JP3217339B2 - ヒトの血小板由来の成長因子受容体 - Google Patents
ヒトの血小板由来の成長因子受容体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は、成長因子及びその受容体、及び特にヒトの
血小板由来成長因子受容体に関するものである。
血小板由来成長因子受容体に関するものである。
（発明の背景） 血小板由来成長因子（PDGF）は間葉細胞の主要なマイ
トジェンである。このタンパク質は、ジスルフィド結合
で結合している２本のポリペプチド鎖Ａ及びＢからなる
32kDaのヘテロニ量体タンパク質である。このPDGFABヘ
テロニ量体に加えて、AA及びBBと表わされる２個のホモ
ニ量体が同定されている。現在のところ、PDGFのAA型が
PDGF受容体に結合するという直接的証拠はない。
トジェンである。このタンパク質は、ジスルフィド結合
で結合している２本のポリペプチド鎖Ａ及びＢからなる
32kDaのヘテロニ量体タンパク質である。このPDGFABヘ
テロニ量体に加えて、AA及びBBと表わされる２個のホモ
ニ量体が同定されている。現在のところ、PDGFのAA型が
PDGF受容体に結合するという直接的証拠はない。
PDGF由来の分裂促進の最初の事象は、細胞膜上での、
PDGFとその受容体との結合である。この相互作用は受容
体チロシンキナーゼの活性化、ホスファチジルイノシト
ールのターンオーバー増加、遺伝子群の発現促進、ホス
ホリパーゼA2の活性化、細胞形の変化、細胞性カルシウ
ム濃度の増加、細胞内pHの変化及びインターナリゼーシ
ョン及び結合PDGFの分解を含む、多くの初期細胞応答の
引き金を引く。これらの変化につづいて、標的細胞の増
殖速度の増加が起こる。
PDGFとその受容体との結合である。この相互作用は受容
体チロシンキナーゼの活性化、ホスファチジルイノシト
ールのターンオーバー増加、遺伝子群の発現促進、ホス
ホリパーゼA2の活性化、細胞形の変化、細胞性カルシウ
ム濃度の増加、細胞内pHの変化及びインターナリゼーシ
ョン及び結合PDGFの分解を含む、多くの初期細胞応答の
引き金を引く。これらの変化につづいて、標的細胞の増
殖速度の増加が起こる。
インビトロでのあるポリペプチドの、特別な細胞型の
増殖促進能は、インビボでの同様の機能を保証しない
が、細胞に関する多くの成長因子の役割が、その因子の
生物全体に果たす役割を測定することで研究されてい
る。インビトロで、血小板由来成長因子は、繊維芽細
胞、平滑筋細胞及びグリア細胞などの間葉細胞に対する
血清中の主要なポリペプチドマイトジェンである。イン
ビボでは、PDGFは血液血小板のα顆粒中に含まれて循環
しており、血液中を遊離して循環してはいない。凝血及
び血小板粘着の際、この顆粒は、しばしば血管の障害部
位に放出され、血管の修復にPDGFが差し向けられる。ま
たPDGFは、動脈の中間層から内層への、動脈平滑筋細胞
の移動を促進し、そこでそれらは障害の初期応答として
増殖する。
増殖促進能は、インビボでの同様の機能を保証しない
が、細胞に関する多くの成長因子の役割が、その因子の
生物全体に果たす役割を測定することで研究されてい
る。インビトロで、血小板由来成長因子は、繊維芽細
胞、平滑筋細胞及びグリア細胞などの間葉細胞に対する
血清中の主要なポリペプチドマイトジェンである。イン
ビボでは、PDGFは血液血小板のα顆粒中に含まれて循環
しており、血液中を遊離して循環してはいない。凝血及
び血小板粘着の際、この顆粒は、しばしば血管の障害部
位に放出され、血管の修復にPDGFが差し向けられる。ま
たPDGFは、動脈の中間層から内層への、動脈平滑筋細胞
の移動を促進し、そこでそれらは障害の初期応答として
増殖する。
細胞増殖が身体の中でどのようにコントロールされて
いるのかを調べるため、PDGFが研究されている。この成
長因子は傷の治癒、アテローム性動脈硬化症及び細胞の
がん性トランスホーメーション関連遺伝子、特にｃ−my
c、及びｃ−fosの刺激に関係している。それゆえ、PDGF
アゴニストは、障害治癒の促進に有用である。PDGFアン
ダゴニストは、アテローム性動脈硬化症、心血管系の手
術（cardiovascularintervention）後に起こる血管閉塞
の遅延及びがん細胞増殖のコントロールに有用である。
いるのかを調べるため、PDGFが研究されている。この成
長因子は傷の治癒、アテローム性動脈硬化症及び細胞の
がん性トランスホーメーション関連遺伝子、特にｃ−my
c、及びｃ−fosの刺激に関係している。それゆえ、PDGF
アゴニストは、障害治癒の促進に有用である。PDGFアン
ダゴニストは、アテローム性動脈硬化症、心血管系の手
術（cardiovascularintervention）後に起こる血管閉塞
の遅延及びがん細胞増殖のコントロールに有用である。
（関連文献） マウスのPDGF受容体が同定、精製され（ダニエル（Da
niel）等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA
（1985）82、2684〜2687）、また配列決定されている
（ヤーデン（Yarden）等、ネイチャー（Nature）（198
6）323、226−232）。
niel）等、プロシーディング・イン・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA
（1985）82、2684〜2687）、また配列決定されている
（ヤーデン（Yarden）等、ネイチャー（Nature）（198
6）323、226−232）。
（発明の概要） ここでは、ヒトの血小板由来成長因子受容体（hPDGF
−Ｒ）をコードするDNA配列が単離され、かつ配列決定
された。この配列を含む発現構築物は、ホ乳類細胞の膜
中に分泌され若しくは組込まれる受容体をコードしてい
る。組込まれた受容体は、この受容体を欠く細胞での、
PDGF感受性マイトジェン応答に関し、野生型受容体と機
能的に等価である。この構築物は、細胞のPDGF応答の促
進、PDGF結合に応答してそのシグナルを伝達するのに関
連している領域の決定、変異した類似物の提供及び薬剤
の生理学的活性の評価に使用することができる。
−Ｒ）をコードするDNA配列が単離され、かつ配列決定
された。この配列を含む発現構築物は、ホ乳類細胞の膜
中に分泌され若しくは組込まれる受容体をコードしてい
る。組込まれた受容体は、この受容体を欠く細胞での、
PDGF感受性マイトジェン応答に関し、野生型受容体と機
能的に等価である。この構築物は、細胞のPDGF応答の促
進、PDGF結合に応答してそのシグナルを伝達するのに関
連している領域の決定、変異した類似物の提供及び薬剤
の生理学的活性の評価に使用することができる。
（具体的態様の説明） hPDGF−Ｒを含む細胞の他にも、ヒトの血小板由来成
長因子受容体（hPDGF−Ｒ）の生産方法及びその生産の
ための核酸構築物が提供され、その組成物及び細胞が診
断、hPDGF−Ｒシグナルの誘導に関する薬剤の評価及びh
PDGF−Ｒに関連する病気の治療に使用される。特に、hP
DGF−Ｒをコードする発現構築物が提供される。この構
築物は、細胞をトランスフェクトし、機能的に野生型受
容体と等価な膜結合受容体を提供し、かつ受容体欠失細
胞にPDGF感受性マイトジェン応答を与えるのに用いるこ
とができる。このトランスフェクトした細胞は、細胞の
PDGF誘導応答の研究、PDGF結合に応答したシグナルの伝
達に関係する領域の決定及び薬剤の生理学的活性の評価
のモデルとして使用することができる。このコードされ
ている受容体又はその結合領域も、PDGFアゴニストの評
価に使用される。このDNA配列の他の利用法としては、
多くの成長制御関連遺伝子が密集している染色体５の領
域内の欠失を検出するプローブとしてこの配列断片を使
用することを挙げることができる。
長因子受容体（hPDGF−Ｒ）の生産方法及びその生産の
ための核酸構築物が提供され、その組成物及び細胞が診
断、hPDGF−Ｒシグナルの誘導に関する薬剤の評価及びh
PDGF−Ｒに関連する病気の治療に使用される。特に、hP
DGF−Ｒをコードする発現構築物が提供される。この構
築物は、細胞をトランスフェクトし、機能的に野生型受
容体と等価な膜結合受容体を提供し、かつ受容体欠失細
胞にPDGF感受性マイトジェン応答を与えるのに用いるこ
とができる。このトランスフェクトした細胞は、細胞の
PDGF誘導応答の研究、PDGF結合に応答したシグナルの伝
達に関係する領域の決定及び薬剤の生理学的活性の評価
のモデルとして使用することができる。このコードされ
ている受容体又はその結合領域も、PDGFアゴニストの評
価に使用される。このDNA配列の他の利用法としては、
多くの成長制御関連遺伝子が密集している染色体５の領
域内の欠失を検出するプローブとしてこの配列断片を使
用することを挙げることができる。
hPDGF−ＲをコードするcDNA配列のヌクレオチド配列
を、その受容体前駆体のアミノ酸配列とともに第１図に
示した。第１番のアミノ酸で始まる配列は、ヒトのPDGF
−Ｒのアミノ末端に対応している。最初の32個のアミノ
酸（−32番から−１番で示されている）は、シグナルペ
プチド配列をコードしている。黒棒の下線はトランスメ
ンブレン配列を示している（アミノ酸残基500番から524
番）。潜在的Ｎ−グリコシル化部位を線で示した。cDNA
の３′末端のポリアデニル化部位に下線を付した。
を、その受容体前駆体のアミノ酸配列とともに第１図に
示した。第１番のアミノ酸で始まる配列は、ヒトのPDGF
−Ｒのアミノ末端に対応している。最初の32個のアミノ
酸（−32番から−１番で示されている）は、シグナルペ
プチド配列をコードしている。黒棒の下線はトランスメ
ンブレン配列を示している（アミノ酸残基500番から524
番）。潜在的Ｎ−グリコシル化部位を線で示した。cDNA
の３′末端のポリアデニル化部位に下線を付した。
本発明のDNA組成物はゲノムDNA又は、合成もしくはそ
れらの組合せで調製されるcDNAから誘導することができ
る。このDNA組成物は、１個以上のイントロンが存在し
ていてもよく、通常、少なくとも８個のコドン（24b
p）、より一般的には少なくとも12個のコドンを含む、h
PDGF−Ｒをコードする完全なコード領域又は、その重要
な断片を含んでいる。ほとんどの場合、野生型配列が使
われるが、場合によっては、アミノ酸配列を変化させた
りサイレントな突然変異を起こす欠失、置換又は挿入な
どの１以上の突然変異が導入されても良い。そのゲノム
配列は通常50Kbpを越えず、より一般的には、約10Kbpを
越えず、好ましくは6Kbp以下である。
れらの組合せで調製されるcDNAから誘導することができ
る。このDNA組成物は、１個以上のイントロンが存在し
ていてもよく、通常、少なくとも８個のコドン（24b
p）、より一般的には少なくとも12個のコドンを含む、h
PDGF−Ｒをコードする完全なコード領域又は、その重要
な断片を含んでいる。ほとんどの場合、野生型配列が使
われるが、場合によっては、アミノ酸配列を変化させた
りサイレントな突然変異を起こす欠失、置換又は挿入な
どの１以上の突然変異が導入されても良い。そのゲノム
配列は通常50Kbpを越えず、より一般的には、約10Kbpを
越えず、好ましくは6Kbp以下である。
hPDGF−ＲをコードするDNA断片は、実質的にhPDGF−
Ｒとの相同性を有する他種のPDGF受容体をコードするDN
Aを単離するのに使用される。hPDGF−ＲをコードするDN
A配列由来の少なくとも約10ヌクレオチド、通常少なく
とも約20ヌクレオチド以上、かつ約6knt（キロヌクレオ
チド）以下、通常約0.5knt以下のヌクレオチドを有する
DNA断片の一部がプローブとして使用される。このプロ
ーブは、細胞中に、hPDGF−ＲをコードするmRNAが存在
するか否かを調べるのに用いることができる。
Ｒとの相同性を有する他種のPDGF受容体をコードするDN
Aを単離するのに使用される。hPDGF−ＲをコードするDN
A配列由来の少なくとも約10ヌクレオチド、通常少なく
とも約20ヌクレオチド以上、かつ約6knt（キロヌクレオ
チド）以下、通常約0.5knt以下のヌクレオチドを有する
DNA断片の一部がプローブとして使用される。このプロ
ーブは、細胞中に、hPDGF−ＲをコードするmRNAが存在
するか否かを調べるのに用いることができる。
さらに、ヒトのPDGF受容体遺伝子は、多くの成長コン
トロール関連遺伝子が密集する染色体５上の一部位に位
置する。少なくとも１つの遺伝病、5qマイナス症（5q m
inus syndrome）は、この領域の欠失に関係しているこ
とが示された。このhPDGF−Ｒ遺伝子配列の断片は、ゲ
ノム中のこの重要な領域の構造を探り、また、ゲノム中
のこの領域に関連する遺伝病を診断するマーカーとして
用いることができる。
トロール関連遺伝子が密集する染色体５上の一部位に位
置する。少なくとも１つの遺伝病、5qマイナス症（5q m
inus syndrome）は、この領域の欠失に関係しているこ
とが示された。このhPDGF−Ｒ遺伝子配列の断片は、ゲ
ノム中のこの重要な領域の構造を探り、また、ゲノム中
のこの領域に関連する遺伝病を診断するマーカーとして
用いることができる。
また、このDNA断片又はその一部分も、hPDGF−Ｒの発
現構築物を調製するのに用いられる。この構築物には、
本来の、もしくはその他のプロモーターの転写コントロ
ール下のhPDGF−ＲをコードするDNA配列が含まれてい
る。通常、このプロモーターはホ乳類細胞中に発現する
ための真核性プロモーターであり、その場合、このホ乳
類細胞はPDGF受容体を欠くことも、欠いていない場合も
ある。原核性宿主において、このDNA配列を増巾し、も
しくは、受容体タンパク質又はその断片を産生したい場
合には、このプロモーターを原核性プロモーターとして
もよい。通常強力なプロモーターが高いレベルの転写及
び発現を提供するのに使用される。
現構築物を調製するのに用いられる。この構築物には、
本来の、もしくはその他のプロモーターの転写コントロ
ール下のhPDGF−ＲをコードするDNA配列が含まれてい
る。通常、このプロモーターはホ乳類細胞中に発現する
ための真核性プロモーターであり、その場合、このホ乳
類細胞はPDGF受容体を欠くことも、欠いていない場合も
ある。原核性宿主において、このDNA配列を増巾し、も
しくは、受容体タンパク質又はその断片を産生したい場
合には、このプロモーターを原核性プロモーターとして
もよい。通常強力なプロモーターが高いレベルの転写及
び発現を提供するのに使用される。
この発現構築物は、適当な細胞宿主において安定な染
色体外維持可能なベクターの一部のときもあるし、ま
た、宿主ゲノムに組込まれていてもよい。この発現カセ
ットはトランスポゾン配列、溶原性ウイルス配列などの
ような、宿主への挿入を可能にする配列に隣接してい
る。通常、マーカーを発現カセットに与えて、この発現
カセットを含む宿主細胞の選択を可能にする。このマー
カーは、同じDNA分子上にあっても、別のDNA分子にあっ
てもよいが、おなじDNA分子上であることが望ましい。
色体外維持可能なベクターの一部のときもあるし、ま
た、宿主ゲノムに組込まれていてもよい。この発現カセ
ットはトランスポゾン配列、溶原性ウイルス配列などの
ような、宿主への挿入を可能にする配列に隣接してい
る。通常、マーカーを発現カセットに与えて、この発現
カセットを含む宿主細胞の選択を可能にする。このマー
カーは、同じDNA分子上にあっても、別のDNA分子にあっ
てもよいが、おなじDNA分子上であることが望ましい。
ホ乳類細胞の場合、この受容体遺伝子自身が都合のよ
いマーカーとなっている。しかし、原核細胞の場合に
は、細胞毒性薬剤に対する耐性、栄養要求性宿主のプロ
トトロピーへの相補性、検出可能な産物の生産などのマ
ーカーがより都合がよい。
いマーカーとなっている。しかし、原核細胞の場合に
は、細胞毒性薬剤に対する耐性、栄養要求性宿主のプロ
トトロピーへの相補性、検出可能な産物の生産などのマ
ーカーがより都合がよい。
この発現構築物を、計画された宿主細胞により認識さ
れる複製システムに結合することができる。種々の複製
システムとして、レトロウイルス、シミアン（simian）
ウイルス、ボバインパピローマ（bovinepapilloma）ウ
イルス等のウイルス複製システムを挙げることができ
る。さらに、この構築物を増巾可能遺伝子、例えばDHFR
遺伝子に結合し、この結果、PDGF−Ｒ遺伝子の複製物を
多数作ることができる。
れる複製システムに結合することができる。種々の複製
システムとして、レトロウイルス、シミアン（simian）
ウイルス、ボバインパピローマ（bovinepapilloma）ウ
イルス等のウイルス複製システムを挙げることができ
る。さらに、この構築物を増巾可能遺伝子、例えばDHFR
遺伝子に結合し、この結果、PDGF−Ｒ遺伝子の複製物を
多数作ることができる。
宿主へのこの構築物の導入法は、各々の構築物に依存
して色々ある。導入は、科学文献で詳細に報告されてい
るように、融合、結合、トランスフェクション、トラン
スダクション、エレクトロポレーション、インジェクシ
ョン等を含む、いくつかの簡便な手段で行うことができ
る。通常、この宿主細胞は培地中で継続的に継代できる
不朽化した細胞（immortalized cells）である。ほとん
どの場合、これらの細胞、はPDGF−Ｒを発現でき、また
望ましい場合は、成熟ポリペプチドを提供する様にこの
ポリペプチドをプロセシングできる簡便なホ乳類細胞系
である。プロセシングは、グリコシル化、コビキチン
化、ジスルフィド結合形成などを目的に行う。通常、宿
主はhPDGF−Ｒを、この細胞の膜内に挿入するためのシ
グナル配列を認識することができる。もし分泌が望まれ
るなら、トランスメンブレンロケーター配列を欠失もし
くは、変異し、このタンパク質の膜挿入を阻止すること
ができる。
して色々ある。導入は、科学文献で詳細に報告されてい
るように、融合、結合、トランスフェクション、トラン
スダクション、エレクトロポレーション、インジェクシ
ョン等を含む、いくつかの簡便な手段で行うことができ
る。通常、この宿主細胞は培地中で継続的に継代できる
不朽化した細胞（immortalized cells）である。ほとん
どの場合、これらの細胞、はPDGF−Ｒを発現でき、また
望ましい場合は、成熟ポリペプチドを提供する様にこの
ポリペプチドをプロセシングできる簡便なホ乳類細胞系
である。プロセシングは、グリコシル化、コビキチン
化、ジスルフィド結合形成などを目的に行う。通常、宿
主はhPDGF−Ｒを、この細胞の膜内に挿入するためのシ
グナル配列を認識することができる。もし分泌が望まれ
るなら、トランスメンブレンロケーター配列を欠失もし
くは、変異し、このタンパク質の膜挿入を阻止すること
ができる。
このペプチド発現には、原核性又は真核性の広範な宿
主を使用することができる。有用な宿主には大腸菌、イ
ースト、糸状菌類などのバクテリア、種々のマウス系
列、サル系列、チャイニース・ハムスター卵巣系列、ヒ
ト系列のような不朽化ホ乳類細胞などが含まれる。ほと
んどの場合、このホ乳類細胞は不朽化細胞系列である。
場合によっては、これらの細胞を、悪性宿主から単離し
てもよいし、また野生型細胞をオンコジーン、腫瘍ウイ
ルス等でトランスホームしてもよい。
主を使用することができる。有用な宿主には大腸菌、イ
ースト、糸状菌類などのバクテリア、種々のマウス系
列、サル系列、チャイニース・ハムスター卵巣系列、ヒ
ト系列のような不朽化ホ乳類細胞などが含まれる。ほと
んどの場合、このホ乳類細胞は不朽化細胞系列である。
場合によっては、これらの細胞を、悪性宿主から単離し
てもよいし、また野生型細胞をオンコジーン、腫瘍ウイ
ルス等でトランスホームしてもよい。
多くの場合には、PDGF受容体を欠くホ乳類細胞をトラ
ンスフェクトし、そのシグナル配列がそのペプチドを細
胞膜に指し向けることが望ましい。リンパ細胞及び心筋
細胞は、受容体を欠く基本的細胞である。また，チャイ
ニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、上皮細胞系列及び
多くのヒト腫瘍細胞系列はPDGF受容体を欠いている。
ンスフェクトし、そのシグナル配列がそのペプチドを細
胞膜に指し向けることが望ましい。リンパ細胞及び心筋
細胞は、受容体を欠く基本的細胞である。また，チャイ
ニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、上皮細胞系列及び
多くのヒト腫瘍細胞系列はPDGF受容体を欠いている。
トランスフェクトした細胞は、PDGFに対する細胞応答
を研究するためのモデルとして使用される。コントロー
ルされた研究のため、PDGF受容体を欠くホ乳類細胞をhP
DGF−ＲをコードするDNA配列を含む発現構築物でトラン
スフェクトすることができる。野生型受容体と機能的に
等価でかつ、その細胞にPDGF感受性マイトジェン応答を
与える受容体をコードする細胞が生成する。このように
して、タンパク質性及び非タンパク質性の合成化合物ば
かりでなく、天然のPDGF、テスト断片の結合性を分析す
ることができる。実施例で示される様に、トランスフェ
クトした細胞を、PDGFのAA体が受容体チロシンキナーゼ
を活性化することの確認に用いた。
を研究するためのモデルとして使用される。コントロー
ルされた研究のため、PDGF受容体を欠くホ乳類細胞をhP
DGF−ＲをコードするDNA配列を含む発現構築物でトラン
スフェクトすることができる。野生型受容体と機能的に
等価でかつ、その細胞にPDGF感受性マイトジェン応答を
与える受容体をコードする細胞が生成する。このように
して、タンパク質性及び非タンパク質性の合成化合物ば
かりでなく、天然のPDGF、テスト断片の結合性を分析す
ることができる。実施例で示される様に、トランスフェ
クトした細胞を、PDGFのAA体が受容体チロシンキナーゼ
を活性化することの確認に用いた。
PDGF依存の分裂促進の研究に加えて、このトランスフ
ェクトした細胞は、PDGFアゴニスト又はアンタゴニスト
として機能する薬剤の能力を評価するのに用いることが
できる。特に、トランスフェクトした細胞をテスト薬剤
に接触させて、受容体チロシンキナーゼの活性量又はDN
A合成速度をPDGF又は既知の活性をもつその類似物の存
在、又は非存在下でコントロール細胞と比較することに
よって測定することができる。
ェクトした細胞は、PDGFアゴニスト又はアンタゴニスト
として機能する薬剤の能力を評価するのに用いることが
できる。特に、トランスフェクトした細胞をテスト薬剤
に接触させて、受容体チロシンキナーゼの活性量又はDN
A合成速度をPDGF又は既知の活性をもつその類似物の存
在、又は非存在下でコントロール細胞と比較することに
よって測定することができる。
トランスフェクトした細胞によって発現されるhPDGF
−Ｒタンパク質も使用される。もし、このペプチドが分
泌されるなら、このペプチドは、発現宿主が増殖した上
清中から単離することができる。もし分泌されないな
ら、このペプチドは、発現宿主の溶解物から単離するこ
とができる。その後、このペプチドをHPLC、電気泳動、
勾配遠心、特にPDGFその他を用いたアフィニティークロ
マトグラフィーを用いた従来技術によって単離し、実質
的に純粋な産物、特に細胞成分混入物のない産物が得ら
れる。
−Ｒタンパク質も使用される。もし、このペプチドが分
泌されるなら、このペプチドは、発現宿主が増殖した上
清中から単離することができる。もし分泌されないな
ら、このペプチドは、発現宿主の溶解物から単離するこ
とができる。その後、このペプチドをHPLC、電気泳動、
勾配遠心、特にPDGFその他を用いたアフィニティークロ
マトグラフィーを用いた従来技術によって単離し、実質
的に純粋な産物、特に細胞成分混入物のない産物が得ら
れる。
この受容体タンパク質又は、この受容体タンパク質の
結合部位である外部ドメインを形成するこの受容体のア
ミノ末端の約33番から始まり約500番までのアミノ酸
は、PDGFをアフィニティー精製するのに使用できる。こ
の外部ドメインも固体基質に固定して用いるか、溶液中
に遊離した状態で、PDGFアゴニスト及びアンタコニスト
として有用な薬剤を確認するのに使用される。
結合部位である外部ドメインを形成するこの受容体のア
ミノ末端の約33番から始まり約500番までのアミノ酸
は、PDGFをアフィニティー精製するのに使用できる。こ
の外部ドメインも固体基質に固定して用いるか、溶液中
に遊離した状態で、PDGFアゴニスト及びアンタコニスト
として有用な薬剤を確認するのに使用される。
このタンパク質もしくは、hPDGF−Ｒの約525番からカ
ルボキシ末端までの、このタンパク質の細胞内部分もチ
ロシンキナーゼ活性を有する酵素として用いられる。さ
らに、この受容体のアミノ末端配列のアミノ酸１番から
32番には、トランスフェクトした細胞の膜を通過させる
構造タンパク質を決めるシグナル配列が含まれている。
このシグナル配列はhPDGF−Ｒとともに使用できるが、
他のタンパク質とも使うことができる。
ルボキシ末端までの、このタンパク質の細胞内部分もチ
ロシンキナーゼ活性を有する酵素として用いられる。さ
らに、この受容体のアミノ末端配列のアミノ酸１番から
32番には、トランスフェクトした細胞の膜を通過させる
構造タンパク質を決めるシグナル配列が含まれている。
このシグナル配列はhPDGF−Ｒとともに使用できるが、
他のタンパク質とも使うことができる。
ペプチド又はその一部も、ポリクローナル又はモノク
ローナル抗体を生産するのに使用できる。抗体は、例え
ばマウス等の適当な脊椎動物宿主を、ペプチド単独でも
しくは従来のアジュバントと組合せて免疫化することに
よって生産される。通常２回以上の免疫化を行ない、そ
して、その血液又は脾臓を、最後の注射から数日後に収
穫すればよい。
ローナル抗体を生産するのに使用できる。抗体は、例え
ばマウス等の適当な脊椎動物宿主を、ペプチド単独でも
しくは従来のアジュバントと組合せて免疫化することに
よって生産される。通常２回以上の免疫化を行ない、そ
して、その血液又は脾臓を、最後の注射から数日後に収
穫すればよい。
ポリクローナル抗血清には、イムノグロブリンを沈殿
化し、これを単離し、ついでアフィニティー精製を含む
精製を行った。モノクローナル抗体には、通常、脾臓細
胞をハイブリドーマに選択的な条件下で、骨髄細胞系列
のような不朽化リンパ細胞と融合する。それからこのハ
イブリドーマを制限希釈条件下でクローン化し、ついで
その上清を、望ましい特異性をもつ抗体に関してスクリ
ーニングした。抗体を産生するための技術は文献でよく
知られているものであり、米国特許第4,381,292号、第
4,451,570号及び第4,618,577号に例示されている。
化し、これを単離し、ついでアフィニティー精製を含む
精製を行った。モノクローナル抗体には、通常、脾臓細
胞をハイブリドーマに選択的な条件下で、骨髄細胞系列
のような不朽化リンパ細胞と融合する。それからこのハ
イブリドーマを制限希釈条件下でクローン化し、ついで
その上清を、望ましい特異性をもつ抗体に関してスクリ
ーニングした。抗体を産生するための技術は文献でよく
知られているものであり、米国特許第4,381,292号、第
4,451,570号及び第4,618,577号に例示されている。
（実施例） （ヒト腎臓λGT11cDNAライブラリー及びヒト胎盤λGT10
cDNAライブラリーのスクリーニング） マウスPDGF受容体（mPDGF−Ｒ）タンパク質をコード
する全DNA配列をヒト腎臓cDNAライブラリーの250,000個
のプラークをスクリーニングするプローブとして用い
た。μｇ当り12×108cpmの比活性をもつプローブを作る
のにニック・トランスレーションを使用した。30％ホル
ムアミド、１×デンハート溶液、５×SSC、0.02Mリン酸
ナトリウム（pH6.5）及びml当り500μｇのサケ精子DNA
を含むハイブリダイゼーションバッファ中このフィルタ
ーをプローブ（ml当り105cpm）とインキュベーションし
た。40℃、14時間のハイブリダイゼーションの後、この
フィルターを55℃の0.2×SSC、0.1％SDS溶液で４度洗浄
し、さらに65℃の0.2×SSCで２度洗浄した。それからこ
のフィルターを空気乾燥してから、16時間の露光を行っ
た。
cDNAライブラリーのスクリーニング） マウスPDGF受容体（mPDGF−Ｒ）タンパク質をコード
する全DNA配列をヒト腎臓cDNAライブラリーの250,000個
のプラークをスクリーニングするプローブとして用い
た。μｇ当り12×108cpmの比活性をもつプローブを作る
のにニック・トランスレーションを使用した。30％ホル
ムアミド、１×デンハート溶液、５×SSC、0.02Mリン酸
ナトリウム（pH6.5）及びml当り500μｇのサケ精子DNA
を含むハイブリダイゼーションバッファ中このフィルタ
ーをプローブ（ml当り105cpm）とインキュベーションし
た。40℃、14時間のハイブリダイゼーションの後、この
フィルターを55℃の0.2×SSC、0.1％SDS溶液で４度洗浄
し、さらに65℃の0.2×SSCで２度洗浄した。それからこ
のフィルターを空気乾燥してから、16時間の露光を行っ
た。
10個の陽性クローンが得られ、これを、全mPDGF−Ｒ
のプローブを用いて再スクリーニングした。個々のクロ
ーンを単離し、EcoR Iエンドヌクレアーゼを用いた制限
分析を行った。クローンHK−６という名の最も大きい挿
入物（2.3kb）を含むクローンについて、さらに特徴を
明らかにし、かつダイデオキシターミネーターを用いて
配列決定を行った。クローンHK−６は、ヌクレオチド35
54から5691までの受容体配列と、ポリＡティル由来の９
個の塩基を含んでいた。
のプローブを用いて再スクリーニングした。個々のクロ
ーンを単離し、EcoR Iエンドヌクレアーゼを用いた制限
分析を行った。クローンHK−６という名の最も大きい挿
入物（2.3kb）を含むクローンについて、さらに特徴を
明らかにし、かつダイデオキシターミネーターを用いて
配列決定を行った。クローンHK−６は、ヌクレオチド35
54から5691までの受容体配列と、ポリＡティル由来の９
個の塩基を含んでいた。
2.3kbのHK−6DNAから作る、ニック・トランスレーシ
ョンプローブを、ヒトの胎盤cDNAライブラリーの250,00
0個のプラークをスクリーニングするのに用いた。この
スクリーニングは高ハイブリダイゼーション・ストリン
ジェンシー条件（上述ハイブリダイゼーションバッファ
ー中50％ホルムアミド）で行った。このフィルターを42
℃、14〜16時間、ml当り５×105cpmのプローブとインキ
ュベーションした。さらに、このフィルターを65℃の0.
1％SSC、0.1％SDS溶液で４度洗浄した。
ョンプローブを、ヒトの胎盤cDNAライブラリーの250,00
0個のプラークをスクリーニングするのに用いた。この
スクリーニングは高ハイブリダイゼーション・ストリン
ジェンシー条件（上述ハイブリダイゼーションバッファ
ー中50％ホルムアミド）で行った。このフィルターを42
℃、14〜16時間、ml当り５×105cpmのプローブとインキ
ュベーションした。さらに、このフィルターを65℃の0.
1％SSC、0.1％SDS溶液で４度洗浄した。
HK−６プローブを用いた第２のスクリーニングの後、
７個のクローンを選択し、EcoR Iエンドヌクレアーゼを
用いた制限消化により分析した。4.5kbの挿入物を含む
クローン（HP−７）を選択し、その特徴を明らかにし
た。このクローンの配列を第１図に示す。
７個のクローンを選択し、EcoR Iエンドヌクレアーゼを
用いた制限消化により分析した。4.5kbの挿入物を含む
クローン（HP−７）を選択し、その特徴を明らかにし
た。このクローンの配列を第１図に示す。
（発現ベクターの構築） ヒトPDGF受容体の全コード配列を含む、4.5kbDNA断片
をEcoR I消化により、HP−７クローンから単離した。ゲ
ル精製した断片を、SV40発現ベクターpSV7Cのポリリン
カー領域のEcoR I部位にクローン化した。pSV7d発現ベ
クター（デービス、カルホルニア大学、P.ルシュウ（Lu
ciw）により提供された）は、SV40初期プロモーター領
域（SV40ヌクレオチド 5190−5270）、EcoR I、Sma
I、Xba I及びSal Iの制限部位とそれにつづく３個の翻
訳終止コドン（TAA）を含む合成ポリリンカー、及びSV4
0ポリアデニレーションシグナル（SV40ヌクレオチド255
6−2770）を含むpML誘導体である（トルート（Truett）
等、DNA（1984）４、333−349）。HP−７由来のcDNA配
列を含むEcoR I断片をpSV7dのEcoR I部位に挿入した。
この発現ベクターにおいて、hPDGF−受容体遺伝子は、S
V40プロモーターの転写コントロール下にある。
をEcoR I消化により、HP−７クローンから単離した。ゲ
ル精製した断片を、SV40発現ベクターpSV7Cのポリリン
カー領域のEcoR I部位にクローン化した。pSV7d発現ベ
クター（デービス、カルホルニア大学、P.ルシュウ（Lu
ciw）により提供された）は、SV40初期プロモーター領
域（SV40ヌクレオチド 5190−5270）、EcoR I、Sma
I、Xba I及びSal Iの制限部位とそれにつづく３個の翻
訳終止コドン（TAA）を含む合成ポリリンカー、及びSV4
0ポリアデニレーションシグナル（SV40ヌクレオチド255
6−2770）を含むpML誘導体である（トルート（Truett）
等、DNA（1984）４、333−349）。HP−７由来のcDNA配
列を含むEcoR I断片をpSV7dのEcoR I部位に挿入した。
この発現ベクターにおいて、hPDGF−受容体遺伝子は、S
V40プロモーターの転写コントロール下にある。
SV40プロモーターに対し、PDGF受容体挿入物（4.5k
b）の正しい方向を保証するため、この陽性クローンをS
ma Iエンドヌクレアーゼで消化し、受容体配列の部位57
3番及び発現ベクターのポリリンカー領域で切断した。
b）の正しい方向を保証するため、この陽性クローンをS
ma Iエンドヌクレアーゼで消化し、受容体配列の部位57
3番及び発現ベクターのポリリンカー領域で切断した。
正しい転写方向をもつ受容体を含むクローンは、発現
ベクタと受容体の５′末端の573塩基対を含む3.2kbの断
片に加えて、4.0kbの挿入物を放出した。このプラスミ
ドpSVRH5は、抗生物質ネオマイシン耐性を与えるpSV2ne
oプラスミドとともに細胞のコトランスフェクションに
用いた。
ベクタと受容体の５′末端の573塩基対を含む3.2kbの断
片に加えて、4.0kbの挿入物を放出した。このプラスミ
ドpSVRH5は、抗生物質ネオマイシン耐性を与えるpSV2ne
oプラスミドとともに細胞のコトランスフェクションに
用いた。
（CHO細胞の培養のトランスフェクション） U.C.S.F.ティシュ・カルチャー・ファシリティーから
入手した、CHO細胞クローンKIを、37℃、５％CO2/95％
空気中、10％FCS（U.C.S.F.ティシュ・カルチャー・フ
ァシリティー）及びペニシリン及びストレプトマイシン
を補ったハム（Ham）Ｆ−12培地中で増殖した。
入手した、CHO細胞クローンKIを、37℃、５％CO2/95％
空気中、10％FCS（U.C.S.F.ティシュ・カルチャー・フ
ァシリティー）及びペニシリン及びストレプトマイシン
を補ったハム（Ham）Ｆ−12培地中で増殖した。
pSVRH5プラスミドDNA（10μｇ）及びpSV2neo（１μ
ｇ）を、カルシウム沈殿法（ファン・デル・エブ（Van
der Eb）等、メソッズ エンザイモロジー（Methoeds E
nzymology）（1980）65巻、826−839頁）により、トラ
ンスフェクトしたDNAの分解を防ぐための10μｇのクロ
ロキノン・ジホスフェート（CDP）添加条件下（ルスマ
ン（Luthman）及びマグヌソン（Magnusson）、ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ（Nucl,Acids,Res,）（198
3）91巻、1295〜1308頁）、１×106個のCHO細胞のコト
ランスフェクションに用いた。このDNAに露してから12
時間後、この細胞をトリプシン処理し、その５倍（1:
5）希釈物を再プレーティングした。24時間後、ネオマ
イシン類似物の抗生物質G418（ギブコ）を400μg/ml濃
度となるように培地に添加した。
ｇ）を、カルシウム沈殿法（ファン・デル・エブ（Van
der Eb）等、メソッズ エンザイモロジー（Methoeds E
nzymology）（1980）65巻、826−839頁）により、トラ
ンスフェクトしたDNAの分解を防ぐための10μｇのクロ
ロキノン・ジホスフェート（CDP）添加条件下（ルスマ
ン（Luthman）及びマグヌソン（Magnusson）、ヌクレイ
ック・アシッズ・リサーチ（Nucl,Acids,Res,）（198
3）91巻、1295〜1308頁）、１×106個のCHO細胞のコト
ランスフェクションに用いた。このDNAに露してから12
時間後、この細胞をトリプシン処理し、その５倍（1:
5）希釈物を再プレーティングした。24時間後、ネオマ
イシン類似物の抗生物質G418（ギブコ）を400μg/ml濃
度となるように培地に添加した。
選択のための２週間の後、個々のコロニーをつり上げ
24穴プレートに移した。この集密培養物について、抗受
容体抗体を用いたイムノブロットによる、PDGF受容体の
存否の検定を行った。この検定で陽性のコロニーをエン
ド・リミッティング・ダイリューションにより単一細胞
クローンとした。
24穴プレートに移した。この集密培養物について、抗受
容体抗体を用いたイムノブロットによる、PDGF受容体の
存否の検定を行った。この検定で陽性のコロニーをエン
ド・リミッティング・ダイリューションにより単一細胞
クローンとした。
安定なトランスフェクト細胞について、RNA保護検定
法で測定するPDGF受容体メッセージの発現（ジン（Zin
n）等、セル（Cell）（1983）34巻、865〜879頁）及び
抗ホスホチロシン抗体により検出される、PDGF依存の受
容体タンパク質の存在（フラケルトン（Frackelton）
等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem.）（1984）259巻、7909−7915頁）に関
するテストを行った。
法で測定するPDGF受容体メッセージの発現（ジン（Zin
n）等、セル（Cell）（1983）34巻、865〜879頁）及び
抗ホスホチロシン抗体により検出される、PDGF依存の受
容体タンパク質の存在（フラケルトン（Frackelton）
等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem.）（1984）259巻、7909−7915頁）に関
するテストを行った。
（CHO細胞におけるhPDGF−RcDNAの発現） SV40初期プロモーターの転写コントロールＦ、ヒト受
容体cDNAを含むプラスミドDNAでトランスフェクトしたC
HO細胞（CHO−HR5）及び、マウス受容体cDNAを含む同様
のプラスミドでトランスフェクトしたCHO細胞（CHO−R1
8）を先に報告されているように可溶化した（エスコベ
ド（Escobedo）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（J.Biol.Chem.）（1988）263巻、1482
−1487頁）。先に報告されているように、この受容体カ
ルボキシ末端領域中の配列を特異的に認識する抗体を用
いた、ウェスタン・ブロット分析により、この抽出物の
分析を行った（エスコベド（Escobedo）等（上述）；キ
ーティング（Keeting）等、上述（1987）262巻、7932−
3937頁）。195KDaのタンパク質は、成熟受容体であり、
一方、160KDaのタンパク質は、その受容体の前駆体であ
る。
容体cDNAを含むプラスミドDNAでトランスフェクトしたC
HO細胞（CHO−HR5）及び、マウス受容体cDNAを含む同様
のプラスミドでトランスフェクトしたCHO細胞（CHO−R1
8）を先に報告されているように可溶化した（エスコベ
ド（Escobedo）等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（J.Biol.Chem.）（1988）263巻、1482
−1487頁）。先に報告されているように、この受容体カ
ルボキシ末端領域中の配列を特異的に認識する抗体を用
いた、ウェスタン・ブロット分析により、この抽出物の
分析を行った（エスコベド（Escobedo）等（上述）；キ
ーティング（Keeting）等、上述（1987）262巻、7932−
3937頁）。195KDaのタンパク質は、成熟受容体であり、
一方、160KDaのタンパク質は、その受容体の前駆体であ
る。
このトランスフェクタントにおける受容体タンパク質
の発現がこの受容体の細胞内配列を認識する抗体を用い
て示された。ヒト受容体の最も高い発現を行うクローン
を選択し、次の実験に用いた。このトランスフェクタン
トは、以下に述べる競合結合実験で示されるように、
125I−PDGFでラベルした受容体を有していた。
の発現がこの受容体の細胞内配列を認識する抗体を用い
て示された。ヒト受容体の最も高い発現を行うクローン
を選択し、次の実験に用いた。このトランスフェクタン
トは、以下に述べる競合結合実験で示されるように、
125I−PDGFでラベルした受容体を有していた。
（種々のPDGF型のPDGF受容体への競合的結合） ヒトの組換えAA及びBBホモニ量体（コリンズ（Collin
s）等、ネイチャー（Nature）（1987）328巻、621−624
頁）が受容体部位に対して競合し、かつ、125Iラベル化
PDGFに置き換る能力を研究した。各ホモニ量体を、イー
ストの発現システム（ブレーク（Blake）等、プロシー
ディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA（1984）81巻、4642
−4646頁）により選択的に産生させ、ついで、その他の
間葉細胞増殖因子を欠き、従って、ホ乳類発現システム
中に存在する可能性のある因子の混入のアーテファクト
を回避したイースト培地から精製した。
s）等、ネイチャー（Nature）（1987）328巻、621−624
頁）が受容体部位に対して競合し、かつ、125Iラベル化
PDGFに置き換る能力を研究した。各ホモニ量体を、イー
ストの発現システム（ブレーク（Blake）等、プロシー
ディング・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA（1984）81巻、4642
−4646頁）により選択的に産生させ、ついで、その他の
間葉細胞増殖因子を欠き、従って、ホ乳類発現システム
中に存在する可能性のある因子の混入のアーテファクト
を回避したイースト培地から精製した。
BAL B/C 3T3細胞及びCHOトランスフェクタント（CHO
−HR5）をAA又はBBの濃度を順次高めた条件下で125I−P
DGFとインキュベートした（ウィリアムス（Williams）
等上述（1982）79、5067−5070）。結合は、37℃、45分
間細胞懸濁液中で行った。未結合の、放射性ラベル化PD
GFは、フィコール（Ficoll）勾配遠心により除去した
（オーカンスキー（Orchansky）等、ジャーナル・オブ
・イムノロジー（J.Immunol.）（1986）136、169−17
3）。CHO細胞の125I−PDGFとのインキベーションで測定
した非特異的結合は、結合放射活性の25％であった。
−HR5）をAA又はBBの濃度を順次高めた条件下で125I−P
DGFとインキュベートした（ウィリアムス（Williams）
等上述（1982）79、5067−5070）。結合は、37℃、45分
間細胞懸濁液中で行った。未結合の、放射性ラベル化PD
GFは、フィコール（Ficoll）勾配遠心により除去した
（オーカンスキー（Orchansky）等、ジャーナル・オブ
・イムノロジー（J.Immunol.）（1986）136、169−17
3）。CHO細胞の125I−PDGFとのインキベーションで測定
した非特異的結合は、結合放射活性の25％であった。
この結合実験は、このトランスフェクトした細胞がhP
DGFとその受容体の相互作用を研究するモデルとして使
用できることを示している。特に、この実験は、このト
ランスフェクトしたヒト受容体が以下に示す結果によっ
て示されるように、本来のマウスの受容体と機能的に同
一であることを示した。PDGFのAA型及びBB型の両方共、
ヒト受容体トランスフェクタントにおける125I−PDGFラ
ベル化部位に対して競合した。本来のマウス受容体と同
様、トランスフェクトしたヒト受容体に対してもBB型は
AA型よりも高い親和性をもっていた。イーストで発現さ
れたとき、PDGFのAA型は異常なプロセシングを受け、ト
ランスフェクトした細胞及びマウス3T3細胞の両方に対
し、そのBB型よりも低い親和性を示した。この競合パタ
ーンの一致は、そのAA型が本来のマウス受容体との相互
作用と同様の様式で、トランスフェクトしたヒト受容体
と相互作用することを示し、つまり、これら受容体が機
能的に同一であることを示している。
DGFとその受容体の相互作用を研究するモデルとして使
用できることを示している。特に、この実験は、このト
ランスフェクトしたヒト受容体が以下に示す結果によっ
て示されるように、本来のマウスの受容体と機能的に同
一であることを示した。PDGFのAA型及びBB型の両方共、
ヒト受容体トランスフェクタントにおける125I−PDGFラ
ベル化部位に対して競合した。本来のマウス受容体と同
様、トランスフェクトしたヒト受容体に対してもBB型は
AA型よりも高い親和性をもっていた。イーストで発現さ
れたとき、PDGFのAA型は異常なプロセシングを受け、ト
ランスフェクトした細胞及びマウス3T3細胞の両方に対
し、そのBB型よりも低い親和性を示した。この競合パタ
ーンの一致は、そのAA型が本来のマウス受容体との相互
作用と同様の様式で、トランスフェクトしたヒト受容体
と相互作用することを示し、つまり、これら受容体が機
能的に同一であることを示している。
（PDGF受容体チロシンキナーゼの活性化） 受容体チロシンキナーゼを活性化する、組換えAA及び
BBホモニ量体及びヒトの部分精製ABPDGFの能力を研究し
た。イースト由来のAA及びBBホモニ量体型及び血小板由
来のAB型は、トランスフェクトされたヒト受容体のオー
トホスホリゼーションを促進した。
BBホモニ量体及びヒトの部分精製ABPDGFの能力を研究し
た。イースト由来のAA及びBBホモニ量体型及び血小板由
来のAB型は、トランスフェクトされたヒト受容体のオー
トホスホリゼーションを促進した。
ヒトのPDGF受容体cDNAでトランスフェクトしたCHO細
胞（CHO−HR5）及びBALB/C 3T3細胞を種々の型のPDGF
（AA、BB及びAB）と量を変化させてインキュベートし
た。ポリアクリルアミド−SDS電気泳動につづいて、リ
ン酸化した受容体を、抗ホスホチロシン抗体を用いたウ
ェスタンブロットによって固定した（ワング（Wang）、
モレキュラー、アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.
Cell.Biol.）（1985）５巻、3640−3643頁）。
胞（CHO−HR5）及びBALB/C 3T3細胞を種々の型のPDGF
（AA、BB及びAB）と量を変化させてインキュベートし
た。ポリアクリルアミド−SDS電気泳動につづいて、リ
ン酸化した受容体を、抗ホスホチロシン抗体を用いたウ
ェスタンブロットによって固定した（ワング（Wang）、
モレキュラー、アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.
Cell.Biol.）（1985）５巻、3640−3643頁）。
この受容体タンパク質を、200KDaの分子量マーカーと
共泳動した。トランスフェクトされたヒト受容体のオー
トホスホリレーションを促進するのに有効な各型の濃度
は、本来のマウス3T3受容体又は、トランスフェクトさ
れたマウス受容体に対し、同じオートホスホリレーショ
ンを与える濃度と同一であった。
共泳動した。トランスフェクトされたヒト受容体のオー
トホスホリレーションを促進するのに有効な各型の濃度
は、本来のマウス3T3受容体又は、トランスフェクトさ
れたマウス受容体に対し、同じオートホスホリレーショ
ンを与える濃度と同一であった。
これらの結果は、まず、PDGFのAA型が、受容体チロシ
ンキナーゼを活性化することを示している。トランスフ
ェクトした細胞に使用する前に、AA型がhPDGF活性を有
していること、又は単一受容体がPDGFの全三種の型を認
識できることは示されていなかった。さらに、これらの
結果は、ヒトcDNAが、マウス3T3細胞における、PDGF依
存のチロシンキナーゼ活性が由来する野生型受容体と機
能的に等しい受容体をコードしていることを示してい
る。
ンキナーゼを活性化することを示している。トランスフ
ェクトした細胞に使用する前に、AA型がhPDGF活性を有
していること、又は単一受容体がPDGFの全三種の型を認
識できることは示されていなかった。さらに、これらの
結果は、ヒトcDNAが、マウス3T3細胞における、PDGF依
存のチロシンキナーゼ活性が由来する野生型受容体と機
能的に等しい受容体をコードしていることを示してい
る。
従って、このトランスフェクトした細胞は、PDGFで誘
導されるマイトジェン応答を研究するための有用なモデ
ルである。
導されるマイトジェン応答を研究するための有用なモデ
ルである。
（トランスフェクトされたCHO細胞におけるDNA合成速
度） ヒトのPDGF受容体cDNAでトランスフェクトしたCHO細
胞（CHO−HR5）及びBALB/C 3T3細胞を、飽和濃度までの
三型のPDGFとインキュベートした。未処理の細胞及びウ
シ胎児血清（FCS）で処理した細胞を、各々ネガティブ
及びポジティブコントロールとして使用した。DNAへの3
H−チミジン取込みのレベルを、先に報告されているよ
うな、酸沈殿化物質の放射活性により測定した（エスコ
ベド（Escobedo）、上述）。
度） ヒトのPDGF受容体cDNAでトランスフェクトしたCHO細
胞（CHO−HR5）及びBALB/C 3T3細胞を、飽和濃度までの
三型のPDGFとインキュベートした。未処理の細胞及びウ
シ胎児血清（FCS）で処理した細胞を、各々ネガティブ
及びポジティブコントロールとして使用した。DNAへの3
H−チミジン取込みのレベルを、先に報告されているよ
うな、酸沈殿化物質の放射活性により測定した（エスコ
ベド（Escobedo）、上述）。
ヒト又はマウスの受容体によるCHO細胞のトランスフ
ェクションは、PDGF感受性のマイトジェン応答を与え
た。全ての型のPDGFは、ヒトの受容体トランスフェクタ
ント及びマウスのネカティブ受容体をもつ細胞双方にお
けるDNA合成を促進した。
ェクションは、PDGF感受性のマイトジェン応答を与え
た。全ての型のPDGFは、ヒトの受容体トランスフェクタ
ント及びマウスのネカティブ受容体をもつ細胞双方にお
けるDNA合成を促進した。
これらデータは、血小板由来のAB型と同様に、Ａ鎖ホ
モニ量体及びＢ鎖ホモニ量体は、このヒトcDNA配列によ
ってコードされる受容体を介して作用できるマイトジェ
ンであることを示した。トランスフェクトしたヒト受容
体を含むCHO細胞及びマウス3T3細胞に関するこれらの型
のPDGFのマイトジェン作用は、この応答が機能的に同一
の受容体によって仲介されることを示している。
モニ量体及びＢ鎖ホモニ量体は、このヒトcDNA配列によ
ってコードされる受容体を介して作用できるマイトジェ
ンであることを示した。トランスフェクトしたヒト受容
体を含むCHO細胞及びマウス3T3細胞に関するこれらの型
のPDGFのマイトジェン作用は、この応答が機能的に同一
の受容体によって仲介されることを示している。
これらの研究は、他の成長因子の混入を回避した成長
因子調製物と、測定された全てのPDGF応答がこの単一の
トランスフェクトされた受容体cDNAに帰因する受容体発
現システムの使用によって可能となったものである。
因子調製物と、測定された全てのPDGF応答がこの単一の
トランスフェクトされた受容体cDNAに帰因する受容体発
現システムの使用によって可能となったものである。
この明細書に記述した全ての刊行物及び特許出願は、
本発明が関係する当業者の技術水準を示している。全て
の刊行物及び特許出願は、過去に各刊行物又は特許出願
が参考として組込まれていることを特別に、及び個々に
示されているのと同種度に、参考として組込んだ。本発
明は、十分説明されてきたので、添付した特許請求の範
囲の精神又は範囲を逸脱することなしに多くの変化及び
修正がなしうることは、普通の当業者にとっては明白で
あろう。
本発明が関係する当業者の技術水準を示している。全て
の刊行物及び特許出願は、過去に各刊行物又は特許出願
が参考として組込まれていることを特別に、及び個々に
示されているのと同種度に、参考として組込んだ。本発
明は、十分説明されてきたので、添付した特許請求の範
囲の精神又は範囲を逸脱することなしに多くの変化及び
修正がなしうることは、普通の当業者にとっては明白で
あろう。
第１図は、hPDGF−ＲをコードするcDNA配列のヌクレオ
チド配列を、その受容体前駆体のアミノ酸配列とともに
示す。
チド配列を、その受容体前駆体のアミノ酸配列とともに
示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 17/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １０７ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/49 43/00 １０７ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ０７Ｋ 14/49 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ハイメ エ エスコベド アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94122 サン フランシスコ セヴンス アベニュー 1467 (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，323（1986）ｐ．226− 232 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (9)
- 【請求項１】以下に示されるアミノ酸配列の１番から10
74番で表されるヒトの血小板由来の成長因子受容体（hP
DGF−Ｒ）又はその配列において一若しくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換若しくは付加されかつhPDGF−Ｒ活性
を有する変異アミノ酸配列、をコードする50kbp以下のD
NA断片。 - 【請求項２】上記断片が、以下に示されるアミノ酸配列
の１番から1074番で表されるヒトの血小板由来の成長因
子受容体（hPDGF−Ｒ）又はその配列において一若しく
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されかつhP
DGF−Ｒ活性を有する変異アミノ酸配列、をコードする6
kbp以下のcDNA配列を含む、請求項（１）記載の断片。 - 【請求項３】以下に示されるアミノ酸配列の１番から10
74番で表されるヒトの血小板由来の成長因子受容体（hP
DGF−Ｒ）又はその配列において一若しくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換若しくは付加されかつhPDGF−Ｒ活性
を有する変異アミノ酸配列、をコードするDNA配列の25
乃至100個のヌクレオチドから成るプローブ。 - 【請求項４】以下に示されるアミノ酸配列の１番から10
74番で表されるヒトの血小板由来の成長因子受容体（hP
DGF−Ｒ）又はその配列において一若しくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換若しくは付加されかつhPDGF−Ｒ活性
を有する変異アミノ酸配列、の発現構築物であって、転
写の５′−３′の方向に、一つのプロモーター、及び自
然界でhPDGF−ＲをコードするDNA配列に結合している以
外のDNAに結合している核プロモーターの転写制御下に
あるhPDGF−Ｒ又は該変異アミノ酸配列をコードするDNA
配列を含む、hPDGF−Ｒ又はその変異体の発現構築物。 - 【請求項５】上記のプロモーターが真核性プロモーター
である、請求項（４）記載の発現構築物。 - 【請求項６】以下に示されるアミノ酸配列の33番から50
0番までのアミノ酸配列又はその配列において一若しく
は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異
アミノ酸配列を必須成分として成るPDGF受容体結合活性
を有するhPDGF−Ｒ又はPDGF受容体結合活性を有するそ
の変異体の断片。 - 【請求項７】以下に示されるアミノ酸配列の１番から10
74番で表されるヒトの血小板由来の成長因子受容体（hP
DGF−Ｒ）又はその配列において一若しくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換若しくは付加されかつhPDGF−Ｒ活性
を有する変異アミノ酸配列又はhPDGF−Ｒ活性を有する
その断片の調製物。 - 【請求項８】以下に示されるアミノ酸配列の１番から10
74番で表されるヒトの血小板由来の成長因子受容体（hP
DGF−Ｒ）又はその配列において一若しくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換若しくは付加されかつhPDGF−Ｒ活性
を有する変異アミノ酸配列、の発現構築物であって、転
写の５′−３′の方向に、一つのプロモーター、及び自
然界でhPDGF−ＲをコードするDNA配列に結合している以
外のDNAに結合している該プロモーターの転写制御下に
あるhPDGF−Ｒ又は該変異アミノ酸配列をコードするDNA
配列を含む、hPDGF−Ｒ又はその変異体の発現構築物で
トランスフェクトした細胞。 - 【請求項９】下記の工程を含む、hPDGFアゴニスト又は
アンタゴニストとして機能する薬剤の能力を評価する方
法： （ａ）以下に示されるアミノ酸配列の１番から1074番で
表されるhPDGF−Ｒ又はその配列において一若しくは数
個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されかつhPDGF
−Ｒ活性を有する変異アミノ酸配列、をコードするDNA
配列を含む発現構築物でトランスフェクトした結果とし
てhPDGF−Ｒ又はその変異体を含むホ乳動物細胞を薬剤
と接触させる工程、及び （ｂ）非トランスフェクト細胞又は、既知の応答を与え
る薬剤と比較して、該細胞におけるPDGF誘導の応答量を
測定する工程。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US15141488A | 1988-02-02 | 1988-02-02 | |
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| Publication Number | Publication Date |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02472989A Expired - Fee Related JP3217339B2 (ja) | 1988-02-02 | 1989-02-02 | ヒトの血小板由来の成長因子受容体 |
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| DE68926888T2 (de) * | 1988-01-22 | 1997-01-09 | Zymogenetics Inc | Verfahren zur Herstellung von sekretierten Rezeptoranalogen |
| US6018026A (en) | 1988-01-22 | 2000-01-25 | Zymogenetics, Inc. | Biologically active dimerized and multimerized polypeptide fusions |
| US6110737A (en) | 1988-02-02 | 2000-08-29 | The Regents Of The University Of California | Human platelet-derived growth factor receptor, type A |
| US6372438B1 (en) | 1988-02-02 | 2002-04-16 | The Regents Of The University Of California | Human platelet-derived growth factor receptors |
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| CA2100559C (en) * | 1991-01-31 | 2007-05-22 | David Wolf | Domains of extracellular region of human platelet derived growth factor receptor polypeptides |
| US5780036A (en) * | 1991-08-26 | 1998-07-14 | The Scripps Research Institute | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepattis B virus |
| US6607727B1 (en) | 1991-08-26 | 2003-08-19 | The Scripps Research Institute | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitus B virus |
| RU2194760C2 (ru) * | 1991-12-02 | 2002-12-20 | Кор Терапьютикс, Инк. | Иммуноглобулиновый полипептид, его фрагмент, композиция, штамм гибридных культивируемых клеток, способ получения полипептида |
| WO1993011223A1 (en) * | 1991-12-02 | 1993-06-10 | Cor Therapeutics, Inc. | Methods for production of purified soluble type b and type a human platelet-derived growth factor receptor fragments |
| US5817310A (en) * | 1991-12-02 | 1998-10-06 | Cor Therapeutics, Inc. | Inhibitory immunoglobulin polypeptides to human PDGF beta receptor |
| US6235288B1 (en) | 1992-08-26 | 2001-05-22 | The Scripps Research Institute | Peptides for inducing cytotoxic T lymphocyte responses to hepatitis B virus |
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-
1989
- 1989-02-01 CA CA000589758A patent/CA1339356C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-02-01 AU AU28989/89A patent/AU607306B2/en not_active Ceased
- 1989-02-02 EP EP89301021A patent/EP0327369A3/en not_active Withdrawn
- 1989-02-02 JP JP02472989A patent/JP3217339B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Ｎａｔｕｒｅ，３２３（１９８６）ｐ．２２６−２３２ |
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|---|---|
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| CA1339356C (en) | 1997-08-26 |
| AU2898989A (en) | 1989-08-03 |
| JPH025865A (ja) | 1990-01-10 |
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