JPH06503966A - 生合成したｐｄｇｆアンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生合成したＰＤＧＦアンタゴニスト 光里立宜見 アテローム性動脈硬化性心臓血管障害は、筋肉性動脈の血管内膜の肥厚化によっ て特徴付けられており、しばしば最終的に死につながるような心筋梗塞や脳梗塞 を引き起こす主な原因である。肥厚化は大及び中程度の太さの動脈に発生し、脂 肪痕を含み、そしてその後に、著しい肥厚層によって、血管内腔の狭窄を生じ、 臨床症状を引き起こす、障害に先行する血管内膜の肥厚化または線維性プラーク は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）の線維状層及び過剰の脂質含有部分の下に存在する結 合組織マトリックスを含んでいる。脂質性の基礎構造が支持床として弱いので、 血管は高い動脈流速からくる圧迫によって不安定になっている。

さらに肥厚化した部分の血栓性物質の蓄積によって、血管内腔の完全な閉塞が発 生する。

アテローム性動脈硬化症の原因論は解明されていない。しかし、つぎのように仮 定されている。すなわち、内腔を取り巻く内皮層の変形、傷害及び／または破裂 とＳＭＣ層の過剰性がもたらす事象が、一連のプロセスを誘発するのである。傷 害を受けると、事象の一連の複雑な連鎖が、アテローム性プラークの基本的形態 を誘導するのである。内皮細胞は血管の内膜の剥離した部分を再生するために増 殖する。内膜内皮細胞の傷害は、循環している血小板を傷害部分に凝集させる原 因であると考えられている。唾小板は傷の露出部分に付着する。浮腫が傷の部分 に発生するが、おそらく血液と下部の組織層から浸出してきたマクロファージの 浸潤によるものである。マクロファージが増殖し、傷害部分で摂食した低密度リ ポプロティンを蓄積し、脂肪泡沫細胞に変化する。さらに傷害部分でのＳＭＣは 、静止状態から生合成状態へと変化して増殖し、そしてコラーゲン、エラスチン 、プロテオグリカンといったような細胞外マトリラスの材料を生産するようにな る。動脈の内腔での肥厚の増大はこのようにして発達していく。

血小板由来生長因子（ＰＤＧＦ）の高濃縮現象が傷の部分に認められ、遅れて線 維性プラークが出現する（Ｂａｒｒｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、８５：２８１０−２８１４．１ ９８８）　、この生長因子は種々の細胞の表面のレセプターに結合することが知 られている。そしてこれらの細胞の増殖を一時的にもたらすような細胞内の事象 の一連の連鎖を誘発する。

天然のＰＤＧＦは二つのポリペプチド鎖からなる二量体であり、１またはそれ以 上がグリコジル化されている０、二本の鎖は（以下Ａまたはα及びＢまたはβと 称する）Ｉｆ似しているが、同一ではない。それぞれの分子量は約１７．０００ −１８．０００ダルトン及び約１３，０００−１４，０００ダルトンである。イ ンビボでは、Ａ　ｔｌ　。

Ｂ鎖はより大きな前駆体として合成され、引き続いてアミノおよびカルボキシル 末端で切断される。成熟ヒトＡ鎖は１１０または１２５アミノ酸と種々のＮ結合 糖側鎖からなり、その長さとアミノ酸配列はその由来組織に依存している。充分 なプロセシングを受けたヒ）Ｂ鎖はＣ−５ｉｓ遺伝子にコードされており、１１ ２アミノ酸からなっている。この物質は、シミアン　ザルコーマウィルス（ＳＳ Ｖ）のｖ−ｓｉｓトランスフォーミング遺伝子のｐ２８ｓｉｓ　ＩＦ白産物と高 いホモロジーを有していることが確認されている（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ　ｅｔ　ａ ｌ、、　ＥＴｌｂｏ、　３　：９２Ｌ　１９８４）。

生物学的に活性なＰＤＧＦは、ＡＡまたはＢＢのホモダイマーとして存在し、そ れぞれ３５．０００ダルトン（３５ｋＤ）または３２ｋＤの分子量を有し、さら に分子量３４ｋＤのヘテロダイマーとしても存在する。ヒトＰＤＣＦダイマーは グリコジル化されており、生物学的に活性な３次元構造に翻訳後に変換されてい る。

この立体構造は、緩やかな非共役水素結合、疎水結合、静電気的結合及びシステ ィン残基のイオウ原子間の強い共役結合により成り立っている。ＰＤＧＦダイマ ーは、８個のＳＳ結合を有しており、この結合は鎖同士（Ｉ相互の結合）と同− 鎖内（鎖内結合）の両方が存在する。コンポーネントであるモノメリック鎖にＡ ＡまたはＢＢを還元すると生物学的活性が消失する。

細胞のタイプの変化によってＰＤＧＦの異なったグイメリックの形Ｍを誘導する ことが知られている。実際に、多数の細胞がプラーク形成に関わっており、ＰＤ （：、Ｆの種々の形態の物を分泌している。例えば内膜内皮細胞での初めの傷の 部分に凝集する血小板はＰＤＣ；ＦのＡＢを分泌しており、マクロファージはＰ ＤＧＦのＢＢを生産しており、ＳＭＣと内皮細胞はＰＤＧＦのＡＡを生産してい る。

血小板由来の生長因子はアテローム性動脈硬化症の原因物質であることが仮説と して考えられてきた（以下の文献を参照、Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ、 、Ｊ、ｃｅ目、Ｂｉｏｌ、　６９：１９６−２０３．１９７６、Ｆｒｉｅｄｗａ ｎｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、６０：１１９１−１２０１） 　、遊離されたＰＤＧＦは、化学走化性的に働いて傷害の部位に線維芽細胞、モ ノサイト、ダリア細胞、平滑筋細胞を遊走させて動員することができる。さらに 遊離したＰＤ（１，Ｆはこれらの細胞に対してＤＮＡ合成を促進するマイト−ジ エンとして作用し、これらの細胞の分裂増殖を促進させる。停止期のＳＭＣは非 胚性動脈壁で通常見出され、内皮細胞、マクロファージ、血小板によって生産さ れたＰＤＧＦにより合成性、分裂性が促進された活性状態に変わる。この活性状 態では、ＳＭＣそれ自身が、停止期のＳＭＣを活性化させるＰＤＧＦのＡＡを生 産するように変化している。

ＰＤＧＦの活性を阻害することにより、アテローム性プラークの形成を阻害する かあるいは減少させることができるという仮説が考えられている。このために多 数の異なる物質が、ＰＤＧＦの阻害剤またはアンタゴニスト（拮抗剤）として試 験に供されている。例えば、フェノフィブレート（Ｋｌｏｅｒ、　Ａｍ、　Ｊ、 　Ｍｅｄ。

８３（Ｂ）：３−８．１９８７）、レチノイン酸（Ｍｏｒｄａｎ＋　Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｒｅａ、、　４９：９０６−９０９．１９８９）はＰＤＧＦ依存性ＤＮＡ合 成の促進を阻害する。

抗Ｃ３，１モノクローナル抗体（Ｋａｗａｈａｒａ　ａｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈ ｅｒａ、　Ｂｉ。

ｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ＋＊ｍｕｎ、、　１４７　：８３９−８４５．１９ ８７）および５−メチル−７−ジエチルアミノ−Ｓ−トリアゾール（１，５−ａ ）ピリミジン（Ｏｈｎｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｌｉｆｅ　Ｓａｔ、、３１：２ ５９５−２６０２．１９８３．；　Ｔｉｅｌｌ　ｅｔａｌ、、　Ａｒｔｅｒｙ、 １２：３３−５０．１９８３）はＰＤＧＦの拮抗剤である。インターフェロンは 、線維芽細胞のＰＤＧＦ誘導蛋白質合成を阻害して（Ｚａｇａｒｉ　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｔｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、１５ ０：１２０７−１２１２．１９８８）、線維芽細胞に対するＰＤＧＦのマイト− ジエン作用を阻害する（Ｈｏｓａｎｇ、　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、 　４９４：３９６−４０４゜１９８８）。スラミンはＰＤＧＦに結合してその生 物活性を阻害する（Ｈｏｓａｎｇ、　Ｊ、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、＋　２ ９：２６５−２７３）　、さらにプロタＣｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、２６：２０５ −２２０．　１９８４）　。

本発明の目的はＰＤＧＦに対する感受性細胞上のレセプターへのＰＤＧＦの結合 を阻害し、そのレセプターに活性ＰＤＧＦが結合することによって誘発されて、 さらに引き続いておこる生物学的作用を阻害するところにある。さらに、本発明 の目的はＰＤＧＦの生物学的活性を抑制することにより、アテローム性の傷害と 線維状プラークの発生を抑制するところにある。他の目的としては、アテローム 性動脈硬化の進行を抑制及び／または回復させるところにある。更に本発明の他 の目的としては、動脈の傷や傷害の部位における平滑筋細胞の分裂増殖を抑制す るところにある。また、他の目的としては、中および大型の筋肉質動脈でのマク ロファージの遊走と増殖の防止にある。

又ユニ！ｈ 本発明は、ＰＤＧＦに関連の生物学的活性を有しないが、細胞上のＰＤＧＦレセ プターに対してはＰＤＧＦの生物学的に活性な形態に拮抗する作用を有している ポリペプチドまたはアンタゴニストを用いて、血小板由来の生長因子（ＦＤＣＦ ）の活性を拮抗的に抑制する方法を提供するものである。ポリペプチドは、ＰＤ ＧＦの結合に対して生物学的に応答する細胞上に存在し、細胞膜結合性レセプタ ーに対して天然型ＦＤＣＦが結合するような、ＰＤＧＦの生物学的に活性である 形態のＡｌが十分に複製されているアミノ酸配列の一部分を有しているものであ る０本発明ポリペプチドが、ＰＤＩＣＦレセプターに対する結合性を存すること によって、ＰＤＧＦがレセプターに結合することを阻害する。そしてＰＤＧＦの 結合により誘発される生物学活性のイニシェーションがこの方法によりブロック される。

本発明の幾つかの観点においては、ポリペプチドは配列表配列番号１と配列番号 ３に示したＰＤＧＦのＡ鎖アミノ酸配列の１２−１１０残基に対して少なくとも ７０％ホモロジーを有している。

本発明により提供されるポリペプチド拮抗剤を、生物学的に活性なＰＤＧＦの２ 量体を形成するために欠くことの出来ないスルフォヒドリル基の交差結合部位を 欠いている構造にする場合には、グリコジル化されていなくてもよいし、単量体 であっても差し支えない。発明のこの観点によれば、ポリペプチドは内皮型のＡ 鎖（配列番号１を参照）またはグリオマー型のＡ鎖（配列番号３を参照）のよう な全長型または省略型Ａｌｌであって、システィンフリーまたシスティンブロッ ク型とすることができる。あるいはまた、ポリペプチドは、ミューティン（ｍｕ ｔｅｉｎ）、アナログ、ＰＤＧＦのＡｌｌの省略型アナログであっても良い。

ポリペプチドのシスティン残基はブロックされていても良い。

例えばスルフォン化、ピリジルエチル化、カルボキシメチル化などを含む従来の 方法を例示することができる。

少なくともＰＤＧＦ特異的なレセプターに残存性のある特異的な親和性を存して いる天然型ＡＭのペプチド断片、アナログ、それらを含むミニ−ティンは、ＰＤ ＧＦ拮抗剤として有用である。これらのフラグメントのシスティン残基の一部ま たは全部をブロックするかＳＳ結合を構成しないアミノ酸に置き換えることによ り、単量体とすることができる。あるいはまた、これらのフラグメントはＰＤＧ Ｆの生物活性を有していない第２のポリペプチドとＳＳ結合させても良い、好ま しくは、フラグメントは、天然の内皮またはグリオマ一種のＰＤＧＦ　Ａ鎖の一 部分とホモロジーを有しており、そして特に好ましくはＰＤＧＦの（配列表配列 番号１または３参照）配列で、アミノ酸残基８０−１００番または１２−４１番 を含んでいる。本発明の一具体例としては、Ａ鎖のＣ末端部分を含むものをあげ ることができる。

本発明は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ並１ｉ　（Ｅ、　ｃｏ上団のような原核細胞 で発現させた場合に、上述したポリペプチドの一つを、十分に発現することので きるようなりＮＡを提供するものである。組換えＤＮＡは、原核細胞で実施可能 なプロモーター／オペレータ９７域を含むヌクレオチド配列および、本発明によ って提供されるポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を含んでいる 。さらに、このＤＮＡ配列を保有しており、発現する細胞を提供するものである 。

最後に、本発明は、ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を形質転換された 細胞を培養し、ＤＮＡを発現させ、そして細胞から合成されたポリペプチドを精 製するステップを含み、これらＰＤＧＦ拮抗物質であるポリペプチドを調製する 方法を提供するものである。

本発明に関するこれらおよび他の特徴は、以下にに示す説明およびクレームによ り明確化される。

皿至豆ユ 本発明、本発明と同じくそれらの種々の特徴に関する、上述した目的およびその 他の目的は、付属する図面を合わせて読むことにより、以下の説明から十分に理 解できるものであろう。

図１はＳＳ結合を持つ天然型ＰＤＧＦ二量体の概念図（図ＩＡ）と本発明の種々 の実例の概念図（図ＩＢ−図１０）比較である。

図２は、ＰＤＧＦの内皮細胞型Ａ鎖をコードする構造遺伝子、対応するアミノ酸 配列、制限酵素地図からなる本発明の組換えＤＮＡの概念図である。

図３はベクター由来ポリリンカー領域、ＰＤＧＦのグリオマー型Ａｔｊｆをコー ドする構造遺伝子、対応するアミノ酸配列、制限酵素地図からなる本発明の組換 えＤＮＡの概念図である。

図４は、トリプトファンオペレーター／プロモーター領域、修飾ＬＥリーダーペ プチドをコードする構造遺伝子、ＬＥペプチドに対応するアミノ酸配列を示す組 換えＤＮＡを示す概念図である。このオペレーター／プロモーターリーダーＤＮ Ａは、Ｅ、ｃｏｌｉでの図１．２．３のＰＤＧＦ拮抗剤を発現させるために選択 される。

主ユ皇困豊星脱ユ ＰＤＣ，Ｆは、高い親和性をもつ特定の細胞表面のレセプターに結合して、生物 学的活性を発揮する。ＰＤＧＦ二量体がレセプターに結合すると、細胞内の事象 のカスケードの引き金がひかれる。この事象とは、レセプターが分布している細 胞の分裂や化学的遊走化やその他の挙動を、最終的にもたらすものである。２種 類のＰＤＧＦレセプターが知られている。「タイプＡ」レセプターはＡＢへテロ ダイマーと同様に、ＰＤＧＦのＡＡおよびＢＢホモダイマーと結合する。「タイ プＢ」レセプターはＢＢホモダイマーに高い親和性を有して結合し、ＡＢへテロ ダイマーに低い親和性で結合する。種々の公知のＰＤＧＦの特異性に対する感受 性を示す全ての細胞は、ＰＤＧＦレセプター（群）の１つまた両方及び／または 未だ認識されていないレセブターを含んでいる。例えば、包皮線維芽細胞はＡＡ 、ＢＢ、ＡＢ型のＰＤＧＦに反応し、タイプＡとタイプＢの両方のレセプターを もっている。ＳＭＣはＰＤＣＦのＡＡホモダイマー特異的で分裂性に応答するこ とから、タイプＡレセプターを有すると考えられている。しかし、タイプＡレセ プターは未だにＳＭＣからは単離されていない。

ＰＤＧＦの生物活性を示さないＰＤＧＦのＡ鎖でＳＭＣとその他のＰＤＧＦ感受 性細胞を処理すると、天然型ＰＤＧＦにより誘発される作用のカスケードを阻害 することが見出されている。このＰＤＧＦアンタゴニストはＰＤＣ；Ｆレセプタ ーに結合するが、ＰＤＧＦレセプターを有する細胞による生物学的反応を誘導す る細胞内事象を誘発しない、レセプターはＰＤＧＦアンタゴニストによって結合 されており、このため二量体ＰＤＧＦの活性型の結合から阻害されるかあるいは ブロックされるのである。そしてこのために、特徴的なＰＤＧＦの反応を開始さ せることができないのである。この観察は、インビボとインビトロでのＰＤＣＦ の作用を調節するためのものを許容する。Ａ鎖のアナログまたはフラグメントは レセプター結合性を持ち、さらにフラグメント／レセプターの相互作用の結合定 数に依存している阻害の容量に相当する抑制またはアンタゴニスト作用を持って いる。天然型のＡ鎖の単量体、幾つかの省略体、二量体は強く結合して強く活性 を阻害する。

図１は、天然型ＰＤＧＦ二量体の高度に概念化されたモデルと、本発明の幾つか の実例の２次構造を比較したものである。

図１−Ａの二量体は、鎖間の８組のＳＳ結合によって結合した２本の全長型の鎖 を描いたものである。しかし二量体の活性型ではこれらのＳＳ結合の幾つかは鎖 内の結合となっている０図１−Ｂに示すように、本発明のアンタゴニストのポリ ペプチドは、精製した天然型ＡＡまたはＡＢ型の二量体を分割させて、そして再 結合しないようにシスティン残基を還元し、ブロックして得られるＰＤＧＦの全 長型Ａ鎖であっても良い。さらにまた、全長型の単量体は、遺伝子組換えで生産 したものでも良い。

この場合システィン残基は合成後にブロックするか、類似のチャージを持ってい るセリンのようなＳを含まないアミノ酸に置き換えることもできる。アンタゴニ ストは、全長型Ａ鎖のフラグメントの形態にすることもできる（図ＩＣ）。さら に、全長型Ａ鎖を含む二量体の二量体型フラグメント（図ＩＤ）、あるいはＡま たはＢ鎖のフラグメントでＰＤＧＦの生物活性を示さない第２のポリペプチドと ＳＳ結合することによって、部分的にブロックされた単量体Ａ鎖（図ＩＥ−ＩＧ ）であっても良い。

現在では、ヒト血小板からＰＤＧＦを抽出するための多数の方法が、知られてい る（Ｈｅｌｄｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、　７６：３７２２−３７２６．１９７９；　Ａｎｔｏｎｔａｄｅ ｓ　ｅｔ　ａｌ、＋Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、７６：１８０９−１８１３．１９７９） 。しかし、実施のためには高コストである上に、これらの方法は、オリジナルの 出発材料の約５％程度しか回収できないため、通常では役に立たない。改良され た回収方法としては、Ａｎｔｏｎｉａｄｅｓの方法（米国特許第４，４７９．８ ９６号）およびＬｉｐｔｏｎらの方法（米国特許第４，３５０，６８７号）があ り、これに従って得ることができる。しかし回収はあくまでヒト血小板の生産性 に限定されている。さらにヒト血液由来の物質を治療に用いることは後天性免疫 不全症候群のような多数の疾患に感染するリスクを冒すことである。

発明のポリペプチドを得るためにより好ましい方法として、導入した組換えＤＮ Ａを発現させるだめの宿主細胞を取り扱うことが一般的である。ＰＤＧＦのよう な真核細胞性の蛍白質は、酵母のような真核細胞で生産されている（ＥＰ公開第 ０１７７９５７号）。しかし真核細胞は翻訳後の蛋白質を修飾する機能を有して いるために、得られた二量体の形態を還元し、さらに得られた単量体の物質の二 量体化をブロックすることがさらに必要となる。それにもかかわらず、本発明の 蛋白質アゴニストは、もしも必要であれば真核細胞で生産することができる。仮 に、真核細胞生産ＰＤＣＦ二量体の二量体化フラグメントがアンタゴニストとし て必要であれば、適当なプロテアーゼにより単離した二量体を切断することで入 手することができる。

原核細胞は、その蛋白質物質を翻訳後修飾するだめの細胞内機能を有していない 、さらに原核細胞は成長速度が速く、操作が簡単であり、培養コストが安いため 、本発明の阻害ポリペプチドの生産のために選択される宿主細胞として適してい る。原核細胞宿主から得られるＦＤＧＦモノマーはグリコジル化されないし、Ｐ ＤＧＦの生物活性に必要な二量体構造に折り畳まれない。

ＰＤＧＦや目的とするいくつかのアミノ酸配列をコードするＤＮＡのデザイン、 操作、組換えのための工程は、一般的に先行文献により良く知られており、その ためここでは詳細に記載はしない。目的の蛋白質をコードする遺伝子の同定と単 離の方法あるいはこのような遺伝子を構築する方法は、良く知られており開発さ れている。これらの方法は特許及び文献に記載されている（米国特許第４，４３ １，７３９号：　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　−虹より狙」ｖＭａｎｕ ａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ、１９８４．　ｅｔ　ｓｅｑ、、 Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔ。

ｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　％　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎ ｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ。

本出願に先行して出版）。一般には、この方法には、遺伝的コードに従う目的の ポリペプチドを特定するアミノ酸をコードする遺伝子材料を選択することも含ま れている。

典型的で且つ代表的で好ましい核酸およびアミノ酸配列がこの分野では知られて いる（Ｂｏｎｔｈｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、８５：１４９２−１４９６．１９８８；　Ｄｅｔｓｃｈｏ ｌｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ。

３２０：６９５−６９９．１９８６を参照）。例えば、少なくとも２つのヒト型 Ａｉｌが存在していることが知られている。一つば内皮細胞由来であり（配列表 配列番号１および図２の概念図を参照）、グリオマーからはより長いものが分離 されている（配列表配列番号３および図３の概念図を参照）。

これらをコードするＤＮＡ、ここに開示したものに加えて、ＰＤＧＦの種々のそ の他Ａ頷、その他活性なＰＤＧＦのＡｌｌフラグメント、ミューティン、アナロ グ体をコードするＤＮＡの構築は先行技術と文献によって実施できるし、さらに 公知の技術を用いて生産することが可能である。これらの技術は、種々の酵素類 の使用を含んでいる。ＤＮＡの配列特異的切断をする制限酵素であり、デオキシ リボ核酸配列をつなぐＤＮＡリガーゼ、新しい遺伝子材料の構成を触媒するポリ メラーゼ、単離するＰＤＧＦをコードする配列に対するプローブ、平滑末端ＤＮ Ａに突出末端を酵素的に付加するなどがあげられる。

ここに開示するポリペプチドをコードするＤＮＡを得るための一つの方法として 、従来の自動化したポリヌクレオチドシンセサイザー、適当な酵素を用いたライ ゲーションと従来方法による増幅により生産した合成オリゴヌクレオチドの結合 による方法が上げられる。例えば、重複し、１５塩基からなる相補ＤＮＡフラグ メントは、ライゲーションの間、重合化を抑制するために非リン酸化して残った 末端部分を用いて、半自動化したリン酸アミダイト化学により合成できる０合成 りＮＡの一方の末端は、特定の制限エンドヌクレアーゼの作用する部位に対応し た「突出末端」で残っている。そしてもう一方の側の末端は、別の制限エンドヌ クレアーゼの作用部位に対応する末端として残っている。

さらにまた、この手法は完全に自動化することが可能である。

ＡｌｌまたはこれらのフラグメントやアナログをコードするＤＮＡは、長い１本 鎖フラグメント（５０−１００ヌクレオチド）を、例えばオリゴヌクレオチド　 シンセサイザー（バイオサーチ製）を用いて合成して調製される。そして引き続 いてフラグメントをライゲーションする。さらにまた、目的のポリペプチドをコ ードするＤＮＡは、逆転写酵素を用いて、そのポリペプチドに特異的な相補ＤＮ Ａ　（ｃＤＮＡ）を得るために、ｍＲＮＡから合成することができる。ＤＮＡを 入手するためのこれらの方法は、それ自体が公知であり、本発明の一部分を構成 していない。

ヌクレオチドの配列は、図２または図３の配列のアミノ酸配列の１またはそれ以 上を変更することにより、阻害性のあるアナログやミューティンをコードさせる こともできる０例えば、領内および鎖間の結合をはずすために、■またはそれ以 上のシスティン残基をセリン残基に置き換えることができる。モノマーと同じ長 さで変化させた、特定の鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列のいく つかの変更は、ＰＤ（：、Ｆ二量体のマイト−ジエン活性を阻害するために、Ｐ ＤＧＦレセプターニまだ結合可能である。異なった種類由来の生物学的に活性な 蛋白質を用いた実験によれば、アミノ酸配列の有意な変化は阻害活性の保持時間 を延長することができることを推測させる。さらに、全長型ＰＤＧＦのそれぞれ のフラグメントは、ＰＤＧＦ活性を阻害することを示しており（表１）、これら は、−例としてＣ末端をリジン残基で切断する酵素であるＥｎｄｏ　Ｌｙｓ　Ｃ を使用して酵素的に切断することにより調製したものである。従って、ここに開 示した手法は、ＰＤＧＦに拮抗する作用を示す、多数の異なる特異的な配列を生 産するために使用できることは明らかである。

このような構築には、自動化されたペプチド合成技術を使用することができる。

しかし、組換ＤＮＡの発現を行う宿主細胞で生産することが好ましい。特に好ま しい蛋白質生産の手法としては、成熟型の物質を生産するために、原核細胞で発 現させた融合蛋白質を、引き続いて分解する方法をあげることができる。図４に 示したようなリーダーポリペプチドは、Ｅ、　ｃｏｌｔでこのような構築物を発 現させるために使用することができる。もちろん、その他のリーダーも使用可能 であるし、もしも必要であれば、別の原核細胞型を発現運搬体として使用するこ ともできる。リーダーはメチオニン残基、あるいはＡ鎖の構築物のＮ末端とリー ダーペプチドの結合を保存し、リーダーのＣ末端を切断する試薬によって認識さ れる他の好ましい特徴的なアミノ酸またはアミノ酸配列をコードするものである 。この従来の手法により、部位特異的なエンドペプチダーゼの作用部位またはシ アノプロミドによるメチオニン残基の作用する適当な切断部位が調製される。図 ４にはこのようなメチオニン残基が２６０−２６２番目のヌクレオチドにコード されていることをしめしている。

これらの合成したＰＤＧＦコードＤＮＡの発現は、ＤＮＡを含むベクターにより 原核細胞の形質転換によって達成される。

多数の有用な原核性宿主細胞は公知であり、最も好ましいＥ。

匹旦は入手可能である。その他の原核細胞としてはＢａｃｉｌｌｕｓをあげるこ とができる。さらに従来の形質導入方法は、先行技術により公知であり、本発明 の実施にあたり有用である。

プラスミドやバクテリオファージのような種々のベクターを形質導入に使用する ことができる。これらのベクターは、多様なプロモーター／オペレーター配列が 公知で、入手可能であり、さらに発現を行うために使用することのできる、その 他の調節ＤＮＡ配列を含んでいる。ベクターには多様なマーカー遺伝子を持たせ ることができる。このマーカー遺伝子は検出可能な、ベクターの組換えＤＮＡを 充分に取り込んだクローンのファミリーを特定するために使用することのできる ような表現型機能を形質導入細胞に対して充分に付与する。

このように、ＰＤＧＦのＡ鎖またはアナログまたはそれらのミューティンをコー ドし、融合蛋白質のような真核細胞の翻訳産物を細胞内で発現させ、保持するた めに原核細胞宿主に使用するタイプのリーダーペプチドを結合させたＤＮＡを含 むベクターにより、原核細胞宿主を形質転換させる。融合蛋白質は導入したＤＮ Ａから翻訳生産され、宿主細胞に蓄積される。ｈ皿中の貯蔵物は、インクルージ ヨンボディーのような蛋白質凝集体となる。融合蛋白質からＰＤＧＦアンタゴニ ストを得るためには、公知の精製方法により、ハーベストした宿主細胞からイン クルージヨンボディーを精製する。この方法には、−例をあげると、宿主細胞の 酵素および界面活性剤による溶解も含んでいる。次いで、蛋白質分子の外来性リ ーダーペプチドを除去するために融合蛋白質を切断する０例えば、リーダーペプ チドの除去は、Ａ鎖ポリペプチドに結合させたリーダーペプチドのメチオニン残 基にシアノブロマイド（ＣＮＢｒ）を作用させて分解することにより行うことが できる。もちろん、これらの先行技術を使用する場合は、多数のその他の切断部 位／切断剤の組み合わせを使用できる。放出された一本鎖またはフラグメントは 、ゲル濾過、ＣＭセルロースクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー （ＨＰＬＣ）のような手法を用いて単離することができる。

必要に応じて、単離したポリペプチドは一本鎖を保持させるか、あるいは一つの ＰＤＣＦＩ　（またはフラグメント）の８個（またはそれ以下）のシスティン残 基同士の分子内ＳＳ結合の形成および第２の鎖（またはフラグメント）のシステ ィン残基とのＳＳ結合の形成を阻害することによって、活性型である二量体化を ブッロクする。例えば、ピリジルエチル化（Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅｅｔ　ａｌ、、 　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｓ、、　２６２　：１２９４５−１２９５２．１９ ８７を参照）、スルフォン化（Ｈｏｐｐｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 、２８：　２９５６−２９６０．１９８９を参照）、カルボキシメチル化（Ｗｅ ｌｉｎｄｅｒ、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅａ、、ｉＺＬ：５４−５４）により ＳＳ結合形成をブロックし、ＦＤＣＦの二量体化を阻害する。自然発生的な二量 体化を起こさないような、あるいはＰＤＧＦレセプターに結合するが細胞の活性 化を起こさないようなＡ鎖の省略型アナログを使用する場合は、このステ７プは 必要としない。

さらにまた、宿主細胞をＰＤＧＦ　（またはそのフラグメント）のミューティン やアナログをコードする遺伝子で形質転換しても良い。この場合、ＰＤＧＦは、 二量体が容易に得ることができないか、あるいは全く得ることができないような システィン残基の数を減らしたものである。

ペプチドフラグメントもまた、Ｅｎｄｏ　Ｌｙｓ　ＣやＥｎｄｏ　Ａｒｇ　Ｃの ようなエンドペプチダーゼ用いて分解することにより、Ａ鎖から生産できる。レ セプター結合機能を有し、活性型ＰＤＧＦの結合ドメインの部分からなるフラグ メントは、ＰＤＧＦ活性を阻害する目的に使用できる。例えば、天然ＰＤＧＦＡ 鎖レセプターの１２−４１残基及び８０−１２０残基は有用性がある。このよう なペプチドフラグメントもまた、二量体化を抑えるために、ピリジルエチル化、 カルボキシメチル化、Ｓ−スルフォン化を行うことができる。

システィン残基の一部または全部をそのままに保持し、ブロックしないで残す場 合には、ポリペプチドは第二のポリペプチドとＳＳ結合させておく。この第二の ポリペプチドは、それが結合してもポリペプチドのＰＤＧＦレセプター結合能に 影響せず、そしてＰＤＧＦの生物活性を有していないようなものであればどのよ うなポリペプチドまたはそのフラグメントであっても良い。

アンタゴニストとしてそうやって調製したポリペプチドが作用するためには、こ れらのポリペプチドに、レセプターに結合するために必要な３次元構造をとらせ る必要がある。この構造は、比較的緩やかで、非共有水素結合、疎水性および荷 電結合、イオウ原子間の強い共有結合（ＳＳ結合）によってもっとも好ましい状 態となる。真核細胞は、少なくともＳＳ結合を含むことで翻訳後の修飾を行って いる（仮にシスティン残基が存在したと仮定した場合）ために、真核細胞で生産 されたポリペプチドは、ＰＤＧＦがレセプターに結合するための正しい３次元構 造を最も好ましいようにとる。

しかし原核細胞宿主で遺伝子組換え生産されるか、生化学的に合成されたこれら のアンタゴニストには、結合させるための構造をとらせるための処理をおこなわ なければならない。処理としては、疎水性および荷電結合と水素結合を生しさせ るために、単に生理学的な特性を有する溶液（生理食塩水またはバッファー）に 曝すことを含む、しかし、ＳＳ結合が必要な場合には、アンタゴニストを、スル フオヒドリル基を含むアミノ酸残基の酸化を促進させる、生理学的に両性の物質 に曝させなければならない。この機能を有する代表的な物質は、酸化と還元のい ずれもグルタチオンの存在である。一つの育用な方法は、グルタチオンの存在下 で、ｐＨ７−８の溶液中で酸化型と還元型を１：１０の比率としてアンタゴニス トを曝すことである。この方法の詳細は、出願中の発明　１９８８年２月１１日 出願済の出願番号１５５，０６６号、発明の名称「血小板由来のグロースファク ター（ＰＤＧＦ）とそれらのミューティンの生産」の詳細な説明に引用文献とと もに記載している。

すでにアンタゴニストが調製され、レセプター結合のために３次元構造をとるこ とができた場合、これらの物質は、細胞が有するＰＤＧＦレセプターのＰＤＧＦ 誘導生物活性の阻害能を試験する。一つの試験方法として、細胞のトリチウムチ ミジンの取り込みの試験を示す。この細胞はＰＤＧＦの存在下で、通常は分裂が 誘導されるが、有効なアンタゴニストと生物学的に活性なＰＤＧＦを同時に加え ておく。発明のアンタゴニストは、ＰＤＧＦレセプターに対して拮抗的に結合し 、そしてその結果ＤＮＡ合成を開始させないことによって、放射能活性の取り込 みを抑制または阻害する。ＰＤＧＦレセプターに拮抗的に結合できないか、ある いは細胞分裂を開始させないではこのようなレセプターに結合できないようなポ リペプチドは、ここに示すよ・うなアンタゴニストではない。このように、この サンプル試験は、発明の実施の有効性を容易にチェ・ツクするために使用可能で ある。

以下の実施例は本発明の好ましい態様を充分に説明したものであるが、本発明を いかなる方法に限定することを意味するものではない。次の開示する出発材料お よび試薬類の全ては先行技術により公知であり、市場より入手可能であるかある いは良く知られた方法でｉ＠調製能である。

Ｘ施■ ■、ポリペプチドの製造 ＰＤＧＦのＡＩＭモノマーは、本発明の関連出願である１９８８年２月１１日出 願の米国特許出願番号１５５．０６６号の記載、ここに示した引用文献、次の記 載のようにＥ、　ｃｏｌｉでの組換え法によって調製した。

ＰＤＧＦのｍ　ＲＮ　Ａからの逆転写または合成オリゴヌクレオチドの酵素的連 結のいずれかの方法によって調製したＰＤＣ；Ｆ鎖をコードする遺伝子ブロック は、ｐＵｃ８クローニングベクターにクローニングした。そして５０μｇ　／　 ｍ　ＩのＸ−ｇａｌ指示染色剤および５０μｇ　／　ｍ　ｌのアンピシリンを含 有するＬＢ寒天培地上に、充分なＥ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ８３株を植えつけた（Ｍ ｅｓｓｉｎｇ　ｅｔａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　９　： ３０９゜１９８１）。挿入のないｐＵＣ８プラスミドはＪＭ８３細胞の青いコロ ニーを形成し、一方、遺伝子の挿入のあるｐＵＣは白いコロニーを形成する。白 いコロニーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に釣り上げ、３７° Ｃの回転振盪式インキュベータで一晩培養した。

プラスミドＤＮＡはアルカリ溶解法（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　■匹ｎＬａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ、　ｐｐ、８８−９Ｌ　１９８２）によりこの培養液から調製した 。ＤＮＡは適当な酵素により限定分解し、ついでポリアクリルアミドゲル電気泳 動法（ＰＡＧＥ）により分析した。

全ての合成遺伝子はＳａｎｇｅｒによるジデオキシ　シーケンシング法（Ｊ、　 Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、＋　９４：４４１．１９７５）によって分析した。得られ た挿入遺伝子は、５％ゲル上のＰＡＧＥに従って、制限酵素分解によって単離し た。ゲルからのＤＮＡフラグメントの電気泳動終了後、フラグメントはｍ１３Ｒ Ｆ（複製型）ベクターにクローニングし、Ｌ匹ｌｉ　ＪＭＩＯＩ株を形質転換さ せ、Ｘ−ｇａｌ及びＩ　ＰＴＧを含むプレートに植えつけた。白いプラークを釣 り上げ、怒染細胞を２ＹＴ培地中で１晩培養した。Ｍ１３組換えファージをポリ エチレングリコールを用いた沈澱法により培養上清から単離した。シーケンシン グを行うために１本鎖ファージＤＮＡの鋳型をフェノール　クロロフォルム抽出 によって調製した。

正しいクローンを付加遺伝子を用いたアッセンブリーのために保持した。ＤＮＡ シーケンシングは、全てのアッセンブリーまたは修飾工程で行った。次の方法に 従って調製したＡ鎖をコードするＤＮＡを、図２及び３に示した。

遺伝子をｐＵＣクローニングベクターから得て、合成ＴＲＰプロモーター／オペ レーターと下流のＰＤＧＦ構造遺伝子と一緒にｐ　Ｂ　Ｒ３２２由来の発現ベク ターに挿入した。融合蛋白質を発現させ、インクルージヨンボディーを蓄積させ るために、この発現ベクターを充分量のＥ、　ｃｏｌｉ宿主にトランスフェクシ ョンした。

細胞をｐＨ８の２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡｉｌ衝液に再懸濁させ た（１０ｍ　１緩衝液当たり１ｇの細胞を）、リゾチームを最終濃度が０．１ｍ ｇ／ｍｌになるように添加した。この懸濁液を３０分間撹拌し、超音波処理後、 遠心分離を行った。得られた沈澱を再度１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（界面活 性剤）を含むｐＨ８の２５ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡＰｉ衝液に 懸濁させ、一時間攪拌した後、遠心分離を行った。得られた沈澱を、ｐＨ８の８ Ｍ尿素、２．５ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＤＴＴ緩 衝液に再懸濁させた。溶液を３０分間攪拌し、遠心分離を行い、上滑を回収した 。調製方法の残りの工程には、イオン交換クロマトグラフィーを使用した融合蛋 白質の精製、ＣＮＢｒによる切断、ゲル濾過、ＣＭセルロース、ＨＰＬＣによる ＰＤＧＦ鎖の精製などがふくまれる。

ＣＭナセルースカラム（細胞１ｇ当たり２．５ｍ　ｌの樹脂）をｐＨ６の６Ｍ尿 素、２．５ｍＭ　酢酸アンモニウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＤＴＴ緩衝 液（ＣＭカラム緩衝液）で平衡化した。８Ｍ尿素の上清をｐＨ６に調整した後、 カラムに負荷した。次いで負荷したカラムをＣＭカラム緩衝液で洗浄した。カラ ムに結合した蛋白質をＣＭカラム緩衝液のＯＯ，３Ｍ食塩グラシュエンドで溶出 した（樹脂１０ｍ１当たり３３３ｍ　ｌ　）。カラムのフラクションをレムリー の１５％還元−変成ゲルにより分析した。あきらかな融合蛋白質を含むフラクシ ョンをプールし、ｐＨ３の水に対して透析し、凍結乾燥した。

融合蛋白質は、一定の濃度で５％蟻酸溶液に再懸濁させた。

続いてＣＮＢｒを添加し、その後この溶液を室温で８−２４時間攪拌した。分解 後、反応溶液を０．ＩＮ酢酸により、Ｃ，Ｆ　−０５）リスアクリルを用いてゲ ル濾過を行った０次いで溶出液を凍結乾燥した。

分解物をｐＨ６の６Ｍ尿素、２．５ｍＭ　酢酸アンモニウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡ 、１０ｍＭ　ＤＴＴＩＩ衝液に２ｍｇ／ｍｌの濃度で再懸濁させた。ＣＭカラム （分解物１０ｍｇ当たり３ｍｌの樹脂）を０Ｍ緩衝液で平衡化した。分解物をカ ラムに負荷し、ＣＭカラム緩衝液で洗浄し、さらにＣＭカラム緩衝液のＯ−０， ３Ｍ食塩グラシュエンドで溶出した（樹脂１０ｍ　ｌ当たり３３３ｍ１）。

次いでＰＤＧＦ七ツマ−を含むことが確認されたフラクションをプールした。

七ツマ−をＣ１８カラム（Ｊ、Ｔ、　Ｂａｋｅｒ　Ｉｎｃ、、Ｐｈｉｌｉｐｓｂ ｕｒｇ、　ＮＪ）に負荷し、アセトニトリル／ＴＦＡグラジェントで溶出させた （２５−５５％　アセトニトリル　９０分以上）、フラクションをレムリーの１ ５％週元−変成ゲルにより分析した。ＰＤＧＦを含むフラクションを集め、アセ トニトリルをロータリーエバポレーターで除去した。その後七ツマ−を凍結乾燥 した。

２、二量体化の防止 単量体ＰＤＧＦのＡ鎖のシスティン残基を二量体化防止のためピリジルエチル化 した。二量体化あるいは酸化したＰＤＧＦのＡＡ型の精製物を、ｐＨ８，５の６ Ｍ尿素と２８ｍＭ　ＤＤＴを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、１ｍＭ　ＥＤＴ Ａ、１０ｍＭＤＴＴ緩衝液に最終濃度を約１ｍｇ／ｍｌになるように溶かして還 元を行った。試料を３７″Ｃで１時間インキュベートし、その後アルキル化する ため、４０Ｍの４−ビニルピリジン中で、室温で４５分間放置した。アルキル化 反応を、ｐ　Ｈ８，５の２ｍＭのＥＤＴＡを含む５０ｍＭの炭酸アンモニウム溶 液で希釈することにより停止させた。ピリジルエチル化ＰＤＣ，Ｆ　Ａモノマー をＨＰＬＣで精製した。

３、ペプチドフラグメントの調製 アルキル化したＰＤＧＦのＡモノマーのペプチドフラグメントをリジン特異的エ ンドプロテアーゼＥｎｄｏ　Ｌｙｓ−Ｃを用いて切断して調製した。ＰＤＧＦ単 量体の溶液（０，３ｍ　ｇ　）に対して、最終的にＩＭになるように尿素を添加 した。ｐＨを２ＭのＴｒｉｚｍａ塩基を添加して７．０に調整した。Ｅｎｄｏ　 Ｌｙｓ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ製）を１　／２０　（Ｗ／Ｗ）の比率で添加 した。その後３７゛Ｃで１晩インキユベーシヨンを行った。

得られたペプチドを逆相ＨＰＬＣで精製した。混合液を０．１％水性トリフロ酢 酸で平衡化したカラム（０，４ｘ２５ｃｍ、　Ｖｙｄａｃ２１４　ＴＯ５４）に 負荷した。カラムを、２２０ｎｍの吸光度が洗浄開始時の値になるまで同し溶媒 で洗浄した。次いでペプチドを０．１％水性トリフロロ酢酸を含むアセトニトリ ルの１５％から４２％の直線的グラジェントで、４０分に溶出させた。その時の 流速は０．７ｍｌ／分であった。フラクションは１分間でそれぞれ集めた。

溶出は２２０ｎｍのＬＩＶ吸収をモニターした。

フラクションを４Ｍ尿素を含む１３．５％ゲルを使用してＳＤＳ〜ポリアクリル アミドゲル電気泳動を行った。ゲルはクーマシーブルー及び／または銀染色を行 った。フラグメントは、引き続いて阻害試験に使用した。

４、阻害性の分析 ヒト包皮線維芽細胞を新生児包皮から樹立成育させた。ＮＩＨ／３Ｔ３！ＩＩ胞 をＳ、　Ａａｒｏｎｓｏｎ（ＭＣＩ）から入手した。細胞は、１０％ウシ胎児血 清を含むダルベツコ変法イーグル培地（Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ）で、３７°Ｃ１二酸化 炭素ｌＯ％空気９０％の条件で培養した。細胞をコンフルエントまで４８ウエル プレートで培養し、３−４日後に分析に使用した。異なる形態またはＰＤＧＦの フラグメントを培地に加え、１８時間後に１０ξｇのＰＤＧＦのＡＡ型型置量体 たはＢＢ型型置量体２ξＣｉ／ｍｌのトリチウムチミジンを添加下。細胞を２時 間インキュベーションし、４°Ｃで３回、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し 、そして５回、５％トリクロロ酢酸（Ｔ　ＣＡ）で洗浄した。ＴＣＡ不溶不溶合 物、ＩＮ　ＮａＯＨ１０，１％　ＳＤＳで溶解した。トリチウムチミジンの取り 込み量をベンクマン液体シンチレーションカウンターで測定した。

いくつかの代表的な結果を表１に示ｊ７た。

表１ 跋料（Ａ鎖）　ＬＵＬ　ゑ込ｊ１１υ目竪侭Ａ　天然型　１００１０ ０ｎ　ａａ　８０−１００　ＬＯＯｎＭＡ６　ａａ　１２−４１　＞２００ｎＭ Ａ４のフラグメントは、天然型のＡ鎖と同程度に分裂増殖の阻害を示すことが可 能であった。この結果、ＰＤＣ，Ｆレセプター結合部位は、天然のＡ頷のＣ末端 側の８０−１１０アミノ酸残基で特定される範囲に結合することが確認された。

しかしフラグメントＡ６もまた、少ない量で作用して分裂増殖を阻害するなんら かの活性を示しており、Ｎ末端の近傍の第２の結合ドメインが存在することをこ の結果は示している。

さらに、Ａ鎖の全長型アナログは、ＢＢダイマーの分裂増殖作用を阻害する機能 を有しており、ＢＢ二量体とＡＡ二量体は異なったＰＤＧＦレセプターに結合す るという事実を考慮すると、予想外の結果が得られている。この結果は、本発明 のＡｉｉ関連ポリペプチドもまたＢＢレセプターに結合することができることを 示している。

本発明は、その精神または必須な特徴から逸脱せずに、その他の特異的な方法で 実施することが可能である。そのため、本発明の詳細な説明としてすべてに関し て考慮するものであって、先立つ詳細な説明よりもむしろ、付属するクレームに よって説明された発明の範囲を限定するものではない、そしてそれゆえに、クレ ームと同等の意味とクレームの範囲からなるすべての変更は、それらを同等のも のとして包含するものである。

配列表 （１）一般情報 （ｉ）　出願人：パン　ロイ　エッチ、エル。

（ｉｉ）発明の名称：生合成ＰＤＧＦアンタゴニスト（ｉｉｉ）配列の数：６ （ｉｉ）分子の型二合成りＮＡ蓋白質 （ｘｉ）配列の記′Ｒ：配列番号Ｉ ＣＧＴ　ＴＡＡ　３４２ （２）配列番号２ （ｉ　ｉ）分子の型：蛋白質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号２ Ｓｉｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　人ｌａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　人１ａ　Ｖａｌ　 Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ｌ１ｅτｙ７　Ｇｌｕ工ｉ Ｉ！ｐＦ　ｆｉ、７ｚ　５＠ＨＧＬｒ＋　Ｖａｌ　Ａ！ｐ　ｐＨＯτｈｒ　Ｓａ ｒ　Ａｌａ　Ａｓｒ＋　Ｐｈｅ　Ｌｅｕｔｕ　ｔり　−υ τｈｒ　Ｓｉｒ　Ｓｉｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　 Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｖａ１Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａ ｌａ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐ ｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　に１ｕ（２）配列番号３ （ｉｔ）分子の型二合成りＮＡ、蛋白質（ｘｉ）配列の記ｉ！：配列番号３ （２）配列番号４ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１２５アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉ　ｉ）分子の型：蛋白質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号４ 工１ｅ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　 Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　ＡｓｎＴｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓ ｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｈ ｉｓ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｖａ１Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｖａ ｌ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ＾ｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ 　Ｌｙｓ　ＧｌｕＳｅｒ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａ３１）　Ｔｖｒ　Ａｒｇ 　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌ■ ｌｏｏ　１０５　１１０ （２）配列番号５ （ｉ　ｉ）分子の型：合成りＮＡ、蛋白質（ｘｉ）配列の記！！：配列番号５ （２）配列番号６ （ｉｉ）分子の型：蛋白質 （ｘｉ）配列の記載：配列番号６ Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　 Ａｓｐ　Ｈｌｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ＡｓｐＥ匹足ぶＬユ ＲｓａＩ ａｕ３Ａ Ｘｈｏ　工Ｘ ５ａｕ３人Ｈａｓエエエ Ｃｆｒ工 ｒｕＩ ＮＳｐＨ工 ！　−嘩 Ｕｎｄｅｃｓｃｏｒｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｓ　ｔ ｈａｔ＋ｏｆａｎ　Ａ　ｃｈａｉｎ　ｏｆ　ＰＤＧＦ。

會　５１ｇｎ１ｆｉｅｓ　辷ｈｅ　ｅｎｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　５ｔｒｕｃセｕｒａ ｌ　ｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　Ａ　ｃｈａｉｎ。

Ｅ区！田二二 Ｒ５ａ工 Ｓａｕ３人 ｆｒＸ １＋ Ｎ５ｐＨ工 ３６０　３７０　３Ｅ１５　３９５ Ｓａｕ３八 ＸｈｏＸ工 Ｕｎｄｅｃｓｃｏｒｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉａ　５ｅｑｕａｎｃａ　＝ｓ　ｔ ｈａセｏｆａｎ　Ａ　ｃｈａｉｎ　ｏｆ　ＰＤＧＦ。

宵　５１ｇｎ１ｆｉｅｓ　セｈａ　ｅｎｄ　ｏｅ　ｔｈｅ　５ｔｒｕｃセｕｒａ ｌ　ｇａｎｇｅｎｃｏｄｉｎｇセｈｅ八ｃｈａｉｎ。

Ｕｎｄｅへｓｃｏｒｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｓ 　ａｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ。

Ｅ区瓜田ＬＡ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年６月２１日曲

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．血小板由来の生長因子（ＰＤＧＦ）の活性に拮抗化する方法であって次のス テップからなる方法（ａ）細胞上のＰＤＧＦに特異的なレセプターに結合するよ うなポリペプチドであって、ＰＤＧＦのＡ鎖のアミノ酸配列の少なくとも一部分 が充分に複製されたアミノ酸配列からなるＰＤＧＦ活性のないポリペプチドを提 供し、（ｂ）上記細胞上の上記レセプターに結合するような上記ポリペプチドを 、上記の細胞に接触させ、上記ポリペプチドの上記レセプターへの結合が、天然 型のＰＤＧＦの結合を阻害させる。
2. ２．上記の提供されるステップが、少なくとも内皮細胞型のＰＤＧＦのＡ鎖の一 部分とホモローガスであるポリペプチドを提供することからなる、請求項１の方 法。
3. ３．上記の提供されるステップが、配列表配列番号１に示したアミノ酸配列から なるポリペプチドを提供することからなる、請求項２の方法。
4. ４．上記の提供されるステップが、少なくともグリオマー細胞型のＰＤＧＦのＡ 鎖の一部分とホモローガスであるポリペプチドを提供することからなる、請求項 １の方法。
5. ５．上記の提供されるステップが、配列表配列番号３に示したアミノ酸配列から なるポリペプチドを提供することからなる、請求項４の方法。
6. ６．上記の提供されるステップが、ＰＤＧＦのＡ鎖のＣ末端の一部分からなるポ リペプチドを提供することからなる、請求項１の方法。
7. ７．上記の提供されるステップが、配列表配列番号３に示したアミノ酸配列の１ ２番から１１０番目の残基と少なくとも７０％のホモロジーを有するポリペプチ ドを提供することからなる、請求項１の方法。
8. ８．上記の提供されるステップが、ＰＤＧＦのＡ鎖の省略型アナログを含むポリ ペプチドを提供することからなる、請求項１の方法。
9. ９．上記の提供されるステップが、ＰＤＧＦのＡ鎖の天然型のフラグメントを含 むポリペプチドを提供することからなる、請求項１の方法。
10. １０．上記の提供されるステップが、ＰＤＧＦのＡ鎖の１２−４１残基のアミノ 酸を含むポリペプチドのフラグメントを提供することからなる、請求項９の方法 。
11. １１．上記の提供されるステップが、配列表配列番号１または配列番号３に示す 配列の１２−４１残基のアミノ酸を含むポリペプチドのフラグメントを提供する ことからなる、請求項１０の方法。
12. １２．上記の提供されるステップが、ＰＤＧＦのＡ鎖の８０−１１０残基のアミ ノ酸を含むポリペプチドのフラグメントを提供することからなる、請求項９の方 法。
13. １３．上記の提供されるステップが、配列表配列番号１または配列番号３に示す 配列の８００−１１０残基のアミノ酸を含むポリペプチドのフラグメントを提供 することからなる、請求項１２の方法。
14. １４．上記の提供されるステップが、生物学的活性を有しない第２のポリペプチ ドに対してＳＳ結合したＰＤＧＦのＡ鎖の省略型アナログを提供することからな る、請求項８の方法。
15. １５．上記の提供されるステップが、生物学的活性を有しない第２のポリペプチ ドに対してＳＳ結合したＰＤＧＦのＡ鎖のフラグメントを提供することからなる 、請求項９の方法。
16. １６．上記の提供されるステップが、原核宿主細胞で組換えＤＮＡを発現させた 物質を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供することからなる、請求項 １の方法。
17. １７．上記の提供されるステップが、グリコシル化されていないポリペプチドを 提供することからなる、請求項１の方法。
18. １８．上記の提供されるステップが、複数のブロックされたシステイン残基を含 むアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供することからなる、請求項１の方法 。
19. １９．血小板由来の生長因子（ＰＤＧＦ）活性に拮抗し、そしてＰＤＧＦのＡ鎖 のアミノ酸配列の少なくとも一部分が充分に複製されたアミノ酸配列からなるポ リペプチドであって、前記ポリペプチドは、ＰＤＧＦの結合に生物学的に応答す る細胞上の天然型ＰＤＧＦのための細胞膜結合型レセプターに結合し、前記ポリ ペプチドの前記レセプターへの結合はＰＤＧＦ結合を阻害し、そしてＰＤＧＦ活 性をブロックするのに有効であるペプチド。
20. ２０．請求項１９のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
21. ２１．クレーム２０のＤＮＡ配列を保有し、発現する細胞。
22. ２２．次のステップからなる血小板由来の生長因子（ＰＤＧＦ）の活性に拮抗す るポリペプチドを調製するための方法。 （ａ）上記ポリペプチドを合成するため請求項２１の細胞を培養し、 （ｂ）上記の細胞から上記のポリペプチドを精製する。