephritis, Koronarstenose, verbunden mit Kawasake's-Krankheit, und vaskuläre Verengungen, verbunden mit anderen Arteritiden, wie Takayasha's-Krankheit;
c) Vorbeugung gegen Verengungen bei Venentransplantationen;
d) Vorbeugung gegen Verengungen aufgrund von beschleunigter Migration und Proliferation von glatten Muskelzellen in transplantierten Organen;
e) andere fibrotische Prozesse, wie Sklerodermia, Myofibrose; und
f) Inhibierung von Tumorzellproliferation, welche durch PDGF vermittelt wird.

Die vorliegende Erfindung erfüllt diese und andere Bedürfnisse.
Zusammenfassung der Erfindung
Unter einem ersten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines monokfonalen Antikörpers gegen den PDGF-β-Rezeptor oder eines Antigen-bindenden Fragments des Antikörpers bereitstellt, welche an ein Epitop in einer extrazellulären Ig-ähnlichen Domäne des PDGF-β-Rezeptors binden und die Bindung von PDGF an den PDGF-β-Rezeptor inhibieren, zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung einer PDGF-vermittelten Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

a) vaskulären proliferativen Phänomenen und Fibrose;
b) vaskulären Verengungen bei Venentransplantationen;
c) vaskulären Verengungen aufgrund von beschleunigter Migration und Proliferation von glatten Muskelzellen in transplantierten Organen;
d) nichtvaskulären fibrotischen Prozessen;
e) Restenose.

Unter einem zweiten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte Zelllinie, wie in Anspruch 14 angegeben, bereitgestellt.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein monoklonaler Antikörper, wie in Anspruch 15 definiert, angegeben.
Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein im Wesentlichen gereinigtes Immunglobulinpolypeptid oder eines seiner Antigen-bindenden Fragmente, wie in den Ansprüchen 16 und 17 angegeben, bereitgestellt.
Unter noch einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines im Wesentlichen gereinigten Immunglobulinpolypeptids oder eines seiner Antigen-bindenden Fragmente, wie in den Ansprüchen 18 und 19 angegeben, bereitgestellt.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 Rekombinante Konstrukte der extrazellulären Domäne des humanen β-Rezeptors.
Deletionsmutagenese des vollständigen PDGF-β-Rezeptors wurde, wie unter den Verfahren beschrieben, durchgeführt. PΔ1 bezieht sich auf den aus fünf extrazellulären Domänen bestehenden PDGF-β-Rezeptor (Aminosäuren 1–499), welcher aus der PDGF-β-Rezeptor-cDNA durch Deletion der Codons für die Aminosäurereste 500–1074 hergestellt wurde, wobei die Oligonukleotide GTG TGA GGA ACG GGA AAT TCA TCG AAG GAC ATC CCC CGAC (SEQ ID NR. 1) verwendet wurden. PΔ2 bezieht sich auf den aus vier extrazellulären Domänen bestehenden PDGF-β-Rezeptor (AS 1–384), welcher aus der cDNA durch Deletion der Codons für die Aminosäurereste 385–1074 hergestellt wurde, wobei das Oligonukleotid GGA AGG TCG ATG TCT AGT TAA TCG AAG GAC ATC CCC CGAC (SEQ ID NR. 2) verwendet wurde. Die putativen Ig-Domänen werden wie folgt angezeigt: D1 (AS 1–91), D2 (AS 92–181), D3 (AS 182–282), D4 (AS 283–384) und D5 (AS 385–499). Die Peptiddeterminante der polyklonalen Antiseren 1-3-5 ist vorstehend mit D1 bezeichnet.
2. A. Western Blot des sezernierten aus 5 extrazellulären Domänen bestehenden PDGF-β-Rezeptors pΔI-5.
Reduzierte (Spuren 1–3) und nicht reduzierte (Spuren 4–6) sezernierte extrazelluläre Domäne des PDGF-β-Rezeptors (PΔ1-5, 5 μg/Spur) wurde auf 7%-Lämmli-Gelen elektrophoretisch getrennt, gefolgt von Westernübertragung, wie unter den Verfahren beschrieben. Die Nitrocellulose wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 2% Milch enthielt, geblockt, in Streifen geschnitten und über Nacht bei 4°C mit 60 μg/ml entweder von MAb 2A1E2 (Spuren 1 und 4), eines anderen monoklonalen Antikörpers gegen den PDGF-β-Rezeptor (1C7D5) (Spuren 2 und 5) oder eines unspezifischen monoklonalen Antikörpers (Spuren 3 und 6) inkubiert. Die Nitrocellulose-Streifen wurden mit PBS, die 0,5% Milch und 0,1% Tween 20 enthielt, gewaschen, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit ¹²⁵I-markiertem Protein A inkubiert, und auf einen Röntgenfilm belichtet. Der Pfeil zeigt die Position von pΔI-5 an.
B. Immunpräzipitation von sezerniertem aus vier extrazellulären Domänen bestehendem PDGF-β-Rezeptor pΔ2–7.
Der sezernierte, aus vier extrazellulären Domänen bestehende PDGF-β-Rezeptor pΔ2-7 (2,6 μg) wurde entweder mit MAb 2A1E2 (Spur 2, 5 μg), 1 C7D5 (Spur 3, 5 μg) oder unspezifischem MAb (Spur 4, 5 μg) in einem Endvolumen von 500 μl in I. P.-Puffer 3 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Protein A-Sepharose CL4B: Protein G-Sepharose CL4B(1 : 1) wurde zu jedem Röhrchen (60 μl einer 50%-Aufschlämmung) zugefügt, und die Inkubation wurde 2 Stunden lang bei 4°C fortgeführt. Die Kügelchen wurden herunter geschleudert, 5x in I. P.-Puffer gewaschen und auf einem 10%-Lämmli-Gel elektrophoretisch getrennt. Das Gel wurde auf Nitrocellulose übertragen und in PBS, die 5% Milch enthielt, geblockt. Der Blot wurde mit einer 1 : 100-Verdünnung eines polyklonalen Kaninchen anti-PDGF-β-Rezeptor-Ab (1-3-5) in PBS, die 0,5% Milch enthielt, inkubiert. Nach Inkubieren über Nacht wurde der Blot gewaschen, mit ¹²⁵I-Protein A inkubiert, gewaschen und auf einen Röntgenfilm belichtet. Spur 1 zeigt einen Standard von PΔ2-7 ohne Immunpräzipitation. Der Pfeil zeigt die Position von pΔ2-7 an.
C. Immunpräzipitation von sezerniertem extrazellulärem PDGF-ß-Rezeptor durch MAb 2A1E2.
Extrazellulärer humaner PDGF-ß-Rezeptor (pΔ1-5, 5 μg) wurde, wie für Abschnitt A beschrieben, durch Immunpräzipitation mit 5 μg entweder unspezifischem MAb (Spur 2), MAb 2A1E2 (Spur 3) oder 1 C7D5 (Spur 4) gefällt. Die Proben wurden verarbeitet, und der Blot wurde, wie in der Legende für Abschnitt B beschrieben, mit polyklonalem Kaninchen anti-PDGF-β-Rezeptor 1-3-5 (1 : 100-Verdünnung) und ¹²⁵I-Protein A inkubiert. Spur 1 enthielt 5 μg von Standard pΔ1-5.
3. Inhibierung der ¹²⁵I-PDGF-BB-Bindung an HR5-Zellen.

A) HR5-Zellen wurden, wie unter den Verfahren beschrieben, mit verschiedenen Konzentrationen von MAb 2A1E2 oder Kontroll-MAbs (200 nM anti-IIb/IIIa oder 200 nM 4C5C8) inkubiert. Die Zellen wurden dann mit¹²⁵I-PDGF-BB inkubiert, und die gebundene Radioaktivität wurde, wie beschrieben, bestimmt. Unspezifische Bindung wird definiert als die Menge an¹²⁵I-PDGF-BB, die in Gegenwart von 100-fachem Überschuss von unmarkiertem PDGF-BB gebunden wurde.
B) HR5-Zellen wurden, wie unter den Verfahren beschrieben, mit verschiedenen Konzentrationen von vollständigem MAb 2A1E2, MAb 2A1E2-F(ab')2 oder MA 2A1E2-Fab und 100 nM vollständigem anti-IIb/IIIa inkubiert. Die Gesamtbindung von¹²⁵I-PDGF-BB an die Zellen in Gegenwart und bei Fehlen von MAbs und ihren Derivaten wurde gemessen. Die Menge an ¹²⁵I-PDGF-BB, die in Gegenwart von 100-fachem Überschuss von unmarkiertem PDGF-BB gebunden wurde, stellt die unspezifische Bindung dar.

4. Inhibierung der Phosphorylierung von HR5-Zellen durch MAb 2A1E2.
Konfluente einzellige Schichten von HR5-Zellen in Platten mit sechs Vertiefungen wurden, wie unter den Verfahren beschrieben, in doppelter Ausführung mit verschiedenen MAbs vorinkubiert, gefolgt von Inkubation mit Ligand-PDGF-BB. Die Zellen wurden solubilisiert, und das Äquivalent einer Schale mit sechs Vertiefungen wurde auf einem 7%-Lämmli-Gel elektrophoretisch getrennt und auf Nitrocellulose übertragen. Der Western-Blot wurde geblockt und dann mit anti-Phosphotyrosin-MAb inkubiert. Der Blot wurde dann mit ¹²⁵I-Protein A inkubiert und autoradiographisch aufgenommen. Die Spuren 3–7 stellen Vertiefungen dar, welche entweder mit 0,13 nM MAb 2A1E2 (Spur 3), 1,3 nM MAb 2A1E2 (Spur 4), 13,3 nM MAb 2A1E2 (Spur 5), 0,13 μM MAb 2A1E2 (Spur 6) oder 0,53 μM MAb 2A1E2 (Spur 7), gefolgt von 100 ng/ml PDGF-BB vorinkubiert wurden. Spur 2 zeigt den Grad der Phosphorylierung in Gegenwart von 100 ng/ml PDGF-BB, wenn die Zelten zuerst mit 0,53 μM unspezifischem MAb vorinkubiert wurden, und Spur 8 zeigt PDGF-Bß-induzierte Phosphorylierung, wenn Zellen mit 0,53 μM PDGF-β-Rezeptor-MAb 4C5C8 vorinkubiert wurden. Der Pfeil zeigt die Position des vollständigen humanen PDGF-β-Rezeptors an.
5. Inhibierung der PDGF-BB-vermittelten Dimerisierung des PDGF-Rezeptors durch MAb 2A1E2.
HR5-Zellen wurden entweder mit 13 nM MAb 2A1E2 (Spur 3), 0,13 μM MAb 2A1E2 (Spur 4) oder 1,3 μM MAb 2A1E2 (Spur 5), gefolgt von 100 ng/ml PDGF-BB, inkubiert, und Vernetzung wurde, wie unter den Verfahren beschrie ben, durchgeführt. Spur 6 stellt die Wirkung von 0,1 μM anti-IIb/IIIa-MAb bei Dimerisierung dar. Spur 1 zeigt die relative Menge an Dimer bei Fehlen von zugefügtem Vernetzungsmittel, und Spur 2 zeigt die Menge an dimerisiertem PDGF-Rezeptor bei Fehlen des Antikörpers.
6. Inhibierung der Mitogenese bei AG01523B-Zellen durch MAb 2A1E2.
Zellen wurden bis zur Konfluenz wachsengelassen und, wie unter den Verfahren beschrieben, mit verschiedenen Konzentrationen entweder von MAb 2A1E2 (leere Kreise) oder nicht-inhibierendern Kontroll-PDGF-β-Rezeptor-MAb 4C5C8 (ausgefüllte Quadrate) in Gegenwart von 50 ng/ml PDGF-BB inkubiert. Der ³H-Thymidin-Einbau wurde, wie beschrieben, gemessen.
7. Inhibierung der Phosphorylierung durch MAb 2A1E2 in glatten Muskelzellen des Pavians.
Glatte Muskelzellen des Pavians wurden ohne PDGF-BB (Spur 1) oder mit 100 ng/ml PDGF-BB bei Fehlen von MAb (Spur 2) oder in Gegenwart von 2 nM MAb 2A1E2 (Spur 3), 200 nM MAb 2A1E2 (Spur 4) oder 20 nM MAb 2A1E2 (Spur 5) inkubiert. Ligand-induzierte Phosphorylierung wurde, wie unter den Verfahren beschrieben, durch Westernanalyse bestimmt.
8. Inhibierung der Mitogenese durch MAb 2A1E2 in glatten Muskelzellen des Pavians.
Konfluente glatte Muskelzellen des Pavians wurden mit 1 nM, 5 nM, 25 nM, 250 nM oder 1 μM MAb 2A1E2 in Gegenwarf verschiedener Konzentrationen von PDGF-BB inkubiert. Der ³H-Thymidin-Einbau wurde, wie unter den Verfahren beschrieben, gemessen. Die Daten werden als Prozentsatz des maximal eingebauten ³H-Thymidins (ungefähr 30–50000 Cpm) bei sättigender Ligandkonzentration (10 ng/ml) bei Fehlen von MAb angegeben. Der ³H-Thymidin-Einbau bei Fehlen von PDGF-BB beträgt 5–8000 Cpm. Das Diagramm stellt das Mittel von vier verschiedenen Experimenten dar.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung stellt ein Immunglobulinpolypeptid bereit, das spezifisch an den humanen β-PDGF-Rezeptor bindet. Der Antikörper ist in der Lage, die PDGF-induzierte Mitogenese von Zellen zu inhibieren, die den humanen β-PDGF-Rezeptor auf der Zelloberfläche aufweisen. Die Erfindung ist in Diagnoseanwendungen und auch zur Behandlung von Krankheiten nützlich, die mit PDGF-vermittelter Proliferation, Migration und Chemotaxis von Zellen in Beziehung stehen, die den humanen β-PDGF-Rezeptor aufweisen.
Definitionen
a) Proteine.
Die Begriffe "Peptid", "Polypeptid" oder "Protein" werden hier austauschbar verwendet. Der Begriff "wesentliche Identität", wenn er sich auf Polypeptide bezieht, zeigt an, dass das fragliche Polypeptid oder Protein mindestens etwa 30% identisch ist mit einem vollständig natürlich vorkommenden Protein oder einem Teil davon, üblicherweise mindestens etwa 70% identisch ist, und vorzugsweise mindestens etwa 95% identisch ist.
In dieser Anmeldung werden die Begriffe "isoliert", "im Wesentlichen rein" und "im Wesentlichen homogen" austauschbar verwendet und beschreiben ein Protein, das aus Komponenten getrennt worden ist, welche es natürlicherweise begleiten. Typischerweise ist ein monomeres Protein im Wesentlichen rein, wenn mindestens etwa 60 bis 75% einer Probe ein einziges Polypeptidgerüst aufweist. Kleinere Varianten oder chemische Modifikationen teilen typischerweise dieselbe Polypeptidsequenz. Ein im Wesentlichen gereinigtes Protein umfasst typischerweise über etwa 85 bis 90% einer Proteinprobe, üblicherweise etwa 95%, und vorzugsweise ist sie zu über 99% rein. Die Proteinreinheit oder -homogenität kann durch mehrere Verfahren angezeigt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie Polyacrylamidgel-Elektrophorese einer Proteinprobe, gefolgt durch ein Sichtbarmachen einer einzelnen Polypeptidbande auf einem Polyacrylamidgel nach Anfärbung. Für bestimmte Zwecke ist eine hohe Auflösung erforderlich, und HPLC- oder ein ähnliches Verfahren wird zur Reinigung verwendet.
Ein Polypeptid ist im Wesentlichen frei von natürlich verbundenen Komponenten, wenn es von den natürlichen Verunreinigungen, welche es in seinem natürlichen Zustand begleiten, getrennt ist. Folglich ist ein Polypeptid, welches chemisch synthetisiert oder in einem Zellsystem synthetisiert wurde, das von der Zelle, aus welcher es natürlicherweise stammt, verschieden ist, im Wesentlichen frei von seinen natürlich verbundenen Komponenten.
Proteine können durch Standardverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, einschließlich selektiver Präzipitation mit solchen Stoffen, wie Ammoniumsulfat, Säulenchromatographie, Immun-Reinigungsverfahren und anderen, zu erheblicher Homogenität aufgereinigt werden, siehe zum Beispiel R. Scopes, Protein Purification: Principles and Practice („Protein-Reinigung: Grundlagen und Praxis"), Springer-Vertag: New York (1982).
b) Nukleinsäuren.
Die hier verwendeten Nukleinsäuren können DNA oder RNA sein. Wenn sich der Begriff "wesentliche Identität" auf Nukleinsäuren bezieht, zeigt er an, dass die Sequenzen von zwei Nukleinsäuren oder gekennzeichneten Teilen davon mit passenden Nukleotidinsertionen oder -deletionen in mindestens etwa 80% der Nukleotide, üblicherweise mindestens etwa 90% bis 95% und insbesondere bevorzugt mindestens etwa 98 bis 99,5% der Nukleotide identisch sind, wenn sie optimal abgeglichen und verglichen werden.
In einer anderen Ausführungsform besteht erhebliche Nukleinsäuresequenzidentität, wenn ein Nukleinsäuresegment unter selektiven Hybridisierungsbedingungen an ein Komplement eines anderen Nukleinsäurestranges hybridisiert.
"Im Wesentlichen komplementär" bedeutet in gleicher Weise, dass eine Nukleinsäure identisch ist mit oder selektiv hybridisiert an eine andere Nukleinsäure. Typi scherweise tritt selektive Hybridisierung auf, wenn die Identität zu mindestens etwa 55% über eine Ausdehnung von mindestens 14–25 Nukleotiden besteht, vorzugsweise zu mindestens etwa 65%, stärker bevorzugt zu mindestens etwa 75% und am meisten bevorzugt zu mindestens etwa 90%, siehe M. Kanehisa, Nucleic Acids Res., 12: 203 (1984).
Stringente Hybridisierungsbedingungen schließen typischerweise Salzkonzentrationen von kleiner als etwa 1 M, gewöhnlich von kleiner als etwa 500 mM und insbesondere bevorzugt von kleiner als etwa 200 mM ein. Die Temperaturbedingungen sind typischerweise größer als 22°C, noch typischer größer als etwa 30°C und vorzugsweise mehr als etwa 37°C. Weil andere Faktoren die Stringenz der Hybridisierung, einschließlich der Basenzusammensetzung und Größe der komplementären Stränge, der Gegenwart organischer Lösungsmittel und des Ausmaßes der Basenfehlpaarung, drastisch beeinflussen können, ist die Kombination von Parametern wichtiger als das absolute Maß eines einzelnen allein.
"Isoliert" oder "im Wesentlichen rein" bezieht sich, wenn sich diese Begriffe auf Nukleinsäuren beziehen, auf solche, die von anderen zellulären Komponenten oder andere Verunreinigungen gereinigt worden sind, z. B. anderen zellulären Nukleinsäuren oder Proteinen, durch Standardverfahren, einschließlich alkalische/SDS-Behandlung, CsCl-Bandenbildung, Säulenchromatographie und anderen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, siehe F. Ausubel et al., Hrsg. Current Protocols in Molecular Biology ("Gegenwärtige Protokolle in der Molekularbiologie"), Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987).
Eine Nukleinsäure ist "funktionsfähig verbunden", wenn sie in ein funktionelles Verhältnis zu einer anderen Nukleinsäuresequenz gesetzt wird. Zum Beispiel ist ein Promotor oder ein Verstärker mit einer kodierenden Sequenz funktionsfähig verbunden, wenn sie die Transkription der Sequenz beeinflusst. Allgemein bedeutet funktionsfähig verbunden, dass die Nukleinsäuresequenzen, die verbunden werden, benachbart sind und, wenn es erforderlich ist, zwei Protein-kodierende Regionen zu verbinden, benachbart und im Leserahmen.
Verfahren zur Nukleinsäuremanipulation, wie das Subklonieren von Nukleinsäuresequenzen, die Polypeptide kodieren, in Expressionsvektoren, Markieren von Sonden, DNA-Hybridisierung und so weiter, werden allgemein zum Beispiel in Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual („Molekulares Kolnieren: Ein Labor-Handbuch") (2.Aufl.), Bd. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory, oder Ausubel et al., Hrsg. (1987), ibid., beschrieben.
"Expressionsvektoren", "Klonierungsvektoren" oder "Vektoren" sind häufig Plasmide oder andere Nukleinsäuremoleküle, die in der Lage sind, in einer ausgewählten Wirtszelle zu replizieren. Expressionsvektoren können autonom replizieren, oder sie können replizieren, indem sie durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren in das Genom der Wirtszelle insertiert werden. Autonom replizierende Vektoren haben einen Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS), die in der/den ausgewählten Wirtszelle(n) funktionell ist. Häufig ist es wünschenswert, dass ein Vektor in mehr als einer Wirtszelle, z. B. in E. coli zur Klonierung und Konstruktion und in einer Säugetierzelle zur Expression verwendbar ist.
Säugetierzelllinien werden häufig als Wirtszellen zur Expression von Polypeptiden verwendet, die sich von Eukaryoten ableiten. Propagation von Säugetierzellen in Kultur ist an sich bekannt, siehe Tissue Culture („Gewebekultur"), Academic Press, Kruse und Patterson, Hrsg. (1973). Wirtszelllinien können auch solche Organismen, wie unter anderem Bakterien (z. B. E. coli oder B. subtilis), Hefe, filamentöse Pilze, Pflanzenzellen oder Insektenzellen einschließen.
"Transformation" bezieht sich auf die Einbringung von die interessierenden Nukleinsäuren enthaltenden Vektoren durch bekannte Verfahren direkt in Wirtszellen. Transformationverfahren, welche in Abhängigkeit vom Typ der Wirtszelle variieren, schließen Elektroporation, Transfektion, bei der Calciumchlorid, Rubidiumchlorid, Calciumphosphat, DEAE-Dextran oder andere Stoffe verwendet werden, Beschuss mit Mikroprojektilen, Lipofektion, Infektion (bei der der Vektor ein infektiöses Mittel ist) und andere Verfahren ein, siehe allgemein Sambrook et al., (1989) ibid. und Ausubel et al. (Hrsg.), (1987) ibid.. Bezugnahme auf Zellen, in welche die vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren eingebracht worden sind, schließt auch die Nachkommen derartiger Zellen ein.
c) Antikörper.
Die hier verwendeten "Immunglobulinpolypeptide" beziehen sich auf Moleküle, welche spezifische immunreaktive Aktivität aufweisen. Antikörper sind typischerweise Tetramere von Immunglobulinpolypeptiden. Der hier verwendete Begriff "Antikörper" bezieht sich auf ein Protein, das aus einem oder mehreren im Wesentlichen durch Immunglobulin-Gene kodierte Polypeptiden besteht. Immunglobulin-Gene schließen solche ein, die die leichten Ketten kodieren, welche vom koder λ-Typ sein können, sowie solche, die die schweren Ketten kodieren. Die schweren Kettentypen sind α, γ, δ, ε und μ. Die carboxyterminalen Teile der schweren und leichten Ketten des Immunglobulins sind konstante Regionen, während die aminoterminalen Teile durch die unzähligen Gene der variablen Region des Immunglobulins kodiert werden. Die variablen Regionen eines Immunglobulins sind die Teile, die Antigenerkennungsspezifität aufweisen. Insbesondere besteht die Spezifität in den komplementaritätsbestimmenden Regionen (complementarity determining regions) (CDRs) der Immunglobuline, die auch als hypervariable Regionen bekannt sind. Die Immunglobuline können in einer Vielzahl von Formen auftreten, z. B. Fv, Fab und F(ab)₂, sowie in Single-Chains (z. B. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879–5883 (1988) und Bird et al., Science, 242: 423–426 (1988)).
(Siehe allgemein Hood et al. "Immunology" („Immunologie"), Benjamin, N. Y., 2. Aufl. (1984) und Hunkapiller und Hood, Nature, 323: 15–16 (1986)).
Single-Chain-Antikörper, in welchen Gene für eine schwere Kette und eine leichte Kette zu einer einzigen kodierenden Sequenz kombiniert sind, können ebenfalls verwendet werden.
"Monoklonale Antikörper" können mit verschiedenen Verfahren erhalten werden, die dem Fachmann vertraut sind. Milzzellen von einem Tier, das mit einem gewünschten Antigen immunisiert wurde, werden allgemein durch Fusion mit einer Myelomzelle immortalisiert (siehe Kohlen und Milstein, Eur. J. Immunol., 6: 511–519 (1976)). Alternative Verfahren der Immortalisation schließen Transformation mit einem Epstein-Barr-Virus, Onkogenen oder Retroviren oder andere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren ein. Die aus einzelnen, immortalisierten Zellen hervorgehenden Kolonien werden auf die Produktion von Antikörpern der gewünschten Spezifität und Affinität zum Antigen abgesucht, und die Ausbeute der monoklonalen Antikörper, die durch derartige Zellen produziert werden, kann mit verschiedenen Verfahren, einschließlich Injektion in die Cavitas peritonealis eines Wirbeltierwirtes erhöht werden.
Monospezifische Immunglobuline können auch durch rekombinante Verfahren in den prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen produziert werden.
"Chimäre" Antikörper werden durch Immunglobulin-Gene kodiert, die gentechnisch so verändert worden sind, dass die Gene der leichten und schweren Ketten aus Immunglobulin-Gensegmenten bestehen, die zu verschiedenen Spezies gehören. Zum Beispiel können die variablen (V) Segmente der Gene eines monoklonalen Mausantikörpers mit humanen konstanten (C) Segmenten verbunden werden. Solch ein chimärer Antikörper ist wahrscheinlich weniger antigen gegen einen Menschen als Antikörper mit konstanten Mausregionen sowie variablen Mausregionen.
Der hier verwendete Begriff chimärer Antikörper bezieht sich auch auf einen Antikörper, der ein Immunglobulin einschließt, das ein Mensch-ähnliches Gerüst hat und in welchem jede vorliegende konstante Region mindestens etwa 85–90% und vorzugsweise etwa 95% Polypeptidsequenzidentität zur konstanten Region eines humanen Immunglobulins aufweist, ein sogenanntes "humansiertes" Immunglobulin (siehe zum Beispiel PCT-Veröffentlichung WO 90/07861).
Folglich sind alle Teile solch eines "humansierten" Immunglobulins, ausgenommen vielleicht die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs), im Wesentlichen identisch mit entsprechenden Teilen von einer oder mehreren nativen humanen Immunglobulinsequenzen.
Der hier verwendete Begriff "Gerüstregion" bezieht sich auf solche Teile der variablen Regionen der leichten und schweren Ketten des Immunglobulins, die unter verschiedenen Immunglobulinen in einer einzigen Spezies verhältnismäßig konserviert sind (d. h. anders als die CDRs), wie von Kabat et al., (1987): Seguences of Proteins of Immunologic Interest ("Sequenzen von Proteinen mit immunologischer Bedeutung"), 4. Aufl., US Dept. Health and Human Services, definiert. Die hier verwendete "Mensch-ähnliche Gerüstregion" ist eine Gerüstregion, die in jeder vorhandenen Kette mindestens etwa 70 oder mehr Aminosäurereste, typischerweise 75 bis 85 oder mehr Reste umfasst, die mit denen in einem humanen Immunglobulin identisch sind.
Humane DNA-Sequenzen einer konstanten Region können mit bekannten Verfahren aus verschiedenen humanen Zellen, aber vorzugsweise aus immortalisierten B-Zellen isoliert werden. Die variablen Regionen oder CDRs zur Produktion der chimären Immunglobuline gemäß der vorliegenden Erfindung leiten sich in gleicher Weise von den monoklonalen Antikörpern ab, die in der Lage sind, an den humanen β-PDGF-Rezeptor zu binden, und werden in jeder günstigen Säugetierquelle, einschließlich Mäusen, Ratten, Kaninchen oder anderen Wirbeltieren produziert, die in der Läge sind, Antikörper durch bekannte Verfahren zu produzieren.
Geeignete Quellzellen für die DNA-Sequenzen und Wirtszellen zur Immunglobulinexpression und -sekretion können von mehreren Quellen, wie der American Type Culture Collection ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas" („Katalog der Zelllinien und der Hybridome"), 5. Aufl. (1985) Rockville, Maruland, USA) erhalten werden.
Zusätzlich zu den chimären und "humanisierten" Immunglobulinen, die hier spezifisch beschrieben wurden, können leicht andere im Wesentlichen identische modifizierte Immunglobuline unter Verwendung verschiedener rekombinanter dem Fachmann bekannter DNA-Verfahren entworfen und hergestellt werden. Allgemein können Modifikationen der Gene durch verschiedene bekannte Verfahren, wie ortsgerichtete Mutagenese leicht erreicht werden (siehe Gillman und Smith, Gene, 8: 81–97 (1979) und S. Roberts et al., Nature, 328: 731–734 (1987)).
In einer anderen Ausführungsform können Polypeptidfragmente, die nur einen Teil der primären Immunglobulinstruktur aufweisen, produziert werden. Zum Beispiel kann es wünschenswert sein, Immunglobulinpolypeptidfragmente zu produzieren, die eine oder mehrere Immunglobulin-Aktivitäten zusätzlich zur oder andere als die Antigenerkennung besitzen (z. B. Komplementbindung).
Vollständige Immunglobulin-Gene oder Teile davon können auch mit funktionellen Regionen von anderen Genen (z. B. Enzymen) oder mit anderen Molekülen, wie Giftstoffen oder Markierungen, kombiniert werden, um Fusionsproteine (z. B. "Immuntoxine") mit neuen Eigenschaften zu produzieren. In diesen Fällen von Genfusion liegen die beiden Komponenten innerhalb derselben Polypeptidkette vor. In einer anderen Ausführungsform kann das Immunglobulin oder eines seiner Fragmente durch eines von verschiedenen bekannten chemischen Verfahren chemisch an das Toxin oder die Markierung gebunden werden. Wenn zum Beispiel die Markierung oder das cytotoxische Mittel ein Protein ist und die zweite Komponente ein intaktes Immunglobulin, kann die Bindung über heterobifunktionelle Vernetzungsmittel, z. B. SPDP, Carbodiimid, Glutaraldehyd oder dergleichen, gebildet werden.
Geeignete Markierungen schließen zum Beispiel Radionuklide, Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, Fluoreszenzmittel, Chemolumineszenzmittel, magnetische Teilchen ein, siehe zum Beispiel Patente, die die Verwendung derartiger Markierungen lehren, US-Patente Nr. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; und 4,366,241.
Immuntoxine, einschließlich Single Chain-Moleküle, können auch durch rekombinante Mittel produziert werden. Die Produktion verschiedener Immuntoxine ist auf dem Fachgebiet bekannt, und Verfahren können z. B. in "Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet" („Monoklonale Antikörper-Toxin-Konjugate: Zielen auf das Wunderheilmittel"), Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine („Monoklonale Antikörper in der klinischen Medizin"), Academic Press, S. 168–190 (1982); E. Vitetta, Science, (1987) 238: 1098–1104 und G. Winter und C. Milstein, Nature, (1991) 349: 293–299 gefunden werden.
Verschiedene cytotoxische Mittel sind zur Verwendung in Immuntoxinen geeignet. Cytotoxische Mittel können Radionuklide, wie Iod-131, Yttrium-90, Rhenium-188 und Bismuth-212, mehrere chemotherapeutische Arzneistoffe, wie Vindesin, Methotrexat, Adriamycin und Cisplatin, sowie cytotoxische Proteine, wie ribosomale inhibierende Proteine, wie Kermesbeere-Antivirenprotein, Pseudomonas-Exotoxin A, Ricin, Diphtherietoxin, Ricin A-Kette usw. oder ein Mittel, das an der Zelloberfläche aktiv ist, wie die Phospholipaseenzyme (z. B. Phospholipase C) einschließen (siehe allgemein "Chimeric Toxins" („Chimäre Toxine"), Olsnes und Pihl, Pharmac. Ther., 15: 355–381 (1981) und "Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy" ("Monoklonale Antikörper zur Krebserkennung und -therapie"), Hrsg. Baldwin und Byers, S. 159–179, 224–266, Academic Press (1985).
Beschreibung der Erfindung
Die erfindungsgemäßen Immunglobulinpolypeptide werden in Therapeutika sowie in der Diagnostik und anderen Anwendungen eingesetzt. Verschiedene Verfahren, die auf diesen Fachgebieten nützlich sind, werden diskutiert, zum Beispiel in Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual („Antikörper: Ein Labor-Handbuch"), Cold Spring Harbor, New York (1988), einschließlich: Immunisierung von Tieren, um Immunglobuline zu produzieren, Produktion von monoklonalen Antikörpern; Markierung von Immunglobulinen zur Verwendung als Sonden, Immunaffinitätsreinigung und Immunassays.
Ein Beispiel eines erfindungsgemäßen Immunglobulinpolypeptids ist der nachstehend beschriebene monoklonale Antikörper 2A1E2, welcher spezifisch an den humanen β-PDGF-Rezeptor bindet. Der monoklonale Antikörper 2A1E2, welcher vom IgG₁-Isotyp ist, wurde vor dem Anmeldetag dieser Anmeldung bei der American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Manland 20231 (ATCC-Nr. HB10938) hinterlegt.
Die erfindungsgemäßen anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptide können durch Immunisierung eines Tieres mit einer gereinigten oder teilweise gereinigten extrazellulären Domäne des humanen β-PDGF-Rezeptors hergestellt werden. Die immunisierten Tiere können eines von verschiedenen Spezies sein, welche in der Lage sind, die für die extrazelluläre Domäne des humanen β-PDGF-Rezeptors charakteristischen Epitope immunologisch zu erkennen, wie Maus, Hasenartige, Pferdeartige usw.
Erfindungsgemäße monoklonale Antikörper können durch Immortalisation von Nukleinsäuresequenzen hergestellt werden, welche Immunglobulinpolypeptide oder Teile davon kodieren, die spezifisch an für die extrazelluläre Domäne des humanen β-PDGF-Rezeptors charakteristische Antigendeterminanten binden. Das Immortalisationsverfahren kann durch Hybridomafusionsverfahren, durch Virentransformation von Antikörper-produzierenden Lymphozyten, rekombinante DNA-Verfahren oder durch Verfahren, die Zellenfusion, Virentransformation und/oder rekombinante DNA-Verfahren kombinieren, durchgeführt werden.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung werden humane monoklonale Antikörper gegen den PDGF-Rezeptor produzierende Zellen unter Verwendung z. B. von Epstein-Barr-Virus(EBV)-Transformationsverfahren immortalisiert. Zum Beispiel werden B-Lymphozyten, die sich vom peripheren Blut, Knochenmark, von Lymphknoten, Mandeln usw. ableiten, von vorzugsweise mit dem PDGF-Rezeptor oder Teilen davon immunisierten Patienten unter Verwendung von EBV nach den Verfahren, wie denen, die in US-Patent Nr. 4,464,465 und Chan et al., J. Immunol., 136: 106 (1986) beschrieben sind, immortalisiert.
Humane monoklonale Antikörper gegen den PDGF-Rezeptor können auch auf verschiedene andere Art und Weisen, z. B. unter Verwendung einer Kombination von EBV oder anderen Virentransformations- und Hybridomafusionsverfahren, hergestellt werden. Zum Beispiel können die Hybridomazellen durch Fusion von stimulierten B-Zellen, die aus einer mit dem PDGF-Rezeptor oder einem Teil davon immunisierten Einzelperson erhalten wurden, mit einem Maus/Mensch-Heterohybrid-Fusionspartner erzeugt werden, von dem eine Vielzahl beschrieben worden ist, siehe z. B. US-Patent Nr. 4,624,921 und James und Bell, J. Immunol. Meths., 100: 5–40 (1987).
Ein Maus/Mensch-Fusionspartner kann durch Fusion von durch EBV stimulierten oder transformierten humanen Lymphozyten mit leicht verfügbaren Mausmyelomlinien, wie NS-1 oder P3NS-1, in Gegenwart von z. B. Polyethylenglykol konstruiert werden. Das Hybrid sollte in geeigneter Weise mit Arzneistoff markiert werden, was durch Züchten des Hybrids in zunehmenden Konzentrationen des gewünschten Arzneistoffs, wie von 6-Thioguanin, Ouabain oder Neomycin, erreicht werden kann.
Die Hybridoma- oder Lymphoblastoidzellen, welche interessierende Antikörper sezernieren, können durch Absuchen der Kulturüberstände auf einen an den (β-PDGF-Rezeptor bindenden Antikörper identifiziert werden. Insbesondere kann ein Screeningassay verwendet werden, um solche Antikörper aufzuspüren, welche zum Beispiel durch PDGF vermittelte Mitogenese inhibieren. Zellen, welche die gewünschte Aktivität besitzen, werden kloniert und mit herkömmlichen Verfahren subkloniert und überwacht, bis stabile, immortalisierte Linien identifiziert sind, die den interessierenden monoklonalen Antikörper gegen den PDGF-Rezeptor produzieren. Unter einem monoklonalen Antikörper ist ein Antikörper zu verstehen, der durch eine klonale, immortalisierte Zelllinie produziert wird, die von Zellen getrennt sind, die die Antikörper mit einer verschiedenen Antigen-bindenden Spezifität produzieren. Folglich werden derartige monoklonale Antikörper isoliert von anderen monoklonalen Antikörpern produziert und demgemäß in im Wesentlichen reiner Form (im Verhältnis zu anderen Antikörpern) und in einer Konzentration, die im Allgemeinen größer ist als die, die in Seren von Tierspezies normalerweise auftreten, welche als B-Zellen-Quelle dienen.
In einer anderen Ausführungsform können DNA-Sequenzen isoliert werden, welche ein humanes anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptid oder deren Teile kodieren, die spezifisch an die extrazelluläre Domäne des PDGF-Rezeptors binden, indem eine DNA-Bibliothek von humanen B-Zellen nach einem allgemeinen Protokoll durchsucht wird, wie von Huse et al., Science, 246: 1275–1281 (1989) dargestellt, das hier durch Inbezugnafime aufgenommen ist, und indem die Sequenzen dann kloniert und amplifiziert werden, welche die anti-PDGF-Rezeptor-Antikörper (oder das Bindungsfragment) der gewünschten Spezifität kodieren.
Die Immunglobuline können dann durch Einbringen eines das passende Immunglobulin-Gen oder einen Teil davon enthaltenden Expressionsvektors in eine passende Wirtszelle produziert werden. Die Wirtszelllinie wird dann unter Bedingungen gehalten, die für die Expression großer Mengen der Immunglobulinnukleotidsequenzen geeignet sind, und, wenn gewünscht, können eine Sammlung und Reinigung der leichten Ketten, schweren Ketten, leichte/schwere-Kettedimere oder der intakten Antikörper, Bindungsfragmente oder anderer Immunglobulinformen folgen.
Geeignete Wirtszellen schließen Mikroorganismen ein, aber Säugetier- oder Insektengewebe-Zellenkultur kann zur Produktion der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper bevorzugt sein (siehe E. Winnacker, "From Genes to Clones" („Von Genen zu Klonen"), VCH Publishers, N. Y., N. Y. (1987)). Mehrere geeignete Wirtszelllinien, die in der Lage sind, intakte Immunglobuline zu sezernieren, sind auf dem Fachgebiet entwickelt worden und schließen die Chinese hamster ovarium-Zellenlinie (CHO) ein, aber vorzugsweise werden transformierte B-Zellen oder Hybridomazellen verwendet.
Sobald exprimiert, können die vollständigen Antikörper, deren Dimere, einzelnen leichten und schweren Ketten oder andere erfindungsgemäße Immunglobulinformen nach Standardverfahren auf dem Fachgebiet, einschließlich der Ammoniumsulfat-Präzipitation, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und dergleichen; gereinigt werden (siehe allgemein R. Scopes, Protein Purification („Protein-Reinigung"), Springer-Verlag, N. Y. (1982), das hier durch Inbezugnahme aufgenommen ist). im Wesentlichen reine Immunglobuline mit mindestens etwa 90 bis 95% Homogenität sind bevorzugt, und solche mit 98 bis 99% oder größerer Homogenität sind für pharmazeutische Verwendungen besonders bevorzugt. Sobald die Polypeptide teilweise oder zur gewünschten Homogenität gereinigt sind, können sie dann therapeutisch (einschließlich extrakorporal) oder beim Entwickeln und Durchführen von Assayverfahren, Immunfluoreszenzanfärbungen und dergleichen verwendet werden. (Siehe allgemein, Immunological Methods ("Immunologische Methoden"), Bd. I und II, Lefkovits und Pernis, Hrsg., Academic Press, New York, N. Y. (1979 und 1981)).
Die Immunglobulinpolypeptide, die nach der vorliegenden Erfindung produziert worden sind, können vom IgG-, IgM-, IgA- oder IgD-Isotyp sein und können ferner yu einer der passenden Unterklassen davon gehren, wie z. B. IgG₁, IgG₂, IgG₃ oder IgG₄. Unter Verwendung rekombinanter DNA-Verfahren kann ein "Klassenwechsel" der isolierten Immunglobulinpolypeptide leicht erreicht werden. Bei diesem Verfahren werden Gene, die die konstanten Regionen kodieren, welche den Isotyp des interessierenden Immunglobulin-Moleküls bestimmen, durch Gene ersetzt, die einen gewünschten Isotyp oder eine Unterklasse kodieren, wie allgemein in der Europäischen Patentveröffentlichung EP 314,161 beschrieben ist.
Klassengewechselte Immunglobuline können auch durch Selektion von Zellen, welche spontan gewechselt sind, unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Selektionsverfahren isoliert werden.
Die Verabreichung von im Wesentlichen nicht humanen Immunglobulinpolypeptiden an Menschen kann Anti-Antikörper-Reaktionen hervorrufen. Folglich kann es wünschenswert sein, erfindungsgemäße anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptide herzustellen, welche im Wesentlichen human sind. "Im Wesentlichen human" bedeutet, dass ein Antikörper oder Bindungsfragment davon, der/das aus Aminosäuresequenzen besteht, welche im Ursprung zu mindestens etwa 50% human, stärker bevorzugt zu mindestens etwa 70 bis 80% und am meisten bevorzugt zu etwa 95–99% oder mehr human sind, insbesondere für wiederholte Verabreichungen über einen längeren Zeitraum, wie es erforderlich sein kann, um nachgewiesene durch PDGF vermittelte Zellproliferationserkrankungen zu behandeln. Der hier verwendete humane Antikörper schließt Antikörper von vollständig humanem Ursprung sowie solche ein, welche im Wesentlichen human sind, soweit der Kontext nicht etwas anderes anzeigt.
Da die Erzeugung humaner monoklonaler Antikörper gegen den PDGF-Rezeptor mit herkömmlichen Immortalisationsverfahren schwierig sein kann, kann es wünschenswert sein, zuerst nichthumane Antikörper herzustellen und dann die Antigen-bindenden Regionen der nichthumanen Antikörper z. B. das Fab, die komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) oder die hypervariablen Regionen über rekombinante DNA-Verfahren je nach Geeignetheit auf humane konstante Regionen (Fc) oder Gerüstregionen zu übertragen, um im Wesentlichen humane Moleküle zu produzieren. Derartige Verfahren sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt und sind zum Beispiel in US-Patent Nr. 4,816,397, PCT-Veröffentlichung WO 90/07861 und in den EP-Veröffentlichungen 173494 und 239400 beschrieben.
Die so erhaltenen Chimären Antikörper oder Chimären Immunglobulinpolypeptide, die spezifisch an den humanen β-PDGF-Rezeptor binden und folglich die Bindung von PDGF an den Rezeptor inhibieren, liegen auch im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung. Ein typischer therapeutischer chimärer Antikörper würde ein hybrides Protein sein, das aus der variablen (V) oder Antigen-bindenden Domäne eines Maus-Immunglobulins, das spezifisch für eine Antigendeterminante des humanen PDGF-β-Rezeptors ist, und der konstanten (C) oder Effektordomäne eines humanen Immunglobulins besteht, obwohl Domänen von anderen Säugetierspezies sowohl für die variable als auch die konstante Domäne verwendet werden können. Der hier verwendete Begriff "chimärer Antikörper" bezieht sich auch auf Antikörper, die durch Immunglobulin-Gene kodiert werden, in welchen nur die komplementaritätsbestimmenden die Antigendeterminanten spezifisch erkennenden Regionen (CDRs) vom Immunglobulin übertragen werden, wobei sich der Rest des Immunglobulin-Gens von einem humanen Immunglobulin-Gen (oder, wenn gewünscht, von einem Immunoglobulin-Gen eines anderen Säugetieres) ableitet. Diese Art des chimären Antikörpers wird als "humansierter" Antikörper (wenn ein humanes Immunglobulin-Gen verwendet wird) bezeichnet.
Die hypervariablen Regionen der variablen Domänen der anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptide umfassen eine verwandte Ausführungsform der Erfindung. Die hypervariablen Regionen oder CDRs in Verbindung mit den Gerüstregionen (jenen Teilen der variablen Regionen der leichten und schweren Kette des Immunglobulins, die unter verschiedenen Immunglobulinen in einer einzelnen Spezies verhältnismäßig konserviert sind) ermöglichen den anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptiden, den humanen β-PDGF-Rezeptor zu erkennen und folglich an ihn zu binden. Die hypervariablen Regionen können kloniert und se quenziert werden. Sobald sie identifiziert sind, können diese Regionen, die spezifische Erkennung des PDGF-Rezeptors ermöglichen, dann in einen Vektor zur Expression in einem Wirt als Teil eines anderen Immunglobulinmoleküls oder als ein Fusionsprotein kloniert werden, z. B. eines Trägermoleküls, welches arbeitet, um die (mmunogenizität des klonierten Idiotops zu erhöhen.
Die erfindungsgemäßen anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptide werden allgemein intakt oder als immunogene Fragmente, wie F_v , Fab- oder F(ab')₂-Fragmente, verwendet. Die Fragmente können durch herkömmliche Verfahren aus Antikörpern erhalten werden, wie durch proteolytischen Verdau des Antikörpers unter Verwendung von z. B. Pepsin oder Papain oder durch rekombinante DNA-Verfahren, in welchen ein Gen oder ein Teil davon, das das gewünschte Fragment kodiert, kloniert oder synthetisiert und in verschiedenen Wirten exprimiert wird.
Der Fachmann stellt fest, dass "antiidiotype" Antikörper unter Verwendung eines spezifischen Immunglobulins als Immunogen nach Standardverfahren produziert werden können. Zum Beispiel induziert Infektion oder Immunisierung mit einem PDGF-Rezeptorpolypeptid oder Fragment davon ein neutralisierendes Immunglobulin, welches an seiner kombinierenden Stelle der variablen Fab-Region ein Bild des PDGF-Rezeptorpolypeptids aufweist, das zu diesem bestimmten Immunglobulin, d. h. einem Idiotyp, einzigartig ist. Immunisierung mit solch einem anti-PDGF-R-Immunglobulin induziert einen anti-Idiotyp-Antikörper, welcher an seiner kombinierenden Stelle eine Konformation aufweist, die die Struktur des ursprünglichen PDGF-R-Antigens nachahmt. Diese anti-Idiotyp-Antikörper können deshalb anstelle des PDGF-R-Antigens verwendet werden, um durch PDGF vermittelte Krankheiten zu behandeln (siehe zum Beispiel Nisonoff (1991) J. Immunol., 147: 2429–2438).
Die erfindungsgemäßen anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptide werden in therapeutischen und Diagnoseverfahren und in Zusammensetzungen eingesetzt. Für therapeutische Verwendungen werden anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptide als löslicher Ligand für den humanen β-PDGF-Rezeptor verwendet, wobei der Rezeptor maskiert wird oder anderweit PDGF-Moleküle von einer Bindung an den Rezeptor inhibiert werden, so dass die unerwünschte Zellmigration und -proliferation inhibiert wird.
Für Arzneimittel werden die hier beschriebenen erfindungsgemäßen anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptide an eine Einzelperson mit einer PDGF-vermittelten Zellproliferationsstörung verabreicht. In therapeutischen Anwendungen werden Zusammensetzungen in einer Menge an einen Patienten verabreicht, die ausreicht, um die Zellrezeptoren wirksam zu blockieren und dadurch die Zellproliferation und ihre Symptome und/oder Komplikationen zu heilen oder zumindest teilweise aufzuhalten. Eine Menge, die ausreicht, um dies zu erreichen, wird als "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Die Mengen, die für diese Verwendung wirksam sind, hängen z. B. von der Natur der anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptid-Zusammensetzung, der Art und Weise der Verabreichung, dem Stadium und der Schwere der zu behandelnden Krankheit, dem Gewicht und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten und dem Urteil des verschreibenden Arztes ab, liegen im Allgemeinen aber im Bereich von etwa 0,01 mg/kg bis etwa 100,0 mg/kg Antikörper pro Tag, wobei Dosierungen von etwa 0,1 mg/kg bis etwa 10,0 mg/kg Antikörper pro Tag häufiger verwendet werden. Es muss berücksichtigt werden, dass die anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptide und -peptid-Zusammensetzungen, die sich davon ableiten, bei schwerwiegenden Krankheitzuständen, d. h. lebensbedrohlichen oder möglicherweise lebensbedrohlichen Zuständen, verwendet werden können. In solchen Fällen ist es möglich und kann es vom behandelnden Arzt als wünschenswert empfunden werden, dass erhebliche Überschüsse dieser Zusammensetzungen verabreicht werden. Folglich sind humane monoklonale Antikörper gegen den PDGF-Rezeptor oder im Wesentlichen humane monnklonale Antikörper gegen den erfindungsgemäßen PDGF-Rezeptor unter diesen Umständen besonders bevorzugt.
Die Zusammensetzungen können nach der Entscheidung des behandelnden Arztes mit den Dosismengen und -mustern einzeln oder mehrfach verabreicht werden. Auf jeden Fall sollten die pharmazeutischen Formulierungen eine Menge des erfindungsgemäßen anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptids bereitstellen, die ausreicht, um den Patienten wirksam zu behandeln. Die Verabreichung sollte bei der ersten Indikation von unerwünschter Zellproliferation oder kurz nach der Diagnose begonnen und fortgeführt werden, bis die Symptome im Wesentlichen und über einen Zeitraum danach gelindert sind. In gut begründeten Krankheitsfällen sind Initialdosen, gefolgt von Erhaltungsdosen, erforderlich.
Die Arzneimittel zur therapeutischen Behandlung sind zur parenteralen, topischen, oralen oder lokalen Verabreichung bestimmt. Vorzugsweise werden die Arzneimittel parenteral, z. B. intravenös, subkutan, intradermal oder intramuskulär verabreicht. Folglich werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung bereitgestellt, welche eine Lösung des anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptids enthalten, das in einem verträglichen Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger, gelöst oder suspendiert ist. Verschiedene wässrige Träger können verwendet werden, z. B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Kochsalzlösung, 0,3% Glycin, Hyaluronsäure und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche, bekannte Sterilisationsverfahren sterilisiert werden oder können steril filtriert werden. Die so erhaltenen wässrigen Lösungen können, so wie sie sind, zur Verwendung verpackt werden oder lyophilisiert werden, wobei das lyophilisierte Präparat vor der Verabreichung mit einer sterilen Lösung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können erforderliche pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe enthalten, um sie physiologischen Bedingungen anzugleichen, wie pH-Einstell- und -Puffermittel, Tonizitätseinstellmittel, Benetzungsmittel und dergleichen, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlactat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorbitanmonolaurat, Triethanolaminoleat usw.
Die Konzentration der erfindungsgemäßen anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptide in den pharmazeutischen Formulierungen kann weit variieren, d. h. von weniger als etwa 1 Gewichtsprozent (Gew.-%), üblicherweise bei oder mindestens etwa 10–15 Gew.-% bis zu 50 Gew.-% oder mehr, und wird hauptsächlich durch Flüssigkeitsvolumen, Viskositäten usw. nach der ausgewählten bestimmten Form der Verabreichung ausgewählt.
Folglich könnte ein typisches Arzneimittel zur intravenösen Infusion aus 250 ml steriler Ringer-Lösung und 100 mg anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptid bestehen. Gegenwärtige Verfahren zur Herstellung parenteral verabreichbarer Verbindungen sind dem Fachmann bekannt oder ersichtlich und werden zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Science, 17. Aufl., Mack Publishing Company, Easton, PA (1985) ausführlich beschrieben.
Die anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptide und deren Fragmente können auch über Liposome verabreicht werden. Die anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptide können dazu dienen, die Liposomen auf bestimmte Gewebe oder Zellen zu richten, die den humanen β-PDGF-Rezeptor aufweisen. Liposomen schließen Emulsionen, Schäume, Micellen, unlösliche Monolagen, Flüssigkristalle, Phospholipiddispersionen, Lamellenschichten und dergleichen ein. Bei diesen Präparaten wird das abzugebende Immunglobulinpolypeptid oder -fragment als Teil des Liposoms alleine oder in Verbindung mit einem Molekül eingebracht, welches zum Beispiel zu den Zielzellen toxisch ist. Eine Liposomensuspension, die ein Immunglobulinpolypeptid enthält, kann in einer Dosis, welche unter anderem nach der Art und Weise der Verabreichung, des abzugebenden Peptids und dem Stadium der zu behandelnden Erkrankung intravenös, lokal, topisch usw. verabreicht werden.
Für feste Zusammensetzungen der erfindungsgemäßen anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptide können herkömmliche nichttoxische feste Träger verwendet werden, welche zum Beispiel Arzneibuchqualitäten von Mannit, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Talkum, Cellulose, Glukose, Saccharose, Magnesiumcarbonat und dergleichen einschließen. Zur oralen Verabreichung wird eine pharmazeutisch verträgliche nichttoxische Zusammensetzung durch das Einbringen eines der normalerweise verwendeten Excipienten, wie jener vorher aufgeführten Träger, und allgemein 10–95% des Wirkstoffes, d. h. eines oder mehrerer anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptide und insbesondere bevorzugt bei einer Konzentration von 25%–75% hergestellt.
Für Diagnosezwecke können die anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptide entweder markiert oder nichtmarkiert sein. Eine Markierung ist ein Stoff, der ein detektierbares Signal durch eines von verschiedenen Verfahren hervorruft, die bekannt sind und von denen auf dem Fachgebiet berichtet wird. Die erfindungsgemäßen Immunglobulinpolypeptide selbst können direkt markiert werden. In einer anderen Ausführungsform können unmarkierte Antikörper, die in der Erfindung eingeschlossen sind, in Verbindung mit anderen markierten und die erfindungsgemäßen anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptide erkennenden Antikörpern (zweiten Antikörpern) verwendet werden. Zum Beispiel können markierte Antikörper, die für die konstanten Regionen der anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptide spezifisch sind, verwendet werden, um das an der Probe gebundene Immunglobulinpolypeptid zu detektieren.
Eine breite Vielzahl von Markierungen kann verwendet werden, wie Radionuklide, fluoreszierende Stoffe, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzymcofaktoren, Enzyminhibitoren, Liganden (insbesondere Haptene) usw. Zahlreiche Arten von Immunassays sind verfügbar und sind dem Fachmann bekannt.
Die erfindungsgemäßen anti-PDGF-Rezeptor-Immunglobulinpolypeptide und deren Fragmente können in verschiedenen Immunassays zum Detektieren des PDGF-Rezeptors in physiologischen Proben verwendet werden. Derartige Immunassayverfahren können Flüssigphasenimmunassays und Westernblot-Analyse, kompetitive und nichtkompetitive Proteinbindungsassays, heterogene Enzym-Immunassays (enzyme-linked immunosorbant assays) (ELISA) und andere üblicherweise verwendete und in der wissenschaftlichen und Patentliteratur verbreitet beschriebene und viele kommerziell verwendete Assays einschließen.
Derartige Immunglobuline und Peptide können ebenso in immunhistochemischen Anfärbungen durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren verwendet werden.
Das folgende Beispiel wird zur Veranschaulichung und nicht als Beschränkung dargestellt.
Beispiel
Materialien
PDGF-BB wurde von Amgen bezogen. Der monoklonale anti-Phosphotyrosin-Antikörper (MAb) PY20 wurde von ICI gekauft. DMEM, RPMI 1640, F12, Kälber serum, Penicillin-Streptomycin-Lösung, G418-Neomycin, 200 mM Glutamin, 1 M HEPES, Natriumpyruvat (11 mg/ml) und Phosphat-gepufterte Kochsalzlösung (PBS) waren von GIBCO. Das fötale Kälberserum (FCS) und der monoklonale Antikörper-Subtyping-Kit waren von Hyclone. Tris, Natriumphosphat, Natriumborat, Essigsäure, Natriumpyrophosphat, Natriumfluorid, Dithiothreitol (DTT), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), EGTA, Natriumdodecylsulfat (SDS), Natriumorthovanadat, Natriumchlorid (NaCl), Zitronensäure, Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Rinderserumalbumin (BSA), Triton X100, Tween 20, 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonsäure (ABTS) und Wasserstoffperoxid waren von Sigma. Ziege-anti-Mausperoxidase und Hypoxanthinthiamin (HT) waren von Boehringer Mannheim. Gelatine, ungefärbte Proteinmolekulargewichtmarker und Nitrocellulose waren von BioRad. Vorgefärbte -Proteinmarker mit hohem Molekulargewicht waren von BRL. Protein A-Sepharose CL4B-, Protein G-Sepharose CL4B-, Immunopure^TM-Bindungspuffer-, F(ab')₂- und Fab-Herstellungskits waren von Pierce. Vorgepackte Säulen PD10 waren von Pharmacia. ¹²⁵I-Protein A und ¹⁴C-Molekulargewichtsmarker waren von Amersham.
¹²⁵I-Diiodo-Bolton-Hunter-Reagenz war von New England Nuclear. Methanol war von Burdick-Jackson. Gewebekulturbedarf war von Costar. AG01523B-Zellen wurden von ATCC erhalten. HR5-Zellen wurden freundlicherweise von J. A. Escobedo (USCF) bereitgestellt. Primäre glatte Muskelzellen der Arferia brachialis des Pavians wurden großzügigerweise von J. Anderson und S. Hanson (Emory Univ.) bereitgestellt.
Methoden
Zellkultur.
NIH 3T3-Zellen wurden routinemäßig in DMEM gehalten, das 10% fötales Kälberserum, 1x Penicillin-Streptomycin, 2 mM Glutamin und Natriumpyruvat (0,11 mg/ml) enthielt. CHO-Zellen, die die extrazelluläre Domäne (pΔ1-5) oder den vollständigen PDGF-β-Rezeptor (HR5) exprimierten, wurden in RPMI gezüchtet, das 10% FCS, 1x Penicillin-Streptomycin, 2 mM Glutamin, Natriumpyruvat (0,11 mg/ml) und G418 (200 μg/ml) enthielt. Humane Vorhautfibroblasten (AG01523B) wurden in DMEM gezüchtet, das 10% FCS, 1x Penicillin-Streptomycin, 2 mM Glutamin und Natriumpyruvat (0,11 mg/ml) enthielt. Monoklonale Hybridomazellen wurden in 50 : 50 DME : RPMI gehalten, das 20% FCS, 1x Penicillin-Streptomycin, 2 mM Glutamin, Natriumpyruvat (0,1 mg/ml), 1x HT und 10% Makrophagen-konditioniertes Medium enthielt.
Konstruktion von Zeltlinien, die den trunkierten humanen PDGF-β-Rezeptor exprimieren.
Trunkierung der humanen PDGF-β-Rezeptor-cDNA wurde durch Oligonukleotidgerichtete Deletionsmutagenese durchgeführt. Oligonukleotid-gerichtete in vitro-Mutagenese wurde gemäß einem modifizierten Verfahren von Kunkel et al., (1987) Meth. Enzymol., 154: 367–382) durchgeführt.
Zuerst wurde ein 3,9 kB EcoRI-HindIII-cDNA-Fragment der gesamten kodierenden Region des humanen PDGF-β-Rezeptors (Reste –32 bis 499) in die EcoRIund HindIII-Stellen vom M13mp18-erzeugenden Vektor mp18PR subkloniert (T. Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual („Molekulares Klonieren: Ein Labor-Handbuch"), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Oligonukleotide wurden entworfen, um die Teile der humanen PDGF-β-RezeptorcDNA zu deletieren, die die Aminosäuren 499–1074 (PRΔ1; GTG TGA GGA ACG GGA AAT TCA TCG AAG GAC ATC CCC CGAC) oder die Aminosäuren 384-1074 (PRΔ2; GGA AGG TCG ATG TCT AGT TAA TCG AAG GAC ATC CCC CGAC) kodieren (1.). Ein Stopcodon wurde nach Rest 499 (PRΔ1) oder Rest 384 (PRΔ2) eingebracht. Die Subklonierung wurde durch Restriktionsenzym-Verdau-Analyse und Didesoxykettenabbruchsequenzierung überprüft (F. Sangen et al., (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463–5467).
Die modifizierten PDGF-β-Rezeptorpolypeptide wurden in die EcoRI- und HindIII-Stellen des Expressionsvektors PBJ1 subkloniert (A. Lin et al., (1990) Science, 249: 677–679) und mit dem Vektor pSV2Neo (P. J. Southern und P. Berg, (1982) J. Mol. Appl. Gen., 1: 327–341) in einem Verhältnis von 1 : 10 in CHO-K1-Zellen nach dem Verfahren der Lipofectin-Reagenz-Aufnahme (P. L. Felgner et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413–7417) cotransfiziert.
Transfizierte Zellen wurden auf G418-Neomycinresistenz ausgewählt, und einzelne Klone wurden isoliert und bei gleicher Zelldichte auf die Expression großer Mengen des extrazellulären PDGF-β-Rezeptors in Serum-freiem Medium abgesucht. Die Expression der modifizierten extrazellulären PDGF-β-Rezeptorproteine wurde durch Westernblotanalyse unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchenserums (Ab 1-3-5, siehe 1) bestimmt, das gegen ein synthetisches Peptid gezogen wurde, das sich auf die Reste 51–68 des humanen PDGF-Rezeptors bezieht (SVLTLTNLTGLDTGEYFC SEQ ID NR. 3). Die rekombinanten Klone pΔ1-5 (die den vollständigen extrazellulären PDGF-Rezeptor exprimieren) und pΔ2-7 (die die Domänen 1–4 des extrazellulären PDGF-Rezeptors exprimieren) wurden für die nachfolgende Proteinproduktion verwendet.
Herstellung von MAbs gegen den humanen PDGF-ß-Rezeptor.
Antikörper wurden, wie von Harlow und Lane beschrieben, entwickelt (1988, In: Antibodies: A Laboratory Manual („Antikörper: Ein Labor-Handbuch"), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY}.
Mäuse wurden mit teilweise gereinigter extrazellulärer Domäne des PDGF-β-Rezeptors (pΔ1-5) unter Verwendung von 50–100 μg/Immunisierung) immunisiert. Der Titer des Antikörpers in den immunisierten Mäusen wurde unter Verwendung eines heterogenen Enzym-Immunassays (ELISA) wie folgt bestimmt. Immunolon 11-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden über Nacht bei 4°C mit teilweise gereinigter (10–15%) extrazellulärer Domäne des PDGF-β-Rezeptors beschichtet (200–300 ng/Vertiefung) Die restlichen Handhabungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Vertiefungen wurden 1 Stunde lang mit 0,05 M Tris, pH 7, das 100 mM NaCl und 0,5% Gelatine enthielt, geblockt. Die Platten wurden 2 Stunden lang mit verschiedenen Verdünnungen von Mausseren inkubiert, 5x mit Waschpuffer (0,05 M Tris, pH 7, 100 mM NaCl und 0,3% Gelatine) gewaschen und 1 Stunde lang mit Ziege-anti-Mausperoxidase (1 : 1000 in Waschpuffer) inkubiert. Die Platten wurden, wie vorher beschrieben, gewaschen und mit 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonsäure (ABTS, 1 mg/ml) in 0,1 M-Zitronensäure, 0,1 M Natriumdihydrogenphosphat, pH 4, das Wasserstoffperoxid enthielt (0,003% Endkonzentration), entwickelt. Die Extinktion bei 650 nm wurde bestimmt, und die Werte wurden mit den Werfen verglichen, die mit dem Protein erhalten wurden, das in einem ähnlichen Umfang von konditionierten Medien von CHO-Zellen gereinigt worden war, die mit dem pBJ-Vektor alleine transfiziert wurden.
Die Mäuse, die hohe Reaktivität zeigten, wurden getötet und die Milzen wurden isoliert. Milzzellen wurden entfernt und mit Myelomzellen P3X fusioniert, wie beschrieben (Harlow und Lane, ibid.). Hybridomzellen wurden unter Verwendung desselben ELISA abgesucht, und positive Hybridomzellen wurden kloniert und erneut abgesucht. Positive monoklonale Zellen wurden gezüchtet, und Bauchwasser wurde in Balb/c-Mäusen hergestellt, wie beschrieben (Harlow und Lane, ibid.). Gewebekulturmedien wurden verwendet, um die MAbs, wie durch den Hersteller angegeben, unter Verwendung des Subtyping-Kits von HyClone zu subtypisieren.
Reinigung der Antikörper.
Die Antikörper wurden auf Protein A-Sepharose CL4B wie folgt gereinigt. Bauchwasserflüssigkeit wurde in Immunopure^TM-Bindungspuffer (Pierce) 1 : 5 verdünnt und auf einer Protein A-Sepharose CL4B-Säule chromatographiert, die mit demselben Puffer equilibriert worden war. Der Durchfluss wurde gesammelt, und die Säule wurde mit Immunopure-Bindungspuffer gewaschen (10 Säulenvolumina). Die gebundenen IgGs wurden mit 0,1 M Glycin, pH 2,8 eluiert und in Röhrchen gesammelt, die 2 M Tris, pH 11 (40 μl/ml) als neutralisierendes Mittel enthielten. Die Peakproteinfraktionen wurden durch Messen der Extinktion bei 280 nm detektiert, vereinigt und in PBS dialysiert (2 Wechsel mit jeweils 4 1).
Produktion von proteolytischen F(ab')₂- und Fab-Fragmenten von MAb 2A1E2. F(ab')₂-Fragmente von MAb 2A1E2 wurden unter Verwendung des Immunopure- F(ab')₂-Herstellungskits (Pierce) nach den Herstelleranweisungen aus intaktem MAb hergestellt. Der monoklonale Antikörper 2A1E2 wurde mit immobilisiertem Pepsin 4 Stunden lang bei 37°C bei pH 4,2 inkubiert, und die unverdauten IgGund Fc-Fragmente wurden unter Verwendung von Protein A-Sepharose CL4B von den F(ab')₂-Fragmenten getrennt. Fab-Fragmente wurden unter Verwendung des Pierce-Immunopure-Fab-Herstellungskits in gleicher Weise hergestellt. Das IgG wurde mit immobilisiertem Papain 5 Stunden lang bei 37°C bei pH 7 inkubiert, und unverdaute IgG- und Fc-Fragmente wurden unter Verwendung von Protein A entfernt. Die Proben wurden nach enzymatischem Verdau durch SDS-PAGE analysiert, und der PDGF-β-Rezeptor-ELISA wurde verwendet, um einen Verlust von Antigenerkennung, wenn überhaupt einer bestand, zu bestimmen.
Immunpräzipitationsassay.
Immunpräzipitationen wurden durch eine Modifikation des Verfahrens von S. W: Kessler, (1981, Meth. Enzymol., 73: 442–471, welches hier durch Inbezugnahme eingeführt wird) durchgeführt. Wenn gereinigte pΔ1-5 oder pΔ2-7 verwendet wurden, wurde das Protein mit MAb entweder 2 Stunden lang bei Raumtemperatur oder 12 Stunden lang bei 4°C in Immunpräzipitations- (IP-) Puffer (40 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA und 1% Triton X100) inkubiert. Wenn der vollständige Rezeptor durch Immunpräzipitation gefällt wurde, dann wurden die Zellen, die den PDGF-β-Rezeptor exprimieren, in IP-Puffer solubilisiert, der 1 μM Natriumorthovanadat und 1 mM PMSF enthielt, und 8–12 Stunden lang bei 4°C mit dem MAb inkubiert. Dann wurden die Proben mit einer 50% Aufschlämmung eines 1 : 1 Gemisches von Protein A-Sepharose CL4B und Protein G-Sepharose CL4B (50–100 μl/Probe) inkubiert. Nach 1–2 Stunden bei 4°C wurde das Harz durch 3 Zyklen Zentrifugation und Resuspension in IP-Puffer gewaschen, und schließlich wurde das Harz in Laemmli-Probensolubilisierungspufter gekocht (50–100 μl/Probe) (1970, Nature, 227: 680–685).
Die Proben wurden auf einem 7%- oder 10%-Laemmli-Gel SDS-PAGE unterzogen und dann auf Nitrocellulose übertragen. Der Westernblot wurde in Blockpuffer (0,05 M Tris, pH 8, das 0,5% NaCl und 4% BSA enthielt) geblockt und mit dem primären Antikörper 12 Stunden lang bei 4°C inkubiert. Die Nitrocellulose wurde mit Blockpuffer gewaschen und 1–2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit¹²⁵I-Protein A (0,4 mCi/ml) inkubiert und auf einen Röntgenfilm belichtet.
Radioiodierung von PDGF-BB.
PDGF-BB wurde durch eine Modifikation des Bolton-Hunter-Verfahrens iodiert, das von Duan et al. (1991, J. Biol. Chem., 266: 413–418, welches hier durch Inbezugnahme eingeführt wird) beschrieben wurde. ¹²⁵I-Diiodo-Bolton-Hunter-Reagenz (1 mCi) wurde unter Stickstoff getrocknet. Dann wurde PDGF-BB (2,5 μg) 15 min lang bei 4°C zum ¹²⁵I-Diiodo-Bolton-Hunter-Reagenz in 10 μl 0,1 M Natriumborat (pH 8,5) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde 10 min lang bei 4°C mit 500 μl 0,1 M Natriumborat, 0,2 M Glycin, pH 8,5 gelöscht. Dieses Material wurde Gelfiltrations-Chromatographie auf einer PD10-Säule unterzogen, die vorher mit 0,3 M Essigsäure, die 1 mg/ml BSA enthielt, equilibriert. Die Peakfraktionen des radiomarkierten Proteins wurden unter Verwendung eines Gammazählers detektiert. Typischerweise betrug die spezifische Aktivität von iodiertem PDGF-BB 50000 Counts/ng.
Binden von ¹²⁵I-PDGF-BB an intakte HR5-Zellen. HR5-Zellen wurden 20 min lang bei 37°C mit PBS geerntet, das 2 mM EDTA enthielt. Gewaschene HR5-Zellen (1 × 10⁶ Zellen/100 μl) wurden 30 min lang bei Raumtemperatur in dreifacher Ausführung in Suspension mit verschiedenen Konzentrationen von MAb (oder F(ab')₂-oder Fab-Fragmenten) in PBS inkubiert, das 0,5% BSA enthielt. HR5-Zellen wurden 45 min lang bei Raumtemperatur mit ¹²⁵I-PDGF-BB (ungefähr 1 ng/Röhrchen) bei Fehlen (Gesamtbindung) oder in Gegenwart (unspezifische Bindung) von 100-fachem Überschuss von unmarkiertem PDGF-BB und Trägerprotein (Blutplättchen-armem Plasma, 50 μl) inkubiert. Das Endvolumen der Inkubation betrug 500 μl. Das Inkubationgemisch (400 μl) wurde auf Ficoll-paque (700 μl) geschichtet und zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Radioaktivität im Zellpellet wurde bestimmt.
Phosphorylierungsassay.
HR5-Zellen wurden zur Konfluenz in Platten mit 6 Vertiefungen wachsen gelassen, und primäre Zellen wurden in 100 mm-Schalen gezüchtet. Die Zellen wurden zweimal mit kaltem Serum-freiem DMEM gewaschen und 10 min lang auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden in doppelter Ausführung mit MAb 2A1E2 30–45 min lang auf Eis auf einem Rotationschüttler vorinkubiert, und dann wurde der Ligand PDGF-BB zu den Vertiefungen zugefügt, und die Inkubation wurde 1,5–2 Stunden lang fortgesetzt. Die Zellen wurden zweimal mit kaltem PBS gewaschen und entweder in Lysepuffer (100 mM Tris, pH 8, 30 mM Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumfluorid, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1% SDS, 100 mM DTT) oder in IP-Puffer, die beide 1 mM PMSF und 1 μM Natriumorthovanadat enthielten, solubilisiert. Die Proben wurden dann vor der Elektrophorese weiter verarbeitet.
Mitogenese in humanen Vorhautfibroblast-AG01523B-Zellen und glatten Muskelzellen des Pavians.
Humane Vorhautfibroblast-AG01523B-Zellen und glatte Muskelzellen des Pavians wurden zur Konfluenz in Platten mit 96 Vertiefungen wachsen gelassen. Glatte Muskelzellen des Pavians wurden durch Inkubation über Nacht mit DMEM, das 0,5% Kälberserum enthielt, ruhig gehalten. Die Zellen wurden dann in dreifacher Ausführung mit verschiedenen Konzentrationen von MAb 2A1E2 in Gegenwart von PDGF-BB 18 Stunden lang bei 37°C, gefolgt von 5 Stunden lang bei 37°C mit 2 μCi/Vertiefung ³H-Thymidin inkubiert. Primäre glatte Muskelzellen des Pavians zur Kontrolle wurden parallel mit einem unspezifischen MAb inkubiert, und Kontroll-AG01523B-Zellen wurden mit einem nicht-inhibierenden anti-PDGF-β-Rezeptor-MAb (4C5C8) inkubiert. Die Vertiefungen wurden dann mit eiskalter 5% TCA (2 × 250 μl) gewaschen und mit 0,25 N NaOH (2 × 100 μl) solubilisiert. Die solubilisierten Proben wurden in Szintillationfläschchen überführt, und die Radioaktivität wurde bestimmt.
Dimerisierungsassay.
Konfluente HR5-Zellen wurden, wie vorstehend beschrieben, in 100 mm-Schalen gezüchtet. Die Zellen wurden zweimal mit kaltem PBS gewaschen und 1 Stunde lang bei 4°C mit verschiedenen Konzentrationen von MAb 2A1E2 in PBS, das BSA (1,5 mg/ml) und 25 mM Hepes enthielt, inkubiert. PDGF-BB wurde zu, den Zellen zugefügt, und die Inkubation wurde 2 Stunden lang bei 4°C fortgesetzt. Die Zellen wurden zweimal mit kaltem PBS gewaschen und 30 min lang bei 4°C mit dem Vernetzungsmittel BS³ (0,75 mg/Platte) in PBS, das 25 mM Hepes enthielt, inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Verdünnung in Löschpuffer (0,025 M Tris, pH 7,4, das 150 mM NaCl enthielt; 10 ml/P1atte) abgebrochen. Die Zellen wurden 20 min lang bei 4°C in IP-Puffer, der 1 mM PMSF und 100 μM Natriumorthovanadat (0,5 ml/Platte) enthielt, extrahiert. Zelllysate wurden durch Immunpräzipitation über Nacht bei 4°C unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern gegen den humanen β-Rezeptor AB (AB88, 1 : 500 Verdünnung) gefällt. Dann wurde Protein A CL4B (60 μl einer 50% Aufschlämmung) zu jeder Probe zugefügt. Nach 1 Stunde bei 4°C wurden die Kügelchen nacheinander mit PBS, das 0,5% NP40 enthielt, mit 0,5 M Lithiumchlorid, das 0,5% NP40 enthielt, mit 0,5 M Lithiumchlorid und schließlich mit Wasser gewaschen. Die Proben wurden mit Laemmli-Probensolubilisierungspufter solubilisiert und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 3%–8% Gradientengel unterworfen, gefolgt von Westernübertragung auf Nitrocellulose. Die Westernblots wurden über Nacht bei 4°C entweder mit anti-Phosphotyrosin-MAb (1 : 1000) oder mit Ab88 (1 : 500 Verdünnung) inkubiert, gefolgt von ¹²⁵I-Protein A (0,15 μCi/ml) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur. Die Westernblots wurden dann auf einen Röntgenfilm belichtet.
Ergebnisse
Eigenschaften von MAb 2A1E2.
MAb 2A1E2 ist ein monoklonaler IgG₁-Antikörper. Westernanalyse zeigt, dass MAb 2A1E2 nichtreduzierten humanen PDGF-β-Rezeptor erkennt (2, Abschnitt A, Spur 4), reduziertes Protein aber nicht erkennt (2, Abschnitt A, Spur 1). MAb 2A1E2 fällt den vollständigen extrazellulären Rezeptor (pΔ1-5: Reste 1-499) aus der Lösung (2, Abschnitt C, Spur 3) durch Immunpräzipitation. Wenn jedoch gereinigtes pΔ2-7 (ohne Domäne 5; Reste 1–384) das Antigen ist, gibt es keine Reaktivität (2, Abschnitt B, Spur 2).
Mengenabhängige Inhibierung von ¹²⁵I-PDGF-BB, das an HR5-Zellen durch MAb 2A1E2 bindet.
Wenn HR5-Zellen (CHO-K-Zellen, welche den vollständigen humanen PDGF-β-Rezeptor exprimieren) zuerst mit MAb 2A1E2 inkubiert werden, gefolgt von ¹²⁵I-PDGF-BB, wird wesentliche (48,1%) Inhibierung bei einer Konzentration von bis zu 0,1 nM MAb beobachtet, verglichen mit den Zellen, die nicht mit MAb 2A1E2 behandelt wurden. Wenn 1 nM oder größere Konzentrationen von MAb 2A1E2 verwendet werden, gibt es 100% Inhibierung der Bindung des Liganden an den vollständigen PDGF-β-Rezeptor auf den Zellen (3, Abschnitt A). Wenn 200 nM eines verschiedenen, PDGF-β-Rezeptor nicht-inhibierenden MAb (4C5C8) in der Vorinkubation verwendet wird, beträgt der Inhibierungswert nur 36,1%. Dies ist mit der Wirkung von 200 nM eines nicht-relevanten MAb (anti-IIb/IIIa) vergleichbar (19,18% Inhibierung). Die Menge der ¹²⁵I-PDGF-BB-Bindung in Gegenwart von 1 nM MAb 2A1E2 ist zu der Menge der Liganden-Bindung äquivalent, die in Gegenwart eines 1500-fachen Überschusses von unmarkiertem PDGF-BB erkennbar war, (3, Abschnitt A) oder der Menge der Bindung des Liganden an nichttransfizierte CHO-Zellen, die den humanen PDGF-Rezeptor (Daten nicht gezeigt} nicht exprimieren.
Um festzustellen, ob die Inhibierung, die mit MAb 2A1E2 erkennbar war, an der sterischen Hinderung lag, stellten wir F(ab')2- und Fab-Fragmente des MAb her. Diese proteolytischen Fragmente des Antikörpers erkannten den PDGF-ß-Rezeptor im ELISA (Daten nicht gezeigt) noch immer, obwohl ihre Aktivität etwas vermindert wurde. Wenn diese in Bindungsassays mit radiomarkiertem Liganden verwendet wurden, stellten wir fest, dass die Antikörperfragmente die Bindung von ¹²⁵I-PDGF-BB an den vollständigen PDGF-β-Rezeptor auf HR5-Zellen auf eine konzentrationsabhängige Art und Weise noch inhibierten (3, Abschnitt B). Jedoch war vollständige Inhibierung mit 10 nM MAb 2A1E2 F(ab')₂- oder Fab-Fragmenten erkennbar, wohingegen 1 nM intakter Antikörper Bindung vollständig inhibierte. Bindung des Liganden in Gegenwart von 1 nM F(ab')₂-Fragmenten wur de um 64,5% inhibiert, und Bindung in Gegenwart von 1 nM Fab-Fragmenten wurde um 50% inhibiert.
Inhibierung der Phosphorylierung durch MAb 2A1E2.
Wie in 4 gezeigt ist, inhibierte MAb 2A1E2 spezifisch PDGF-induzierte Phosphorylierung in HR5-Zellen auf konzentrationsabhängige Art und Weise, wobei ungefähr 50% Inhibierung bei einer Konzentration von 1,3 nM (Spur 4) auftrat und 100% Inhibierung bei 13,3 nM MAb 2A1E2 (Spur 5) auftrat. Nichtrelevanter Kontroll-MAb (anti-IIb/IIIa) hatte keine Wirkung (Spur 3), und MAb 4C5C8, welcher auch gegen den humanen PDGF-ß-Rezeptor entwickelt wurde, aber ein anderes Epitop erkennt, hatte keine Wirkung auf die Ligand-induzierte Phosphorylierung (Spur 8).
Wirkung von MAb 2A1 E2 auf PDGF-BB-induzierte Dimerisierung des humanen PDGF-β-Rezeptors.
Behandlung von HR5-Zellen mit PDGF-BB ergab Ligand-vermittelte Phosphorylierung (5, 180 kDa-Protein in den Spuren 1–6) und Dimerisierung (5, 390 kDa-Protein in den Spuren 2 und 6) des PDGF-β-Rezeptors. Wenn HR5-Zellen zuerst mit MAb 2A1E2 und dann mit PDGF-BB vorinkubiert wurden, wurde die Dimerisierung bei allen getesteten Konzentrationen inhibiert (5, Spuren 3, 4 und 5). Diese Daten zeigen an, dass die Bindung von MAb 2A1E2 an den Rezeptor Ligandbindung und Rezeptor-Dimerisierung ausschließt.
Inhibierung der Mitogenese durch MAb 2A1E2.
Wie in 6 gezeigt ist, inhibiert MAb 2A1E2 die PDGF-BB-induzierte Mitogenese in humanen Vorhautfibroblastenzellen AG01523B auf konzentrationsabhängige Art und Weise, wobei die maximale Inhibierung (69,55%) bei einer Konzentration von 1,3 μM auftritt. Wenn ein nicht-inhibierender MAb, 4C5C8, verwendet wurde, ermittelten wir keine wesentliche Inhibierung der Mitogenese. Die Erhöhung der Konzentration von MAb 2A1E2 verbesserte den Grad der Inhibierung nicht, haupt sächlich weil diese Zellen auch PDGF-α-Rezeptor exprimieren (Daten nicht gezeigt), welcher durch 2A1E2 nicht gebunden oder inhibiert wird.
Wir bestimmten auch die Wirkung von verschiedenen Konzentrationen von MAb 2A1E2 auf primäre glatte Muskelzellen von der Pavianarterie. Die PDGF-BB-vermittelte PDGF-Rezeptor-Phosporylierung in glatten Muskelzellen der Pavianarterie wurde durch 200 nM und 20 nM MAb 2A1E2 inhibiert (7, Spuren 4 beziehungsweise 5).
Wie aus 8 erkennbar ist, inhibiert 1 nM MAb 2A1E2 den ³H-Thymidin-Einbau in Gegenwart von 1–2 ng/ml PDGF-BB um 90%, und 25 nM MAb inhibiert die Mitogenese um 80% bei Ligandkonzentrationen, die im Bereich von 1–10 ng/ml liegen. Konzentrationen von MAb 2A1E2 von größer als 250 nM inhibieren die Mitogenese um 90% bei allen getesteten Konzentrationen des Liganden. Wenn nicht-relevante MAbs verwendet werden, gibt es keine wesentliche Wirkung auf die Mitogenese in glatten Muskelzellen des Pavians.
Zusammenfassend gesehen haben wir einen monoklonalen Antikörper, MAb 2A1E2, offenbart, der für den humanen PDGF-β-Rezeptor hochspezifisch ist. MAb 2A1E2 inhibiert die Bindung von PDGF an den humanen β-PDGF-Rezeptor bei nanomolaren Konzentrationen, und inhibiert folglich die Rezeptoraktivierung, wie durch Inhibierung der Ligand-vermittelten Phosphorylierung und Dimerisierung angezeigt wird. Der Antikörper inhibiert die Mitogenese in vitro bei mikromolaren Konzentrationen. Die proteolytischen Fragmente des MAb behalten die inhibierende Funktion, wie durch die Inhibierung der ¹²⁵I-PDGF-BB-Bindung gemessen wird (3A).
Es gibt eine spezifische und wesentliche Inhibierung der Ligand-induzierten Autophosphorylierung des PDGF-β-Rezeptors (4), bei Konzentrationen von bis zu 1,3 nM MAb 2A1E2. Folglich haben wir vollständige Inhibierung der PDGF-induzierten Mitogenese in HR5-Zellen (Daten nicht gezeigt) bei 0,1 μM MAb 2A1E2 festgestellt, und in humanen Vorhautfibroblastenzellen (AG01523B) wird 70% Inhibierung bei einer Konzentration von 1 μM MAb 2A1E2 erzielt.
MAb 2A1E2 wurde auch auf Kreuzreaktivität mit glatten Muskelzellen der Arteria brachialis des Pavians getestet. Die PDGF-BB-induzierte Phosphorylierung ( 7) und Mitogenese (8) wurde bis zu 80% durch 20–25 nM MAb 2A1E2 inhibiert. Der monoklonale Antikörper 2A1E2 kreuzreagiert nicht mit PDGF-Rezeptoren von Hund, Ratte, Maus oder Schwein, und kreuzreagiert auch nicht mit dem humanen α-PDGF-Rezeptor (Daten nicht gezeigt).
Die vorliegende Erfindung stellt ein Immunglobulinpolypeptid bereit, das spezifisch an den humanen β-PDGF-Rezeptor bindet. Der Antikörper ist in der Lage, die PDGF-induzierte Mitogenese von Zellen zu inhibieren, die den humanen β-PDGF-Rezeptor auf der Zellobertläche aufweisen.
Es sollte selbstverständlich sein, dass die vorstehende Beschreibung veranschaulichend und nicht beschränkend sein soll. Viele Ausführungsformen sind für den Fachmann beim Nachprüfen der vorstehenden Beschreibung erkennbar. Der Schutzbereich der Erfindung sollte deshalb nicht mit Bezug auf die vorstehende Beschreibung festgelegt werden, sondern sollte statt dessen mit Bezug auf die angehängten Patentansprüche, zusammen mit dem vollen Schutzbereich von Äquivalenten, zu welchen derartige Patentansprüche berechtigt sind, festgelegt werden.

Claims

Verwendung eines anti-PDGF Beta-Rezeptor monoklonalen Antikörpers oder eines Antigen bindenden Fragmentes des Antikörpers, welche an ein Epitop in einer extrazellulären Ig-ähnlichen Domäne des PDGF Beta-Rezeptors binden und die Bindung von PDGF an den PDGF Beta-Rezeptor inhibieren, zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung einer PDGFvermittelten Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a. vasculären proliferativen Phänomenen und Fibrosen; b. vasculären Verengungen bei Venen-Verpflanzungen; c. vasculären Verengungen aufgrund von beschleunigter Glatte-Muskel Zellmigration und Proliferation in transplantierten Organen; d. nichtvasculären fibrotischen Prozessen; e. Restenosis.
Verwendung des anti-PDGF Rezeptor Antikörpers oder des Antigen bindenden Fragmentes des Antikörpers, welche die Bindung von PDGF an den PDGF Rezeptor inhibieren, zur Herstellung eines Medikaments, das zur Verabreichung an ein Säugetier vor einer akuten Gefäßverletzung, Venen-Verpflanzung oder Organtransplantation geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Gefäßverletzung aufgrund von Plaque-Entfernung entsteht.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Plaque-Entfernung die Angioplastie oder Atherektomie umfasst.
Verwendung eines anti-PDGF Rezeptor Antikörpers nach Anspruch 1 oder eines Antigen bindenden Fragmentes des Antikörpers, welche die Bindung von PDGF an den PDGF Beta-Rezeptor inhibieren, zur Herstellung eines Medikaments, das zur Verabreichung an ein Säugetier nach einer akuten Gefäßverletzung, Venen-Verpflanzung oder Organtransplantation geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Gefäßverletzung aufgrund von Plaque-Entfernung entsteht.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Plaque-Entfernung die Angioplastie oder Atherektomie umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–7, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei der monoklonale Antikörper ein chimärischer Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei der chimärische Antikörper ein „humanisierter" Antikörper ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1–7, wobei der Antikörper ein single-chain Antikörper ist.
Isolierte Zelllinie, bezeichnet als ATCC No. HB10938.
Monoklonaler Antikörper, welcher von der Zelllinie ATCC No. HB10938 produziert wird.
Im Wesentlichen gereinigtes Immunglobulin-Polypeptid oder ein Antigen bindendes Fragment des Polypeptids, das spezifisch an eine extrazelluläre Domäne des humanen Typs Beta platelet-derived growth factor Rezeptor (βPDGF-R) bindet, wobei das Immunglobulin-Polypeptid oder das Antigen bindende Fragment des Polypeptids nicht spezifisch an den humanen αPDGF-R bindet und die spezifische Bindung des Polypeptides oder Fragmentes an den humanen βPDFG-R einen oder mehrere der folgenden Effekte hat: i) Inhibieren von PDGF-induzierter βPDGF-R Phosphorylierung; ii) Inhibieren von PDGF-induzierter Dimerisierung des βPDGF-R; iii) Inhibieren von PDGF-induzierter Mitogenese von Zellen, die den humanen βPDGF-R aufweisen; iv) Inhibieren von PDGF-induzierter Chemotaxis und Migration von Zellen, die βPDGF-R aufweisen; und v) Inhibieren von PDGF BB oder AB, die an den βPDGF-R binden, wobei das Polypeptid der monoklonale Antikörper 2A1E2 ist.
Im Wesentlichen gereinigtes Immunglobulin-Polypeptid oder ein Antigen bindendes Fragment des Polypeptids, welches spezifisch an den humanen βPDGF-R bindet, wobei das Binden des Polypeptides die folgenden Effekte bei Zellen hat, die den βPDGF-R aufweisen: a. Inhibieren von PDGF-induzierter βPDGF-R Phosphorvlierung in vitro mit dem Immunglobulin-Polypeptid oder Antigen bindenden Fragment mit einer Konzentration von 0,13 nanomolar, gefolgt von 100 Nanogramm pro Milliliter PDGF BB, unter Bedingungen, in welchen das Immunglobulin-Polypeptid oder Antigen bindende Fragment produziert wird, wobei das Polypeptid der monoklonale Antikörper 2A1E2 ist.
Methode zur Produktion von einem im Wesentlichen gereinigten Immunglobulin-Polypeptid oder von einem Antigen bindenden Fragment des Polypeptids, die die folgenden Schritte umfasst: i) Ziehen einer Zelllinie, transformiert mit einer isolierten Nukleinsäure-Sequenz, die für ein im Wesentlichen gereinigtes Immunglobulin-Polypeptid oder ein Antigen bindendes Fragment des Polypeptids kodiert nach Anspruch 14; ii) Ernten des produzierten Immunglobulin-Polypeptides oder Fragmentes, wobei die Zelllinie eine Hybridoma-Zelllinie ATCC No. HB10938 ist.
Methode zur Produktion von einem im Wesentlichen gereinigten Immunglobulin-Polypeptid oder von einem Antigen bindenden Fragment des Polypeptids, die die folgenden Schritte umfasst: i) Ziehen einer Zelllinie, transformiert mit einer isolierten Nukleinsäure-Sequenz, die für ein im Wesentlichen gereinigtes Immunglobulin-Polypeptid oder ein Antigen bindendes Fragment des Polypeptids kodiert nach Anspruch 15; ii) Ernten des produzierten Immunglobulin-Polypeptides oder Fragmentes, wobei die Zelllinie eine Hybridoma-Zelllinie ATCC No. HB10938 ist.