JPH06502538A - 上皮細胞成長因子（ｅｇｆ）との相同性をもつヘパリン結合性マイトジェン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）との相同性をもつヘパリン結合性マイトジェン発明 の背景 本発明は、１９９０年１０月１６日に出願された米国特許出願番号第０７１５９ ８．０８２号（発明者：　Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ他）の一部継続出願である。

本発明は、国立衛生研究所により付与された＃Ｒ３７ＣＡ３７３９２の下で、政 府の後援により為されたものである。

本発明は、成長因子に関する。

成長因子は、細胞増殖及び分化において中心的役割を果たしている。例えば、塩 基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トラ ンスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、及びトランスフォーミング成長 因子−β（ＴＧＦ−β）は、結合組繊細胞の増殖及び傷修復における血管新生の 誘起に関与してきた（Ｖａｎ　Ｂｒｕｎｔ　ａｎｄ　Ｋｌａｕｓｎｅｒ、６Ｒｉ ｏｔｅｒ力ｔｙｏ１０ｉｙ　２５，１９８８）、更に、Ａｇｅ　ｌ他（１４６） 、Ｐｉｔ力ｏ／、１９７．１９８５）により、成長因子はアテローム性動脈硬化 の病因に関わっていることが示唆されている。例えば、アテローム性動脈硬化を 伴う平滑筋細胞（ＳＭＣ）の過剰形成は、ＰＤＧＦ、潜在ＳＭＣマイトジェンに 起因するものであった。

種々のこれらの成長因子の精製及び特定をするために、ヘバリンアフイニテイク ロマトグラフィーが広く使用されてきた。酸性ＦＧＦ　（ａＦＧＦ）及び塩基性 ＦＧＦ　（ｂＦＧＦ）は固定化ヘパリンカラムにかけられ、それぞれ１．０〜１ ゜２Ｍ塩化ナトリウム溶液及び１，５〜１．８Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶離され る（Ｆｏｌｋｍａｎ　ａｎｄ　Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ、２３５　５ｃｉｅｎｃｅ　 ４４２．１９８７；　Ｌｏｂｂ他、２６１　）、Ｅｊｏｌ、Ｃ力ｅｍ、１９２４ ゜１９８６）。また、ａＦＧＦ及びｂＦＧＦと構造的に相同である幾つかの成長 因子も、ヘパリンに対して親和性を有している（例えば、Ｒｕｂｉｎ他、８６　 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０２．１２８９参照）。

ＰＤＧＦは固定化ヘパリンと結合するか、その親和性は比較的低く、わずか０． ５Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶出される。上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）は、ヘパリ ン結合性成長因子に関する各参照文献に記載されたような条件下では、実質的に は殆どヘパリンと結合しない。ｌ、ｏｂｂ他（２６１）、Ｅｊｏｌ、（’力ｅｍ 、１９２４．１９８６）は、ヘパリンアフィニテイにより、上皮細胞を細胞分裂 させる２種類の成長因子を部分的に精製したと報告している。Ｇｏｓｐｏｄａｒ ｏｗｉｃｚ他（８１Ｐｒｏｃ、Ａｆａｒ／、Ａｃ１ｄ、　５ｃｉ、１ｌｓＡ　６ ９６３．１９８４）は、ウシ脳及び松果体の繊維芽細胞成長因子の精製にヘパリ ンアフィニテイを使用することを報告している。Ｓｈｉｎｇ他（２９）、ｔ″ｅ ｌＩＥｉＯＣ力ｅｍ、２７５．１．９８５）は、ヘバリンセファロースアフィニ テイクロマトグラフィー及びＢｉｏ　Ｒｅｘ７０陽イオン交換クロマトグラフィ ーによって精製される軟骨肉腫由来成長因子を報告している。Ｂｏｈｌｅｎ他（ １８５ＦＥＥＳ　１ｅｌｒ、１７７．１９８５）は、ヒト脳由来繊維芽細胞成長 因子を報告しており、該因子は、陽イオン交換クロマトグラフィー、ヘバリンセ ファロースアフィニテイ、及び逆相ＨＰＬＣによって精製される。Ｓｈｉｎｇ他 （２２３Ｓｃｉｅｎｃｅ　１２９６．１９８４）は、ヘパリン結合性の腫瘍細胞 由来の毛細血管上皮細胞因子を報告している。Ｂｏｓｎｅｒ他（１０７１，Ｃｅ １ｊＪｉｏ！、４８１ａ、１９８８）は、６０００−１４．ＯＯＯＭＷであり、 陽イオン性であり、熱（１００℃、１０分）で失活し、ジチオトレイトール（５ ｍＭ）によって失活し、４Ｍグアニジンまたは０．１Ｍ塩酸での培養に耐性をも つ、ヘパリン結合性の単細胞由来成長因子の検出について報告している。

発明の概要 概して言えば、本発明は、その一つの側面として、ヘパリン結合性−ＥＧＦ相同 性マイトジェン（ＨＢ−ＥＨＭ）と命名した新規な成長因子であることを特徴と する。ｒＥＧＦ相同性」とは、ＥＧＦ族蛋白（例：　ヒトアンフィレグリン（Ａ Ｒ）　、５ｈｏｙａｂ他、２４３　５ｃｊｅｔｙｃｅ　１０７４．１９８９；ｈ ｕｍａｎ　ＴＧＦ−α、Ｄｅｒｙｎｃｋ他、３８　Ｃｅ／ノ　２８７，１９８４ ；　及びヒトＥＧＦ、Ｇｒｅｇｏｒｙ、２５７　Ｎａｔｕｒｅ　３２５．１９７ ５）に特徴的な間隔で配置された６個のンステイン残基を含むという点で、上皮 細胞成長因子と構造的に関連する部分を有することを意味する。これは、後述す るように、−または複数のＥＧＦ族の受容体（例・　Ａ−４３１細胞または平滑 筋細胞）との結合作用にかかわる。一般に、ＥＧＦ相同部分は、少なくとも部分 的に熱（例えば、９０℃で５分間加熱する）に耐性の領域及びジチオトレイト４ −ル（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ　（ＤＴＴ））に敏感（例えば、５ｍＭの ＤＴＴに２時間さらす）な領域を含む蛋白質を構成する。「ヘパリン結合性」と は、特異的な親和性を有しない類似の電荷の蛋白質を溶出する塩化ナトリウム濃 度でヘパリンと結合していることにより立証されるような、ヘパリンに特異的な 親和性を有する（例えば、イオン的な相互作用のみから予想されるものよりも強 い親和力）ことを意味する。一般に、ヘパリン結合性因子は、少なくとも０．６ Ｍ（最も好ましくは、少なくとも０．９Ｍ）の塩化ナトリウム濃度であってもヘ パリンと結合した状態にある。

第２の態様では、本発明は、ヘパリンと結合し、ＥＧＦ相同性部分を有するポリ ペプチドであって、繊維芽細胞、上皮細胞及び平滑筋細胞の増殖を刺激するが、 内皮細胞の増殖は刺激しないポリペプチドであることを特徴とする。

好適な実施例では、これらのポリペプチドは、ヒトＨＢ−ＥＨＭであり、更に好 適には、特徴的なＥＧＦ−相同性部分の配列（実質的には、配列番号：１の１０ ８〜１４３のアミノ酸配列：ＣＬＲＫＹＫＤＦＣＩＨＧＥＣＫＹＶＫＥＬＲＡＰ ＳＣＩ　ＣＨＰＧ　Ｙ　ＨＧ　Ｅ　ＲＣ）を含む。このようなペプチドの一つに は、上述したＥＧＦ−相同性部分の配列及び次に示す配列番号：１の１〜２０８ のアミノ酸配列の全てまたは一部が含まれる： ＭＫＬＬＰＳＶＶＬＫＬＦｒ、、ＡＡＶＬＳＡＬＶＴＧＥＳＬＥＲＬＲＲＧＩ、 ＡＡＧＴＳＮＰＤＰＰＴＶＳＴＤＱＬＬＰＬＧＧＧＲＤＲＫＶＲＤＬＱＥＡＤＬ ＤＬＬＲＶＴＬＳ！９ＫＰＱＡＬＡＴＰＮＫＥＥＨＧＫＲＫＫＫＧＫＧＬＧＫ） ＣＲＤＰＣＬＲＫＹＫＤＦＣ工ＨＧＥＣＫＹＶＫＥＬＲＡＰ！９ＣｒＣＨＰＧＹ ＨＧＥＲＣＨＧＬＳＬＰＶＥＮＲＬＹ’ｒＹＤＨＴＴｒＬＡＶＶＡＶＶＬＳＳＶ ＣＬＬＶ工ＶＧＬＬＭＦＲＹＨＲＲＧＧＹＤＶＥＮＥＥＫＶＫＬＧＭ　Ｔ　Ｎ　 Ｓ　Ｈ。

このような成熟した形態では、ＨＢ−ＥＨＭ群は、アスパラギン酸残基６３とア ラニン残基８２（図３、配列番号、１参照）との間にアミノ末端を有し、セリン 残基１４７とプロリン残！１４９　（同様に、図３、配列番号＝１参照）との間 にカルボキシル末端を有する。本発明はまた、例えば、アルギニン残基７３とア ラニン残基８２（図３、配列番号；ｌ′＃照）との間にアミノ末端を有するもの やセリン残基１４７にカルボキシル末端を有するもの（同様に、図３、配列番号 ：１参照）等の、より小さいポリペプチドも含む。これらのポリペプチドは、好 適には酸に対して安定である。単離されたポリペプチドは、図１に示したアミノ 酸配列と実質的に同一の配列（配列番号＝１における８２〜１４７のアミノ酸） 、或いは図４に示したアミノ酸配列と実質的に同一の配列（配列番号：１におけ る６３〜１４８のアミノ酸）を含む。本発明に係るポリペプチドは好適には陽イ オン性であり、（例えば、真核細胞により産生されたとき）７．２〜７．８の間 のｐＩを有し、そしておそらくは、しかしそうである必要はないが、グリコジル 化されるであろう。本発明に係る好適なポリペプチドは、非還元性ポリアクリル アミドゲルで約２２、ＯＯＯのみかけ分子量を有し、少なくとも６６のアミノ酸 残基を含む。更に、これらのポリペプチドは、好適には、治療目的に適している 他の共精製物質から十分に分離される。

他の態様においては、本発明は、前記ポリペプチドをコードする精製された核酸 、及び真核細胞（好適には哺乳細胞）または原核細胞（好適には大腸菌、最も好 適にはＥ、ｃｏｊｊ　ＢもしくはＥ、ｃｏ／／′　Ｗ３１１０）においてこの核 酸を発現させるベクター（好適には、ｐＭＴＮ−ＨＢＥＧＦ、ｐＡＸ−ＨＢＥＧ Ｆ、ｐＮＡ２８及びｐＮＡ５１）であることを特徴としている。本発明はまた、 そうしたベクターを含む細胞であることを特徴としている。このような細胞は、 成熟型蛋白質の主要配列を含むポリペプチドを生成することが可能であり、且っ ＨＢ−ＥＨＭの改善された発現、安定性または分離の簡易化を容易化する付加ア ミノ酸をアミノ末端またはカルボキシル末端に含む、真核細胞（例えば、成熟型 蛋白質を増殖培養基中へ分泌することが可能な哺乳動物細胞）または原核細胞で ある。本発明の発現ベクターまたはベクター含有細胞は、ＨＢ−ＥＨＭ及びこれ と等価のポリペプチドを生成するための本発明の方法に使用可能である。これら のポリペプチドは、その傷治療量を傷へ適用することを含む、患者の傷治療のた めの方法に使用可能である。これらのポリペプチドはまた、その増殖がＨＢ−Ｅ ＨＭ、好適には繊維芽細胞、上皮細胞、または平滑筋細胞によって刺激される肋 ｖｌｔｒＯ培養方法にも使用することができる。この方法は、上述したポリペプ チドの増殖刺激量を細胞に接触させる工程を含む。ポリペプチドは、更に、ポリ ペプチドと優先的に結合する抗体を生成するためにも使用可能である。抗体は好 適には単クローンであり、Ｉｎ　ｖｉｖｏ生体内で、上述したポリペプチドの生 物学的活性を中和する。

最後の態様では、本発明は、ＨＢ−ＥＨＭに対するアンタゴニストを確認する方 法であって、候補アンタゴニストの存在下でこの因子によってその増殖が刺激さ れる培養細胞へＨＢ−ＥＨＭを供給する工程と、候補アンタゴニストが細胞のＨ Ｂ−ＥＨＭ誘起増殖を阻止できるかどうかを定める工程と、を含む。

「成熟」という用語は、細胞外の形態に処理された蛋白質の一つの形態を意味す る。「生物学的活性」とは、後述する方法でアッセイされた細胞（例えば、繊維 芽細胞、上皮細胞または平滑筋細胞、ただし内皮細胞は除外）の増殖を刺激する 因子の能力を意味する。「分離された」とは、その自然発生環境から取り出され ること、好適には標準生化学的または組換えＤＮＡ技術によって均質溶液として 産出されることを意味する。「酸安定性（酸に対して安定）」とは、例えばｐＨ ２，５で２時間にわたって溶液にされされた後も、生物学的活性（上述）を保有 していることを意味する。「グリコジル化された」とは、共有結合した炭水化物 群を−または複数有することを意味する。「グリコジル化されていない」とは、 共有結合した炭水化物群を含まないことを意味する。「みかけ分子ｊｌＪとは、 標準蛋白等の周知の分子量を有する標準物質との比較によって、変性ポリアクリ ルアミドゲルに対して定められた分子量を意味する。「非還元性ポリアクリルア ミド」とは、β−メルカプトエタノール等の還元剤が欠如したポリアクリルアミ ド電気泳動ゲルを意味する。「傷の治療」とは、制限なしに、組織修復または血 管新生の刺激を意味する。「アンタゴニスト」とは因子の活性を抑制する分子１ ．二の場合には、例えば応答細胞（例、　繊維芽細胞、上皮細胞及び平滑筋細胞 ）の増殖を刺激するＨＢ−ＥＨＭの活性を抑制する分子を意味する。「実質上同 一」のアミノ酸配列とは、保存性のアミノ酸置換のみによって異なっているアミ ノ酸配列を意味し、例えば−のアミノ酸が同じクラスの他のアミノ酸と置換（例 えば、グリシンに対するバリン、リジンに対するアルギニンなど）すること、或 いは成長因子の生物学的活性（上述）を破壊しないアミノ酸配列の位置に配置さ れたーもしくは複数の非保存性アミノ酸の置換、除去または挿入によってのみ異 なるアミノ酸配列を意味する。このような等価因子は、こうした因子を自然生成 または誘起可能なあらゆる動物の細胞または組織から後述する方法を用いてまた はその等価の方法で抽出することによって分離可能であり、或いは化学的合成法 で分離可能であり、或いはそうした成長因子をコードするｃＤＮＡまたはゲノム ＤＮＡの分離等による組換えＤＮＡ技術の標準的な技術によって分離することが 可能である。「実質的に同一の」核酸配列とは、実質的に同一のアミノ酸配列を コードする核酸配列を意味する（即ち、上述したように、同一もしくは保存アミ ノ酸置換、非保存アミノ酸置換、または因子の生物学的活性を破壊しない欠損ま たは挿入によってのみ異なるもの）。このような核酸配列は、制限なく、組換え ＤＮＡ技術の標準的な技術によって分離することができる（例えば、ゲノムＤＮ ＡまたはｃＤＮＡの分離によって、または試験管内突然変異によって、ポリメラ ーゼ連鎖反応法または化学合成法によって）。「中和」とは、（例えば、成長因 子の生物学的活性を）部分的にまたは完全にブロックすることを意味する。

本発明は、翻訳された成長因子（例えば、図１で示したアミノ酸を含むＨＢ−Ｅ ｌ（Ｍの６６アミノ酸形態、図４に示したＨＢ−ＥＨＭの８６アミノ酸形態、ま たは図３に示した蛋白質の２０８アミノ酸形！Ｂ）、及び翻訳後の変化または処 理を受けた蛋白質の任意の増殖促進形態を含む。このような翻訳後の変化には、 制限なく、例えば前記列の一部もしくは全てまたはシグナル配列の一部もしくは 全ての除去等によるアミノ末端の処理、或いは、膜スパンニング領域の全てもし くは一部またはサイトプラスマ領域の全てもしくは一部の除去等によるカルボキ シル末端の処理、或いは０結合されたグリコシレージジン、或いはこれらの任意 の組５みｈわせを含むつ更に、本発明は、図１．３または４に示し、たアミノ酸 または核酸配列には制限されない。当業者であれば、ここで記載の方法を用いて 、等価もしくは実質的に同一の成長因子、または等価もしくは実質的に同一の成 長因子をコードする核酸配列を容易に単離することができる。

本発明の成長因子は、傷修復、増殖及び成長、アテローム性動脈硬化、腫瘍及び 骨髄繊維症に所定の作用を果たしており、従って、傷治療の促進並びにアテロー ム性動脈硬化及び腫瘍疾病の検出治療のために培養されたを髄動物細胞の増殖を 刺激するのに有用となる。

本発明の他の特徴及び効果は、後述する好適な実施例の説明及び特許請求の範囲 より明らかとなろう。

好適な実施例の説明 まず、各図面について簡単に説明する。

図面 図１は、成熟（即ち細胞外の形態に処理された）ヘパリン結合性ＥＧＦ相同性マ イトジェンの一形態として存在するアミノ酸配列を示す図である。

図２は、いくつかのＥＧＦ相同性部分のアミノ酸配列を示す図である。

図３は、ＨＢ−ＥＨＭをコードするｃＤＮＡの核酸配列及び主な翻訳生成物の推 定アミノ酸配列を示す図である。

図４は、成熟（即ち細胞外の形態に処理された）ヘパリン結合性ＥＧＦ相同性マ イトジェンの少なくとも−の形態で存在するアミノ酸配列を示す図である。

図５は、融合蛋白クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ） −ＨＢ−ＥＨＭの核酸及び推定アミノ酸配列を示す図である。

寄託物質の分譲 本発明に係る物質は、メリーランド州、ロックパイルのアメリカン・タイプ・カ ルチャー−コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ）に寄託された。これによって当業者であれば、本 発明に係る物質を、容易に得ることができる。これらの寄託物質の分譲は、後述 する。これらの寄託物質によって生成された成長因子は、本発明の例示的なもの で、これに限定されるものではない。当業者であれば、等価の成長因子、そのよ うな成長因子をコードする核酸、及び次に述べる方法を用いてそのような成長因 子に優先的に結合する抗体、を容易に分離することかできる。

リンパ腫因子とアミノ酸配列 ヘパリン結合性ＥＧＦ相同性マイトジェン（ＨＢ　−Ｅ　ＨＭ）の１つの起源は 、＾５ｅｒｌｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１ ２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｌｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｌｌ撃■A　ＨＤ　２ ０ ８５２より入手可能な、ヒト組織法リンパ腫因子株Ｕ−９３７（登録番号ＣＲＬ １５９３）である。Ｕ−９３７細胞は、１〜２Ｘ１０８／Ｔ−１５０フラスコ（ Ｃｏｓｔａｒ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）の細胞密度で、１０％ウシ胎 仔血清（ＧＩＢＣＯ，ニューヨーク州グランドアイランド）及び抗生物質（ペニ シリン１００単位／ｍ！及び硫酸ストレプトマイシン１００　ｕ　ｇ／ｍ　Ｌ　 ＧＩＢＣＯ。

ニューヨーク州グランドアイランド）を添加したＲＰＭＩ　１６４０　（Ｇ　Ｉ ＢＣＯ、ニューヨーク州グランドアイランド）中で平板培養した。細胞の組織培 養フラスコへの付着を容易にするため、細胞を６０ｎＭミリスチン酸酢酸フォル ボール（ＰＭＡ；別名１２−０−テトラデカノイルフォルボール−１３−アセテ ート（工２−Ｏ−ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌ　ｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａｃｅ ｔａｔｅ　）　；またはＴＰＡ）により、３７℃で２４時間処理したが、このス テップはＨＢ−ＥＨＭの生成には必要ない。細胞はリン酸緩衝食塩水で２回洗浄 し、培地を、抗生物質を添加した非血清ＲＰＭＩ　１６４０と取り替えた。３７ ℃で７２時間後、培養液を採取し、同量の新鮮な非血清培地と取り替え、細胞を 再び７２時間培養し、再び培地を取り替えた。細胞は、成長因子を連続的に分泌 しながら、このような状態で１０〜１４日間維持された。

処理培地（ＣＭ）は、３日ごとに採取した。採取した培地はＧ５−３Ｓｏｒｖａ １１０−夕により１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、プロテアーゼ分解から 保護するため、その上清に、塩酸ベンザミジン（Ｓｉｇ■ａ、ミズーリ州セント ルイス）を最終濃度１ｍＭで添加した。上清は使用するまで一２０℃で保存した 。

これとは別に、ＰＭＡ処理細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、培地を非血清ＲＰ ＭＩ　１６４０培地と取り替えることにより（前述の方法に従う）、処理培地調 製した。次いで処理培地を採取し、約２４．４８．７２．１２０．１６８時間後 （すなわちＰＭＡ処理後）に、新鮮な非血清培地と取り替えた。

処理培地につき、以下に示すように、繊維芽細胞（すなわち、ＢＡＬＢ／ｃマウ ス３Ｔ３細胞）、上皮細胞（すなわち、ヒトケラチノサイト）、または平滑筋細 胞（すなわち、ウシ大動脈平滑筋細胞、Ｂ　Ａ　Ｓ　Ｍ　Ｃ）を用いて、直接成 長因子活性を測定した。これとは別に、ＣＭ５００ｍｌをＴＳＫ−ヘパリンＳＰ Ｗカラム（８Ｘ　７５　ｍ　ｍ、　ＴＯ３ＯＨＡＡＳ、ペンシルベニア州フィラ デルフィア）に供し、高速タンパク液体クロマトグラフィー（Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ、 Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニューシャーシーＰｉｓｃａｔａｗａｙ）によってＣＭを まず分画した。カラムは、カラムの１０倍容量の平衡化緩衝液（０，２Ｍ　Ｎａ Ｃ１，０，０１Ｍトリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，５）で洗浄し、結合タンパク質を、 ０．０１Ｍトリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，４の、０．２〜２Ｍ　ＮａＣ１４０ｍ１直 線濃度勾配により、毎分１ｍｌで溶出した。フラクシン（２，５ｍ１）につき、 フラクションのアリコートのＤＮＡ合成に対する作用か、或いはＢＡＬＢ／Ｃマ ウス３Ｔ３細胞の増殖を測定することによって成長因子活性を調べた。このよう な活性は、［３Ｈ］−チミジンのＤＮＡへの取り込みを測定するか、細胞数の増 加を測定するか、或いはこれらの双方によってモニタした。Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／ 　ｃマウス３Ｔ３細胞のＤＮＡ合成の測定は、Ｓｈｌｎｇらの方法（２２３５ｃ ｉｅｎｃｅ　１２９６．１９８４．　参考文献の中に含まれる）に従って行った 。ＢＡＬＢ／マウス３Ｔ３刺激活性の１単位は、Ｓｈｉｎｇらの報告（ｓｕｐｒ ａ　）の条件下において、ＢＡＬＢ／ｃマウス３Ｔ３細胞の最大ＤＮＡ合成量の 半分の量を刺激するのに必要な成長因子の量であると定義される。ウシ毛細管内 皮細胞のＤＮＡ合成を測定するため、細胞をトリプシンで処理し、１０％ウシ胎 仔血清（ＧＩＢＣＯ，ニューヨーク州グランドアイランド）及び抗生物質（ペニ シリン１００単位／ｍｌ及び硫酸ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ　ＧＩＢ ＣＯ，−ユ　Ｅ−り州グランドアイランド）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏの修正 Ｅａｇｌｅの培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ，ニューヨーク州グランドアイランド ）４００μｌにより、４８ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、マサチニーセッッ州 ケンブリッジ）で、細胞密度を希薄にして（ウェル当り細胞数ｌＸｌ０’）再平 板培養した。培養２４時間後に、培地を、２％ウシ胎仔血清、抗生物質１μＭチ ミジン及び０．５％ウシ血清アルブミンを添加した同量のＤＭＥＭと取り替えた 。培養２４時間後に、試験サンプルをウェルに加えた。１８時間後、［３Ｈ］− チミジン（０，６ｕＣｉ／ウエル、　ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、 プラウエア州つイルミントン）を添加した。さらにその５時間後に各プレートを 、ＢＡＬＢ／ｃマウス３Ｔ３細胞の培養に用いたのと同様の操作により処理し、 ［”Ｈ］　−チミジンの細胞のＤＮＡへの取り込みを測定しウシ大動脈平滑筋（ ボストンのＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ　）ＩｏｓｐｔｔａｌのＨ０ｖｅｔｃｈ博士よ り入手）ＤＮＡ合成を測定するため、細胞をトリプシン処理し、２％コロラドウ シ胎仔血清（Ｃｏｌｏｒａｄｏ　５ｅｒｕｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ）及び抗生物質（ ペニシリン１００単位／ｍｌ及び硫酸ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、Ｇ ＩＢＣＯ，ニューヨーク州グランドアイランド）を添加したＤＭＥＭ４００μｌ により、４８ウエルプレートで、細胞密度を希薄にして（ウェル当り細胞数ｌＸ ｌ０’）再平板培養した。細胞がコンフルエンス状態まで増殖した後、培地を、 ２％コロラドウシ胎仔血清及び抗生物質を添加した同量のＤＭＥＭと取り替えた （前述の方法に従う）。

培養２４時間後に、試験サンプルをウェルに加えた。１８時間後、［３Ｈ］−チ ミジン（１ｕＣｉ／ウェル）を添加した。さらにその６時間後に各プレートを、 Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス３Ｔ３細胞及び毛細管内皮細胞の培養に用いたの と同様の操作により処理し、［３Ｈ］−チミジンの細胞のＤＮＡへの取り込みを 測定した。

ウシ大動脈平滑筋細胞の増殖は、成長因子の刺激に続いて細胞数をカウントする ことによっても測定した。これらの実験では、細胞は細胞密度を希薄にして２４ のウェルプレートにおいてＤＥＭＥ／１０％ウシ胎仔血清／１％ＧＰＳ　（１０ ０％ＧＰＳはグルタミン２９．２ｍｇ／ｍｌ、ペニシリン１０，０００単位／ｍ １１硫酸ストレプトマイシン１０，０００Ｍｇ／ｍｌ　；ＧＩＢＣＯ，＝ｓ−ヨ ーク州ダグランドアイランド中、細胞数１０４／ウエルで平板培養した。次いで 試サンプルを加え、３日後に、細胞をトリプシン処理によって除去し、Ｃｏｕ　 ｌ　ｔｅｒカウンタ（Ｃｏｕｌｔｅｒ、フロリダ州Ｈ１ａｌｅａｈ　）によって カウントした。

ＨＢ−ＥＨＭは次のように精製した。精製操作中、ＢＡＬＢ／Ｃマウス３Ｔ３細 胞を標的細胞として用い、［３Ｈ］−チミジンのＤＮＡへの取り込みを測定して 成長因活性をモニタした。処理培地（９〜１０Ｌ）は、０．２ＭＮａＣ１，０゜ ０１Ｍトリフ、−ＭＣＩ、ｐＨ７，５により、流速毎時３００ｍ１で平衡化した Ｂｉｏ−Ｒｅｘ７０陽イオン交換カラム（５Ｘ１０ｃｍ、２００ｍ１）（Ｂｉｏ Ｒａｄ。

カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）に直接供した。カラムは平衡化緩衝液で十 分に洗浄し、結合タンパク質はＩＭ　ＮａＣ１、Ｏ，０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐ Ｈ７，５で溶出した。生物学的に活性な分画はｐＨｓ、０に調整しくＢＡＬＢ／ ｃマウス３Ｔ３細胞を用いて測定した前述の方法と同様）、硫酸銅で飽和し、０ ．５ＭＮａＣ１，０，０１Ｍトリス−ＨＣＬ　ｐＨ８，０で平衡化した銅キレー トセファロースカラム（２ｘ　１１　ｃ　ｍｓ　Ｐｈａｒｍａｃｌａ　ＬＫＢ　 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、　、ニューシャーシー州ｐｔｓｃａｔａ ｖａｙ）に供した。カラムを平衡化緩衝液で十分に洗浄した後、結合タンパク質 を０．５Ｍ　ＮａＣ１，０，ＯＩＭ）リス−ＨＣｌ５ｐＨｓ、０の０〜０．４Ｍ Ｌ−ヒスチジン２００ｍ１の直線濃度勾配により、流速毎時４０ｍ１で溶出した 。この方法を用いて、Ｌ−ヒスチジン０．０２Ｍ〜０．　０２５Ｍにより、単一 の生物活性ピークが溶出された。活性のある本ピークに含まれる生物学的に活性 な分画をプールし、Ｏ，０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐａ７．５で１゜１に希釈し、 ０．２Ｍ　ＮａＣ１、Ｏ，０１Ｍトリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，５の２０ｍ１で平衡 したＴＳＫ−ヘパリンＳＰＷ　ＦＰＬＣカラム（８Ｘ７５ｍｍ、ＴＯ５ＯＨＡＡ Ｓペンシルベニア州フィラデルフィア）に供した。カラムを０．２ＭＮａＣ１， ０，０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５の２０ｍ１で洗浄した後、結合タンパク 質をＯ，０１Ｍトリス−ＭＣＩ、ｐＨ７，５の０．２〜２ＭＮａＣ１４０ｍｌの 直濃度勾配により、流速毎分１ｍｌで溶出した。

上記に概説した３段階の精製によって部分精製したＨＢ−ＥＨＭのサンプル（Ｔ ＳＫ−ヘパ１ルカラムからＮａＣ１濃度１〜１，２Ｍで溶出）をＣ４逆相高速液 クロマトグラフイーカラム（ＲＰ−ＨＰＬＣ）に供した。Ｂｅｃｋｍａｎｍｏｄ ｅｌ　３３４ＨＰＬＣシステム（Ｂｅｃｋｓａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　 Ｉｎｃ、、ニュージャージ州Ｓｏｍｅｒｓｅｔ）を使用した。サンプルは、５％ アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸で平衡化したＣ４逆相ＨＰＬＣカラ ム（４，６Ｘ２５０ｍｍ、Ｖｙｄａｃ　）注入した。カラムを本溶媒で十分に洗 浄し、結合タンパク質を０．１％トリフルオロ酢酸の５％〜１５％アセトニトリ ル濃度勾配５ｍｌ、次いで、０．１％トリフルオロ酢酸の１５％〜４０％アセト ニトリル濃度勾配置２０ｍ１により、流速毎分１ｍｌで溶出した。フラクション を採取し、アリコートを１％ウシ血清アルブミン（８１ｇｍａ、ミズーリ州セン トルイス）リン酸緩衝食塩水中で１０倍希釈し、成長因子活性を測定した。溶出 タンパク質は２１４ｎｍにおける吸収をモニタリングすることによって検出した 。

成長因子活性の単一の優勢ピークがアセトニトリル約２３９６においてＣ４カラ より溶出した。この活性ピークは、２１．４　ｎ　Ｍにおける成長因子の吸収の ２つのピーク（すなわち、３３分で溶出したピークと３４．５分で溶出したピー ク）に一致した。これら２つのピークうちの１番目（すなわち、３３分のピーク ）に一致するフラクションを採取し、さらに解析した。精製タンパク質は単一の バンドとして移動し、非還元性条件下（すなわち、１５％ポリアクリルアミド／ ＳＤＳゲル）ではみかけ分子量約２２ｋＤ、還元条件下（すなわち、１％β−メ ルカプトエタノールを含む１５％ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル）ではみかけ 分子量約２０ｋＤであった。成長因子のみかけ分子量は、成長因子の電気泳動移 動度を分子量既知のタンパク質の電気泳動移動度と比較することによって決定し た。

因子の成長刺激活性（これは、上述の方法によってＢａ１ｂ／ｃマウス３Ｔ３の 細胞性（ｅｅｌ　１ｕｌａｒ）　Ｄ　Ｎ　Ａに統合（Ｉ　ｎｃｏｒｐｏｒａｔ　 １ｏｎ）された［３Ｈ］−チミジンとして分析された）により測定すると、ＨＢ −ＥＨＭのこの精製型はｐＨ２，５で２時間放置しても安定であり、この９０℃ で５分間加熱しても分解されなかったが、５ｍＭ　ＤＴＴに２時間放置すること により、完全に分解された。活性は、０．１ＭグリシンーＨＣＩ、ｐＨ２，５の ２時間の酸処理後も消失しなかった。

これらの操作のすべてにおいて、タンパク質がガラス管に吸着することによる活 性の消失を防ぐため、シグマコート（Ｓｉｇｍａ　）によってシリコンコーティ ングた試験管を使用した。処理培地試料８Ｌの精製の一例を次の表に要約する。

Ｕ−９３７処理培地からのＨＢ−ＥＨＭの精製精製ステップ　タンパク質　最大 刺激３　精製度　収率０（μｇ）　（ｎｇ／ｍｌ）　（倍）　（％）Ｂ　ｉ　ｏ −Ｒｅｘ７０　４５０，０００ｂ３．７５０　１　１００％銅キレートセファロ ース　９０．０００ｂ３，７５０　１　２３％ＴＳＫ−ヘパリン　２９５’　１ ６．４　２２９　１８％Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣ１，２０，５７，５００１５％ａ、 最大刺激は、平滑筋細胞ＤＮＡへの［３Ｈ］−チミジンの取り込みによって定し た。

１％ ｂ、タンパク質はＡ　−１４μｇを用いて推定した。

仁収率は、第１の部分精製フラクションの総活性に基づく。

ｄ、タンパク質はＡ１％２１４−１４０μｇを用いて推定した。

ｅ、タンパク質はアミノ酸分析により推定した。

タンパク質のこの精製型は、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス３Ｔ３繊維芽細胞の 増殖を濃度５０ｐｇ／ｍ１〜１，０００ｐｇ／ｍｌで刺激し、ウシ大動脈平滑筋 細胞の増殖を濃度５０ｐｇ／ｍ１〜５００ｐｇ／ｍｌで刺激し、ヒトケラチノサ イトの増殖を濃度１１００ｐ／ｍ１〜２ｎｇ／ｍｌで刺激した。しかしながら、 この因子は、ウシ毛細管内皮細胞の増殖は刺激しなかった。

タンパク質のこの精製型のアミノ酸配列を決定するため、処理培地２ＯＬから、 陽イオン交換クロマトグラフィ、銅アフィニティクロマトグラフィ、ヘパリンー アフィニティクロマトグラフィ、２サイクルのＣ４−逆相ＨＰＬＣにより得られ タンパク質の約１．７μｇをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ気相プロチ ンシーケンサに注入した。２０回のＥｄｍａｎ分解を行い、アミノ酸誘導体の同 定を自動オンラインＰＴＨアミノ酸分析計（モデル４７７　Ａ、　Ａｐｐｌ　ｌ ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ■Ｓ、カリフォルニア州フォスターシティ−）を使用し て行った。アミノ末端残基の収量は１７７ｐｍｏ　ｌであった。サイクル１〜２ ０のアミノ酸に対してなされたアサインは次のとおりである（配列番号：３）。

Ｖａ　ｌ　−Ｘ−Ｌｅｕ−３ｅ　ｒ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ −Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇ ｌｙ−ＬｙｓｏＸは未知または疑問の残るものである。

Ｕ〜９３７処理媒体（上述のもの）からのＨＢ−ＥＨ〜１の次の精製においては 、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製段階で異なるＣ　カラムを用い、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３　［ ３Ｈ］一チミジ〉取り込み測定は、各フラクションから１０倍回のタンパク質を 用いて実施した。この方法を用い、成長因子活性の４つの主ピークが、１５９６ 〜４０％アセトニトリル（責度勾配開始後３Ｂ、３４．５．４３．３．４７．８ 分でカラムから溶出された。非還元性１５９６ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル において、３３．４３．３．４７．８分の活性ピークは、それぞれ、みかけ分子 量２２．２３．２２．５ｋＤに一致した。３４５分のピークは時に２つのタンパ ク質バンドを示し、一方はみかけ分子ｊｉ２２ｋＤｓ他方はみかけ分子量１９ｋ Ｄであり、他の試料においては、みかけ分子Ｒ１９ｋＤバンドのバンドのみが検 出された。成長因子活性の５番目のピークも、いくつかの試料において検出され た。このピークは非還元性ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル電気泳動の条件下で は、３４゜５分と４３．３分のピークの間に溶出し、みかけ分子量２４ｋＤのタ ンパク質種を含んでいた。

これらの精製においてＨＢ−ＥＨＭの最も優勢な型は一般に、３３分で溶出する 型だった。

追加の成長因子種の比活性を測定した。すべて、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞におけ るＤＮＡ合成を刺激する能力においてほぼ同等であり、ＥＧＦ受容体への結合に ついて１２５１−　Ｅ　Ｇ　Ｆと競合することが明らかとなった。これらの結果 は、異る分離ピークに含まれる成長因子種はすべてＨＢ−ＥＨＭの型に一致する ことを示唆した。

次いで、前述の成長因子活性の様々なピークのいくつかを示すＨＢ−ＥＨＭの５ つの追加サンプルにつき、アミノ末端配列の決定を実施した。前述のように、５ ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析により、これらのサンプルはみがけ 分子量か異なるタンパク質種を含むことか明らかとなった。具体的には、サンプ ル＃１（すなわち、３４．５分と４３３分のピークの間に溶出するピーク）はみ かけ分子ｊ１２４ｋＤの種を含み、サンプル＃２（すなわち、３３分のピーク） はみかけ分子量２２ｋＤの種を含み、サンプル＃３（すなわち、３４．５分のピ ーク）はみかけ分子量２２ｋＤの種とみかけ分子ｊｌ１９ｋＤの種の混合物を含 み、サンプル＃４（すなわち、３４．５分のピークの独立した単離）は、主とし てみかけ分子ｆｆ１１９ｋＤの種から成り、サンプル＃５（すなわち、４３．３ 分のピーク）はみかけ分子量２３ｋＤの種を含む。サンプル１のアミノ末端の配 列決定を達成する試みか不成功であったことより、このタンパク質はアミノ末端 が妨害されていることを示唆している。サンプル２．３．４．５について得られ たアミノ末端のアミノ酸配列は以下の通りである。

サンプル＃２ （配列番号：４）： ＲＶＸＬＳＳＫＰＱＡＬＡＸＰＮＫＥＥＨＧＫＲＫＫＫＧＫＧＬＧＫＫＲＤＰＸ ＬＲＫＹＫＤＦＸＩＨＧＥＸＸＹ サンプル＃３ （配列番号・５）：　ＲＶＸＬＳＳＫＰＱＡＬＡＸＰＮＫＥＥ　（サンプルの約 ７５％） （配列番号：６）：　５ＳＫＰＱＡＬＡＸＸＮＸＥＥ　（サンプルの約５％）（ 配列番号：　７）：ＡＬＡＸＸＮＫＸＥＸＧＫＲ（サンプルの約２０％）サンプ ル＃４ （配列番号：８）：ＲＶＸＬＳＳＫＰＱＡＬＡＸＰＮＫＥＥＨＧＫＲＫＫ　（サ ンプルの約６５％） （配列番号：　９）：　ＸＸＫＰＱＡＬＡＸＸＮＸＥ　（サンプルの約５％）（ 配列番号：　１０）：ＡＬＡＸＰＮＫＥＥＸＧＫＲ（サンプルの約３０％）サン プル＃５ これらのアミノ末端配列決定の結果は、前述の例で概説した精製スキームにより 単離されたＨＢ−ＥＨＭが、アミノ末端が異なる複数の型を有することを示唆し た。これらは、最初に同定されたアミノ末端（配列番号二３参照）（ＶＸＬＳＳ ＫＰＱＡＬＡ、、、’）を有する型と、最初の末端にアミノ酸が１個追加された 末端（配列番号：４７照）（ＲＶＸＬＳＳＫＰＱ、、、）を有する型と、最初の 末端にアミノ酸が１１個追加された末端（配列番号：１６参照）を有する型と、 最初の型の最初の残基３個が欠如した型（配列番号：６参照）（ＳＳＫＰＱＡＬ Ａ、　、　、　）と、最初の型の最初の残基８個が欠如した型（配列番号＝７及 び１０参照）（ＡＬＡＸＰＮＫＥ、、、　）と、を含む。さらに、最大（２４ｋ Ｄ）の種がアミノ末端で妨害されるという知見は、配列ＤＬＱＥＡＤＬＤＬＬＲ Ｖ　（配列番号：１６参照）からアミノ末端に延長したＨＢ−ＥＨＭＯ型が存在 することを示唆する。

内部アミノ酸配列情報を得るため、サンプル２．３．４の一部を混合し、配列決 定のためにペプチドフラグメントを生成するため、トリプシン分解に供した。

この解析のため、混合したサンプルを乾燥し、２００μｍの６Ｍグアニジン−Ｈ Ｃｌｌｏ、５Ｍ１−リス−ＨＣ１，ｐＨ８，０／１ｍＭＥＤＴＡ／１０ｍＭジチ オスレイトール中で再懸濁し、３７℃で６０分間インキュベーションした。ヨー ドアセトアミド（０，９２５ｍｇ）を最終濃度２５ｍＭで添加し、溶液を室温で ３０分間インキュベーションした。これらの２つの処理は、タンパク質のシステ ィン残基を還元及びアルキル化するために実施した。リジン残基を修飾するため 、無水コハク酸（アセトニトリル１ｍｌ中１００ｍｇ）を４つの５μｌアリコー トに添加し、それぞれの添加の間、室温で５分間インキュベーションした。タン パク質の混合物はＣ４−１−逆相ＨＰＬＣカラムを通過させて脱塩し、乾燥し、 １００Ｍｆｔ炭酸アンモニウム２００μｌ中で再懸濁し、トリプシン０．５μｇ により、２５゛Ｃで４時間分解した。トリプシン（０，３μｇ）の第２のアリコ ートを加え、反応を更に２時間２７°Ｃでインキュベーションした。分解生成物 は、Ｃ１８−逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムで分離し、アミノ末端配列 決定に供した。

配列決定の結果は、無水コハク酸処理により、混合ＨＢ−ＥＨＭサンプル中のり ジン残基の部分的な妨害のみを与えることを示唆した。Ｃ，８ＲＰ−ＨＰＬＣカ ラムから採取されたフラクションの多くは、ペプチドフラグメントの混合物を含 んでいた。決定されたアミノ酸配列と、配列番号に登録されたペプチド残基は次 Ｊ　ＹＶＫＥＬＲ１２３〜１２８ ＤＦＣＩＨＧＥＣＫ　１１４〜１２２ Ｓ　ＫＹＫＤＦＣＩＨＧＥＣＫＹＶＫ　１１１〜１２５Ｗ　ＤＦＣＩＨＧＥＣＫ ＹＶＫＥＬＲ１１４〜１２８ＫＹＫＤＦＣＩＨＧＥＣＫＹＶＫＥＬＲ１１１〜１ ２８Ｑ　ＫＹＫＤＦＣＩＨＧＥＣＫ　１１１〜１２２Ｘ　ＫＹＫＤＦＣＩＨＧＥ ＣＫＹＶＫＥＬＲ１１１〜１２８　′Ｔ　ＣＨＧＬＳ　１４３〜１４７ ＫＹＫＤＦＣＩＨＧＥＣＫＹＶＫ　１１１〜１２５追加のアミノ酸配列情報は０ ４カラムから４７．８分に溶出するＨＢ−ＥＨＭ性のピークよりトリプシンフラ グメントを生成し、配列決定することによって得た。４７．８分のピークの全量 約４μｇの物質を乾燥し、１５０μｌの４Ｍグアニジン−ＭＣＩ、Ｏ，１Ｍトリ ス−ＭＣＩ、ｐＨ８，０中で再懸濁した。ジチオスレイトール（Ｄ　Ｔ　Ｔ）を 最終濃度２０ｍＭで添加し、反応を３７°Ｃで６０分間インキュベーションした 。システィンを還元し、次いで固体ヨードアセトアミドを最終濃度２５ｍＭで添 加してアルキル化し、さらに反応混合物を３０分間室温でインキュベーションし た。Ｃｆ１ｌｌ逆相ＨＰＬＣカラム（４，６Ｘ１５０ｍｍ。

Ｖｙｄａｃ；　０．　１％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル１０％〜４０％濃 度勾配）脱塩した後、タンパク質を乾燥し、０．　１Ｍｆｆ１炭酸アンモニウム １５０μｌ中で再懸濁した。トリプシン（０，４ｕ　ｇＳＢｏｅｈｒ＋ｎｇｅｒ 　Ｍａｎｎｈｅｉｓ　）を添加し、反応２７°Ｃで２時間インキュベーションし た。次いで分解生成物を、０．１％トリフルオロ酢酸のア七トニトリル３９６〜 ６３％濃度勾配を用い、Ｃｌ８ＨＰＬＣ（４゜６Ｘ１５０ｍｍ）カラムで分画し た。検知可能な吸収のピークのすべて（検出波長２１４ｎＭ）を採取し、配列解 析に供した。決定されたアミノ酸配列と、配列ＩＤ番号に登録されたペプチド残 基は次のとおりである。

５　ＫＲＤＰＣＬＲ１０４〜１１０ ６　ＲＤＰＣＬＲ１０５〜１１０ ８　ＡＰＳＣＩＣＨＰＧＹＨＧＥ、、、　１２９〜１４１１０ＤＦＣＩＨＧＥＣ Ｋ１１４〜１２２１１　ＫＹＫＤＦＣｌ、、、　１１１〜１１７１２　ＹＫＤＦ ＣＩＨＧＥＣＫ　１１２〜１２２１４　ＣＨＧＬＳＬ、、、　１４３〜１４８１ ７　ＤＬＱＥＡＤＬＤＬＬＸＶ、、、　６３〜７４１８　ＤＬＱＥＡＤＬＤＬ、 、、　６３〜７１点は、ペプチド配列が完全には決定できなかったことを示して いる。

得られた最アミノ末端フラグメントは、アスパラギン酸残基６３を開始点とする が、この残基は潜在的なトリプシン開裂部位（すなわち、６２番のアルギニン残 基とのカルボキシ末端）の直後にあるため、このデータから残基６３が必ずＨＢ −ＥＨＭの絶対的なアミノ末端を示しているとは結論できなかった。得られたト リプシンフラグメントの最カルボキシ末端は、少なくとも予測した前駆体の残基 １４８　（Ｌｅｕ）まで伸びていた。したがって、トリプシンフラグメント配列 は、ＨＢ−ＥＨＭタンパク質の成熟型が少なくとも８６個のアミノ酸まで延長し て存在することを示している。

Ｕ−９３７細胞の処理培地の優勢型であり、したがって、構造解析に最も利用で きる、ＨＢ−ＥＨＭのアミノ末端配列ＲＶＸＬＳＳＫＰＱＡＬＡＸＰＮＫＥＥＨ ＧＫＲＫＫ　（すなわち、３３分のピークに含まれる型）の解析について、さら に検討した。ＨＢ−ＥＧＦとＥＦＧの等電点をクロマトフオーカシングによって 決定した（Ｆａｇｅｒｓｔａｉ　ｅｔ　ａｌ、、　２６６　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａ ｔｏｇｒ、　５２３．１９８３に記載されている一般的な方法による）。簡単に 説明すると、ＨＢ−ＥＨＭの３３分のピーク型（前述のもの）１００ｎｇを、２ ５ｍＭエタノールアミン−酢酸緩衝液、ｐＨ９゜４で平衡化したＭｏｎｏＰカラ ムに供した。カラムは本緩衝液で２０分間、次で０．ＩＸ　Ｐｏ１ｙｂｕｆｆｅ ｒ　９６−酢酸、ｐＨ６，０（Ｐｈａｒｍａｃｌａ　）で分間、流速毎分１ｍｌ で洗浄した。比較のため、ヒト組替え型Ｅ　Ｇ　Ｆ　（Ｃｏｌ　１ａｂｏｒａｔ ｌｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　７サチニーセソツ州Ｂｅｄｆｏｒｄ　）の等電点 も決定した。ＥＧＦ】Ｏｎｇを、２５ｍＭイミダゾール−ＭＣＩ緩衝液、ｐＨ７ ，４で平衡化したＭ。

ｎｏ　Ｐカラムに供した。カラムは本緩衝液で２０分間、次いで０．１２５Ｘｏ １ｙｂｕｆ　ｆｅｒ　７４−ＨＣＩ、ｐＨ４，０（Ｐｈａｒｓａｃ４ａ）で４０ 分間、流毎分１ｍｌで洗浄した。１ｍｌのフラクションを採取し、各フラクショ ンの５μｍにつき、成長因子活性を測定した。ＨＢ−ＥＨＭの３３分のピークの 型のＰＩは、５．３〜５．５のＥＧＦのＰＩに対し、７，２と７．８の間である ことが明らかとなった。

ＨＢ−ＥＨＭは翻訳後修飾を受けていることもある。Ｅ、ｃｏｌ［で生成された 組え型ＨＢ−ＥＨＭは約５〜６ｋＤａであり、１５％ポリアクリルアミド／ＳＤ Ｓゲル電気泳動によって決定した元のＨＢ−ＥＨＭより低く、タンパク質の配列 決定では明らかとならなかったヌクレオチド配列より予測される２つのスレオニ ン残基があった（これらのスレオニン残基は、翻訳後修飾を受けている可能性を 示−ＨＢ−ＨＭ　（すなわち、前述の３３分のピーク）を合成し、エンド−Ｎ− アセチルガラクトサミニダーゼ（０−グリカナーゼ）で処理し、〇−結合グリコ シル化の存在について試験した。

ヨードビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を使用し、１２５＾ ｎａ＋ｙｔｔｃａｔ　Ｂｌｏｃｈｅｔ　４２７．１９８２に記載された方法によ って、ＨＢ−ＥＨＭ２ｔ、ｔｇをＮａ１２５１　（２００μＣｉ／２．ｃｚ　１ 　；　Ｉ　ＣＮ、カリフォルニア州Ｃｏ５ｔａ　Ｍｅｓａ）で放射性同位元素標 識した。簡単に説明すると、ヨードビーズを５０　ｍ　Ｍ　トリス−ＨＣｌ　（ ｐＨ７，４）で洗浄し、乾燥し、５０ｍＭ）リス−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４）　２ ００μｍと２００μＣ１１２５，を含むマイクロフユージ管に加えた。５分間イ ンキュベーションした後、ＨＢ−ＥＨＭ　（５０μｌトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７， ４中２μｇ）を加えた。放射性ヨウ素化時間１５分の後、反応混合物を、５０ｍ Ｍトリス−ＨＣ１（ｐＨ７，４）　、０．５％ＢＳＡ、２００ｍＭ　ＮａＣ１， １０ｍＭ　Ｋｌ平衡化した小型のヘパリン−セファロースカラム（５０μｍ）に 供した。

カラムを本緩衝液で十分に洗浄し、　Ｉ−ＨＢ−ＥＨＭを２Ｍ　ＮａＣ１を含む 平衡緩衝液で溶出した。１２５１−ＨＢ−ＥＨＭの比活性は２２，５００ＣＰＭ ／ｎｇあった。１２５１−ＨＢ−ＥＨＭから〇−−合オリゴ糖鎖を除去するため 、１２５１ＨＢ−ＥＨＭ　（５０ｍＭカコジル酸ナトリウム、ｐＨ６，ｏ、２５ ｍＭＣａ　Ｃ１２，０，１％ＳＤＳ及び１０ｍＭ　ＤＴＴの１０μｍ中０．５ｎ ｇ）を５分間煮沸した。反応混合物１％トリトンＸ−１００と２ｍＭフッ化フェ ニルメチルスルホニル（Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｆ　；　ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌ 　（’ｏｎｙｌｆＩｕｏｒｉｄｅ）に調整し、サンプルをまずノイラミニダーゼ （０，０１単位、Ｃａｌｂｊｏｃｈｅｍ）により３７”Ｃで６０分間、次いでエ ンド−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（０，２５ｍ単位、Ｇｅｎｚ）’１１ ３　、マチューセッツ州ケンブリッジ）により３７°Ｃで終夜分解した。サンプ ルはＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。ポリアクリル アミドゲルは乾燥し、Ｋｏｄａｋ　Ｘ−Ｏｍａｔオートラジオグラフィフィルム に一７０℃で１２時間露光した。

０−グリカナーゼによる処理により、ＨＢ−ＥＨＭのみかけ分子量は１８〜２０ ｋＤａから約１４〜１６ｋＤａ　（ポリアクリルアミドゲル電気泳動より決定） に低下し、本ポリペプチドが〇−結結合グリコシルトよってのみ修飾されている ことが示唆された。

クローニング ＨＢ−ＥＨＭをコードするクローンを単離するために、上述のＨＢ−ＥＨＭアミ ノ酸配列配列列番号、３・ＶＸＬＳＳＫＰＱＡＬＡＸＰＮＫＥＥＨＧＫＩに基づ くオリゴヌクレオチドプローブを用いて、ヒト細網肉腫細胞系Ｕ−９３７のｍＲ ｓ　、Ａから構築したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。Ｃ１ｏｎｔ ｅｅｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、　ＧＡ）から購入し たこのライブラリーは、５０　ｎｇ／ｍｌのｐｈｏｒｂｏｌ　ｍｙｒｉｓｔａＬ ｅ　ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ）を添加することにより３．５日間分化させたＵ− ９３７細胞由来のｍＲＮＡを用いて作製された；ｍＲＮＡから合成されたＣＤＮ Ａは、クローニングベクターλｇＬ１０のＥｃｏＲＩ部位にクローニングされた 。

独立した組み換え体の数は１．４Ｘ１０６個と報告された。ライブラリーの一定 部分を宿主細胞［すなわち、大腸菌株ＮＭ５３８、ｈｓｄＲ（ｒ、　−１１）　 ５ｕｐＦ（ＰｒｌＳＣｈａｕｆ　Ｑｔ　ａｌ、、　１７０ス、ｈ／、ｉ１０／、 　１１２７．１９８３．参考文献として引用）に導入し、その結果得られたプラ ークをｔ（ｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブレン（Ａａｅｒｓｈａｓ　Ｃｏｒｐ ｏｒａｔｉｏｎ、　ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ）に固定化し 、元来ＨＢ−ＥＨＭに由来するアミノ末端アミノ酸配列に基づく合成オリゴヌク レオチドをプローブに用いて標準的な方法によりスクリーニングした。このプロ ーブは４５残基の“コドン選択”オリゴヌクレオチドであり、ＨＢ−ＥＨＭ遺伝 子中、アミノ酸６〜２０をコードするコドンの各々が、すでに報文及びデータベ ースにおいて報告されているヒト遺伝子（インターフェロン及びコラーゲンを除 く）において、そのアミノ酸に最も頻繁に使用されているコドンに対応すると想 定して作製した（プローブをデザインする際使用したコドン頻度表は、Ｄｒ、　 Ｂａｒｒｙ　ＧｒｅｅｎｂｅｒｇによりＣａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　ＣＡ、において作 成された）。プロリン及びグリシンについては、プローブに、可能性のある２つ のコドンを取り入れ、正しい選択コドンが存在する確率を高めた。さらに、哺乳 類遺伝子において不都合を生じることが多いジヌクレオチド配列ＣｐＧを排除す るために、１８番目のヒスチジンコドンについては、より開度の高いＣＡＣの代 わりにＣＡＴを使用した（例えば、Ｂｉｒｄ、　８　１ｔｔｃｈｒ／ｃｌｃＭｓ ｌｔｙｓ、　１４９９．１９８０参照）。推定コドン領域の逆鎖として合成され た８通りを有するプローブ（プローブ４９５５）の配列（配列番号：１１）は以 下の通りであるニ プローブ４９５５　： Ｕ−９３７ｃＤＮＡライブラリーフイルタをスクリーニングするにあたり、プロ ーブ４９５５をγ　、３２ＰコーＡＴＰ　（Ａａｅｒｓｈａｓ　Ｃｏｒｐｏｒａ ｔｉｏｎ、　ＡｒｌｌＡｒ１１ｎ　ＨｅＩｇｈｔｓ、ＩＬ）により５゛末端標識 した。プローブの放射標識及びフィルタハイブリダイゼーションは、標準的な技 術により行なった：ハイブリダイゼーション条−件には、プローブー１．７Ｘ１ ０８ｃｐｍ、ハイブリダイゼーション温度−４２℃、／１イブリダイゼーション 混合液（２０％ホルムアミド、６ＸＳＳＣ，５０ｍＭリン酸ナトリウム　ｐＨ６ ，８，１００μｇ／ｍｌオートクレーブ済みＤＮＡ。

及び５　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液）−２００ｍｌが含まれる。−晩ハイブリ ダイゼーションを行なった後、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含 有するｌＸ５ＳＣを用いてフィルタを軽く３回すすいだ。次いで、フィルタを１ ｘＳＳＣ１０゜１％ＳＤＳ中で３０分間室温で振盪して２回洗浄した。弱くハイ ブリダイズしている分子を除去するために、４３〜４６℃の振盪恒温槽内で１ｘ ＳＳＣ１０，１％ＳＤＳを用いてフィルタを洗浄した。次いで、フィルタを一７ ０℃以下において、２枚の増感スクリーンに挟まれたＸ線フィルムに露光した。

１６個の強くハイブリダイズするプラークが検出され、これらを標準的な技術に より単離した。これらプラークのいくつかから、Ｓａｇｂｒｏｏｋらの方法（ｋ ｒｈｙｃｖ／、ｙｒ　ｌ’１０ｊｊｐｚ：　／／　１．ｔｊｏｙｔｏｒｙ　ｈｊ ｗ／、５ｅｃｏｎｄ　ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ秩 @Ｌａｂｏｒ ａｉｏｒ＞’　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ 、１９１１９　）によりファージＤＮＡを精製した；ＥｃｏＲｒによる制限酵素 分解解析により、単離された種々のファージは１゜ｌｋｂ〜３ｋｂの範囲の大き さのｃＤＮＡを有することが示された。

これらファージの一つ、λＵ２の挿入物を、全塩基配列解析に供するため選択し た。このｃＤＮＡ挿入物を、適切に消化したＭ１３ｍｐファージに標準的な技術 により連結し、Ｓａｎｇｅｒ　ｄｌｄｅｏｘｙ法（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、 、　１４３）、　Ｎｏ！、　ｌｊｏ／、　１６１゜１９８０）を用いて塩基配列 を決定した。この配列を図３に示す。

図３（配列番号＝１）において、塩基４８１−５４０は、先に決定されたＨＢ− ＥＨＭ７ミノ末端配列［配列番号：　３　：　ＶＸＬＳＳＫＰＱＡＬＡＸＰＮＫ ＥＥＨＧＫＩと一致するアミノ酸配列をコードしている。塩基配列から２番目及 び１２番目のアミノ酸はスレオニン残基であると推定されるが、これらは標準的 な蛋白Ｗ配列自動解析技術によって解析し、たいずれのＨＢ−ＥＨＭ標品におい ても、明確な残基として決定されなかった。このため、当初アミノ酸配列決定を 行なったＨＢ−ＥＨＭ型における２番目及び１２番目に対応するスレオニンは、 成熟ＨＢ　−Ｅ　ＨＭにおいては、恐らくＯ−グリコジル結合により修飾されて いる可能性がある。

ＨＢ−ＥＨＭのコーディング領域は、塩基７３−７５及び塩基８８６−８８８の ＴＧＡ終止コドンの間のオーブンリーディングフレーム中に存在する（図３、配 列番号：１）。このオーブンリーディングフレーム中、塩基２６２−２６４のＡ ＴＧ　（メチオニン）コドンが翻訳開始部位を示している可能性が最も高い。な ぜなら、このメチオニンは、５′から塩基４８１−４８３　（ＨＢ−ＥＨＭにつ いて当初決定されたアミノ末端配列の１番目のアミノ酸であるバリンに対するコ ドン）までの配列中唯一のメチオニンであるからである。このＡＴＧ前後にある 塩基２５３から２６５までの配列（ＴＧＣＧＧＧＡＣＣムエＧＡ）は、を椎動物 の翻訳開始部位に対するコンセンサス配列（配列番号：１２）［（ＧＣＣ）ＧＣ ＣＡ／Ｇ　ＣＣＡ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　；　Ｋｏｚａｋ、　１５　ｔＶｔｔｃ／、　Ｉ ｃｊｄｓ、　ｌｅｓ、　８１２５．１９８７］と相同性があり、特にＡＴＧから −３の位置にあるＡ残基がよく保存されている。さらに、このＡＴＧの３゛直後 にコードされている、疎水性アミノ酸と推定される領域は、ＨＢ−ＥＨＭのよう な分泌蛋白質の初期翻訳産物のアミノ末端に見られる分泌シグナル配列を示唆し ている（ｖｏｎ　）Ｉｅｉｊｎｅ、　１３３　！ｔｉｒ、　、／、　１ｌｏｃ／ ｍ、　１７．１９８３　）。

このように、成熟１（Ｂ−ＥＨＭは、λＵ２　ＨＢ−ＥＨＭ　ｃＤＮＡにおいて 塩基２６２−８８５によりコードされた２０８アミノ酸からなる前駆体の一部分 として合成されると思われる（図３、配列番号＝１）。

ＨＢ−ＥＨＭの種々の精製標品から決定されたアミノ末端は、図３（配列番号； １）に示した推定翻訳産物においてアミノ酸６３．７３．７４．７７、及び８２ に位置している。これらの部位の間に位置するアミノ酸残基（すなわち残基２〇 −６２）及び前駆体蛋白質のアミノ末端における推定疎水性分泌シグナルは“プ ロ°配列を示し、翻訳終了後、成熟ＨＢ−ＥＨＭの形成中に切断されると考えら れる。しかし、単離された中で最も大きい型の蛋白質（２４ｋＤ）のアミノ末端 は、ブロック修飾を受けているため未だ決定されていない；この型がＨＢ−ＥＨ Ｍ派生物であるとすると、これは１．残基１９〜６３の間に位置するアミノ酸の 幾つかを有することによりアミノ末端側か延長されているものと考えられる。し かし、種々の型のＨＢ−ＥＨＭにおいて活性の違いは認められていない。

ＦＡＳＴＡプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｌｉｐｓａｎ、　１１５　Ｐ ｒｏｃ、　３７／／、　ｌｃ、ｙｔｌ、　Ｓｃ／、　Ｉｓ／　２４４４．１９８ ８．　Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　ｅｔ　ａｌ、、　１２　ｆｗ／、　Ｉｃｊｔｌｓ　ｉ ｆ’ｅｓ、　３８７．１９８４）を用■■mａ ｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏ ｎ　（ＮＢＲＦ）蛋白質データベースを検索した結果、ＨＢ−ＥＨＭとＥＧＦ／ ＴＧＦ（Ｚ／アンピレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）ファミリーの蛋白質 との相同性が示され、特に、ＨＢ−ＥＨＭが、ＥＧＦ　（配列番号：１４）／Ｔ ＧＦａ　（配列番号：　１５）　／ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ　（配列番号：１ ３）ファミリーのメンバー中に保存されている６つのシスティン残基のすべてを 含んでいるアミノ酸残基１０８と１４３の間（図３、配列番号：１）で顕著であ る（図２）。

１番目から６番目のシスティンの間の領域において、ＨＢ−ＥＨＭは、ヒトＥＧ Ｆの４０％（３７残基中１５残基）、ヒトＴＧＦαの４２％（３６残基中１５残 基）、ヒトアンビレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌ　Ｉｎ）の５３９６（３６残 基中１９残基）の残基を保存している。ファミリーメンバーの幾つかと共通する その他の特徴は、成熟成長因子を分泌するためにアミノ末端及びカルボキシル末 端がプロセスされる膜内外前駆体構造を有することである。図３（配列番号；１ ）に示すＨＢ−ＥＨ〜１の前駆体配列は、アミノ酸１．６１−１８４から成る非 常に疎水性の高い膜内領域を有し、これは、ＥＧＦ／ＴＧＦα／アンビレグリン ファミリーの他のメンバーにおいては膜内外領域と推定される領域と相同性があ る。ＨＢ−ＥＨＭの成熟カルボキシル末端は、アミノ酸残基１４３に位置する保 存システィン残基と残基１６１の疎水性領域開始点の間に存在する。配列決定し た、ＨＢ−ＥＨＭのトリプシン消化断片の一つの配列はＣＨＧＬＳであった（上 記参照）。この配列は、残基１４’３−１４７に対応する（図３、配列番号＝１ 参照）。この断片の配列は１−リブシン消化部位以前で終わっていることから、 この結果は、ある型のＨＢ−ＥＨＭのカルボキシル末端がアミノ酸残基１４７に 位置することと一致する。他の、配列決定したＨＢ−ＥＨＭトリプシン消化断片 の配列はＣＨＧＬＳＬ　（残基１４３−１４８に対応）であった（図３、配列番 号＝１参照）。この配列データは、残基１４８が蛋白質のカルボキシル末端を表 わすことを示すには不十分である。実際、還元型及びカルボキシルメチル化合成 ペプチドを用いた実験により、このトリプシン消化断片が、合成ペプチドＣＨＧ ＬＳＬＰとほぼ同じアセトニトリル濃度（パーセント）でＣ１８逆相ＨＰＬＣカ ラムから溶出されることが示された。これらの結果は、残基１４９もカルボキシ ル末端であること、またはある成熟型ＨＢ−ＥＨＭ上に存在することと一致する 。

他の同等のクローンは、当業者に既知のハイブリダイゼーションスクリーニング 技術により単離することができる。

Ａ−４３１細胞上のＥＧＦ受容体への、ヘパリン結合ＥＧＦ相同性マイトジェン の結合 ＨＢ−ＥＨＭが構造的にはＥＧＦファミリーのメンバーであるため、ＨＢ−ＥＨ Ｍについて、ＥＧＦに見られる生物学的特性、例えばＥＧＦ受容体への結合能、 を試験した。この相互作用を測定するために、競合的結合活性測定（拮抗的結合 活性測定）を以下の通り行なった。［１２５１］　ＥＧＦ　（２ｎｇ、１．２Ｘ １．Ｏ”ｄ　ｐ　ｍ、　Ｃｏｌ　Ｉａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　 Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＨＡ　）を、ｃｅｎｒＩｕｅｎｔ　Ａ　−４３１■ 胞（Ｆａｂｒｉｃａｎｔ　ａｔ　ａｔ、、　７４１’ｒｏｃ、　７’ｉｔ／、　 Ｊｃ、ｇｄ、　、９ｄ、＃、５’、１５Ｂ５．　１９７７　G　Ｈａｉｇｌｅｒ ｅｔ　ａｌ、、　７５　１’ｒＯｅ、　＃／／、　Ｉｅｌｔ／、　Ｓｄ、　ｌ’ ５Ｉ３３Ｌ７．１９７ｇ、　ＡＴ　ＣＣより入手可能、受託番号ＣＲＬ　１５５ ５）を含む２４ウエルプレートに添加した。ついで、ＨＢ−ＥＨＭまたは組み換 えヒトＥＧＦを量を増やしながら添加し、その後の結合活性測定をＳｉｎｇｈの 方法（１４７ｈｔ７．　！ｙｙｏ／、　１３．１９８７．参考文献として引用） 及びＫ１５ｂａｌ　Ｉ　らの方法（７７１１９１０ｃＡ／ｚ力”ｏｐＪ、ｒｓ　 Ｉｃ１ｉ　８２．１９８４．参考文献として引用）に従って行なった。ウシ大動 脈平滑筋細胞（ＢＡＳＭＣ）への［１２５ＢＥＧＦの競合的結合（拮抗的結合） は、ＢＡＳＭＣを使用し、６ウエルプレートにまいたこと以外は上述のＡ−４３ １細胞について行なったのと同様に測定した。

精製ＨＢ−ＥＨＭは、Ａ−４３１細胞及びＳＭＣ上のＥＧＦ受容体に結合するこ とが判明した。ＨＢ−ＥＨＭは、ＥＧＦと同様、Ａ４３１細胞への〔１２５！コ ＥＧＦの結合を本質的に１００％阻害した。ＨＢ−Ｅｌ（Ｍは、ＢＡＳＭＣ上の ＥＧＦ受容体に対して、ＥＧＦよりも強い親和性を有した。ＥＧＦが２９０ｐｇ ／ｍ１（４８ｐＭ）において已２５■］ＥＧＦ結合を５０％阻害したのに対し、 ＨＢ−ＥＨＭは６３ｐｇ／ｍ＋　（２，９ｐＭ）において５０％阻害した。

ＢＡＳＭＣ上のＥＧＦ受容体に対するこのような異なる親和性を反映して、以下 の活性測定により、ＨＢ−ＥＨＭがＥＧＦよりも宵望なりＡ３ＭＣマイトジェン であることが示された。ＢＡＳＭＣを５×１０３細胞／ウエルで、ＤＭＥＭ、１ ０°６Ｔ−ウシ血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００．ｃｚｇ／ｍｌ硫酸ス トレプトマイシンを金白°する２４ウエルプレートにまき、細胞吸着後（例えば −晩培養した後）、培地をＤＭＥＭ、１％子ウシ血清、及び上述のペニシリンと ストレプトマイシンと交換した。ついで、ＨＢ　−Ｅ　ＨＭ、組み換えヒトＥ　 Ｇ　Ｆ　（ＣｒｅａｔｉｖｅＢｌｏｍｏｌｅｅｕｌｅｓ、　ｔｌｏｐｋｉｎｔｏ ｎ、　ＨＡ）　、または組み換えＰ　Ｄ　Ｇ　Ｆ　（Ｃｒｅａｔｉｖｅ　Ｂｊｏ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、　Ｉ（ｏｐｋｉｎｔｏｎ、　ＨＡ）をウェルに添加した。

３日後細胞を計測した。ＢＡＳＭＣ増殖におけるＨＢ−ＥＨ？ｖｌ活性は、ＥＧ ＦのものよりＰＤＧＦのものにより類似していた。１１００ｐ／ｍｌのＨＢ−Ｅ ＨＭ、５００ｐｇ／ｍｌのＰＤＧＦ。

及び４ｎｇ／ｍｌのＥＧＦが、同様にＢＡＳＭＣ増殖を刺激した（すなわち、２ ゜５倍の増加）。

ＥＧＦ受容体への１２５１−ＥＧＦの結合を阻害することに加えて、ＨＢ−ＥＨ Ｍ（すなわち、上述の３３個の小ピークの型）は、ＥＧＦ受容体の自己リン酸化 も標的とした。これは、Ａ−４３１細胞を６ウエルプレートにまき、１０％　ウ シ胎児血清及び抗生物質を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆ’ｉｅｄ 　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　（ＤＭＥＭ）中で培養することにより示され た６　ｃｏｎｒ＋ｕｅｎｔ単層を５ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ　（Ｃｏｌｌａｂｏｒａ ｔｉｖｅ　Ｒｅ５ａｅｒｃｈ、　’Ｗａｌｔｈａｍ、ＨＡ）または５ｎｇ／ｍｌ のＨＢ−ＥＨＭと共に培養した。１５分後、０．４ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　 フｏｏ酸ナトリウム（Ｎａ（Ｉｕｏｒａｔｅ　）　、１０ｍＭ　ピロリン酸ナト リウム及び０．４ｍＭ　オルトバナジン酸ナトリウムを含む冷リン酸緩衝生理食 塩水を用いて細胞を洗浄後、かきとり、１００μｌのＰＩ／ＲＩＰＡ緩衝液［１ ％　Ｎ　Ｐ　−４０＜Ｐｌｅｒｃｅ、　Ｒ。

ｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）　、１％　デオキシコール酸（Ａｌｄｒｉｃｈ、　Ｍｉ ｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗｌ）　、０．　１％ＳＤＳ、１％　アプロチニン（Ｂｏｅ ｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｓ、　Ｉｎｄｌａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ　） 、１、ｍＭ　ＰＭＳＦ　（Ｐｉｅｒｃｅ）　、２ｍＭ　ＥＤＴＡ　（Ｓｉｇｍａ ）　、１０ｍＭ　フａロ酸ナトリウム（ＳＩｇ＊ａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　 Ｎｏ）　、１０ｍＭ　ピロリン酸ナトリウム（Ｂａｋｅｒ、　Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｂｕｒｇ、　ＮＪ　）　、０．４ｍＭ　オルトバナジン酸ナトリウム（Ａｌｄｒ ｉｃｈ）、１０ｍＭ　ヨードアセトアミド（Ａ！ｄｒｌｃｈ　）を含有するリン 酸緩衝生理食塩水コに溶解した。＠以遠心機で５分間遠心した上清の３０μｌを 、ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動（６％ポリアクリルアミドゲル）に より解析した。

ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅ［ｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ、　Ｋｅ ｅｎ、　Ｎｔ＋）に転写後、チロシン残基がリン酸化されたＥＧＦ受容体を、既 知の方法（Ｗａｄａ　ｅｔ　ａｌ、、　６１１”ｅ／／　１３３９、１９９０　 ）に従って、抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ−２０、Ｉ　ＣＮ　Ｂｉｏ膳ｅｄｉｃ ａｌｓ、　Ｃｏ５ｔａ　Ｍｅｓａ、　ＣＡ）を用いたウェスタンプロット解析及 びそれに続くアルカリホスファターゼ−結合ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｐｒｏ ｍｅｇａ、　Ｍａｄｌｓｏｎ、　Ｖｌ）による発色により検出した。リン酸化Ｅ ＧＦ受容体の標準物質はＵＢ　Ｉ　（Ｌａｋｅ　Ｐｌａｓｉｄ。

ＮＹ）から購入した。

ＨＢ−ＥＨＭは、ＥＧＦ受容体標準物質と共に移動する１７０ｋＤａ蛋白質のリ ン酸化を刺激し、この蛋白質は、細胞がＥＧＦにより刺激された場合にもリン酸 化された。

哺乳類発現ベクター ＨＢ−ＥＨＭを暖乳類細胞中で発現するために、ｃＤＮＡクローンλＵ２由来の ＨＢ−ＥＨＭコーディング領域を２つの異なる発現ベクター、ｐＭＴＮ及びｐＡ ＸｎｅｏＲに挿入した。

ベクターｐＭＴＮは、（ｉ）ＳＶ４０のＨｉｎｄｌｌｌ断片（このウィルスのエ ンハンサ領域を存する）、（ｉｉ）ヒトメタロチオネインＩＩＡ遺伝子のブロン 遺伝子の３′非翻訳領域を有する旦ａｍＨＩ一旦ｃｏＲＩ断片（ポリアゾニレ− ジョンシグナルを提供するため）、（Ｖ）バクテリアの複製オリジン及びアンピ シリン耐性遺伝子を提供するため、バクテリアプラスミドｐＵＣ８全体（ポリリ ンカ一部分を除く）を有する互！旦ＲＩ−Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ断片、及び（ｖｉ ）ＳＶ４０の複製オリジンを有し、ネオマイシンとそのアナログ、Ｇ４１８耐性 をコードしている断片、から成っている。まず初めにベクターｐ　Ｍ　Ｔ　ｐ　 ｎ　（Ｇｒｅｅｎｓ２、ベクターｐ〜１Ｔ５Ｖ４０ｐｏ　ｌ　ｙＡ−Ｂａｍを構 築した。ライフ、ベクターｐＳＶ２−ｎ　ｅｏ　（Ｓｏｕｔｌ＋ｅｒｎ　ａｎｄ 　Ｂｅｒｇ、ｌ　、／、Ｎｏ／、Ｉｐｐ／、　乙’ｅｔｙｅ１．　３２７．　１ ９８２D参 考文献として引用）から２つの断片を単離した：ＳＶ４０初期領域プロモータを 含有するＰｖｕ　Ｉ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片：及びネオマイシン耐性の コーディング領域を含有するＨｉｎｄｌｌｌ−ＢａｍＨ［断片。これら２つの断 片を連結し、ついで、フレノウ断片（Ｋｌｅｎｏｗ断片）ＤＮＡポリメラーゼＩ で処理して末端を平滑化した。その結果得られた断片を、Ｈｉｎｄｌｌｌで部分 消化した後フレノウ断片ＤＮＡポリメラーゼ■で処理して末端を平滑化したベク ターｐＭＴＳＳＶ４０ポリＡ−Ｂａｍに連結した。

ベクターｐＡＸｎｅｏＲは；　（１）β−アクチン遺伝子プロモータを有する、 ヒトβ−アクチン遺伝子単離物ｐ１４Ｔβ−１７（Ｌｅａｖｉｔｔ　ｅｔ　ａｔ 、、　４　ｋｙ／、　ｔ’ｅ／／、　ｌ？Ｉｏ／、　１９６１．１９８４．参考 文献として引用＋　Ｎｇ　ａｔ　ａｌ、、　５　、拾／、　ｌ”ｅ／／、　１ｊ ｔｙ／、　Q ７２０、１９８５．参考文献として引用）由来の４．３ｋｂＥｃｏＲＩ−Ａｌｕ ｌ断片；（１１）発現させるコーディング領域を挿入するための短いポリリンカ ー領域；（ｉ　ｔ　１）ＳＶ４０ウィルスの後期領域ボリアデニレーンヨンシグ ナルと同時にｐＢＲ３２２アンピシリン耐性遺伝子とバクテリアの複製開始点Ｃ ｏｒｉ領域）を含有する、プラスミドｐ　ｃ　Ｄ　Ｖ　１　（Ｏｋａｙａｍａ　 ａｎｄ　Ｂｅｒｇ）由来の２．３ｋｂ断片；及び（ｉｖ）バクテリアのネオマイ シン耐性コーディング領域に連結したＳＶ４０初期プロモータ領域（及び複製開 始点）を含有する、ｐ　５Ｖ２−ｎ　ｅ　ｏ　（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ａｎｄ　Ｂ ｅｒｇ、　１）、１０人１１１１１／、　ｆｅｉｅｌ、３２７．１９１１２．参 考文献として引用）由来の３．４ｋｂのＰｖｕ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片、から 成っている。

発現ベクターに挿入するために、クローンλＵ２中のｃＤＮＡ挿入物をＴａｑＩ 及びＸｍｎ１で消化して塩基２１９から９７０（配列番号＝１）を有する断片を 切り出し、Ｋｌｅｎｏｗ断片ＤＮＡポリメラーゼＩで処理して末端を平滑化した 。その結果得られた断片に、ＢａｍＨＩリンカ−を連結した。ＢａｍＨＩ消化後 、連結産物をアガロースゲルにより分離し、ＨＢ−ＥＨＭコーディング領域を有 する、リンカ−の（＝１加した７６１ｂｐ断片（配列番号：１）を単離した。こ の断片を、ベクターｐ　Ｍ　Ｔ　Ｎ及びｐＡＸｎｅｏＲのＢａｍＨＩ部位に挿入 して（ＨＢ−ＥＨＭコーディング領域が、メタロチオネインまたはアクチンプロ モータと機能的に連結する挿入方向で）、プラスミドｐＭＴｌｌ−ＨＢＥＧＦ及 びｐＡＸ−ＨＢＥＧＦを作製した。ｐＭＴＮ−ＨＢＥＧＦまたはｐＡＸ−ＨＢＥ ＧＦのいずれかをＢａｍＨＩで消化し、７６１ｂｐ断片を単離することにより、 これらのプラスミドからＨＢ−ＥＨＭコーディング領域を有するＤＮＡ断片を単 離することができる。この断片は、いかなる適当な発現ベクターにも挿入するこ とができる。

ｃＤＮＡ発現プラスミド、ｐＭＴＮ−ＨＢＥＧＦ及びｐＡＸ−ＨＢＥＧＦはＡＭ ｅｒｌｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏｌ　１ｅｃｔｉｏｎに寄託され ており、それぞれ受託番号ＡＴＣＣＮｏ、４０９００及びＮｏ、４０８９９を受 けている。出願人の譲渡人であるＴｈｅ　Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ　）４ｅｄｉｃ ａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、これ以降、特許権の存続期間 が終了する前にこれらが死亡した場合、新たなものに置き換える責任を有するこ とを承認しており、また、寄託物が一般に提供可能となる時をＡＴＣＣに通知す る責任を有することも承認している。その時までは、寄託物は３７　ＣＦＲ９１ ，１４及び３５　ＵＳＣ８１１２により特許庁長官に提供され得る。

ＨＢ−ＥＨＭの組み換え発現に用いた宿主細胞は、Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａ＊５ｔ ｅｒ　０ｖａｒｙ（ＣＨＯ−Ｋｌ）細胞であり、これはＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙ ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（受託番号ＣＣＬ　６１）から 入手した。これらの細胞は３７℃、５％ＣＯ２存在下湿度を与えた培養器内で、 ＣＨＯ増殖培地［１０％　ウシ胎児血清、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、５０ｕｎｉ ｔｓ／ｍｌ　ペニシリン、及び５０ｚｚｇ／ｍｌ　ストレプトマイシンを含有す る、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｌｕｓ 　（ＤＭＥＭ　−２／培養皿の濃度でｉｏａｍ組織培養皿にまいた。Ｗｌｇｌｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ、（１８ｆｆｙ／／７７７゜１９７９　）が記載したリン酸カル シウム沈殿法により、プラスミドＤＮＡ　（２０μｇ）をＣＨＯ細胞に導入した 。ＤＮＡ添加後４〜５時間後に、各培養皿から培地を吸引し、１５％グリセロー ルを含むＨＥＰＥＳ緩衝生理緩衝生理食塩水３公ｌ処理することにより細胞に° ショック″を与えた。グリセロールを除去し、各培養皿中の細胞を無血清培地（ １０％　ウシ胎児血清を含有しないＣＨＯ＃ｊ殖培地）８ｍｌで洗浄し、ついで 、各培養皿にＣＨＯ増殖培地を８ｍｌずつ添加した。細胞を２４時間培養した。

“−・過性゛発現実験ては、２４時間の培養後、培地を５ｍｌの無血清培地と置 換した。ｐＭＴＮ−ＨＢＥＧＦまたは元のｐＭＴＮプラスミドでトランスフェク トされた細胞の場合は、無血清培地に５０μＭ　Ｚ　ｎ　Ｓ　Ｏ４及び１μＭ　 ｄｅｘａｔｒｅｔｈａｓｏｎｅを添加した。細胞を３６時間培養した。ついで、 培地を回収し、上述の通りＢａ１ｂ／ｃマウス３Ｔ３細胞中で［３Ｈ］チミジン 取り込み活性測定を行なうことによりＨＢ−ＥＨＭの存在をＭｊ定した。予備実 験では、ｐＡＸ−ＨＢＥＧＦにより一時的にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ ｌ細胞由来の調製培地は、２０Ｕ／ｍｌの刺激活性を示した；コントロールプラ スミドｐＡＸｎｅｏＲによりトランスフェクトされた細胞はＩＯＵ／ｍ＋の活性 を示した。

トランスフェクトされた細胞の安定したプールを選択するために、２４時間の培 養期間後、０４１８　（Ｇｃｎｅｔｉｃ［ｎ；　ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ　ｌ５ ｌａｎｄ、　ＮＹ）を培養皿に添加した。Ｇ４１８の最終濃度は１．Ｏｍｇ／ｍ ｌである。約２週間にわたって、Ｇ４１８抵抗性細胞の選択を行なった。必要に 応じて細胞を分割し、Ｇ４１８を含むＣＨＯ増殖培地を再度添加した。安定プー ルの確立後、細胞の培地を無血清培地（ｐＭＴＮ及びｐ　Ｍ　Ｔ　Ｎ　−ＨＢ　 Ｅ　Ｇ　Ｆでトランスフェクトされた細胞の場合は、行なうことによりＨＢ−Ｅ ＨＭ活性を測定した。

原核生物発現ベクター グリコジル化されていないＨＢ−ＥＨＭを生産したい場合、成熟ＨＢ−ＥＨＭを コードするＤＮＡ配列を、原核生物宿主細胞中で発現させることができる。原核 生物宿主中での発現を可能にする制御シグナルに機能的に連結したベクターに、 成熟ＨＢ−ＥＨＭをフードするＤＮＡを導入する。必要ならば、発現された蛋白 質を宿主細胞のペリプラズムに分泌させる既知のシグナル配列をコーディング領 域の５゛末端に付加し、これにより蛋白質の回収を容易にすることができる。最 も頻繁に使用される原核生物は、大腸菌の種々の株である；しかじ、他の細菌株 も使用することができる。複製開始点、選択マーカー、及び細菌宿主と適合する 種由来の制御配列を有するプラスミドベクターを使用する。例えば、大腸菌はｐ ＢＲ３２２（このプラスミドは、サルモネラ種から単離された２つ及び大腸菌か ら単離された１つの計３つの自然発生プラスミド由来の断片を使用してＢｏｌ［ ｖａｒｅｔ　ａｔ、　（２１ｕｓｔｙθ９５．１９７７　）により構築された） 派生物により形質転換することができる。ｐＢＲ３２２は、アンピンリンとテト ラサイクリン耐性の遺伝子を有しており、これにより、目的の発現ベクターを構 築する際保存することも破壊することもできる複数の選択マーカーが提供される 。ここでは、通常使用される原核生物制御配列（“制御因子°とも呼ばれる）を 、リボゾーム結合部位配列とともに、時としてオペレータを含む転写開始のプロ モータを有するものと定義する。

蛋白質の発現を促進するために通常使用されるプロモータには、ベーターラクタ マーゼ（ベニシリナーゼ）、ラクトース（ｌ　ａ　ｃ　）　（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９８　Ａｂ１ｗｅ１０５Ｂ、　１９７７　）　、トリプトファン （ｔｒｐ）プロモータシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　８　、多部 ／、Ｉｃｅｓ　、ｆ’ｅｓ、　４０５７．１９８０　）　、及びラムダ白米ＰＬ プロモータ及びＮ−遺伝子リボゾーム結合部位（ＳｈＬｓａｔａｋｅ　ｅｔ　ａ ｌ、＋　２９２　、ｆｒ＃ｒθ１２８．１９８１）が含まれる。

大腸菌におけるＨＢ−ＥＨＭの効果的な生産は２通りの方法で行なった；改変型 クロラムフニニコールトランスフエラーゼ（ＣＡＴ）との融合蛋白質としてプラ スミドｐＮＡ２８から発現させる場合と、アミノ末端にメチオニン残基を有する ＨＢ−ＥＨＭ蛋白質（Ｍｅｔ−ＨＢ−ＥＨＭ）としてプラスミドｐＮＡ５１から 発現させる場合である。ベクターｐＮＡ２８を使用して発現させた場合、融合蛋 白質をシアノジエンブロマイドで切断して目的のＨＢ−ＥＨＭ生産物を切り出し た。ベクターｐＮＡ５１を使用して発現させた場合、Ｍｅｔ−ＨＢ−ＥＨＭはそ れ以上の切断処理を行なわな（でも、また、シアノジエンブロマイド処理によリ アミノ末端のメチオニンを除去しても使用することができる。ｐＮＡ２８及びｐ ＮＡ５１の宿主として、種々の大腸菌を使用することができる；好適な宿主とし て、ｐＮＡ２８には大腸菌株Ｗ３１１Ｃ１（＾ｗｅｒｒｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ受託番号２７３２５　；ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋ ｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　）　、　ｐＮＡ５１には大腸菌株Ｂ（Ａｇ＋ｅｒｉｃａｎ 　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏｌ　Ｉｅｃｔｉｏｎ受託番号２３８４８　； ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　）などがある。

ベクターｐＮＡ２８は、（１）プラスミドｐＢＲ３２２由来の、大腸菌内で機能 する複製開始Ａ：　（ｉ　１）ｐＢＲ３２２由来の、選択可能なテトラサイクソ ン耐性遺伝子；（ｉｉｉ）大腸Ｖ１１工」−オペロンの転写終始領域（上二旦プ ロモータ領域への転写のリードスルーを阻止するためテトラサイクリン耐性遺伝 子の最後に位置している）；　（ｉｖ）ＣＡＴ−ＨＢ−ＥＨＭ融合蛋白質の発現 に使用される大腸＠ｔｒｐオペロンプロモータ；　（ｖ）ＣＡＴ−ＨＢ−ＥＨＭ 融合蛋白質コーディング配列；及び（ｖｉ）大腸菌のりボゾームＲＮＡ　（ｒ　 ｒｎＢ）部位由来のＴＩＴ２転写ターミネータ（ＣＡＴ−ＨＢ−ＥＨＭ融合蛋白 質コーディング配列の最後に位置している）から成っている。ｐＮＡ２８により コードされている融合蛋白質のＣＡＴ部分は、先端が切断され、改変された形の クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼである；このＣＡＴ蛋白質の アミノ酸配列を図５（配列番号：１７．１８）に示す（アミノ酸残基１−７３） 。この融合蛋白質のアミノ酸残基７４はメチオニンであり、これはシアノジエン ブロマイドによる切断部位を示している。融合蛋白質の残基７５−１４９は、Ｈ Ｂ−ＥＨＭの残基７３−１４７に対応する（図３、配列番号＝１参照）。

ベクターｐＮＡ５１の構造は、ＣＡＴ−ＨＢ−ＥＨＭ融合蛋白質をコードする塩 基配列が、ＨＢ−ＥＨＭの残基７３−１４７　（図３、配列番号＝１参照）に融 合するメチオニンアミノ酸に置換されている以外はｐＮＡ２８と同じである。

発現プラスミドｐＮＡ２８及びｐＮＡ５１をそれぞれ有する大腸菌株Ｗ３１１０ 及びＢは＾５ｅｒｌｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ 　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　）に寄託されており、それぞれ受託番号ＡＴ ＣＣＮｏ、　及びＮｏ、　を受けている。

出願人の譲渡人であるＴｈｅ　ＣｈＮｄｒｅｎ’ｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔ ｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、これ以降特許権の存続期間が終了する前にこ れらが死亡した場合、新たなものに置き換える責任を有することを承認しており 、また、寄託物が一般に提供可能となる時をＡＴＣＣに通知する責任を有するこ とも承認している。その時までは、寄託物は３７　ＣＦＲ！ｊ１．１４及び３５ 　ＵＳＣｆｉｌ１２により特許庁長官に提供され得る。

ＣＡＴ−ＨＢ−ＥＨＭを発現するために、ｐＮＡ２８を存する大腸菌株Ｗ３１１ ０の単一コロニーを、最初、４０μｇ／ｍｌ　トリプトファンを含む追補最小培 地（すなわち、Ｍｅ塩に０．４％　グルコース、２μｇ／ｍｌ　チアミン、１％ 　カザミノ酸、０．１ｍＭ　ＣａＣｌ　０１８ｍＭ　ＭｇＳＯ４、及び６゜２　 ゝ ２５μｇ／ｍｌ　テトラサイクリンを追補したもの）１００ｍｌに植菌した。１ ００ｍ１の培養物を３７℃で一晩振盪培養し、ついで、この培養物の一部（１リ ツトルにつき１０ｍ　ｌ）を、４μｇ／ｍｌ　トリプトファンを含む追補最小培 地１リツトルに植菌した。通常、所定の日に８本の１リツトルバツチに同時に植 菌した。各１リツトル培養物を、４リットルｔｒｉｐｌｅ−ｂａｆｆｌｅｄ　Ｅ ｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中で３７℃で光学密度（ＯＤ６ｏｏ）０．５−０． ７に達するまで培養し、この密度に達した時点でｔｒｐプロモータを誘導するた めに１０ｍ１エタノールに溶解した３β−インドールアクリル酸３０ｍｇをフラ スコに添加した。ついで、培養物を３７℃で一晩振盪培養し、５ｏｒｖａ！ｌ　 ＲＣ−３Ｂ遠心機を用いて４５００ｒｐｍで２０分間遠心分漏して細胞を回収し た。１〜８リツトルバツチからの細胞沈殿物を水またはＴＥ緩衝液（２０ｍＭ　 Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＳｐＨ７，５，５ｍＭ　ＥＤＴＡ）に懸濁した後一つにまとめ 、遠心分離して再度沈殿させた。その結果得られた洗浄沈殿物は、直ちに蛋白質 精製に使用するか、または細胞融解に先立ち一２０℃で凍結保存した。

ＣＡＴ−ＨＢ−ＥＨＭを上述の通りに発現させた場合、融合蛋白質はインクルー ジヨンボディ　（封入体）として細胞内に存在した。インクルージヨンボディを 単離するために、上述の通り取得した新鮮な、または凍結した細胞沈殿物をＴＥ Ｄ緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｔｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍ Ｍ　ＤＴＴ）に再度懸濁し、氷上に置き、１（ｅａｔ　５ｙｓｔｅｓｓ　Ｕｌｔ ｒａｓｏｎｌｃｓ　超音波破砕機（パワーレベル７：５０％　パルスサイクル； 直径０．５インチのプローブ；Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、　ＮＹ　）を用いて超 音波破砕した。２−５分間隔（各間隔の間に２分間の冷却期間がある）の超音波 破砕により細胞を破壊した。その結果得られた懸濁物に６Ｍ　グアニジンを最終 濃度ＩＭになるまで添加し、ついで、１６．　０００Ｘｇ　（１０，０００ｒｐ ｍＳＧＳＡｏ−タ）で１０分間遠心分離してインクルージヨンボディを沈殿させ た。沈殿を、１Ｍ　グアニジンを含有するＴＥＤ緩衝液に再懸濁して洗浄し、そ の後１６．ｏｏｏｘｇで１０分間再度遠心分離した。

融合蛋白質のＣＡＴ部分からＨＢ−ＥＨＭを切り出すために、まず始めにインク ルージ３ンボデイを７０％ギ酸に再懸濁した（湿重量１ｇのインクルージヨンボ ディにつき８−１８−１Ｏ。ついで、シアノジエンブロマイド（湿重量１ｇのイ ンクルージヨンボディにつき５０ｍｇ）を添加し、その結果得られる溶液にアル ゴンを重層して室温で４時間撹拌した。この溶液を、真空下で乾燥し、２０ｍＭ 　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、６ｍＭ　尿素に再懸濁し 、ついで、１６．ＯＯＯＸｇで１０分間遠心分離した。上清を回収し、沈殿物は ２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、６ｍＭ　尿素に 再度懸濁した。この懸濁物を上述の通り１６．０００Ｘｇで１０分間遠心分離し 、この時得られた上清を最初の上清とまとめた。

シアノジエンブロマイド切断混合物からＨＢ−ＥＨＭを精製するために、まとめ た上清を、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＳｐＨ７，５，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、６ｍ Ｍ　尿素、０．１Ｍ　ＮａＣ１であらかじめ平衡化したＳＰ−セファデクスＣ２ ５（２，５ｃｍｘ２ｃｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムにのせた。すべてのせ 終わった後、溶出液の吸光度がベースラインに達するまで、平衡化緩衝液を用い てカラムを洗浄した。ついで、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，５ｍ ＭＥＤＴＡ、６ｍＭ　尿素、０．６Ｍ　ＮａＣ１を用いて結合蛋白質を溶出した 。この時点で、溶出液中の変性蛋白質を以下の操作により巻き戻した；　（１） グルタチオン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）及びジスルフィド グルタチオン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）をそれぞれ６ｍＭ と１．２ｍＭの濃度で添加する、（２）その結果得られた溶液を５倍量の２０ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ、ｐＨ８，８，５ｍＭ　ＥＤＴＡで希釈する、（３）溶液 を４℃で４時間〜２４時間放置する。この間に生じた沈殿物をすべて遠心分離に より除去し、蛋白質を、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＳｐＨ７，５，５ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ、６ｍＭ　尿素、Ｏ，ＩＭ　ＮａＣ１で平衡化シタヘハリンーセファロー ス力ラム（２ｃｍｘ２．　５（ｍ、　Ｐｈａｒｍａｅｉａ　）にのせた１、平衡 化緩衝液でよく洗浄した後、最初２ＱｍＭ　Ｔｒｔｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，５ ｍＭ　ＥＤＴＡ、６ｍＭ　尿素、０．６Ｍ　ＮａＣ１，ついで、２０ｍＭ　Ｔｒ ｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、６ｍＭ　尿素、２ＭＮａＣｌを 用いて段階的に溶出することにより、結合蛋白質を溶出した。組み換えＨＢ−Ｅ ＨＭの最終的な精製は、ヘパリン−セファロースカラム溶出液（２Ｍ）を、１５ ”（ｉ７ヒト！トリルを含む０．１％Ｆ・リフロロ酢酸で平衡化したＶｙエンド で溶出して行なった。ＨＢ−ＥＨＭの溶出は、溶出液の２１４ｎｍｌこお番する 吸収測定、及び回収画分の一部をＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル供することに より行なった。ＨＢ−ＥＨＭを真空下で乾固した後、１ノン酸緩衝生理食塩水に 再懸濁し、ＢＡＬＢ／ｃ　３Ｔ３　［３Ｈ］−チミジン取り込み活性！ｆＪＩ定 で活性があることを確認した。

Ｍｅ　ｔ−ＨＢ−ＥＨＭを発現するために、ｐＮＡ５１を有する大腸菌株Ｂ細胞 を、０．４％　グルコース、１．１％　カザミノ酸、２ｍＭ　Ｍｇ２Ｓ０４、及 び６．２５μｇ／ｍｌ　テトラサイクリンを添加したＭｅ塩に植菌した。培養物 ０μｇ／ｍ＋になるよう添加した。ついで、培養物を３０℃で４時間振盪培養し 、培養物の半分について遠心分離により細胞を回収した。残りの半分の培養物（ よさらに３０℃で１６時間（３β−インドールアクリル酸の添加後、合計約２０ 時間）培養してから遠心分離により細胞を回収した。遠心分離（こよる細胞沈殿 物をそれぞれ、蛋白質濃度が約１０ｍｇ／ｍｌになるよう０．　１Ｍ　Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ、ｐＨ８．８、５ｍＭ　ＥＤＴＡに再度懸濁し、ついで、超音波破砕（ こより細胞を溶菌した。その結果得られた溶液を遠心分離して細胞残渣を除去し 、上清を回収した。Ｍｅ　ｔ−ＨＢ−ＥＨＭの発現が、３β−インドールアク１ ノル酸（二よる誘導後４時間または２０時間のいずれの細胞溶菌液においてもポ リアク１ノルアミドゲル電気泳動により解析可能であったため、この２つの時点 の上清を１つにまとめた。その結果得られた上清を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ ｌ％ｐＨ７．５、５ｍＭ　ＥＤＴＡ，Ｏ．ＩＭ　ＮａＣ１で平衡化したへ／くリ ン−セファロースカラムにのせた。溶出液の吸光度がバ・ツクグラウンドまで低 下するまで、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７．５、５ｍＭ　ＥＤＴＡ，０． ６Ｍ　ＮａＣｌを用（１てカラムを洗浄し、この時点で５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｍ ＣＩ、ｐＨ７．５、５ｍＭＥＤＴＡ，１．２Ｍ　ＮａＣｌを用いて結合蛋白質を 溶出した。溶出蛋白質を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ７．５、５ｍＭ　 ＥＤＴＡに対して、４℃で−晩透析し、ついで、Ｖｙｄａｃ　Ｃ４逆相ＨＰＬＣ カラム（０，４６ｃｍＸ２５　ｃ　ｍ）　ヲ用Ｌｖ７１０％〜４０％アセトニト リルを含む０．　１％トリフロロ酢酸のグラジェント分画した。カラムから溶出 される蛋白質の主なピーク（２２０ｎｍの吸収によりモニター）を回収し、Ｍｅ 　ｔ−ＨＢ−ＥＨＭに見られるアミノ末端配列を存することと、ＢＡＬＢ／ｃ　 ３Ｔ３　［３Ｈ］−チミジン取り込み活性測定で活性があることの両方を確認し た。

用法 本発明に係る成長因子は、創傷治癒の促進において有用である。創傷を治癒する 成長因子の量は標準的な技術を用いて当業者により容易に決定され、そのような 量を標準的な技術により創傷に適用することができる。このような成長因子は、 深い皮膚潰瘍（例えば、圧傷、静脈潰瘍、及び糖尿性潰瘍）などの多くの慢性の 治癒し２ない創傷の治療：火傷、切り傷、及び外傷などの急性創傷の治療；及び 皮膚移植やフラップ移植（例えば、傷の修復、及び美容整形のため）などに使用 される修復方法に付随する創傷の治癒の促進に使用することができる。さらに、 このような成長因子は、胃上皮、肺上皮、及び他の内部上皮層の損傷を治療する ために使用できる。例えば、このような成長因子は極端なｐＨに耐性があるため 、食道、胃、十二指腸、及び腸の潰瘍を治癒するために使用できる。さらに、こ れらは、上皮刺激活性ををするため、このような成長因子は、例えば角膜潰瘍及 び角膜剥離のような目の外傷にも使用することができる。

本発明に係る成長因子を表面の傷の治癒に使用する場合、局所的な投与をするこ とができる。このような場合、成長因子を、溶液、スプレー、ゲル、クリーム、 軟膏、または粉として患部に直接投与する。成長因子を局所的包帯または縫合／ ステープル（Ｓｔａｐｌｅ）との組み合わせ及び局所的クリームまたは軟膏（例 えば、外傷の治療によく使われる抗菌性５ｉｌｖａｄｅｎｅ　（Ｍａｒｉｏｎ　 Ｌａｂｓ、　Ｋａｎｓａｓ　Ｃ１ｔｙ、　Ｎｏ）　）との併用として遅効性装置 （ｓｌｏｗ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用することにより患部に適 用することもできる。

局所的に使用する場合、本発明に係る成長因子は、−回投与、または１〜数週間 の期間に１日に数回から数日に１回の範囲の投与計画において、５０−１０゜０ ００μｇ／ｍ＋の範囲の濃度で使用することかできる。通常、局所的投与する量 は、創傷の表面積につき約０．０１〜１００μｇ７ｃｍ２の成長因子を適用する のに十分な量である。消化管内の創傷に適用する場合、これらの成長因子は、消 化管内の酸性ｐＨ及び高レベルのプロテアーゼから蛋白質を保護する担体化合物 を含有する適切な緩衝液中で、経口的に、または、直腸から（ｒｅｃｔａｌ　ｌ ｙ）投与される。さらに、このような成長因子を、カテーテルを用いて直接内部 の創傷に注入することもできる。このような成長因子を目に適用する場合は、目 薬または軟膏に入れて使用することができる。肺の創傷には、スプレーまたはエ アロゾルの吸入により成長因子を投与することができる。

本発明の成長因子は、例えば、線維芽細胞、平滑筋細胞、または上皮細胞のよう な応答性の高い細胞タイプのｊｎ　ｖｉｔｒｏ培養にも使用することができる。

このような用途においては、１０ｐｇ／ｍｌ〜１１００ｎ／ｍｌの濃度で成長因 子を細胞培養培地に添加する。さらに、成長因子の刺激により増殖させた細胞を 、移植の際の、増大する細胞集団の源として使用することができる。これらすべ ての応用例において、本発明の成長因子を、単独で、または、他の成長因子及び 生物活性物質との組み合わせで使用することができる。

本発明の成長因子は、これら成長因子のポリクローナルまたはモノクローナル抗 体を、標準的な方法で生産する場合に使用することができる。このようなモノク ローナル抗体は、本発明において、患者の血清中の成長因子の検出をする場合に 有用である。このような方法で検出された成長因子の量を、同様の患者における このような成長因子の正常値と比較する。このような成長因子レベルの上昇（例 えば、２または３倍の上昇）は、その患者がアテローム硬化を起こしていること を示す。成長因子レベルの上昇が原因で、アテローム硬化を起こしている患者に 対しては、成長因子の抗体を患者の血清に直接添加するか、または、例えば患っ ている血管などに埋め込んだ遅効性装置からこのような抗体を放出することによ る治療を施すことができる。その他の方法として、アンタゴニストの添加、また は、ｂｔｏｃｏｓｐａｔｔｂｌｅ　５ｕｓｔａｉｎｅｄ−ｒｅ＋ｅａｓｅ　ｐｏ ｌｌｓｅｒｉｃ　ｄｅｖｉｃｅに取り込まれたアンチセンスＲＮＡ　（例えば、 ＨＢ−ＥＨＭ　ｍＲＮＡの転写開始点領域に相補的な２０塩基配列）の使用によ っても成長因子の活性レベルまたは発現レベルを低下させることができる。

標的細胞（例えば、線維芽細胞、上皮細胞、及び平滑筋細胞）の、ＨＢ−ＥＨＭ に誘導された増殖により、本発明の成長因子の増殖刺激活性を阻害する候補アン タゴニストのスクリーニング法が提供される。例えば、候補アンタゴニストを一 本発明の成長因子と共に培養細胞に添加し、細胞ＤＮＡへの［３Ｈ］−チミジン の取り込み（上述）、または、適当な期間培養後の細胞数の計測（上述）により 、細胞に対する刺激を測定する。この計測結果を、候補アンタゴニストを添加せ ずに同一の条件下で培養したコントロール細胞標品と比較する。阻害を示す（す なわち、成長因子により誘導される細胞増殖の量を減少させる）分子を、有用な アンタゴニストと定義できる。このように同定されたアンタゴニストを、本発明 の成長因子のＩｎ　ｖｉｖｏ活性を阻害するために使用できる。アンタゴニスト は、例えば、血管形成後の増殖を阻害することによる、アテローム硬化の治療、 または、ある種の新形成または骨髄線維症の治療に有用である。この場合、アン タゴニストは、患者の血液に直接添加するか、遅効性装置に取り込むか、または もし可能であれば患部に局所的に投与される。候補アンタゴニストは、いかなる 源からも選択することが可能であり、また、ＨＢ−ＥＨＭまたはその受容体、Ｈ Ｂ−ＥＨＭのペプチド断片に優先的に結合する抗体、またはすでに同定されてい る、または未だ同定されていない薬物も制限なしで候補アンタゴニストに含まれ る。

さらに、ある種の腫瘍細胞タイプが、本発明の成長因子を合成すると思われる。

もしそうであれば、ＨＢ−ＥＨＭ　ｍＲＮＡまたは蛋白質の存在を調べることに より、ある種のＩｌｌ瘍タイプの存在及び／または拡大の診断をすることができ る。

イムノアフセイ（例えば、本発明の成長因子を認識する抗体を使用したウエスタ 〉プロットまたはＥＬ　Ｉ　ＳＡ）　、ｍＲＮＡに基づく測定法（例えば、本発 明の成長因子をコードする核酸をプローブに使用したノザンプロット）、及びＥ ＧＦ−受容体結合活性測定などの他の測定法は、ＨＢ−ＥＨＭに起因する腫瘍の 存在の診断及び治療に伴う腫瘍の退化をモニターする場合に有用である。

他の実施例は以下の特許請求の範囲に含まれる。

（２）配列番号＝１ （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：　２３６０塩基対 （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　１本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｉｘ）特徴・ （Ａ）特徴を表す記号：　ｃｐｓ （Ｂ）存在位置：　２６２．．８８５ （Ｃ）他の情報： （ｘｌ）配列：　配列番号＝１： ＧＣＣＴＣＣＴＣＴＣＧＧＴＧＣＧＧＧＡＣＣＡＴＧ　入ｋＧＣ丁Ｇ　ＣＴＧ　 ＣＣＧ　ＴＣＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＣＴＣｋＡＧ　２９１Ｍｅｔ　Ｌｙｅ　Ｌａ ｕ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｓａｔ　Ｖａｌ　ＶａＬ　ｔａｕ　Ｌｙｓ１５１゜ ＣＴＣｆｆｒ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＧＣＡ　ＯＴＴ　Ｃ’ｒＣＴＣＧ　ＧＣＡ　Ｃ ＴＧ　ＯＷ　ＡＣＴ　ＣＧＣＧＡＧ　ＡＧＣＣＴＣ３３９Ｌ＠ｕ　Ｐｈｅ　Ｌａ ｕ　ＡＬａ　Ａｌａ　Ｖａｎ　Ｌａｕ　！＋＠ｒ　Ａｌａ　Ｔａａｕ　Ｖａｌ　 Ｔｈｒ　Ｃ１ｙ　ＧＬｕ　Ｓｓｒ　！≠■ ｉｓ　２０　２５ ＧＡＧ　ＣＣＶ　ＣＴＴ　ＣＧＧ　ＡＧＡ　ＧＧＧ　Ｃ’ＴＡ　ＧＣＴ　ＧＣＴ 　ＧＧＡ　ＡＣＣＡＣＣＡＡＣＣＣＯＧＡＣＧＣＴ　３８７Ｇｌｕ　＾ｘｑ　Ｋ Ａｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　＾藷　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　ｓａ ｔ　＾−ｆｉ　ｐｒｏ　入ｍｐ　Ｐｒ。

コＯ３５４０ ＣＣＣＡＣＴ　ＧＴＡ　ＴＣＣＡＣＯＧｋＣＣＡＧ　ＣＴＣＣＴＡ　ＣＣＣＣＴ Ａ　ＧＧＡ　Ｇｌｅｅ　ＧＣｃ　Ｃ００ＧＡＣ４３５Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　 Ｓａｔ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　ＬＪＩＪ　（ＡＹ 　ＧＬｙ　ＧＬｙ　Ａｒｇ＾１ｐＣＧＯＡＭ　Ｇ丁ＣＣＣ丁　ＧＡＣ丁ＴＯＣλ ＾　ＧＡＧ　ＧＣｋ　ＣＡＴ　Ｃ丁ＧＧへ〇〇Ｔτ　ＴｉＣＡＧＡ　ＣＴＣ４８ コＡＪ″ｇ　Ｌｙｅ　Ｖａｌ　ＡＹ９　人ｓｐ　Ｌｓｕ　ａＬｎ　ＧＬｕ　ＡＬ ａ　Ａｍｐ　Ｌａｕ　ＭＰ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｖａ１＾Ｃ丁　丁ＴＡ　 ＴＣＣＴＣＣＡＡＧ　ＣＣｈ　ＣＡＡ　ＧＣＡ　ＣＴＧ　ＯＣＣＡＣＡ　ＣＣＡ 　ＡＡＣ入ＡＯＧへＣＧへＧ　５３１τｈｒ　Ｌａｕ　Ｓａｔ　＄＠ｒ　Ｌｙｓ 　＄’ｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｌ＊ｕ＾Ｌａ　Ｔｈｔ：　Ｐｒｏ＾ｓｎ　Ｌｙｓ 　ＧＬｕ　ａｘｕＣＡＣＧＧＧ　＾＾＾　入ＧＡ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　Ｇ ＧＣ入へ〇　ＣＧＯＣＴＡ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＡＧＧ　ＧＡＣ５７９Ｈ １ｓ　ＧＬｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｅ　Ｌｙｅ　Ｌｙｓ　ａｌｙ　ＬｙｅＧＬ ｙ　Ｌａｕ　ＧＬｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙ−Ａｒｇ　Ａｓｐ９５ユ００１０５ ＣＣＡ　ＴＧＴ　Ｃ’！＋ｒ　ＣＧＧ　ＡＡＡ　ＴＡＣＮＡＧ　ＧＡＣＴｉＣＴ ＣＣＡＴＣＣＡＴ　ＧＣＡ　Ｇｋｋ　ＴＧＣＡＡＡ　６２）ｐｒｏ　ＣＹｓ　Ｌ ａｕ　ｋＸｑ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｙｅ　Ａｍｐ　Ｐｈｅ　Ｃｙｌｌ　ＩＬ＠　 Ｈｌｓ　ＯＬｙ　ＧＬｕ　Ｃｙｓ　Ｌｙ■ ｌｌｏ　１１５　１２０ 丁＾τ　ＧＴＧ　ＭＧ　ＧＡＧ　ＣＴＣＣＯＧ　ＧＣＴ　ＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡ ＴＣＴＧＣＣＡＣＣＣＧ　００丁　ＴＡＣ６７５Ｔｙｒ　Ｖｌｌｌ　ＡＹ８　Ｇ ｌｕ　Ｌ會ｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　５＠ｒ　Ｃｙｓ　ＩＬ＠　Ｃｙｍ　Ｈ ｌｓ　Ｐｒｏ　ＧＬｙ　τｙ■ ＣＡＴ　ＧＧＡ　ＧＡＧＡＣＧ　ＴＧＴ　ＣＡＴ　ＧＯＯＣ％　ＡＣＣＣＴＣＣ ＣＡ　ＧτＧＧ入＾　八Ａτ　ＣＧＣττ＾　７２コＨＬｍ　Ｇｌｙ　ＧＬｕ　 Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　ｊａｒ　ＩＪｕ　Ｐｒｏ　ＶａＬ　 ＧＬｕ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　ｕｕ！４０　１４５　Ｌ５０ 丁＾τ　入ＣＣＴＡτ　ＧＡＣＣＡＣＡＣＡ　ＡＣＣＡＭ　ＣＴＧ　ＧＣＣＧＴ Ｇ　ＣＴＣＧＣＴ　ＣＴＧ　（、ｌ’Ｇ　ＣＴＣ）７１？ｙｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ 　Ａｓｐ　ＨＬｓ　テｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ａｌａ　ＶａＬ　ＶａＬ 　入１ａ　ＶａＬ　ＶａＬ　！ａｕ１５５．１６０１６５１フ０ Ｔ（Ｊ　ＴＧＴ　ａ’ｒｃ　で０丁　ＣＴＣｃｘＧ　Ｃ；ＴＣＡＴＣＧ’！’Ｇ 　ＧＧＧ　０７丁　ＣＴＣ入τＧＴ〒ＴＡＧＯ丁ＡＣ８１９５ｇ５ｒ　Ｓｉｒ　 Ｖａｌ　Ｃｙｓ　ＬａｕしＩＩＪ　Ｖａｌ　工１＠　ＶａＩＧＬｙ　Ｌａｕ　Ｌ ａｕ　ｓｅｔ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　？ｙｒ１７５　１８０　１ＥＩ５ ＣＡＴ　ＡＧＯＡＧＡ　ＧＯＡ　ＧＧＴ　ＴＡ？　ＯＡＴ　ＧＷ　ＣＭ　ＡＡＴ 　Ｑｈｋ　ＧＡＧ　ＭＡ　ＧＴＧ　ＡＡＧ　’Ｉ”Ｍ　１１U７ ＨＬｍ　Ａｚｇ　Ａｒｇ　Ｏｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　（ｉｌｕ 　Ａｓｎ　ＧＬｕ　Ｇｌｕｔ　ＬＹＩＩ　ＶＪＩＬ　ＬＹＩh　−ｕ ｃｃｃ　ｈｗ　ＡＣＴ　ＡＡＴ　ｉＣＣＣＡＣＴＧＡＧＡＧＡＣＡＣτ１Ｇｉｃ ｔｏｕ　ａａｙＴＣＧＧＣ〒　９１５Ｇｌｙ　ＭｏｔτｈＪ＋触ｎ　Ｓａｔ　１ ４１１１　’Ｃ＾τＣτλＧ丁（Ｊ　ＣＭＡＧＡＣＴＣＣｆｆ１ｃＧＴｃｃｃｃ Ａ　ＧＴＴＧＣＣＯ丁Ｃτ　＾ＧＧＣＴＴＧＧＧ（：　Ｃ丁ＣＣｅＡＴＡ`丁　 １０３５ ＴＧｃＴｒＴｃＣＣｋ　ｋｋｋＴＡｃＣＡＧｋ　ＧＣＣＴＴＣＡＡＧτ　ＣＣＣ 入＾＾Ｃ八ＧへＧτＡτｃｒｃｃｃ＾　ＴＧＧＴＡＴＣ％Ｇ@１０９５ ０Ｔ入ＡＧｋＡ（ｆｉＪ％　ＡＧＣＡＡＡＡＣＣＪ　ｋＧＧＧｋｃｃｒＴｃ　Ａ ＴＧＣＣＣＴＴＣＴ　ＧＡＴＴＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＡbＣＣ１１５５ ＣＡＣＴ’ＴＣＣＣＣ？　ＣＡＴＡＡＧＴＴＴＧ　ＴＴＴＡＡＡＣＡＣＴ　ＴＡ ＴＣＴＴＣ？Ｇｔｌ；　ＡτＴＡＧＡＡＴＧＣＣＧＧττＡ`ＡＴＴ　１２１５ ＣＣＡＴＡＴＯＣＴＣＣＡＧＧｊｌｉＴＣＴｒ′Ｔ　ＧＡＣＴＧ入八入入Ａへ　 ＡＡＡＡＡＡＧ入ＡＧ　入入Ｇ入ＡＧ入ＡＧＧ　Ｍ；入ＧＣ■OＣＡＡ　１２７ ５ ＣＣＡＣｋｋＧＣＣＴ　ＣＡＧ入）＊ＣＴＧｋｋ　ＴＴＴτＧＣＧＡＣτ　丁Ｃ 丁ＡＣＣＣへＧＡ　ＴＣＧ入入八＾へＴＡ　ＡＣＡＡＣ丁ＡsＴＴ　１４５５ Ｔ丁ＣＴＴＧＴＴ（：Ｔ　ＴＧＴ？＋ｒＧＴＡＡＡ　ＴＧＣｃｒＣＴｒＡ＾　Ａ ＴＴＡＴＡＴ入Ｔ’Ｔ　丁Ａ丁ＴＴＴＡＴＴＣＴＡＴＧ丁Ａ嘯fＴ？　１５１５ 八ＡｆｆｌＡＴＴＴＡ　ＧＴＴｆｆｒＡＡＣＡ　ＡＴＣＴＡＡＣＡＡＴ　Ａ＾τ 入ＴＴＴＣＡＡ　ＣＴＣ；ＣＣ’ＴＡＧＡＣＴＯＴＴＡａ　Pｓ）５ ＧＣＡＡＴ’！’ＴＣＣ？　ＧＧＣＣＣ？ＣＣＡＣＴＣＣＴＣＪτＣＣＣＣＡＣ ＡＡＴσＩ’ＧＧ　ＣＴＴＡＧＴＧαｍＡ　ＣＣＣＡＯ−〒I’Ｇ　１６３５ ＴＧＣＡＧ入τＣＴ’ｒ　ＣＣＧＴＧＧＴＣ）、Ｇ　ＡＧＷＣＣＡＣＴＧ　ＣＧ ＧＩ：ＡＧＣＴＣＴ　ＧＴＡＴＧＧ？ＣＡＧ　ＣＡＴりτＡfＧＧＧ　１７５５ ττ八ＡＣＴ〒ＣＣ丁　ｃｉｘｃ＾ｃｃｃ＾Ｃ？　ＣｒＡ↑ＧＡＧＴＴＧ　ＣＡ Ｃ丁ＴＣ入ＣＴＣ”！’ＴＧＣＣτ＾ＧＧＣＧ入Ｔτ丁ＴＧ■b丁　１８１５ ＾ＣＧＡＴＴＴＯＴＯＴＴＴＴＧｋＡＡＧＣＣｃＡＡＧＧＴＧＣＴ　ＧＡＴＣＴ ＣＡＡＡＧ　ＴＣＴＡＡＣＡＧＡＴ　ＡＴＣｈＧＴＧＴＣＴ@１！＋７５ ＣＣＣＣＣＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＣ％ＣＣ＾＾ＧτＣＴＣＪＧ八　入ＧＡＧＧＴ ＴＧＧＧ　ＣττＣＣＡτＧＣＣ丁ＧτＡＧＣＴＴテＣ１９R５ ＣＴＷＴＣｃｃ＋ｒＣＡＣＣＣＣＣＡＴＩＩＧ　ＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡ　ｃｘｃ ｃｃ’ｒｃｃａＡ　ＡＣＴＣＡＣＴＴ’ＴＣＣＣτＴＯτＣ嘯b＾　１９９５ ＡＧＡＣＡＴ！？Ｃ〒　Ｃτ八へＣ？ＣＣ丁Ｇ　ＣＣＡＴ丁Ｃ？丁ｅｒ　ａｃ’ ｒｃｃτＡＣ’！’ＯＣＡ’ｌ’１ｆｆ（Ｊ＃　τＣＡＧＴfＣＡＧＣ２０５５ ｋＧｋＧＧｋｃＡＧＴ　Ｃ％ＧＡＧＡＡＧＧ　ＴＡＴＴＡＧＣＡＡＡ　ＧＣＡＡ ｋｈＧＧＣτ　ＧｋＧｋＡＧＧＭＣＪＬＧＧＧＡＡ（ＩＪＴH　２１１５ （２）配列番号：２ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：　２０８アミノ酸 （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　蛋白質 （ｉｘ）配列：　配列番号＝２＝ ｓｅｔ　Ｌｙｓ　ｔａｕ　Ｌｓｕ　Ｐｒｏ　５ｅｒ　Ｖａｌ　ＶａＬ　Ｌａｕ　 Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｐｈｅ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌｌ　Ｓ　１０　１５ Ｌ＠ｕ　５＊ｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　ＴｈｒＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ｓａｔ　Ｌ ａｕ　（Ｌｕ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ＧＡＹ−ｕ　ＡＬａ　Ａｌａ 　ＧＬｙτｈｒ　Ｓｅｒ＾ａｎ　Ｐｒｏ＾ｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｖａ ｎ　Ｓｅｔτｈｒ＾叩ｃｌｎ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　ｃｌｙ　Ｇｌ ｙ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ＾ｓｐ　Ａｒｇ　ＬｙＩＩＶａｌ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅ＋ ａｓｏ　ｓｓ　ａ。

Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　ＡＬａ　八ｓｐ　Ｌ＠ｕ　Ａｍｐ　Ｌ＠ｕ　Ｌｓｕ　Ａｒｇ　 Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｓｕ　５＠ｒ　Ｓ＠ｔ　Ｌｙｇ　Ｐｒ。

６５　７０　７５　ａ。

Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｍｎ　Ｌｙｓ　Ｃ１１ｕ 　ＧＬｕ　Ｈｘｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙ−＾Ｈｇ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＬｙ−＾＃Ｐ　Ｐｈ ＠Ｃｙ−Ｈｌｍ　ｔｌｉｓ　Ｇｌｙ　ＧＬｕ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　ＶａＬ 　Ｌｙｓ　ＧＬｕ　Ｌａｕ　Ａｒｇ＾１ａ　Ｐｒｏ　Ｓｓｒ　Ｃｙｓ　Ｈｌｍ　 Ｃｙｓ　ｌｕｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　’５ｒ　Ｈｌｓ　Ｇｌｙ　ＧＬｕ　Ａｒｇ　 Ｃｙｓ　１４ｉ■ １コｏ　１コ５　１４０ Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｓａｔ　Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　 Ｌｓｕ　Ｔｙｒ　丁ｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　ＨＬｍ　τｈｒ！４５　１５０　ユ ５５　１６０ Ｔｈｒ　Ｘｉ＠　Ｌ＠ｕ　ＡＬａ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　ＡＬａ　ＶａＬ　Ｖａｌ　 Ｌａｕ　Ｓ＠ｒ　！＋＠ｒ　ＶａＬ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｉａ■ ＶａＬ工１＠　ｖａｎ　Ｇｌｙ　Ｌ＠ｕ　Ｌａｕ　Ｈａｔ　Ｐｈａ　Ａｒｇ　Ｔ ｙｒ　Ｈｌｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ１８０　１ＢＳ　１９ ０ Ａｓｐ　ＶａＩ　Ｇｌｕ　Ａｍｎ　ＧＬｕ　ＧＬｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　 Ｌ＠ｕ　Ｇｌｙ　Ｍａｔ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　ＨＬｍ（２）配列番号二３ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：　２０アミノ酸 （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　〕本重 鎖Ｄ）トポロジー二　直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類・　蛋白質 （ｘｉ）配列、　配列番号二３゜ Ｖａｌ　Ｘａａ　Ｌ＠ｕ　Ｓａｔ　５＠ｒ　Ｌｙｅ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　入Ｌａ　 Ｌｓｕ　ＡＬａ　Ｘａａ　Ｐｒｏ　Ａｍｎ　Ｌｙｓ　ＧＬｕｌ　５　１０　１ｓ Ｇｌｕ　ＨＬｍ　（Ａｙ　ＬｙＩＩ （２）配列番号：４ （ｌン配列の特徴 （Ａ）配列の長さ；　５１アミノ酸 （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数＝　１本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　蛋白質 （ｘｉ）配列：　配列番号＝４＝ 入ｒｇ　Ｖａｎ　Ｋａｍ　Ｘａａ　Ｓ＠ｔ　Ｓ＠ｒ　ＬＹ＠　Ｐｒｏ　（ｉｎ　 Ａｉａ　Ｌ＠ｕ　ＡＬａ　Ｘａａ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｙｓｌ　ｓ　ユ０　ユ５ ａＬｕ　ＧＬｕ　Ｈｌｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　入ｘｑ　Ｌｙｓ　Ｌｙｅ　Ｌｙｓ　 Ｇｌｙ　Ｌｙｅ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　ＧＡＹ　ＬＹ＊　Ｌｙｇ２０　２５　コ。

Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｐｅａ　Ｘａａ　Ｌ＠ｕ　入ｒｑ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｙｅ　 Ａｍｐ　Ｐｈｓ　Ｘａａ　Ｘ１ｍ　Ｈｌｍ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ３５　４０　４ｇ Ｘａａ　Ｘａａ　Ｔｙｒ （２）配列番号、５ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：　１８アミノ酸 （Ｂ）配列の型；　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数；　１本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類、　蛋白質 （ｘｉ）配列：　配列番号＝５＝ ＾ｘｑ　Ｖａｌ　Ｘａａ　Ｗｕ　５＊ｒ　Ｓ＠ｘ　Ａｙ廖　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａ Ｌａ　Ｌａｕ　ＡＬａ　Ｘａａ　Ｐｒｏ　＾簡　Ｌｙｇ（２）配列番号；６ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：　１４アミノ酸 （Ｂ）配列の型；　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数＝　１本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）配列の種類：　蛋白質 （ｘ　ｉ）配列：　配列番号：６： ！ｊ＠ｒ　５・ｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｌｓｕ　Ａｌａ　Ｘａａ 　Ｘａａ　＾−ｒｌ　Ｘａａ　ＧＬｕ　ＧＬｕＩ　Ｓ　１０ （２）配列番号ニア （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：　１３アミノ酸 （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｃ）＄１の数、　１本鎖 （Ｄ）トポロジー＋［鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　蛋白質 （ｘｉ）配列：　配列番号＝７： ＡＬａ　Ｌ＠ｕ　Ａｌａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ａ−ｎ　Ｌｙｓ　Ｘａａ　ＧＬｕ　 Ｘａａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　入ｒｇｌ　Ｓ　１０ （２）配列番号＝８ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：　２４アミノ酸 （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　１本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　蛋白質 （ｘｌ）配列：　配列番号　８・ ｋｔｑ　ＶａｌＸａａ　ｔ、＠ｕ　５ｅｒ　ｓ＠ｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ＾ ｌａ　ＬＪｕ＾ｌａ　Ｘａａ　Ｐｒｏ＾ａｎ　Ｌｙｅｌ　５　１０　１ｓ ＧＬｕ　ＧＬｕ　ＨＬｓ　ＧＬｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｅ　Ｌｙｓ（２）配列 番号：９ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：　１３アミノ酸 （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　１本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　蛋白質 （ｘ　ｉ）配列　配列番号：９： Ｘａａ　Ｘａａ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　＾１ｍ　Ｌ＠ｕ　入１ａ　Ｘａａ　 Ｘａａ　Ａｓｎ　Ｘａａ　ＧｌｕＬ　５　１０ （２）配列番号・１０ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：　１３アミノ酸 （Ｂ）配列の型　アミノ酸 ｃｃ＞ｉｎの数、　１本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）配列の種類・　蛋白質 （Ｘｌ）配列　配列番号、１０゜ 入Ｌａ　Ｌａｕ　＾ｌａ　Ｘａａ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｙｍ　ＧＬｕ　Ｇｌｕ　 Ｘａａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　入τ９１５１゜ （２）配列番号＝１１ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：　４５塩基対 （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数＝　１本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）配列の線類：　ＤＮＡ （ｉｘ）特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置：４ （Ｃ）他の情報：／注−ヌクレオチド九ンバー４はＴであろう。

（ｉｘ）特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置：２２ （Ｃ）他の情報：／注−ヌクレオチドナンバー２２はＧであろう。

（ｉｘ）特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）存在位置：４０ （Ｃ）他の情報：／注−ヌクレオチドナンバー４０はＧであろう。

（Ｘｌ）配列：　配列番号：１１： ＣＴＴＧＣＣＡＴＧＣＴｃｃ’ＴｃｃｆｆｌＪ　ＴＡ（Ｇｅｅ　ＣＡＧＧＧＣＣ ＴＧｋ　ＧＧＣＴ丁（２）配列番号　１２ （ｉ）Ｎｐ１ノの特徴 （Ａ）配列の長さ・　１３塩基対 （Ｂ）配列の型、　核酸 （Ｃ）鎖の数：　１本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類　ＤＮＡ （Ｂ）／ｒ：在位置ニア （Ｃ）他の情報：／注−ヌクレオチドナンバー７はＧてあろう。

（ｘｉ）配列、　配列番号、１２： ｃｃｃａｃｃｘｃｃｘ　’ｒｃｃ　１３（２）配列番号　１３ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ二　３６アミノ酸 （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数＝　１本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （１１）配列の種類：　蛋白質 （ｘｉ）配列：　配列番号・１３： Ｃｙ−＾１ｎ　＾Ｌａ　ＧＬｕ　Ｐｈ＠　（ｉＬｎ　Ａｓｎ　Ｐｈ＠　Ｃｙｓ　 工Ｌｅ　Ｈｌｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｌｙｅ　丁ｙｒｌ　Ｓ　１０　１ｓ ＩＬ＊　Ｇｌｕ　Ｈｌｍ　Ｌａｕ　ｃｌｕ　＾ｌａ　ＶａＬ　τｈｒ　Ｃｙｓ　 Ｌｙｅ　Ｃｙｍ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｃ１ｕ　Ｔｙｒ　ＰｈｅＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ａ ｒｇ　Ｃｙｓ ］５ （２）配列番号　１４ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ二　３７アミノ酸 （Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　１本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　蛋白質 （ｘｉ）配列：　配列番号：１４： Ｃ’ｙｍ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｂａｒ　ＨＬｍ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｃｙｍ 　Ｌａｕ　ＨＬｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｍａ■ ｌ　５　１０　１５ 丁ｙｒ　１１ａ　Ｇｌｕ　＾ｌａ　Ｌ＠ｕ　ｘｓｐ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　入Ｌａ　 Ｃｙｍ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｎ　ＶａＬ　Ｇｌｙ　ＴｙｒＩ１ｍ　Ｇｌｙ　Ｇ ｌｕ　ｋｒｑ　Ｃｙｍ（２）配列番号＝１５ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：　３６アミノ酸 （Ｂ）配列の型・　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数　１本鎖 （Ｄ）トポロジー・　直鎖状 （ｉｉ）配列の種類　蛋白質 （ｘｌ）配列、　配列番号、１５ ＣＹ＠　Ｐｒｏ＾＠Ｐ　Ｓｓｒ　１４Ｌ＠τｈｒ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｐ ｈｅ　ＨＬｓ　にｌｙ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　ＰｈＧＬｕｕ　Ｖａｌ　Ｇｉ ｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｅ　Ｐｒｏ＾Ｌａ　Ｃｙｗ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｈｌｓ 　５ｓｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　ＶａｌＧｌｙ　Ａｌａ　入ｒｇ　ｅｙｓ （２）配列番号、１６ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：　１６アミノ酸 （Ｂ）配列の型・　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　１本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類、　蛋白質 （ｘｉ）配列・　配列番号：１６ ＾−ｐ　Ｌｓｕ　Ｇｉｎ　ＧＬｕ　Ａｌａ　八ｍｐ　Ｌ＠ｕ　八ｓｐ　Ｌａｕ　 Ｌ＠ｕ　Ａｒｇ　ＶａＬ　Ｘａａ　Ｌａｕ　Ｘａａ　５ｅｔｌ　Ｓ　１０　１５ （２）配列番号：１７ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ；　４５７　塩基対 （Ｂ）配列の型：　核酸 （Ｃ）鎖の数：　１本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｘ　ｉ）配列：　配列番号＝１７＝ （２）配列番号＝１８ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ＝　１４９　アミノ酸（Ｂ）配列の型：　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　１本鎖 （Ｄ）トポロジー：　直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：　蛋白質 （ｘｉ）配列：　配列番号：１８： Ｌｙｖ　Ｌｙ−＾ａｎ　ＬＹｌｌ　！４ＬＩ　Ｌｙｓ　Ｐｈａ　Ｔｙｒ　ｐｒｏ 　ＡＬａ　Ｐｈａ　Ｘｉｓ　Ｈｉｓ　ｍｉｓ　Ｌａｕ　＾１■ 八ｒｇ　Ｌ＠ｕ　Ｌａｕ　Ａ＊ｎ　ＡＬａ　）Ｉｉｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｈ＠ 　Ｍ＠ｔ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｓｕ　５＊ｒ　５＊■ ６５　７０　７５　８０゛ Ｌｙｅ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　八Ｌａ　Ｌ＠ｕ　入１ａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　＾ａｎ　 Ｌｙｓ　ＧＬｕ　ＧＬｕ　Ｈｌｓ　ＧＬｙ　Ｌｙｅ　ＡｒｇＬｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌ ｙｓ　ＧＬｙ　ＬＹＩＩ　ＧＡＹ　Ｌ＠ｕ　ＣＬｙ　Ｌｙ■　ＬＹＩ　Ａｒｇ　 入簿ｐＰｒロ　Ｃｙｓ　Ｌａｕ　λｒ９１００　１０５　Ｌｌｏ Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　ｆ、ｙ−八ｓｐ　Ｐｈ＠　Ｃｙｓ　Ｘｉｓ　Ｈｌｓ　ＧＬｙ　 ＧＬｕ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　ｔｙｒ　ＶａＬ　Ｌｙｓ　ＧＬｕエユ５　１２０　１ ２５ Ｌｅｕ　＾ｒ９　ＡＬａ　Ｐｒｏ　５ｅｒ　Ｃｙｓ　工Ｌ＊　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　 Ｐｒｏ　ＣＬｙ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　ＧＬｙ　＋Ｊｕ　入ｒ９１３０　ｉ３ｓ　１ ４０ Ｃｙｍ　Ｈｌｓ　Ｇｌｙ　Ｌ＠ｕ　Ｂ＠ｒ日ＯＬＡη１ 討ドご茨　囲　５５　し茨　芥ｔｌ’ｌ　＠ａ５　Ｑ：、Ｑ；ぽ圧　ヨｐ卦　ジ さ　Ｅｓ　濾ぎ　路＝目ｊ　母５＜　＠Ｉ　ｈ　ａｓ　＜　′３ｖ＋　υ−ｈｖ 　ｕ−べ０　トー１　←−←−ＩＪ−１１’−！　べ−ＩＪｊ　ベー　Ｕ−ベト へ　ペー（−〇＜　←−〇＝　＜−Ｕ雷　Ｕ−←ト一　〇閃３芝　ｋｊ　■　ジ ’Ｅ：ｇＥ：ｌｉ’５　訂　ヨ５　ｉ民ｐ２　ｇ５　Ｂ、、ＢＨＱｙ２３，５　 打Ｌ”、尊；ｖａ　２　釦ｖ　＝　ｕ　；　５　Ｍ　２　Ｂ：　５　Ｂ　３５　 ：　ｇ％ｆ、Ｅ＃ｅ−＋　Ｅｚ　’ＱＨＥｇ　”５５　’５Ｅ　、ｉぎ　ＭＥ　 ｔｒ＞ヨ３　（ｐＨＵ　ミ５　母；　拍＝■　目ミ　と！ヨ３　ヨ３　託＝ミ５ 　５５　託　話　Ｕヨ■　拍３書　■　瑚ヨ　井：とＳ　市　短３　訂　９罪Ｈ ；ジジー３Ｅ　ＨＥ’　卦　ｉ、ｉ、ｅｌｌ：　：４Ｂ　５Ｂ　ヨ３　とＳ　本 託ｆ−＋　ｋＷ　ＬＩＩＪ　＜５ＩｔＪ４　ＬＩＭｅ　べ−ｏｃｎ　ｅ：＋　ｖ ａｎ＜＜飄　υＪ：　ｋｍ　ｌＪ、−１ｔＪ＊ｅｌｊｌ−＋　ｅＭ　（＋Ｉ　Ｑ ＩＪＵ　←←　＜←　０〉　ロペ　←切　ベペ　０ぺ　ＯＯペペ国際調査報告 １−ｍｍｍｗｌ　Ａｍｍ　＆、石、ＵＳ９．．ｏ、６Ｑ。

フロントページの続き （７２）発明者　アブラハム　ジューディス　ニーアメリカ合衆国　力リホルニ ア州　サンホセ　カントリーレーン　４９０１ （７２）発明者　ヒガシャマ　シゲキ アメリカ合衆国　マサチューセッツ州　プルツクリン　ビーコンストリート　１ ６００アプト１００７ （７２）発明者　ベスナー　ゲイル　イーアメリカ合衆国　ニューヨーク州　バ ッフアロ　バーカーストリート　６３

Claims (48)

【特許請求の範囲】
1. １．単離されたヘパリン結合性ＥＧＦ相同性マイトジェン（ＨＢ−ＥＨＭ）を含 む組成物。
2. ２．ＥＧＦ相同性分節を含み、繊維芽細胞、上皮細胞、及び平滑筋細胞の増殖を 刺激するが、内皮細胞の増殖は刺激しない、ヘパリンと結合する単離されたポリ ペプチドを含む組成物。
3. ３．請求項１または２に記載の組成において、ヒトＨＢ−ＥＨＭを含む組成物。
4. ４．請求項１または２に記載の組成物において、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に列挙 された次の配列のアミノ酸１０８−１４３を実質上含有する組成物：【配列があ ります】
5. ５．請求項１または２に記載の組成物において、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の次の アミノ酸１−２０８の全てまたは一部を含む組成物：【配列があります】
6. ６．請求項１または２に記載の組成物において、成熟ＨＢ−ＥＨＭを含む組成物 。
7. ７．請求項１または２に記載の組成物において、ＨＢ−ＥＨＭのアミノ酸末端は 、図３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）に示すようにアスパラギン酸残基６３とアラ ニン残基８２との間に存在する組成物。
8. ８．請求項７に記載の組成物において、ＨＢ−ＥＨＭのアミノ末端は、図３（Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）に示すようにアルギニン残基７３とアラニン残基８２と の間に存在する組成物。
9. ９．請求項１または２に記載の組成物において、ＨＢ−ＥＨＭのカルボキシル残 基は、図３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）に示すように、セリン残基１４７とプロ リン残基１４９との間に存在する組成物。
10. １０．請求項１または２に記載の組成物において、酸安定性である組成物。
11. １１．請求項１または２に記載の組成物において、７．２と７．８との間のｐＩ を有する組成物。
12. １２．請求項１に記載の組成物において、図４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）に示 したアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド を含む組成物。
13. １３．請求項１に記載の組成物において、図１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）に示 したアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸を含む精製されたポリペプチドを含 む組成物。
14. １４．請求項１、２、１２または１３に記載の組成物において、グリコシル化さ れている組成物。
15. １５．請求項１２または１３に記載の組成物において、非還元性ポリアクリルア ミドゲルに対して１９ｋＤと２４ｋＤの間の見かけ分子量を有する組成物。
16. １６．請求項１２に記載の組成物において、少なくとも８６のアミノ酸残基を含 む組成物。
17. １７．請求項１３に記載の組成物において、少なくとも６６のアミノ酸残基を含 む組成物。
18. １８．請求項１、２、１２または１３に記載の組成物において、該組成物は、グ リコシル化されていない組成物。
19. １９．請求項１、２、１２または１３に記載の組成物において、該組成物は、陽 イオン化されている組成物。
20. ２０．請求項１、２、１２または１３に記載の組成物において、前記組成物は、 ヒトの治療目的に適した他の共精製物質から十分に単離される組成物。
21. ２１．請求項１、２、１２または１３に記載の組成物をコード化する精製された 核酸。
22. ２２．請求項２１に記載の核酸を含有するベクター。
23. ２３．請求項２２に記載のベクターにおいて、前記ベクターはＡＴＣＣに寄託さ れ、ＡＴＣＣ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．４０９００と命名されたプラスミド ｐＭＴＮ−ＨＢＥＧＦであるベクター。
24. ２４．請求項２２に記載のベクターにおいて、前記ベクターは、ＡＴＣＣに寄託 され、ＡＴＣＣ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．４０８９９と命名されたプラスミ ドｐＡＸ−ＨＢＥＧＦであるベクター。
25. ２５．請求項２２に記載のベクターにおいて、前記ベクターは、ＡＴＣＣに寄託 され、ＡＴＣＣ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　と命名されたプラスミドｐＮＡ ２８であることを特徴とするベクター。
26. ２６．請求項２２に記載のベクターにおいて、前記ベクターは、ＡＴＣＣに寄託 され、ＡＴＣＣ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　と命名されたプラスミドｐＮＡ ５１であることを特徴とするベクター。
27. ２７．請求項２１に記載の核酸を含む細胞。
28. ２８．請求項２７に記載の細胞において、前記細胞は、真核細胞である細胞。
29. ２９．請求項２８に記載の細胞において、前記細胞は哺乳細胞である細胞。
30. ３０．請求項２８に記載の真核細胞において、前記真核細胞は、成熟したグリコ シル化された形態の前記組成物を前記細胞が増殖する媒体内へ分泌可能である細 胞。
31. ３１．請求項２７に記載の細胞において、前記細胞は、原核細胞である細胞。
32. ３２．請求項３１に記載の細胞において、前記原核細胞は、大腸菌である細胞。
33. ３３．請求項３１に記載の細胞において、前記原核細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｂま たはＥ．ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０である細胞。
34. ３４．請求項１、２、１２または１３に記載の組成物を生成する方法において、 請求項２２に記載のベクターを、組成物を発現させる条件下で適切なホスト細胞 内へ導入する工程と、 組成物を発現させる工程と、 組成物を単離する工程と、 を含む方法。
35. ３５．請求項１、２、１２または１３に記載の組成物を生成する方法において、 組成物を発現させる条件下で請求項２８に記載の真核細胞または請求項３１に記 載の原核細胞を培養する工程と、 組成物を単離する工程と、 を含む組成物の生成方法。
36. ３６．請求項３４に記載の方法において、前記細胞は原核細胞であり、前記ベク ターは成熟形態の前記組成物である、組成物の生成方法。
37. ３７．請求項３４に記載の方法において、前記細胞は真核細胞であり、前記ベク ターは成熟した形態の前記組成物である、組成物の生成方法。
38. ３８．請求項３４に記載の方法において、前記細胞は真核細胞であり、前記組成 物は細胞が増殖する媒体内から単離される、組成物の生成方法。
39. ３９．請求項３４に記載の方法において、前記組成物は、付加アミノ末端メチオ ニン残基を含む、組成物の生成方法。
40. ４０．請求項１、２、１２または１３に記載の組成物の有効傷治療量が薬理学的 受容キャリア内に含有された傷治療用薬理学的組成物。
41. ４１．請求項４０に記載の薬理学的組成物において、前記薬理学的組成物は、溶 液、ゲル、クリーム、軟膏またはドライパウダの形態であることを特徴とする傷 治療用薬理学的組成物。
42. ４２．請求項４０に記載の組成物の傷治療量を傷へ適用する工程を含む、患者の 傷治療方法。
43. ４３．その増殖がＨＢ−ＥＨＭによって刺激される細胞の試験管内培養方法にお いて、該方法は、前記細胞を請求項１、２、１２または１３に記載の組成物の増 殖刺激量と接触させる工程を含む、細胞の試験管内培養方法。
44. ４４．請求項４３に記載の方法において、前記細胞は、繊維芽細胞、上皮細胞、 または平滑筋細胞である、細胞の試験管内培養方法。
45. ４５．請求項１、２、１２または１３に記載の組成物へ優先的に結合する生成さ れた抗体。
46. ４６．請求項４５に記載の抗体において、前記抗体はモノクローナル抗体である 抗体。
47. ４７．請求項４５に記載の抗体において、前記抗体は、ＨＢ−ＥＨＭの生体内で の生物学的活性を中和する抗体。
48. ４８．ＨＢ−ＥＨＭに対する拮抗物質を確認する方法において、候補拮抗物質の 存在下で、前記因子によりその増殖が刺激される培養細胞にＨＢ−ＥＨＭを供給 する工程と、 前記細胞のＨＢ−ＥＨＭ誘起増殖を阻止可能な候補拮抗物質を前記拮抗物質とし て確認する工程と、 を含む、ＨＢ−ＥＨＭの拮抗物質確認方法。