JP2001513334A - ヘパリン結合増殖因子（ｈｂｇｆ）ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 実質的に純粋なヘパリン結合増殖因子ポリペプチド(HBGF)、HBGFをコードする核酸、および本発明のHBGFと結合する抗体が提供される。HBGFポリペプチドは骨の誘導、軟骨および組織の形成、子宮内膜の増殖および発達、ならびに創傷治癒の加速に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 〔発明の技術分野〕 本発明は一般的には増殖因子の分野に関し、より特定して述べればヘパリン結
合増殖因子(HBGF)に関する。

【０００２】 〔本発明の背景〕 増殖因子は発生途上の組織中における標的細胞の増殖、分化、および器官形成
を刺激するポリペプチドの一群である。増殖因子の作用は、細胞内のシグナル伝
達事象を刺激する、特異的な受容体への結合に依存する。増殖因子の例としては
血小板由来増殖因子(PDGF)、インシュリン様増殖因子(IGF-I, IGF-II)、トラン スフォーミング増殖因子β(TGF-β)、トランスフォーミング増殖因子α(TGF-α)
、上皮増殖因子(EGF)、酸性および塩基性線維芽細胞増殖因子(aFGF, bFGF)、な らびに結合組織増殖因子(CTGF)を挙げることができ、それらは細胞の増殖を刺激
することが知られている。

【０００３】 PDGFは陽イオン性で熱安定なタンパク質で循環血液中の血小板のアルファ顆粒
に存在し、線維芽細胞および平滑筋細胞などの結合組織細胞に対するマイトジェ
ンおよび走化性剤として知られている。この分子の活性から、PDGFは創傷の正常
な治癒過程に関与し、動脈硬化症および線維症状態などの状態に病理学的に関与
する主要な因子と考えられている。PDGFはαおよび/またはβ鎖の組み合わせか らなる二量体分子である。それらの鎖はヘテロ二量体もしくはホモ二量体を形成
し、現在までに単離された組み合わせは全て生物学的活性を有している。

【０００４】 組織の再生および修復における各種の増殖因子の役割に関する研究から、PDGF
様タンパク質が発見された。これらのタンパク質はPDGFと同様な免疫学的および
生物学的活性を有し、PDGFに特異的な抗体によってブロックされうる。

【０００５】 ポリペプチド増殖因子およびサイトカインは、母体の子宮と成長過程の胚もし
くは胎児との間の増殖シグナル伝達の経路を形成しうる子宮タンパク質の重要な
一群として出現する。種々の生物種での研究ではEGF、ヘパリン結合EGF様増殖因
子(HB-EGF)、IGF-I、IGF-II、aFGF、bFGF、プレイトロフィン(PTN)、白血病阻止
因子、コロニー刺激因子-1(CSF-1)、およびTGF-αが、子宮の増殖-調節分子のう
ちでこれらの過程に関与するものであることが示唆されている。

【０００６】 CTGFはM_r 38,000のシステインに富む単量体ペプチドで、結合組織の細胞に対 してマイトジェンおよび走化性活性を有する増殖因子である。CTGFは細胞から分
泌され、特異的な細胞表面受容体との相互作用によって活性を示す。CTGFはPDGF
のαもしくはβ鎖遺伝子とは無関係の遺伝子産物である。CTGFは増殖調節因子フ
ァミリーのメンバーで、そのファミリーにはマウスCTGF(fisp-12およびβIG-M2 としても知られている)およびヒトCTGF、Cyr61(マウス)、Cef10(ニワトリ)、な らびにNov(ニワトリ)が含まれる。配列の比較に基づくとこのファミリーのメン バーは全て、(1)結合に重要なインシュリン様増殖因子ドメイン、(2)複合体形成
に重要なフォン・ヴィルブランド因子ドメイン、(3)おそらくマトリクス分子の 結合に重要なトロンボスポンジンタイプIリピート、(4)受容体結合に重要である
と仮定されているマトリクスタンパク質中に見出されるC末端モジュール、から なるモジュラー構造を持っていることが示唆される。

【０００７】 ヒトCTGF(hCTGF)cDNAの配列は、130の位置に開始部位があり、1177の位置にTG
A終止部位を有する、349個のアミノ酸からなるペプチドをコードする1047個のヌ
クレオチドからなるオープンリーディングフレームを含んでいる。CTGF cDNAとP
DGFのαもしくはβ鎖のどちらかのcDNAとの間には40%の配列相同性しかない。

【０００８】 hCTGFのオープンリーディングフレームは39個のシステイン残基を含有するポ リペプチドをコードしており、このことは多数の分子内ジスルフィド結合を有す
るタンパク質であることを示している。そのペプチドはアミノ末端に分泌性タン
パク質であることを示す疎水性シグナル配列を有し、アミノ酸配列の28と225の 位置のアスパラギン残基に2つのN-結合グリコシル化部位がある。CTGFポリペプ チドとCEF-10 mRNA転写物によってコードされるポリペプチドとの間には全体と して45%の配列相同性があり、その相同性は推定上の選択的スプライシング領域 を除去した場合には52%に達する。

【０００９】 CTGFはあるとしてもごくわずかのペプチド配列の相同性しかないがその抗原性
はPDGFと関連している。抗PDGF抗体は非還元型のPDGFもしくはCTGFに対して高い
親和性を有するが、これらのペプチドの還元型(生物活性を欠く)に対しての親和
性は10分の1である。このことはPDGFアイソマーとCTGF分子の間には共通の三次 構造を有する領域があり、その結果共通の抗原性を有するエピトープがあること
を示唆している。

【００１０】 CTGFの合成と分泌はTGF-β、BMP-2およびおそらくはTGF-βスーパーファミリ ーのタンパク質のその他のメンバーによって選択的に誘導される。軟寒天培地中
ではTGF-βは正常な線維芽細胞の増殖を刺激することができるが、CTGF単独では
この線維芽細胞中で増殖刺激性を誘導することはできない。しかし、CTGFの合成
とその作用がTGF-βが足場非依存性の線維芽細胞の増殖を刺激するのに必須のも
のであることが示されている。

【００１１】 おそらくCTGFは創傷治癒における増殖因子として機能するのであろう。病理学
的には、CTGFは全身性硬化症、癌、線維症症状および動脈硬化などの結合組織細
胞の過剰増殖がみられるような状態に関与すると考えられている。

【００１２】 CTGFポリペプチドの主な生物活性はそのマイトジェン性、もしくは標的細胞の
増殖を刺激する能力である。in vivoでのこのマイトジェン活性の最終的な結果 は標的組織の増殖である。また、CTGFは走化性活性をも有しており、それは特定
の分子との相互作用の結果として化学的に誘発された細胞の動きである。

【００１３】 〔発明の要旨〕 本発明は子宮分泌液中のヘパリン結合増殖因子(HBGF)の発見、精製、および特
徴の検討に基づいている。これらの増殖因子ポリペプチドはヘパリンと結合し、
完全長のCTGFが示す機能的特徴の多くを示す。

【００１４】 第1の態様においては、本発明はマイトジェン活性を有するものとして同定さ れたヘパリン結合ポリペプチド(HBGFポリペプチド)、およびそのポリペプチドを
コードする核酸を提供する。

【００１５】 本発明の別の態様においては、HBGFに結合する抗体を提供する。

【００１６】 本発明の別の態様においては、HBGFをコードする核酸配列と特異的にハイブリ
ダイズのに十分な長さを有する核酸分子を含んでなる核酸プローブも提供する。

【００１７】 本発明の別の態様では、創傷治癒、組織形成、硬化性もしくは細胞増殖性障害
、動脈硬化または繊維症疾患に影響を及ぼすためのHBGF、HBGFをコードする核酸
分子、もしくはHBGFをコードする核酸分子に対するアンチセンス配列を使用する
方法を提供する。

【００１８】 〔好ましい実施形態の詳細な説明〕 本発明の方法、装置、組成物、および製剤を記載するに先立ち、本明細書中に
記載したような方法、装置、組成物、および製剤はもちろん変更を加えることが
出来るものであり、本発明が本明細書中に記載した特定の方法、装置、組成物、
および製剤に限定されないことは理解されよう。本明細書中で用いられている用
語は特定の実施形態を記載する目的のみで用いられているものであり、本発明の
添付の請求の範囲のみにより制限されるべき本発明の範囲を制限することを意図
していない。

【００１９】 本明細書および添付の請求の範囲に用いられている場合、単数形の"a", "an",
および"the"は、それが用いられる文脈において特に示されない限りはそれらの
複数形の指示物をも含むことは特記すべきである。例えば、"an organism"とは1
またはそれ以上の異なる生物体を含み、"an amino acid"とは1またはそれ以上の
そこで言及しているようなアミノ酸を意味し、"a method"とは当業者であれば既
知の、等価の工程および方法をも含むものであること、などである。

【００２０】 別に定義しない限りは、本明細書中に用いた技術的および科学的用語は全て、
本発明が属している当分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有している。
本明細書中に記載した方法および材料と類似もしくは同等のいかなるものも本発
明の実施もしくは試験において用いることができるが、好ましい方法および材料
についてこれから記載する。上述の刊行物は本出願の出願日以前にそれらの開示
のためにのみ提供される。本明細書中に記載のいずれのものも、先行発明がある
ため本発明はその開示を以前のものとする資格がないということの承認であると
は解釈すべきでない。

【００２１】 本発明はヘパリン結合増殖因子(HBGFポリペプチドもしくはHBGF)を提供し、そ
れは線維芽細胞および平滑筋細胞に対しin vitroでマイトジェン作用を有する。
HBGFは熱及び酸に不安定で、HBGF-0.8-P1、およびHBGF-0.8-P2の2種類の形で存 在し、そのそれぞれのヘパリン結合特性は異なり、それぞれがSDS-PAGEで還元条
件下で調べたとき約10kDaのM_rを有する。HBGFは構造的にも機能的にもCTGFと関 連している。HBGF-0.8-P1およびHBGF-0.8-P2の双方ともヘパリンアフィニティー
カラムからの溶出には0.8M NaClの存在を必要とする。配列を調べることにより 、HBGF-0.8-P1のN末端配列がブタの結合組織増殖因子(CTGF)の一次翻訳産物から
予測される349残基のうちの247-262アミノ酸残基に対応しているが、HBGF-0.8-P
2のN末端配列はCTGFの248-259アミノ酸残基に対応することが明らかとなった。 従って、HBGFは2種の微小不均一性(microheterogenous)で、高度にN末端を切断 された形のCTGFの翻訳産物に対応し、それらの両者とも生物学的に活性である。
HBGF-0.8-P2は、HBGF-0.8-P1のN末端でGlu残基が付加されていることを除いては
HBGF-0.8-P1と同一のものである。

【００２２】 本発明のHBGFはCTGFの高度N末端切断型形態であるが、直接的に2種のタンパク
質のN末端を生ぜしめるイントロン/エクソンの境界がない。HBGFはCTGFの提案さ
れているモジュラー成分と整列せず；本発明のタンパク質はCTGFの硫酸化グリコ
コンジュゲート結合モチーフ(トロンボスポンジンタイプIリピートと称され、マ
トリクス分子の結合に重要であると仮定されている)を全く含まない。マトリク スタンパク質中に認められるCTGFのC末端モジュールは受容体結合に関連してい るものと仮定されており、それはHBGFでも完全な形で存在する。CTGFのアミノ酸
残基206と214との間の硫酸化グリココンジュゲートに対する結合モチーフとして
提案されている部分はHBGFでは欠如しているが、HBGFはヘパリンを結合し、この
ヘパリン相互作用は機能的に顕著である。本発明の2つのタンパク質HBGF-0.8-P1
およびHBGF-0.8-P2はN末端のGlu 1個のみが異なっているにすぎないがヘパリン との結合性は異なっているので、おそらくそれらのN末端はヘパリンとの結合に 関連があるのであろう。

【００２３】 本発明のHBGFはヒトおよびマウスの培養線維芽細胞の両者から分泌される。HB
GFの産生は特定の生物種もしくは生物系に限定されるものではない。好ましくは
、本発明のHBGFは間葉由来細胞(例えば線維芽細胞、軟骨細胞、破骨細胞、骨芽 細胞、および大グリア細胞)に対してマイトジェン性および走化性を示すもので あるが、その他の細胞タイプ(例えば筋細胞、結合組織細胞、上皮細胞、および 分泌細胞など)もHBGFに対して反応性を有する。HBGFはヒトの組織の正常な発生 、発達および修復に非常に重要な役割を果たす。HBGFは子宮洗浄物に存在し、お
そらく子宮内膜の発達と再造形に付加的な役割を有しており、妊娠中にはおそら
く胚の外膜もしくは胎盤膜の増殖および発達に影響を及ぼしているであろう。

【００２４】 HBGF由来の治療用薬剤は、ある種の臨床状態(例えば創傷治癒)において結合組
織が関わる正常もしくは減じられた(impaired)増殖過程の促進に有用なものとな
りうる。HBGFが病的状態に関与する際には、これらのタンパク質を用いた治療法
を開発して制御されていない組織増殖を制御もしくはモジュレートするために用
いることができる。

【００２５】 本明細書中で用いられている"実質的に純粋"とは、天然状態ではHBGFとともに
存在しているその他のタンパク質、脂質、炭水化物、もしくはその他の物質を実
質的に含まないHBGFを意味する。実質的に純粋なHBGFポリペプチドは非還元ポリ
アクリルアミドゲル上で単一の主要なバンドを生じる。また、HBGFの純度はアミ
ノ末端アミノ酸配列分析によって求めることができる。本明細書中で定義したHB
GFはHBGFの生物活性(例えば、当分野では一般的なおよび本明細書中で説明する ような標準的なアッセイで求められる線維芽細胞中での生物学的反応の誘発など
)が保持されている限りはそのポリペプチドの機能的断片をも含む。HBGFの生物 活性を有する、より小さなポリペプチドも本発明に含まれる。さらに例えばHBGF
ポリペプチドcDNAの部位指向性突然変異誘発によって産生されるより有効性の高
いHBGFが含まれる。"組換え"HBGFとは組換えDNA技法によって産生されたHBGFポ リペプチドを意味する；すなわち、所望のHBGFポリペプチドをコードする外来性
のDNA構築物によって形質転換された細胞が産生するものである。"合成"HBGFは 化学合成によって調製されたものである。DNA"コーディング配列"もしくは特定 のHBGFポリペプチドをコードする"ヌクレオチド配列"は、適切な制御配列の制御
下におかれた場合に転写されHBGFポリペプチドに翻訳されるDNA配列である。

【００２６】 本発明はHBGFポリペプチドをコードする核酸を提供する。これらの核酸にはHB
GFをコードするDNA、cDNA、およびRNA配列を含む。HBGFポリペプチドの全体もし
くは一部をコードする核酸は全て、それらがHBGFの生物活性を有するポリペプチ
ドをコードするものである限りは、本明細書中に含まれるものと理解される。そ
のような核酸としては天然に存在する、および意図的に操作を加えた核酸の双方
を含む。例えば、HBGFポリペプチドを部位指向性突然変異誘発に供することがで
きる。

【００２７】 本発明の核酸は遺伝暗号のため縮重している配列を含む。天然のアミノ酸はわ
ずか20種であり、その大部分が2以上のコドンによって特定されている。それ故 、HBGFポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化していない限りは、縮重ヌク
レオチド配列は全て本発明に含まれる。HBGFポリペプチドの断片、誘導体もしく
は類似体とは、(i)HBGFポリペプチドの1つ以上のアミノ酸残基が保存されたもし
くは保存されていないアミノ酸残基(好ましくは保存されたアミノ酸残基)で置換
されたものであって、そのような置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号によってコ
ードされていたものであってもそうでなくてもよく、もしくは好ましい変異体の
うちで保存的アミノ酸置換によって基準となるものから変化させたもの(そのよ うな置換はポリペプチド中のある特定のアミノ酸を類似の特性を有する別のアミ
ノ酸で置換したものである。典型的には保存的置換は、1対1の、脂肪族アミノ酸
のAla、Val、Leu、Ileの間で；水酸基を有する残基のSerとThrの間で、酸性の残
基のAspとGluの間で、アミドを有する残基のAsnとGlnの間で、塩基性の残基のLy
sとArgの間で、芳香族残基のPheとTyrの間での置き換えである)；(ii) HBGFポリ
ペプチドの1以上のアミノ酸残基が置換基を含むものであるようなもの；(iii)HB
GFポリペプチドが別の化合物、例えばHBGFポリペプチドの半減期を延長させる化
合物(例えばポリエチレングリコールなど)と融合したもの；または(iv)HBGFポリ
ペプチドに付加的アミノ酸が融合されたようなものであって、例えばリーダーも
しくは分泌配列、またはHBGFポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製の
ために用いられる配列が融合されたものである。そのような断片、誘導体、およ
び類似体は本明細書中に示す教示によって当業者であれば本発明の範囲内にある
とみなしうるものである。本発明のHBGFおよびそれらをコードする核酸は単離さ
れた形態で提供されることが好ましく、均一となるまで精製されたものであるこ
とが好ましい。

【００２８】 本発明のHBGFポリペプチドをコードするDNA配列は数種類の方法で得ることが できる。例えば、DNAはよく知られたハイブリダイゼーション法によって単離す ることができる。これらとしては：1)ゲノムもしくはcDNAライブラリーへプロー
ブをハイブリダイズさせて共通のヌクレオチド配列を検出すること(例えばCurre
nt Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M.ら編, Green Publishing Co
mpany Assoc. and John Wiley Interscience, New York, 現行版を参照せよ)、 および2)発現ライブラリーを抗体でスクリーニングし、共通の構造的特徴を検出
することなどがあるがそれらに限定されない。HBGFをコードする核酸(少なくと も12個の連続したヌクレオチドからなる)がプローブとして特に有用であること は当業者に理解されるものである。

【００２９】 本明細書中で用いられている「選択的ハイブリダイゼーション」とは、中程度
もしくは高度にストリンジェントな生理学的条件下(J. Sambrookら, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(現行版)を参 照。これは参照によってその全体が本明細書中に組み込まれるものである。)で ハイブリダイゼーションが起こるほど近接しているヌクレオチド配列間の同一性
の程度に基づいて関連のないHBGFを関連のあるHBGFと識別するようなハイブリダ
イゼーションを意味する。ある100bpsの配列の断片が95bpsの長さであれば、も との100bpsの配列とは95%の同一性を有するということが理解されよう。例えばB
LASTNで整列させた場合のように第1の配列と別の配列とを互いに適切に整列させ
た場合に少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%または90%の同一性が第1配列
の塩基と別の配列の塩基との間にあった場合には、本明細書中では第1のDNA(RNA
)配列は別のDNA(RNA)配列と少なくとも70%および好ましくは少なくとも80%同一 であるという言い方をする。

【００３０】 本明細書中で用いられている"同一性"という用語は、基準となるポリヌクレオ
チド配列の塩基と同じ塩基がどのくらいのパーセンテージ含まれているポリヌク
レオチド配列であるかを示す。例えば、基準のポリヌクレオチドと少なくとも90
%の同一性を有するポリヌクレオチドは、基準となるポリヌクレオチドを構成す る塩基と90%は同一であるポリヌクレオチド塩基を有しており(すなわち当分野で
一般に行われている標準的な整列および相同性調整法(例えばNetBlastもしくはG
RAIL)を用いて配列をお互いに適切に整列させた場合)、そのポリヌクレオチド配
列を構成している塩基の10%は異なるものである可能性がある。

【００３１】 核酸のハイブリダイゼーションに基づくスクリーニング手法により、適当なプ
ローブが入手できれば、いかなる生物体からでもいかなる遺伝子配列をも単離す
ることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、対象とするタン
パク質をコードする配列の一部に対応するものであるが、それは化学的に合成す
ることができる。このためにはアミノ酸配列の短いオリゴペプチドの長さのもの
(stretch)が既知でなければならない。そのタンパク質をコードするDNA配列は遺
伝子コードから推定しうるが、コードの縮重を考慮に入れなければならない。配
列が縮重されたものである場合には混合付加反応を行うことができる。これには
変性二重鎖DNAの不均一な混合物が含まれる。このようなスクリーニングには、 ハイブリダイゼーションを一重鎖DNAもしくは変性二重鎖DNAについて行うことが
好ましい。ハイブリダイゼーション法は、対象とするポリペプチドに関係するmR
NA配列が極度に低い量しか存在しないようなソースに由来するcDNAクローンの検
出には特に有用である。言い換えれば、非特異的結合を避けるようにした選択的
ハイブリダイゼーション条件を用いることによって、例えば、標的DNAをそれと 完全に相補的な単一プローブと混合してハイブリダイズさせることにより、オー
トラジオグラフィーで特異的なcDNAクローンを可視化することができるようにな
る(Wallaceら, Nucleic Acid Research, 9:879, 1981)。また、そのような選択 的ハイブリダイゼーションプローブを分析によって検出可能な試薬で標識して該
プローブの同定を容易にすることも可能であり、それが好ましい。有用な試薬と
しては、放射活性、蛍光染料、もしくは検出可能な産物の形成を触媒することの
できる酵素が挙げられるがそれらに限定されない。選択的ハイブリダイゼーショ
ンプローブはその他のソースからのDNAの相補的コピーを単離するため、もしく は関連配列についてそのようなソースをスクリーニングするために有用である。

【００３２】 ラムダgt11などのcDNA発現ライブラリーを、HBGFポリペプチドに特異的な抗体
もしくはHBGFポリペプチドと交差反応するCTGFに対する抗体、もしくはHBGFポリ
ペプチドと交差反応するPDGFに対する抗体を用いて、少なくとも1個のエピトー プを有するHBGFを間接的にスクリーニングすることができる。そのような抗体は
ポリクローナルもしくはモノクローナル由来のどちらでもよく、HBGFポリペプチ
ドcDNAの存在を示す発現産物の検出に用いることができる。

【００３３】 HBGFポリペプチドをコードするDNA配列はin vitroで適当な宿主細胞中にDNAを
移送することによって発現させることができる。「宿主細胞」は、本発明のベク
ターで、それは例えばクローニングベクターもしくは発現ベクターであるが、遺
伝子工学的に処理された(形質導入、形質転換、もしくはトランスフェクトされ た)細胞である。ベクターは例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージその他 の形態にすることができる。処理された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形
質転換体の選択、もしくは本発明の遺伝子の増幅に適切なものとなるように修飾
された従来の栄養培地中で培養することができる。温度、pHなどの培養条件は、
従来その宿主細胞を用いて発現のために選択されたものであり、当業者には自明
のものであろう。また、この用語は当該宿主細胞の後代のものをも含むものであ
る。複製の過程で変異が起こる可能性があるので、全ての後代の細胞が親の細胞
と同じものとはいえないことは理解されるところである。しかし、そのような後
代の細胞は「宿主細胞」という用語が用いられる際には含まれる。構築物の宿主
細胞中への導入は、リン酸カルシウムによるトランスフェクション、DEAE-デキ ストラン介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、もしくは当分野
で用いられるその他のいかなる方法によっても行うことができる(Davis, L.ら,
Basic Methods in Molecular Biology(現行版))。

【００３４】 本発明の核酸は遺伝子組換え技法によるHBGFの産生に用いることができる。例
えば、ポリヌクレオチドをHBGFポリペプチド発現用の各種の発現ベクターのいず
れかに含むことができる。そのようなベクターとしては染色体性、非染色体性、
および合成DNA配列があり、例えば、SV40誘導体；細菌のプラスミド；ファージD
NA；バキュロウイルス；酵母のプラスミド；ファージDNA、ワクシニア、アデノ ウイルス、鶏痘（fowl pox）ウイルスおよび仮性狂犬病などのウイルスDNAとプ ラスミドとの組み合わせから由来するベクターがあげられる。しかし、その他の
ベクターも、それが宿主中で複製可能で生存できるものであるならば用いること
ができる。

【００３５】 適切なDNA配列は種々の方法でベクター中に挿入することができる。通常はDNA
配列は適切な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に、当分野では既知の方法で挿入
される。そのような方法およびその他の方法は当業者にとっては本発明の範囲内
にあるものと見なされる。HBGFをコードするDNA配列は原核細胞か真核細胞のど ちらかでin vivoで発現させることができる。真核細胞性のコーディング配列を 有するDNA配列を原核細胞中で発現させる方法は当分野ではよく知られている。 宿主としては微生物、酵母、および哺乳類の細胞が挙げられる。

【００３６】 宿主中で発現および複製を行いうる、生物学的に機能を有するウイルス性およ
びプラスミドDNAベクターは当分野では既知である。そのようなベクターは本発 明のDNA配列を取り込むために用いられる。一般的には、挿入された真核細胞性 遺伝子配列の効率的な転写を容易にするようなプロモーター配列を含んでいる発
現ベクターが宿主との関連で用いられる。発現ベクターは典型的には複製開始点
、プロモーター、およびターミネーターを、形質転換細胞の表現型での選択を可
能とするような特異的な遺伝子とともに含んでいる。

【００３７】 当分野では既知の細菌、酵母、および哺乳類の発現系等の発現ベクターに加え
、バキュロウイルスベクターも用いることができる。この無脊椎動物のウイルス
発現ベクターを外来遺伝子の発現に用いることの利点の１つは、そのベクターが
組換えタンパク質を高レベルで発現でき、そのタンパク質の抗原性および機能が
そのタンパク質の天然のものと同様であることである。バキュロウイルスベクタ
ーおよびそのベクターと組み合わせて用いられる適切な昆虫宿主細胞は当業者に
は既知である。本発明のポリペプチドを発現させた宿主細胞の単離と精製は、例
えば調製用クロマトグラフィーによる分離、およびモノクローナルもしくはポリ
クローナル抗体の使用などのような免疫学的分離法などの従来法で行うことがで
きる。

【００３８】 本発明はHBGFポリペプチドもしくはその断片と特異的に反応する抗体を提供す
る。このポリペプチドはPDGFもしくはCTGFに対する抗体と交差反応することがあ
るが、HBGFに対する抗体の全てがPDGFとも反応するわけではなく、またCTGFに対
する抗体の全てがHBGFに対して反応するわけではない。異なるエピトープ特異性
を有するプールされたモノクローナル抗体から本質的になる抗体、および単一成
分の（distinct）モノクローナル抗体調製品が提供される。モノクローナル抗体
はそのタンパク質の断片を含有する抗原から当分野ではよく知られた方法によっ
て作成される(Kohlerら, Nature 256:495, 1975; Current Protocols in Molecu
lar Biology, Ausubelら編, 1989)。当業者には一般的である方法を用いて製し た本発明のHBGFに対するポリクローナル抗体も含まれる(HarlowとLane, 1988, A
ntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York,
現行版を参照せよ)。HBGFに特異的なモノクローナル抗体は、例えばHBGFポリペ
プチドに反応するがPDGFとは反応しないようなハイブリドーマ培養上清をスクリ
ーニングすることによって選択することができる。本発明にしたがって作成され
たHBGFに対する抗体は、ポリペプチドの動物への直接注射もしくはそのポリペプ
チドの動物、好ましくはヒト以外の動物への投与によって得られる。そのように
して得られた抗体はポリペプチド自体と結合する。このようなやり方で、そのポ
リペプチドの断片のみをコードする配列でも、もとのポリペプチドと結合する抗
体を作成するために用いることができる。そのような抗体はそのポリペプチドを
発現している細胞からのポリペプチドの単離に用いることができる。

【００３９】 モノクローナル抗体の調製には連続細胞系培養によって産生される抗体を提供
するようないかなる技法も用いることができる。例としては、ハイブリドーマ法
(Kohlerら, Nature 256:495,1975)、トリオーマ法、ヒトB細胞ハイブリドーマ法
(Kozborら, 1983, Immunology Today 4:72)、およびヒトモノクローナル抗体産 生のためのEBV-ハイブリドーマ法がある(Coleら, 1985, Monoclonal Antibodies
and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96)。

【００４０】 単鎖抗体の産生のためのものとして記載されている技法(米国特許第4,946,778
号)を本発明の免疫原性ペプチド産物に対する単鎖抗体を産生させるために適用 することができる。さらに本発明の境界内に含まれるものとしては、HBGFポリペ
プチドもしくはその断片に対する「ヒト」および「ヒト化」抗体の双方を診断用
および治療に応用するための産生および使用法がある。ヒト化抗体は、親の抗体
(すなわち典型的にはマウス起源の)と同じ結合特異性を有するが、ヒトの特徴が
より強く現れている抗体もしくは抗体断片である。ヒト化抗体は鎖のシャフリン
グもしくはファージディスプレイ法で得られる。例えば、HBGFに特異的な非ヒト
抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドをヒトの相補的(重ま たは軽)鎖の可変ドメインのレパートリーと組み合わせる。対象の抗原に特異的 なハイブリッドのペアを選択する。次いで選択されたペアからのヒト鎖を、ヒト
相補的可変ドメイン(重もしくは軽)のレパートリーと組み合わせ、ヒト化抗体ポ
リペプチド二量体を抗原に対する結合特異性で選択する。そのような技法は米国
特許第5,565,332号に記載されており、また、市販もされている(Scotgene, スコ
ットランドもしくはOxford Molecular, Palo Alto, 米国カリフォルニア州)。さ
らに、トランスジェニックマウスでの「ヒト」抗体(すなわち、ヒト定常領域配 列を有するde nove抗体)の産生のための技法として記載されている技法(米国特 許第5,545,806号および米国特許第5,569,825号)は、「ヒト」HBGF抗体もしくは 抗体断片の産生に適用することができ、またそれは企業との契約で行うこともで
きる(GenPharm International Inc., Mountain View, 米国カリフォルニア州)。

【００４１】 本発明のポリペプチドに対して作成された抗体は他の生物体およびサンプルか
らの類似のHBGFポリペプチドのスクリーニング用に用いることができる。そのよ
うなスクリーニング技法は当分野では既知である。 本発明は、対象、例えばヒトにおいて、精製HBGFポリペプチド、PDGF、PDGF関
連分子もしくはそれらを組み合わせたものを含有する組成物の治療的有効量を創
傷に適用することによって創傷治癒を促進させる方法を提供する。本発明のHBGF
ポリペプチドは、皮膚創傷の治癒が損なわれている場合、もしくは正常な治癒メ
カニズムの増大が必要とされる場合には、治療上の価値がある。HBGFポリペプチ
ド、もしくはその機能的断片は、PDGFおよびその他の創傷治癒に関連することが
知られている増殖因子よりも安定で、プロテアーゼによる分解をより受けにくい
。さらに、おそらくHBGFポリペプチドはCTGFより高い特異的生物活性を有してい
る。

【００４２】 HBGFポリペプチドは線維芽細胞から由来するが、その細胞は創傷部位に存在す
る。従って、HBGFポリペプチドの産生を刺激する薬剤を創傷治癒促進に用いられ
る組成中に添加することができる。その薬剤はインシュリン様増殖因子(IGF-I) 、血小板由来増殖因子(PGF)、上皮増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因
子β(TGF-β)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)などの増殖因子のファミリーの
メンバーであることが好ましい。その薬剤がトランスフォーミング増殖因子β(T
GF-β)もしくはその他のTGF-βスーパーファミリーのメンバーであることがより
好ましい。さらにHBGFの生物学的効果は、約1μg/mlから約100μg/mlの濃度範囲
のヘパリンの添加によって変調させることができる。本発明のHBGF組成物は、部
分的には結合組織の増殖を促進することによって創傷治癒を補助する。HBGF組成
物は、製薬上許容しうる担体物質のいかなるもの、例えば不活性ゲルもしくは液
体中に、本発明の精製HBGFポリペプチドを組み合わせることによって調製される
。HBGF組成物中にはヘパリンもしくはTGF-βなどの増殖因子などの他の変調用組
成物を含有させることができる。

【００４３】 「細胞増殖性障害」という用語は異常な細胞数によって特徴づけられる状態を
意味する。その状態としては肥大性(細胞の連続的な増幅がある組織内でのある 細胞集団の増殖過剰を起こす)、および萎縮性(ある組織内での細胞の欠如もしく
は欠乏)の細胞増殖または体内のあるエリア中への細胞の過剰な流入もしくは移 動が挙げられる。その細胞の集団は、必ずしも形質転換されたもの、腫瘍原性の
ものもしくは悪性の細胞であるとは限らず、正常な細胞も含まれる。例えば、HB
GFは動脈壁の血管内膜の増殖性病変を誘発して動脈硬化をもたらす病理学的状態
に関与している可能性がある。その状態への危険因子の低減、例えば血圧を下げ
たり、もしくは高いコレステロールレベルを下げることを試みるかわりに、本発
明のHBGFポリペプチド阻害剤もしくはアンタゴニストの投与は動脈硬化に関係す
るin vivoでのHBGF活性を妨害する上で有用である。また、HBGFポリペプチドア ンタゴニストは、強皮症、関節炎、および肝硬変を含む各種の線維症状態などの
結合組織の過剰増殖に関係するその他の疾患の治療に有用である。

【００４４】 HBGFによって変調を来すこれらの疾病、障害、もしくは軽度の障害としては、
外傷、もしくは関節炎、骨粗鬆症およびその他の骨格障害、ならびに火傷などの
状態に引き続く組織修復がある。これらの問題点は線維芽細胞、幹細胞、軟骨細
胞、骨芽細胞、もしくは創傷部位の線維芽細胞の増殖応答が低いためのものであ
るので、これらの細胞の増殖を刺激もしくは誘発する生物学的に活性のある薬剤
の添加は有益である。本明細書中で用いられている「誘発する」もしくは「誘発
」という用語は、本明細書中で述べているような組織の形成、修復過程、もしく
は発達に必要な細胞性機作もしくはプロセスの活性化、刺激、増強、開始および
/または維持を意味する。

【００４５】 本発明はさらに女性の生殖路（reproductive tract）機能を変調する方法を提
供する。増殖因子は、子宮内膜細胞成分の周期的有糸分裂および分化、子宮内膜
の脱落時におけるマクロファージの漸増、子宮内膜-トロホブラスト相互作用、 初期の妊娠維持、および子宮内膜機能再生に役割を果たしていることが示されて
いる。本明細書中で用いられている「変調する」という用語は、現在の状態もし
くは生物学的状況に変化を与えることを意味する。本明細書中で定義した、状態
の変調には現在の状態に影響を及ぼす決定因子の増加もしくは減少の双方を包含
する。例えば、HBGFの投与は増殖の促進が望ましい状態において子宮機能を増大
させるために用いうる。例えば胎盤膜の増殖および発達もしくは子宮内膜の増殖
を促進するためにHBGFで子宮を治療することができる。さらに、子宮内膜-トロ ホブラスト相互作用を容易にすることによって妊娠の促進および維持のためにHB
GFでの治療を行うことができる。また別に、正常な生物学的状態に比較するとHB
GFのレベルが過剰であるような子宮内膜増殖過剰状態を変調させるためにHBGFア
ンタゴニストが投与される。

【００４６】 また、本発明は、細胞増殖性障害によって特徴づけられる状態を、HBGFに反応
性の薬剤の治療的有効量を用いて治療する方法をも開示する。「治療」という用
語は反応性薬剤の投与を受ける対象における状態の有害な影響を低減させること
を意味する。その状態が細胞の過剰増殖によって起こるものである場合には、HB
GFアンタゴニストは細胞上のHBGF特異的受容体へ結合しうる増殖因子の量を低減
させるので治療上有効である。そのようなアンタゴニストはHBGF特異的抗体もし
くはその機能的断片(例えばFab、F(ab)_２)である。その治療にはその状態の部位
へのHBGFポリペプチドのアンタゴニストの接触もしくは送達が必要である。細胞
増殖性障害が細胞の増殖量の減少によって起こるものである場合は、増殖を刺激
するHBGF反応性薬剤をその状態の部位と接触させるかもしくはそこへ送達する。
例えば、TGF-β(もしくはTGF-βスーパーファミリーの別のメンバー)はそのよう
な反応性薬剤になりうる。当業者にはその他の生物学的薬剤は既知のものであろ
う。

【００４７】 細胞増殖性障害がHBGFの発現に関係する場合には、HBGFのmRNAへの転写もしく
はHBGFmRNAのタンパク質への翻訳を直接的に妨害する治療的アプローチが可能で
ある。例えば、HBGFmRNAと結合するもしくはそれを開裂させるアンチセンス核酸
もしくはリボザイムもまた本発明の範囲内に含まれる。アンチセンスRNAもしく はDNA分子は標的遺伝子のRNAメッセージと特異的に結合し、その遺伝子のタンパ
ク質産物の発現を妨害する。アンチセンスはmRNAと結合してその細胞では翻訳さ
れない二本鎖分子を形成する。約15-25個のヌクレオチドのアンチセンスオリゴ ヌクレオチドは容易に合成でき、アンチセンスRNA分子とほぼ同様の阻害効力を 有するので好ましい。さらに、化学的反応基、例えば鉄をリンクさせたエチレン
ジアミン四酢酸(EDTA-Fc)をアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、RNAの
開裂をハイブリダイゼーションの部位で行わせることができる。遺伝子のin viv
oでの翻訳を阻害するこれらおよびその他のアンチセンス法は当分野ではよく知 られている(例えば De Mesmaekerら, 1995 Backbone modifications in oligonu
cleotides and peptide nucleic acid systems, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:
343-355; Gewirtz, A.M.ら, 1996b, Facilitating delivery of antisense olig
odeoxynucleotides:Helping antisense deliver on its promise; Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 93:3161-3163; Stein, C.A., A discussion of G-tetrads 1
996, Exploiting the potential of antisense: beyond phosphorothioate olig
odeoxynucleotides, Chem. and Biol. 3:319-323)。

【００４８】 本発明の範囲内に含まれる別の治療的アプローチとしては、本発明のHBGFを含
む試薬もしくは組成物の、線維性、硬化性、もしくは細胞増殖性障害、動脈硬化
の患者に対する従来の投与法(例えば局所注射、吸入、もしくは全身投与などだ がそれらに限定されない)による直接投与である。上述のとおり、HBGFの投与は 創傷治癒を促進し、組織の修復もしくは再生、または子宮内膜の増殖と発達を誘
発することができる。また、試薬、製剤、もしくは組成物も、HBGFをコードする
遺伝子を送達、ターゲティング、および発現する方法として本明細書に記載の方
法もしくは当分野で既知のいずれかの方法によって、特異的細胞もしくは受容体
を標的とすることができる。線維性障害、硬化性障害、細胞増殖性障害、動脈硬
化または創傷治癒を変調させる試薬、製剤、もしくは組成物の実際の投与量は、
生物体の大きさおよび健康状態を含む多数の因子によって左右される。しかし当
業者であれば下記の教材で述べられている方法および技法を臨床投与量決定のた
め(Spilker B., Guide to Clinical Studies and Developing Protocols, Raven
Press Books, Ltd., New York, 1984, pp.7-13, 54-60; Spilker B., Guide to
Clinical Trials, Raven Press, Ltd., New York, 1991, pp.93-101; Craig C.
,とR.Stitzel編, Modern Pharmacology, 第2版, Little, Brown and Co., Bosto
n, 1986, pp.127-33; T. Speight編, Avery's Drug Treatment: Principles and
Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 第3版, WilliamsとWi
lkins, Baltimore, 1987, pp.50-56; R.Tallarida, R.Raffa,およびP. McGonigl
e, Principles in General Pharmacology, Springer-Verlag, New York, 1988,
pp.18-20)、または使用に適切な投与量を決定するために用いることができるが 、通常は最終濃度でおおよそ0.5μg/mlおよび500μg/mlの間の範囲を製薬上許容
しうるいずれかの担体中に含有させて成人1日あたりの投与量とする。

【００４９】 また本発明は対象中のHBGFの異常なレベルでの存在を検出する方法も提供し、
それは異常なHBGFレベルに関係する状態または病理の存在を決定するために診断
的にも用いることができる。そのような状態としては、細胞増殖障害、強皮症、
関節炎、肝硬変、および子宮線維症を含む各種の線維症状態が含まれるがそれら
に限定されない。例えばHBGFを含有していることが考えられるサンプルを対象か
ら得て、HBGFポリペプチドのレベルを測定し、正常組織サンプル中のHBGFポリペ
プチドのレベルと比較する。HBGFのレベルは、例えば抗HBGFポリペプチド抗体を
用いたイムノアッセイで測定することができる。そのようなアッセイ法のその他
の変法としてはラジオイムノアッセイ(RIA)、ELISAおよび免疫蛍光法がある。ま
た別に、同じ目的でHBGFポリペプチドmRNAの検出および定量に核酸プローブを用
いることができる。

【００５０】 下記の実施例は当業者に対して本発明のHBGFの作成法および使用法の完全な開
示および説明を提供するために示したものであり、発明者が本発明として考えて
いる範囲をこれらの実施例が制限することを意図しておらず、またそのようにみ
なされるべきでもない。本明細書中に用いた数値(例えば量、時間、温度など)に
関してその正確性を確保する努力は行ってきたが、いくらかの実験誤差および偏
差は斟酌されるべきである。特に記さない限りは、部は重量部、分子量は重量平
均分子量、温度は摂氏温度、および圧力は大気圧もしくはそれに近いものである
。

【００５１】 （実施例1）HBGFポリペプチドの特徴付け及び精製 月齢が約8ヶ月以下の屠殺場のブタからランダムに子宮を集めた。各々の子宮 角を冷（4℃）リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でフラッシュし、子宮管腔（lumina
l）成分を集めた。120頭までの動物から得られたULFの4リットルプールに対して
増殖因子の精製を行った。子宮管腔フラッシュ液（ULF）を13,500×gで30分間、
4℃で遠心分離することによって清澄化し、その上清をガラスウールに通過させ た。

【００５２】 清澄化したULF上清の4リットルサンプルを、予めPBS、0.2M NaClで平衡化し たBioRex70カチオン交換カラム（5×6cm；Bio-Rad）に４℃でのせた。サンプル をのせた後、カラムを500mlのPBS、0.2M NaClで洗浄し、PBS中0.2-2M NaClの勾 配500mlを用いて結合したタンパク質を溶離した。流速は全体を通して3.5ml／分
であり、カラムをNaCl勾配で処理している間に10mlの画分を集めた。Balb／c 3T
3線維芽細胞に対するマイトジェン活性を示す画分をさらに用いるために選択し た。続くクロマトグラフィー工程は全て室温で行った。

【００５３】 ULFのイオン交換クロマトグラフは、0.3-0.6M NaClによってBioRex70カラム から溶離されたBalb／c 3T3細胞に対するカチオン性増殖因子活性の存在を示し た。ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーでは、EconoPacヘパリンカラム
からの溶離に0.8M NaClを要するさらなる未同定のHBGFポリペプチドの存在が明 らかになった。カラムから回収された生物活性の量の観点からは、溶離に0.8M N
aClを要する画分が3T3細胞に対する主要カチオン性ヘパリン結合増殖因子である
ように思われた。ヘパリンアフィニティーカラムからのHBGFポリペプチドの溶出
位置はPDGF、HB-EGF、PTN、aFGF、bFGF、及びアンフィレグリンとは明らかに異 なっていた。HBGFマイトジェン活性を熱（100℃で2分間もしくは56℃で30分間）
又は酸（pH2.0で2分間）に晒すことにより破壊した。

【００５４】 HBGFが約10,000ダルトンの見かけの相対分子量を有していることを示すのにゲ
ル濾過クロマトグラフィーを用いた。これらの研究のため、30頭の動物に由来す
るULFのEconoPacヘパリンアフィニティーFPLCからの0.8M NaCl溶離液を含む画分
0.5mlを、0.5ml／分で、SWガードカラム（4cm×8mm、10μm；TosoHaas）を備え るTSK G2000 SW FPLCカラム（30cm×8mm、粒径10μm、M、500-100,000分画範囲 ；TosoHaas）にかけた。タンパク質は0.3M NaClを含むPBSで溶離した。200μlの
画分を集め、3T3細胞におけるDNA合成を刺激するそれらの能力について試験した
。カラムの較正は、EGF（6,000ＭＷ）、ラクトアルブミン（14,200ＭＷ）、トリ
プシン阻害剤（20,100ＭＷ）、及び卵白アルブミン（45,000ＭＷ）を用いて行っ
た。画分を、上述の通りに、40μl／mlで3T3細胞におけるDNA合成を刺激するそ れらの能力について試験した。

【００５５】 HBGF活性を含む画分（カチオン交換クロマトグラフィー及びヘパリンアフィニ
ティークロマトグラフィーの後に集められた画分16-19）をプールして希釈し、T
SKヘパリン5PWカラムを用いるヘパリンアフィニティーFPLCの第2サイクルに処し
た。この第2ヘパリンアフィニティー精製工程を行うため、EconoPacヘパリン精 製工程からの0.8M NaCl溶出液を含む生物学的に活性なHBGF画分をプールし、20m
Mトリス-HCl（pH7.4）で3倍に希釈して、0.2μmフィルターを通過させることに より清澄化した。このサンプルを2ml／分でTSKヘパリン5PWカラム（0.8×7.5cm ；TosoHaas、Philadelphia、PA）にかけ、それを、バッファからCHAPSを除き、 かつ0.5mlの画分を集めたことを除いて、上述の通りに洗浄及び溶出した。0.8M
NaClによって溶離され、かつ3T3細胞のマイトジェン活性を示すタンパク質を含 む画分を、画分31-34（ピーク1）並びに画分35及び36（ピーク2）からなる2つの
プールに分割した。HBGFポリペプチドを再度0.8M NaClで溶離したが（画分31-36
）、異なるヘパリン結合特性を有するマイトジェン活性の2つのピークとして分 離された。これらの活性ピークを、画分31-34についてはHGBF-0.8-P1、画分35及
び36についてはHGBF-0.8-P2と命名した。

【００５６】 HBGF-0.8-P1及び-P2を10％アセトニトリル、0.1％トリフルオロ酢酸に合わせ て調整し、個別にC₈逆相HPLCにかけた。逆相HPLCは、Hitachi HPLCシステム（Hi
tachi Instruments Inc.、Danbury CT）で、10％（v／v）アセトニトリル及び0.
1％（v／v）トリフルオロ酢酸を含む水で平衡化したC₈カラム（0.46×25cm、粒 径5μm；Rainin Instrument Co.、Woburn、MA）を用いて行った。TSKヘパリン精
製工程からのピーク1及び2を含むプールした画分を、10％アセトニトリル、0.1 ％トリフルオロ酢酸を含むように個別に調整し、0.2μmフィルターを通過させる
ことにより清澄化した。結合したタンパク質の溶離の条件は、サンプル注入後0 から10分が10％アセトニトリル、10分から146分が10-90％であった。流速は全体
を通して1ml／分であり、そのクロマトグラム（A₂₁₄）を記載される通りに記録 した（Bray及びBrigstock, (1994) Amer. Lab. 26, 38）。溶出液を0.5mlの画分
として50μlの125mM NaOHを含有するシリコン処理チューブに集め、トリフルオ ロ酢酸を直ちに中和した。選択された画分の80μlアリコートをSpeedVac濃縮器 （Savant Instruments、Farmingdale、NY）において乾燥するまで蒸発させ、25 μlの10mMトリス-HCl（pH7.4）で戻した。この濃縮物のうちの10μlをそれらの3
T3細胞DNA合成の刺激について検定し、10μlを分析用SDS-PAGEに用いた。第2工 程C₈ HPLC精製については、第1 HPLC工程からの2つの活性画分をプールし（合計
容積1ml）、水、0.1％トリフルオロ酢酸で5倍希釈して、本明細書中に記載され るものと同じクロマトグラフィー溶出条件に処した。HGBF-0.8-P1及び-P２の溶 出位置を、蒸発させてPBSで戻した後の、カラム溶出液を含む画分のアリコート の生物検定により決定したところ、このHPLC工程の過程でpH＝2に長期間（約30 ないし40分）晒されていたにもかかわらず、検出及びさらなる特徴付けを可能に
するのに十分な活性が精製HGBFサンプル中に存在することが示された。

【００５７】 HPLCに続いて、HBGF-0.8-P1又は-P２のいずれかを含む画分の銀染色SDS-PAGE 分析を、記載される通りに（Kim, G.Y.ら, (1995) Biol.Reprod. 52, 561-571）
、還元条件下で、18％ポリアクリルアミドミニゲルを用いて行った。続いて、タ
ンパク質の銀染色を記載される通りに行った（Wray, W.ら, (1981) Anal Bioche
m. 118, 197-203）。SDS-PAGEは、（i）HPLC精製増殖因子、（ii）8μlの非分画
ULF、又は（iii）10mMトリス-HCl、0.5M NaCl（pH7.4）の存在下でヘパリン−セ
ファロースの20μlベッドを通過させ、続いてSDS-PAGEサンプルバッファでその ヘパリンビーズを抽出した後のULF 100μl、に対して行った。次に、ゲルを記載
される通りに調製した（Kim, G.Y.ら, (1995) Biol.Reprod. 52, 561-571）。続
く分析により、Balb／c 3T3マイトジェン活性と共に精製される単一の10kDaタン
パク質の存在が明らかになった。マイトジェン活性のレベルはこの10kDaタンパ ク質のレベルと直接的に相関し、これは銀染色によって示されるように完全に純
粋であった。18の個別のHPLC精製から得られた結果により、この10kDaタンパク 質（1種類もしくは複数種類）とHBGF-0.8-P1及び-P2のマイトジェン活性との直 接の因果関係が確認された。

【００５８】 個々の精製工程の分析により、342mgの粗ULFタンパク質から0.5-1.1μｇのHBG
F-0.8-P1又は-P2が各々精製され、出発物質1リットル中の66,666単位と比較して
HBGF-0.8-P1又はP2について10-22活性単位が第1 HPLC工程の後に回収されること
が示された（表1）。HBGFペプチド-0.8活性の見かけ上の低い回収率が（i）粗製
及び部分精製サンプル（2、8、9、12、25-27）の3T3細胞マイトジェン活性全体 に対するIGF、EGF、PDGF、bFGF、HB-EGF、及びPTNの主要な寄与並びに（ii）HPL
C分離工程（1つもしくは複数）の間のHBGFペプチド-0.8マイトジェン活性の酸不
安定性によるものであることに注意すべきである。より大きい比活性を有する精
製増殖因子を回収しようとする代わりの方策が試みられたが、最終生成物の純度
を損なうことなく、イオン対形成のための逆相HPLC又はトリフルオロ酢酸のいず
れかの使用を回避することは不可能であった。それらの生物学的活性の観点から
はHBGF-0.8-P1及び-P２の回収率が幾らか損なわれたものの、はっきりとSDS-ポ リアクリルアミドゲルの単一の均質10kDaバンドに起因するものだとするのに十 分な活性をそれらが保持し、かつ十分な量の各々のタンパク質が数リットルのUL
Fから単離されたことから、これらのタンパク質の構造的な特徴付けは容易に達 成された。

【００５９】

【表１】 表1 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 精製工程 回収された ED₅₀ ^a 総活性 回収された 精製因子 タンパク質 活性 ng ng／ml 単位 ％ 粗ULF 3.4×10⁸ 25,650 66,666 100 BioRex 70 2.2×10⁷ 3825 28,649 43 7 EconoPac Hep 4.8×10⁵ 3225 744 1.1 8 HBGF-0.8-P1 TSK-Hep 2.1×10⁵ 2230 473 0.7 11 C₈HPLC、工程１^d 1100 250 22 0.03 103 C₈HPLC、工程２^d 100 25 20 0.03 1026 HBGF-0.8-P2 TSK-Hep 2.9×10⁴ 417 347 0.5 62C₈HPLC^d 500 250 10 0.015 103 ^a 最大DNA合成の50％をもたらすのに要するHBGF-0.8調製品の濃度。^b 1単位の活性はED₅₀をもたらすのに要するHBGF-0.8の量である。^c 粗ULFとの比較。^d 酸露出のために生物活性が減少した。

【００６０】 （実施例２）HBGFポリペプチドの配列決定 HPLC精製増殖因子を含む画分をプールして乾燥させ、分離用SDS−PAGEにかけ た。ゲル中のタンパク質を、300mAで90分間、10mM CAPSバッファ（pH11）を用い
て二フッ化ポリビニリデン膜に転写した。そのブロットを50％メタノール中の0.
1％クーマシーR250で2分間染色することにより目的のタンパク質の位置を決定し
、次いで50％メタノール、10％酢酸で脱染した。各々の10kDaタンパク質バンド の半分を切り出し、モデル470A気相シーケンサー（Applied BioSystems、Foster
City、CA）でのN末端アミノ酸配列決定に処した。フェニルチオヒダントイン誘
導体をC₁₈逆相HPLCによって同定した。HBGF−0.8−P1については16残基の配列（
第10残基は未決定）が得られ、HBGF−0.8−P2については12残基の配列（第9残基
は未決定）が得られた（表2）。これらのデータは、HBGF−0.8−P1及び−P2が、
HBGF−0.8−P1のN末端に付加したGlu残基の存在を除いて、N末端同一であること
を示した。GenBank^TMを検索したところ、これらの配列が、hCTGF及びマウスfisp
−12（別名βIG−M2）、CTGFのマウス相同体の推定内部配列と完全に整列するこ
とが明らかとなった（Bradham, D.M.ら, (1991) J.Cell Biol. 114, 1285-1294 ；Ryseck, R-P.ら, (1991) Cell Growth Differ. 2, 225-233；Brunner, A.ら,
(1991) DNA Cell Biol. 10, 293-300）。HBGF−0.8−P1のサイクル10及びHBGF−
0.8−P2のサイクル9に存在する指定のない残基は、hCTGFのCys²⁵⁶及びfisp−12 のCys²⁵⁵に対応する（表2）。

【００６１】

【表２】

【００６２】 これらのHBGF−0.8−P1及び−P２の部分配列が実際にブタCTGF（pCTGF）分子 中に存在することを検証するため、³²Ｐ標識hCTGFプローブを用いるブタ子宮内 膜cDNAライブラリのハイブリダイゼーション・スクリーニングによって完全長pC
TGF cDNAを単離した。これらの研究のため、全ブタ子宮内膜RNAを、文献の記載 に従って取得した（Kim, G.Y.ら, (Biol.Reprod. 52, 561-571 (1995))。poly(A
) Tract mRNA単離システム（Promega、Madison、WI）を用いてポリ（A⁺）RNAを 単離し、その5μgを、モロニー・マウス白血病ウイルス逆転写酵素及びXhoI部位
を含むオリゴ（dT）リンカー・プライマーを用いる第1鎖cDNA合成に供した。第2
鎖合成は、そのmRNA−cDNA複合体をRNアーゼで処理することによって開始した。
二本鎖cDNAをクレノウ断片を用いて平滑末端化し、それをEcoRIアダプターにラ イゲートした後、T4ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した。Sephacryl S−4
00カラムで精製したXhoI消化cDNA 100ngを1μgのUni−ZAP XRベクター・アーム のXhoI−EcoRI多重クローニング部位にライゲートし、その産物をGigapack IIパ
ッケージング抽出物（Stratagene、La Jolla、CA）を用いてパッケージングした
。この一次ライブラリーをXL1−Blue MRF'細胞において1.4×10¹⁰プラーク形成 単位／mlの力価まで増幅させた。

【００６３】 予想されるhCTGF一次翻訳産物の3’末端に相当する検証済みの³²Ｐ標識CTGFプ
ローブを、ヒト包皮線維芽細胞由来のRNAの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応に より、フォワード及びリバースプライマー、それぞれ、5’−GCCGTCTAGAGCGGCCG
CATGGAAGAGAACATTAAGAAGGG−3’（配列番号3）及び3’−CCTCTGTACCGTACTTAAGCG
CCGGCGACC−5’（配列番号4）を用いて得た。そのプローブを用いて10⁶プラーク
をスクリーニングしたところ、そのうちの2つが再現性のあるハイブリダイゼー ションを示し、それらをRapid Excision Kit（Stratagene）を用いて単離した。
pBSK−pBSK−pCTGF1及びpBSK−p−pCTGF2と命名された2つの〜5.0キロ塩基対pBl
uescript SKブタCTGFクローンが得られ、これらを初期配列決定反応に用いた。 次に、pBSK−pCTGF1を、手動及び自動ジデオキシ・ターミネータ配列決定（Sang
er, F.ら, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74, 5463-5467 (1977)）の組み合わせに
よって完全に配列決定した。DNAの両鎖から配列データを得た。HBGF−0.8−P1及
び−P2の配列は表2に記載されている。

【００６４】 クローン化したブタCTGF cDNAは1.51キロ塩基対であり、1,047塩基対のオープ
ンリーディングフレームを有するものと決定された。pCTGFの一次翻訳産物は349
個のアミノ酸を含み、HBGFペプチド−0.8配列の残基247〜262を含むものと予想 される（表2）。アミノ酸のレベルでは、pCTGFはfisp−12及びhCTGFと約〜92％ 同一である。その推定26残基シグナルペプチドを開裂した後には、pCTGFは323個
のアミノ酸を含み、かつhCTGF及びfisp−12において完全に保存される38個のCys
残基を含むものと予想される。

【００６５】 （実施例３）HBGF抗体の産生 HBGFは末端切断型CTGFの微小不均一形態を表すので、CTGFに対するHBGFの関係
を調べた。出発物質における10kDaタンパク質の存在を、非分画ULFサンプルのウ
ェスタンブロッティングにより、HPLC精製HBGFポリペプチドと反応するCTGF抗体
を用いて確認した。

【００６６】 抗体を産生するため、配列EENIKKGKKCIRTP（残基247−260）（配列番号5）を 含む四分岐多抗原性CTGF−（247−260）ペプチドをSynergy 432Aペプチド合成装
置（Applied BioSystems）で産生し、C₁₈カラム（0.46×36cm；Rainin Instrume
nts）を用いる逆相HPLCにより、そのカラムを90分の5−95％アセトニトリル水溶
液勾配、0.1％トリフルオロ酢酸で展開して精製した。精製されたポリペプチド を含む画分をプールし、乾燥するまでエバポレートして、滅菌水中に再構成した
。採血して免疫前血清を採取した2羽のニュージーランド・ホワイト・ラビット （ウサギA及びB）にフロイント完全アジュバント中のポリペプチド1mgを皮下投 与し、3週間後にフロイント不完全アジュバント中のポリペプチド250μgを筋肉 内注射した。抗血清を採取するため、7日後に動物から採血した。これらの抗血 清の反応性をウェスタンブロッティング及び免疫沈降により確認した。ウサギA からの免疫前血清及び抗血清を次の実験において用いた。

【００６７】 （実施例４）10kDa HBGFポリペプチドの生成 ウェスタンブロッティングを文献に記載されている通りに行った（Harlow及び
Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborato
ry, New York, 現行版）。簡単に述べると、SDS−PAGEは、文献に記載されてい るように（Kim, G.Y.ら, Biol. Reprod. 52, 561-571 (1995)）、還元条件下で1
8％ポリアクリルアミドミニゲルを用いて行った。タンパク質の銀染色は文献に 記載されている通りに行った（Wray, W.ら, Anal. Biochem. 118, 197-203 (198
1)）。ウェスタンブロッティングは、（i）HPLC精製増殖因子、（ii）8μlの非 分画ULF、又は（iii）10mMトリス−HCl、0.5M NaCl（pH7.4）の存在下でヘパリ ン−セファロースの20μl床を通過させ、続いてSDS−PAGEサンプルバッファでそ
のヘパリンビーズを抽出処理した後のULF 100μlに対して行った。ゲルを文献に
記載されている通りにブロット及びブロックし（Kim, G.Y.ら, Biol. Reprod. 5
2, 561-571 (1995)）、ウサギ免疫前血清の1：1,000希釈液又はウサギ抗pCTGF−
（247−260）ペプチド抗血清（ウサギA）の1：1,00希釈液と共にインキュベート
した。免疫反応性バンドを、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギIgG、次 いでニトロブルーテトラゾリウム／リン酸5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリ ル色素生成基質を用いて可視化した。

【００６８】 10kDaタンパク質に加えて、CTGFのさらに2種類の質量形態（16及び20kDa）もU
LF中に存在していたが、38kDa CTGFの有力な証拠は得られたなかった。このウェ
スタンブロットからは、さらに、HPLC精製HBGFが単一の免疫反応性10kDaタンパ ク質を含むことが立証された。希釈していない子宮液の所定の容量（すなわち、
0.7−2.3μl）に由来するHBGFの染色強度とマイトジェニックな量の精製HGBFの 染色強度とを比較することで、マイトジェニックな濃度のHBGFがin vivoで子宮 液中に存在することが示された。まとめると、ULFが検出可能な濃度の38kDa CTG
Fは含まないものの、マイトジェン性であるものと思われる量でHBGFを含むこと を示すデータは、HBGFがin vivoで自然に生じるものであって、精製の間に38kDa
CTGFが分解する結果ではないことを示す。

【００６９】 （実施例５）HBGFポリペプチドのヘパリン結合特性 HBGFポリペプチド0.8−P1のN末端のさらなる酸性Glu残基の存在は、HBGF−0.8
−P2と比較した場合のこの分子の低いヘパリン親和性に相関しており、これはHB
GFペプチド−0.8のN末端がヘパリン結合ドメインの一部であり得ることを示唆し
ている。CTGF分子のN末端領域に加えて他の部分のヘパリン結合特性を試験する ため、hCTGFの全C末端103残基にまたがる18のポリペプチドの［³H］ヘパリンと 結合する能力を調べた。

【００７０】 CTGFの全103C末端残基にまたがる18の合成ペプチドを合成し、Chiron Mimotop
es（Clayton、Victoria、オーストラリア）から開裂したPepSet^TMとして得た。 全てのポリペプチドは、遊離Ｎ−末端アミンを用いて合成したCTGF−（247−255
）及びCTGF−（247−260）、並びに酸C末端を用いて合成したCTGF−（326−349 ）及びCTGF−（339−349）を除いて、アセチル化N末端及びアミド化C末端を用い
て合成した（表3）。

【００７１】 全てのポリペプチドはCys残基を1個含むか、又は全く含んでいなかった；CTGF
（285−292）のCys²⁹²及びCTGF−（318−328）のCys³²⁵は、それぞれのポリペプ
チド内のCys²⁸⁷又はCys³²³への鎖内ジスルフィド架橋を防止するためにSerで置 換した。ヘパリン結合特性を、Bairdらの方法（Baird, A.ら, Proc. Natl. Acad
. Sci. U.S.A. 85, 2324-2328 (1988)）を適応させて決定した。簡単に述べると
、各々のペプチド37.5nmolをドット・ブロット装置を用いてニトロセルロースに
2回吸収させた。このブロットを10mMトリス−HCl、0.15M NaCl、0.1％ウシ血清 アルブミン（pH7.4）で30分間ブロックした後、10μCi／ml［³H］ヘパリン（NEN
Life Science Products）を含むこの溶液中で、室温で3時間インキュベートし た。該ブロットを10mMトリス−HCl、0.15M NaClで4回洗浄し、［³H］をカウント
するために個々のドットをシンチレーション液と混合した。

【００７２】 これらの合成ポリペプチドで得られた結果が表3にまとめられている。最高レ ベルのヘパリン結合は残基247−260、274−286、及び305−328を含むポリペプチ
ドについて得られた。これらのポリペプチドのうちで、3T3細胞DNA合成アッセイ
においてHBGFポリペプチドアゴニスト又はアンタゴニスト活性を有するものはな
かったことに注意するべきである。

【００７３】

【表３】

【００７４】 従来の研究では、ヘパリンがbFGF、HB−EGF、及びアンフィレグリンなどの幾 つかのHBGFポリペプチドの受容体結合及び生物学的活性を調節することが示され
ている（Besner, G.E.ら, Growth Factors 7, 289-296 (1992)；Higashiyama, S
.ら, J. Cell Biol., 122, 933-940 (1993)；Rapraeger, A.C.ら, Science 252,
1705-1708 (1991)；Olwin, B.B.ら, J. Cell Biol. 118, 631-639 (1992)；Coo
k, P.ら, J. Cell Physio. 163, 418-429 (1995)；Yayon, A.ら, Cell 64, 841-
848 (1991)；Aviezer, D.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 12173-12177
(1994)）。HBGFペプチド−0.8がヘパリンに対する強い親和性を示したため、HB
GFペプチド−0.8のマイトジェン活性に対するこのグリコサミノグリカンの効果 を調べた。高刺激用量のHBGFペプチド−0.8の活性は、1−3μg／mlのヘパリンで
有意に高められたが、30−100μg／mlのヘパリンで阻害された。同じヘパリン投
与量は、3T3細胞における基礎（basal）又は仔ウシ血清刺激DNA合成に対しては 効果がなかった。

【００７５】 （実施例６）HBGFマイトジェン性アッセイ IGF−1、EGF、bFGF、及びPDGF−ABに対するHBGFの相対マイトジェニック能を 評価するため、3T3細胞でのDNA合成アッセイを行った（表4）。Bio−Rexカラム からの0.3−0.6M NaCl溶出液を含む生物学的に活性の画分をプールし、0.1％CHA
PSを含む20mMトリス−HCl（pH7.4）で3倍希釈し、0.45μmメンブランフィルター
を通過させ、シリコン処理ポリプロピレン容器に入れ、蠕動ポンプを用いてEcon
oPacヘパリンカラム（0.7×3.6cm；Bio-Rad）に2ml／分でかけた。次に、そのヘ
パリンカラムを50mlの20mMトリス−HClバッファ、0.2M NaCl、0.1％CHAPSで洗浄
し、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）システム（Pharmacia Biot
ech Inc.）を用い、20mMトリス−HCl、0.1％CHAPS（pH 7.4）中の0.1−2.0M NaC
lの勾配40mlを用いて、1ml／分で展開した。NaCl勾配溶出の間に画分（1ml）を シリコン処理チューブに集め、3T3細胞マイトジェン活性について試験した。

【００７６】 カラム画分を、文献に記載されているように（Kim, G.Y.ら, Biol. Reprod. 5
2, 561-571 (1995)）、96ウェル培養プレートにおいて200μlのダルベッコ改変 イーグル培地、10％仔ウシ血清中で増殖させた集密休止Balb／c 3T3細胞のDNAへ
の［³H］チミジンの取り込みによって測定される、DNA合成を刺激するそれらの 能力について試験した。ULFから精製した増殖因子に対する用量−応答曲線を、 各々の用量を3回アッセイし、データを平均±S.D.として算出することにより確 立した。増殖因子の活性に対する1−100μg／mlブタヘパリン（Sigma）の効果の
統計的有意性をスチューデントｔ検定によって決定した。

【００７７】 HBGFペプチドによる［³H］チミジンの取り込みは、IGF又はEGFのようなより弱
いマイトジェンよりもむしろ仔ウシ血清又は精製PDGFもしくはbFGFに匹敵するも
のであった。さらに、HBGFの3T3マイトジェン活性及び生物学的活性が10ng／ml
IGF−I、10ng／ml PDGF、3ng／ml EGF、又は0.3ng／ml bFGFによって相乗的に 増強されることが見出された。

【００７８】 標的細胞特異性を、Balb／c 3T3細胞、ウシ毛細血管内皮細胞（BCEC）、及び 血管平滑筋細胞を用いて研究した。3T3細胞は上述の通りに用いた。BCECはDr. J
. Folkman（Children's Hospital、Boston、MA）から入手し、ゼラチン化培養フ
ラスコ内の3ng／ml bFGF及び10％熱不活性化仔ウシ血清を含むダルベッコ改変イ
ーグル培地において維持した。平滑筋細胞は2−3cm長のブタ胸部大動脈から確立
された手順（Weich, H.A.ら, Growth Factors 2, 313-320 (1990)）を用いて単 離し、10％ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清において維持した。
BCEC及び平滑筋細胞DNA合成アッセイは、本質的には文献に記載されている通り に（Besner, G.E., Higashiyama, S., 及びKagsbrun, M. Cell Regul. 1, 811-8
19 (1990)）、48又は96ウェルプレートにおいて行った。BCEC DNA合成アッセイ は100μg／mlブタヘパリンの存在下においても行った。HGBFは平滑筋細胞に対し
てマイトジェン性であることが見出され、EGFの最大量を超えるレベルの刺激を もたらしたが、bFGFよりは下回った。HBGFは、単独で又は100μgのヘパリンの存
在下で試験した場合には、内皮細胞に対するマイトジェン活性を欠いていた（表
4を参照）。

【００７９】

【表４】

【００８０】 現時点で好ましい態様を参照して本発明を説明したが、本発明の精神から逸脱
することなく様々な改変をなし得るものと理解されるべきである。したがって、
本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定される。

【図面の簡単な説明】

下記の図面は本発明の実施形態を説明するものであって、請求項によって包含
される本発明の範囲を限定することを意図したものではない。

【図1a】 子宮の内腔洗浄物のヘパリンアフィニティークロマトグラフィー
画分をDNA合成刺激についてアッセイした結果を示している。

【図1b】 DNA合成のアッセイで陽性を示したサンプル(図1aから)をさらに ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーに供した結果を示しており、その図
では主たる成分のピーク(P1およびP2と表示)はHBGF-0.8ポリペプチドを示す。

【図2】 HBGF-0.8ポリペプチドのゲルろ過クロマトグラフィープロフィー ルを示す。

【図3aおよび3b】 HBGF-0.8ポリペプチドの逆相HPLCおよびSDS-PAGE結果を
示す。

【図4】 未精製子宮内腔洗浄物のウエスタンブロット分析を示す。

【図5】 HBGF-0.8ポリペプチドのマイトジェン活性の影響を示す。

【図6】 HBGF-0.8ポリペプチドとCTGF一次翻訳産物との間の関連を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 16/22 Ｃ０７Ｋ 14/475 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/22 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 15/00 ＺＮＡＡ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/24 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA01 BA02 DA02 DA05 GA11 GA18 GA19 HA01 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA17 BA44 DB52 DB54 DB55 DB61 MA02 ZA452 ZA812 ZA892 4H045 AA10 BA10 CA46 DA20 EA23 EA26 FA74

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項1】 実質的に純粋なポリペプチドであって： a)結合組織増殖因子(CTGF)タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸に対応する
   アミノ酸配列を有し、 b)ヘパリンに結合し、かつ約0.8Mの塩でヘパリンから溶出され、および c)還元SDS-PAGEにより約10kDaの分子量を持つ、 ことを特徴とするポリペプチド。
2. 【請求項2】 ポリペプチドがCTGFのN末端から247番目のアミノ酸残基から 始まるアミノ酸配列を有する、請求項1記載のポリペプチド。
3. 【請求項3】 ポリペプチドがCTGFのN末端から248番目のアミノ酸残基から 始まるアミノ酸配列を有する、請求項1記載のポリペプチド。
4. 【請求項4】 請求項1、2、または3のいずれか1項に記載のアミノ酸配列を 有するポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド配列。
5. 【請求項5】 請求項4記載のポリヌクレオチドを含有する組換え発現ベクタ
   ー。
6. 【請求項6】 請求項5記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
7. 【請求項7】 原核細胞である、請求項6記載の宿主細胞。
8. 【請求項8】 真核細胞である、請求項6記載の宿主細胞。
9. 【請求項9】 請求項1記載のポリペプチドと結合し、かつそのポリペプチド
   の免疫反応性断片と結合する抗体。
10. 【請求項10】 ポリクローナルである、請求項9記載の抗体。
11. 【請求項11】 モノクローナルである、請求項７記載の抗体。
12. 【請求項12】 動脈硬化、または線維症性、硬化性、もしくは細胞増殖性障
    害を治療する方法であって、 a)結合組織増殖因子(CTGF)タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸に由来す
    るアミノ酸配列を有し、 b)ヘパリンに結合し、かつ約0.8Mの塩でヘパリンから溶出され、および c)還元SDS-PAGEにより約10kDaの分子量を持つ、 ことを特徴とするポリペプチドのアンタゴニストの治療的有効量を細胞と接触さ
    せることを含んでなる方法。
13. 【請求項13】 創傷治癒促進をそのような治療を必要とする対象に行う方法
    であって、 a)結合組織増殖因子(CTGF)タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸に由来す
    るアミノ酸配列を有し、 b)ヘパリンに結合し、かつ約0.8Mの塩でヘパリンから溶出され、および c)還元SDS-PAGEにより約10kDaの分子量を持つ、 ことを特徴とするポリペプチドを含有する組成物の治療的有効量を細胞と接触さ
    せることを含んでなる方法。
14. 【請求項14】 細胞が上皮細胞、筋細胞、結合組織細胞および内皮細胞から
    なる群から選択されたものである、請求項12または13記載の方法。
15. 【請求項15】 結合組織細胞が大グリア細胞、線維芽細胞、破骨細胞、骨芽
    細胞、および軟骨細胞からなる群から選択されたものである、請求項14記載の方
    法。
16. 【請求項16】 筋細胞が平滑筋細胞である、請求項14記載の方法。
17. 【請求項17】 筋細胞が心筋細胞である、請求項14記載の方法。
18. 【請求項18】 内皮細胞が毛細血管内皮細胞である、請求項14記載の方法。
19. 【請求項19】 上皮細胞が分泌上皮細胞である、請求項14記載の方法。
20. 【請求項20】 インシュリン様増殖因子(IGF-I)、血小板由来増殖因子(PDGF
    )、上皮増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)、および塩基
    性線維芽細胞増殖因子(bFGF)からなる群から選択された増殖因子を細胞と接触さ
    せることをさらに含んでなる、請求項12または13記載の方法。
21. 【請求項21】 ヘパリンを細胞と接触させることをさらに含んでなる、請求
    項20記載の方法。
22. 【請求項22】 ヘパリンの濃度が約1μg/mlから100μg/mlである、請求項21
    記載の方法。
23. 【請求項23】 請求項1記載のポリペプチドの活性に影響を及ぼす化合物を 同定するための方法であって： a)化合物を、請求項1記載のポリペプチドもしくはそのポリペプチドの生 物学的に活性な断片、または請求項1記載のポリペプチドを発現している組換え 細胞と共に、それらの成分が相互作用するために十分な条件下でインキュベート
    し、 b)請求項1記載のポリペプチドの活性もしくは発現に対するその化合物の 影響を求める、 ことを含んでなる方法。
24. 【請求項24】 影響が請求項1記載のポリペプチドの活性もしくは発現の阻 害である、請求項23記載の方法。
25. 【請求項25】 影響が請求項1記載のポリペプチドの活性もしくは発現の刺 激である、請求項23記載の方法。
26. 【請求項26】 HBGFに関連することを特徴とする状態を有することが疑われ
    る対象においてHBGF状態を診断するための方法であって、対象からHBGFを含有し
    ている可能性のあるサンプルを得て、該サンプル中のHBGFのレベルを測定し、該
    サンプル中のHBGFレベルを正常な標準サンプルと比較すること、を含んでなる方
    法。
27. 【請求項27】 状態が、動脈硬化、線維症、硬化症もしくは細胞増殖性障害
    からなる群から選択されたものである、請求項26記載の方法。
28. 【請求項28】 HBGFに関連する状態を治療する方法であって、その状態を有
    している対象に対して製薬上許容しうる担体中のHBGF反応性試薬の治療的有効量
    を投与することを含んでなる方法。
29. 【請求項29】 状態が細胞増殖の過剰によって特徴づけられる細胞増殖性障
    害である、請求項28記載の方法。
30. 【請求項30】 細胞増殖の過剰が結合組織細胞の過剰によるものである、請
    求項29記載の方法。
31. 【請求項31】 HBGF反応性試薬がHBGFのアンタゴニストである、請求項28記
    載の方法。
32. 【請求項32】 アンタゴニストがHBGFポリペプチドと特異的に結合する抗体
    である、請求項31記載の方法。
33. 【請求項33】 状態が細胞増殖障害であって、かつ細胞増殖の欠損によって
    特徴づけられる、請求項28記載の方法。
34. 【請求項34】 製薬上許容しうる担体中に治療的有効量のHBGFを含んでなる
    医薬組成物。
35. 【請求項35】 子宮内膜もしくは胎盤膜の増殖を変調させる方法。