JP2640568B2 - タイプα血小板由来増殖因子レセプター遺伝子 - Google Patents
タイプα血小板由来増殖因子レセプター遺伝子Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は血小板由来増殖因子（Platelet−Derived Gr
owth Factor（PDGF））のためにレセプター蛋白質をコ
ードし、特にヒトの血小板中に見出されるPDGFの主要な
型に好んで結合するレセプター蛋白質をエンコードする
ヒト遺伝子に関する。また、本発明は組換細胞によるこ
のようなPDGFレセプター遺伝子生成物の合成及びこれら
のレセプターをエンコードするDNAの同定及びクローニ
ングによって可能とされた他のいくつかの新規生成物の
製造及び使用にも関する。
owth Factor（PDGF））のためにレセプター蛋白質をコ
ードし、特にヒトの血小板中に見出されるPDGFの主要な
型に好んで結合するレセプター蛋白質をエンコードする
ヒト遺伝子に関する。また、本発明は組換細胞によるこ
のようなPDGFレセプター遺伝子生成物の合成及びこれら
のレセプターをエンコードするDNAの同定及びクローニ
ングによって可能とされた他のいくつかの新規生成物の
製造及び使用にも関する。
背景技術 成長因子およびそのレセプターをエンコードする遺伝
子は正常な細胞増殖及び成長の調節に密接な関係を有す
る。このような遺伝子の発現に影響する遺伝的変化が悪
性化を伴う細胞増殖の変化の一因となる可能性を示す証
拠も増加している。若干の腫瘍遺伝子の正常な同族体が
チロシンキナーゼ活性を有する膜伸張成長因子をエンコ
ードする（J.Downward et al.,Science 307,521（198
4）;A.Ullrich et al.,Science 309,418（1984）;C.J.S
herr et al.,Cell 41,665（1985）;L.Coussens et al.,
Nature 320,277（1986））。他の腫瘍遺伝子は、成長因
子により活性化された細胞増殖径路でも同じく作用して
いるように思われる（J.M.Bishop,Science 235,305（19
85）;R.A.Weinberg,Science 230,770（1985）;S.K.Hank
s,A.M.Quinn,T.Hunter,Science 241,42（1988））。か
くして、成長因子調節系一般の知識の増加は、正常な成
長調節および腫瘍形成の双方に決定的に関与する遺伝子
を更に理解するのに役立つことが期待される。
子は正常な細胞増殖及び成長の調節に密接な関係を有す
る。このような遺伝子の発現に影響する遺伝的変化が悪
性化を伴う細胞増殖の変化の一因となる可能性を示す証
拠も増加している。若干の腫瘍遺伝子の正常な同族体が
チロシンキナーゼ活性を有する膜伸張成長因子をエンコ
ードする（J.Downward et al.,Science 307,521（198
4）;A.Ullrich et al.,Science 309,418（1984）;C.J.S
herr et al.,Cell 41,665（1985）;L.Coussens et al.,
Nature 320,277（1986））。他の腫瘍遺伝子は、成長因
子により活性化された細胞増殖径路でも同じく作用して
いるように思われる（J.M.Bishop,Science 235,305（19
85）;R.A.Weinberg,Science 230,770（1985）;S.K.Hank
s,A.M.Quinn,T.Hunter,Science 241,42（1988））。か
くして、成長因子調節系一般の知識の増加は、正常な成
長調節および腫瘍形成の双方に決定的に関与する遺伝子
を更に理解するのに役立つことが期待される。
血小板由来増殖因子（PDGF）は、それが正常な創傷治
癒において主要な役割を果すと考えられている結合組織
細胞の主要な分裂促進因子である故に、とりわけ重要で
ある。更にPDGFの異常な発現は癌ばかりでなく、種々の
組織病理学的症状、例えば動脈硬化症、関節炎、および
繊維症にも関係している（R.Ross,E.W.Raines,D.F.Bowe
n−Pope,Cell 46,155（1986））。
癒において主要な役割を果すと考えられている結合組織
細胞の主要な分裂促進因子である故に、とりわけ重要で
ある。更にPDGFの異常な発現は癌ばかりでなく、種々の
組織病理学的症状、例えば動脈硬化症、関節炎、および
繊維症にも関係している（R.Ross,E.W.Raines,D.F.Bowe
n−Pope,Cell 46,155（1986））。
PDGFはＡ鎖およびＢ鎖と命名される２種のポリペプチ
ド鎖のジスルフィド結合ダイマーから成る。Ａ鎖または
Ｂ鎖または双方を含む３種の可能なダイマー構造がすべ
て天然に生ずる証拠が存在する（R.F.Doolittle etal.,
Science 221,275（1983）;M.D.Waterfield et al.,Natu
re 304,35（1983）;K.C.Robbins et al.,Nature 305,60
5（1983）;C−H.Heldin et al.,Nature 319,511（198
6）;P.Stroobant and M.D.Waterfield,EMBOJ.3,2963（1
984））。成長因子の種々のダイマーの型は“イソフォ
ーム（isoform）”と呼ばれる。種々の正常および腫瘍
細胞はＡ鎖またはＢ鎖を特異的に発現するように思われ
る。それにもかかわらず生理学的な調節過程において最
も大切なヒトのイソフォームはヒト血小板から分離され
たイソフォーム、即ち、ABへテロダイマー（即ち１個の
ＡおよびＢ鎖を含むダイマー;A.Johnsson,C.−H.Heldi
n,B.Westermark,A.Wasteon,Biochem.Biophys.Res.Commu
n.104,66（1982））であると信じられている。
ド鎖のジスルフィド結合ダイマーから成る。Ａ鎖または
Ｂ鎖または双方を含む３種の可能なダイマー構造がすべ
て天然に生ずる証拠が存在する（R.F.Doolittle etal.,
Science 221,275（1983）;M.D.Waterfield et al.,Natu
re 304,35（1983）;K.C.Robbins et al.,Nature 305,60
5（1983）;C−H.Heldin et al.,Nature 319,511（198
6）;P.Stroobant and M.D.Waterfield,EMBOJ.3,2963（1
984））。成長因子の種々のダイマーの型は“イソフォ
ーム（isoform）”と呼ばれる。種々の正常および腫瘍
細胞はＡ鎖またはＢ鎖を特異的に発現するように思われ
る。それにもかかわらず生理学的な調節過程において最
も大切なヒトのイソフォームはヒト血小板から分離され
たイソフォーム、即ち、ABへテロダイマー（即ち１個の
ＡおよびＢ鎖を含むダイマー;A.Johnsson,C.−H.Heldi
n,B.Westermark,A.Wasteon,Biochem.Biophys.Res.Commu
n.104,66（1982））であると信じられている。
PDGF−Ａ鎖およびＢ鎖は、区別可能な特性を有する
（P.Beckman et al.,Science 241,1346（1988））。Ａ
鎖の方がＢ鎖よりもはるかに能率的に分泌され、かつよ
り低い比分裂促進活性を発揮する。PDGFのＢ鎖遺伝子
は、サルの肉腫ウィルス誘導ｖ−sis腫瘍遺伝子のヒト
における正常同族体であることが示されている。更にPD
GFレセプターを有する細胞タイプにおいてＢ鎖が発現す
ることにより、これらの細胞が悪性化への道すじをたど
る可能性の証拠が発見されてきている。Ｂ鎖に比してＡ
鎖は培養マウス（NIH/3T3）細胞の腫瘍性形質転換の誘
導性は低い。
（P.Beckman et al.,Science 241,1346（1988））。Ａ
鎖の方がＢ鎖よりもはるかに能率的に分泌され、かつよ
り低い比分裂促進活性を発揮する。PDGFのＢ鎖遺伝子
は、サルの肉腫ウィルス誘導ｖ−sis腫瘍遺伝子のヒト
における正常同族体であることが示されている。更にPD
GFレセプターを有する細胞タイプにおいてＢ鎖が発現す
ることにより、これらの細胞が悪性化への道すじをたど
る可能性の証拠が発見されてきている。Ｂ鎖に比してＡ
鎖は培養マウス（NIH/3T3）細胞の腫瘍性形質転換の誘
導性は低い。
マウス、またはヒト繊維芽細胞を使用してPDGFのイソ
フォームの結合および拮抗力を基礎とする最近の研究で
は、PDGFレセプター（PDGF−Ｒ）に２種のサブタイプの
存在することが暗示されている（C.−H.Heldin et al.,
Nature 7,1387（1988）;C.E.Hart et al.,Science 240,
1529（1988））。これらの研究は、Ｂ鎖ダイマーと選択
的に結合する１個のレセプターのサブタイプと、PDGF分
子のすべてのイソフォームと能率的に結合する今１つの
レセプターのサブタイプが存在するという仮説と符合し
ている。しかし、これらの研究の結果は、このようなレ
セプターに関連した病気の研究と究極的治療についての
異なった意味をもつ２つの別個の可能性（即ちこれらの
サブタイプは単一のPDGF−Ｒ遺伝子が異なって処理され
て生じた産物として現われたのかまたこれは別個の遺伝
子の生成物なのか）を識別することができなかった。
フォームの結合および拮抗力を基礎とする最近の研究で
は、PDGFレセプター（PDGF−Ｒ）に２種のサブタイプの
存在することが暗示されている（C.−H.Heldin et al.,
Nature 7,1387（1988）;C.E.Hart et al.,Science 240,
1529（1988））。これらの研究は、Ｂ鎖ダイマーと選択
的に結合する１個のレセプターのサブタイプと、PDGF分
子のすべてのイソフォームと能率的に結合する今１つの
レセプターのサブタイプが存在するという仮説と符合し
ている。しかし、これらの研究の結果は、このようなレ
セプターに関連した病気の研究と究極的治療についての
異なった意味をもつ２つの別個の可能性（即ちこれらの
サブタイプは単一のPDGF−Ｒ遺伝子が異なって処理され
て生じた産物として現われたのかまたこれは別個の遺伝
子の生成物なのか）を識別することができなかった。
更に、既に同定されているヒトPDGF−Ｒ遺伝子によっ
て生成されたレセプターの種々のPDGFイソフォームの結
合に関して、見解は統一されていない。発現ベクターに
よりPDGF遺伝子を種々のPDGFレセプターを欠除するタイ
プの細胞に導入することによって、PDGF−BBの選択的結
合（R.G.K,Growald et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
8,3435（1988）;L.Claessan−Welsh et al.,Mol.Cell.B
iol.8,3476（1988）），または、その代りに、３種のイ
ソフォームのすべてによる効率のよい結合（J.A.Escobe
do et al.,Science 240,1532（1988））に導く方法が報
告されている。この結果のバラツキの根拠は不明であ
る。
て生成されたレセプターの種々のPDGFイソフォームの結
合に関して、見解は統一されていない。発現ベクターに
よりPDGF遺伝子を種々のPDGFレセプターを欠除するタイ
プの細胞に導入することによって、PDGF−BBの選択的結
合（R.G.K,Growald et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
8,3435（1988）;L.Claessan−Welsh et al.,Mol.Cell.B
iol.8,3476（1988）），または、その代りに、３種のイ
ソフォームのすべてによる効率のよい結合（J.A.Escobe
do et al.,Science 240,1532（1988））に導く方法が報
告されている。この結果のバラツキの根拠は不明であ
る。
このような訳で、既知のPDGFレセプターの異ったPDGF
のイソフォームに対して、また特にヒトPDGFの主要なAB
ヘテロダイマー型に対して反応する能力に関して不確実
性がある。報告された相異的に関しては、既知のPDGF−
Ｒ遺伝子成長物の翻訳後の処理が細胞特異的に異なる
か、または細胞の或るタイプにおいては附属蛋白質が存
在することによって説明されるであろう。その他として
は、種々の研究で報告されている結合特性がそれぞれ異
なる点は、異なったPDGFレセプターをエンコードする２
種の異なった遺伝子の存在によって説明されるであろ
う。
のイソフォームに対して、また特にヒトPDGFの主要なAB
ヘテロダイマー型に対して反応する能力に関して不確実
性がある。報告された相異的に関しては、既知のPDGF−
Ｒ遺伝子成長物の翻訳後の処理が細胞特異的に異なる
か、または細胞の或るタイプにおいては附属蛋白質が存
在することによって説明されるであろう。その他として
は、種々の研究で報告されている結合特性がそれぞれ異
なる点は、異なったPDGFレセプターをエンコードする２
種の異なった遺伝子の存在によって説明されるであろ
う。
上述のPDGFリガンドおよびレセプター活性の複雑性、
およびその際影響される正常な創傷治癒及び結合組織の
異常状態、例えば腫瘍の成長、動脈硬化症、関節炎およ
び繊維症からなる関連した過程を考えてみると、結合組
織の成長の調節の機構に関する知識および解析の改善を
提供する方法と構成、およびバイオアッセイに対する必
要性、また、究極的には内包されるPDGFレセプターにも
とづく新規の診断および治療法に対する必要性の存在す
ることは明白である。
およびその際影響される正常な創傷治癒及び結合組織の
異常状態、例えば腫瘍の成長、動脈硬化症、関節炎およ
び繊維症からなる関連した過程を考えてみると、結合組
織の成長の調節の機構に関する知識および解析の改善を
提供する方法と構成、およびバイオアッセイに対する必
要性、また、究極的には内包されるPDGFレセプターにも
とづく新規の診断および治療法に対する必要性の存在す
ることは明白である。
上述の観察は特にPDGFレセプター成長の遺伝学的基礎
を徹底的に分析することがとりわけ必要であることを示
している。更に、チロシンキナーゼ活性を有する膜伸張
成長因子レセプターをエンコードする遺伝子族、すなわ
ち既知のPDGFレセプター遺伝子およびkitおよびfmsの腫
瘍遺伝子からなる遺伝子族の新規の関連メンバーを、保
存されたチロシンキナーゼをエンコードする領域９をプ
ローブとして利用することによって同定し、またクロー
ニングできることは既に示されている（C.R.King,M.H.K
raus,S.A.Aaronson,Science 229,974（1985）;G.D.Kruh
et al.,Science 234,1545（1986））。
を徹底的に分析することがとりわけ必要であることを示
している。更に、チロシンキナーゼ活性を有する膜伸張
成長因子レセプターをエンコードする遺伝子族、すなわ
ち既知のPDGFレセプター遺伝子およびkitおよびfmsの腫
瘍遺伝子からなる遺伝子族の新規の関連メンバーを、保
存されたチロシンキナーゼをエンコードする領域９をプ
ローブとして利用することによって同定し、またクロー
ニングできることは既に示されている（C.R.King,M.H.K
raus,S.A.Aaronson,Science 229,974（1985）;G.D.Kruh
et al.,Science 234,1545（1986））。
従って、本発明は主要なヒトPDGFの支配的なエフェク
ターと思われるPDGFレセプター蛋白質の生成法を発展さ
せかつ上述のニーズを遂行するために組換えDNA技術を
応用することを企図している。本発明はまた、治癒およ
び病理学的過程に関連したこれらのレセプターの分子メ
カニズムの応用も企図している。
ターと思われるPDGFレセプター蛋白質の生成法を発展さ
せかつ上述のニーズを遂行するために組換えDNA技術を
応用することを企図している。本発明はまた、治癒およ
び病理学的過程に関連したこれらのレセプターの分子メ
カニズムの応用も企図している。
特に、既知のPDGF−Ｒ遺伝子と関連するが、異なって
おり並びにまた他のPDGF−R,kitおよびfms遺伝子からな
るチロシンキナーゼ遺伝子族のメンバーと関連するが異
なっている新しいヒト遺伝子のコード配列を分離同定す
ることが本発明の目的である。更に本発明の目的は、PD
GFを含む生理過程においてPDGFの既知および新規の型の
相対的役割を樹立するのに必要とされる分子レベルの道
具となるものを開発することである。
おり並びにまた他のPDGF−R,kitおよびfms遺伝子からな
るチロシンキナーゼ遺伝子族のメンバーと関連するが異
なっている新しいヒト遺伝子のコード配列を分離同定す
ることが本発明の目的である。更に本発明の目的は、PD
GFを含む生理過程においてPDGFの既知および新規の型の
相対的役割を樹立するのに必要とされる分子レベルの道
具となるものを開発することである。
発明の開示 本発明は他のペプチド因子を含有しない新規のPDGFレ
セプター（PDGF−Ｒ）蛋白質の生成を含む組織DNA技術
の開発に関する。新しいDNAセグメント、RNA、およびバ
イオアッセイ法もまた包括する。
セプター（PDGF−Ｒ）蛋白質の生成を含む組織DNA技術
の開発に関する。新しいDNAセグメント、RNA、およびバ
イオアッセイ法もまた包括する。
特に本発明は、部分的には、DNAセグメントに関し、
以下の既知のレセプター遺伝子、即ち、PDGF−Ｒ遺伝子
と、コロニー形成促進因子−１レセプター（colony sti
mulating factor one receptor:CSF1−Ｒ）遺伝子（fms
腫瘍遺伝子のある細胞型、ｃ−fmsとしても知られる）
と、kit腫瘍遺伝子の細胞型（ｃ−kit（C.J.Sherr et a
l.,Cell 41,665（1985）;L.Coussens et al.,Nature 32
0,277（1986）;Y.Yarden et al.,Nature 323,226（198
6）;P.Besmer et al.,Nature 320,415（1986）;Y.Yarde
n et al.,EMBO J.6,3341（1987））とからなる膜伸張チ
ロシンキナーゼレセプター遺伝子のサブファミリーの内
で新しいヒトレセプターの構造的および／または機能性
に特徴を有するメッセンジャーRNA（mRNA）および蛋白
質をエンコードするDNAセグメントに関する。
以下の既知のレセプター遺伝子、即ち、PDGF−Ｒ遺伝子
と、コロニー形成促進因子−１レセプター（colony sti
mulating factor one receptor:CSF1−Ｒ）遺伝子（fms
腫瘍遺伝子のある細胞型、ｃ−fmsとしても知られる）
と、kit腫瘍遺伝子の細胞型（ｃ−kit（C.J.Sherr et a
l.,Cell 41,665（1985）;L.Coussens et al.,Nature 32
0,277（1986）;Y.Yarden et al.,Nature 323,226（198
6）;P.Besmer et al.,Nature 320,415（1986）;Y.Yarde
n et al.,EMBO J.6,3341（1987））とからなる膜伸張チ
ロシンキナーゼレセプター遺伝子のサブファミリーの内
で新しいヒトレセプターの構造的および／または機能性
に特徴を有するメッセンジャーRNA（mRNA）および蛋白
質をエンコードするDNAセグメントに関する。
より具体的には、本発明は、この成長因子レセプター
のサブファミリーに属する別のレセプターに構造的に類
似している予測された蛋白質生成物とともに、ゲノムDN
A配列または該ゲノムDNAから転写されたmRNAに相補的な
DNA配列を（すなわち、cDNA）含有するDNAセグメントを
含む。これらのレセプターの中でも、予測された新しい
遺伝子生成物は、既知のPDGFレセプターに対して最も近
い配列相同性を示す。
のサブファミリーに属する別のレセプターに構造的に類
似している予測された蛋白質生成物とともに、ゲノムDN
A配列または該ゲノムDNAから転写されたmRNAに相補的な
DNA配列を（すなわち、cDNA）含有するDNAセグメントを
含む。これらのレセプターの中でも、予測された新しい
遺伝子生成物は、既知のPDGFレセプターに対して最も近
い配列相同性を示す。
更に本発明のDNAによってコードされた新規の生成物
は、正常な種々のタイプの細胞において既知のPDGFレセ
プター遺伝子生成物とともに発現される。該蛋白質生成
物はPDGFに結合でき、また機能性にPDGFによって活性化
され得る。しかし、種々のPDGFのイソフォーム（isofor
m）の活性は、ここでタイプαヒトPDGFレセプターと命
名する新しい生成物を、既に同定されているPDGFと結合
できるレセプターをエンコードする遺伝子の生成物（以
前にPDGFレセプターと呼ばれ、かつここでタイプβ PDG
Fレセプタート命名された既知のレセプターを含む）か
ら機能的に区別する。更にここに開示する相当な証拠か
ら、この新しい遺伝子生成物のタイプα PDGFレセプタ
ーは、人体における最も豊富な型のPDGFに対する活性の
主要なエフェクターであることが示される。
は、正常な種々のタイプの細胞において既知のPDGFレセ
プター遺伝子生成物とともに発現される。該蛋白質生成
物はPDGFに結合でき、また機能性にPDGFによって活性化
され得る。しかし、種々のPDGFのイソフォーム（isofor
m）の活性は、ここでタイプαヒトPDGFレセプターと命
名する新しい生成物を、既に同定されているPDGFと結合
できるレセプターをエンコードする遺伝子の生成物（以
前にPDGFレセプターと呼ばれ、かつここでタイプβ PDG
Fレセプタート命名された既知のレセプターを含む）か
ら機能的に区別する。更にここに開示する相当な証拠か
ら、この新しい遺伝子生成物のタイプα PDGFレセプタ
ーは、人体における最も豊富な型のPDGFに対する活性の
主要なエフェクターであることが示される。
本発明の一実施例の実施に際して、DNAセグメントは
適当な宿主細胞中で発現され、その結果、新規のPDGFレ
セプター蛋白質を生成できる。本発明はまた、本発明の
DNAセグメントのセンス類（sense strand）の転写の結
果として生成されたmRNAにも関する。更に本発明は、本
発明のDNAセグメントに関連した遺伝子から生成される
ヒト細胞におけるmRNAおよび蛋白質の発現のレベルを決
定するための新規のバイオアッセイ法を包括する。
適当な宿主細胞中で発現され、その結果、新規のPDGFレ
セプター蛋白質を生成できる。本発明はまた、本発明の
DNAセグメントのセンス類（sense strand）の転写の結
果として生成されたmRNAにも関する。更に本発明は、本
発明のDNAセグメントに関連した遺伝子から生成される
ヒト細胞におけるmRNAおよび蛋白質の発現のレベルを決
定するための新規のバイオアッセイ法を包括する。
主要は実施例において、本発明は以下に例示される如
き新しいPDGFレセプターをエンコードするDNAセグメン
トを含む。すなわち本発明は、正常ヒト胸膜DNAゲノム
クローンであってここではT11ゲノムクローンと命名さ
れるものと、T11に含まれ、HF1,HB6,EF17およびTR4と命
名された配列を含む細胞mRNAのヒトcDNAクローンと、上
述のヒトDNAセグメントのいずれかに対するハイブリッ
ド形成によって検出され、既知のPDGF関連レセプター遺
伝子を含まないレセプター遺伝子をエンコードする関連
DNAセグメントとを含む。
き新しいPDGFレセプターをエンコードするDNAセグメン
トを含む。すなわち本発明は、正常ヒト胸膜DNAゲノム
クローンであってここではT11ゲノムクローンと命名さ
れるものと、T11に含まれ、HF1,HB6,EF17およびTR4と命
名された配列を含む細胞mRNAのヒトcDNAクローンと、上
述のヒトDNAセグメントのいずれかに対するハイブリッ
ド形成によって検出され、既知のPDGF関連レセプター遺
伝子を含まないレセプター遺伝子をエンコードする関連
DNAセグメントとを含む。
T11クローンに関連するヒト遺伝子を今後T11遺伝子と
呼び、また“T11"の言葉を形容詞として使用する場合
は、“T11ゲノムクローン”に特別言及することがなけ
れば、上述の本発明のDNAセグメントのいづれかを含む
ことを意味する。
呼び、また“T11"の言葉を形容詞として使用する場合
は、“T11ゲノムクローン”に特別言及することがなけ
れば、上述の本発明のDNAセグメントのいづれかを含む
ことを意味する。
今一つの実施例において、本発明はベクターと本発明
のDNAからなる組換DNA分子に関する。これらの組換分子
は、T11遺伝子関連のゲノムクローンまたはcDNAクロー
ン及び次のベクターDNAのいずれか−即ちλファージク
ローニングベクターまたは挿入されたDNAを哺乳類細胞
中に発現できる発現ベクター−からなる分子によって例
示される。
のDNAからなる組換DNA分子に関する。これらの組換分子
は、T11遺伝子関連のゲノムクローンまたはcDNAクロー
ン及び次のベクターDNAのいずれか−即ちλファージク
ローニングベクターまたは挿入されたDNAを哺乳類細胞
中に発現できる発現ベクター−からなる分子によって例
示される。
なお、今一つ他の実施例において、本発明は、細胞、
好ましくは哺乳類細胞であって本発明のDNAで形質転換
した細胞を含む。更に本発明は、酵母細胞および、バク
テリア細胞を含む細胞、例えばE.coliまたはB.subtilis
の細胞で、本発明のDNAで形質転換した細胞を含む。本
発明の今一つの実施例によれば、形質転換DNAはこの細
胞中において発現され、それにより本DNAによってエン
コードされたPDGF−Ｒ蛋白質の量をこの細胞内において
増加することができる。
好ましくは哺乳類細胞であって本発明のDNAで形質転換
した細胞を含む。更に本発明は、酵母細胞および、バク
テリア細胞を含む細胞、例えばE.coliまたはB.subtilis
の細胞で、本発明のDNAで形質転換した細胞を含む。本
発明の今一つの実施例によれば、形質転換DNAはこの細
胞中において発現され、それにより本DNAによってエン
コードされたPDGF−Ｒ蛋白質の量をこの細胞内において
増加することができる。
また更に、本発明は、本発明のDNAの発現によりまた
は本発明のRNAの翻訳によって作られた新規のPDGF−Ｒ
蛋白質を含む。これらのレセプターは機能の研究に使用
でき、更に生化学的および機能の分析、例えばレセプタ
ー定性的および定量的な結合アッセイのために精製する
ことが可能である。
は本発明のRNAの翻訳によって作られた新規のPDGF−Ｒ
蛋白質を含む。これらのレセプターは機能の研究に使用
でき、更に生化学的および機能の分析、例えばレセプタ
ー定性的および定量的な結合アッセイのために精製する
ことが可能である。
特に、これらのαタイプのPDGFレセプターは、ヒトPD
GFの主要型を含む種々のPDGFのイソフォームの潜在的類
似体（拮抗体（antagonist）またはアゴニスト）のレセ
プター結合および活性化活性をテストすることによっ
て、PDGFとそのレセプターが含まれる異常な過程を含む
症状の治療の開発に使用できるであろう。
GFの主要型を含む種々のPDGFのイソフォームの潜在的類
似体（拮抗体（antagonist）またはアゴニスト）のレセ
プター結合および活性化活性をテストすることによっ
て、PDGFとそのレセプターが含まれる異常な過程を含む
症状の治療の開発に使用できるであろう。
本発明のこの側面によれば、この新しいPDGF−Ｒ蛋白
質は本発明の“非変性（unmodified）”のDNAおよびmRN
Aの蛋白質生成物であることが可能で、これらの蛋白質
は変性されまたは遺伝子工学的に操作された蛋白質生成
物であることも可能である。DNA配列を工学的方法で変
異させた結果として、変性されたPDGF−Ｒ蛋白質は、対
応する天然の“野性型（wild−type）”蛋白質とは、ア
ミノ酸配列中に１個またはそれ以上の相異点を有してい
る。これらの相異点は、変性された遺伝子生成物に機能
性な相異、例えばそれらの製造能力の改善またはバイオ
アッセイでの使用に対する好適性を付与しうる。
質は本発明の“非変性（unmodified）”のDNAおよびmRN
Aの蛋白質生成物であることが可能で、これらの蛋白質
は変性されまたは遺伝子工学的に操作された蛋白質生成
物であることも可能である。DNA配列を工学的方法で変
異させた結果として、変性されたPDGF−Ｒ蛋白質は、対
応する天然の“野性型（wild−type）”蛋白質とは、ア
ミノ酸配列中に１個またはそれ以上の相異点を有してい
る。これらの相異点は、変性された遺伝子生成物に機能
性な相異、例えばそれらの製造能力の改善またはバイオ
アッセイでの使用に対する好適性を付与しうる。
本発明はまた、本発明のDNA関連遺伝子の発現検出の
ための新規のバイオアッセイ法に関する。このような一
つの実施例によれば、本発明のDNA、特に最も好ましいD
NAは、既知のPDGFレセプター遺伝子のmRNAにさまたげら
れることなく、タイプαPDGFレセプター関連のmRNAの特
定のレベルを決定するプローブとして使用することがで
きる。このようなバイオアッセイは、例えば、種々のク
ラスの腫瘍細胞または結合組織の成長および／または治
癒反応における遺伝的欠陥の同定に有用であろう。
ための新規のバイオアッセイ法に関する。このような一
つの実施例によれば、本発明のDNA、特に最も好ましいD
NAは、既知のPDGFレセプター遺伝子のmRNAにさまたげら
れることなく、タイプαPDGFレセプター関連のmRNAの特
定のレベルを決定するプローブとして使用することがで
きる。このようなバイオアッセイは、例えば、種々のク
ラスの腫瘍細胞または結合組織の成長および／または治
癒反応における遺伝的欠陥の同定に有用であろう。
本発明は更に、本発明のDNAセグメントまたは関連DNA
によってエンコードされたペプチドに対して作られた新
しい抗体類を含む。本発明のこの実施例においては、抗
体類はモノクロナールまたはポリクロナール起源であ
り、また天然、組換または合成化的方法によるPDGFレセ
プター関連ポリペプチドを使用して生成される。これら
の抗体は、このようなポリペプチドの配列を含むPDGF−
Ｒ蛋白質に特異的に結合する。望ましくは、これらの抗
体は、αタイプのPDGFレセプター蛋白質に対してのみ、
またはその他の場合としてβタイプのPDGFレセプター蛋
白質にだけ結合する。また、本発明の望ましい抗体類
は、その蛋白質がそれの生来の（生物学的に活性の）コ
ンホメーションで存在する場合にPDGFレセプター蛋白質
に結合する。
によってエンコードされたペプチドに対して作られた新
しい抗体類を含む。本発明のこの実施例においては、抗
体類はモノクロナールまたはポリクロナール起源であ
り、また天然、組換または合成化的方法によるPDGFレセ
プター関連ポリペプチドを使用して生成される。これら
の抗体は、このようなポリペプチドの配列を含むPDGF−
Ｒ蛋白質に特異的に結合する。望ましくは、これらの抗
体は、αタイプのPDGFレセプター蛋白質に対してのみ、
またはその他の場合としてβタイプのPDGFレセプター蛋
白質にだけ結合する。また、本発明の望ましい抗体類
は、その蛋白質がそれの生来の（生物学的に活性の）コ
ンホメーションで存在する場合にPDGFレセプター蛋白質
に結合する。
本発明の抗体類の断片、例えば抗原結合活性を保持
し、本技術分野において既知の方法によって調製の可能
なFadまたはＦ（ad）′断片もまた本発明の範囲内に入
る。更に本発明は、本発明の抗体類またはそれらの活性
断片の薬剤としての配合よりなるが、これらは本技術分
野において公知であるポリペプチドを投与するための薬
剤を調製する材料と方法を使用して調製でき、また余計
な実験を行うことなく本抗体類の投与に容易に適応する
ことが可能である。
し、本技術分野において既知の方法によって調製の可能
なFadまたはＦ（ad）′断片もまた本発明の範囲内に入
る。更に本発明は、本発明の抗体類またはそれらの活性
断片の薬剤としての配合よりなるが、これらは本技術分
野において公知であるポリペプチドを投与するための薬
剤を調製する材料と方法を使用して調製でき、また余計
な実験を行うことなく本抗体類の投与に容易に適応する
ことが可能である。
これらの抗体類、およびこれらの活性断片は、例え
ば、新しいαタイプのPDGFレセプターか、またはその代
りに既知のβタイプのPDGFレセプターのいづれかを特異
的な方法で検出し、あるいは精製するのに使用できる。
また、かかる抗体類は、高レベルのPDGFレセプターを有
する組織に対して薬剤を集中させるための本技術分野に
おける既知の種々の方法において、例えば、このような
抗体と細胞を殺す薬剤との複合体を使用して適当な腫瘍
を治療する際に、使用することができる。
ば、新しいαタイプのPDGFレセプターか、またはその代
りに既知のβタイプのPDGFレセプターのいづれかを特異
的な方法で検出し、あるいは精製するのに使用できる。
また、かかる抗体類は、高レベルのPDGFレセプターを有
する組織に対して薬剤を集中させるための本技術分野に
おける既知の種々の方法において、例えば、このような
抗体と細胞を殺す薬剤との複合体を使用して適当な腫瘍
を治療する際に、使用することができる。
図面の簡単な説明 第１図。ヒト胎盤および胸腺DNAにおけるｖ−fmsPDGF
レセプター関連遺伝子断片の検出。ｖ−fmsプローブ
（Ａ）またはマウスPDGFレセプタープローブ（Ｂ）をヒ
ト胎盤（レーン１および３）または胸腺（レーン２およ
び４）DNAに対して緊縮（50％ホルムアミド；レーン１
および２）または緩和（30％ホルムアミド：レーン３お
よび４）ハイブリッド形成条件下のハイブリッド形成。
矢印は、ｖ−fmsおよびマウスPDGF−Ｒプローブの双方
による、緩和条件のもとで検出された12−kbpEcoR I断
片を示す。
レセプター関連遺伝子断片の検出。ｖ−fmsプローブ
（Ａ）またはマウスPDGFレセプタープローブ（Ｂ）をヒ
ト胎盤（レーン１および３）または胸腺（レーン２およ
び４）DNAに対して緊縮（50％ホルムアミド；レーン１
および２）または緩和（30％ホルムアミド：レーン３お
よび４）ハイブリッド形成条件下のハイブリッド形成。
矢印は、ｖ−fmsおよびマウスPDGF−Ｒプローブの双方
による、緩和条件のもとで検出された12−kbpEcoR I断
片を示す。
第２図。λT11ゲノム断片並びにT11のcDNAおよびPDGF
−Ｒ遺伝子の分子クローニング。制限地図：すなわちλ
T11ゲノムクローン（実線）;T11 cDNAクローン（中実の
棒）；およびPDGF−R cDNAクローン（中空の棒）。ヌク
レオチド配列解析によって決定された如く、３個の断片
的のコード領域をa,bおよびｃとラベルされた黒い四辺
形で示す。
−Ｒ遺伝子の分子クローニング。制限地図：すなわちλ
T11ゲノムクローン（実線）;T11 cDNAクローン（中実の
棒）；およびPDGF−R cDNAクローン（中空の棒）。ヌク
レオチド配列解析によって決定された如く、３個の断片
的のコード領域をa,bおよびｃとラベルされた黒い四辺
形で示す。
第３−１〜３−10図。T11 cDNAヌクレオチドおよび予
測されたアミノ酸配列。ヌクレオチドは左側に番号で示
す。予測アミノ酸配列の長く開いた読みとり枠をヌクレ
オチド配列の上部に示す。アミノ酸は、推定される開始
コドンから始めてアミノ酸上部に番号を付す。潜在的Ｎ
端末シグナルの配列には下線を付す。Ｎ結合したグリコ
シル化の潜在的部位には上部に線を付し、シスライン残
基は箱でかこむ。推定の単一膜透過領域は斜線をつけた
棒で示す。キナーゼ領域の潜在的ATP結合部位はグリシ
ンの600,602および605残基上とリジン627残基上にサー
クルで示す。チロシンの849残基の推定自動隣酸化部位
は＊によって示す。a,bおよびｃのエキソンによって明
示されたT11のゲノム配列の領域にはアンダーラインを
付す。ポリアデニル化されたcDNAの３′未満に近接した
AATAAボックスも同様にアンダーラインを付す。
測されたアミノ酸配列。ヌクレオチドは左側に番号で示
す。予測アミノ酸配列の長く開いた読みとり枠をヌクレ
オチド配列の上部に示す。アミノ酸は、推定される開始
コドンから始めてアミノ酸上部に番号を付す。潜在的Ｎ
端末シグナルの配列には下線を付す。Ｎ結合したグリコ
シル化の潜在的部位には上部に線を付し、シスライン残
基は箱でかこむ。推定の単一膜透過領域は斜線をつけた
棒で示す。キナーゼ領域の潜在的ATP結合部位はグリシ
ンの600,602および605残基上とリジン627残基上にサー
クルで示す。チロシンの849残基の推定自動隣酸化部位
は＊によって示す。a,bおよびｃのエキソンによって明
示されたT11のゲノム配列の領域にはアンダーラインを
付す。ポリアデニル化されたcDNAの３′未満に近接した
AATAAボックスも同様にアンダーラインを付す。
第４図。ヒドロパシシティー（hydropathicity）プロ
ファイルおよび他のT11レセプター様遺伝子生成物のチ
ロシンキナーゼとの相似性（homology）。予測された蛋
白質領域の略図は、シグナル配列（S;黒色のボック
ス）、リガンド結合（ligand binding）領域（LB）、膜
透過（transmembrane）領域（TM;2番目の黒色のボック
ス）、隣接膜（juxtamembrane）領域（JM）、チロシン
キナーゼ（tyrosine kinase）領域（TK1,TK2;点を打っ
たボックス）、インターキナーゼ（inter−kinase）領
域（IK）およびカルボキシル未満（carboxyl terminu
s）（Ｃ）を示す。ヒドロパシシティーのプロファイル
はKyteおよびDoolittle（J.Kyte and R.F.Doolittle,J.
Mol.Biol.157,105（1982））の方法によって計算した。
相同性の百分率（homology percentage）は各自の領域
内の同じアミノ酸類に関して示される。用語の省略形:I
Rはインシュリンレセプター;EGF−Ｒは表皮成長因子レ
セプター;NDは未確定。
ファイルおよび他のT11レセプター様遺伝子生成物のチ
ロシンキナーゼとの相似性（homology）。予測された蛋
白質領域の略図は、シグナル配列（S;黒色のボック
ス）、リガンド結合（ligand binding）領域（LB）、膜
透過（transmembrane）領域（TM;2番目の黒色のボック
ス）、隣接膜（juxtamembrane）領域（JM）、チロシン
キナーゼ（tyrosine kinase）領域（TK1,TK2;点を打っ
たボックス）、インターキナーゼ（inter−kinase）領
域（IK）およびカルボキシル未満（carboxyl terminu
s）（Ｃ）を示す。ヒドロパシシティーのプロファイル
はKyteおよびDoolittle（J.Kyte and R.F.Doolittle,J.
Mol.Biol.157,105（1982））の方法によって計算した。
相同性の百分率（homology percentage）は各自の領域
内の同じアミノ酸類に関して示される。用語の省略形:I
Rはインシュリンレセプター;EGF−Ｒは表皮成長因子レ
セプター;NDは未確定。
第５図。T11遺伝子の染色体マッピング。（Ａ）pT11
−Ｐプローブとの切片上ハイブリッド形成による正常ヒ
ト染色体上の銀顆粒の分布（3.8kbp Pst Iゲノム断片の
クローン）（第１図参照）。（Ｂ）第４染色体上の顆粒
の分布。
−Ｐプローブとの切片上ハイブリッド形成による正常ヒ
ト染色体上の銀顆粒の分布（3.8kbp Pst Iゲノム断片の
クローン）（第１図参照）。（Ｂ）第４染色体上の顆粒
の分布。
第６図。T11および既知のPDGF−Ｒ遺伝子のmRNA種の
正常および腫瘍細胞における比較。最初に同一のフィル
ターをpT11−HP（0.95−kbp Hind III−Pst Iゲノム断
片）（Ａ）からのプローブとハイブリッドさせそれから
PDGF−R cDNAプローブ（Ｂ）で再びハイブリッドさせ
た。別のフィルターを最初T11 cDNA（エンコード領域全
体を含むTR4の3.5−kbp BamH I断片）でハイブリッドさ
せ（Ｃ）それからPDGF−R cDNA（HPR2の3.8−kbp Nde I
断片）（Ｄ）で再びハイブリッドさせた。ＡおよびＢ
は、ヒト平滑筋（レーン１）、心臓（レーン２）、肝臓
（レーン３）、脾臓（レーン４）または胎児（レーン５
および６）から抽出したRNA（レーン当り５μｇ）とpol
y（Ａ）を含有していた。ＣおよびＤは、G402 leiomyob
lastoma細胞（レーン１）、SK−LMS−1 leiomyosarcoma
細胞（レーン２）,A1186またはA204 rhabdomyosarcoma
細胞（レーン３および４）、8387fibrosarcoma細胞（レ
ーン５）、astrocytoma組織（レーン６および７）、A16
90 astrocytoma細胞（レーン８）,A1207またはA172 gli
oblastoma細胞（レーン９および10）またはA875 melano
ma細胞（レーン11）から抽出した全RNA（レーン当り20
μｇ）を含有した。28Sおよび18SリボゾームRNA（マー
カー）の游走は示す通りである。
正常および腫瘍細胞における比較。最初に同一のフィル
ターをpT11−HP（0.95−kbp Hind III−Pst Iゲノム断
片）（Ａ）からのプローブとハイブリッドさせそれから
PDGF−R cDNAプローブ（Ｂ）で再びハイブリッドさせ
た。別のフィルターを最初T11 cDNA（エンコード領域全
体を含むTR4の3.5−kbp BamH I断片）でハイブリッドさ
せ（Ｃ）それからPDGF−R cDNA（HPR2の3.8−kbp Nde I
断片）（Ｄ）で再びハイブリッドさせた。ＡおよびＢ
は、ヒト平滑筋（レーン１）、心臓（レーン２）、肝臓
（レーン３）、脾臓（レーン４）または胎児（レーン５
および６）から抽出したRNA（レーン当り５μｇ）とpol
y（Ａ）を含有していた。ＣおよびＤは、G402 leiomyob
lastoma細胞（レーン１）、SK−LMS−1 leiomyosarcoma
細胞（レーン２）,A1186またはA204 rhabdomyosarcoma
細胞（レーン３および４）、8387fibrosarcoma細胞（レ
ーン５）、astrocytoma組織（レーン６および７）、A16
90 astrocytoma細胞（レーン８）,A1207またはA172 gli
oblastoma細胞（レーン９および10）またはA875 melano
ma細胞（レーン11）から抽出した全RNA（レーン当り20
μｇ）を含有した。28Sおよび18SリボゾームRNA（マー
カー）の游走は示す通りである。
第７図。ヒト細胞系（Ａ）およびCOS−１細胞トラン
スフェクタント（Ｂ）における、ペプチドの抗血清によ
るT11およびPDGF−Ｒ蛋白質の検出。（Ａ）M426 ヒト胎
児繊維芽細胞（fibroblast）（レーン1,4,7および1
0）、8387 fibrosarcomo細胞（レーン2,5,8および1
1）、A204 rhabdomyosarcoma細胞（レーン3,6,9および1
2）、（Ｂ）COS−1 細胞（レーン１および４）、T11 cD
NA（レーン２および３）またはPDGF−R cDNA（レーン５
および６）を運ぶベクターにより移入されたCOS−１細
胞。
スフェクタント（Ｂ）における、ペプチドの抗血清によ
るT11およびPDGF−Ｒ蛋白質の検出。（Ａ）M426 ヒト胎
児繊維芽細胞（fibroblast）（レーン1,4,7および1
0）、8387 fibrosarcomo細胞（レーン2,5,8および1
1）、A204 rhabdomyosarcoma細胞（レーン3,6,9および1
2）、（Ｂ）COS−1 細胞（レーン１および４）、T11 cD
NA（レーン２および３）またはPDGF−R cDNA（レーン５
および６）を運ぶベクターにより移入されたCOS−１細
胞。
第８図。マウス対照区（control）NIH/3T3と、対照区
COS−１と、T11または既知のPDGF−R cDNA発現ベクター
により移入されたCOS−１細胞とへの125Iでラベルされ
たヒトPDGFの結合。結果は３つの試料による平均値（±
SD）を表わす。
COS−１と、T11または既知のPDGF−R cDNA発現ベクター
により移入されたCOS−１細胞とへの125Iでラベルされ
たヒトPDGFの結合。結果は３つの試料による平均値（±
SD）を表わす。
第９図。異ったPDGFイソフォームによって誘導された
タイプαおよびタイプβのPDGF−Ｒ遺伝子生成物のチロ
シンの自動燐酸化（autophosphorylation）。A204
（Ａ）,8387（Ｂ）、またはNIH/3T3（Ｃ）細胞を、PDGF
−BB（30ng/ml）（レーン２）、ヒトPDGF（30ng/ml）
（レーン３）、PDGF−AA（300ng/ml）（レーン４）また
は3mM酢酸（媒体対照区（vehicle control:レーン１）
でインキュベートした。細胞溶解物（cell lysate）を
予想されたタイプαまたはタイプβのPDGFレセプター
（それぞれ抗T11（anti−T11）および抗HPR（anti−HP
R））に対するペプチド抗血清によって免疫沈澱させ
た。免疫ブロット解析（immunoblot analysis）をレセ
プターまたはphosphotyrosine（anti−Ｐ−Tys）（J.J.
Wang,Mol.Cell.Biol.5,3640（1985））に対する抗体を
用いてブロットの上に示すように行った。矢印は免疫ペ
プチドの存在のもとでブロックされた特定のバンドを示
す。
タイプαおよびタイプβのPDGF−Ｒ遺伝子生成物のチロ
シンの自動燐酸化（autophosphorylation）。A204
（Ａ）,8387（Ｂ）、またはNIH/3T3（Ｃ）細胞を、PDGF
−BB（30ng/ml）（レーン２）、ヒトPDGF（30ng/ml）
（レーン３）、PDGF−AA（300ng/ml）（レーン４）また
は3mM酢酸（媒体対照区（vehicle control:レーン１）
でインキュベートした。細胞溶解物（cell lysate）を
予想されたタイプαまたはタイプβのPDGFレセプター
（それぞれ抗T11（anti−T11）および抗HPR（anti−HP
R））に対するペプチド抗血清によって免疫沈澱させ
た。免疫ブロット解析（immunoblot analysis）をレセ
プターまたはphosphotyrosine（anti−Ｐ−Tys）（J.J.
Wang,Mol.Cell.Biol.5,3640（1985））に対する抗体を
用いてブロットの上に示すように行った。矢印は免疫ペ
プチドの存在のもとでブロックされた特定のバンドを示
す。
第10図。種々の細胞、例えば（Ａ）マウスNIH/3T3:
（Ｂ）ヒトM426;（Ｃ）AG1523;（Ｄ）ヒトM413におけ
る、PDGF−AB（△）またはPDGF−BB（○）によるDNA合
成の刺激。
（Ｂ）ヒトM426;（Ｃ）AG1523;（Ｄ）ヒトM413におけ
る、PDGF−AB（△）またはPDGF−BB（○）によるDNA合
成の刺激。
第11図。それぞれcDNAをになうベクターを使用するト
ランスフェクションによりタイプα（開いた印）または
タイプβ（閉じた印）のPDGFレセプターで再構成された
ヒトD32細胞のレセプターとPDGF−AB（△）またはPDGF
−BB（◯）との結合。挿入図は、標準（セミログ）のス
キャッチャード）（Scatchard）形式により再プロット
された同一のデータを表わす。
ランスフェクションによりタイプα（開いた印）または
タイプβ（閉じた印）のPDGFレセプターで再構成された
ヒトD32細胞のレセプターとPDGF−AB（△）またはPDGF
−BB（◯）との結合。挿入図は、標準（セミログ）のス
キャッチャード）（Scatchard）形式により再プロット
された同一のデータを表わす。
第12図。タイプα（上部パネル）またはタイプβ（下
部パネル）PDGFレセプターで再構成されたヒトD32細胞
によるPDGF−AB（△）またはPDGF−BB（○）に対するDN
A合成刺激反応。
部パネル）PDGFレセプターで再構成されたヒトD32細胞
によるPDGF−AB（△）またはPDGF−BB（○）に対するDN
A合成刺激反応。
第13図。タイプα（上部パネル）またはタイプβ（下
方パネル）PDGFレセプターにより再構成されたヒトD32
細胞によるPDGF−AB（△）またはPDGF−BB（○）に対す
る走化性反応。
方パネル）PDGFレセプターにより再構成されたヒトD32
細胞によるPDGF−AB（△）またはPDGF−BB（○）に対す
る走化性反応。
第14図。タイプα（上方パネル）またはタイプβ（下
方パネル）PDGFレセプターで再構成されたヒトD32細胞
によるPDGF−AB（△）またはPDGF−BB（○）に対する燐
酸イノシトール（inositol phosphate）形成およびサイ
トゾルのカルシウムイオン起動（すなわち〔Ca2+〕i;デ
ーターは挿入図中）の反応。
方パネル）PDGFレセプターで再構成されたヒトD32細胞
によるPDGF−AB（△）またはPDGF−BB（○）に対する燐
酸イノシトール（inositol phosphate）形成およびサイ
トゾルのカルシウムイオン起動（すなわち〔Ca2+〕i;デ
ーターは挿入図中）の反応。
具体例の説明 本発明のDNAは、T11ゲノムのクローン、および、T11
ゲノムのクローンに含まれた配列を有する細胞mRNAクロ
ーンのヒトcDNAクローンからなるHF12,HB6,EF17およびT
R4クローンとここで呼ばれるDNAによって例示される。
ゲノムのクローンに含まれた配列を有する細胞mRNAクロ
ーンのヒトcDNAクローンからなるHF12,HB6,EF17およびT
R4クローンとここで呼ばれるDNAによって例示される。
T11ゲノムのクローンおよびTR4 cDNAクローンは、本
発明における好ましいDNAである。pT11−HP（ゲノムク
ローンT11のHind III−Pst I 0.95−kbp断片）と命名さ
れたクローンおよびT11 cDNAからの特定の制限断片（エ
ンコードする全域を含むTR4の3.5−kpd BamH I断片）
は、本発明の中で最も好ましいDNAである。
発明における好ましいDNAである。pT11−HP（ゲノムク
ローンT11のHind III−Pst I 0.95−kbp断片）と命名さ
れたクローンおよびT11 cDNAからの特定の制限断片（エ
ンコードする全域を含むTR4の3.5−kpd BamH I断片）
は、本発明の中で最も好ましいDNAである。
HF1,HB6,EF17およびTR4のcDNAクローンの制限酵素に
よる消化地図、およびこれらのゲノムクローンT11に対
するマッピングの関係を第２図に表わす。T11遺伝子関
連の最大のcDNAクローンである、TR4 cDNAクローンにつ
いてセンス類（sense strand）DNAヌクレオチド配列お
よび予想され、エンコードされた主要蛋白質配列を第３
図に示す。
よる消化地図、およびこれらのゲノムクローンT11に対
するマッピングの関係を第２図に表わす。T11遺伝子関
連の最大のcDNAクローンである、TR4 cDNAクローンにつ
いてセンス類（sense strand）DNAヌクレオチド配列お
よび予想され、エンコードされた主要蛋白質配列を第３
図に示す。
実験セクションで記載するように、T11ゲノムクロー
ンは、制限酵素のEcoR Iの認識部位によって境界づけら
れた12−kbp配列を含む正常ヒト胸腺DNAゲノム断片のク
ローンを含むが、その断片はウィルス腫瘍遺伝子ｖ−/f
msおよびマウスの細胞PDGF−Ｒ遺伝子（第１図を参照）
のチロシンキナーゼ領域に由来するDNAプローブと他の
断片に比して、ブロット法ハイブリッド形成による分析
に際してはるかに強くハイブリッドした（第１図参
照）。T11ゲノムのクローンは、mRNAに見出されない介
在遺伝子配列（すなわちイントロン）に加えて、T11遺
伝子のmRNA生成物に見出される配列のブロック（すなわ
ちエキソン）のほとんどを含む。
ンは、制限酵素のEcoR Iの認識部位によって境界づけら
れた12−kbp配列を含む正常ヒト胸腺DNAゲノム断片のク
ローンを含むが、その断片はウィルス腫瘍遺伝子ｖ−/f
msおよびマウスの細胞PDGF−Ｒ遺伝子（第１図を参照）
のチロシンキナーゼ領域に由来するDNAプローブと他の
断片に比して、ブロット法ハイブリッド形成による分析
に際してはるかに強くハイブリッドした（第１図参
照）。T11ゲノムのクローンは、mRNAに見出されない介
在遺伝子配列（すなわちイントロン）に加えて、T11遺
伝子のmRNA生成物に見出される配列のブロック（すなわ
ちエキソン）のほとんどを含む。
本発明の他のDNAは、本発明のT11関連のゲノムまたは
cDNAクローンおよび次のDNAベクターのいづれか：例え
ばλバクテリオファージクローニングベクター（例証と
してλEMBL4またはλgt11）、または〔挿入されたDNAを
哺乳類（例えば、cos−１）細胞において発現できる〕
哺乳類発現ベクター（例えば、猿のsarcomaウィルスプ
ロモーターを工学的に組入れたpSV2gtベクター）からな
る組換分子を包含する。
cDNAクローンおよび次のDNAベクターのいづれか：例え
ばλバクテリオファージクローニングベクター（例証と
してλEMBL4またはλgt11）、または〔挿入されたDNAを
哺乳類（例えば、cos−１）細胞において発現できる〕
哺乳類発現ベクター（例えば、猿のsarcomaウィルスプ
ロモーターを工学的に組入れたpSV2gtベクター）からな
る組換分子を包含する。
ゲノムのクローンT11DNAは、当該技術分野において公
知の標準的な遺伝子クローニング法により、すなわちEc
oR Iで消化された正常ヒト胸腺DNA（蔗糖密度勾配法に
よっ大きさが選別され、EMBL−４ベクター系へとクロー
ン化されたもの）より構成されたゲノムライブラリーか
ら分離された。λT11クローンは、ｖ−fmsおよびマウス
PDGF−Ｒプローブを用いるハイブリッド形成を基礎にし
て同定され、緩和されてはいるが緊縮されていないハイ
ブリッド形成の条件のもとでのみ行なわれた。更なるク
ローニングの戦略およびプローブの詳細を、以下および
それにつづく実験セクションで提供する。
知の標準的な遺伝子クローニング法により、すなわちEc
oR Iで消化された正常ヒト胸腺DNA（蔗糖密度勾配法に
よっ大きさが選別され、EMBL−４ベクター系へとクロー
ン化されたもの）より構成されたゲノムライブラリーか
ら分離された。λT11クローンは、ｖ−fmsおよびマウス
PDGF−Ｒプローブを用いるハイブリッド形成を基礎にし
て同定され、緩和されてはいるが緊縮されていないハイ
ブリッド形成の条件のもとでのみ行なわれた。更なるク
ローニングの戦略およびプローブの詳細を、以下および
それにつづく実験セクションで提供する。
pHF1と命名される、HF1 cDNAクローンを含むプラスミ
ドは公知の標準的方法により、本発明の中で最も好まし
いDNAのλT11の0.9−kbp Hind III−Pst I断片を使用し
てOkayama−Berg発現ベクターの中で、正常ヒト繊維芽
細胞cDNAライブラリーから緊縮条件のもとで分離され
た。これは正常ヒト繊維芽細胞（fibroblast）における
6.4−kbRNA転写体にハイブリッドした3.9−kbp cDNA挿
入片を含み、その３′末端にpoly（Ａ）尾部が後続して
いるポリアデニル化シグナルを含む。これはまたλT11D
NA内にコード配列およびCSF1−Ｒ関連の170個のヌクレ
オチドおよびエキソン（ａ）上流のPDGF−Ｒチロシンキ
ナーゼ領域を含む。
ドは公知の標準的方法により、本発明の中で最も好まし
いDNAのλT11の0.9−kbp Hind III−Pst I断片を使用し
てOkayama−Berg発現ベクターの中で、正常ヒト繊維芽
細胞cDNAライブラリーから緊縮条件のもとで分離され
た。これは正常ヒト繊維芽細胞（fibroblast）における
6.4−kbRNA転写体にハイブリッドした3.9−kbp cDNA挿
入片を含み、その３′末端にpoly（Ａ）尾部が後続して
いるポリアデニル化シグナルを含む。これはまたλT11D
NA内にコード配列およびCSF1−Ｒ関連の170個のヌクレ
オチドおよびエキソン（ａ）上流のPDGF−Ｒチロシンキ
ナーゼ領域を含む。
cDNAクローンであるλHB6は、ヒト小児脳cDNAライブ
ラリーをλgt11ベクター中でスクリーニングするため
に、クローンHF1の0.4−kbp5′末端を使用する標準的方
法によって分離された。
ラリーをλgt11ベクター中でスクリーニングするため
に、クローンHF1の0.4−kbp5′末端を使用する標準的方
法によって分離された。
今１つのcDNAクローンであるλEF17は、mRNAの鋳型上
でDNA合成のランダムなプライミングおよびλgt11ベク
ター中のクローニングによって調製されたヒト胎児繊維
芽細胞（M426細胞系）のcDNAライブラリーをλHB6の0.2
−Kbp5′断片をプローブとしてスクリーニングすること
によって分離された。可能なATGの開始コドンはEF17内
部で同定された。
でDNA合成のランダムなプライミングおよびλgt11ベク
ター中のクローニングによって調製されたヒト胎児繊維
芽細胞（M426細胞系）のcDNAライブラリーをλHB6の0.2
−Kbp5′断片をプローブとしてスクリーニングすること
によって分離された。可能なATGの開始コドンはEF17内
部で同定された。
３種のオーバーラップしたクローン（pHF1,λHB6及び
λEF17）は、翻訳されない配列の138−bp5′および３′
の３−kbpに加えて、全コード領域を含む（第２図）。
λEF17）は、翻訳されない配列の138−bp5′および３′
の３−kbpに加えて、全コード領域を含む（第２図）。
cDNAクローンのTR4は、“phagemid"（ファージとプラ
スミドのハイブリッド）ベクター中でM426ヒト胎児繊維
芽細胞cDNAライブラリーをスクリーニングするためにλ
EF17の５′0.2−kbpのサブフラグメントを使用して得ら
れた（米国特許出願の内容、No.07/386,053、標題“効
率的指向性クリーニング系（Efficient Directional Cl
oning System）"1989年７月28日出願）。6.4−kbp TR4
cDNAクローンは、ヌクレオチド部位139において可能なA
T開始コドンで始まり、3406部位のTAA終止コドンまで伸
びる開いた読みとり枠を含む（第３図参照）。更に最初
の23個のアミノ酸は、切断可能な疎水性のシグナルペプ
チド特性を発揮した（第３図および第４図）。この開い
た読みとり枠には、翻訳されない配列の−３−kbpおよ
びcDNAの３′末端のpoly（Ａ）配列からヌクレオチド25
個分上流に位置するポリアデニル化シグナル（AATAAA）
が続いた。
スミドのハイブリッド）ベクター中でM426ヒト胎児繊維
芽細胞cDNAライブラリーをスクリーニングするためにλ
EF17の５′0.2−kbpのサブフラグメントを使用して得ら
れた（米国特許出願の内容、No.07/386,053、標題“効
率的指向性クリーニング系（Efficient Directional Cl
oning System）"1989年７月28日出願）。6.4−kbp TR4
cDNAクローンは、ヌクレオチド部位139において可能なA
T開始コドンで始まり、3406部位のTAA終止コドンまで伸
びる開いた読みとり枠を含む（第３図参照）。更に最初
の23個のアミノ酸は、切断可能な疎水性のシグナルペプ
チド特性を発揮した（第３図および第４図）。この開い
た読みとり枠には、翻訳されない配列の−３−kbpおよ
びcDNAの３′末端のpoly（Ａ）配列からヌクレオチド25
個分上流に位置するポリアデニル化シグナル（AATAAA）
が続いた。
cDNA発現プラスミドは、ヌクレオチドの１から3454迄
（第３図）を包含するT11関連cDNAをpSV2gptベクター中
に導入することにより当該技術分野において公知の標準
的クローニング法を使用して組立てられたが、pSV2gpt
ベクター中にはサルのsarcomaウィルスの長い反覆末端
（LTR）が、以前に詳細に記載したようにしてプロモー
ターとして工学的に組入れられた（C.R.Kig,N.A.Giese,
K.C.Robbins,S.A.Aaronson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
2,5295（1985））。
（第３図）を包含するT11関連cDNAをpSV2gptベクター中
に導入することにより当該技術分野において公知の標準
的クローニング法を使用して組立てられたが、pSV2gpt
ベクター中にはサルのsarcomaウィルスの長い反覆末端
（LTR）が、以前に詳細に記載したようにしてプロモー
ターとして工学的に組入れられた（C.R.Kig,N.A.Giese,
K.C.Robbins,S.A.Aaronson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
2,5295（1985））。
本発明のDNAおよびセンス鎖のRNAは、当該技術分野に
おいて既知の蛋白質生成方法と組合わせて、他のPDGFレ
セプターの不在の下で、新しい遺伝子から機能性タイプ
αPDGF−Ｒ蛋白質を発現する細胞を作るために使用でき
る。これらの新規のレセプターは、細胞における機能の
研究、例えば定性および定量のレセプター結合アッセイ
に使用できる。
おいて既知の蛋白質生成方法と組合わせて、他のPDGFレ
セプターの不在の下で、新しい遺伝子から機能性タイプ
αPDGF−Ｒ蛋白質を発現する細胞を作るために使用でき
る。これらの新規のレセプターは、細胞における機能の
研究、例えば定性および定量のレセプター結合アッセイ
に使用できる。
従って、本発明のこの側面における実施例の１つは、
好ましくは哺乳類の細胞であって、本発明のDNAにより
形質転換され、そこにおいて形質転換DNAを発現できる
細胞を含む」。T11関連cDNAを保持するpSV2gtベクター
で形質転換した哺乳類細胞（cos−１）は、公知の方法
に従って調製され、185kdおよび160kd種（species）
（第7B図）としてT11遺伝子生成物を発現することが示
された。これらの生成物は、以下の実験セクション第８
図参照）に示される如く、血小板から分離されたヒトPD
GFと結合することができた。
好ましくは哺乳類の細胞であって、本発明のDNAにより
形質転換され、そこにおいて形質転換DNAを発現できる
細胞を含む」。T11関連cDNAを保持するpSV2gtベクター
で形質転換した哺乳類細胞（cos−１）は、公知の方法
に従って調製され、185kdおよび160kd種（species）
（第7B図）としてT11遺伝子生成物を発現することが示
された。これらの生成物は、以下の実験セクション第８
図参照）に示される如く、血小板から分離されたヒトPD
GFと結合することができた。
実験セクションの他の研究によれば、本発明のDNA
は、PDGFレセプターの存在しない他の細胞中にタイプα
PDGFレセプター遺伝子機能を再構成するのに使用可能
で、また各々のαまたはβタイプのレセプターは、細胞
分裂シグナルの形質導入、走化性およびホスホイノシチ
ドのターンオーバーの刺激を含む既知のPDGFの主要な活
性を有効に仲介することが更に示されている。更にこれ
らの研究によって、タイプαのPDGFレセプターが血小板
由来のヒトPDGFの主要な型に対する主なレセプターであ
ることが明らかになっている。
は、PDGFレセプターの存在しない他の細胞中にタイプα
PDGFレセプター遺伝子機能を再構成するのに使用可能
で、また各々のαまたはβタイプのレセプターは、細胞
分裂シグナルの形質導入、走化性およびホスホイノシチ
ドのターンオーバーの刺激を含む既知のPDGFの主要な活
性を有効に仲介することが更に示されている。更にこれ
らの研究によって、タイプαのPDGFレセプターが血小板
由来のヒトPDGFの主要な型に対する主なレセプターであ
ることが明らかになっている。
かくして、遺伝子発現方法における本発明のDNA、特
にここであげられた有利なTR4 cDNAクローンをこのよう
に使用することによって、当該分野に習熟した人々は、
PDGFの調節過程のメカニズムを決定し、新規なPDGFレセ
プター蛋白質を大量に成長するために、不要な実験をく
りかえすことなく、本発明の範囲内の細胞系を構築する
ことができる。
にここであげられた有利なTR4 cDNAクローンをこのよう
に使用することによって、当該分野に習熟した人々は、
PDGFの調節過程のメカニズムを決定し、新規なPDGFレセ
プター蛋白質を大量に成長するために、不要な実験をく
りかえすことなく、本発明の範囲内の細胞系を構築する
ことができる。
本発明は更に、本発明のDNAに関連したの遺伝子の発
現を検出するための新規のバイオアッセイ法を含む。こ
のような実施例によれば、本発明のDNAは関連mRNAのレ
ベルを決定するプローブとして使用されうる。この実施
例は、T11のmRNA種と正常および腫瘍細胞における既知
のPDGF−Ｒ遺伝子の比較によって例証される（第６
図）。全体またはポリアデニル化されたRNAは、ホルム
アルデヒド中での変性ゲル電気泳動によって分離し（H.
D.Lehrach,D.Diamond,J.M.Wozney,H.Boedker,Biochemis
try 16,4743（1977））、ニトロセルローズに移行し、
緊縮条件のもとで32Pでラベルしたプローブでハイブリ
ッドさせた。該プローブは、以下の本発明のDNAのいづ
れか、例えばクローンpT11−HP（ゲノムのクローンT11
の0.95−kbp Hind III−Pst I断片）から；またはT11 c
DNA（コード領域全体を含むTR4の3.5−kbp BamH I断
片）から調製した。
現を検出するための新規のバイオアッセイ法を含む。こ
のような実施例によれば、本発明のDNAは関連mRNAのレ
ベルを決定するプローブとして使用されうる。この実施
例は、T11のmRNA種と正常および腫瘍細胞における既知
のPDGF−Ｒ遺伝子の比較によって例証される（第６
図）。全体またはポリアデニル化されたRNAは、ホルム
アルデヒド中での変性ゲル電気泳動によって分離し（H.
D.Lehrach,D.Diamond,J.M.Wozney,H.Boedker,Biochemis
try 16,4743（1977））、ニトロセルローズに移行し、
緊縮条件のもとで32Pでラベルしたプローブでハイブリ
ッドさせた。該プローブは、以下の本発明のDNAのいづ
れか、例えばクローンpT11−HP（ゲノムのクローンT11
の0.95−kbp Hind III−Pst I断片）から；またはT11 c
DNA（コード領域全体を含むTR4の3.5−kbp BamH I断
片）から調製した。
従って、本発明のDNAおよびRNA〔特にここであげられ
た最も好ましいDNA〕を既知のハイブリッド形成法を使
用することによりいわゆる当業者は、無駄な実験をくり
かえすことなく、タイプαのPDGF−Ｒ遺伝子の発現レベ
ルを、タイプβのPDGF−Ｒ遺伝子または他の関連腫瘍遺
伝子のmRNAから妨害されることなく測定できる。
た最も好ましいDNA〕を既知のハイブリッド形成法を使
用することによりいわゆる当業者は、無駄な実験をくり
かえすことなく、タイプαのPDGF−Ｒ遺伝子の発現レベ
ルを、タイプβのPDGF−Ｒ遺伝子または他の関連腫瘍遺
伝子のmRNAから妨害されることなく測定できる。
本発明はまた、本発明のDNAセグメントまたは他の関
連DNAによってエンコーダされたペプチドに対する新規
の抗体類を含む。本発明によるこの実施例は、タイプα
のPDGF−Ｒ蛋白質またはその代りとして、ここではタイ
プβと命名された既知のPDGF−Ｒ蛋白質に特異的に結合
する抗体類を含むウサギ抗血清によって例証される。
連DNAによってエンコーダされたペプチドに対する新規
の抗体類を含む。本発明によるこの実施例は、タイプα
のPDGF−Ｒ蛋白質またはその代りとして、ここではタイ
プβと命名された既知のPDGF−Ｒ蛋白質に特異的に結合
する抗体類を含むウサギ抗血清によって例証される。
かかるタイプ特異的な抗血清（type specific antise
ra）は、それぞれのPDGF−Ｒ蛋白質（第３図に示された
タイプα配列の959−973残基およびそれぞれのcDNA配列
によって予測される、既知の対応するタイプβ配列の96
7−981残基）のカルボキシル末端領域から15のアミノ酸
配列を示す合成ペプチドに対して作られた。これらのペ
プチドは、次の基準に合致するように選択された。即
ち、２種のPDGF−Ｒタイプ間の配列関連性の欠除（50％
以下の配列の相同性）；相対親水性、およびもとの蛋白
質と反応性の抗体を成長する比較的高い可能性と関連す
ることが知られているカルボキシル末端の配置である。
ra）は、それぞれのPDGF−Ｒ蛋白質（第３図に示された
タイプα配列の959−973残基およびそれぞれのcDNA配列
によって予測される、既知の対応するタイプβ配列の96
7−981残基）のカルボキシル末端領域から15のアミノ酸
配列を示す合成ペプチドに対して作られた。これらのペ
プチドは、次の基準に合致するように選択された。即
ち、２種のPDGF−Ｒタイプ間の配列関連性の欠除（50％
以下の配列の相同性）；相対親水性、およびもとの蛋白
質と反応性の抗体を成長する比較的高い可能性と関連す
ることが知られているカルボキシル末端の配置である。
ペプチドに対する抗血清は、ペプチドを化学的に合成
し、それらを担体（thyroglobulin）に結合させ、かつ
ペプチド免疫の標準の方法に従って、完全なFreundのア
ジュバントとともに、ペプチド結合体をウサギに注射す
ることによって調製された。
し、それらを担体（thyroglobulin）に結合させ、かつ
ペプチド免疫の標準の方法に従って、完全なFreundのア
ジュバントとともに、ペプチド結合体をウサギに注射す
ることによって調製された。
これらの抗体は、蛋白質生成物の検出または精製に使
用できる。かくして第７図は、対応するタイプ特異的ペ
プチドに対して作られた２種の異ったウサギ抗体〔抗T1
1（タイプαのPDGF−Ｒ）および抗−HPR（タイプβのPD
GF−Ｒ）〕のWesternブロット実験における使い方を示
す。図から明らかなように、特定のPDGF−Ｒタイプは、
合成ペプチドで免疫したウサギ抗血清によって種々の細
胞中に特異的に検出される。
用できる。かくして第７図は、対応するタイプ特異的ペ
プチドに対して作られた２種の異ったウサギ抗体〔抗T1
1（タイプαのPDGF−Ｒ）および抗−HPR（タイプβのPD
GF−Ｒ）〕のWesternブロット実験における使い方を示
す。図から明らかなように、特定のPDGF−Ｒタイプは、
合成ペプチドで免疫したウサギ抗血清によって種々の細
胞中に特異的に検出される。
実験セクション 本セクションは、PDGFレセプター/CSF−1 レセプター
のサブファミリーのレセプターに類似した新規な遺伝子
のゲノム配列およびcDNAの同定およびクローニングのた
めの実験的研究について記載する。本遺伝子によって正
常ヒト組織中に既知の5.3−kb PDGF レセプターmRNAと
ともに発現する6.4−kb RNA転写体を生ずる。この新規
のPDGFレセプター遺伝子は、先祖関係のある染色体４お
よび５の上に存在するこのレセプターサブファミリーの
その他の遺伝子のクラスタと両立し、染色体４の4p11−
12の位置の染色体４に局在した。
のサブファミリーのレセプターに類似した新規な遺伝子
のゲノム配列およびcDNAの同定およびクローニングのた
めの実験的研究について記載する。本遺伝子によって正
常ヒト組織中に既知の5.3−kb PDGF レセプターmRNAと
ともに発現する6.4−kb RNA転写体を生ずる。この新規
のPDGFレセプター遺伝子は、先祖関係のある染色体４お
よび５の上に存在するこのレセプターサブファミリーの
その他の遺伝子のクラスタと両立し、染色体４の4p11−
12の位置の染色体４に局在した。
クローンされたcDNAに機能性のあることは、COS−１
細胞に新規な遺伝子のcDNAを導入することによって（ウ
ィルスのベクターを使用するトランスフェクションによ
る）、蛋白質の発現が、予測されたペプチドに対する抗
血清により特異的に検出されるという観察結果によって
示される。トランスフェクトされたが、対照区ではない
COS−１細胞は、125I−ヒトPDGFと特異的結合を示す
が、このPDGFはヒト血小板で見出された主要なAB型を含
む３種のPDGFイソフォームのすべてによって有効に競合
される。対照区に、COS−１細胞における既知のPDGFレ
セプターcDNAの発現は、PDGFのBB型に対する顕著な選好
性を特徴とする、同一のPDGFイソフォームによる異なっ
た競合パターンを有するPDGF結合を引きおこす。
細胞に新規な遺伝子のcDNAを導入することによって（ウ
ィルスのベクターを使用するトランスフェクションによ
る）、蛋白質の発現が、予測されたペプチドに対する抗
血清により特異的に検出されるという観察結果によって
示される。トランスフェクトされたが、対照区ではない
COS−１細胞は、125I−ヒトPDGFと特異的結合を示す
が、このPDGFはヒト血小板で見出された主要なAB型を含
む３種のPDGFイソフォームのすべてによって有効に競合
される。対照区に、COS−１細胞における既知のPDGFレ
セプターcDNAの発現は、PDGFのBB型に対する顕著な選好
性を特徴とする、同一のPDGFイソフォームによる異なっ
た競合パターンを有するPDGF結合を引きおこす。
新しいレセプター遺伝子が独特のPDGFレセプターをエ
ンコードするという更なる証拠は、元来PDGFレセプター
のないヒトの細胞の調査に由来しているが、その場合PD
GFレセプターの活性は、それぞれのcDNAをになうベクタ
ーを使用し、トランスフェクトすることによって導入さ
れたタイプαまたはタイプβのレセプターによって再構
成される。タイプαのレセプターを有する細胞は、以下
のPDGFにより仲介される細胞活性のすべて、すなわちレ
セプター遺伝子生成物のチロシンの燐酸化、DNA合成お
よびその結果としての細胞増殖の刺激、走化性、ホスホ
イノシチド（phosphoinositide）の分解、およびサイト
ゾルのカルシウムの起動（〔Ca+〕ｉ）において、PDGF
−ABに対して相当により高い反応性を有する。
ンコードするという更なる証拠は、元来PDGFレセプター
のないヒトの細胞の調査に由来しているが、その場合PD
GFレセプターの活性は、それぞれのcDNAをになうベクタ
ーを使用し、トランスフェクトすることによって導入さ
れたタイプαまたはタイプβのレセプターによって再構
成される。タイプαのレセプターを有する細胞は、以下
のPDGFにより仲介される細胞活性のすべて、すなわちレ
セプター遺伝子生成物のチロシンの燐酸化、DNA合成お
よびその結果としての細胞増殖の刺激、走化性、ホスホ
イノシチド（phosphoinositide）の分解、およびサイト
ゾルのカルシウムの起動（〔Ca+〕ｉ）において、PDGF
−ABに対して相当により高い反応性を有する。
かくして、再構成されたPDGF−Ｒ遺伝子生成物の各々
のタイプは、PDGF−BBに対して独自に同様な生化学的並
びに生物学的反応を誘発するが、タイプαのPDGF−Ｒ
は、血小板に見出されるヒトPDGFの主要なイソフォーム
であるPDGF−ABについてより好ましいレセプターであ
る。従って、タイプαのPDGFレセプターの構造または発
現の異常性は、深刻な病理学的影響を有するであろう
し、それに対して本発明は、診断および治療の手段を提
供する。
のタイプは、PDGF−BBに対して独自に同様な生化学的並
びに生物学的反応を誘発するが、タイプαのPDGF−Ｒ
は、血小板に見出されるヒトPDGFの主要なイソフォーム
であるPDGF−ABについてより好ましいレセプターであ
る。従って、タイプαのPDGFレセプターの構造または発
現の異常性は、深刻な病理学的影響を有するであろう
し、それに対して本発明は、診断および治療の手段を提
供する。
材料および方法 ヒト胎盤および胸腺DNAにおけるｖ−fmsおよびPDGFレ
セプター関連遺伝子の検出。ゲノムDNA 20μｇをEcoR I
で消化し、0.8％のアガロースゲル中での電気泳動によ
り分離して、ニトロセルロース紙に移行させた（E.M.So
uthern,J.Med.Biol.98,503（1975））。32Pでラベルし
たプローブに対するハイブリッド形成は（P.W.J.Rigby,
M.Dieckerman,C.Rhodes,P.Berg,J.Med.Biol.113,237（1
977））、50％または30％のホルムアミド、0.75M NaC
l、および0.075Mクエン酸ナトリウムの溶液中で42℃で
行われた（G.M.Wahl,M.Stern,G.R.Stark,Proc.Natl,Ada
d.Sci.USA 76,3683（1979））。ハイブリッド形成後、
ブロットを室温で２倍のSSC（0.3M NaCl;0.03Mクエン酸
ナトリウム）で洗ってから、50℃で0.1倍または0.6倍の
SSC（それぞれ緊縮または緩和条件）で洗った。ｖ−fms
のプローブは、ｖ−fms腫瘍遺伝子（A.Hampe,M.Gobet,
C.J.Sherr,F.Galibert,Proc.Soc.NaCl.Acad.Sci.USA 8
1,85（1984））の3891から4419のヌクレオチドを包含す
る0.44−kbp Xho I−Bal II断片であった。マウスPDGF
レセプターのプローブは、そのcDNAのヌクレオチド2490
から2995を包含する0.5−kbp Sin I−Pvu I断片であっ
た（Y.Yarden et al.,Nature 323,226（1986））。
セプター関連遺伝子の検出。ゲノムDNA 20μｇをEcoR I
で消化し、0.8％のアガロースゲル中での電気泳動によ
り分離して、ニトロセルロース紙に移行させた（E.M.So
uthern,J.Med.Biol.98,503（1975））。32Pでラベルし
たプローブに対するハイブリッド形成は（P.W.J.Rigby,
M.Dieckerman,C.Rhodes,P.Berg,J.Med.Biol.113,237（1
977））、50％または30％のホルムアミド、0.75M NaC
l、および0.075Mクエン酸ナトリウムの溶液中で42℃で
行われた（G.M.Wahl,M.Stern,G.R.Stark,Proc.Natl,Ada
d.Sci.USA 76,3683（1979））。ハイブリッド形成後、
ブロットを室温で２倍のSSC（0.3M NaCl;0.03Mクエン酸
ナトリウム）で洗ってから、50℃で0.1倍または0.6倍の
SSC（それぞれ緊縮または緩和条件）で洗った。ｖ−fms
のプローブは、ｖ−fms腫瘍遺伝子（A.Hampe,M.Gobet,
C.J.Sherr,F.Galibert,Proc.Soc.NaCl.Acad.Sci.USA 8
1,85（1984））の3891から4419のヌクレオチドを包含す
る0.44−kbp Xho I−Bal II断片であった。マウスPDGF
レセプターのプローブは、そのcDNAのヌクレオチド2490
から2995を包含する0.5−kbp Sin I−Pvu I断片であっ
た（Y.Yarden et al.,Nature 323,226（1986））。
λT11ゲノム断片並びにT11のcDNAおよびPDGF−Ｒ遺伝
子の分子クローニング。特定のcDNAクローン（カッコ
中）が分離されたライブラリーは、例えばOkayma−Berg
ベクター（pHF）中のヒト繊維芽細胞mRNA λgt11中のヒ
ト幼児脳mRNA（λHB）、λgt11中のヒト胎児繊維芽細胞
のランダムにプライムされたmRNA（λEF）、および指向
性クローニングphagemid（TR4またはHPR）中のヒト胎児
繊維芽細胞mRNAを包含した。制限部位は、一重および二
重の消化による生成物を電気泳動で分析することによっ
て決定した。ｖ−fmsまたはマウスのPDGFレセプタープ
ローブに対して相同のλT11領域は、第１図に記載した
ように、ハイブリッド形成によって同定された。ｖ−/f
msおよびマウスPDGFレセプタープローブに相同な領域を
含む３個の制限断片（0.95−kbp Hind III−Pst I,0.5k
bp Ava I−Sac I、および0.35−kbp Kpn I−Xba I）
は、プラスミド中にサブクローンされたdideoxy鎖終止
方法（F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 74,5463（1977））によって配列が決定され
た。
子の分子クローニング。特定のcDNAクローン（カッコ
中）が分離されたライブラリーは、例えばOkayma−Berg
ベクター（pHF）中のヒト繊維芽細胞mRNA λgt11中のヒ
ト幼児脳mRNA（λHB）、λgt11中のヒト胎児繊維芽細胞
のランダムにプライムされたmRNA（λEF）、および指向
性クローニングphagemid（TR4またはHPR）中のヒト胎児
繊維芽細胞mRNAを包含した。制限部位は、一重および二
重の消化による生成物を電気泳動で分析することによっ
て決定した。ｖ−fmsまたはマウスのPDGFレセプタープ
ローブに対して相同のλT11領域は、第１図に記載した
ように、ハイブリッド形成によって同定された。ｖ−/f
msおよびマウスPDGFレセプタープローブに相同な領域を
含む３個の制限断片（0.95−kbp Hind III−Pst I,0.5k
bp Ava I−Sac I、および0.35−kbp Kpn I−Xba I）
は、プラスミド中にサブクローンされたdideoxy鎖終止
方法（F.Sanger,S.Nicklen,A.R.Coulson,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 74,5463（1977））によって配列が決定され
た。
T11遺伝子の染色体マッピング。プローブを、変形ニ
ック翻訳キット（Amershem,ArlingtonHeights,IL）を使
用して、４種の3Hヌクレオチド（New England Nuclear,
Boston,MA）すべてにより、比活性が2.5×107 cpm/ngDN
Aになるように、ラベルした。methotrexateでシンクロ
ナイズされたヒト周辺部淋巴球培養体からのヒトのメタ
ファーゼおよびプロメタファーゼとの切片上ハイブリッ
ド形成を、以前記載されたようにして行った（M.E.Harp
er and G.F.Saunders,Chromosoma（Barl.）83,431（198
1）;N.C.Popescu et al.,Cytogenet.Cell Genet 39,73
（1985））。
ック翻訳キット（Amershem,ArlingtonHeights,IL）を使
用して、４種の3Hヌクレオチド（New England Nuclear,
Boston,MA）すべてにより、比活性が2.5×107 cpm/ngDN
Aになるように、ラベルした。methotrexateでシンクロ
ナイズされたヒト周辺部淋巴球培養体からのヒトのメタ
ファーゼおよびプロメタファーゼとの切片上ハイブリッ
ド形成を、以前記載されたようにして行った（M.E.Harp
er and G.F.Saunders,Chromosoma（Barl.）83,431（198
1）;N.C.Popescu et al.,Cytogenet.Cell Genet 39,73
（1985））。
Northernブロットハイブリッド形成法によるmRNA種の
比較。全部またはポリアデニル化されたRNAをホルムア
ルデヒド中で変性ゲル電気泳動の実施によって分離し
（H.D.Lehrach,D.Diamond,J.M.Wozney,H.Boedtker,Bioc
hemistry 16,4743（1977））、ニトロセルローズ膜に移
して、32Pでラベルしたプローブを用いて緊縮の条件で
（50％ホルムアミド、0.075M NaCl、075Mクエン酸ナト
リウム、42℃）でハイブリッドさせた。
比較。全部またはポリアデニル化されたRNAをホルムア
ルデヒド中で変性ゲル電気泳動の実施によって分離し
（H.D.Lehrach,D.Diamond,J.M.Wozney,H.Boedtker,Bioc
hemistry 16,4743（1977））、ニトロセルローズ膜に移
して、32Pでラベルしたプローブを用いて緊縮の条件で
（50％ホルムアミド、0.075M NaCl、075Mクエン酸ナト
リウム、42℃）でハイブリッドさせた。
抗ペプチド血清によるT11およびPDGF−Ｒ蛋白質の検
出。抗T11（anti−T11）および抗PDGF−Ｒ血清（anti−
PDGF−R sera）を、予想レセプターの対応するカルボキ
シル末端領域から15個のアミノ酸ペプチドによりウサギ
を免疫することによって得た。これらのペプチド配列の
相同性は、50％以下であった。cDNA発現プラスミドをヌ
クレオチドの１〜3454を包含するT11 cDNA（第３図）ま
たはヌクレオチドの１〜3939を包含するPDGF−R cDNA
を、サルのSarcomaウィルスLTRがプロモーターとして工
学的に組入れられたpSV2gptベクター中に導入すること
によって組立てた（C.R.King,N.A.Giese,K.C.Robbins,
S.A.Aaronson,Proc,Natl.Acad.Sci.USA82,5295（198
5））。10cmのペトリ皿に約106のCOS−１細胞を、10％
の牛胎児血清を添加したDulbeccoの変法によるEagleの
倍知（DMEM）中で、トランスフェクションの24時間前に
インキュベートした。DNAのトランスフェクションは、
燐酸カルシウム沈澱法によって分析の48時間前に実施さ
れた（M.Wigler et al.,Cell 11,223,（1977））。培養
体をstaph−Ａバッファー（10mM燐酸ナトリウムpH7.5,1
00mM NaCl,1％TritonX−100,0.1％SDS,0.5％ deoxychol
ate,0.1％ apro−tinin,1mMPMSF、および1mM sodium or
thovanadate）で溶解し、10,000 x g、30分間の遠心分
離により透明にした。蛋白質類（100μg/レーン）を７
％のSDSポリアクリルアミドゲルによる電気泳動で溶解
させ、ニトロセルローズフィルターに移して、125I−pr
otein A（H.Towbin,T.Staehelin,J.Gordon,Natl.Acad.S
ci.USA 76,4350（1979））を使用して免疫ブロット分析
（ペプチドブロッキングを使用または不使用）によって
調べた。
出。抗T11（anti−T11）および抗PDGF−Ｒ血清（anti−
PDGF−R sera）を、予想レセプターの対応するカルボキ
シル末端領域から15個のアミノ酸ペプチドによりウサギ
を免疫することによって得た。これらのペプチド配列の
相同性は、50％以下であった。cDNA発現プラスミドをヌ
クレオチドの１〜3454を包含するT11 cDNA（第３図）ま
たはヌクレオチドの１〜3939を包含するPDGF−R cDNA
を、サルのSarcomaウィルスLTRがプロモーターとして工
学的に組入れられたpSV2gptベクター中に導入すること
によって組立てた（C.R.King,N.A.Giese,K.C.Robbins,
S.A.Aaronson,Proc,Natl.Acad.Sci.USA82,5295（198
5））。10cmのペトリ皿に約106のCOS−１細胞を、10％
の牛胎児血清を添加したDulbeccoの変法によるEagleの
倍知（DMEM）中で、トランスフェクションの24時間前に
インキュベートした。DNAのトランスフェクションは、
燐酸カルシウム沈澱法によって分析の48時間前に実施さ
れた（M.Wigler et al.,Cell 11,223,（1977））。培養
体をstaph−Ａバッファー（10mM燐酸ナトリウムpH7.5,1
00mM NaCl,1％TritonX−100,0.1％SDS,0.5％ deoxychol
ate,0.1％ apro−tinin,1mMPMSF、および1mM sodium or
thovanadate）で溶解し、10,000 x g、30分間の遠心分
離により透明にした。蛋白質類（100μg/レーン）を７
％のSDSポリアクリルアミドゲルによる電気泳動で溶解
させ、ニトロセルローズフィルターに移して、125I−pr
otein A（H.Towbin,T.Staehelin,J.Gordon,Natl.Acad.S
ci.USA 76,4350（1979））を使用して免疫ブロット分析
（ペプチドブロッキングを使用または不使用）によって
調べた。
125IでラベルしたヒトPDGFの細胞上のレセプターに対
する結合。COS−１細胞を12ウエルのプレートにうえつ
けて、第７図に記載されているようにアッセイ前の48時
間にトランスフェクトした。ヒトPDGFをchloramine−Ｔ
法で125Iでラベルし、比活性を3.7×104cpm/ngとした
（W.M.Hunter and F.C.Greenwood,Nature 194,495（196
2））。ヒト血小板から分離され125IでラベルされたPDG
Fの、50〜100倍過剰の未ラベルのヒトPDGF（AB）（Coll
aborative Research）または組換ヒトPDGF−BB（AmGe
n）または組換PDGF−AA（P.Beckman et al.,Sience 24
1,1346（1988））の不在または存在のもとにおける結合
を（E.W.Raines and R.Ross.J.Biol,Chem 257,5154（19
82））、４℃で２時間行った。結合しない125IPDGFを、
結合に用いた緩衝液で４回継続して洗うことによって除
去した（牛血清アルブミンをmlあたり1mg含有するDME
M）。続いて細胞を可溶化緩衝液で（１％Triton X−10
0、20mM Hepes pH7.4、10％［v/v］グリセロール）で溶
解し、γカウンターを使用して放射能を測定した。
する結合。COS−１細胞を12ウエルのプレートにうえつ
けて、第７図に記載されているようにアッセイ前の48時
間にトランスフェクトした。ヒトPDGFをchloramine−Ｔ
法で125Iでラベルし、比活性を3.7×104cpm/ngとした
（W.M.Hunter and F.C.Greenwood,Nature 194,495（196
2））。ヒト血小板から分離され125IでラベルされたPDG
Fの、50〜100倍過剰の未ラベルのヒトPDGF（AB）（Coll
aborative Research）または組換ヒトPDGF−BB（AmGe
n）または組換PDGF−AA（P.Beckman et al.,Sience 24
1,1346（1988））の不在または存在のもとにおける結合
を（E.W.Raines and R.Ross.J.Biol,Chem 257,5154（19
82））、４℃で２時間行った。結合しない125IPDGFを、
結合に用いた緩衝液で４回継続して洗うことによって除
去した（牛血清アルブミンをmlあたり1mg含有するDME
M）。続いて細胞を可溶化緩衝液で（１％Triton X−10
0、20mM Hepes pH7.4、10％［v/v］グリセロール）で溶
解し、γカウンターを使用して放射能を測定した。
タイプαおよびβPDGF−Ｒ遺伝子成長物のチロシン自
動燐酸化。PDGFを加えて５分間37℃でインキュベート
後、細胞溶解物を抗ペプチド抗血清によって免疫沈澱さ
せた。全細胞溶解物または免疫沈澱物を、レセプターま
たはphosphotyrosine（抗−Ｐ−Tyr）（J.J.Wang,Mol.C
ell.Biol.5,3640（1985））に対する抗体を使用して、
免疫ブロット（immunoblot）法によって分析した。抗ph
osphotyrosine抗体を遮断用の10mMのphosphotyrosineと
ともに、予めインキュベートした。
動燐酸化。PDGFを加えて５分間37℃でインキュベート
後、細胞溶解物を抗ペプチド抗血清によって免疫沈澱さ
せた。全細胞溶解物または免疫沈澱物を、レセプターま
たはphosphotyrosine（抗−Ｐ−Tyr）（J.J.Wang,Mol.C
ell.Biol.5,3640（1985））に対する抗体を使用して、
免疫ブロット（immunoblot）法によって分析した。抗ph
osphotyrosine抗体を遮断用の10mMのphosphotyrosineと
ともに、予めインキュベートした。
結果 新しいヒトPDGF−R/CSF1−Ｒ関連遺伝子の検出。PDGF
−R/CSF1−Ｒ族の既知の成長因子レセプター遺伝子に関
連した新規な配列を探求するために、ヒト胎盤および胸
腺から調製された高分子量DNAをEcosR Iで消化しｖ−fm
sのチロシンキナーゼ領域由来のDNAプローブおよびマウ
スPDGF−Ｒ遺伝子（第１図）由来のDNAプローブを使用
して、ブロットハイブリッド形成法によって分析した。
緊縮条件下では、ｖ−fmsプローブは、以前報告された
この部位（D.Q.Xu,S.Guilhot,F.Galibert,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 82,2862（1985））における制限多形性（re
striction polymorphism）にもとづいて、27−kbpおよ
び／または20−kbpのEcoR I制限断片を検出した。低い
緊縮条件のもとでは、いくつかのｖ−fmsのプローブに
ハイブリッドした12−,6.8−,5−,2.7−,2.2−kbpの断
片が更に観察された。対応したマウスのPDGF−R cDNAの
領域は、緊縮条件のもとでは単一の21−kbp断片とハイ
ブリッドした（第１図）。
−R/CSF1−Ｒ族の既知の成長因子レセプター遺伝子に関
連した新規な配列を探求するために、ヒト胎盤および胸
腺から調製された高分子量DNAをEcosR Iで消化しｖ−fm
sのチロシンキナーゼ領域由来のDNAプローブおよびマウ
スPDGF−Ｒ遺伝子（第１図）由来のDNAプローブを使用
して、ブロットハイブリッド形成法によって分析した。
緊縮条件下では、ｖ−fmsプローブは、以前報告された
この部位（D.Q.Xu,S.Guilhot,F.Galibert,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 82,2862（1985））における制限多形性（re
striction polymorphism）にもとづいて、27−kbpおよ
び／または20−kbpのEcoR I制限断片を検出した。低い
緊縮条件のもとでは、いくつかのｖ−fmsのプローブに
ハイブリッドした12−,6.8−,5−,2.7−,2.2−kbpの断
片が更に観察された。対応したマウスのPDGF−R cDNAの
領域は、緊縮条件のもとでは単一の21−kbp断片とハイ
ブリッドした（第１図）。
より低い緊縮度では、同じプローブは更にいくつかの
断片を検出し、その内の若干は、上述のｖ−fms関連の
断片の大きさに類似のサイズを有していた。これらの中
で、12−kpd EcoR I断片は、他の断片より以上につよく
双方のプローブとハイブリッドした。更に、比較的小さ
い若干のバンドは、ヒトｃ−kitに対して報告された制
限断片に対応した（P.Besmer al.,Nature 320,415（198
6）;Y.Yarden et al.,EMBOJ.6,3341（1987））。かくし
て、12−kbp EcoR I DNA断片をクローンし、またその性
質を一層十分に検討することが決定された。
断片を検出し、その内の若干は、上述のｖ−fms関連の
断片の大きさに類似のサイズを有していた。これらの中
で、12−kpd EcoR I断片は、他の断片より以上につよく
双方のプローブとハイブリッドした。更に、比較的小さ
い若干のバンドは、ヒトｃ−kitに対して報告された制
限断片に対応した（P.Besmer al.,Nature 320,415（198
6）;Y.Yarden et al.,EMBOJ.6,3341（1987））。かくし
て、12−kbp EcoR I DNA断片をクローンし、またその性
質を一層十分に検討することが決定された。
λEMBL−４ベクター系を使用して、蔗糖勾配によって
大きさの選択されたゲノムライブラリーを、EcoR I 消
化正常ヒト胸腺DNAから組立てた。第２図は12−kbp Eco
R I 挿入片を含むλT11の制限地図を示すが、これはｖ
−fmsおよびマウスのPDGF−Ｒのプローブでもっぱら緩
和されているが緊縮でないハイブリッド形成条件下での
みハイブリッドさせたものを表わす。ｖ−fms/PDGF−Ｒ
チロシンキナーゼ領域に相同の領域は、λT11DNAの制限
エンドヌクレアーゼ消化物に対するハイブリッド形勢に
よって配置が決定された。
大きさの選択されたゲノムライブラリーを、EcoR I 消
化正常ヒト胸腺DNAから組立てた。第２図は12−kbp Eco
R I 挿入片を含むλT11の制限地図を示すが、これはｖ
−fmsおよびマウスのPDGF−Ｒのプローブでもっぱら緩
和されているが緊縮でないハイブリッド形成条件下での
みハイブリッドさせたものを表わす。ｖ−fms/PDGF−Ｒ
チロシンキナーゼ領域に相同の領域は、λT11DNAの制限
エンドヌクレアーゼ消化物に対するハイブリッド形勢に
よって配置が決定された。
λT11の0.95−kbp Hind III−Pst I,0.5−kbp Ava I
−Sac I、および0.35−kbp Kpn I−Xba I断片にハイブ
リッドする配列を含む３個のプラスミドサブクローンを
ヌクレオチド配列分析で調べた。これらの別個の開いた
読みとり枠（第３図）は、ヒトｃ−fms並びにマウスPDG
F−Ｒ遺伝子に対する関連性を示したが、これらの遺伝
子の各々からは容易に区別され（C.J.Sherr et al.,Cel
l 41,665（1985）;L.Coussens et al.,Nature 320,277
（1986）;Y.Yarden et al.,Nature 323,226（198
6））、さらに、ｃ−kit（P.Besmer et al.,Nature 32
0,415（1986）;Y.Yarden et al.,EMBOJ.6,3341（198
7））からも区別された。この３個の推定のコード領域
は、真核生物の遺伝子のエキソン（R.Breathnad and P.
Chambon,Annu.Rev.Biochem.50,349（1981））に面するA
GおよびGTジヌクレオチドによってそれぞれ境界を接し
た。
−Sac I、および0.35−kbp Kpn I−Xba I断片にハイブ
リッドする配列を含む３個のプラスミドサブクローンを
ヌクレオチド配列分析で調べた。これらの別個の開いた
読みとり枠（第３図）は、ヒトｃ−fms並びにマウスPDG
F−Ｒ遺伝子に対する関連性を示したが、これらの遺伝
子の各々からは容易に区別され（C.J.Sherr et al.,Cel
l 41,665（1985）;L.Coussens et al.,Nature 320,277
（1986）;Y.Yarden et al.,Nature 323,226（198
6））、さらに、ｃ−kit（P.Besmer et al.,Nature 32
0,415（1986）;Y.Yarden et al.,EMBOJ.6,3341（198
7））からも区別された。この３個の推定のコード領域
は、真核生物の遺伝子のエキソン（R.Breathnad and P.
Chambon,Annu.Rev.Biochem.50,349（1981））に面するA
GおよびGTジヌクレオチドによってそれぞれ境界を接し
た。
T11配列が転写されたか否かを査定するために種々の
細胞のNorthernブロット分析が、エキソン（ａ）（第２
図）を含み、かつヒトの反復配列を欠如0.95−kbp Hind
III−Pst I断片（pT11−HP）のクローンを使用して実
施された。緊縮な条件のもとで、単一の6.4−kbp RNA転
写体が正常ヒト繊維芽細胞から調製されたpoly（Ａ）＋
RNAの中に検出された（データ省略）。この転写体は、
以前に報告されているPDGF−Ｒ（Y.Yarden et al.,Natu
re 323,226（1986））,c−fms（３）またはｃ−kit遺伝
子（P.Besmer et al.,Nature 320,415（1986）;Y.Yarde
n et al.,EMBOJ.6,3341（1987））に対する転写体とは
大きさにおいて異っていた。これらの発見のすべてによ
り、T11配列が既知のチロシンキナーゼレセプターのサ
ブファミリーの既知メンバーとは異なる遺伝子を表わし
ていることが示された。
細胞のNorthernブロット分析が、エキソン（ａ）（第２
図）を含み、かつヒトの反復配列を欠如0.95−kbp Hind
III−Pst I断片（pT11−HP）のクローンを使用して実
施された。緊縮な条件のもとで、単一の6.4−kbp RNA転
写体が正常ヒト繊維芽細胞から調製されたpoly（Ａ）＋
RNAの中に検出された（データ省略）。この転写体は、
以前に報告されているPDGF−Ｒ（Y.Yarden et al.,Natu
re 323,226（1986））,c−fms（３）またはｃ−kit遺伝
子（P.Besmer et al.,Nature 320,415（1986）;Y.Yarde
n et al.,EMBOJ.6,3341（1987））に対する転写体とは
大きさにおいて異っていた。これらの発見のすべてによ
り、T11配列が既知のチロシンキナーゼレセプターのサ
ブファミリーの既知メンバーとは異なる遺伝子を表わし
ていることが示された。
新規な遺伝子のcDNAクローニング。Okayama−Berg発
現ベクターにおける正常ヒト繊維芽細胞のcDNAライブラ
リーを、最初にλT11の0.9−kbp Hind III−Pst I断片
のpT11−HPクローンを使用して緊縮条件のもとでスクリ
ーニングした。3.9−kbp cDNA挿入片を含む１個の強く
対合するクローンを分離した（第２図）。PHF1と命名さ
れた該クローンは、正常なヒト繊維芽細胞における6.4
−kb転写体とハイブリッドし、またその３′末端にpoly
（Ａ）の尾部がつづくポリアデニル化のシグナルを含ん
でいた。これはまた、λT11DNA内にエンコードする配
列、およびエキソン（ａ）の上流に、CSF1−Ｒ−PDGF−
Ｒチロシンキナーゼ領域に関連した170個のヌクレオチ
ドも含んでいた。
現ベクターにおける正常ヒト繊維芽細胞のcDNAライブラ
リーを、最初にλT11の0.9−kbp Hind III−Pst I断片
のpT11−HPクローンを使用して緊縮条件のもとでスクリ
ーニングした。3.9−kbp cDNA挿入片を含む１個の強く
対合するクローンを分離した（第２図）。PHF1と命名さ
れた該クローンは、正常なヒト繊維芽細胞における6.4
−kb転写体とハイブリッドし、またその３′末端にpoly
（Ａ）の尾部がつづくポリアデニル化のシグナルを含ん
でいた。これはまた、λT11DNA内にエンコードする配
列、およびエキソン（ａ）の上流に、CSF1−Ｒ−PDGF−
Ｒチロシンキナーゼ領域に関連した170個のヌクレオチ
ドも含んでいた。
pHF1の0.4−kbp 5′末端をヒト幼児脳ライブラリーの
オーバーラップしたcDNAクローンを探すために使用し
た。緊縮条件のもとで、類似した制限地図を有する多く
の正（positive）のクローンを分離した（データは図示
せず）。最長λHB6（第２図）を配列分析にかけた。可
能なATG開始コドンは、別のクローン、すなわちλEF17
内部で、同定された。このλEF17は、λHB6の0.2−kbp
5′断片をプローブとして使用し、λgt11ベクターの中
で,M426ヒト胎児繊維芽細胞のcDNAライブラリーをスク
リーニングすることによって分離されたものである。こ
の３種のオーバーラップしたクローン（pHF1,λHB6およ
びλEF17）は、３′の翻訳されない配列（第２図）の13
8−bp 5′および−３−kbpに加えて、全コード領域（co
ding region）を包含していた。
オーバーラップしたcDNAクローンを探すために使用し
た。緊縮条件のもとで、類似した制限地図を有する多く
の正（positive）のクローンを分離した（データは図示
せず）。最長λHB6（第２図）を配列分析にかけた。可
能なATG開始コドンは、別のクローン、すなわちλEF17
内部で、同定された。このλEF17は、λHB6の0.2−kbp
5′断片をプローブとして使用し、λgt11ベクターの中
で,M426ヒト胎児繊維芽細胞のcDNAライブラリーをスク
リーニングすることによって分離されたものである。こ
の３種のオーバーラップしたクローン（pHF1,λHB6およ
びλEF17）は、３′の翻訳されない配列（第２図）の13
8−bp 5′および−３−kbpに加えて、全コード領域（co
ding region）を包含していた。
ヒト小児脳のライブラリーをスクリーニングする際に
プラークハイブリッド形成（plaque hybridization）に
おいて比較弱いシグナルを与えた２つのクローンのλHB
3とλHB4の配列も決定した。これらの、マウスPDGF−R
cDNA（Y.Yarden et al.,Nature 323,226（1986））の配
列に近い類似性を示した。更に、λHB4の2.0−kbp挿入
片を正常のヒト繊維芽細胞RNAにハイブリッドさせた際
に、PDGF−Ｒの動写体に符合する5.3−kbの転写体を検
出した（Y.Yarden et al.,Nature 323,226（1986））。
プラークハイブリッド形成（plaque hybridization）に
おいて比較弱いシグナルを与えた２つのクローンのλHB
3とλHB4の配列も決定した。これらの、マウスPDGF−R
cDNA（Y.Yarden et al.,Nature 323,226（1986））の配
列に近い類似性を示した。更に、λHB4の2.0−kbp挿入
片を正常のヒト繊維芽細胞RNAにハイブリッドさせた際
に、PDGF−Ｒの動写体に符合する5.3−kbの転写体を検
出した（Y.Yarden et al.,Nature 323,226（1986））。
λHB4の５′末端からさらに上流の配列を含むクロー
ンはいずれも、λgt11中でヒト小児脳cDNAライブラリー
をスクリーンニングすることによって得ることはできな
かった。これは別に記載（標題“効率的指向性クローニ
ング系（Efficient Directional Cloning System）”の
米国特許明細書のテーマ、1989年２月出願）されたよう
にして組立てられた新しいphagemidベクター中でM426ヒ
ト胎児繊維芽細胞cDNAライブラリーを利用することによ
って完成した。このライブラリーをλHB−３の0.3−kbp
5′サブフラグメントでスクリーニングすることによっ
て、２個のオーバラップしたクローン、HPR2およびHPR5
を得た。これらには、既知のヒトのPDGF−Ｒのエンコー
ド配列の全部、その完全な３′非翻訳領域（untranslat
ed region）、およびその５′非翻訳領域の360個のヌク
レオチドを含んでいた（第２図）。新しい関連遺伝子の
6.4−kbp cDNAクローン（TR4）はまた、同じライブラリ
ーから、λEF17の５′0.2−kbpサブフラグメントにより
スクリーニングすることによって得られた。
ンはいずれも、λgt11中でヒト小児脳cDNAライブラリー
をスクリーンニングすることによって得ることはできな
かった。これは別に記載（標題“効率的指向性クローニ
ング系（Efficient Directional Cloning System）”の
米国特許明細書のテーマ、1989年２月出願）されたよう
にして組立てられた新しいphagemidベクター中でM426ヒ
ト胎児繊維芽細胞cDNAライブラリーを利用することによ
って完成した。このライブラリーをλHB−３の0.3−kbp
5′サブフラグメントでスクリーニングすることによっ
て、２個のオーバラップしたクローン、HPR2およびHPR5
を得た。これらには、既知のヒトのPDGF−Ｒのエンコー
ド配列の全部、その完全な３′非翻訳領域（untranslat
ed region）、およびその５′非翻訳領域の360個のヌク
レオチドを含んでいた（第２図）。新しい関連遺伝子の
6.4−kbp cDNAクローン（TR4）はまた、同じライブラリ
ーから、λEF17の５′0.2−kbpサブフラグメントにより
スクリーニングすることによって得られた。
推論されたアミノ酸配列は、T11遺伝子をPDGF−R/CSF
1−Ｒサブファミリーの一員として確定する。T11遺伝子
の6.4−kbp cDNAの完全なヌクレオチド配列を第３図に
示す。ヌクレオチドの位置139において、可能なATG開始
コドンで始まる開いた読みとり枠は、部位3406における
TAA終止コドン迄伸張した。この開いた読みとり枠は、
更に上流に伸びたが、推定される開始ATGコドンは、真
正開始コドンのKozakの基準（M.Kozak.Cell 44,283（19
86））をみたす配列に隣接していた。更に最初の23のア
ミノ酸の伸びは、切断可能な疎水性のシグナルペプチド
の特性を発揮した（図３および４）。３′末端で、開い
た読みとり枠には、非翻訳配列の３′−kbpが後続し
た。ポリアデニル化シグナル（AATAAA）はcDNAの３′端
のpoly（Ａ）配列から25ヌクレオチド上流に位置してい
た。
1−Ｒサブファミリーの一員として確定する。T11遺伝子
の6.4−kbp cDNAの完全なヌクレオチド配列を第３図に
示す。ヌクレオチドの位置139において、可能なATG開始
コドンで始まる開いた読みとり枠は、部位3406における
TAA終止コドン迄伸張した。この開いた読みとり枠は、
更に上流に伸びたが、推定される開始ATGコドンは、真
正開始コドンのKozakの基準（M.Kozak.Cell 44,283（19
86））をみたす配列に隣接していた。更に最初の23のア
ミノ酸の伸びは、切断可能な疎水性のシグナルペプチド
の特性を発揮した（図３および４）。３′末端で、開い
た読みとり枠には、非翻訳配列の３′−kbpが後続し
た。ポリアデニル化シグナル（AATAAA）はcDNAの３′端
のpoly（Ａ）配列から25ヌクレオチド上流に位置してい
た。
このシグナルペプチドに対する指定切断部位に従って
（G.von Heijne,Nucleic Acids Res.14,4683（198
6））、成熟成長物のアミノ末端は、1066個のアミノ酸
が後続する24番目のアミノ酸におけるグルタミンと予測
された。この略120kd（キロダルトン）の計算分子量値
を有するポリペプチド配列は、膜伸張チロシンキナーゼ
レセプターのすべての特徴を含んでいた。24個のアミノ
酸（525〜548残基）からなる疎水性のセグメントは、レ
セプターの膜透過領域の特徴を発揮した（図３および
４）。このシグナルペプチドと膜透過領域の間に、PDGF
−R/CSF1−Ｒのサブファミリー領域を結合する細胞外リ
ガンドとの構造上の相同性が存在した。10個のシステイ
ン残基がこのサブファミリーの他のレセプターと同一の
部位の配置を有し、また８個の潜在的なＮ連鎖（Ｎ−li
nked）グリコシル化部位がその推定細胞外領域に分布し
ていた（第３図）。
（G.von Heijne,Nucleic Acids Res.14,4683（198
6））、成熟成長物のアミノ末端は、1066個のアミノ酸
が後続する24番目のアミノ酸におけるグルタミンと予測
された。この略120kd（キロダルトン）の計算分子量値
を有するポリペプチド配列は、膜伸張チロシンキナーゼ
レセプターのすべての特徴を含んでいた。24個のアミノ
酸（525〜548残基）からなる疎水性のセグメントは、レ
セプターの膜透過領域の特徴を発揮した（図３および
４）。このシグナルペプチドと膜透過領域の間に、PDGF
−R/CSF1−Ｒのサブファミリー領域を結合する細胞外リ
ガンドとの構造上の相同性が存在した。10個のシステイ
ン残基がこのサブファミリーの他のレセプターと同一の
部位の配置を有し、また８個の潜在的なＮ連鎖（Ｎ−li
nked）グリコシル化部位がその推定細胞外領域に分布し
ていた（第３図）。
細胞質領域は、保存されたチロシンキナーゼ領域およ
び親水性カルボキシル末端の尾部から成っていた（図３
および４）。チロシンキナーゼ領域は、共通（consensu
s）ATP結合配列（Gly−Ｘ−Gly−Ｘ−Ｘ−Gly....Lys残
基）および、416部位にあるpp60v-srcの主要な自動燐酸
化部に相同な849部位のチロシン残基を含んでいた（J.
E.Smart et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 78,6013（19
81））。更に、チロシンキナーゼを、以前にｃ−fms/CS
F1−R,PDGF−Ｒおよびｃ−kitに対して示したように、
親水性インターキナーゼ配列によって２つの領域に分け
た（第４図）。
び親水性カルボキシル末端の尾部から成っていた（図３
および４）。チロシンキナーゼ領域は、共通（consensu
s）ATP結合配列（Gly−Ｘ−Gly−Ｘ−Ｘ−Gly....Lys残
基）および、416部位にあるpp60v-srcの主要な自動燐酸
化部に相同な849部位のチロシン残基を含んでいた（J.
E.Smart et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 78,6013（19
81））。更に、チロシンキナーゼを、以前にｃ−fms/CS
F1−R,PDGF−Ｒおよびｃ−kitに対して示したように、
親水性インターキナーゼ配列によって２つの領域に分け
た（第４図）。
PDGF−Ｒ、CSF1−Ｒ、およびｃ−kitのアミノ酸と細
胞外領域のアミノ酸の相同性は、それぞれ31％、18％お
よび19％であった。T11遺伝子の２個のキナーゼの領域
は、ｃ−fmsおよびｃ−kitに対する67〜70％に比較し
て、ヒトPDGFレセプターのキナーゼの領域に対して最も
相同であった（それぞれ85％および75％）（第４図）。
インターキナーゼの領域においてさえも、このアミノ酸
の配列は、ｃ−fmsまたはｃ−kitの10および19％の相同
性と比較して、27％の相同性でPDGF−Ｒにより接近して
並列するものであった。これらの観察によって、T11生
成物は、PDGF−R/CSF1−Ｒのサブファミリー中にあり、
またPDGF−Ｒに最も深く関連しているという結論に導か
れる。
胞外領域のアミノ酸の相同性は、それぞれ31％、18％お
よび19％であった。T11遺伝子の２個のキナーゼの領域
は、ｃ−fmsおよびｃ−kitに対する67〜70％に比較し
て、ヒトPDGFレセプターのキナーゼの領域に対して最も
相同であった（それぞれ85％および75％）（第４図）。
インターキナーゼの領域においてさえも、このアミノ酸
の配列は、ｃ−fmsまたはｃ−kitの10および19％の相同
性と比較して、27％の相同性でPDGF−Ｒにより接近して
並列するものであった。これらの観察によって、T11生
成物は、PDGF−R/CSF1−Ｒのサブファミリー中にあり、
またPDGF−Ｒに最も深く関連しているという結論に導か
れる。
今一つのcDNAクローンの推定されるアミノ酸配列は
（TR4 cDNAクローンを製造したのと同じ実験により得ら
れた）、その成長物を既知のヒトPDGFレセプターとして
確定した。その配列は、最近発表された既知のヒトPDGF
レセプターの配列と殆ど完全に一致した（P.G.K.Gronwa
ld et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,3435（1988）;
L.Claesson−Welsh et al.,Mol.Cell.Biol.8,3476（198
8））。１個のヌクレオチドの相異は、残基240をアスパ
ラギン（Asn）からセリン（Ser）に変えた。また、マウ
スPDGFレセプターcDNAアミノ酸配列との比較により、リ
ガンド結合配列（79％）、膜透過領域（transmembrane
domain）（96％）、近接膜領域（juxtamembrane domai
n）（97％），分裂チロシンキナーゼ（split tyrosine
kinase）領域（TK1,99％およびTK2,97％）、インターキ
ナーゼ領域（86％）およびカルボキシル末端（85％）を
含むすべての機能領域を通じて、高い類似性のあること
が判明した。
（TR4 cDNAクローンを製造したのと同じ実験により得ら
れた）、その成長物を既知のヒトPDGFレセプターとして
確定した。その配列は、最近発表された既知のヒトPDGF
レセプターの配列と殆ど完全に一致した（P.G.K.Gronwa
ld et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88,3435（1988）;
L.Claesson−Welsh et al.,Mol.Cell.Biol.8,3476（198
8））。１個のヌクレオチドの相異は、残基240をアスパ
ラギン（Asn）からセリン（Ser）に変えた。また、マウ
スPDGFレセプターcDNAアミノ酸配列との比較により、リ
ガンド結合配列（79％）、膜透過領域（transmembrane
domain）（96％）、近接膜領域（juxtamembrane domai
n）（97％），分裂チロシンキナーゼ（split tyrosine
kinase）領域（TK1,99％およびTK2,97％）、インターキ
ナーゼ領域（86％）およびカルボキシル末端（85％）を
含むすべての機能領域を通じて、高い類似性のあること
が判明した。
T11遺伝子の染色体マッピング。染色体の位置に関し
て新しい遺伝子特定するために、104個の染色体の展開
をpT11−ｐのプローブを使用して切片上ハイブリッド形
成によって検討した。全部で136個の小粒（grain）を40
0バイトの核型図式（ideogram）の上に分布させた（第
５図）。全小粒のうち、50個（37％）がq11−12のバン
ドの長腕のアセントロメア領域（acentromeric regio
n）近くに密集する45個の大多数の小粒と共に染色体４
の上に存在した。７個の小粒からなる染色体5q 11.1−1
1.2上の２番目のハイブリッド形成の部位は、全小粒の
５％に達した（第５図）。
て新しい遺伝子特定するために、104個の染色体の展開
をpT11−ｐのプローブを使用して切片上ハイブリッド形
成によって検討した。全部で136個の小粒（grain）を40
0バイトの核型図式（ideogram）の上に分布させた（第
５図）。全小粒のうち、50個（37％）がq11−12のバン
ドの長腕のアセントロメア領域（acentromeric regio
n）近くに密集する45個の大多数の小粒と共に染色体４
の上に存在した。７個の小粒からなる染色体5q 11.1−1
1.2上の２番目のハイブリッド形成の部位は、全小粒の
５％に達した（第５図）。
T11遺伝子プローブはまた、転座（translocation）t
1;5（p22,q23）転座より生ずる大型の異常なマーカー染
色体を有するBurkitt lymphoma細胞系の由来の染色体と
もハイブリッドした。染色体５における小粒の存在を検
討した。300以上の染色体の展開の中で、この再配列さ
れた染色体５のラベル化は検出されなかった。かくして
切片上のハイブリッド形成によりT11遺伝子は、染色体
４のq11−12部位に割当てられた。この位置測定により
この新規な遺伝子は、ｃ−kit癌原遺伝子と同じ領域内
にあることがわかった（L.d′Auroiol et al.,Hum.Gene
t 78,374（1988））。血小板因子４（C.A.Griffinet et
al.,Cytogenetic Cell Genet 45,67（1987））、イン
ターフェロンγ誘導因子；γIP−10（A.D.Luster et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,2868（1987））および
メラノーマ成長刺激活性（MGSA）（A.Richmond etal.,E
MBOJ.7,2025（1988））に対する構造的に関連した遺伝
子群並びにα−フエト（feto）蛋白質、アルブミン（M.
E.Harper and G.Dugaiczyk,J.Hum.Genet.35,565（198
3））、HPAFP（M.A.Furgnson−Smith et al.,Cytogenet
Cell Genet 40,628（1985）に対する遺伝子群および遺
伝子デンチン形成不全症（dentino−genesis imperfect
a）の遺伝子が4q11−13にマッピングされている（S.P.B
all,P.J.L.Cook,M.Mars,K.E.Buckton,Aun Hum.Genet 4
6,35（1982））。
1;5（p22,q23）転座より生ずる大型の異常なマーカー染
色体を有するBurkitt lymphoma細胞系の由来の染色体と
もハイブリッドした。染色体５における小粒の存在を検
討した。300以上の染色体の展開の中で、この再配列さ
れた染色体５のラベル化は検出されなかった。かくして
切片上のハイブリッド形成によりT11遺伝子は、染色体
４のq11−12部位に割当てられた。この位置測定により
この新規な遺伝子は、ｃ−kit癌原遺伝子と同じ領域内
にあることがわかった（L.d′Auroiol et al.,Hum.Gene
t 78,374（1988））。血小板因子４（C.A.Griffinet et
al.,Cytogenetic Cell Genet 45,67（1987））、イン
ターフェロンγ誘導因子；γIP−10（A.D.Luster et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,2868（1987））および
メラノーマ成長刺激活性（MGSA）（A.Richmond etal.,E
MBOJ.7,2025（1988））に対する構造的に関連した遺伝
子群並びにα−フエト（feto）蛋白質、アルブミン（M.
E.Harper and G.Dugaiczyk,J.Hum.Genet.35,565（198
3））、HPAFP（M.A.Furgnson−Smith et al.,Cytogenet
Cell Genet 40,628（1985）に対する遺伝子群および遺
伝子デンチン形成不全症（dentino−genesis imperfect
a）の遺伝子が4q11−13にマッピングされている（S.P.B
all,P.J.L.Cook,M.Mars,K.E.Buckton,Aun Hum.Genet 4
6,35（1982））。
正常および腫瘍細胞における内因性（endogenous）の
T11遺伝子の転写体および蛋白質生成物の発現。新しい
レセプター様遺伝子の組織特異的発現を調べるために、
本発明の中で最も好ましいDNAのうちのいづれか、すな
わちT11ゲノムのクローンのHind III−Pst I 0.95−kbp
断片、またはTR4のcDNA挿入片を、Northernブロットハ
イブリッド形成実験に使用した。単一の6.4−kb転写体
が種々のヒト組織および細胞系のRNAを含有するpoly
（Ａ）内で検出された。第６図に示すように、比較的高
いレベルの転写体を平滑筋、心臓、およびヒト胎児に見
出したが、ヒト肝臓および脾臓では、これらの条件のも
とでは、検出されないか、またはやっと検出できる程度
の転写体を示した。既知のヒトPDGFレセプター遺伝子に
対するプローブを使用して、T11および5.3−kb PDGF−
Ｒ転写体が、それぞれ類似したレベルで、これらの同一
の各組織において同時に発現することがわかった。ヒト
骨格筋、胎児脳、胎盤並びに培養繊維芽細胞およびグリ
ア細胞（glial cell）もまた、高レベルの双方の転写体
を発現した（データ省略）。
T11遺伝子の転写体および蛋白質生成物の発現。新しい
レセプター様遺伝子の組織特異的発現を調べるために、
本発明の中で最も好ましいDNAのうちのいづれか、すな
わちT11ゲノムのクローンのHind III−Pst I 0.95−kbp
断片、またはTR4のcDNA挿入片を、Northernブロットハ
イブリッド形成実験に使用した。単一の6.4−kb転写体
が種々のヒト組織および細胞系のRNAを含有するpoly
（Ａ）内で検出された。第６図に示すように、比較的高
いレベルの転写体を平滑筋、心臓、およびヒト胎児に見
出したが、ヒト肝臓および脾臓では、これらの条件のも
とでは、検出されないか、またはやっと検出できる程度
の転写体を示した。既知のヒトPDGFレセプター遺伝子に
対するプローブを使用して、T11および5.3−kb PDGF−
Ｒ転写体が、それぞれ類似したレベルで、これらの同一
の各組織において同時に発現することがわかった。ヒト
骨格筋、胎児脳、胎盤並びに培養繊維芽細胞およびグリ
ア細胞（glial cell）もまた、高レベルの双方の転写体
を発現した（データ省略）。
かくして、この新しい遺伝子および既知のPDGF−Ｒ遺
伝子は、協調して調査された正常組織に発現するように
思われ、ｃ−fms/CSF1−Ｒまたはｃ−kitに関して報告
されたデータとは非常に異ったパターンを示した（D.J.
Sherret et al.,Cell 41,665（1985）;L.Coussens et a
l.,Nature 320,277（1986）;P.Besmer et al.,Nature 3
20,277（1986）;P.Besmer et al.,Nature 320,415（198
6）;Y.Yarden et al.,EMBOJ 6,3341（1987））。
伝子は、協調して調査された正常組織に発現するように
思われ、ｃ−fms/CSF1−Ｒまたはｃ−kitに関して報告
されたデータとは非常に異ったパターンを示した（D.J.
Sherret et al.,Cell 41,665（1985）;L.Coussens et a
l.,Nature 320,277（1986）;P.Besmer et al.,Nature 3
20,277（1986）;P.Besmer et al.,Nature 320,415（198
6）;Y.Yarden et al.,EMBOJ 6,3341（1987））。
また、T11およびPDGF−Ｒ遺伝子の発現を、ヒト腫瘍
細胞において比較した。ここでは、これらの表現のパタ
ーンを容易に区別することが可能であった。いくつかの
腫瘍細胞系は、T11またはPDGF−Ｒ遺伝子転写体のいず
れかを含むが、双方は含まないことが見出された（第6C
およびＤ図）。
細胞において比較した。ここでは、これらの表現のパタ
ーンを容易に区別することが可能であった。いくつかの
腫瘍細胞系は、T11またはPDGF−Ｒ遺伝子転写体のいず
れかを含むが、双方は含まないことが見出された（第6C
およびＤ図）。
新規なまたは既知のPDGFレセプター蛋白質に対して特
異的な抗体。この新しい遺伝子による蛋白質生成物を同
定するために、ペプチド類に対する抗血清を、予測され
たその配列にもとづいて調製した。既知のPDGF−Ｒの予
測された配列の類似領域を利用して抗血清をも成長し
た。最初にT11遺伝子生成物の特異的発現を検出するた
めに、双方のレセプターのcDNAが分離されているM426胎
児繊維芽細胞を利用した。PDGF−ＲまたはT11遺伝子転
写体を特異的に発現した8387およびA204細胞系をそれぞ
れ同様に分析した（第7A図）。
異的な抗体。この新しい遺伝子による蛋白質生成物を同
定するために、ペプチド類に対する抗血清を、予測され
たその配列にもとづいて調製した。既知のPDGF−Ｒの予
測された配列の類似領域を利用して抗血清をも成長し
た。最初にT11遺伝子生成物の特異的発現を検出するた
めに、双方のレセプターのcDNAが分離されているM426胎
児繊維芽細胞を利用した。PDGF−ＲまたはT11遺伝子転
写体を特異的に発現した8387およびA204細胞系をそれぞ
れ同様に分析した（第7A図）。
T11遺伝子生成物に対する抗血清（抗T11）を使用した
M426細胞のWesternブロット分析法によって、180kdおよ
び160kdの蛋白質種が免疫ペプチドと特異的に競合する
ことが判明した。抗PDGF−Ｒ（anti−PDGF−Ｒ）ペプチ
ド血清（抗HPRと命名）により、同じ細胞中に180および
165kdの蛋白質が検出された。8387細胞のWesternブロッ
ト分析により、抗−HPRによって認知されたが、抗T11に
血清によっては認知されない180および165kdの種（spec
ies）が判明した。これとは反対に、A204細胞は、抗T11
によって特異的に検出されたが抗HPR血清によっては認
知されなかった180および160kdの種を含んでいた。
M426細胞のWesternブロット分析法によって、180kdおよ
び160kdの蛋白質種が免疫ペプチドと特異的に競合する
ことが判明した。抗PDGF−Ｒ（anti−PDGF−Ｒ）ペプチ
ド血清（抗HPRと命名）により、同じ細胞中に180および
165kdの蛋白質が検出された。8387細胞のWesternブロッ
ト分析により、抗−HPRによって認知されたが、抗T11に
血清によっては認知されない180および165kdの種（spec
ies）が判明した。これとは反対に、A204細胞は、抗T11
によって特異的に検出されたが抗HPR血清によっては認
知されなかった180および160kdの種を含んでいた。
これらの発見すべてによって、本発明のこれらの抗体
は、同族のレセプター遺伝子生成物の検出に関しては特
異的であり、かつT11遺伝子生成物は、その転写体を含
む細胞において発現されることが示された。
は、同族のレセプター遺伝子生成物の検出に関しては特
異的であり、かつT11遺伝子生成物は、その転写体を含
む細胞において発現されることが示された。
哺乳類ベクター系におけるT11 cDNAの発現。更にT11
遺伝子成長物を免疫学的に検出する能力のテスト並びに
そのcDNAの機能の発現調査として、LTRを基礎とした発
現ベクター（LTR−based expression vector）をヌクレ
オチド１から3435（第３図）を包含するT11 cDNAおよび
対応する既知のPDGF−R cDNAに対して同様に組立てた。
遺伝子成長物を免疫学的に検出する能力のテスト並びに
そのcDNAの機能の発現調査として、LTRを基礎とした発
現ベクター（LTR−based expression vector）をヌクレ
オチド１から3435（第３図）を包含するT11 cDNAおよび
対応する既知のPDGF−R cDNAに対して同様に組立てた。
cos−１細胞における過渡的発現により、PDGF−Ｒは1
85kdおよび165kd蛋白質として出現したが、T11遺伝子成
長物は185kdおよび160kd種として特異的に検出された
（第7B図）。各レセプターのそれぞれの低分子量のもの
は、分析された細胞の間では、大きさに変化はなかっ
た。しかし、比較的に分子量が大きい種の中には、若干
の大きさの異ったものが観察されたが、これはグリコシ
ル化（glycosylation）の細胞特異的な相違にもとづく
ようである。
85kdおよび165kd蛋白質として出現したが、T11遺伝子成
長物は185kdおよび160kd種として特異的に検出された
（第7B図）。各レセプターのそれぞれの低分子量のもの
は、分析された細胞の間では、大きさに変化はなかっ
た。しかし、比較的に分子量が大きい種の中には、若干
の大きさの異ったものが観察されたが、これはグリコシ
ル化（glycosylation）の細胞特異的な相違にもとづく
ようである。
PDGFのT11成長物との結合による新しいPDGF−Ｒ遺伝
子の確定。その構造的および推定アミノ酸配列の類似性
並びにPDGFに反応することの知られる正常な細胞タイプ
によるその共通の発現性を理由として、T11遺伝子生成
物が既知のPDGF−Ｒ生成物に何等かの機能性関連性を示
したか否かを決定する研究が行われた。
子の確定。その構造的および推定アミノ酸配列の類似性
並びにPDGFに反応することの知られる正常な細胞タイプ
によるその共通の発現性を理由として、T11遺伝子生成
物が既知のPDGF−Ｒ生成物に何等かの機能性関連性を示
したか否かを決定する研究が行われた。
かくして、125IでラベルされたヒトPDGFを、対照区
（control）およびトランスフェクトされたcos−１細胞
とともに、未ラベルのPDGFイソフォームの存在または不
在のもとで、インキュベートした。
（control）およびトランスフェクトされたcos−１細胞
とともに、未ラベルのPDGFイソフォームの存在または不
在のもとで、インキュベートした。
第８図に示すように、新しいレセプター遺伝子でトラ
ンスフェクトされたcos−１細胞には、NIH/3T3細胞に対
するように、それだけ多くの125I−PDGFが特異的に結合
した。過剰のヒトPDGF（ABが支配的）、PDGF−BB、また
PDGF−AAとの競合によって、結合はトランスフェクトさ
れていないcos−１細胞のレベル迄減少した。また125I
−PDGFのPDGF−R cDNAによりトランスフェクトされたco
s−１細胞に対する特異的結合も観察された。しかしこ
の場合には、結合はヒトPDGF（すなわち、PDGF−AB）お
よびPDGF−BBにより競合されたが、PDGF−AAによっては
競合されなかった（第８図）。
ンスフェクトされたcos−１細胞には、NIH/3T3細胞に対
するように、それだけ多くの125I−PDGFが特異的に結合
した。過剰のヒトPDGF（ABが支配的）、PDGF−BB、また
PDGF−AAとの競合によって、結合はトランスフェクトさ
れていないcos−１細胞のレベル迄減少した。また125I
−PDGFのPDGF−R cDNAによりトランスフェクトされたco
s−１細胞に対する特異的結合も観察された。しかしこ
の場合には、結合はヒトPDGF（すなわち、PDGF−AB）お
よびPDGF−BBにより競合されたが、PDGF−AAによっては
競合されなかった（第８図）。
かくして、T11遺伝子とPDGF−Ｒ遺伝子の生成物の双
方は、ヒトPDGFと結合したが、PDGFの異なるイソフォー
ムによる競合のパターンによって、２種のレセプターが
区別された。これらの結果は、T11遺伝子がPDGFの３種
のダイマー型に対して異なった親和性を有する新しいPD
GFレセプターをエンコードすることを意味した。従っ
て、T11レセプター遺伝子生成物は、PDGF結合がAA並び
にBBイソフォームと競合したので、仮にタイプαPDGF−
Ｒと命名せられ、また以前にクローンされたPDGFレセプ
ター遺伝子の生成物は、タイプβと命名された。
方は、ヒトPDGFと結合したが、PDGFの異なるイソフォー
ムによる競合のパターンによって、２種のレセプターが
区別された。これらの結果は、T11遺伝子がPDGFの３種
のダイマー型に対して異なった親和性を有する新しいPD
GFレセプターをエンコードすることを意味した。従っ
て、T11レセプター遺伝子生成物は、PDGF結合がAA並び
にBBイソフォームと競合したので、仮にタイプαPDGF−
Ｒと命名せられ、また以前にクローンされたPDGFレセプ
ター遺伝子の生成物は、タイプβと命名された。
PDGFのイソフォームは新規および既知のPDGFレセプタ
ーの異なるパターンの自動燐酸化を誘導する。
ーの異なるパターンの自動燐酸化を誘導する。
レセプターにPDGFが結合した後、レセプター蛋白質の
チロシン残基の燐酸化（phosphorylation）を含む分子
間の多数の変化が生体内において（in vivo）で迅速に
触発される（A.R.Frackelton,P.M.Tremble Jr.,L.T.Wil
liams,J.Biol.Chem.259,7909（1984）;T.O.Daniel et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,2684（1985））。各PDG
Fのイソフォームによる２種のPDGF−Ｒ遺伝子生成物の
相対的自動燐酸化を比較するために、タイプαおよびタ
イプβのPDGF−Ｒ遺伝子を発現するA204および8387細胞
の反応をそれぞれ分析した。
チロシン残基の燐酸化（phosphorylation）を含む分子
間の多数の変化が生体内において（in vivo）で迅速に
触発される（A.R.Frackelton,P.M.Tremble Jr.,L.T.Wil
liams,J.Biol.Chem.259,7909（1984）;T.O.Daniel et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,2684（1985））。各PDG
Fのイソフォームによる２種のPDGF−Ｒ遺伝子生成物の
相対的自動燐酸化を比較するために、タイプαおよびタ
イプβのPDGF−Ｒ遺伝子を発現するA204および8387細胞
の反応をそれぞれ分析した。
第9A図に示すように、リガンド処理に続いて５分間溶
解（1yse）されたA204細胞のイムノブロットにより、容
易に検出可能でかつ非常に類似したレベルの180kd種（s
pecies）の自動燐酸化が３種のPDGFのイソフォームの各
々に応じて行われることが判明した。誘導された自動燐
酸化がタイプαのレセプター遺伝子生成物に特異的であ
るという更なる証拠として、リガンドで刺激されたA204
細胞の溶解物（lynsate）を最初に抗タイプαPDGF−Ｒ
血清（抗−T11）で免疫沈澱させ、つづいて抗phosphoty
rosine血清を用いて免疫ブロット法を行った。この試み
によって、180kdのタイプαPDGFレセプターは、各々３
種のリガンドに反応して同様の強度でチロシンが燐酸化
されることが確認された。
解（1yse）されたA204細胞のイムノブロットにより、容
易に検出可能でかつ非常に類似したレベルの180kd種（s
pecies）の自動燐酸化が３種のPDGFのイソフォームの各
々に応じて行われることが判明した。誘導された自動燐
酸化がタイプαのレセプター遺伝子生成物に特異的であ
るという更なる証拠として、リガンドで刺激されたA204
細胞の溶解物（lynsate）を最初に抗タイプαPDGF−Ｒ
血清（抗−T11）で免疫沈澱させ、つづいて抗phosphoty
rosine血清を用いて免疫ブロット法を行った。この試み
によって、180kdのタイプαPDGFレセプターは、各々３
種のリガンドに反応して同様の強度でチロシンが燐酸化
されることが確認された。
タイプβのPDGF遺伝子成長物のみを発現した8387細胞
を各々同量のPDGFイソフォームで処理すると、非常に異
ったパターンのレセプターの自動燐酸化がみられた。こ
こでPDGF−BBは、抗タイプβPDGF−Ｒ血清（抗HPR）に
よって特異的に認識される180kd種の最高レベルの自動
燐酸化を誘導し、またヒトPDGFは、検出可能な自動燐酸
化を同じく誘導した（第9B図）。これとは対照的に、PD
GF−AAは、検出可能な燐酸化を誘導しなかった。
を各々同量のPDGFイソフォームで処理すると、非常に異
ったパターンのレセプターの自動燐酸化がみられた。こ
こでPDGF−BBは、抗タイプβPDGF−Ｒ血清（抗HPR）に
よって特異的に認識される180kd種の最高レベルの自動
燐酸化を誘導し、またヒトPDGFは、検出可能な自動燐酸
化を同じく誘導した（第9B図）。これとは対照的に、PD
GF−AAは、検出可能な燐酸化を誘導しなかった。
かくして、PDGF−ABとPDGF−BBは双方のレセプターを
触発したが、BBホモダイマーに対するβタイプレセプタ
ーのはるかに強力な反応並びにAAホモダイマーに対する
検出可能な反応の欠如は、容易にレセプターを機能性に
区別した。
触発したが、BBホモダイマーに対するβタイプレセプタ
ーのはるかに強力な反応並びにAAホモダイマーに対する
検出可能な反応の欠如は、容易にレセプターを機能性に
区別した。
異ったPDGFイソフォームによる２種のレセプターの自
動燐酸化のパターンを同じ細胞で検討するために、最初
にNIH/3T3細胞を異なるリガンドによって触発し、つづ
いて抗タイプαまたはβのPDGF−Ｒ血清により免疫沈澱
（immunoprecipitation）せしめた。続いて免疫沈澱し
たレセプター蛋白質を抗phosphotyrosine血清を使用し
て免疫ブロット法によって解析した。
動燐酸化のパターンを同じ細胞で検討するために、最初
にNIH/3T3細胞を異なるリガンドによって触発し、つづ
いて抗タイプαまたはβのPDGF−Ｒ血清により免疫沈澱
（immunoprecipitation）せしめた。続いて免疫沈澱し
たレセプター蛋白質を抗phosphotyrosine血清を使用し
て免疫ブロット法によって解析した。
第9C図に示すように、タイプαPDGF−Ｒ抗血清によっ
て免疫沈澱した180kdの蛋白質は、PDGFのすべての３種
のダイマー形式によって燐酸化された。対照的に、抗タ
イプβレセプター血清によって免疫沈澱した180kdの燐
蛋白質は、ヒトPDGF−ABまたはPDGF−BB刺激後にのみ検
出された。このようにして、異なったPDGFリガンドに対
する反応のパターンは、自然に双方のPDGF−Ｒ遺伝子を
発現する形質未転換細胞の一例においてレセプター特異
的なままであった。
て免疫沈澱した180kdの蛋白質は、PDGFのすべての３種
のダイマー形式によって燐酸化された。対照的に、抗タ
イプβレセプター血清によって免疫沈澱した180kdの燐
蛋白質は、ヒトPDGF−ABまたはPDGF−BB刺激後にのみ検
出された。このようにして、異なったPDGFリガンドに対
する反応のパターンは、自然に双方のPDGF−Ｒ遺伝子を
発現する形質未転換細胞の一例においてレセプター特異
的なままであった。
タイプαのPDGFレセプターはPDGFイソフォームABに反
応して、DNA合成を刺激する際により効率的である。他
の繊維芽細胞系における２種のレセプターの発現を次に
分析した。Westernブロット分析（データ省略）によっ
て分析された系（line）の中で、２種のレセプターの比
率に相当の変化の存在することが判明した。マウス繊維
芽細胞は、類似したレベルのタイプαおよびβのレセプ
ターを発現したが、ヒト繊維芽細胞、例えばAG1532また
はM413は、マウス繊維芽細胞またはM426ヒト繊維芽細胞
に比べて、比較的低いレベルのタイプαのレセプターを
発現した。
応して、DNA合成を刺激する際により効率的である。他
の繊維芽細胞系における２種のレセプターの発現を次に
分析した。Westernブロット分析（データ省略）によっ
て分析された系（line）の中で、２種のレセプターの比
率に相当の変化の存在することが判明した。マウス繊維
芽細胞は、類似したレベルのタイプαおよびβのレセプ
ターを発現したが、ヒト繊維芽細胞、例えばAG1532また
はM413は、マウス繊維芽細胞またはM426ヒト繊維芽細胞
に比べて、比較的低いレベルのタイプαのレセプターを
発現した。
飽和量のPDGF−ABまたはPDGF−BBは、各々の細胞系に
おいて同じ様にDNA合成の増加を示した（データ省
略）。しかし、最高に次ぐ用量のPDGF−ABおよびPDGF−
BBは、観察された分裂促進活性レベルの相当な相異を示
した（第10図）。NIH/3T3,BALB/3T3およびM426細胞は、
同等な効率でPDGF−BBおよびPDGF−ABに反応したが、PD
GF−ABは、AG1523またはM413細胞に対して相当に低い活
性を示した。PDGF−ABに対する比較的低い分裂促進性の
反応性は、これらの細胞における免疫学的に検出された
αレセプターに比してβレセプターの高い比率と相関関
係があるように思われた。
おいて同じ様にDNA合成の増加を示した（データ省
略）。しかし、最高に次ぐ用量のPDGF−ABおよびPDGF−
BBは、観察された分裂促進活性レベルの相当な相異を示
した（第10図）。NIH/3T3,BALB/3T3およびM426細胞は、
同等な効率でPDGF−BBおよびPDGF−ABに反応したが、PD
GF−ABは、AG1523またはM413細胞に対して相当に低い活
性を示した。PDGF−ABに対する比較的低い分裂促進性の
反応性は、これらの細胞における免疫学的に検出された
αレセプターに比してβレセプターの高い比率と相関関
係があるように思われた。
異なったPDGFイソフォームによるNIH/3T3細胞中の２
種のレセプターの燐酸化について見られる用量反応曲線
とまとめて考えると、これらの結果は、タイプβレセプ
ターの存在における、PDGF−AB並びにPDGF−AAによるタ
イプαレセプターの選択的な誘発を強く示唆した。
種のレセプターの燐酸化について見られる用量反応曲線
とまとめて考えると、これらの結果は、タイプβレセプ
ターの存在における、PDGF−AB並びにPDGF−AAによるタ
イプαレセプターの選択的な誘発を強く示唆した。
PDGFレセプターのない造血細胞中へcDNAを導入後の２
種のPDGF遺伝子タイプの独立した発現。各PDGF−Ｒ遺伝
子生成物に対する特異的な生物学的および生化学的反応
を調査するために、各々のタイプが独立して導入され発
現される可能性のある細胞において該レセプターを調べ
るためのシステムを開発した。これらのシステムは、32
D細胞系である、生存および増殖のため通常II−３に依
存するマウス造血細胞系を基礎とした。最近の研究は、
EGF−Ｒに対する発現ベクターをこれらの細胞中に導入
することにより、EGFの分裂促進シグナルの導入経路と
の効果的カップリングに結びつくことを確認した。
種のPDGF遺伝子タイプの独立した発現。各PDGF−Ｒ遺伝
子生成物に対する特異的な生物学的および生化学的反応
を調査するために、各々のタイプが独立して導入され発
現される可能性のある細胞において該レセプターを調べ
るためのシステムを開発した。これらのシステムは、32
D細胞系である、生存および増殖のため通常II−３に依
存するマウス造血細胞系を基礎とした。最近の研究は、
EGF−Ｒに対する発現ベクターをこれらの細胞中に導入
することにより、EGFの分裂促進シグナルの導入経路と
の効果的カップリングに結びつくことを確認した。
get選択可能なマーカーを保持する上述の哺乳類の発
現ベクターが、32D細胞をタイプαまたはタイプβのPDG
F−R cDNAを使用するエレクトロポレーション法（elect
roporation）によってトランスフェクトするために、使
用された。形質転換体（transformant）をmycophenolio
acidを加えた培地を用いて選択した。選択培地中で２
週間後、成育培養体を得た。
現ベクターが、32D細胞をタイプαまたはタイプβのPDG
F−R cDNAを使用するエレクトロポレーション法（elect
roporation）によってトランスフェクトするために、使
用された。形質転換体（transformant）をmycophenolio
acidを加えた培地を用いて選択した。選択培地中で２
週間後、成育培養体を得た。
32D−αＲおよび32D−βＲと命名された培養体、上述
したようにそれぞれNorthernブロット分析にかけた。NI
H/3T3繊維芽細胞においてマウスの各PDGF−Ｒ遺伝子転
写体の検出を可能ならしめる緩和されたハイブリッド形
成条件のもとでさえも、いずれのタイプのPDGF−R mRNA
も32Dの親細胞中には検出されなかった。対照的に、32D
−αＲおよび32D−βＲのトランスフェクト体（transfe
ctant）は、ヒトのタイプαおよびタイプβの各PDGF−
Ｒ遺伝子にそれぞれ特異的な転写体を豊富に発現した。
これらのトランフェクト体の膜溶解物を免疫ブロット分
析にかけると、抗タイプαPDGF−Ｒペプチド血清は、18
0kdおよび160kd蛋白質種を32D−αＲ中に検出したが、3
2D−β細胞中には検出しなかった。更にこれらの蛋白質
は、免疫ペプチドと特異的に競合した。32D−βＲ細胞
は、これとは反対に、抗タイプβPDGF−Ｒ血清によって
特異的に検出される180−200kdおよび165kd種を含有し
た。これらの蛋白質種のいずれも、対照（control）で
ある32D細胞中には検出されなかった。
したようにそれぞれNorthernブロット分析にかけた。NI
H/3T3繊維芽細胞においてマウスの各PDGF−Ｒ遺伝子転
写体の検出を可能ならしめる緩和されたハイブリッド形
成条件のもとでさえも、いずれのタイプのPDGF−R mRNA
も32Dの親細胞中には検出されなかった。対照的に、32D
−αＲおよび32D−βＲのトランスフェクト体（transfe
ctant）は、ヒトのタイプαおよびタイプβの各PDGF−
Ｒ遺伝子にそれぞれ特異的な転写体を豊富に発現した。
これらのトランフェクト体の膜溶解物を免疫ブロット分
析にかけると、抗タイプαPDGF−Ｒペプチド血清は、18
0kdおよび160kd蛋白質種を32D−αＲ中に検出したが、3
2D−β細胞中には検出しなかった。更にこれらの蛋白質
は、免疫ペプチドと特異的に競合した。32D−βＲ細胞
は、これとは反対に、抗タイプβPDGF−Ｒ血清によって
特異的に検出される180−200kdおよび165kd種を含有し
た。これらの蛋白質種のいずれも、対照（control）で
ある32D細胞中には検出されなかった。
タイプαのレセプターはPDGF−ABイソフォームに対し
てより高い結合親和性を有する。PDGF−BB結合を32D−
αＲまたは32D−βＲトランスフェクト体において比較
したが、両者は高い親和性結合を示した。スキャッチャ
ード分析によって、単一親和性クラスの結合部位を有す
る１細胞当り約2000のレセプターの存在が明らかとなっ
た。Ｋα値は、32D−αＲおよび32D−βＲ細胞に対して
それぞれ0.4nMおよび0.5nMであった（第11図）。また、
32D−αＲ細胞は、125I−PDGF−ABに対して高い結合親
和性（kd＝0.4nM）を示し、PDGF−BBに対するものと同
数の結合部位を現わした。
てより高い結合親和性を有する。PDGF−BB結合を32D−
αＲまたは32D−βＲトランスフェクト体において比較
したが、両者は高い親和性結合を示した。スキャッチャ
ード分析によって、単一親和性クラスの結合部位を有す
る１細胞当り約2000のレセプターの存在が明らかとなっ
た。Ｋα値は、32D−αＲおよび32D−βＲ細胞に対して
それぞれ0.4nMおよび0.5nMであった（第11図）。また、
32D−αＲ細胞は、125I−PDGF−ABに対して高い結合親
和性（kd＝0.4nM）を示し、PDGF−BBに対するものと同
数の結合部位を現わした。
対照的に、32D−βＲ細胞はしかしながら、32D−αＲ
細胞にくらべて、125I−PDGF−ABに対して10倍も低い結
合能を示した。かくして、これらの類似したPDGF−BBの
結合をもとに標準化すると、タイプβのレセプターは、
PDGF−ABに対して極端に低い親和性を示した。
細胞にくらべて、125I−PDGF−ABに対して10倍も低い結
合能を示した。かくして、これらの類似したPDGF−BBの
結合をもとに標準化すると、タイプβのレセプターは、
PDGF−ABに対して極端に低い親和性を示した。
タイプαおよびβのPDGF遺伝子生成物によって独自に
誘発された共通の生物学的機能。有機分裂促進性（mito
genesis）および走化性は、PDGFに対する繊維芽細胞の
反応の中でも最もよく性質が調べられている。従って、
32D−αＲまたはβＲ細胞系がこれらの生物学的反応の
どちらを仲介するかが調べられた。
誘発された共通の生物学的機能。有機分裂促進性（mito
genesis）および走化性は、PDGFに対する繊維芽細胞の
反応の中でも最もよく性質が調べられている。従って、
32D−αＲまたはβＲ細胞系がこれらの生物学的反応の
どちらを仲介するかが調べられた。
32D細胞の増殖は、通常インターロイキン３（以後、I
L−３）に厳密に依存し、IL3を培地から除去すること
は、トランスフェクト体および対照の32D細胞の双方の
生存能力を迅速に失わせた。第12図に示すごとく、PDGF
−BBは、分裂促進のシグナル形質導入経路と効率的にカ
ップルし、また双方のトランスフェクト体においてIL−
３依存性を類似した用量依存を示しながら排除すること
ができたが、対照の32D細胞においては効果がなかっ
た。こうして、αまたはβタイプのいずれかの存在がPD
GF−BBに対する分裂促進反応（mitogenicresponse）に
とって必要かつ十分であった。しかしながら、32D細胞
を含むタイプαのレセプターがPDGF−BBに対するの同じ
ようにPDGF−ABに対しても反応性があったのに対して、
32D−βＲ細胞においてPDGF−ABは相当に低いDNA合成反
応を誘発した（第12図）。
L−３）に厳密に依存し、IL3を培地から除去すること
は、トランスフェクト体および対照の32D細胞の双方の
生存能力を迅速に失わせた。第12図に示すごとく、PDGF
−BBは、分裂促進のシグナル形質導入経路と効率的にカ
ップルし、また双方のトランスフェクト体においてIL−
３依存性を類似した用量依存を示しながら排除すること
ができたが、対照の32D細胞においては効果がなかっ
た。こうして、αまたはβタイプのいずれかの存在がPD
GF−BBに対する分裂促進反応（mitogenicresponse）に
とって必要かつ十分であった。しかしながら、32D細胞
を含むタイプαのレセプターがPDGF−BBに対するの同じ
ようにPDGF−ABに対しても反応性があったのに対して、
32D−βＲ細胞においてPDGF−ABは相当に低いDNA合成反
応を誘発した（第12図）。
これらの発見を寒天を含む半固形の培地中のコロニー
形成分析によって確認した。両方のトランスフェクト体
がPDGF−BB添加培地で容易にコロニーを形成したが、32
D−αＲ細胞のみがPDGF−AB添加培地でコロニーを形成
した（データ省略）。かくして、32D−αＲおよびβＲ
トランスフェクト体により観察された分裂促進反応は、
各々の細胞系によってそれぞれ発現されたαおよびβの
レセプターに対する同一のPDGFイソフォームの結合特性
をよく相関した。
形成分析によって確認した。両方のトランスフェクト体
がPDGF−BB添加培地で容易にコロニーを形成したが、32
D−αＲ細胞のみがPDGF−AB添加培地でコロニーを形成
した（データ省略）。かくして、32D−αＲおよびβＲ
トランスフェクト体により観察された分裂促進反応は、
各々の細胞系によってそれぞれ発現されたαおよびβの
レセプターに対する同一のPDGFイソフォームの結合特性
をよく相関した。
走化性がタイプαまたはβのいずれかのPDGFレセプタ
ーによって特異的に仲介されたか否かを調べるために、
当該分野で公知の変形Boydenチェンバー技術を使用して
走化性のアッセイを行った。PDGFレセプターが欠如して
いる32D細胞は、PDGF−ABまたはPDGF−BBに反応しなか
ったが、PDGF−BBは、αおよびβレセプター発現トラン
スフェクト体の双方に対して走化性を示した。PDGF−AB
は32D−αＲ細胞に対して比較的により活性であった
（第13図）。
ーによって特異的に仲介されたか否かを調べるために、
当該分野で公知の変形Boydenチェンバー技術を使用して
走化性のアッセイを行った。PDGFレセプターが欠如して
いる32D細胞は、PDGF−ABまたはPDGF−BBに反応しなか
ったが、PDGF−BBは、αおよびβレセプター発現トラン
スフェクト体の双方に対して走化性を示した。PDGF−AB
は32D−αＲ細胞に対して比較的により活性であった
（第13図）。
かくして、各PDGFレセプターは、それぞれ独自に32D
細胞に遺伝子に内在する分裂促進および走化性のシグナ
ル経路とカップルした。更に、これらの生物的機能は、
いずれかのレセプターに対するPDGFのイソフォームの相
対的結合能に応じて誘発された。
細胞に遺伝子に内在する分裂促進および走化性のシグナ
ル経路とカップルした。更に、これらの生物的機能は、
いずれかのレセプターに対するPDGFのイソフォームの相
対的結合能に応じて誘発された。
独自に再構成されたレセプターと共役するイノシトー
ル樹脂代謝およびサイトゾルのCa2+起動。
ル樹脂代謝およびサイトゾルのCa2+起動。
最近の研究によれば、PDGFで誘導された分裂促進のシ
グナルの導入に際して、細胞内の遊離カルシウムおよび
ジアシルグリセロールといった第２メッセンジャーの増
加をおこすイノシトール脂質のレセプター仲介による代
謝回転（turnover）の重要な役割が示唆されている。か
くしてイノシトール脂質代謝および細胞内遊離Ca
2+（〔Ca2+〕ｉ）に対するPDGF−ABおよびPDGF−BBの効
果を、32D細胞を含むタイプαおよびタイプβのPDGF−
Ｒにおいて研究した。
グナルの導入に際して、細胞内の遊離カルシウムおよび
ジアシルグリセロールといった第２メッセンジャーの増
加をおこすイノシトール脂質のレセプター仲介による代
謝回転（turnover）の重要な役割が示唆されている。か
くしてイノシトール脂質代謝および細胞内遊離Ca
2+（〔Ca2+〕ｉ）に対するPDGF−ABおよびPDGF−BBの効
果を、32D細胞を含むタイプαおよびタイプβのPDGF−
Ｒにおいて研究した。
放射性燐酸イノシトールの蓄積を、3Hミオイノシトー
ル（3H−myoinositol）で培養体をラベルし、当該分野
で公知の方法に従ってPDGFのイソフォームを37℃でLiCl
の存在で誘発し測定した。〔Ca2+〕ｉを、懸濁液中の32
D細胞において螢光〔Ca2+〕ｉインジケーターfura2で負
荷し、また完全なインキュベーション培地中でPDGFで処
理して、測定した。
ル（3H−myoinositol）で培養体をラベルし、当該分野
で公知の方法に従ってPDGFのイソフォームを37℃でLiCl
の存在で誘発し測定した。〔Ca2+〕ｉを、懸濁液中の32
D細胞において螢光〔Ca2+〕ｉインジケーターfura2で負
荷し、また完全なインキュベーション培地中でPDGFで処
理して、測定した。
第14図に燐酸イノシトール（inositol phosphate）に
対するPDGF−ABおよびPDGF−BBの効果と、タイプαおよ
びタイプβのPDGF−R 32D細胞における〔Ca2+〕ｉとを
示す。第14図（パネルＡ）に示すように、PDGF−BBおよ
びPDGF−ABは、燐酸イノシトールの用量依存性の蓄積を
同様な相対的効力で誘発することが可能であった。同じ
イソフォームは、タイプαのPDGF−R 32D細胞において
も〔Ca2+〕ｉを殆ど同様に増加させた（第14図、パネル
Ａ、挿入図）。PDGF−BBもまた、タイプβのPDGF−R 32
D細胞におけるイノシトール脂質の代謝および細胞内のC
a2+起動を顕著に刺激し、PDGF−BBに反応して酷使した
生化学的反応がこれらの異なったPDGF−Ｒ遺伝子成長物
によって32D細胞中に誘発されることが確認された。
対するPDGF−ABおよびPDGF−BBの効果と、タイプαおよ
びタイプβのPDGF−R 32D細胞における〔Ca2+〕ｉとを
示す。第14図（パネルＡ）に示すように、PDGF−BBおよ
びPDGF−ABは、燐酸イノシトールの用量依存性の蓄積を
同様な相対的効力で誘発することが可能であった。同じ
イソフォームは、タイプαのPDGF−R 32D細胞において
も〔Ca2+〕ｉを殆ど同様に増加させた（第14図、パネル
Ａ、挿入図）。PDGF−BBもまた、タイプβのPDGF−R 32
D細胞におけるイノシトール脂質の代謝および細胞内のC
a2+起動を顕著に刺激し、PDGF−BBに反応して酷使した
生化学的反応がこれらの異なったPDGF−Ｒ遺伝子成長物
によって32D細胞中に誘発されることが確認された。
第14図（パネルＢ）は、タイプβのPDGF−R 32D細胞
における燐酸イノシトール蓄積を促進する際に、PDGF−
ABがPDGF−BBよりも相当に効果が低かったことを示す。
検出可能な燐酸イノシトールの放出は、PDGF−ABの濃度
が高い場合のみ起った。同様にPDGF−ABは、殆どまたは
全く（Ca2+）ｉ反応を誘発しなかった。
における燐酸イノシトール蓄積を促進する際に、PDGF−
ABがPDGF−BBよりも相当に効果が低かったことを示す。
検出可能な燐酸イノシトールの放出は、PDGF−ABの濃度
が高い場合のみ起った。同様にPDGF−ABは、殆どまたは
全く（Ca2+）ｉ反応を誘発しなかった。
論考 本研究は、２種の異ったヒトPDGFレセプター遺伝子の
存在を示す。更に、本研究は、本発明の２つの主要な具
体例PDGF−R/CSF1−Ｒサブファミリー内における新規遺
伝子のゲノムおよびcDNAクローンの検出および分離を例
証する。この遺伝子は、既知のPDGF−Ｒ遺伝子とは異な
るが、最も深く関連している。自然な発現の条件のも
と、並びにこの新規のcDNAを発現ベクターを使用して適
当なターゲットの細胞内に導入に次いて、その成長物の
PDGFに対する機能性反応は、既に同定されているPDGFレ
セプターのチロシン燐酸化を結合し触発した濃度におい
て示された。
存在を示す。更に、本研究は、本発明の２つの主要な具
体例PDGF−R/CSF1−Ｒサブファミリー内における新規遺
伝子のゲノムおよびcDNAクローンの検出および分離を例
証する。この遺伝子は、既知のPDGF−Ｒ遺伝子とは異な
るが、最も深く関連している。自然な発現の条件のも
と、並びにこの新規のcDNAを発現ベクターを使用して適
当なターゲットの細胞内に導入に次いて、その成長物の
PDGFに対する機能性反応は、既に同定されているPDGFレ
セプターのチロシン燐酸化を結合し触発した濃度におい
て示された。
一定量のPDGFによって誘導されたPDGF−Ｒ遺伝子成長
物のチロシン燐酸化（および幾つかその他の活性）の類
似したレベルをもとにして標準化すると、新規のレセプ
ターは、AAのホモダイマー（homodimer）に対して既知
のPDGF−Ｒよりもよく反応することが示された。反対
に、既地のレセプターは、BBのホモダイマーに選択的に
反応した。今回の発見をもとにして、この新規の遺伝子
生成物をタイプαPDGF−Ｒと命名し、また以前に同定さ
れているPDGF−Ｒ遺伝子生成物をタイプβのレセプター
として命名した。
物のチロシン燐酸化（および幾つかその他の活性）の類
似したレベルをもとにして標準化すると、新規のレセプ
ターは、AAのホモダイマー（homodimer）に対して既知
のPDGF−Ｒよりもよく反応することが示された。反対
に、既地のレセプターは、BBのホモダイマーに選択的に
反応した。今回の発見をもとにして、この新規の遺伝子
生成物をタイプαPDGF−Ｒと命名し、また以前に同定さ
れているPDGF−Ｒ遺伝子生成物をタイプβのレセプター
として命名した。
AAホモダイマーは、NIH/3T3細胞における検出可能の
βタイプレセプターのチロシン燐酸化を刺激できなかっ
たが、該細胞系においてDNA合成を誘導できる（P.Beckm
an et al.,Science 241,1346（1988））。これは、αタ
イプのレセプターが繊維芽細胞における分裂促進シグナ
ルの経路とカップルできることを示した。タイプβのレ
セプターもまた、PDGFを分裂促進経路とカップルさせる
ことが報告されている（J.A.Escobedo et al.,Science
240,1532（1988））。これらの結果は、両方の遺伝子生
成物が増殖反応を誘導できることを示唆した。
βタイプレセプターのチロシン燐酸化を刺激できなかっ
たが、該細胞系においてDNA合成を誘導できる（P.Beckm
an et al.,Science 241,1346（1988））。これは、αタ
イプのレセプターが繊維芽細胞における分裂促進シグナ
ルの経路とカップルできることを示した。タイプβのレ
セプターもまた、PDGFを分裂促進経路とカップルさせる
ことが報告されている（J.A.Escobedo et al.,Science
240,1532（1988））。これらの結果は、両方の遺伝子生
成物が増殖反応を誘導できることを示唆した。
本発明の構成と方法に従って、ヌル細胞中にこれらの
異ったレセプター遺伝子に対する発現ベクターを安定し
て導入できることは、このような示唆をヒト細胞におい
て確認することを可能とした。このような細胞における
研究は、走化性（H.Seppa et al.,J.Cell Biol.92,584
（1982）;G.R.Grotendorst et al.,J.Cell Physiol.11
3,261（1983）;T.F.Deuel,R.M.Senior,J.S.Huang,G.L.G
riffin,J.Clin.Invest.69,1046（1982））、膜の波うち
（ruffling）（K.Mellstrom et al.,J.Cell Motility a
nd Muscle Res.4,589（1983））、並びに非相同（heter
ologous）レセプターの転移調整（transmodulation）
（E.Rozengurt,M.Rodriquez−Pnena,K.A.Smith,Proc,Na
tl.Acad.Sci.USA 80,7244（1983）;R.J,Davis and M.P.
Czech,Proc,Natl.Acad.Sci.USA 82,4080（1985））を含
む既知のその他のPDGFの機能は、タイプαまたはβのPD
GF−Ｒ遺伝子生成物によって特異的には仲介されないこ
とを更に示した。
異ったレセプター遺伝子に対する発現ベクターを安定し
て導入できることは、このような示唆をヒト細胞におい
て確認することを可能とした。このような細胞における
研究は、走化性（H.Seppa et al.,J.Cell Biol.92,584
（1982）;G.R.Grotendorst et al.,J.Cell Physiol.11
3,261（1983）;T.F.Deuel,R.M.Senior,J.S.Huang,G.L.G
riffin,J.Clin.Invest.69,1046（1982））、膜の波うち
（ruffling）（K.Mellstrom et al.,J.Cell Motility a
nd Muscle Res.4,589（1983））、並びに非相同（heter
ologous）レセプターの転移調整（transmodulation）
（E.Rozengurt,M.Rodriquez−Pnena,K.A.Smith,Proc,Na
tl.Acad.Sci.USA 80,7244（1983）;R.J,Davis and M.P.
Czech,Proc,Natl.Acad.Sci.USA 82,4080（1985））を含
む既知のその他のPDGFの機能は、タイプαまたはβのPD
GF−Ｒ遺伝子生成物によって特異的には仲介されないこ
とを更に示した。
このような知識は、これらのPDGF機能に影響を与える
病態の理解と診断への必要な前奏となるものであり、本
発明を更に実施することによって推進することができ
る。
病態の理解と診断への必要な前奏となるものであり、本
発明を更に実施することによって推進することができ
る。
本発明の方法を使用して解析されたヒト腫瘍細胞系の
うちで、２種のPDGF−Ｒ遺伝子の発現が不調分のいくつ
かの例が観察された。更に、いずれかの遺伝子からのmR
NAを発現する代表的腫瘍細胞系は、細胞に結合しかつPD
GFに反応してチロシンが燐酸化される代表的蛋白質生成
物をそれぞれ含有することが示された。
うちで、２種のPDGF−Ｒ遺伝子の発現が不調分のいくつ
かの例が観察された。更に、いずれかの遺伝子からのmR
NAを発現する代表的腫瘍細胞系は、細胞に結合しかつPD
GFに反応してチロシンが燐酸化される代表的蛋白質生成
物をそれぞれ含有することが示された。
本発明のタイプαあるいはタイプβのPDGF−Ｒ遺伝子
生成物に対して特異的な免疫学的並びに分子生物学的プ
ローブが利用できることは、PDGF−Ａ鎖またはＢ鎖の発
現が、いづれかのレセプター遺伝子との組合せにおい
て、腫瘍の発生に因果的に関連しているヒトの腫瘍の同
定を可能とする。同時に、各タイプの成分を特異的に検
出する試薬を利用できることは、他の慢性病態、例えば
動脈硬化症、関節炎、および繊維症における該成長因子
とレセプターの複雑なネットワークの異常な発現の関与
を発見しようとする努力に対して、決定的な援助となる
（R.Ross.E.W.Raines,D.F.Bowen−Pope,Cell 46,155（1
986））。更に、科学的に重要な観察は、ここに記載さ
れたように本発明の実施によって既に与えられている。
例えば、新しい遺伝子の染色体上の配置は、本発明のDN
Aを使用して確定せられ、該レセプター遺伝子族の進化
の可能性に対する見通しを与える。かくして、この染色
体の配置の特定は、タイプαのPDGFレセプター遺伝子が
染色体４上の関連レセプター様遺伝子、ｃ−kit（L.d′
Auriol et al.,Hum.Genet 78,374（1988））と同一領域
の4q11−12にあることを示す。その他のこのサブファミ
リーの遺伝子は、染色体５の上にあることがわかった。
これらは、5q23−31に位置することがわかったタイプβ
のPDGF−Ｒ（Y.Yardenet al.,Nature 323,226（198
6））および5q33.2−33.3上のCSF1−Ｒの遺伝子（M.M.L
eBeau et al.,Science 231,984（1986）を含む。ヒト染
色体の４および５が共通の祖先に由来する証拠が存する
（D.E.Cominge,Nature 238,455（1972））。これらの関
連レセプター遺伝子は、4q上のセントロメア（centrome
re）近くまたは5qの末端半分に集まる。かくして、これ
らの遺伝子の先祖が単一の祖先の染色体に限定されたな
らば、リンケージの切断は長腕（long arm）内の逆位に
よって説明されるであろう。
生成物に対して特異的な免疫学的並びに分子生物学的プ
ローブが利用できることは、PDGF−Ａ鎖またはＢ鎖の発
現が、いづれかのレセプター遺伝子との組合せにおい
て、腫瘍の発生に因果的に関連しているヒトの腫瘍の同
定を可能とする。同時に、各タイプの成分を特異的に検
出する試薬を利用できることは、他の慢性病態、例えば
動脈硬化症、関節炎、および繊維症における該成長因子
とレセプターの複雑なネットワークの異常な発現の関与
を発見しようとする努力に対して、決定的な援助となる
（R.Ross.E.W.Raines,D.F.Bowen−Pope,Cell 46,155（1
986））。更に、科学的に重要な観察は、ここに記載さ
れたように本発明の実施によって既に与えられている。
例えば、新しい遺伝子の染色体上の配置は、本発明のDN
Aを使用して確定せられ、該レセプター遺伝子族の進化
の可能性に対する見通しを与える。かくして、この染色
体の配置の特定は、タイプαのPDGFレセプター遺伝子が
染色体４上の関連レセプター様遺伝子、ｃ−kit（L.d′
Auriol et al.,Hum.Genet 78,374（1988））と同一領域
の4q11−12にあることを示す。その他のこのサブファミ
リーの遺伝子は、染色体５の上にあることがわかった。
これらは、5q23−31に位置することがわかったタイプβ
のPDGF−Ｒ（Y.Yardenet al.,Nature 323,226（198
6））および5q33.2−33.3上のCSF1−Ｒの遺伝子（M.M.L
eBeau et al.,Science 231,984（1986）を含む。ヒト染
色体の４および５が共通の祖先に由来する証拠が存する
（D.E.Cominge,Nature 238,455（1972））。これらの関
連レセプター遺伝子は、4q上のセントロメア（centrome
re）近くまたは5qの末端半分に集まる。かくして、これ
らの遺伝子の先祖が単一の祖先の染色体に限定されたな
らば、リンケージの切断は長腕（long arm）内の逆位に
よって説明されるであろう。
また本研究は、異なったPDGF−Ｒ遺伝子が、それぞれ
が発現される細胞とは明らかに独立した結合特性を有す
る２種のレセプタータイプをエンコードすることを明ら
かにしている。この観察の示唆するところは、他のレセ
プターに関する知識を考慮すれば一層よく評価すること
ができる。
が発現される細胞とは明らかに独立した結合特性を有す
る２種のレセプタータイプをエンコードすることを明ら
かにしている。この観察の示唆するところは、他のレセ
プターに関する知識を考慮すれば一層よく評価すること
ができる。
より複雑な生物が進化するにつれて、細胞間伝達機構
の複雑性も同じく増大している証拠が浮上してきてい
る。関連したEGFおよびTEGα分子が類似した親和性をも
って共通のレセプターである。EGFレセプターと作用す
る（J.Massague,J.Biol.Chem.258,13614（1983））。
の複雑性も同じく増大している証拠が浮上してきてい
る。関連したEGFおよびTEGα分子が類似した親和性をも
って共通のレセプターである。EGFレセプターと作用す
る（J.Massague,J.Biol.Chem.258,13614（1983））。
これらの成長因子の発生および組織発現の色々のパタ
ーンは（R.Derynck et al.,Cancer Res.47,707（198
7）;D.C.Lee et al.,Mol.Cell.Biol.5,3644（1985）;D.
R.Twardzik,Cancer Res.45,5413（1985）;R.J.Coffey e
t al.,Nature 328,817（1987））、これらの現在存在す
る意味を説明するものと考えられる。
ーンは（R.Derynck et al.,Cancer Res.47,707（198
7）;D.C.Lee et al.,Mol.Cell.Biol.5,3644（1985）;D.
R.Twardzik,Cancer Res.45,5413（1985）;R.J.Coffey e
t al.,Nature 328,817（1987））、これらの現在存在す
る意味を説明するものと考えられる。
進化論的に多岐にわたるレセプター遺伝子の例も増加
している。このような遺伝子の生成物は、PDGFやCSF−1
レセプターの例のように、全く異ったリガンドに対応
可能であるか（E.S.Kawasaki et al.,Science 230,291
（1985）;C.Betsholtz et al.,Nature 320,695（198
6））、またはその代りに、IGF−Ｉおよびインシュリン
レセプターにおける如く関連リガンドに反応できる（A.
Ullrichet al.,Nature 313（1985）;Y.Ebina et al.,Ce
ll 40,747（1985）;A.Ullrich et al.,EMBO J.5,2503
（1986））。ここで、レセプター並びにそれらのリガン
ドの発生および組織の特異的発現、さらに触発された生
化学的反応は、生体の複雑性とともに進化してきてい
る。
している。このような遺伝子の生成物は、PDGFやCSF−1
レセプターの例のように、全く異ったリガンドに対応
可能であるか（E.S.Kawasaki et al.,Science 230,291
（1985）;C.Betsholtz et al.,Nature 320,695（198
6））、またはその代りに、IGF−Ｉおよびインシュリン
レセプターにおける如く関連リガンドに反応できる（A.
Ullrichet al.,Nature 313（1985）;Y.Ebina et al.,Ce
ll 40,747（1985）;A.Ullrich et al.,EMBO J.5,2503
（1986））。ここで、レセプター並びにそれらのリガン
ドの発生および組織の特異的発現、さらに触発された生
化学的反応は、生体の複雑性とともに進化してきてい
る。
本研究で示されたように、PDGFによって仲介された反
応は、２種の遺伝子によってエンコードされた異なった
ダイマー型の関連リガンドを含むだけでなく、異なった
PDGFレセプターを同じくエンコードする２種の関連遺伝
子をも含む。それらの組織特異的発現（C.Betsholtz et
al.,Nature 320,695（1986）;R.A.Seifert,S.M.Schwar
tz,D.F.Bowen−Pope Nature 34,669（1984）;M.Jaye et
al.,Science 228,882（1985）;J.Nilsson et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 82,4418（1985）;T.Collins et a
l.,Nature 316,748（1985））における相異に加えて、
この２種のPDGF遺伝子生成物は、彼等の相対的な分泌能
において異なることが知られている。PDGF−Ａ鎖はＢ鎖
よりもはるかに効果的に遊離され（P.Beckman et al.,S
cience 241,1346（1988）、このことがPDGF−Ａ鎖に比
較的大きく離れても作用する可能性を与える。
応は、２種の遺伝子によってエンコードされた異なった
ダイマー型の関連リガンドを含むだけでなく、異なった
PDGFレセプターを同じくエンコードする２種の関連遺伝
子をも含む。それらの組織特異的発現（C.Betsholtz et
al.,Nature 320,695（1986）;R.A.Seifert,S.M.Schwar
tz,D.F.Bowen−Pope Nature 34,669（1984）;M.Jaye et
al.,Science 228,882（1985）;J.Nilsson et al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 82,4418（1985）;T.Collins et a
l.,Nature 316,748（1985））における相異に加えて、
この２種のPDGF遺伝子生成物は、彼等の相対的な分泌能
において異なることが知られている。PDGF−Ａ鎖はＢ鎖
よりもはるかに効果的に遊離され（P.Beckman et al.,S
cience 241,1346（1988）、このことがPDGF−Ａ鎖に比
較的大きく離れても作用する可能性を与える。
今迄調査されたすべての正常な組織中に２種のPDGFレ
セプター遺伝子が同時に発現する今回の証拠を考える
と、これらの組織特異的発現は、これらの機能の主要な
決定因子ではないのであろう。しかしながら、本発明の
方法を胎児発生期間および正常の同質の細胞集団におけ
る各レセプタータイプ発現の包括的な調査に適用するこ
とによって、示差調節（differential regulation）の
証拠が明らかにされ得る。
セプター遺伝子が同時に発現する今回の証拠を考える
と、これらの組織特異的発現は、これらの機能の主要な
決定因子ではないのであろう。しかしながら、本発明の
方法を胎児発生期間および正常の同質の細胞集団におけ
る各レセプタータイプ発現の包括的な調査に適用するこ
とによって、示差調節（differential regulation）の
証拠が明らかにされ得る。
記載の背景および今回の発表を完成するため各発表論
文、特許および今迄本文中で同定された特許明細書をこ
こで参考文献として明細書中に引用する。
文、特許および今迄本文中で同定された特許明細書をこ
こで参考文献として明細書中に引用する。
上述のように本発明が明瞭に理解できるよう若干詳細
に記載した。本発明の範囲から逸脱することなく形式や
詳細を色々と組合わせることができることもまた明らか
であろう。
に記載した。本発明の範囲から逸脱することなく形式や
詳細を色々と組合わせることができることもまた明らか
であろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ピアース，ジャカリン・エイチ アメリカ合衆国、20816 メリーランド、 ベセスダ、オーガスタ・ストリート 5306 (56)参考文献 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．240（1988) Ｐ．1529−1531 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．85（1988）Ｐ. 3435−3439 Ｓｃｌｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．234（1986) Ｐ．1545−1548 Ｓｃｌｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．229（1985) Ｐ．974−976
Claims (19)
- 【請求項１】ヒトのタイプα血小板由来増殖因子レセプ
ター（α−PDGFR）蛋白質をコードするcDNAであって、
該cDNAは、 の１位のヌクレオチドから始まり、3454位のヌクレオチ
ドで終わるヌクレオチド配列を有するcDNAであるT11
と、 （ｂ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含み、上記配列の139位のヌクレオチドから始まり、3
406位のヌクレオチドのTAA終止コドンまで延びる読み取
り枠を有するcDNAであるTR4と、 （ｃ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含まず、上記配列の208位のヌクレオチドから始ま
り、3406位のヌクレオチドで終わるヌクレオチド配列を
有するcDNAであるTR4と、 （ｄ）上記配列の2568位のヌクレオチドから始まり、63
78位のヌクレオチドで終わるヌクレオチド配列を有する
下記に示されるcDNAであるpHF1と、 からなる群から選ばれるDNAプローブと、緊縮条件下で
ハイブリッド形成するcDNA。 - 【請求項２】ヒトのタイプα血小板由来増殖因子レセプ
ター蛋白質が、（ａ）請求項１に記載の配列の１〜1089
番目のアミノ酸、及び、（ｂ）請求項１に記載の配列の
24〜1089番目のアミノ酸からなる群から選択されるアミ
ノ酸配列を有する、請求項１に記載のヒトのタイプα血
小板由来増殖因子レセプター蛋白質をコードするcDNA。 - 【請求項３】血小板由来増殖因子レセプター蛋白質がシ
グナルペプチドを含み、請求項１に記載の配列の１〜10
89位のアミノ酸配列を有する請求項２に記載のヒトのタ
イプα血小板由来増殖因子レセプターをコードするcDN
A。 - 【請求項４】シグナルペプチドを示すアミノ酸が切断さ
れ、レセプター蛋白質が請求項１に記載の配列の24〜10
89位のアミノ酸配列を有する、請求項２に記載のヒトの
タイプα血小板由来増殖因子レセプターをコードするcD
NA。 - 【請求項５】ベクター及び請求項１に記載のcDNAからな
る組換えDNA分子。 - 【請求項６】請求項１に記載のcDNAを含む形質転換細
胞。 - 【請求項７】ヒトのタイプα血小板由来増殖因子レセプ
ター蛋白質が生成される条件下で、請求項６に記載の細
胞を培養し、かつ該培養細胞から該蛋白質を単離するこ
とからなるヒトのタイプα血小板由来増殖因子レセプタ
ー蛋白質を製造する方法。 - 【請求項８】請求項１に記載の配列の１番目のアミノ酸
から始まり、1089番目のアミノ酸で終わるアミノ酸配
列、及び、（ｂ）請求項１に記載の配列の24番目のアミ
ノ酸で始まり1089番目のアミノ酸で終わるアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタイプ
α血小板由来増殖因子レセプター（α−PDGFR）蛋白
質。 - 【請求項９】請求項１に記載の配列の１番目のアミノ酸
から始まり、1089番目のアミノ酸で終わる、シグナルペ
プチドを含むアミノ酸配列を有するタイプα血小板由来
増殖因子レセプタータンパク質。 - 【請求項１０】シグナルペプチドに相当するアミノ酸配
列が切断され、請求項１に記載の配列の24番目のアミノ
酸から始まり1089番目のアミノ酸で終わるアミノ酸配列
を有するタイプα血小板由来増殖因子レセプター蛋白
質。 - 【請求項１１】請求項８〜10のいずれか一に記載のタイ
プα血小板由来増殖因子レセプター蛋白質のアミノ酸配
列を有する蛋白質に特異的な抗体。 - 【請求項１２】該抗体がタイプα血小板由来増殖因子レ
セプター蛋白質に対してのみ特異的な請求項11に記載の
抗体。 - 【請求項１３】タイプα血小板由来増殖因子レセプター
（α−PDGFR）抗原を検出するバイオアッセイにおい
て、 ｉ）請求項11に記載の抗体とα−PDGFR抗原の複合体が
形成される条件下で、該α−PDGFR抗原を含むと推定さ
れる生物試料を該抗体と接触させる工程と、 ii）生物試料中にα−PDGFR抗原の存在を示す該抗体抗
原複合体の存在を検出する工程と、 を含むバイオアッセイ。 - 【請求項１４】生物試料の細胞におけるタイプα血小板
由来増殖因子レセプター（α−PDGFR）のmRNAを検出す
ることによって、タイプα血小板由来増殖因子レセプタ
ー（α−PDGFR）遺伝子の発現を該細胞において検出す
る方法において、 ｉ）（ａ）請求項１に記載の配列の１位のヌクレオチド
から始まり、3454位のヌクレオチドで終わるcDNAである
T11と、 （ｂ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含み、請求項１に記載の配列の139位のヌクレオチド
から始まり、3406位のTAA終止コドンまで延びる読み取
り枠を有するcDNAであるTR4と、 （ｃ）シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含まず、請求項１に記載の配列の208位のヌクレオチ
ドから始まり3406位のヌクレオチドで終わるヌクレオチ
ド配列を有するcDNAであるTR4と、 （ｄ）請求項１に記載の配列の2568位のヌクレオチドか
ら始まり、6378位のヌクレオチドで終わる下記に示すpH
F1と呼ばれるDNAフラグメントと からなる群から選ばれる、緊縮条件下でα−PDGFRの該m
RNAとハイブリッド形成する検出可能な標識の付いたDNA
プローブと該生物試料の該細胞を接触させる工程と、 ii）mRNAの存在を検出する工程と、 を含む方法。 - 【請求項１５】DNAプローブは、請求項１に記載の配列
の１位のヌクレオチドから始まり、3454位のヌクレオチ
ドで終わるcDNA T11である請求項14に記載の方法。 - 【請求項１６】DNAプローブは、シグナルペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列を含み、請求項１に記載の配
列の139位のヌクレオチドから始まり、3406位のヌクレ
オチドのTAA終止コドンまで延びる読み取り枠を有するc
DNA TR4である請求項14に記載の方法。 - 【請求項１７】DNAプローブは、シグナルペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列を含まず、請求項１に記載の
配列の208位のヌクレオチドから始まり、3406位のヌク
レオチドで終わるヌクレオチド配列を有するcDNA TR4で
ある請求項14に記載の方法。 - 【請求項１８】DNAプローブは、請求項１に記載の配列
の2568位のヌクレオチドから始まり、6378位のヌクレオ
チドで終わる下記に示すpHF1と呼ばれるDNAフラグメン
トである請求項14に記載の方法。 - 【請求項１９】タイプα血小板由来増殖因子レセプター
（α−PDGFR）により仲介される活性のアゴニスト又は
拮抗体を同定するためのバイオアッセイであって、 ｉ）α−PDGFRのcDNAで形質転換した請求項６に記載の
細胞と、α−PDGFRによって仲介される活性のアゴニス
ト又は拮抗体と推定される分子を接触させる工程であっ
て、該DNAセグメントで形質転換する前の該細胞の生存
能力は、通常、インターロイキン３に依存する工程と、 ii）α−PDGFRで形質転換した該細胞が血小板由来増殖
因子AA（PDGF−AA）、血小板由来増殖因子AB（PDGF−A
B）、又は血小板由来増殖因子BB（PDGF−BB）と接触さ
せたときに示される活性のレベルと比較することによっ
て、α−PDGFRのアゴニスト又は拮抗体と推定される該
分子と接触させたα−PDGFRで形質転換した該細胞に存
在するα−PDGFRにより仲介される生物的活性の量を決
定する工程と、 を含むバイオアッセイ。
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