KR20000023669A

KR20000023669A - 잠재형 ＴＧＦ-β의 활성화를 촉진하는 펩티드 및 ＴＧＦ-β 활성조절 화합물의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20000023669A
Application number: KR1019997000124A
Authority: KR
Inventors: 야마사끼모또우; 시바따겐지; 사또야스시
Original assignee: 히라타 다다시; 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤
Priority date: 1997-05-12
Filing date: 1999-01-09
Publication date: 2000-04-25
Also published as: EP0922710A1; US20030027218A1; EP0922710A4; AU736207B2; JP4104671B2; AU7236098A; CA2259956A1; CN1226898A; WO1998051704A1

Abstract

다음 화학식 (I) 로 나타내고 잠재 TGF-β 로부터 활성 TGF-β 의 방출을 촉진하는 활성 또는 잠재 TGF-β 의 세포막으로의 결합을 촉진하는 활성을 갖는 펩티드; 상기 활성을 분석하여 TGF-β 가 관여하는 질병을 예방 및 치료하는 화합물을 스크리닝하는 방법; 및 이렇게 수득한 화합물. 상술한 펩티드 및 화합물은 암, 당뇨병성 망막염, 죽상동맥경화증 등의 예방제 또는 치료제로서 유용하다. 화학식 (I) :R1-A-R2, 식중 R1 는 수소, 임의로 치환된 알카노일 등을 나타내고; R2 는 히드록시 또는 임의로 치환된 알콕시 또는 아미노를 나타내며; A 는 TGF-β전구체 서열의 부분 서열들 중에서 선택된 서열이다.

Description

잠재형 ＴＧＦ-β의 활성화를 촉진하는 펩티드 및 ＴＧＦ-β 활성조절 화합물의 스크리닝 방법 {PEPTIDES PROMOTING THE ACTIVATION OF LATENT TGF-BETA AND METHOD FOR SCREENING TGF-BETA ACTIVITY REGULATORS}

인간를 포함하는 포유류에는 TGF-β1, β2, β3 등의 TGF-β가 존재하고 있지만, 모두 불활성 LTGF-β 로서 분비되므로 [Robert, A.B. & Sporn, M.B., Peptide Growth Factors and Their Receptors, Handbook of Experimental Pharmacology, Part 1, SPRINGER-VERLAG, Berlin, p 419 ∼ 472, (1990)], 작용이 발현하기 위해서는 분비후의 활성화가 필요하다. LTGF-β 에는, TGF-β 에 레이턴시 어소시에이트 펩티드 (latency associated peptide) (이하, LAP 라 약칭함) 가 비공유 결합한 소분자량 잠재형 TGF-β (이하 SLTGF-β라 약칭함) 와 여기에 잠재 TGF-β 결합 단백질 (latent TGF-β binding protein, 이하 LTBP 라 약칭함) 이 LAP 와의 사이에서 SS 결합한 대분자량 잠재형 TGF-β (이후 LLTGF-β 라 약칭하기도 한다) 의 2 종류가 있는데, 대부분은 LLTGF-β 형으로 분비된다 [EMBO Journal, 10, 1091 (1991)]. TGF-β 와 LAP 는 시그널 펩티드를 갖는 동일한 단백질 분자 (TGF-β 전구체) 로서 생합성되며 그 아미노산 서열이 알려져 있다 [Nature, 316, 701 (1985)].

잠재형 TGF-β의 활성화에는 몇가지 프로테아제의 관여가 지적되고 있는데, 가장 잘 분석되어 있는 것이 플라스민이다. 즉, 플라스민이 LAP 를 한정분해함으로써 비공유 결합되어 있는 TGF-β가 유리된다 [Journal of Cell Biology, 110, 1361 (1990)]. 플라스민에 의한 활성화된 세포레벨에서의 분석에서, 플라스민에 의한 활성화는 세포막 표면에서 행해진다는 점 [Journal of Cell Biology, 109, 309 (1989)], 잠재형 TGF-β가 세포막에 결합되는 것이 활성화에 필요하다는 점 [Journal of Cell Biology, 121, 439 (1993), Journal of Cell Biology 120, 995 (1993), Journal of Cell Biology, 123, 1249 (1993)], 잠재형 TGF-β세포막에 대한 결합은 LAP 을 통해서라는 점 [Journal of Cell Biology, 123, 1249 (1993), Tohoku Journal of Experimental Medicine, 179, 23 (1996)] 이 명확히 되어 있다. 그러나 잠재형 TGF-β 세포막에 대한 결합성의 제어가 TGF-β의 활성제어에 어떻게 관련되어 있는지는 명확하지 않다.

혈관 평활근 세포에 대한 잠재형 TGF-β의 결합은 알려져 있지만, 혈관 내피 세포로는 결합하지 않는다고 되어 있다 [Journal of Cell Biology, 123, 1249 (1993)].

TGF-β는 세포증식의 억제, 세포분화의 촉진, 면역기능의 억제, 섬유아 세포의 주화성의 항진 등 다채로운 생리활성을 가지고 있다. TGF-β는 여러 가지 병태와 관련된다고 생각되고 있으며, TGF-β의 작용결핍이 관여된 것으로 당뇨병성 망막증 [Journal of Cell Biology, 109, 309 (1989), Archieves of Ophthalmology, 66, 366 (1961)], 죽(粥)형 동맥경화의 초기병변 [Nature Medicine, 1, 1067 (1995)] 을 들 수 있다. 또한, TGF-β 자신에는 골절, 심근경색, 허혈 재환류후의 심근장해, 뇌경색, 망막박리 등에 대한 치료효과가 기대되고 있다 [Journal of Cell Biology, 119, 1017 (1992)]. 또, TGF-β 는 여러 가지 암세포의 증식을 억제한다고 알려져 있으며 [Endocrinology, 128, 1981 (1991), Journal of Clin. Invest., 87 277 (1991), Cell Growth & Differentiation, 1, 549 (1990)], 항종양제로서도 기대된다 [Proceedings of the National Academy of Science U.S.A, 92, 4254, (1995)].

생체내에서 생성·분비된 잠재형 TGF-β 중 활성화되어 작용을 발휘하고 있는 것은 일부분이다. 이런 점에서, 생채내에서 잠재형 TGF-β 의 활성화 효율을 증가시킴으로써 TGF-β 의 작용증강이 달성되는 것으로 보인다. 따라서, 잠재형 TGF-β의 활성화를 촉진하는 화합물은, TGF-β의 작용결핍이 지적되고 있는 질환 또는 외래성 TGF-β 투여가 유효하다고 생각되는 질환, 즉 암, 당뇨병성 망막증, 죽상 동맥경화, 골절, 심근경색, 허혈 재환류후의 심근장해, 뇌경색, 망막박리 등의 치료약으로서 유효성이 기대된다.

또, 반대로 TGF-β의 작용항진으로 야기되는 기본적으로 세포외 매트릭스의 조성을 수반하는 각종 질환이 알려져 있고, TGF-β의 활성화를 억제하는 물질은 예를 들면 사구체 신장염, 당뇨병성 신장증, 이식신장거절, HIV 신장증, 특발성 폐섬유증, 자기면역성 폐섬유증, 간경변, (암 요법후에 자주 발생되는) 정맥협착성 간장해, 전신성 경화증, 켈로이드, 호산구 증가-근육통증후군, 혈행재건 수술후 재협착, 안내 (眼內) 섬유증, 류머티즘성 관절염, 비용 등의 각종 섬유증의 치료약으로서 유효성이 기대된다 [Border W.A. & Noble N.A., Transforming growth factor-β in tissue fibrosis, New Engl. J. Med., 331, 1286 (1994) 및 Border W.A & Rouslahti E., Transforming growth factor-β in disease : The dark side of tissue repair, Journal of Clinical Investigation, 90, 1 (1992)].

본 발명은 세포증식의 억제, 세포분화의 촉진, 면역기능의 억제, 섬유아 세포의 주화성의 항진 등 다채로운 생리활성을 가지고 있는 활성형 전환 성장 인자 (transforming growth factor) -β (이후 활성형 TGF-β 또는 단순히 TGF-β 라 약칭함) 로 통상적인 분비형인 잠재형 TGF-β에서 변환시키는 것을 촉진하고, 암, 골절, 심근경색, 허혈 재환류후의 심근장해, 뇌경색, 망막박리 등 TGF-β 의 작용결핍이 지적되고 있는 질환 및 외래성 TGF-β 투여가 유효하다고 생각되는 질환의 치료약으로서 유용한 신규 펩티드에 관한 것이다.

또, 본 발명은 잠재형 전환 성장 인자-β (이후 LTGF-β 라 약칭함) 세포에 대한 결합을 조절하는 화합물 또는 잠재형 TGF-β 로부터 활성형 TGF-β 의 유리를 조절하는 화합물의 선택방법에 관한 것으로, 상기 방법으로 선택된 TGF-β 가 관여된 질병을 치료 또는 예방하는 화합물에 관한 것이다.

도 1 은 돼지혈관의 평활근세포 (PSMC) 에 대한 활성형 TGF-β 의 결합도를 방사활성으로 측정한 결과이다. 「비클(Vehicle)」의 레인은 시험화합물을 함유하지 않은 용액을 첨가한 경우의 방사활성, 그밖의 레인은 각 시험화합물을 100 ㎍/㎖ 농도가 되도록 첨가한 경우의 방사활성을 각각 나타낸다.

도 2 는 소혈관 평활근세포 (BSMC) 에 대한 활성형 TGF-β 의 결합도를 방사활성으로 측정한 결과이다. 「비클」의 레인은 시험화합물을 함유하지 않은 용액을 첨가한 경우, 「무세포 (Cell free)」의 레인은 세포가 존재하지 않는 플레이트에 125Ⅰ-LLTGF-β 만 첨가한 경우, 그밖의 레인은 각 레인에 나타내는 시험화합물을 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가한 경우의 방사활성을 각각 나타낸다.

도 3 은 소 모세혈관 내피세포 (BCEC) 에 대한 활성형 TGF-β 의 유주 저해활성을 현미경하의 시야내로 유주되어 온 세포수로 측정한 결과이다.

「비클」의 레인은 시험화합물을 함유하지 않은 용액을 첨가한 경우, 그밖의 레인은 각 레인에 나타내는 시험화합물을 50 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가한 경우의 시야내의 세포수를 각각 나타낸다.

도 4 는 소 모세혈관 내피세포 (BCEC) 에 대한 활성형 TGF-β 의 유주 저해활성을 현미경하의 시야내로 유주(遊走)되어 온 세포수로 측정한 결과이다.

「비클」의 레인은 시험화합물을 함유하지 않은 용액을 첨가한 경우, 그밖의 레인은 각 레인에 나타내는 시험화합물을 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가한 경우의 시야내의 세포수를 각각 나타낸다.

도 5 는 소 모세혈관 내피세포 (BCEC) 에 대한 활성형 TGF-β 의 유주 저해활성을 현미경하의 시야내로 유주되어 온 세포수로 측정한 결과이다.

「비클」의 레인은 시험화합물을 함유하지 않은 용액을 첨가한 경우, 그밖의 레인은 각 레인에 나타내는 시험화합물을 함께 나타낸 농도가 되도록 첨가한 경우의 시야내의 세포수를 각각 나타낸다.

도 6 은 루시페라아제·어세이·시스템으로 활성화 TGF-β 양을 측정하였을 때의 실제 발광강도의 측정결과이다. 「STD」의 레인은 정상상태, 「비클」의 레인은 시험화합물을 함유하지 않은 용액을 첨가한 경우, 그밖의 레인은 각 레인에 나타내는 시험화합물을 함께 나타낸 농도가 되도록 첨가한 경우의 발광강도를 각각 나타낸다.

도 7 은 도 6 에서 나타낸 발광강도에서 환산하여 활성화 TGF-β 양을 구한 결과이다. 각 레인의 의미는 도 6 과 같다.

발명의 개시

본 발명에 의해, 잠재형 TGF-β 로부터 활성형 TGF-β 의 유리를 촉진하는 활성 또는 잠재형 TGF-β 세포막에 대한 결합을 촉진하는 활성을 갖는 펩티드 또는 그 약리적으로 허용되는 염이 제공된다. 하나의 태양으로는, 본 발명에 의해, 화학식Ⅰ

R¹-A-R²

(식중, R¹은 수소원자, 치환 또는 비치환된 알카노일, 치환 또는 비치환된 아로일, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴카르보닐, 치환 또는 비치환된 알콕시카르보닐, 치환 또는 비치환된 아릴옥시카르보닐, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴옥시카르보닐을 나타내고; R²는 히드록시, 치환 또는 비치환된 알콕시, 또는 치환 또는 비치환된 아미노를 나타내며; A 는 TGF-β전구체 서열의 부분서열에서 선택되고, 상기 서열 중 1 ∼ 5 의 아미노산잔기가 결실, 치환, 부가되어 있어도 되는 아미노산 서열을 나타내며; 서열 내의 N 말단 및 C 말단 아미노산 잔기를 포함한 아미노산 잔기에서 선택된 두 개의 아미노산 잔기에서, N 말단 아미노기 또는 측쇄의 아미노기 및 C 말단 카르복실기 또는 측쇄의 카르복실기는 CO-NH 로 표시되는 아미드 결합 또는 NH-CO 로 표시되는 역아미드 결합을 형성하거나, 또는 측쇄의 티올기가 디술피드 결합을 형성할 수 있다) 으로 나타나고, 또 잠재형 TGF-β 로부터 활성형 TGF-β 의 유리를 촉진하는 활성 또는 잠재형 TGF-β 세포막에 대한 결합을 촉진하는 활성을 갖는 펩티드 또는 그의 약리적으로 허용되는 염이 제공된다.

또 하나의 태양으로, 본 발명에 의해, A 가 인간 TGF-β1 전구체 서열의 아미노산 30 ∼ 60, 아미노산 142 ∼ 186 및 아미노산 269 ∼ 297 의 서열 및 인간 TGF-β1 서열과 정렬화하였을 때에 인간 TGF-β1 전구체 서열의 아미노산 30 ∼ 60, 아미노산 142 ∼ 186 및 아미노산 269 ∼ 297 의 서열에 상당하는 인간 TGF-β1 이외의 TGF-β 전구체 서열에서 선택된 아미노산 서열의 부분서열에서 선택되고, 이 서열 중 1 ∼ 5 의 아미노산잔기가 결실, 치환, 부가되어 있어도 되는 아미노산 서열이며, 또 잠재형 TGF-β 로부터 활성형 TGF-β 의 유리를 촉진하는 활성 또는 잠재형 TGF-β 세포막에 대한 결합을 촉진하는 활성을 갖는 화학식 (I) 로 나타낸 펩티드 또는 그의 약리적으로 허용되는 염이 제공된다.

또 하나의 태양으로, 본 발명에 의해, A 가 서열번호 1 ∼ 16 중 어느 하나의 아미노산 서열에서 선택되고, 이 서열 중 1 ∼ 5 의 아미노산잔기가 결실, 치환, 부가되어 있어도 되는 아미노산 서열이며, 잠재형 TGF-β 로부터 활성형 TGF-β 의 유리를 촉진하는 활성 또는 잠재형 TGF-β 세포막에 대한 결합을 촉진하는 활성을 갖는 화학식 (I) 로 나타낸 펩티드 또는 그의 약리적으로 허용되는 염이 제공된다.

또 하나의 태양으로, 본 발명에 의해, 잠재형 TGF-β 를 동물세포에 첨가한후 이 세포에 결합되는 잠재형 TGF-β 양을 측정하는 것; 잠재형 TGF-β 와 활성을 평가해야 할 화합물을 동물세포에 첨가한후 이 세포에 결합되는 잠재형 TGF-β 양을 측정하는 것; 상기 화합물의 첨가에 의한 동물세포에 결합되는 잠재형 TGF-β 양의 변화로부터 상기 화합물의 잠재형 TGF-β 세포에 대한 결합 저해활성 또는 촉진활성을 평가하는 것으로 이루어진 TGF-β 가 관여된 질병의 치료 또는 예방하기 위한 화합물을 선택하는 방법이 제공된다.

또 하나의 태양으로, 본 발명에 의해, 동물세포에 화학식Ⅰ 로 나타나는 펩티드 또는 그의 약리적으로 허용되는 염을 첨가한후 TGF-β 양을 측정하는 것; 평가해야 할 화합물 및 화학식Ⅰ 로 표시되는 펩티드 또는 그의 약리적으로 허용되는 염을 동물세포에 첨가한후 TGF-β 양을 측정하는 것; 상기 화합물의 첨가에 의한 TGF-β 양의 변화로부터 상기 화합물의 잠재형 TGF-β 의 TGF-β 로의 변환반응의 저해활성 또는 촉진활성을 평가하는 것으로 이루어진 TGF-β 가 관여된 질병의 치료 또는 예방하기 위한 화합물을 선택하는 방법이 제공된다.

또 하나의 태양으로, 본 발명에 의해, 상술한 두가지 방법 중 어느 한 방법으로 잠재형 TGF-β 세포에 대한 결합을 저해하는 활성 또는 촉진하는 활성 또는 잠재형 TGF-β 의 TGF-β 에 대한 전환반응을 저해하는 활성 또는 촉진하는 활성을 갖는 화합물이 선택되며, TGF-β 가 관여된 질병의 치료 또는 예방하기 위한 화합물 또는 그의 약리적으로 허용되는 염이 제공된다.

이하, 화학식Ⅰ 로 표시되는 펩티드를 화합물(Ⅰ) 이라고 한다.

화학식Ⅰ 의 각 기의 정의에 있어서, 알카노일로서는, 탄소수 1 ∼ 20 의 알카노일기, 예컨대 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 발레릴, 이소발레릴, 피발로일, 헥사노일, 헵타노일, 라우로일, 이코사노일 등을 들 수 있다.

아로일 및 아릴옥시카르보닐의 아릴 부분으로서는, 페닐, 나프틸 등을 들 수 있다.

헤테로아릴카르보닐 및 헤테로아릴옥시카르보닐의 헤테로아릴 부분은 푸릴, 티에닐, 피리딜, 피롤릴, 피라졸릴, 피리미디닐, 피라지닐, 인돌릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 퀴나졸리닐 등을 들 수 있다.

알콕시카르보닐 및 알콕시의 알킬 부분으로서는, 탄소수 1 ∼ 20 의 알킬기, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 데실, 도데실, 이코실 등을 들 수 있다.

치환 알카노일, 치환 알콕시카르보닐 및 치환 알콕시에서의 치환기로서는, 동일 또는 상이하게 치환수 1 ∼ 3 의 치환기, 예컨대 히드록시, 카르복실, 또한, 탄소수 3 ∼ 8 의 지환식 알킬기, 예컨대 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 치환 또는 비치환된 페닐, 플루오레닐 등을 들 수 있다. 치환 페닐의 치환기로서는, 동일 또는 상이하게 치환수 1 ∼ 3 의 알킬 치환기, 예컨대, 알콕시, 히드록시, 니트로, 술포, 시아노, 할로겐 등을 들 수 있고, 할로겐으로서는 불소, 염소, 브롬, 요오드의 각 원자를 들 수 있다. 치환 페닐의 치환기로서의 알킬 및 알콕시의 알킬 부분은 상기 알콕시카르보닐 및 알콕시의 알킬 부분과 같은 의미이다.

치환 아로일, 치환 아릴옥시카르보닐, 치환 헤테로아릴카르보닐 및 치환 헤테로아릴옥시카르보닐의 치환기는 동일 또는 상이하게 치환수 1 ∼ 3 이고, 상기 치환 페닐의 치환기와 같은 의미이다.

치환 아미노의 치환기로서는, 동일 또는 상이하게 치환수 1 ∼ 2 의 치환 또는 비치환된 알킬 또는 치환 또는 비치환된 아릴을 들 수 있다. 알킬은 치환기도 포함시켜 상기 알콕시 등의 알킬 부분과 같은 의미이다. 아릴기는 치환기도 포함시켜 상기 아로일 또는 아릴옥시카르보닐의 아릴부분과 같은 의미이다.

TGF-β 전구체 서열로서는, 어떠한 동물기원의 어떤 종류의 TGF-β 서열이어도 되고, 예컨대 인간 TGF-β1 (J05114) [Nature, 316, 701 (1985)] (서열번호 17), 인간 TGF-β2 (Y00083) [EMBO. J., 6, 3673 (1987)] (서열번호 18), 인간 TGF-β3 (J03241) [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 4715 (1988)] (서열번호 19), 생쥐(mouse) TGF-β1 (M13177) [J. Biol. Chem., 261, 4377 (1986)] (서열번호 20), 생쥐 TGF-β2 (X57413) [Mol. Endocrinol., 3, 1108 (1989)] (서열번호 21), 생쥐 TGF-β3 (M32745) [Mol. Endocrinol., 3, 1926 (1989)] (서열번호 22), 쥐 TGF-β1 (X52498) [Nucleic Acids Res., 18, 3059 (1990)] (서열번호 23), 쥐 TGF-β3 (U03491) [J. Biol. Chem., 270, 2722 (1995)] (서열번호 24), 소 TGF-β1 (M36271) [Mol. Endocrinol., 1, 693 (1987)] (서열번호 25), 돼지 TGF-β1 (Y00111) [Nucleic Acids Res., 15, 3187 (1987)] (서열번호 26), 돼지 TGF-β3 (X14150) [EMBO. J., 7, 3737 (1988)] (서열번호 27), 개 TGF-β1 (L34956) [Gene, 155, 307 (1995)] (서열번호 28), 양 TGF-β1 (X76916) [Gene, 150, 371 (1994)] (서열번호 29), 닭 TGF-β2 (X58071) [Mol. Endocrinol., 7, 175 (1991)] (서열번호 30), 닭 TGF-β3 (M31154) [Mol. Endocrinol., 2, 747 (1988)] (서열번호 31), 닭 TGF-β4 (M31160) [Mol. Endocrinol., 6, 989 (1992)] (서열번호 32), 원숭이 (아프리카 녹색 원숭이) TGF-β (M16658) [DNA, 6, 239 (1987)] (서열번호 33), 개구리 (Xenopus laevis) TGF-β5 (J05180) [J. Biol. Chem., 265, 1089 (1990)] (서열번호 34) 등을 들 수 있다. 또, TGF-β 전구체 서열명 다음의 괄호안에 쓴 숫자는 GenBank 의 승인번호 (Accession Number) 를 나타낸다.

A 는 TGF-β 전구체 서열의 부분서열에서 선택되고, 이 서열 중 1 ∼ 5 의 아미노산잔기가 결실, 치환, 부가되어 있어도 되는 아미노산 서열이면 특별한 제한은 없다. A 는 인간 TGF-β1 전구체 서열의 아미노산 30 ∼ 60, 아미노산 142 ∼ 186 및 아미노산 269 ∼ 297 의 서열 및 인간 TGF-β1 서열과 정렬화하였을 때에 인간 TGF-β1 전구체 서열의 아미노산 30 ∼ 60, 아미노산 142 ∼ 186 및 아미노산 269 ∼ 297 의 서열에 상당하는 인간 TGF-β1 이외의 TGF-β 전구체 서열에서 선택된 서열의 부분서열이고, 이 아미노산 서열 중 1 ∼ 5 의 아미노산잔기가 결실, 치환, 부가되어 있어도 되는 아미노산 서열인 것이 바람직하다.

특히 A 가 인간 TGF-β1 전구체 서열의 아미노산 30 ∼ 60, 아미노산 142 ∼ 186 및 아미노산 269 ∼ 297 의 서열 및 인간 TGF-β1 서열과 정렬화하였을 때에 인간 TGF-β1 전구체 서열의 아미노산 30 ∼ 60, 아미노산 142 ∼ 186 및 아미노산 269 ∼ 297 의 서열에 상당하는 인간 TGF-β1 이외의 TGF-β 전구체 서열에서 선택된 서열의 부분서열인 것이 바람직하다.

앞에 예시한 각종 동물기원의 각종 TGF-β 전구체를 인간 TGF-β1 전구체 서열과 정렬화한 것을 표 1a ∼ 표 1h 에 나타낸다. 서열의 전후에 나타낸 수치는 아미노산의 위치번호를 나타내고, 아미노산 서열 중의 "-" 는 공위 (空位) 의 아미노산 위치를 나타낸다.

인간 TGF-β1 전구체의 30 ∼ 60 번째, 142 ∼ 186 번째, 269 ∼ 297 번째의 아미노산 서열 (표 1 중 밑줄친 인간 TGF-β1 전구체의 아미노산 서열) 에 상당하는 부분은, 예컨대 인간 TGF-β2 전구체에서는 각각 21 ∼ 51 번째, 137 ∼ 188 번째, 291 ∼ 320 번째이고, 인간 TGF-β3 전구체에서는 각각 24 ∼ 54 번째, 139 ∼ 190 번째, 288 ∼ 318 번째이다. 이러한 정렬화는 바톤 (Barton) 과 스턴베르그 (Sternberg) 의 방법 [Journal of Molecular Biology, 198, 327 (1987)] 을 사용해서 실시할 수 있다.

또한, 화합물(Ⅰ) 중 바람직한 화합물로서는 A 가 서열번호 1 ∼ 16 의 서열로부터 선택되고, 이 서열중 1 ∼ 5 의 아미노산잔기가 결실, 치환, 부가되어 있어도 되는 아미노산 서열인 펩티드 또는 그 약리적으로 허용되는 염을 들 수 있다.특히, A 가 서열번호 1 ∼ 16 의 서열에서 선택된 아미노산 서열이 바람직하다.

서열중 1 ∼ 5 의 아미노산잔기가 결실, 치환, 부가되어 있어도 된다는 것은, 하나의 서열중의 임의 또한 단일 혹은 복수개의 위치에 있어서의 단일 또는 복수개의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 부가가 전체에서 1 ∼ 5 잔기인 것을 의미하고, 결실, 치환 또는 부가가 동시에 일어나도 되고, 치환 또는 부가되는 아미노산은 천연형과 비천연형에 관계없다.

부가로서는, 예컨대 서열의 양쪽말단에 시스테인, 호모시스테인 등, 티올기를 갖는 아미노산 혹은 유기잔기의 부가를 들 수 있다. 치환으로서는 예컨대 서열내에 존재하는 시스테인잔기의 세린 또는 알라닌잔기로의 치환 및 세린 또는 알라닌잔기의 시스테인잔기로의 치환을 들 수 있다. 또한, 서열중에 포함되는 2 개의 티올기 사이에서 디술피드결합을 형성하여 고리형화할 수도 있다. 또, N 말단 아미노기 또는 측쇄의 아미노기 및 C 말단 카르복실기 또는 측쇄의 카르복실기사이에서 고리화를 위해 CO-NH 로 표시되는 아미드결합 또는 NH-CO 로 표시되는 역아미드결합을 형성할 수도 있다.

천연형 아미노산으로서는 글리신, L-알라닌, L-트레오닌, L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-글루탐산, L-글루타민, L-발린, L-루신, L-세린, L-메티오닌, L-이소루신, L-페닐알라닌, L-티로신, L-리진, L-아르기닌, L-히스티딘, L-프롤린, L-시스테인, L-트립토판을 들 수 있다.

잠재형 TGF-β 란, TGF-β와 그 활성을 억제하는 LAP 로 이루어진 소분자량 잠재형 TGF-β(SLTGF-β) 또는 TGF-β와 그 활성을 억제하는 LAP 와 LTBP 로 이루어진 대분자량 잠재형 TGF-β(LLTGF-β) 를 나타낸다.

본 발명의 선택방법으로 선택되는 화합물 또는 화합물(Ⅰ) 의 약리적으로 허용되는 염으로서는 산부가염, 금속염, 유기염기 부가염 등을 들 수 있다. 산부가염으로서는 염산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염 및 아세트산염, 말레인산염, 푸말산염, 타르타르산염, 시트르산염 등의 유기산염을 들 수 있다. 금속염으로서는 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리금속염, 마그네슘염, 칼슘염 등의 알칼리토금속염 및 알루미늄염, 아연염 등을 들 수 있다. 유기염기 부가염으로서는 메틸아민, 에틸아민, 아닐린 등의 일급아민, 디메틸아민, 디에틸아민, 피롤리딘, 피페리딘, 모르폴린, 피페라진 등의 이급아민 및 트리메틸아민, 트리에틸아민, N,N-디메틸아닐린, 피리딘 등의 삼급아민 등으로 형성되는 염 및 암모늄염 등을 들 수 있다.

이하, 본 명세서중에서 사용되는 아미노산 및 그 보호기에 관한 약호를 설명한다.

아미노산 및 그 보호기에 관한 약호는 생화학명명에 관한 IUPAC-IUB 위원회 (IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature) 의 권고 (European Journal of Biochemistry, 138, 9 (1984)] 에 따른다.

본 명세서에서 사용하는 다음 약호는 특별히 제한이 없는 한 대응하는 하기 아미노산 및 보호기를 나타낸다.

Gly 또는 G ; 글리신

Ala 또는 A ; L-알라닌

Thr 또는 T ; L-트레오닌

Aap 또는 D ; L-아스파르트산

Asn 또는 N ; L-아스파라긴

Asx ; L-아스파르트산 또는 L-아스파라긴

Glu 또는 E ; L-글루탐산

Gln 또는 Q ; L-글루타민

Glx ; L-글루탐산 또는 L-글루타민

Val 또는 V ; L-발린

Leu 또는 L ; L-루신

Ser 또는 S ; L-세린

Met 또는 M ; L-메티오닌

Ile 또는 I ; L-이소루신

Phe 또는 F ; L-페닐알라닌

Tyr 또는 Y ; L-티로신

Lys 또는 K ; L-리진

Arg 또는 R ; L-아르기닌

His 또는 H ; L-히스티딘

Pro 또는 P ; L-프롤린

Cys 또는 C ; L-시스테인

Trp 또는 W ; L-트립토판

Fmoc ; 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐

t-Bu ; t-부틸

Trt ; 트리틸

Pmc ; 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐

Boc ; t-부틸옥시카르보닐

이하의 약호는 대응하는 하기 측쇄보호아미노산을 나타낸다.

Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH ; Nα-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-L-아스파르트산 β-t-부틸에스테르

Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH ; Nα-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-L-글루탐산 γ-t-부틸에스테르

Fmoc-Thr(t-Bu)-OH ; Nα-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-O-t-부틸-L-트레오닌

Fmoc-Ser(t-Bu)-OH ; Nα-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-O-t-부틸-L-세린

Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH ; Nα-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-O-t-부틸-L-티로신

Fmoc-Lys(Boc)-OH ; Nα-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-Nε-t-부틸옥시카르보닐-L-리진

Fmoc-Asn(Trt)-OH ; Nα-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-Nγ-트리틸-L-아스파라긴

Fmoc-Gln(Trt)-OH ; Nα-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-Nδ-트리틸-L-글루타민

Fmoc-Arg(Pmc)-OH ; Nα-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-Ng-2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술포닐-L-아르기닌

Fmoc-His(Trt)-OH ; Nα-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-Nim-트리틸-L-글루타민

Fmoc-Cys(Trt)-OH ; Nα-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-S-트리틸-L-시스테인

Fmoc-Trp(Boc)-OH ; Nα-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐-Nind-t-부틸옥시카르보닐-L-트립토판

이하의 약호는 대응하는 하기 반응용매, 반응시약 등을 나타낸다.

PyBOP ; 벤조트리아졸-1-일옥시트리스피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트

HOBt ; N-히드록시벤조트리아졸

DCC ; 디시클로헥실카르보디이미드

NMM ; N-메틸모르폴린

DMF ; N,N-디메틸포름아미드

NMP ; N-메틸피롤리돈

TFA ; 트리플루오로아세트산

DTT ; 디티오트레이톨

HBTU ; 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트

DIPC ; N,N'-디이소프로필카르보디이미드

DIEA ; N,N-디이소프로필에틸아민

DCM ; 디클로로메탄

이어서, 화합물(Ⅰ) 의 제조법에 대하여 설명한다.

화합물(Ⅰ) 은 일반적인 액상 혹은 고상 펩티드 합성법 [Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis, Nobuo Izumiya, et al., Maruzen (1985)] 또는 이들을 적절히 조합함으로써 합성할 수 있다. 또한, 자동 펩티드 합성기를 사용할 수도 있다. 펩티드 합성기에 의한 펩티드의 합성은, 시미즈세이사꾸쇼 제조펩티드 합성기, Applied Biosystems Inc. U.S.A. (ABI사) 제조펩티드 합성기, Advanced ChemTech Inc. U.S.A. (ACT사) 제조펩티드 합성기 등의 시판되는 펩티드 합성기상에서 적당히 측쇄보호한 Nα-9-플루오레닐메틸옥시카르보닐아미노산 또는 Nα-t-부틸옥시카르보닐아미노산을 사용하며 각각의 합성프로그램에 따라 실시할 수 있다.

화합물(Ⅰ) 의 원료가 되는 보호아미노산 및 담체수지는 ABI사, 시마즈세이사꾸쇼, 고꾸산가가꾸(주), Nova Biochem 사, 와따나베가가꾸(주), ACT사 또는 펩티드겐뀨쇼(주) 에서 입수할 수 있다.

고리형화 반응은 액상법, 고상법 또는 이들의 조합에 따라 필요한 아미노산 잔기와 유기기를 모두 조합하고 나서 실시하는 경우와 펩티드사슬 신장의 도중에 실시하는 경우가 있다. 후자에 있어서는 고리형 구조의 완성후에, 다시 아미노산 잔기 또는 유기기를 신장시켜 화합물(Ⅰ) 을 완성한다. 또한, 화학식Ⅰ 중의 고리형 구조를 형성하는 디술피드결합, 아미드결합 또는 역아미드결합을 제조의 최종단계에서 완성하는 경우뿐만 아니라, 먼저 이들 결합이 형성된 후, 고리형 구조의 일부를 이루는 아미노산 잔기와 그 옆에 상당하는 아미노산 잔기 사이에서 통상적인 서열에 있어서의 아미드결합이 형성됨으로써 고리형 구조가 완성되어도 된다. 이하, 상세하게 고리형화 공정을 설명한다.

1. 디술피드결합에 의한 고리형화 공정

적당한 보호기에 의해 보호된 티올기를 갖는 아미노기잔기를 서열중의 두군데에 갖는 펩티드를 고상법, 액상법 또는 이들 조합으로 얻은 후에 티올보호기 이외의 보호기를 우선 제거하고, 계속해서 상기 티올보호기를 제거함으로써 얻을 수 있는 전구체 펩티드를 산화반응시키고, 유기화학반응공정에 있어서의 일반적인 정제방법을 거쳐 목적하는 디술피드결합을 포함한 고리형 펩티드를 제조할 수 있다.

1-1 액상법에 있어서의 디술피드결합에 따른 고리형화 공정

상기 전구체 펩티드를 반응에 불활성인 용매중 공기산화시키거나 산화제와 반응시킴으로써 디술피드결합을 갖는 고리형 펩티드를 제조할 수 있다. 반응은 0.5 ∼ 5000 μmol/ℓ, 바람직하게는 50 ∼ 500 μmol/ℓ 의 펩티드 농도로 실시한다. 용매는 pH 4 ∼ 9, 바람직하게는 pH 6 ∼ 8 로 조정한 50 mM ∼ 1 M 의 트리스(히드록시메틸)아미노메탄-염산 (Tris-HCl) 등의 완충액, 5 ∼ 50 ％ 산-수용액, 물, 또한 DMF, DMSO , 아세토니트릴, 테트라히드로푸란, 메탄올, 에탄올 등의 유기용매를 단독 혹은 혼합하여 사용한다. 산화제로서는 상기 전구체 펩티드에 대한 중량비 0.1 ∼ 1 배량의 페리시안화칼륨, 동중량비 0.5 ∼ 5 배량, 바람직하게는 등중량의 요오드, 용매량으로서 10 ∼ 50 ％ 의 DMSO 등이 사용된다. 반응은 통상 0 ∼ 40 ℃ 에서 1 시간 ∼ 1 주일에 종료한다. 본 산화반응시에 글루타티온을 첨가하면 수율의 향상이 도모되는 경우가 있고, 상기 전구체 펩티드에 대하여 중량비 0.5 ∼ 5 배량의 산화형 글루타티온과 그 1/2 량의 환원형 글루타티온을 공존시켜 반응시켜도 된다 [Journal of American Chemical Society, 103, 5867 (1981) ; 속의약품의 개발, 제14권, 펩티드 합성, 239페이지, 야지마하루아키 감수, 요꼬가와쇼뗑 (1991)]. 산화제로서 요오드를 사용하는 경우에는 반응종료후, 아연분말을 용액에서 요오드의 색이 없어질 때까지 첨가하고, 그대로 혹은 감압하에 농축한 후, 각종 크로마토그래피에 의해 정제한다. 산화제로서 페리시안화칼륨을 사용하는 경우에는 아세트산을 첨가하여 용액을 미(微)산성으로 한 후, 그대로 혹은 감압하에 농축한 후, 각종 크로마토그래피에 의해 정제해도 되며, 또한 Dowex 1X2 (AcO-) (다우·케미컬사) 등의 음이온 교환수지를 첨가하여 과잉의 페리시안화칼륨 (페리시안이온, 페로시안이온) 을 흡착제거한 후에 그대로 혹은 감압하에 농축한 후, 각종 크로마토그래피에 의해 정제해도 된다.

또한, 원하는 한군데의 티올기를 피리딜술페닐화 또는 2-니트로피리딜술페닐화해 두고, 다른 일측의 티올기를 선택적으로 제거시키면 동시에 한번에 고리화 반응을 진행시킬수도 있다 [International Journal of Peptide and Protein Research, 29, 162 (1987) 참조]. 고리화 반응에 사용되는 용매, 반응온도 및 반응시간 등은 대략 상기한 바와 동일하다. 그리고, 두군데의 티올기를 제거한 후, 피리딜술페닐화 시약 또는 2-니트로피리딜술페닐화 시약을 1 당량분 도입하여도 된다. 피리딜술페닐화 반응에는, 예컨대 2,2'-디티오디피리딘을 사용하며 1 ∼ 3 당량을 펩티드를 함유한 용매에 첨가하여 교반하면 된다. 2-니트로피리딜술페닐화도 이에 준하여 실시할 수 있다. 반응에 사용되는 용매, 반응온도 및 반응시간 등은 대략 상기한 바와 동일하다 [Peptide Chemistry, 1991, 125 (1992)].

1-2 고상법에 있어서의 디술피드결합에 의한 고리형화 공정

적당한 보호기에 의해 보호된 티올기를 갖는 아미노잔기를 서열중의 두군데에 갖는 펩티드를 고상법으로 신장시켜 수지에서 펩티드를 잘라내기 전에, 티올보호기를 선택적으로 제거하고, 산화반응시킴으로써 목적하는 고리형 펩티드부분을 제조할 수 있다. 그 후 수지에서 펩티드를 잘라내고, 다시 남은 보호기를 제거하면 목적하는 고리형 펩티드를 얻을 수 있다.

티올보호기에는 예를 들면 아세트아미드메틸 (Acm) 기 또는 트리틸기 (Trt) 를 사용할 수 있다. 수지상의 보호펩티드를 예를 들면 DMF, DCM 등의 적당한 용매 중, 요오드를 반응시키면 Acm 기나 Trt 기가 제거됨과 동시에 분자내 디술피드결합이 형성된다. 수지 50 ㎎ 에 대하여 0.5 ∼ 2 ㎖ 용매를 사용하며, 수지상의 상기 펩티드의 계산중량에 대한 중량비 0.5 ∼ 5 배량, 바람직하게는 등중량인 요오드와 반응시킨다. 반응은 통상 0 ∼ 40 ℃ 에서 행하며 1 시간 ∼ 1 주일에 종료한다. 반응종료후에는, 고상법의 통상적인 처리, 즉, 소량의 DMF, DCM 등의 용매로 수지를 세정하여 다음 반응에 이용할 수 있다.

또, 상기 1 - 1에서 서술한 한군데의 티올기를 피리딜술페닐화 또는 2-니트로피리딜술페닐화하는 방법을 고상법으로 행할 수도 있고, 반응조건은 대개 고리화 반응에 이용되는 용매, 반응온도 및 반응시간 등은 대개 상기한 바와 동일하다. 또한, 액상법과 동일한 방법으로 두군데의 티올기를 제거한 후, 피리딜술페닐화 시약 또는 2-니트로피리딜술페닐화 시약을 1 당량분 도입하여도 된다. 반응에는 예를 들면 2,2'-디티오디피리딘을 이용하며, 1 ∼ 3 당량을, 수지를 팽윤시킨 용매에 첨가하여 교반하면 된다. 2-니트로피리딜술페닐화도 동일하다. 반응에 사용되는 용매, 반응온도 및 반응시간 등은 대개 상기 고상반응에서의 고리화 반응과 동일하다.

2. 아미드결합 및 역아미드결합에 의한 고리형화 공정

적당한 보호기에 의해 보호된 아미노기를 갖는 아미노산 잔기 및 적당한 보호기에 의해 보호된 카르복실기를 갖는 아미노산 잔기를 서열중의 두군데에 갖는 측쇄, N 말단 및 C 말단의 보호된 펩티드를, 고상법, 액상법, 또는 이들 조합으로 제조한다. 그 후, 상기 아미노기 및 상기 카르복실시의 보호기를 선택적으로 제거함으로써 얻을 수 있는 펩티드를 분자내 축합반응시키고 유기화학 반응공정에서의 일반적인 정제방법을 거쳐 측쇄, N 말단 및 C 말단의 보호된 고리형 펩티드를 얻고, 다시 남은 보호기의 탈보호반응을 행함으로써 목적하는 펩티드를 제조할 수 있다. 또한, 고리형 펩티드부분구조를 얻은 후에 펩티드사슬을 신장시켜 목적하는 펩티드로 유도해도 된다.

2-1 액상법에 있어서의 아미드결합 및 역아미드결합에 의한 고리형화 공정

적당한 보호기에 의해 보호된 아미노기를 갖는 아미노산 잔기 및 적당한 보호기에 의해 보호된 카르복실기를 갖는 아미노산 잔기를 서열중의 두군데에 갖는 펩티드를 고상법으로 얻고, 수지에서 펩티드를 잘라내기 전에, 상기 아미노기 및 상기 카르복실기의 보호기를 선택적으로 제거함으로써 얻을 수 있는 유리의 아미노기 및 카르복실기를 축합반응시켜 목적하는 고리형 펩티드부분을 형성할 수 있다. 그 후, 수지에서 펩티드를 잘라냄과 동시에 다른 아미노산 잔기의 측쇄보호기를 제거하면 목적하는 고리형 펩티드를 제조할 수 있다.

아미노기의 보호기로서 4-메틸트리틸기를 사용하는 경우, 이 탈보호반응은, 아세트산/트리플루오로에탄올/DCM (1/2/7) 을 사용하여 행할 수 있다. 반응은 통상 0 ∼ 40 ℃ 에서 행하며 0.5 ∼ 6 시간에 종료한다. 반응종료후, 디에틸에테르 등을 첨가하여 펩티드를 침전시키고 용매를 제거하거나, 감압하에 용매를 제거한다. 필요에 따라, 이러한 조작을 포함한 유기화학 반응공정에서의 일반적인 정제방법을 이용할 수 있다.

아미노기의 보호기로서 알릴옥시카르보닐기를 사용하며 카르복실기의 보호기로서 알릴에스테르기를 사용하는 경우, 파라듐촉매의 존재하, 환원제를 반응시키면 한꺼번에 원하는 탈보호반응을 진행시킬 수 있다. 카르복실기만의 보호기에 알릴에스테르기를 사용하여도 된다. 파라듐촉매는 0 가의 균일계 촉매라면 어느 것이나 좋고, 테트라키스(트리페닐포스핀)파라듐 (0) 또는 아세트산파라듐 (II)-트리페닐포스핀 등을 예시할 수 있다. 첨가량은 상기 보호기에 대하여 0.01 ∼ 1 당량, 바람직하게는 0.1 ∼ 0.5 당량을 사용한다. 또한, 첨가제로서 상기 보호기에 대하여 1 당량부터 과잉량의 포름산, 포름산-트리에틸암모늄, 수소화트리부틸주석, 수소화트리페닐주석, 트리메틸히드로실란, 수소화붕소나트륨, 아세트산, 아세트산-NMM 등을 첨가한다. 용매로서는, 에테르, 테트라히드로푸란, 아세토니트릴, DMF, 클로로포름 등을 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 알릴옥시카르보닐기 또는 알릴에스테르기 1 mM 에 대하여 상기 시약과 용매 3 ∼ 10 ㎖ 를 첨가하고, 반응은 -20 ∼ 80 ℃, 바람직하게는 0 ∼ 30 ℃에서 행하여, 10 분 ∼ 6 시간에 종료한다. 반응종료후, 유기화학반응공정에서의 일반적인 정제방법을 이용할 수 있다.

얻은 펩티드의 유리의 아미노기와 카르복실기의 사이에서 분자간 아미드결합을 다음에 형성한다. 사용할 수 있는 고리형 아미드화 반응에는 여러 가지가 있는데, 대표적인 것을 이하에 든다. 각 반응에 공통적인 조건으로서, 반응용매는 DMF, NMP, 염화메틸렌, 클로로포름, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란 등을 단독 또는 혼합하여 사용한다. 펩티드의 농도는 0.5 ∼ 5000 μ㏖/ℓ, 바람직하게는 50 ∼ 500 μ㏖/ℓ 로 행한다. 반응은 통상 0 ∼ 40 ℃, 바람직하게는 4 ∼ 25 ℃ 에서 교반하며 통상 3 시간내에서 1 주일에 종료한다. 반응종료후, 유기화학반응공정에서의 일반적인 정제방법을 이용할 수 있다.

카르복실기에 대하여 1 ∼ 10 당량의 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC) 또는 수용성카르보디이미드 (WSC) 등의 카로보디이미드를 사용할 수 있다. 또한 카르보디이미드의 1.5 ∼ 2 당량의 NMM, DIEA, 또는 탄산수소나트륨을 첨가한다. 필요에 따라 카르보디이미드에 대하여 첨가제로서 등몰량의 HOBt 또는 HONSu 를 첨가해도 된다.

카르복실기에 대하여 1 ∼ 10 당량의 디페닐포스포릴아지드 (DPPA) 또는 디에틸포스포로시아니데이트 (DEPC) 를 이용할 수도 있다. 또한 카르보디이미드의 1.5 ∼ 2 당량의 NMM, DIEA 또는 탄산수소나트륨을 첨가한다.

카르복실기에 대하여 1 ∼ 10 당량, 바람직하게는 2 ∼ 5 당량의 PyBOP 와 등몰인 HOBt 또는 HBTU 와 등몰인 HOBt 를 사용할 수도 있다. 또한 PyBOP 또는 HBTU 의 1.5 ∼ 2 당량의 NMM, DIEA 또는 탄산수소나트륨을 첨가한다.

또, 일단 카르복실기를 활성화 에스테르로 유도한 후, 원하는 아미노기의 보호기를 선택적으로 탈리하고, 이어서 아미드결합을 형성해도 된다. 활성화 에스테르로서는 p-니트로페닐에스테르, 펜타플루오로페닐에스테르, N-옥시숙신산이미드에스테르 등을 들 수 있다. 활성화 에스테르의 도입방법은 여러 가지 있는데, 예를 들면 DCC 를 카르복실기에 대하여 1 ∼ 10 당량 사용하며 등몰인 p-니트로페놀, 펜타플루오로페놀 또는 HONSu 를 첨가하여 0 ∼ 5 ℃ 에서 1 시간 ∼ 1 일 교반한 후, 생성되는 디시클로헥실우레아 (DCUrea) 를 여과제거한 후, 유기화학 반응공정에서의 일반적인 정제방법을 이용하여 정제할 수 있다. 본 활성 에스테르 형성반응에 사용되는 용매, 반응온도, 반응시간 등은 상기 아미드형성반응과 동일하다.

2-2 고상법에 있어서의 아미드결합 및 역아미드결합에 의한 고리형화 공정

적당한 보호기에 의해 보호된 아미노기를 갖는 아미노산 잔기 또는 유기기 및 적당한 보호기에 의해 보호된 카르복실기를 갖는 아미노산 잔기 또는 유기기를 서열중의 두군데에 갖는 펩티드를 고상법으로 얻고, 수지에서 펩티드를 잘라내기 전에, 상기 아미노기 및 상기 카르복실기의 보호기를 선택적으로 제거함으로써 얻을 수 있는 유리의 아미노기 및 카르복실기를 축합반응시켜 목적하는 고리형 펩티드부분을 형성할 수 있다. 그 후, 수지에서 펩티드를 잘라냄과 동시에 다른 아미노산 잔기의 측쇄보호기를 제거하면, 목적하는 고리형 펩티드를 제조할 수 있다.

아미노기의 보호기로서 4-메틸트리틸기를 사용하는 경우, 상기 탈보호반응에는 수지 50 ㎎ 에 대하여 아세트산/트리플루오로에탄올/DCM (1/2/7) 을 0.5 ∼ 2 ㎖ 의 비율로 사용할 수 있다. 반응은 통상 0 ∼ 40 ℃ 에서 행하며 0.5 ∼ 6 시간에 종료한다. 반응종료후에는, 고상법의 통상적인 처리, 즉, 소량의 DMF 등의 용매로 수지를 세정하여 다음 반응에 사용할 수 있다.

아미노기의 보호기로서 알릴옥시카르보닐기를 사용하며 카르복실기의 보호기로서 알릴에스테르기를 사용하는 경우, 탈보호반응에는 통상 0.1 ∼ 0.2 M 의 테트라키스(트리페닐포스핀) 파라듐 (0), 5％ 아세트산, 2.5 ％ NMM을 함유한 클로로포름 등의 용매를 사용할 수 있다. 알릴옥시카르보닐기 및 알릴에스테르기 1mM 에 대하여 상기 클로로포름용액을 3 ∼ 10 ㎖ 첨가하고 반응은 통상 0 ∼ 40 ℃ 에서 행하며 0.5 ∼ 6 시간에 종료한다. 반응종료후에는, 고상법의 통상적인 처리, 즉, 소량의 DMF 등의 용매로 수지를 세정하여 다음 반응에 사용할 수 있다.

다음에 수지상의 계산상의 카르복실기량에 대하여 1 ∼ 10 당량, 바람직하게는 2 ∼ 5 당량의 PyBOP 또는 HBTU, PyBOP 또는 HBTU 와 등몰인 HOBt 및 PyBOP 또는 HBTU 의 1.5 ∼ 2 당량의 NMM 또는 DIEA를 함유한 DMF, DCM 또는 NMP 등의 유기용매의 용액을 수지 50 ㎎ 에 대하여 1 ㎖ 의 비율로 사용한다. 반응은 통상 0 ∼ 40 ℃, 바람직하게는 4 ∼ 25℃ 에서 교반하며 통상 3 시간에서 1 주일에 종료한다. 반응종료후에는, 고상법의 통상적인 처리, 즉, 소량의 DMF 등의 용매로 수지를 세정하여 다음 반응에 사용할 수 있다.

이와 같이 해서 얻은 화합물 (1) 은, C-4, C-8 또는 C-18 타입 등의 역상실리카겔칼럼을 이용한 고속액체 크로마토그래피 (이하, HPLC 라 함), 분배수지, 흡착수지, 이온교환수지, 실리카겔, 화학수식실리카겔, 역상실리카겔, 알루미나, 규조토, 또는 규산마그네슘 등을 이용한 겔여과 등의 칼럼크로마토그래피 또는 박층 크로마토그래피 등으로 정제할 수 있다.

화합물 (I) 의 약리적으로 허용되는 염을 취득할 때는 통상적인 방법에 따른다. 즉, 화합물 (I) 의 산부가염 또는 유기염기부가염은, 대응하는 산 또는 유기염기의 수용액에 화합물 (I) 을 용해하고 동결건조함으로써 얻을 수 있다. 또, 화합물 (I) 의 금속염은, 대응하는 금속이온을 함유하는 수용액에 화합물 (I) 을 용해하고 겔여과 또는 HPLC 로 정제함으로써 얻을 수 있다.

다음에 화합물 (I) 의 구체예를 표 2 에 나타낸다.

이어서, 잠재형 TGF-β 를 동물세포에 첨가하여 상기 세포에 결합되는 잠재형 TGF-β 양을 측정하는 것, 잠재형 TGF-β 와 활성을 평가해야 하는 화합물을 동물세포에 첨가하여 상기 세포에 결합되는 잠재형 TGF-β 양을 측정하는 것, 상기 화합물에 의한 동물세포에 결합되는 잠재형 TGF-β 양의 변화에서 상기 화합물의 잠재형 TGF-β 세포에 대한 결합 저해활성 또는 촉진활성을 평가하는 것으로 이루어진 TGF-β 가 관여된 질병의 치료 또는 예방하기 위한 화합물을 선택하는 방법에 대하여 서술한다.

본 발명에서 선택 대상이 되는 화합물은, 합성 화합물이든 천연 물질이든 특별한 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 천연 또는 합성의 펩티드 또는 천연 단백질을 효소 등으로 가수분해하여 얻은 펩티드 등을 평가할 수 있다.

잠재형 TGF-β 는, 각종 동물세포로부터 예를 들어 오카다 등의 방법 [Journal of Biochemistry, 106, 304 (1989)] 등으로 추출·정제한 것, 유전자 재조합법을 이용하여 제조한 것 [Journal of Biological Chemistry, 271, 29891 (1996)] 등을 이용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 동물세포로는 잠재형 TGF-β 를 결합할 수 있는 세포를 들 수 있다. 상기 세포로는, 예를 들어 혈소판, 혈관 평활근세포, 모세혈관 내피세포, 경동맥 내피세포, 섬유아세포, 상피세포, 마크로퍼지 등의 세포를 들 수 있다. 세포는 인간, 소, 돼지, 쥐 등의 동물에서 단리·정제한 것 또는 이들 세포에서 유래된 배양세포를 이용할 수 있다. 단리·정제 방법으로는, 예를 들어 오까다 등의 방법 [Journal of Biochemistry, 106, 304 (1989)] 등을 들 수 있다. 세포로의 잠재형 TGF-β 의 결합은, 예를 들어 세포를 배지에서 배양하고 잠재형 TGF-β 를 첨가하여 인큐베이트한 후, 세포를 세정하고 세포에 결합되어 있는 잠재형 TGF-β 를 측정함으로써 행할 수 있다.

잠재형 TGF-β 는, 예를 들어 클로라민 T 법 [Molecular & Cellular Biology, 2, 599 (1982)] 으로 125Ⅰ 표식한 것을 이용하는 것이 바람직하다. 따라서 세포에 결합된 잠재형 TGF-β 는 방사활성을 측정함으로써 구할 수 있다.

또한, 잠재형 TGF-β 가 세포에 결합되어 활성화되므로, 세포에 결합되는 잠재형 TGF-β 양의 측정은 활성형 TGF-β 양을 측정하여 행할 수도 있다. 활성형 TGF-β 의 정량은 어떠한 방법으로 측정해도 된다. 직접 항 TGF-β 항체를 사용한 효소면역측정방법 [Methods in Enzymology, 198, 303 (1991)] 또는 아베 등의 루시페라제·어세이·시스템 [Analytical Biochemistry, 216, 276 (1994)] 등으로 측정할 수 있다. 또, 혈관 내피세포의 유주도 [Journal of Cell Biology, 123, 1249 (1993)], 혈관 평활근세포의 증식 [Tohoku Journal of Experimental Medicine, 179, 23 (1996)], 각종 암세포의 증식저해 [Journal of Clinical Investigation, 87, 277 (1991), Endocrinology, 128, 1981 (1991)], 밍크 폐 상피세포의 증식저해 [Methods in Enzymology, 198, 317 (1991)] 등의 방법으로 측정할 수 있다.

활성을 평가해야 하는 화합물을 첨가하지 않은 때 세포에 결합되는 잠재형 TGF-β 양 또는 활성형 TGF-β 양과, 활성을 평가해야 하는 화합물을 첨가했을 때세포에 결합되는 잠재형 TGF-β 양 또는 활성형 TGF-β 양을 비교하여, 그 차이에서 상기 화합물이 TGF-β 가 관여된 질병의 치료 또는 예방하기 위한 화합물로서 유망성의 여부가 판단된다. 목적화합물의 선택은, 예를 들어 첨가농도 1 mM 로 평가해야 하는 화합물을 첨가하지 않은 경우의 활성형 TGF-β 양에 대하여, 첨가한 경우의 활성형 TGF-β 가 10 ％ 이상 증가 또는 감소된 것으로 보이는 화합물을 선택하는 것이 바람직하다.

또한, 동물세포에 화합물(Ⅰ) 로 표시되는 펩티드 또는 그 약리적으로 허용되는 염을 첨가하여 TGF-β 양을 측정하는 것, 평가해야 하는 화합물 및 화합물(Ⅰ) 로 표시되는 펩티드 또는 그 약리적으로 허용되는 염을 동물세포에 첨가하여 TGF-β 양을 측정하는 것, 상기 화합물에 의한 TGF-β 양의 변화에서 상기 화합물의 잠재형 TGF-β 의 TGF-β 에 대한 전환반응의 저해활성 또는 촉진활성을 평가하는 것으로 이루어진 TGF-β 가 관여된 질병의 치료 또는 예방을 위한 화합물을 선택하는 방법에 대하여 서술한다.

본 발명에서 선택 대상이 되는 화합물은 합성 화합물이든 천연 물질이든 특별한 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 천연 또는 합성의 펩티드 또는 천연 단백질을 효소 등으로 가수분해하여 얻은 펩티드 등을 평가할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 세포는, 세포 자체가 잠재형 TGF-β 를 분비하는 세포이다. 이 세포계에서는 시험계에 잠재형 TGF-β 를 첨가하지 않고 목적화합물을 선택할 수 있으므로 바람직하다. 잠재형 TGF-β 를 분비하는 세포로는, 예를 들어 혈관 내피세포, 혈관 평활근세포, 마크로퍼지 등 및 이것들에서 유래한 배양세포를 들 수 있다.

활성형 TGF-β 의 정량은 어떠한 방법으로 측정해도 되고, 예를 들어 상술한 정량 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에서 선택된 화합물은, 상술한 바에서 규정한 펩티드뿐만이 아니라 잠재형 TGF-β 로부터 활성형 TGF-β 의 유리를 촉진하는 활성 또는 잠재형 TGF-β 세포막에 대한 결합을 촉진하는 활성을 가지는 화합물 모두를 함유한다.

본 발명의 선택 방법에 의해 얻어지는 화합물 및 화합물(Ⅰ) 또는 약리적으로 허용되는 염은 암, 당뇨병성 망막증, 죽상 동맥경화, 골절, 심근경색, 허혈 재환류후의 심근장해, 뇌경색, 망막박리, 사구체 신장염, 당뇨변성 신장염, 이식신장거절, HIV 신장증, 특발성 폐섬유증, 자기면역성 폐섬유증, 간경변, (암요법 후에 자주 발생되는) 정맥협착성 간장해, 전신성 경화증, 켈로이드, 호산구 증가-근육통 증후군, 혈행 재건수술후 재협착, 안내섬유증, 류마티즘성 관절염, 비용 등의 치료 또는 예방제로서 사용할 수 있으며, 특히 각종 항섬유증제, 항종양제 또는 항동맥경화제로서 바람직하게 사용할 수 있다. 본 화합물은 그대로 또는 각종 투여형태로 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 선택 방법에 의해 얻어지는 화합물 및 화합물(Ⅰ) 또는 그 약리적으로 허용되는 염을 생리식염수, 글루코오스, 락토오스, 만니톨 등의 수용액에 용해시켜 주사액으로서 적당한 의약조성물로 할 수 있다. 또한, 예를 들어 본 발명의 선택 방법에 의해 얻어지는 화합물 및 화합물(Ⅰ) 또는 그 약리적으로 허용되는 염을 동결 건조시키고, 여기에 염화나트륨을 첨가함으로써 분말주사제를 제조할 수 있다. 본 의약조성물은, 필요에 따라 제제분야에서 주지된 첨가제, 예를 들어 제제상 허용되는 염을 함유할 수 있다.

또, 본 발명의 선택 방법에 의해 얻어지는 화합물 및 화합물(Ⅰ) 또는 그 약리적으로 허용되는 염과 적당한 부형제, 붕괴제, 결합제, 활택제 등을 혼합 성형하여 정제, 입제, 분제, 시럽제 등으로 함으로써 경구제로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 선택 방법에 의해 얻어지는 화합물 및 화합물(Ⅰ) 또는 그 약리적으로 허용되는 염과 상용되는 담체를, 혼합 형성하여 좌제로 하며 직장 투여할 수도 있다.

투여량은 투여 방법, 본 발명의 선택 방법에 의해 얻어지는 화합물 및 화합물(Ⅰ) 또는 그 약리적으로 허용되는 염의 종류, 환자의 연령, 증상 등에 따라서 다르며, 또한 투여 방법도 증상이나 투여량에 따라서 변할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 선택 방법에 의해 얻어지는 화합물 및 화합물(Ⅰ) 또는 그 약리적으로 허용되는 염은 1 일당 0.00001 ~ 100 ㎎/㎏, 바람직하게는 0.01 ~ 10 ㎎/㎏ 을 투여할 수 있다.

이하 실시예에 있어서, 화합물의 이화학적 성질은 다음의 방법으로 측정한다. 질량분석은 닛뽕덴시 JMS-SX102A 를 사용하며 FAB 법으로 행한다. 아미노산 분석은 Bidlingmeyer B. A. 등의 방법 [Journal of Chromatography, 336, 93 (1984)] 으로 행한다. 가수분해는 염산증기중 110 ℃ 에서 22 시간 수행하고, 가수분해물의 아미노산 조성은 Pico Tag 아미노산 분석계 (Waters 사 제조) 를 사용하여 분석한다.

실시예 1

화합물1(서열번호1)(H-Leu-Gln-Ser-Ser-Arg-His-Arg-Arg-Ala-Leu-Asp-Thr-Asn-Tyr-Ser-Phe-Ser-Ser-Thr-Glu-Lys-Asn-Cys-OH) 의 합성

Fmoc-Cys(Trt) 62.5 ㎛㏖ 이 결합된 담체수지 (Wang 레진) 123 ㎎ 을, ABI 사 자동합성기 model 430A 의 반응기에 넣고, ABI 사의 Fmoc 법에 의한 합성 프로그램에 따라 다음 조작을 행한다.

(a) 20 ％ 피페리딘-NMP 용액을 첨가하고 혼합물을 20 분간 교반하여 이 용액을 배출한다.

(b) 담체수지를 NMP 로 5 분간 세정하여 이 용액을 배출한다.

이렇게 하여 Fmoc 기를 제거한 Cys(Trt) 가 결합된 담체수지를 얻는다.

(c) Fmoc-Asn(Trt)-OH 250 μ㏖ (수지상의 아미노산에 대해 4 당량) 을 NMP 중 미리 DCC 및 HOBt 와 50 분간 교반한 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 60 분간교반하여 용액을 배출한다.

(d) 담체수지를 NMP 로 3 분간 세정한다. 이렇게 하여 Fmoc-Asn(Trt)-Cys(Trt) 가 담체상에 합성된다.

이어서, (a), (b) 의 탈보호, 세정공정을 행한 후, (c) 공정에서 Fmoc-Lys(Boc)-OH 를 사용하여 축합반응을 행하고, 계속해서 (d) 세정공정을 거쳐 Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Cys(Trt) 가 담체상에 합성된다. 이하, 공정 (c) 에 있어서, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Leu-OH 을 순차적으로 사용하고 (a) ∼ (d) 를 반복하여 보호 펩티드가 결합된 담체수지를 얻는다. 또한, (a) ∼ (b) 의 탈보호, 세정공정을 행한 후, 담체수지를 메탄올, 부틸에테르로 순차적으로 세정한 후, 감압하 12 시간 건조시켜 측쇄보호 펩티드가 결합된 담체수지 310.3 ㎎ 을 얻는다. 이것에 TFA (82.5 ％), 티오아니솔 (5 ％), 물 (5 ％), 에틸메틸술피드 (3 ％), 1,2-에탄디티올 (2.5 ％) 및 티오페놀 (2 ％) 로 이루어진 혼합용액 10 ㎖ 을 첨가하여 실온에서 8 시간 방치하고, 측쇄보호기를 제거함과 동시에 수지에서 펩티드를 잘라낸다. 수지를 여과분리한 후 얻은 용액을 2 ㎖ 정도까지 감압하 농축한 후에 에테르 약 10 ㎖ 를 첨가하고, 생성된 침전을 원심분리 및 데칸테이션에 의해 회수하여 조(粗)펩티드로서 145 ㎎ 을 취득한다. 이 조생성물 중 70 ㎎ 을 2 M 아세트산에 용해한 후, 역상칼럼 (시세이도 제조, CAPCELL PAK C18 30 ㎜I.D. × 25 ㎜) 을 사용한 HPLC 로 정제한다. 0.1 ％ TFA 수용액에, TFA 0.1 ％ 를 함유한 90 ％ 아세토니트릴 수용액을 첨가하는 직선 농도 구배법으로 용출하고 220 ㎚ 으로 검출하여 화합물 1 을 함유하는 분획을 얻는다. 이 분획을 동결건조하여 화합물 1 을 25.5 ㎎ 얻는다.

질량분석 [FABMS] ; m/z ＝ 2701.1 (M＋H^＋)

아미노산 분석 ; Asx 3.1 (3), Glx 2.1 (2), Ser 5.0 (5), His 1.0 (1), Arg 2.9 (3), Thr 2.0 (2), Ala 1.0 (1), Tyr 1.0 (1), Leu 1.9 (2), Phe 1.0 (1), Lys 1.1 (1), Cys 1.1 (1)

실시예 2

화합물2(서열번호2)(H-Pro-Val-Leu-Leu-Ser-Arg-Ala-Glu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Val-Glu-Gln-His-Val-Cys-OH) 의 합성

Fmoc-Cys(Trt), 100 μ㏖ 이 결합된 담체수지 (Wang 레진), 181.8 ㎎ 을 출발물질로 하고, 실시예 1 과 동일한 방법으로 Fmoc-Val-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OE, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-.Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, 와 Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, .Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Pro-OH 을 순차적으로 축합한 후에, 세정, 건조를 거쳐 측쇄보호 펩티드가 결합된 담체수지, 568.4 ㎎ 을 얻는다. 실시예 1 과 동일한 방법으로 측쇄보호기의 절단 및 수지로부터의 잘라내기를 행하여 조펩티드 320 ㎎ 을 취득하고, 역상칼럼 (시세이도 제조, CAPCELL PAK C18 30 ㎜ I.D. × 250 ㎜) 을 사용한 HPLC 로 정제하여 화합물 2 를 26.4 ㎎ 얻는다.

질량분석 [FABMS] ; m/z ＝ 2870.4 (M＋H⁺)

아미노산 분석 ;Glx 3.0 (3), Ser 1.1(1), His 1.0 (1), Arg 3.8 (4), Ala 1.1 (1), Pro 0.9 (1), Val 2.6 (3), Leu 7.3 (7), Lys 2.1 (2), Cys 1.2 (1)

실시예 3

화합물3(서열번호3)H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-Cys-OH 의 합성

Fmoc-Cys(Trt) 33 μ㏖ 이 결합된 담체수지 (Wang 레진) 60 ㎎ 을 시마즈세이사꾸쇼 제조 자동합성기 PSSM-8 의 반응기에 넣고, 합성 프로그램에 따라 다음 조작을 행한다. (a) 담체수지를 500 ㎕ DMF 로 3 분간 세정하여 이 용액을 배출한다. (b) 30 ％ 피페리딘- DMF 용액 500 ㎕ 를 첨가하여 혼합물을 4 분간 교반하여 이 용액을 배출하며, 이 조작을 1 회 더 반복한다.

(c) 담체수지를 500 ㎕ 의 DMF 로 1 분간 세정하여 이 용액을 배출하고, 이 조작을 5 회 반복한다.

(d) Fmoc-Gly-OH 330 μ㏖, PyBOP 330 μ㏖, HOBt 1 수화물 330 μ㏖ 및 NMM 495 μ㏖ 을 DMF 1155 ㎕ 중에서 3 분간 교반하여 얻은 용액을 수지에 첨가하고 혼합물을 30 분간 교반하여 용액을 배출한다.

(e) 담지수지를 500 ㎕ 의 DMF 로 1 분간 세정하여 이것을 5 회 반복한다. 이렇게 하여 Fmoc-Gly-Cys(Trt) 가 담체상에 합성된다.

이어서, (a) ∼ (c) 의 세정, 탈보호공정을 행한 후, (d) 공정에서 Fmoc-Arg(Pmc)-OH 를 사용하여 축합반응을 하고, 계속해서 (e) 세정공정을 거쳐 Fmoc-Arg(Pmc)-Gly-Cys(Trt) 가 담체상에 합성된다. 이하, 공정 (d) 에 있어서, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Leu-OH 을 순차적으로 사용하고 (a) ∼ (e) 을 반복하여 보호 펩티드가 결합된 담체수지를 얻는다. 또한 (a) ∼ (c) 의 세정, 탈보호공정을 행한 후, 담체수지를 500 ㎕ 의 DMF 로 1 분간 세정하고 이것을 5 회 반복한 후, 메탄올, 부틸에테르로 순차적으로 세정한 후, 감압하 12 시간 건조시켜 측쇄보호 펩티드가 결합된 담체수지를 얻는다. 실시예 1 과 동일한 방법으로 측쇄보호기의 절단 및 수지로부터의 잘라내기를 행하여 조펩티드 103.2 ㎎ 을 취득하고, 역상칼럼 (YMC 제조, YMC-Pack ODS-AM 30 ㎜ I.D. × 250 ㎜) 을 사용한 HPLC 로 정제하여 화합물 3 을 25.4 ㎎ 얻는다.

질량분석 [FABMS] ; m/z ＝ 2648.1 (M＋H^＋)

아미노산 분석 ;Asx 1.1(1), Glx 2.1 (2), Ser 1.9 (2), Gly 1.1 (1), Arg 2.5 (3), Thr 1.8 (2), Ala 1.1 (1), Val 0.9 (1), Met 1.0 (1), Ile 3.0 (3), Leu 2.1 (2), Lys 3.1 (3), Cys 1.2 (1)

실시예 4

화합물 4 (서열번호 4)(H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-OH) 의 합성

Fmoc-Gly 33 μ㏖ 이 결합된 담체수지 (Wang 레진) 60 ㎎ 을 출발물질로 하여 실시예 1 과 동일하게 하여, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OE, Fmoc-Leu-OH 을 순차적으로 축합한 후에, 세정, 건조를 거쳐 측쇄보호 펩티드가 결합된 담체수지를 얻는다. 실시예 1 과 동일한 방법으로 측쇄보호기의 절단 및 수지로부터의 잘라내기를 행하여 조펩티드 115.3 ㎎ 을 취득하고, 역상칼럼 (YMC 제조, YMC-Pack ODS-AM 30 ㎜ I.D. × 250 ㎜) 을 사용한 HPLC 로 정제하여 화합물 4 를 63.3 ㎎ 얻는다.

질량분석 [FABMS] ; m/z ＝ 2545.1 (M＋H^＋)

아미노산 분석 ;Asx 1.1 (1), Glx 2.1 (2), Ser 1.9 (2), Gly 1.1 (1), Arg 2.6 (3), Thr 1.9 (2), Ala 1.1 (1), Val 0. 9 (1), Met 0.9 (1), Ile 3.0 (3), Leu 2.1 (2), Lys 3.0 (3)

실시예 5

화합물5(서열번호5)(H-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-OH) 의 합성

Fmoc-Gly 25 μ㏖ 이 결합된 담체수지 (Wang 레진) 51.0 ㎎ 을 출발물질로 하고, ACT 사의 펩티드 합성기 ACT 357 을 사용하여 다음 조작을 행한다.

(a) 담체수지를 DMF 1 ㎖ 로 30 초간 세정하여 이 용액을 배출한다.

(b) 25 ％ 피페리딘-DMF 용액 1 ㎖ 를 첨가하고 혼합물을 2 분간 교반하여 이 용액을 배출하고, 다시 25 ％ 피페리딘-DMF 용액 1 ㎖ 를 첨가하여 혼합물을 10 분간 교반하여 이 용액을 배출한다.

(c) 담체수지를 DMF 로 12 초간 세정하여 이 용액을 배출하고, 이 조작을 7 회 반복한다.

이렇게 하여 Fmoc 기를 제거한 Gly 가 결합된 담체수지를 얻는다.

(d) DMF 125 ㎕, Fmoc-Arg(Pmc)-OH 와 HOBt 1 수화물을 각각 0.25 M 농도로 함유한 NMP 용액 500 ㎕, PyBOP 를 0.25 M 농도로 함유한 DMF 용액 500 ㎕ 및 NMM 을 2.0M 농도로 함유한 DMF 용액 125 ㎕ 를 수지에 첨가하고 60 분간 교반하여 용액을 배출한다.

(e) 반응용기를 500 ㎕ 의 DMF 로 세정한 후, 1 ㎖ DMF 로 30 초간 교반세정하고, 또 다시 500 ㎕ 의 DMF 로 세정한다. 이렇게 하여 Fmoc-Arg(Pmc)-Gly 가 담체상에 합성된다.

이어서, (a) ∼ (c) 의 세정, 탈보호공정을 행한 후, (d) 공정에서 Fmoc-Arg(Pmc)-OH 대신에 Fmoc-IIe-OH 를 함유한 용액을 사용하면서 축합반응을 행하고, 계속해서 (e) 세정공정을 거쳐 Fmoc-IIe-Arg(Pmc)-Gly 가 담체상에 합성된다. 이하, 공정 (d) 에 있어서, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OE, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmcc-Leu-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ile-OB, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH 를 순차적으로 축합한 후에, 세정, 건조를 거쳐 측쇄 보호 펩티드가 결합된 담체수지 (Wang 레진) 132.5 ㎎ 을 얻는다. 실시예 1 과 동일한 방법으로 측쇄 보호기의 절단 및 수지로부터의 잘라내기를 행하여 조펩티드 58.3 ㎎ 을 취득한다. 이것을 실시예 1 과 동일한 방법으로 역상칼럼 (YMC 제조, YMC-Pack ODS-AM 30㎜I.D. × 250 ㎜) 을 사용한 HPLC 로 정제하여 화합물 5 를 22.6 ㎎ 얻는다.

질량분석 [FABMS]; m/z=2029.2 (M+H⁺)

아미노산 분석; Asx 1.0 (1), Glx 2.0 (2), Gly 1.0 (1), Arg 3.0 (3), Thr 1.0 (1), Ala 1.1 (1), Val 0.9 (1), Met 1.1, Ile 2.9 (3), Leu 1.I (1), Lys 2.0 (2)

실시예 6

화합물 6 (서열번호6) (H-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-OH) 의 합성

Fmoc-Gly 25.0 μ㏖ 이 결합된 담체수지 (Wang 레진) 51.0 ㎎ 을 출발물질로 하고, 실시예 5 와 동일한 방법으로 Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-H, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH 를 순차적으로 축합한 후에, 세정, 건조를 거쳐 측쇄 보호 펩티드가 결합된 담체수지, 112.2 ㎎ 을 얻는다. 실시예 1 과 동일한 방법으로 측쇄 보호기의 절단 및 수지로부터의 잘라내기를 행하여 조펩티드 48.7 ㎎ 을 취득한다. 이것을 재차 1 ㎖ TFA 에 용해하고 50 ㎖ 에테르내에 적하한 후 생성된 침전을 여과 분리 회수하여 건조시켜 화합물 6 을 35.5 ㎎ 얻는다.

질량분석 [FABMS]; m/z=1439.0 (M+H⁺)

아미노산 분석; Glx 1.1 (1), Gly 1.0 (1), Arg 3.0 (3), Ala 1.1 (1), Val 0.8 (1), Ile 1.9 (2), Leu 1.0 (1), Lys 2.0 (2)

실시예 7

화합물7(서열번호7)(H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-OH) 의 합성

Fmoc-Ile, 25.0 μ㏖ 이 결합된 담체수지 (Wang 레진), 56.8 ㎎을 출발물질로 하고, 실시예 5 와 동일한 방법으로 Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH ,Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmac-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Leu-OH 를 순차적으로 축합한 후에, 세정, 건조를 거쳐 측쇄 보호 펩티드가 결합된 담체수지 280.9 ㎎ 을 얻는다. 실시예 1 과 동일한 방법으로 측쇄 보호기의 절단 및 수지로부터의 잘라내기를 행하여 조펩티드 123.1 ㎎ 을 취득한다. 이것을 실시예 1 과 동일한 방법으로 역상칼럼 (YMC 제조, YMC-Pack ODS-AM 30㎜I.D. × 250 ㎜) 을 사용한 HPLC 로 정제하여 화합물 7 을 26.7 ㎎ 얻는다.

질량분석 [FABMS]; m/z=2019.2 (M+H⁺)

아미노산 분석 ;Asx 1.1 (1), Glx 1.1(1), Ser 1.7 (2), Arg 2.2 (2), Thr 1.7 (2), Val 1.0 (1), Met 1.0 (1), Ile 2.1 (2), Leu 2.1 (2), Lys 3.1 (3)

실시예 8

화합물8(서열번호8) (H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-OH) 의 합성

Fmoc-Arg (Pmc) 25.0 μ㏖ 이 결합된 담체수지 (Wang 레진), 48.1 ㎎을 출발물질로 하고, 실시예 5 와 동일한 방법으로 Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Leu-OH 를 순차적으로 축합한 후에, 세정, 건조를 거쳐 측쇄 보호 펩티드가 결합된 담체수지 79.3 ㎎ 을 얻는다. 실시예 1 과 동일한 방법으로 측쇄 보호기의 절단 및 수지로부터의 잘라내기를 행하여 조펩티드 18.3 ㎎ 을 취득한다. 이것을 실시예 1 과 동일한 방법으로 역상칼럼 (YMC 제조, YMC-Pack ODS-AM 30㎜I.D. × 250 ㎜) 을 사용한 HPLC 로 정제하여 화합물 8 을 4.7 ㎎ 얻는다.

질량분석 [FABMS]; m/z=1621.0 (M+H⁺)

아미노산 분석 ;Asx 1.1 (1), Glx 1.1 (1), Ser 1.8 (2), Arg 1.1 (1), Thr 1.9 (2), Val 0.9 (1), Met 1.0 (1), Ile 1.0 (1), Leu 2.1 (2), Lys 2.0 (2)

실시예 9

화합물9 (서열번호 9) (H-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-OH) 의 합성

Fmoc-Val, 25.0 μ㏖ 이 결합된 담체수지 (Wang 레진), 48.1 ㎎ 을 출발물질로 하고, 실시예 5 와 동일한 방법으로 Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Leu-OH 를 순차적으로 축합한 후에, 세정, 건조를 거쳐 측쇄 보호 펩티드가 결합된 담체수지, 120.3 ㎎ 을 얻는다. 실시예 1 과 동일한 방법으로 측쇄 보호기의 절단 및 수지로부터의 잘라내기를 행하여 조펩티드 49.0 ㎎ 을 취득한다. 단, 잘라내기에 사용한 혼합용액은 90 ％ TFA, 5％ 1,2-에탄디티올, 5 ％ 티오아니솔로 이루어지며, 이것을 첨가한 후 방치시간은 2 시간으로 한다. 이것을 실시예 1 과 동일한 방법으로 역상칼럼 (YMC 제조, YMC-Pack ODS-AM 30㎜I.D. × 250 ㎜) 을 사용한 HPLC 로 정제하여 화합물 9 를 20.2 ㎎ 얻는다.

질량분석 [FABMS]; m/z=1336.7 (M+H⁺)

아미노산 분석: Asx 1.1 (1), Glx 1.1 (1), Ser 1.8 (2), Thr 1.8(2), Val 1.0 (1), Met 1.0 (1), Ile 1.0 (1), Leu 2.1 (2), Lys 1.0 (1)

실시예 10

화합물10(서열번호10)[H-cyclo(Cys-Leu-Ser-Thr-Ser-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-Cys)-OH) 의 합성

Fmoc-Cys(Trt), 16.5 μ㏖ 이 결합된 담체수지 (Wang 레진) 30 ㎎ 을 출발물질로 하고, 실시예 3 과 동일한 방법으로 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asp(Ot-Bu).-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH 를 순차 축합한 후에, 세정, 건조를 거쳐 측쇄 보호 펩티드가 결합된 담체수지를 얻는다. 단, 아미노산의 축합시간은 60 분간으로 한다. 실시예 1 과 동일한 방법으로 측쇄 보호기의 절단 및 수지로부터의 잘라내기를 행하여 조펩티드 54.5 ㎎ 을 취득한다. 이것을 실시예 1 과 동일한 방법으로 역상칼럼 (시세이도 제조, CAPCELL PAK C18 30㎜I.D. × 250 ㎜) 을 사용한 HPLC 로 정제하여 화합물 10 의 미(未)고리화체를 14.0 ㎎ 얻는다.

질량분석 [FABMS]; m/z=2751.7 (M+H⁺)

이것을 10 ㎖ DMSO 에 용해하고 암모니아수를 첨가하여 pH 7.1 로 하고, 실온에서 29 시간 교반한다. 용액을 동결 건조시킨 후, 재차 2 M 아세트산 수용액에 용해하고 동결 건조시켜 화합물 10 을 13.5 ㎎ 얻는다.

질량분석 [FABMS]; m/z=2749.5 (M+H+)

아미노산 분석;Asx 1.2 (1), Glx 2.2 (2), Ser 2.0 (2), Gly 1.1 (1), Arg 3.0 (3), Thr 2.0 (2), Ala 1.1 (1), Val 1. 0 (1), Met 1.1 (1), Ile 3.1 (3), Leu 2.2 (2), Lys 3.1 (3), Cys 1.8 (2)

실시예 11

화합물11(서열번호11)[H-Leu-Ser-Thr-cyclo(Cys-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg.-Ile-Glu-Ala-Ile-Arg-Gly-Cys)-OH] 의 합성

Fmoc-Cys(Trt) 16.5 μ㏖ 이 결합된 담체수지 (Wang 레진) 30 ㎎ 을 출발물질로 하고, 실시예 3 과 동일한 방법으로 Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asp(Ot-Bu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Leu-OH 를 순차 축합한 후에, 세정, 건조를 거쳐 측쇄 보호 펩티드가 결합된 담체수지를 얻는다. 단, 아미노산의 축합시간은 60 분간으로 한다. 실시예 1 과 동일한 방법으로 측쇄 보호기의 절단 및 수지로부터의 잘라내기를 행하여 조펩티드, 55.2 ㎎ 을 얻는다. 이것을 실시예 1 과 동일한 방법으로 역상칼럼 (시세이도 제조, CAPCELL PAK C18 30㎜I.D. × 250 ㎜) 을 사용한 HPLC 로 정제하여 화합물 11 의 미고리화체를 9.7 ㎎ 얻는다.

질량분석 [FABMS]; m/z=2664.5 (M+H⁺)

이것을 10 ㎖ DMSO 에 용해하고 암모니아수를 첨가하여 pH 7.3 로 하고, 실온에서 20 시간 교반한다. 용액을 동결 건조시킨 후, 재차 2 M 아세트산 수용액에 용해하여 동결 건조시켜 화합물 11을 9.9 ㎎ 얻는다.

질량분석 [FABMS]; m/z=2662.5 (M+H⁺)

아미노산 분석; Asx 0.9 (1), Glx 2.0 (2), Ser 0.9 (1), Gly 1.1 (1), Arg 3.0 (3) Thr 1.9 (2), Ala 1.1 (1) Val 0.9 (1), Ile 3.2 (3), Leu 2.1 (2), Lys 2.9 (3) Cys 1.5 (2)

실시예 12

화합물12(서열번호12)[H-cyclo(Cys-Val-Leu-Leu-Ser-Arg-Ala-Glu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Cys)-OH] 의 합성

H-Cys(Trt) 140 μ㏖ 이 결합된 담체수지 (Cl-Trt 레진) 250 ㎎ 을 출발물질로 하고, ACT 사의 펩티드 합성기 ACT 357 을 이용하여 다음 조작을 행한다.

(a) 담체 수지를 DMF 2.5 ㎖ 로 3 분간 세정하고, 이 용액을 배출하는 조작을 2 회 반복한다.

(b) DMF 250 ㎕, Fmoc-Lys(Boc)-OH 와 HOBt·1 수화물을 각각 0.5M 농도로 함유한 NMP 용액 1.4 ㎖, DIPC 를 0.5 M 농도로 함유한 NMP 용액 1.4 ㎖ 를 수지에 첨가하고 40 분간 교반하여 용액을 배출한다.

(c) DMF 2.5 ㎖ 로 1 분간 세정하고, 이 용액을 배출하는 조작을 2 회 반복한다.

(d) DMF 250 ㎕, Fmoc-Lys(Boc)-OH 와 HOBt·1 수화물을 각각 0.5M 농도로 함유한 NMP 용액 1.4 ㎖, HBTU 를 0.5 M 농도로 함유한 DMF 용액 1.4 ㎖, 및 DIEA 를 2.0M 농도로 함유한 용액 0.7 ㎖ 를 수지에 첨가하고 20 분간 교반하여 용액을 배출한다.

(e) (c) 와 동일한 조작을 행한다.

이렇게 하여 Fmoc-Lys(Boc)-Cys(Trt) 가 담체상에 합성된다. 이어서,

(f) 피페리딘을 25 ％ 농도로 함유한 DMF 용액 2.5㎖ 를 첨가하고 혼합물을 2 분간 교반하여 이 용액을 배출하고, 다시 같은 용액 2.5㎖ 를 첨가하고 혼합물을 10 분간 교반하여 이 용액을 배출한다.

(g) 담체수지를 2.5 ㎖ DMF 로 1 분간 세정하여 이 용액을 배출하며, 이 조작을 7 회 반복한다.

이렇게 하여 Fmoc 기를 제거한 Lys(Boc)-Cys(Trt) 이 결합된 담체수지를 얻는다.

이어서, (a)∼(e) 공정에서 Fmoc-Lys(Boc)-OH 대신에 Fmoc-Leu-OH를 함유한 용액을 이용하여 축합반응을 행하며, 계속해서 (f), (g) 의 탈보호, 세정공정을 거쳐 Leu-Lys(Boc)-Cys(Trt) 가 담체상에 합성된다. 이하, 공정 (a)∼(e) 에 있어서, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH 를 사용하여 각 공정을 반복하고, 세정, 건조를 거쳐 측쇄 보호 펩티드가 결합된 담체수지를 얻는다.

얻은 수지중 4/5 분량을 사용하고 실시예 1 과 동일한 방법으로 측쇄 보호기의 절단 및 수지로부터의 잘라내기를 행하여 조펩티드 137.2 ㎎ 을 취득한다. 100 ㎎ DTT 와 함께 2 ㎖ DMF 에 용해하고 50 ℃ 에서 1 시간 방치한 후, 실시예 1 과 동일한 방법으로 역상칼럼 (시세이도 제조, CAPCELL PAK C18 30㎜I.D. × 250 ㎜) 을 사용한 HPLC 로 정제하여 2 개의 SH 기가 유리된 상태의 펩티드를 12.2 ㎎ 얻는다.

질량분석 [FABMS]; m/z=2284.3 (M+H⁺)

이것을 5 ㎖ 2M 아세트산 수용액에 용해하고 물로 50 ㎖로 희석한 후, 희암모니아수를 첨가하여 pH 5.7 로 한다. 여기에 0.1M K3Fe(CN)6 수용액 0.5 ㎖ 를 첨가하고 실온에서 2.5 시간 교반한 후, 반응용액에 1 ㎖ 아세트산을 첨가한다. 실시예 1 과 동일한 방법으로 역상칼럼 (시세이도 제조, CAPCELL PAK C18 30㎜I.D. × 250 ㎜) 을 사용한 HPLC 로 정제하여 화합물 12 를 7.3 ㎎ 얻는다.

질량분석 [FABMS]; m/z=2282.5 (M+H+)

아미노산분석; Glx 1.0 (1), Ser 1.0 (1), Arg 3.9 (4), Ala 1.1 (1), Val 0.7 (1), Leu 7.2 (7), Lys 2.1 (2), Cys 2. 7 (2)

실시예 13

화합물13(서열번호13)[Biotinyl-cyclo(Cys-Val-Leu-Leu-Ser-Arg-Ala-Glu-Leu-Arg-Leu-Leu-Arg-Arc-.-Leu-Lys-Leu-Lys-Cys) -OH] 의 합성

실시예 12 에서 얻은 측쇄 보호 펩티드가 결합된 담체수지 중 1/5 양을 1 ㎖ DMF 로 세정한 후, 68.4 ㎎ D-비오틴 (나카라이테스크) 을 함유한 440 ㎕ DMF 현탁액 및 DIPC 를 0.5 M 농도로 함유한 NMP 용액을 첨가하여 실온에서 2 일간 교반한다. 용액을 배출한 후, 세정, 건조를 거쳐 N 분말이 비오틴화된 측쇄 보호 펩티드가 결합된 수지를 얻는다. 실시예 1 과 동일한 방법으로 측쇄 보호기의 절단 및 수지로부터의 잘라내기를 행하여 조펩티드 47.3 ㎎ 을 취득한다. 50 ㎎ DTT 와 함께 1 ㎖ DMF 에 용해하고 50 ℃ 에서 1 시간 방치한 후, 실시예 1 과 동일한 방법으로 역상칼럼 (시세이도 제조 CAPCELL PAK C18 30 ㎜ I.D. × 250 ㎜) 을 사용한 HPLC 로 정제하여 두 개의 SH 기가 유리된 상태의 펩티드를 11.8 ㎎ 얻는다.

질량분석 (FAB-MS) ; m/z = 2510.8 (M+H⁺)

이것을 5 ㎖ 2M 아세트산 수용액에 용해하고 물에서 50 ㎖ 로 희석한 후, 희암모니아 수용액을 첨가하여 pH 5.5 로 한다. 여기에 0.1 M K3Fe(CN)6 수용액 0.5 ㎖ 를 첨가하고 실온에서 3 시간 교반한 후, 반응용액에 1 ㎖ 아세트산을 첨가한다. 실시예 1 과 동일한 방법으로 역상칼럼 (시세이도 제조 CAPCELL PAK C18 30 ㎜ I.D. × 250 ㎜) 을 사용한 HPLC 로 정제하여 화합물 13 을 3.8 ㎎ 얻는다.

질량분석 (FABMS) ; m/z = 2508.8 (M+H⁺)

아미노산 분석 ;Glx 1.1 (1), Ser 1.0 (1), Arg 3.8 (4), Ala 1.1 (1), Val 0.8 (1), Leu 6.8 (7), Lys 2.0 (2), Cys 2. 1 (2)

실시예 14

화합물14(서열번호14)[H-Leu-Ser-Thr-Cys-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu-Leu-Val-Lys-Arg-Lys-Arg-OH] 의 합성

Fmoc-Arg(Pmc), 23 μmol 이 결합된 담체수지 (Wang 레진) 50 ㎎ 을 출발물질로 하고, 실시예 3 과 동일한 방법으로 Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OE, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH 을 순차적으로 축합한 후에, 세정, 건조를 거쳐 측쇄 보호 펩티드가 결합된 담체수지를 얻는다. 단, 아미노산의 축합 시간은 60 분간으로 한다. 실시예 1 과 동일한 방법으로 측쇄 보호기의 절단 및 수지로부터의 잘라내기를 행하여 조펩티드 59.8 ㎎ 을 취득한다. 이것을 실시예 1 과 동일한 방법으로 역상칼럼 (시세이도 제조 CAPCELL PAK C18 30 ㎜ I.D. × 250 ㎜) 을 사용한 HPLC 로 정제하여 화합물 14 를 7.7 ㎎ 얻는다.

질량분석 (FABMS) ; m/z : 1921.7 (M+H⁺)

아미노산 분석 ;Asx 1.0 (1), Glx 1.1 (1), Ser 0.9 (1), Arg 2.2 (2), Thr 1.6 (2), Val 0.9 (1), Met 1.1 (1), Ile 1.0 (1), Leu 2.1 (2), Lys 3.1 (3), Cys 1.3 (1)

실시예 15

화합물15(서열번호15)[H-Leu-Lys-Leu-Lys-Val-Glu-Gln-His-Val-Glu-Leu-Tyr-Gln-Lys-Tyr-Ser-Asn-Asn-Ser-Trp-Arg-OH) 의 합성

Fmoc-Arg(Pmc), 23 μmol 이 결합된 담체수지 (Wang 레진), 50 ㎎ 을 출발물질로 하고, 실시예 3 과 동일한 방법으로 Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH 을 순차적으로 결합한 후에, 세정, 건조를 거쳐 측쇄 보호 펩티드가 결합된 담체수지를 얻는다. 단, 아미노산의 축합 시간은 60 분간으로 한다. 측쇄 보호기의 절단 및 수지로부터의 잘라내기는, 사용되는 혼합액으로서 실시예 1 의 조성인 것에 5 ㎎/㎖ 의 비율로 2-메틸인돌을 첨가한 것을 사용하고, 방치시간을 6 시간으로 하는 것 외에는 실시예 1 과 동일한 방법으로 행하여 조펩티드 20.9 ㎎ 을 취득한다. 이것은 실시예 1 과 동일한 방법으로 역상칼럼 (시세이도 제조 CAPCELL PAK C18 30 ㎜ I.D. × 250 ㎜) 을 사용한 HPLC 로 정제하여 화합물 15 를 7.8 ㎎ 얻는다.

질량분석 (FABMS) ; m/z = 2663.5 (M+H⁺)

아미노산 분석 ;Asx 2.0 (2), Glx 3.9 (4), Ser 2.0 (2), His 1.1 (1). Arg 1.1 (1), Tyr 2.2 (2), Val 1.8 (2), Leu 3. 0 (3), Lys 3.0 (3)

실시예 16

화합물16(서열번호16)(Biotinyl-Gly-Arg-Arg-Leu-Lys-Leu-Lys-Val-Glu-Gln-His-Val-Glu-Leu-Tyr-Gln-Lys-Tyr-Ser-Asn-Asn-Ser-Trp-Arg-OH) 의 합성

Fmoc-Arg(Pmc), 13.8 μmol 이 결합된 담체수지 (Wang 레진) 30 ㎎ 을 출발물질로 하고, 실시예 3 과 동일한 방법으로 Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Asn(Tit)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Gly-OH 을 순차적으로 결합한 후에, 수지에 대해 61.9 ㎎ D-비오틴 (나카라이테스크) 에, 0.5M 농도로 HBTU 및 HOBt·1 수화물을 함유한 DMF 용액 562 ㎕ 와 DIEA 를 1M 농도로 함유한 DMF 용액 562 ㎕ 를 첨가하고 실온에서 5 분간 교반한 용액을 첨가하여 4 시간 교반한다. 용액을 배출한 후, 세정, 건조를 거쳐 N 분말이 비오틴화된 측쇄 보호 펩티드가 결합된 담체수지를 얻는다. 단, 아미노산의 축합반응공정 (d) 에 있어서, PyBOP 대신에 HBTU 를, NMM 대신에 DIEA 를 사용한다. 측쇄 보호기의 절단 및 수지로부터의 잘라내기는, 사용되는 혼합액으로서 실시예 1 의 조성인 것에 5 ㎎/㎖ 의 비율로 2-메틸인돌을 첨가한 것을 사용하고, 방치시간을 6 시간으로 하는 것 외에는 실시예 1 과 동일한 방법으로 행하여 조펩티드 44.2 ㎎ 을 취득한다. 이것을 실시예 1 과 동일한 방법으로 역상칼럼 (시세이도 제조 CAPCELL PAK C18 30 ㎜ I.D. × 250 ㎜) 을 사용한 HPLC 로 정제하여 화합물 16 을 10.3 ㎎ 얻는다.

질량분석 (FABMS) ; m/z = 3260.0 (M+H⁺)

아미노산 분석 ;Asx 2.1 (2), Glx 4.1 (4), Ser 2.0 (2), Gly 1.0 (1), His 1.0 (1), Arg 2.8 (3), Tyr 2.1 (2), Yal 1. 9 (2), Leu 3.0 (3), Lys 2.9 (3)

실시예 17 화합물 10 의 아세트산염으로의 변환

실시예 10 과 같이 하여 얻은 화합물 10, 22.1 ㎎ 을 1 ％ 아세트산 수용액 5 ㎖ 에 용해하고, 음이온 교환 칼럼 (아사히가세히 Asahi Pack ES-502N 21.5 mm I.D. × 100 mm) 을 거침으로써, TFA를 제거하며 아세트산염으로 교환한다. 펩티드는 1 ％ 아세트산 수용액으로 용출시키고 220 nm 으로 검출한다. 용출액을 동결건조시켜 화합물 10 의 아세트산염 20.0 ㎎ 을 얻는다.

실시예 18 화합물 12 의 아세트산염으로의 변환

실시예 12 와 같이 하여 얻은 화합물 12, 17.5 ㎎ 을 1 ％ 아세트산 수용액 5 ㎖ 에 용해하고, 음이온 교환 칼럼 (아사히가세히 Asahi Pack ES-502N 21.5 mm I.D. × 100 mm) 을 거침으로써, TFA를 제거하며 아세트산염으로 교환한다. 펩티드는 1 ％ 아세트산 수용액으로 용출시키고 220 nm 으로 검출한다. 용출액을 동결건조하고, 화합물 12 의 아세트산염 13.0 ㎎ 을 얻는다.

다음에 화합물(Ⅰ) 의 생물활성 및 스크리닝 방법에 대해 실시예를 나타낸다.

실시예 19 소 혈관 평활근세포, 돼지 혈관 평활근세포, 소 모세혈관 내피세포 또는 소 경동맥 내피세포에 대한 TGF-β 의 결합도 측정에 의한 잠재형 TGF-β 로부터의 활성형 TGF-β 유리활성

(1-1) LLTGF-β125Ⅰ-표식

오까다 등의 방법 [Journal of Biochemistry, 106, 304 (1989)] 에 따라 인간 혈소판에서 정제한 LLTGF-β 를 사용하고, 클로라민 T 법 [Molecular & Cellular Biology, 2, 599 (1982)] 으로 125Ⅰ 로 표식한다. 구체적으로는 다음 조작을 행한다.

2 ㎍ LLTGF-β 에 1M K-포스페이트 버퍼 (pH 7.5) 를 25 ㎕, Na- 125Ⅰ(DuPont NEW) 를 37 MBq, 클로라민-T (0.5 mg/100 ㎕ in 0.05M K-포스페이트 버퍼, 와꼬오준야꾸) 를 10 ㎕ 첨가하고 40 초간 실온에서 교반한다. Na2S2O5, (1 ㎎/100 ㎕ in 0.05M K-포스페이트 버퍼) 을 15 ㎕ 첨가하고 5 초간 실온에서 교반한 후, 티로신 수용액 (1 mg/㎖) 을 첨가한다. 반응액을 Sephadex G25 칼럼으로 적용하고 500 ㎕ 씩 분획을 분취하여, γ-카운터 (ARC-2000, 아로카) 로 카운트하고 표식된 단백질을 함유한 분획을 선택하여 실험에 사용한다.

(1-2) 세포의 제조

실험에 사용된 세포는 사또 등의 방법 [Journal of Cell Biology, 123, 1249 (1993)] 에 따라 취득한다. 소 혈관 평활근세포 (BSMC) 는 소 대동맥에서, 돼지 혈관 평활근세포 (PSMC) 는 돼지 대동맥에서, 익스플랜트 (explant) 법 [Journal of Cell Biology, 50, 172 (1971)] 으로 단리, 배양한다. 소 모세혈관 내피세포 (BCEC) 는, 소 부신 모세혈관에서 단리, 배양한다. 소 경동맥 내피세포 (BAEC) 는, 소 경동맥에서 단리, 배양한다.

(1-3) TGF-β 결합도의 측정

사또 등의 방법 [Journal of Cell Biology, 123, 1249 (1993)] 에 따라 다음과 같이 조작을 행한다.

상술한 바와 같이 단리, 배양한 BSMC, PSMC 또는 BCEC 를 4 × 104 세포/접시의 비율로 35 mm 접시에 뿌리고, 다음날 배양지를 0.1 ％ 소 혈청 알부민 (BSA) 을 함유한 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM, Nissui Pharmaceutical Co.) 로 변경하고 5 시간 인큐베이트한다. 0.1 g/1 의 MgCl2·6H2O 와 CaCl2 를 함유한 인산 완충 생리식염수 (이하, 간단히 PBS(+) 라고 기재하고, MgCl2·6H2O 와 CaCl2 를 함유하지 않은 인산 완충 생리식염수를 간단히 PBS(-) 라고 기재한다.) 2 ㎖ 로 세포를 세정한 후, 2ng/ml125Ⅰ-LLTGF-β 및 시험화합물을 함유한 빙냉 0.1 ％ BSA 함유 DMEM 1 ㎖ 로 배양지를 바꾸고 4 ℃ 에서 3 시간 인큐베이트한다. 시험화합물은 디메틸술폭시드 (DMSO) 용액으로 첨가하고, 계(系)중의 최종 DMSO 농도가 0.1 ％ 가 되도록 한다. 빙냉 PBS(+) 2 ㎖ 로 3 회 세포를 세정한 후, 0.5 ％ Triton X-100 900 ㎕ 로 세포를 용해한다 (실온, 0.5―1 시간). 용해액 중 800 ㎕ 를 분취하고, γ-카운터로 방사활성을 측정한다.

결과를 도 1, 2 및 표 3 ∼ 표 6 에 나타낸다.

표 3 의 결과는, 소 모세혈관 내피세포 (BCEC) 에 대한 활성형 TGF-β 의 결합도를 방사활성으로 측정한 결과이다. 「비클」의 레인은 시험화합물을 함유하지 않은 용액을 첨가한 경우,「무세포」의 레인은 세포가 존재하지 않는 플레이트에 125Ⅰ-LLTGF-β 만 첨가한 경우, 그밖의 레인은 각 레인에 나타내는 시험화합물을 30 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가한 경우의 방사활성을 각각 나타낸다.

표 4 의 결과는, 소 모세혈관 내피세포 (BCEC) 에 대한 활성형 TGF-β 의 결합도를 방사활성로 측정한 결과이다. 「비클」의 레인은 시험화합물을 함유하지 않은 용액을 첨가한 경우,「무세포」의 레인은 세포가 존재하지 않는 플레이트에 125Ⅰ-LLTGF-β 만 첨가한 경우, 그밖의 레인은 각 레인에 나타내는 시험화합물을 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가한 경우의 방사활성을 각각 나타낸다.

표 5 의 결과는 소 경동맥 내피세포 (BAEC) 에 대한 활성형 TGF-β 결합도를 방사활성으로 측정한 결과이다. 「비클」의 레인은 시험화합물을 함유하지 않은 용액을 첨가한 경우, 「무세포 플레이트」의 레인은 세포가 존재하지 않는 플레이트에 125I-LLTGF-β 만 첨가한 경우 그밖의 레인은 각 레인에 시험화합물을 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가한 경우의 방사활성을 각각 나타낸다.

표 6 의 결과는 소 경동맥 내피세포 (BAEC) 에 대한 활성형 TGE-β 결합도를 방사활성으로 측정한 결과이다. 「비클」의 레인은 시험화합물을 함유하지 않은 용액을 첨가한 경우, 「무세포 플레이트」의 레인은 세포가 존재하지 않는 플레이트에 125I-LLTGF-β 만 첨가한 경우 그밖의 레인은 각 레인에 시험화합물을 100 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가한 경우의 방사활성을 각각 나타낸다.

이상, 도 1 과 도 2 및 표 3 ∼ 표 6 에 나타낸 바와 같이, 화합물 1 ∼ 3, 5 ∼ 9 및 13 ∼ 16 은 100 ㎍/㎖ 농도에서, 화합물 12 는 30 ㎍/㎖ 농도에서 세포에 대한 결합도가 증대하며 잠재형 TGF-β 로부터의 활성형 TGF-β 의 유리를 촉진시켰다.

또, 본 발명의 방법으로, 잠재형 TGF-β 로부터의 활성형 TGF-β 의 유리를 촉진시키며 세포에 대한 결합도를 증대시키는 화합물을 선택할 수 있다.

실시예 20 소 혈관 내피세포의 유주도 측정에 의한 잠재형 TGF-β 로부터의 활성형 TGF-β 유리활성

사또 등의 방법 [Journal of Cell Biology, 123, 1249 (1993)] 에 따라 아래와 같은 조작을 행한다.

35 ㎜ 접시 에 BCEC 를 컨플루엔트한 후, 배지를 0.1 ％ BSA 함유 DMEM 으로 변경하고 5 시간 인큐베이트한다. 면도칼로 일부세포를 긁어 PBS(-) 로 세정한 후, 시험화합물을 함유한 0.1 ％ BSA 함유 DMEA 로 인큐베이트하고 24 시간후에 4 시야의 유주 세포수를 현미경 (IX70, Olympus) 하, 각 접시 마다 카운트한다. 시험화합물은 시험예 1 과 동일한 방법으로 첨가한다. 결과를 도 3 ∼ 5 에 나타낸다. 화합물 3, 5 ∼ 9 는 50 ㎍/㎖ 농도에서 세포의 유주를 저해하며 잠재형 TGF-β 로부터의 활성형 TGF-β 의 유리를 촉진시켰다. 화합물 4 는 100 ㎍/㎖ 농도에서 세포의 유주를 저해하였다. 화합물 10 은 10 ㎍/㎖ 농도에서도 세포의 유주를 저해하였다.

본 발명의 방법으로, 잠재형 TGF-β 로부터의 활성형 TGF-β 의 유리를 촉진시키며 세포에 대한 결합도를 증대시키는 화합물을 선택할 수 있다.

실시예 21 루시페라아제 어세이에 의한 활성형 TGF-β 존재량의 측정 활성형 TGF-β 양은 아베 등의 방법 [Analytical Biochemistry, 216, 276(1994)] 에 의거하여 PAI-1 프로모터의 하류에 루시페라아제 유전자를 도입한 밍크 폐 상피세포 (MLEC) 의 발광을 루시페라아제·어세이·시스템 (Promega) 으로 측정함으로써 행한다. 구체적으로는 다음 조작을 행한다.

24 웰 플레이트에 BCEC 를 컨플루엔트해지도록 세포를 뿌리고 배지를 0.1 ％ BSA 함유 DMEM 으로 변경하고서 6 시간후 빗으로 세포를 그물코형으로 긁어 PBS(-) 로 세정한 후, 시험화합물을 함유한 0.1 ％ BSA 함유 DMEM 로 24 시간 인큐베이트하며 배양 상청액을 샘플로 한다. 이 배양 상청액을 채취하기 6 시간전에 96 웰 플레이트에 상기 MLEC 를 2.8×104 세포/웰 의 비율로 뿌려두고 6 시간 10 ％ 소 태아혈청 (FCS) 함유 DMEM 로 배양한후, 샘플로 한 상기 배양 상청액에 배지를 치환하고 16 시간 배양한다. 세포를 PBS(-) 로 2 회 세정한 후 루시페라아제·어세이·시스템을 이용하여 활성화 TGF-β 농도를 측정한다. 결과를 도 6 에 나타낸다. 화합물 3 및 10 의 첨가로 활성형 TGF-β 가 유리된다. 특히 화합물 10 에서는 10 ㎍/㎖ 로도 현저한 효과가 보인다.

본 발명에 의해 잠재형 TGF-β 의 세포막 결합의 증강에 따라 잠재형 TGF-β 의 활성화를 촉진시키는 활성을 갖는 신규 펩티드 또는 그 약리적으로 허용되는 염을 제공할 수 있다.

또, 본 발명의 화합물의 선택 방법에 따르면 잠재형 TGF-β 로부터 활성형 TGF-β 의 유리를 촉진시키는 활성 또는 잠재형 TGF-β 세포막에 대한 결합을 촉진시키는 활성을 갖는 화합물이 선택된다.

본 발명의 선택 방법에 의해 얻어지는 화합물 또는 화합물(Ⅰ) 또는 이들 약리적으로 허용되는 염은, 잠재형 TGF-β 세포에 대한 결합을 저해하는 활성 또는 촉진시키는 활성 또는 잠재형 TGF-β 의 TGF-β 에 대한 전환반응을 저해하는 활성 또는 촉진시키는 활성을 가지므로, 암, 당뇨병성 망막증, 죽상 동맥경화, 골절, 심근경색, 허혈 재환류후의 심근장해, 뇌경색, 망막박리, 사구체 신장염, 당뇨변성 신장증, 이식신장거절, HIV 신장증, 특발성 폐섬유증, 자기면역성 폐섬유증, 간경변, (암요법 후에 자주 발병되는) 정맥협착성 간장해, 전신성 경화증, 켈로이드, 호산구 증가-근육통 증후군, 혈행 재건수술후 재협착, 안내 섬유증, 류마티즘성 관절염, 비용 등의 치료 또는 예방제로서 유용하다.

(1) 서지적 항목

출원인명 또는 명칭

교오와 학꼬 고오교 가부시끼가이샤

발명의 명칭

잠재형 TGF-β 의 활성화를 촉진시키는 펩티드 및 TGF-β 활성조절 화합물의 스크리닝 방법

정리번호

1060

출원일

1998 년 5 월 12 일

우선권번호

평성 9 년 특허출원 제 120683 호

우선일

평성 9 년 5 월 12 일

서열의 수

34

(2) 서열에 관한 기술적 항목

서열번호 : 1

서열길이 : 23

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 1]

서열번호 : 2

서열길이 : 24

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 2]

서열번호 : 3

서열길이 : 23

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 3]

서열번호 : 4

서열길이 : 23

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 4]

서열번호 : 5

서열길이 : 17

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 5]

서열번호 : 6

서열길이 : 12

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 6]

서열번호 : 7

서열길이 : 17

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 7]

서열번호 : 8

서열길이 : 14

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 8]

서열번호 : 9

서열길이 : 12

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 9]

서열번호 : 10

서열길이 : 24

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

서열 특징 :

특징을 나타내는 기호 : 디술피드결합

존재위치 : 1 및 24

[서열 10]

서열번호 : 11

서열길이 : 23

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

서열 특징 :

특징을 나타내는 기호 : 디술피드결합

존재위치 : 4 및 23

[서열 11]

서열번호 : 12

서열길이 : 19

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

서열 특징 :

특징을 나타내는 기호 : 디술피드결합

존재위치 : 1 및 19

[서열 12]

서열번호 : 13

서열길이 : 19

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

서열 특징 :

특징을 나타내는 기호 : 디술피드결합

존재위치 : 1 및 19

특징을 나타내는 기호 : 변성된 부위

존재위치 : 1

다른 정보 : Xaa 는 Nα-Biotinyl-L-시스테인을 나타낸다

[서열 13]

서열번호 : 14

서열길이 : 16

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 14]

서열번호 : 15

서열길이 : 21

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 15]

서열번호 : 16

서열길이 : 24

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

서열 특징 :

특징을 나타내는 기호 : 변성된 부위

존재위치 : 1

다른 정보 : Xaa 는 Nα-Biotinyl-글리신을 나타낸다

[서열 16]

서열번호 : 17

서열길이 : 391

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 17a]

[서열 17b]

[서열 17c]

서열번호 : 18

서열길이 : 414

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 18a]

[서열 18b]

[서열 18c]

서열번호 : 19

서열길이 : 412

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 19a]

[서열 19b]

서열번호 : 20

서열길이 : 390

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 20a]

[서열 20b]

[서열 20c]

서열번호 : 21

서열길이 : 414

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 21a]

[서열 21b]

[서열 21c]

서열번호 : 22

서열길이 : 410

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 22a]

[서열 22b]

[서열 22c]

서열번호 : 23

서열길이 : 390

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 23a]

[서열 23b]

[서열 23c]

서열번호 : 24

서열길이 : 412

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 24a]

[서열 24b]

[서열 24c]

서열번호 : 25

서열길이 : 315

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 25a]

[서열 25b]

[서열 25c]

서열번호 : 26

서열길이 : 390

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 26a]

[서열 26b]

[서열 26c]

서열번호 : 27

서열길이 : 409

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 27a]

[서열 27b]

[서열 27c]

서열번호 : 28

서열길이 : 390

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 28a]

[서열 28b]

서열번호 : 29

서열길이 : 390

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 29a]

[서열 29b]

[서열 29c]

서열번호 : 30

서열길이 : 412

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 30a]

[서열 30b]

[서열 30c]

서열번호 : 31

서열길이 : 412

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 31a]

[서열 31b]

[서열 31c]

서열번호 : 32

서열길이 : 373

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 32a]

[서열 32b]

[서열 32c]

서열번호 : 33

서열길이 : 390

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 33a]

[서열 33b]

[서열 33c]

서열번호 : 34

서열길이 : 382

서열형 : 아미노산

사슬의 수 : 단일가닥

토폴러지 : 직쇄형

서열종류 : 펩티드

[서열 34a]

[서열 34b]

[서열 34c]

Claims

잠재형 TGF-β 로부터 활성형 TGF-β 의 유리를 촉진하는 활성 또는 잠재형 TGF-β의 세포막에 대한 결합을 촉진하는 활성을 갖는 펩티드 또는 그의 약리적으로 허용되는 염.
제 1 항에 있어서, 화학식Ⅰ

[화학식 Ⅰ]

R¹-A-R²

(식중, R¹은 수소원자, 치환 또는 비치환된 알카노일, 치환 또는 비치환된 아로일, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴카르보닐, 치환 또는 비치환된 알콕시카르보닐, 치환 또는 비치환된 아릴옥시카르보닐, 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴옥시카르보닐을 나타내고, R²는 히드록시, 치환 또는 비치환된 알콕시, 또는 치환 또는 비치환된 아미노를 나타내며, A 는 TGF-β 전구체 서열의 부분서열에서 선택되며 상기 서열 중 1 ∼ 5 의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 부가되어 있어도 되는 아미노산 서열을 나타내고, 서열 내의 N 말단 및 C 말단 아미노산 잔기를 포함한 임의의 아미노산 잔기에서 선택된 두 개의 아미노산 잔기에, N 말단 아미노기 또는 측쇄의 아미노기 및 C 말단 카르복실기 또는 측쇄의 아미노기가 CO-NH 로 표시되는 아미드 결합 또는 NH-CO 로 표시되는 역아미드 결합을 형성하거나, 또는 측쇄의 티올기로 디술피드 결합을 형성할 수 있다) 으로 표시되는 펩티드 또는 그의 약리적으로 허용되는 염.
제 2 항에 있어서, A 가 인간 TGF-β1 전구체 서열의 아미노산 30 ∼ 60, 아미노산 142 ∼ 186 및 아미노산 269 ∼ 297 의 서열 및 인간 TGF-β1 서열과 정렬화하였을 때에 인간 TGF-β1 전구체 서열의 아미노산 30 ∼ 60, 아미노산 142 ∼ 186 및 아미노산 269 ∼ 297 의 서열에 상당하는 인간 TGF-β1 이외의 TGF-β 전구체 서열에서 선택된 아미노산 서열의 부분서열에서 선택되고, 이 서열 중 1 ∼ 5 의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 부가되어 있어도 되는 아미노산 서열인 펩티드 또는 그의 약리적으로 허용되는 염.
제 2 항에 있어서, A 가 인간 TGF-β1 전구체 서열의 아미노산 30 ∼ 60, 아미노산 142 ∼ 186 및 아미노산 269 ∼ 297 의 서열 및 인간 TGF-β1 서열과 정렬화하였을 때에 인간 TGF-β1 전구체 서열의 아미노산 30 ∼ 60, 아미노산 142 ∼ 186 및 아미노산 269 ∼ 297 의 서열에 상당하는 인간 TGF-β1 이외의 TGF-β 전구체 서열에서 선택된 아미노산 서열의 부분서열에서 선택되는 펩티드 또는 그의 약리적으로 허용되는 염.
제 2 항에 있어서, A 가 서열번호 1 ∼ 16 의 서열로부터 선택되고, 이 서열 중 1 ∼ 5 의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 부가되어 있어도 되는 아미노산 서열인 펩티드 또는 그의 약리적으로 허용되는 염.
제 2 항에 있어서, A 가 서열번호 1 ∼ 16 의 서열로부터 선택된 아미노산 서열인 펩티드 또는 그의 약리적으로 허용되는 염.
잠재형 TGF-β 를 동물세포에 첨가하여 이 세포에 결합되는 잠재형 TGF-β 양을 측정하는 것; 잠재형 TGF-β 와 활성을 평가해야 할 화합물을 동물세포에 첨가하여 이 세포에 결합되는 잠재형 TGF-β 양을 측정하는 것; 상기 화합물의 첨가에 의한 동물세포에 결합되는 잠재형 TGF-β 양의 변화로부터 상기 화합물의 잠재형 TGF-β 세포에 대한 결합 저해활성 또는 촉진활성을 평가하는 것으로 이루어진 TGF-β 가 관여된 질병의 치료 또는 예방하기 위한 화합물을 선택하는 방법.
제 7 항에 있어서, 동물세포가 혈관 내피세포인 방법.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 화합물의 잠재형 TGF-β 세포에 대한 결합을 촉진하는 활성을 평가하는 방법.
동물세포에 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한항에 기재된 펩티드 또는 그 약리적으로 허용되는 염을 첨가한후 TGF-β 양을 측정하는 것; 평가해야 할 화합물 및 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한항에 기재된 펩티드 또는 그의 약리적으로 허용되는 염을 동물세포에 첨가한후 TGF-β 양을 측정하는 것; 상기 화합물의 첨가에 의한 TGF-β 양의 변화로부터 상기 화합물의 잠재형 TGF-β 의 TGF-β 로의 전환반응의 저해활성 또는 촉진활성을 평가하는 것으로 이루어진 TGF-β 가 관여된 질병의 치료 또는 예방하기 위한 화합물을 선택하는 방법.
제 10 항에 있어서, 동물세포가 혈관 내피세포인 방법.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 화합물의 잠재형 TGF-β 의 TGF-β 로의 전환반응을 저해하는 활성을 평가하는 방법.
제 7 항 내지 제 12 항 중 어느 한항에 기재된 방법으로 선택되는 TGF-β 가 관여된 질병의 치료 또는 예방하기 위한 화합물 또는 그의 약리적으로 허용되는 염.