ES2307322T3 - Polipeptidos factor de crecimiento de union a heparina (hbgf). - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido factor de crecimiento de unión a heparina (HBGF) caracterizado porque: (a) tiene una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos del extremo carboxilo terminal de una proteína factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF), en el que la secuencia de dicho polipéptido HBGF comienza con la secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1 ó 2; (b) se une a heparina y empieza a eluir de la heparina con NaCl 0,8 M; y (c) tiene un peso molecular de aproximadamente 10 kDa en PAGE-SDS en condiciones reductoras.
Description
Polipéptidos factor de crecimiento de unión a
heparina (HBGF).
Esta invención se refiere en general al campo de
los factores de crecimiento, más específicamente a factores de
crecimiento de unión a heparina (HBGF).
Los factores de crecimiento son una clase de
polipéptidos que estimula la proliferación, diferenciación y
organización de células durante el desarrollo de tejidos. La acción
de los factores de crecimiento depende de su unión a receptores
específicos que estimulan un acontecimiento de señalización dentro
de la célula. Entre los ejemplos de factores de crecimiento se
incluyen el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el
factor de crecimiento similar a insulina (IGF-I,
IGF-II), el factor de crecimiento transformante beta
(TGF-\beta), el factor de crecimiento
transformante alfa (TGF-\alpha), el factor de
crecimiento epidérmico (EGF), los factores de crecimiento de
fibroblastos ácido y básico (aFGF, bFGF) y el factor de crecimiento
de tejido conectivo (CTGF) que son conocidos porque estimulan el
crecimiento celular.
PDGF es una proteína termoestable catiónica que
se encuentra en los gránulos alfa de plaquetas en circulación,
conocido como mitógeno y agente quimiotáctico para células del
tejido conectivo, tales como fibroblastos y células de músculo
liso. Debido a las actividades de esta molécula, se considera que el
PDGF es un factor importante implicado en la curación normal de las
heridas y, patológicamente, contribuye a enfermedades como la
aterosclerosis y afecciones fibróticas. PDGF es una molécula
dimérica compuesta por combinaciones de las cadenas \alpha y/o
\beta. Las cadenas forman heterodímeros u homodímeros y todas las
combinaciones aisladas hasta la fecha son biológicamente
activas.
Los estudios sobre la función de diversos
factores de crecimiento en la regeneración y reparación de tejidos
han llevado al descubrimiento de proteínas similares a PDGF. Estas
proteínas comparten tanto actividades inmunológicas como biológicas
con PDGF y pueden bloquearse con anticuerpos específicos de este
factor de crecimiento.
Los factores de crecimiento polipeptídicos y las
citocinas surgen como una clase importante de proteínas uterinas
que pueden formar rutas de señalización de crecimiento entre el
útero materno y el embrión o el feto en desarrollo. Los estudios en
una variedad de especies han sugerido que EGF, el factor de
crecimiento similar a EGF de unión a heparina
(HB-EGF), IGF-I,
IGF-II, aFGF, bFGF, pleiotropina (PTN), el factor de
inhibición de leucemia, el factor estimulante de colonias 1
(CSF-1) y TGF-\alpha pueden
encontrarse entre las moléculas reguladoras del crecimiento uterino
implicadas en estos procesos.
CTGF es un péptido monomérico rico en cisteína
de Mr 38.000, que es un factor de crecimiento con actividades
mitogénicas y quimiotácticas para las células del tejido conectivo.
CTGF es secretado por las células y es activo tras la interacción
con un receptor específico de la superficie celular. CTGF es el
producto de un gen no relacionado con los genes de las cadenas
\alpha o \beta de PDGF. Es un miembro de una familia de
reguladores de crecimiento que incluye a CTGF de ratón (también
conocido como fisp-12 o
\betaIG-M2) y humano, Cyr61 (ratón), Cef10
(pollo) y Nov (pollo). En base a las comparaciones de secuencias, se
ha sugerido que los miembros de esta familia tienen todos una
estructura modular, constituido por (1) un dominio de factor de
crecimiento similar a la insulina responsable de la unión, (2) un
dominio de unión factor von Willebrand responsable de la formación
del complejo, (3) un motivo de trombospondina de tipo I,
posiblemente responsable de la unión a moléculas de la matriz y (4)
un módulo C-terminal encontrado en las proteínas de
la matriz, que se postula como responsable de la unión al
receptor.
La secuencia del ADNc para el CTGF humano
(hCTGF) contiene una fase de lectura abierta de 1.047 nucleótidos
con un sitio de inicio en la posición 130 y un sitio de terminación
TGA en la posición 1.177 y codifica un péptido de 349 aminoácidos.
Presenta sólo una homología de secuencia del 40% entre el ADNc del
CTGF y el ADNc de las cadenas \alpha o \beta del PDGF.
La fase de lectura abierta de hCTGF codifica un
polipéptido que contiene 39 restos de cisteína, lo que indica que
es una proteína con múltiples enlaces disulfuro intramoleculares. El
extremo amino terminal del péptido contiene una secuencia señal
hidrófoba indicativa de una proteína secretada y tiene dos sitios de
N-glicosilación en los restos de asparragina 28 y
225 en la secuencia de aminoácidos. Se observa una homología de
secuencia global del 45% entre el polipéptido CTGF y el polipéptido
codificado por el ARNm trascrito de CEF-10; la
homología alcanza el 52% cuando se deleciona una posible región de
ayuste alternativo.
CTGF está antigénicamente relacionado con PDGF,
aunque la homología de secuencia peptídica, si existe, es pequeña.
El anticuerpo anti-PDGF tiene una afinidad elevada
por las formas no reducidas de PDGF o CTGF y una afinidad diez
veces menor por las formas reducidas de estos péptidos, que carecen
de actividad biológica. Esto sugiere que hay regiones que comparten
estructura terciaria entre los isómeros de PDGF y la molécula de
CTGF, lo que da lugar a epítopos antigénicos comunes.
\newpage
La síntesis y secreción de CTGF están inducidas
selectivamente por TGF-\beta,
BMP-2 y, posiblemente, otros miembros de la
superfamilia de proteínas TGF-\beta. Aunque
TGF-\beta puede estimular el crecimiento de
fibroblastos normales en agar blando, CTGF por sí solo no puede
inducir esta propiedad en los fibroblastos. Sin embargo, se ha
demostrado que la síntesis y la acción de CTGF son esenciales para
que el TGF-\beta estimule el crecimiento de
fibroblastos independiente del anclaje.
Es probable que CTGF actué como factor de
crecimiento en la curación de heridas. Patológicamente, se ha
postulado que CTGF está implicado en afecciones en las que se
observa un sobrecrecimiento de las células del tejido conectivo,
como es la esclerosis múltiple, cáncer, afecciones fibróticas y
aterosclerosis.
La actividad biológica principal del polipéptido
CTGF es su mitogenicidad, o capacidad para estimular la
proliferación de las células diana. El resultado final de esta
actividad mitogénica in vivo es el crecimiento del tejido
diana. CTGF también posee actividad quimiotáctica, que es el
movimiento de células inducido químicamente como resultado de la
interacción con moléculas específicas.
La presente invención se basa en el
descubrimiento, purificación y caracterización de factores de
crecimiento de unión a heparina (HBGF) en las secreciones uterinas.
Estos polipéptidos factores de crecimiento se unen a heparina y
muestran muchas de las características funcionales del CTGF de
longitud completa.
La invención se define en las reivindicaciones.
Para una explicación adicional, en un primer aspecto la presente
invención proporciona polipéptidos de unión a heparina (polipéptidos
HBGF), que se han identificado como dotados de actividad
mitogénica, y los ácidos nucleicos que codifican dichos
polipéptidos.
En un aspecto adicional más de la presente
invención, se proporcionan anticuerpos que se unen a los HGBF.
También se describen en este documento sondas de
ácido nucleico que comprenden moléculas de ácido nucleico de
longitud suficiente como para hibridar específicamente con una
secuencia de ácido nucleico que codifica los HBGF.
Según otro aspecto adicional más de la
invención, se proporciona un procedimiento para el uso de los HBGF,
las moléculas de ácido nucleico que codifican los HBGF o secuencias
complementarias a las moléculas de ácido nucleico que codifican los
HBGF para actuar sobre la curación de heridas, trastornos de la
proliferación celular o escleróticos, aterosclerosis o enfermedad
fibrótica.
Los siguientes dibujos ilustran las
realizaciones de la invención y no pretenden limitar el alcance de
la misma según abarcan las reivindicaciones.
La figura 1a es una ilustración que muestra los
resultados de las fracciones de la cromatografía de afinidad en
heparina de los lavados de la luz del útero en las que se ensayó la
capacidad de estimulación de la síntesis de ADN.
La figura 1b es una ilustración que muestra los
resultados de la cromatografía de afinidad en heparina posterior de
las muestras positivas para la síntesis de ADN (a partir de la fig.
1a) en la que los picos de los componentes principales (marcados
como P1 y P2) representan a los polipéptidos
HBGF-0,8.
La figura 2 es una ilustración que muestra un
perfil cromatográfico de la filtración en gel de los
polipéptidos
HBGF-0.8.
HBGF-0.8.
Las figuras 3a y 3b son ilustraciones que
muestran el perfil del HPLC en fase inversa y el
PAGE-SDS de los polipéptidos
HBGF-0,8.
La figura 4 es una imagen que muestra el
análisis por inmunotransferencia de los lavados de la luz uterina no
purificados.
La figura 5 es una ilustración que muestra el
efecto de la actividad mitogénica de los polipéptidos
HBGF-0.8.
La figura 6 es una ilustración que muestra la
relación entre los polipéptidos HBGF-0,8 y el
producto principal de traducción CTGF.
Se entenderá que la terminología usada en este
documento sólo tiene la intención de describir realizaciones
concretas y no pretende limitar el alcance de la presente invención,
que sólo estará limitada por las reivindicaciones adjuntas.
\newpage
Debería apreciarse que, según se usa en este
documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares
"un/una" y "el/la" incluyen los referentes plurales
siempre que el contexto no dicte lo contrario. Por tanto, por
ejemplo, la referencia a "un organismo" incluye uno o más
organismos diferentes, la referencia a "un aminoácido" incluye
uno o más de tales aminoácidos y la referencia a "un
procedimiento" incluye referencia a etapas y procedimientos
equivalentes conocidos por los expertos en la materia y así
sucesivamente.
Siempre que no se defina de otro modo, todos los
términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el
mismo significado que normalmente entiende un experto en la materia
a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse en la
práctica o ensayo de la invención cualesquiera procedimientos y
materiales similares o equivalentes a los descritos en este
documento, aquí se describen los procedimientos y materiales
preferidos. Las publicaciones descritas anteriormente se
proporcionan exclusivamente debido a su divulgación antes de la
fecha de presentación de la solicitud actual. Nada en este documento
se ha de interpretar como una admisión de que la invención no tiene
derecho a antedatar tal divulagación en virtud de una invención
previa.
La presente invención proporciona factores de
crecimiento de unión a heparina según se define en la reivindicación
1 (polipéptidos HBGF), los cuales tienen actividad mitogénica sobre
fibroblastos y células de músculo liso in vitro. Los HBGF
son termolábiles y lábiles en ácido y se encuentra en dos formas,
HBGF-0,8-P1 y
HBGF-0,8-P2, cada una con
diferentes propiedades de unión a heparina y también cada una con
una M_{r} de aproximadamente 10 kDa en PAGE-SDS
en condiciones reductoras. Los HBGF están relacionados estructural y
funcionalmente con CTGF. Tanto
HBGF-0,8-P1 como
HBGF-0,8-P2 requieren la presencia
de NaCl 0,8 M para su elución de una columna de afinidad en
heparina. La secuenciación reveló que la secuencia
N-terminal de
HBGF-0,8-P1 se correspondía con los
restos de aminoácidos 247-262 del producto principal
de traducción previsto del factor de crecimiento del tejido
conectivo (CTGF) porcino de 349 aminoácidos mientras que la
secuencia N-terminal de
HBGF-0,8-P2 se correspondía con los
restos de aminoácidos 248-259 de CTGF. Por tanto,
los HBGF se corresponden con dos formas
N-terminales muy truncadas y microheterogéneas del
producto de traducción de CTGF, ambos biológicamente activos.
HBGF-0,8-P2 es idéntico a
HBGF-0,8-P1 excepto por la presencia
de un resto Glu adicional en el extremo N-terminal
de HBGF-0,8-P1.
Los HBGF de la invención son formas muy
truncadas del extremo N-terminal de CTGF, sin
embargo, no existe unión intrón/exón que pueda dar lugar
directamente al extremo N-terminal de las dos
proteínas. Los HBGF no se alinean con los componentes modulares
propuestos del CTGF; las proteínas de la invención no contienen
ninguno de los motivos de CTGF de unión a glicoconjugados
sulfatados, denominados motivos de trombospondina de tipo I, que se
proponen como responsables de la unión a moléculas de la matriz. En
los HBGF se encuentra completo un módulo C-terminal
de CTGF que aparece en las proteínas de la matriz y que se propone
como implicado en la unión al receptor. El motivo de unión
propuesto para glicoconjugados sulfatados entre los restos de
aminoácidos 206 y 214 de CTGF está ausente en los HBGF, aun así los
HBGF se unen a heparina y las interacciones con heparina tienen
significación funcional. Los extremos N-terminales
de HBGF-0,8-P1 y
HBGF-0,8-P2 pueden estar implicados
en la unión a heparina, puesto que las dos proteínas de la invención
difieren sólo en un único resto Glu del extremo
N-terminal, incluso muestran una unión diferencial a
la heparina.
Los HBGF de la invención son secretados tanto
por fibroblastos humanos como murinos en cultivo. La producción de
HBGF no se limita a una especie o sistema biológico en particular.
Preferiblemente, los HBGF de la invención son mitogénicos y
quimiotácticos para células derivadas de mesénquima (por ejemplo,
fibroblastos, condrocitos, osteoclastos, osteoblastos y astroglía),
sin embargo, otros tipos de células (por ejemplo, células
musculares, células del tejido conectivo, células epiteliales y
células secretoras) también responden a los HBGF. Los HBGF pueden
tener una función importante en el desarrollo, crecimiento y
reparación normales del tejido humano. Estos factores de
crecimiento están presentes en los lavados uterinos y pueden tener
una función adicional en el crecimiento y remodelado del endometrio
y, durante el embarazo, también pueden afectar al crecimiento y
desarrollo de las membranas extraembrionarias o placentarias.
Los agentes terapéuticos derivados de HBGF
pueden ser útiles para aumentar los procesos de crecimiento normal
o alterado que afecten a los tejidos conectivos en determinados
estados clínicos (por ejemplo, la curación de heridas). Cuando
estos HBGF están implicados en afecciones patológicas, pueden
utilizarse avances terapéuticos a partir de estas proteínas para el
control o la modulación del crecimiento tisular incontrolado.
La expresión "sustancialmente puro" según
se usa en este documento se refiere a HBGF que están sustancialmente
libres de otras proteínas, lípidos, hidratos de carbono u otros
materiales con los que se asocian de forma natural. Un polipéptido
HBGF sustancialmente puro proporcionará una única banda principal en
un gel de poliacrilamida no reductor. La pureza de los HBGF también
puede determinarse mediante análisis de la secuencia de aminoácidos
del extremo amino terminal. También se describen fragmentos
funcionales del polipéptido, siempre que mantengan la actividad
biológica de HBGF (por ejemplo, induzcan una respuesta biológica en
fibroblastos según se determina usando ensayos convencionales
habituales en la técnica como se muestra en este documento). También
se describen polipéptidos más pequeños que contienen la actividad
biológica de HBGF. Adicionalmente, se describen HBGF más eficaces
producidos, por ejemplo, a través de mutagénesis dirigida a sitio
del ADNc del polipéptido HBGF. La expresión HBGF
"recombinantes" hace referencia a polipéptidos HBGF producidos
mediante técnicas de ADN recombinante; es decir, producidos a
partir de células transformadas mediante una construcción de ADN
exógeno que codifica el polipéptido HBGF deseado. Los HBGF
"sintéticos" son aquellos que se preparan mediante síntesis
química. Una "secuencia codificadora" de ADN o una "secuencia
de nucleótidos que codifica" un polipéptido HBGF en concreto, es
una secuencia de ADN que se transcribe y traduce en un polipéptido
HBGF cuando se sitúa bajo el control de secuencias reguladoras
adecuadas.
Como se define en las reivindicaciones, la
invención proporciona ácidos nucleicos que codifican los
polipéptidos HBGF. Los ácidos nucleicos descritos en este documento
incluyen secuencias de ADN, ADNc y ARN que codifican los HBGF. Se
entiende que también se describen en este documento ácidos nucleicos
que codifican los polipéptidos HBGF completos o una porción de los
mismos siempre que codifiquen un polipéptido con la actividad
biológica de HBGF. Estos ácidos nucleicos incluyen tanto ácidos
nucleicos que se encuentran en la naturaleza como aquellos
manipulados intencionadamente. Por ejemplo, los polipéptidos HBGF
pueden someterse a mutagénesis dirigida a sitio.
Los ácidos nucleicos descritos en este documento
incluyen secuencias degeneradas como resultado del código genético.
Sólo se conocen 20 aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales
están codificados por más de un codon. Por tanto, en este documento
se describen todas las secuencias de nucleótidos degeneradas siempre
que no cambie la secuencia de aminoácidos de un polipéptido HBGF.
El fragmento derivado o análogo de los polipéptidos HBGF puede ser
(i) uno en el que uno o más restos de aminoácidos se han sustituido
por restos de aminoácidos conservados o no conservados
(preferiblemente un resto de aminoácido conservado) y este resto de
aminoácido sustituido puede o no ser uno de los aminoácidos
codificados por el código genético o, entre las variantes
preferidas, se encuentran aquellas que varían con respecto a una
secuencia de referencia en sustituciones conservadoras de
aminoácidos (estas sustituciones son aquellas en las que se
sustituye en un polipéptido un determinado aminoácido por otro
aminoácido de características similares). Típicamente, las
sustituciones conservadoras son sustituciones, uno por otro, entre
los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile; intercambio de los
restos hidróxilo de Ser y Thr; cambio de los restos ácidos de Asp y
Glu, sustitución entre los restos amino de Asn y Gln, cambio de los
restos básicos de Lys y Arg y sustituciones entre los restos
aromáticos de Phe y Tyr; (ii) uno en el que uno o más restos
aminoacídicos contienen un grupo de sustitución; (iii) uno en el
que un polipéptido HBGF se fusiona con otro compuesto, como un
compuesto que aumente la semivida de los polipéptidos HBGF (por
ejemplo, polietilénglicol) o iv) uno en el que se fusionan
aminoácidos adicionales a los polipéptidos HBGF como una secuencia
líder o secretora, una secuencia que se emplea para la purificación
de los polipéptidos HBGF o una secuencia proproteína. Los HBGF de
la presente invención y los ácidos nucleicos que los codifican se
proporcionan, preferiblemente, en forma aislada y, preferiblemente,
se purifican a homogeneidad.
Las secuencias de ADN que codifican los
polipéptidos HBGF de la invención pueden obtenerse mediante varios
procedimientos. Por ejemplo, el ADN puede aislarse usando
procedimientos de hibridación bien conocidos. Estos incluyen, pero
sin limitaciones: 1) hibridación con sondas de colecciones genómicas
o de ADNc para detectar secuencias de nucleótidos compartidas
(véase, por ejemplo: Current Protocols in Molecular Biology,
Ausubel F.M. y col. (eds.) Green Publishing Company Assoc. y John
Wiley Interscience, Nueva York, última edición) y 2) selección con
anticuerpos de colecciones de expresión para detectar
características estructurales compartidas. Los expertos en la
materia apreciarán que los ácidos nucleicos (que comprenden al menos
12 aminoácidos contiguos), que codifican los HBGF, son
especialmente útiles como sondas.
La expresión "hibridación selectiva" según
se usa en este documento, se refiere a la hibridación en condiciones
fisiológicas moderadamente rigurosas o muy rigurosas (Véase J.
Sambrook y col. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory (última edición)) que distinguen entre HBGF
relacionado y no relacionado en función del grado de identidad
entre secuencias de nucleótidos próximas para que tenga lugar la
hibridación. También se entiende que un fragmento de una secuencia
de 100 pb que tiene una longitud de 95 pb tiene una identidad del
95% con la secuencia de 100 pb a partir de la cual se obtiene. Según
se usa en este documento, una primera secuencia de ADN (ARN) es de
al menos el 70% y, preferiblemente al menos el 80%, idéntica a otra
secuencia de ADN (ARN) si existe una identidad de al menos el 70% y,
preferiblemente, al menos el 80% ó 90%, respectivamente, entre las
bases de la primera secuencia y las bases de la otra secuencia
cuando se alinean adecuadamente entre sí, por ejemplo, cuando se
alinean mediante el programa BLASTN.
El término "identidad" según se usa en este
documento, se refiere a una secuencia polinucleotídica que comprende
un porcentaje de bases iguales como un polinucleótido de
referencia. Por ejemplo, un polinucleótido que es al menos el 90%
idéntico a otro polinucleótido de referencia, tiene bases
polinucleotídicas que son idénticas en el 90% de las bases que
componen el polinucleótido de referencia (es decir, cuando las
secuencias se alinean entre sí de forma adecuada usando un
alineamiento convencional y ajustes de homología comunes en la
técnica (por ejemplo, NetBlast o GRAIL)) y pueden tener bases
diferentes en el 10% de las bases que comprenden esta secuencia de
polinucleótidos.
Los procedimientos de análisis que dependen de
la hibridación de ácidos nucleicos permiten aislar cualquier
secuencia génica de cualquier organismo, siempre que se disponga de
la sonda adecuada. Por ejemplo, pueden sintetizarse químicamente
sondas oligonucleotídicas que se corresponden con parte de la
secuencia que codifica la proteína en cuestión. Esto requiere que
sean conocidos segmentos oligopeptídicos cortos de la secuencia de
aminoácidos. La secuencia de ADN que codifica la proteína puede
deducirse del código genético, sin embargo, debe tenerse en cuenta
la degeneración del código. Es posible realizar una reacción de
adición mixta cuando la secuencia es degenerada. Esto incluye una
mezcla heterogénea de ADN de cadena doble desnaturalizada. Para
este análisis, preferiblemente, la hibridación se realiza sobre el
ADN de cadena sencilla o el ADN de cadena doble desnaturalizada. La
hibridación es especialmente útil para la detección de clones de
ADNc derivados de fuentes en las que se presentan cantidades
extremadamente bajas de secuencias de ARNm relativas al polipéptido
de interés. En otras palabras, usando condiciones de hibridación
selectivas dirigidas a evitar la unión no específica es posible,
por ejemplo, permitir la visualización autorradiográfica de un clon
de ADNc específico mediante la hibridación del ADN diana con esta
sonda única en la mezcla que es su complementaria completa (Wallace
y col., Nucleic Acid Research, 9:879, 1981). También se
aprecia que estas sondas de hibridación selectiva pueden ser y
están preferiblemente marcadas con un reactivo analíticamente
detectable para facilidar la identificación de la sonda. Los
reactivos útiles incluyen, pero sin limitaciones, radioactividad,
marcadores fluorescentes o enzimas capaces de catalizar la
formación de un producto detectable. Las sondas de hibridación
selectiva son, por tanto, útiles para aislar copias complementarias
de ADN a partir de otras fuentes o para analizar la presencia de
secuencias relacionadas en estas fuentes.
Puede analizarse indirectamente la presencia de
HBGF que tenga al menos un epítopo en una colección de expresión de
ADNc, como la de lambda gt11, usando anticuerpos específicos de
polipéptidos HBGF, anticuerpos frente a CTGF que presenten reacción
cruzada con los polipéptidos HBGF o anticuerpos frente a PDGF que
presenten reacción cruzada con los polipéptidos HBGF. Pueden
obtenerse anticuerpos policlonales o monoclonales que se utilizarán
para detectar productos de expresión indicativos de la presencia de
ADNc de los polipéptidos HBGF.
Las secuencias de ADN que codifican los
polipéptidos HBGF pueden expresarse in vitro mediante
transferencia de ADN a una célula hospedadora adecuada. Las
"células hospedadoras" son células modificadas genéticamente
(transducidas, transformadas o transfectadas) con los vectores de
esta invención que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación
o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en
forma de plásmido, partícula vírica, fago, etc. Las células
hospedadores modificadas genéticamente pueden cultivarse en medios
nutritivos convencionales modificados de manera apropiada para la
activación de promotores, la selección de transformantes y la
amplificación de los genes descritos en este documento. Las
condiciones de cultivo, como temperatura, pH y similares, son las
utilizadas previamente para la expresión de las células hospedadoras
seleccionadas y serán evidentes para el experto en la materia. El
término también incluye cualquier progenie de la célula hospedadora
en cuestión. Se entiende que es posible que toda la progenie no sea
idéntica a la célula parental puesto que pueden aparecer mutaciones
durante la replicación. Sin embargo, cuando se usa la expresión
"célula hospedadora" progenies de este tipo están incluidas. La
introducción de la construcción en la célula hospedadora puede
realizarse mediante transfección con fosfato de calcio, transfección
mediada por DEAE-Dextrano, electroporación o
cualquier otro procedimiento de la técnica (Davis, L. y col.,
Basic Methods in Molecular Biology, (última edición)).
Los ácidos nucleicos de la presente invención
pueden emplearse para producir HBGF mediante técnicas recombinantes.
Por tanto, por ejemplo, el polinucleótido puede incluirse en
cualquiera de una diversidad de vectores de expresión para
conseguir la expresión de los polipéptidos HBGF. Estos vectores
incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético,
por ejemplo, derivadas de SV40; plásmidos bacterianos, ADN de fago;
baculovirus; plásmidos de levaduras; vectores derivados de
combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN vírico como del virus
de vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar y virus de la
pseudorrabia. Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector
siempre que se replique y sea viable en el hospedador.
La secuencia de ADN apropiada puede insertarse
en el vector mediante diversos procedimientos. En general, la
secuencia de ADN se inserta en un sitio o sitios de restricción para
endonucleasas apropiados mediante procedimientos conocidos en la
técnica. Estos procedimientos y otros se consideran dentro del campo
de acción de los expertos en la técnica. Las secuencias de ADN que
codifican los HBGF pueden expresarse in vivo en procariotas
o en eucariotas. Los procedimientos de expresión de secuencias de
ADN que tienen secuencias codificadoras eucariotas en procariotas
son bien conocidos en la técnica. Entre los hospedadores se incluyen
organismos microbianos, levaduras y mamíferos.
Los vectores de ADN vírico y plasmídico
biológicamente funcionales capaces de la expresión y replicación en
un hospedador son conocidos en la técnica. Estos vectores se
utilizan para incorporar las secuencias de ADN de la invención. En
general, los vectores de expresión que contienen secuencias
promotoras para facilitar la transcripción eficaz de la secuencia
genética eucariota insertada se utilizan en conexión con el
hospedador. El vector de expresión típicamente contiene un origen
de replicación, un promotor y un terminador, así como genes
específicos capaces de proporcionar una selección fenotípica de las
células transformadas.
Además de los vectores de expresión conocidos en
la técnica, tal como sistemas de expresión bacteriana, de levaduras
y mamíferos, también pueden utilizarse vectores de baculovirus. Una
ventaja para la expresión de genes extraños en este vector de
expresión de virus de invertebrados es que es capaz de la expresión
de niveles elevados de proteínas recombinantes, que son antigénica
y funcionalmente similares a sus homólogas naturales. Los vectores
de baculovirus y las células hospedadoras de insectos apropiadas
usadas junto con los vectores son conocidos por los expertos en la
técnica. El aislamiento y la purificación de los polipéptidos
expresados por las células hospedadoras de la invención pueden
realizarse mediante cualquier procedimiento convencional tal como,
por ejemplo, separaciones cromatrográficas preparativas y
separaciones inmunológicas como aquellas que implican el uso de
anticuerpos monoclonales o policlonales.
La invención proporciona anticuerpos, según se
define en las reivindicaciones, que reaccionan específicamente con
los polipéptidos HBGF o fragmentos de los mismos. Aunque este
polipéptido puede presentar reacción cruzada con anticuerpos frente
a PDGF o CTGF, no todos los anticuerpos frente a HBGF reaccionan a
su vez con PDGF, y no todos los anticuerpos frente a CTGF
reaccionarán con HBGF. Se proporcionan anticuerpos que están
compuestos esencialmente de un conjunto de anticuerpos monoclonales
con diferentes especificidades epitópicas, así como preparaciones
de anticuerpos monoclonales diferentes. Los anticuerpos monoclonales
se obtienen a partir fragmentos antigénicos de la proteína mediante
procedimientos bien conocidos en la técnica (Kohler y col.,
Nature 256:495. 1975; Current Protocols in Molecular
Biology, Ausubel y col., ed. 1989). También se incluyen
anticuerpos policlonales frente a los HBGF de la invención obtenidos
usando procedimientos comunes para los expertos en la técnica
(véase Harlow y Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory; Nueva York, última edición). Los
anticuerpos monoclonales específicos para los HBGF pueden
seleccionarse, por ejemplo, mediante el análisis de los
sobrenadantes del cultivo de hibridomas que reaccionan con los
polipéptidos HBGF, pero no reaccionan con PDGF. Pueden obtenerse
anticuerpos generados frente a los HBGF correspondientes de la
presente invención mediante inyección directa de los polipéptidos en
un animal, o administrando los polipéptidos a un animal,
preferiblemente no humano. El anticuerpo obtenido de este modo se
unirá a continuación al polipéptido en sí. De este modo, puede
utilizarse incluso una secuencia que codifique sólo un fragmento de
los polipéptidos para generar anticuerpos que se unan a los
polipéptidos originales. A continuación, tales anticuerpos pueden
usarse para aislar los polipéptidos a partir de las células que
expresan dicho polipéptido.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales,
puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos
producidos mediante cultivos continuos de la línea celular. Entre
los ejemplos se incluyen la técnica de hibridomas (Kohler y col.,
Nature 256:495, 1975), la técnica de triomas, la técnica de
hibridoma de células B humanas (Kozbor y col., 1983, Immunology
today 4:72) y la técnica de hibridoma-EBV para
producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., 1985, en
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.
pág. 77-96).
Las técnicas descritas para la producción de
anticuerpos de cadena única (Patente de EE.UU. Nº 4.946.779) pueden
adaptarse para producir anticuerpos de cadena única frente a los
productos peptídicos inmunogénicos de esta invención.
Adicionalmente incluidos dentro de los límites de la invención,
están la producción y el uso para aplicaciones diagnósticas y
terapéuticas tanto de anticuerpos "humanos" como
"humanizados" dirigidos a polipéptidos HBGF o fragmentos de
los mismos. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos, o
fragmentos de anticuerpo, que tienen la misma especificidad de
unión que el anticuerpo parental (es decir, típicamente de origen
murino) pero tienen características humanas aumentadas. Pueden
obtenerse anticuerpos humanizados mediante mezcla aleatoria de
cadenas o utilizando tecnología de despliegue de fagos. Por ejemplo,
un polipéptido que comprende un dominio variable de cadena pesada o
ligera de un anticuerpo no humano específico para un HBGF se
combina con un repertorio de dominios de cadena variable (ligera o
pesada) humana complementaria. Se seleccionan los pares híbridos
que presenten especificidad por el antígeno de interés. A
continuación las cadenas humanas de los pares seleccionados pueden
combinarse con un repertorio de dominios variables (pesados o
ligeros) humanos complementarios y después pueden seleccionarse
dímeros polipeptídicos de anticuerpos humanizados según la
especificidad de unión a un antígeno. Estas técnicas se describen en
la patente de EE.UU. Nº 5.565.332 o pueden obtenerse comercialmente
(Scotgene, Escocia u Oxford Molecular, Palo Alto, CA, EE.UU.).
Además, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos
"humanos" (es decir, anticuerpos de novo con secuencias
de la región constante humana) en ratones transgénicos (Patente de
EE.UU. Nº 5.545.806 y patente de EE.UU. Nº 5.569.825) también puede
adaptarse para producir anticuerpos HBGF o fragmentos de anticuerpo
"humanos", o también pueden obtenerse comercialmente
(GenPharin International; Inc. Mountain View, CA, EE.UU.).
Los anticuerpos generados frente a los
polipéptidos de la presente invención pueden usarse para el análisis
de polipéptidos HBGF similares en otros organismos y muestras.
Estas técnicas de análisis son conocidas en la técnica.
La invención proporciona las aplicaciones, según
se define en las reivindicaciones, para acelerar la curación de
heridas en un sujeto, por ejemplo, un humano. Se describe la
aplicación a la herida de una cantidad terapéuticamente eficaz de
una composición que contiene polipéptidos HBGF purificados, PDGF,
moléculas relacionadas con PDGF o combinaciones de los mismos. Los
polipéptidos HBGF de esta invención son válidos como agentes
terapéuticos en casos en los que existe una alteración de la
curación de heridas cutáneas o existe una necesidad de aumentar los
mecanismos normales de curación. Los polipéptidos HBGF, o los
fragmentos funcionales de los mismos, son más estables y menos
susceptibles a la degradación por proteasas que PDGF y otros
factores conocidos por estar implicados en la curación de heridas.
Además, los polipéptidos HBGF pueden tener una actividad biológica
específica mayor que CTGF.
Los polipéptidos HBGF derivan de células
fibroblásticas que están presenten en el lugar de la herida. Por
tanto, pueden añadirse agentes que estimulan la producción de
polipéptidos HBGF a la composición que se usa para acelerar la
curación de heridas. Preferiblemente, el agente es un miembro de la
familia de factores de crecimiento como el factor de crecimiento
similar a insulina (IGF-I), el factor de crecimiento
derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento epidérmico
(EGF), el factor de crecimiento transformante beta
(TGF-\beta) y el factor de crecimiento de
fibroblastos básico (bFGF). Más preferiblemente, el agente es el
factor de crecimiento transformante beta
(TGF-\beta) u otro miembro de la superfamilia del
TGF-\beta. Adicionalmente, el efecto biológico de
HBGF puede modularse mediante la adición de heparina en una
concentración dentro del intervalo de aproximadamente 1 \mug/ml a
100 \mug/ml. Las composiciones de HBGF de la invención ayudan a la
curación de heridas promoviendo, en parte, el crecimiento de tejido
conectivo. Las composiciones de HBGF se preparan mezclando los
polipéptidos HBGF purificados de la invención con cualquier
sustancia vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo geles o
líquidos inertes. En las composiciones de HBGF pueden incluirse
otras composiciones moduladoras como heparina o factores de
crecimiento como TGF-\beta.
La expresión "trastorno de la proliferación
celular" se refiere a una afección caracterizada por un número
anómalo de células. La afección puede incluir tanto crecimiento
celular hipertrófico (la multiplicación continua de células que
ocasiona un sobrecrecimiento de una población celular dentro de un
tejido) e hipotrófico (carencia o deficiencia de células dentro de
un tejido) o un flujo o migración excesivo de células hacia un área
del organismo. Las poblaciones celulares no son necesariamente
células transformadas, tumorigénicas o malignas, sino que pueden
incluir también células normales. Por ejemplo, los HBGF pueden están
implicados en una afección patológica induciendo una lesión
proliferativa en la capa íntima de la pared de una arteria, lo que
origina aterosclerosis. En lugar de intentar reducir los factores
de riesgo de padecer la afección, por ejemplo, disminuyendo la
presión sanguínea o reduciendo los niveles de colesterol, los
anticuerpos, moléculas antisentido y ribozimas de la invención
podrían ser útiles interfiriendo con la actividad in vivo de
los HBGF asociados con la aterosclerosis. Los anticuerpos,
moléculas antisentido y ribozimas de la invención también son útiles
para el tratamiento de otros trastornos asociados con un
sobrecrecimiento de los tejidos conectivos, como diversas
afecciones fibróticas, incluyendo escleroderma, artritis y cirrosis
hepática.
Estas enfermedades, trastornos o dolencias
moduladas por HBGF incluyen la reparación de tejidos posterior a
lesiones traumáticas o afecciones como artritis, osteoporosis y
otros trastornos óseos, y quemaduras. Puesto que estos problemas
son debidos a una mala respuesta proliferativa de los fibroblastos,
células troncales, condrocitos, osteoblastos o fibroblastos en el
lugar de la lesión, la adición de un agente biológico activo que
estimule o induzca el crecimiento de estas células es beneficiosa.
El término "induce" o "inducción" según se usa en este
documento, se refiere a la activación, estimulación, potenciación,
inicio y/o mantenimiento de los mecanismos o procesos celulares
necesarios para la formación de cualquier tejido, proceso de
reparación o desarrollo como se describe en este documento.
La presente invención además proporciona
aplicaciones, según se define en las reivindicaciones, para la
modulación de la función del conducto reproductor femenino. Se ha
mostrado que los factores de crecimiento actúan en la mitosis
cíclica y en la diferenciación de los componentes celulares del
endometrio, en el reclutamiento de macrófagos durante el
desprendimiento del endometrio, en las interacciones entre el
endometrio y el trofoblasto, en el mantenimiento temprano del
embarazo y en la regeneración funcioanl endometrial. El término
"modulado" según se usa en este documento, indica una
modificación de una afección o estado biológico existente. La
modulación de una afección, según se define en este documento,
abarca tanto un aumento como una disminución de los determinantes
que afectan a la afección existente. Por ejemplo, la administración
de los polipéptidos HBGF de la invención podría usarse para
aumentar las funciones uterinas en una afección donde es deseable la
promoción del crecimiento, por ejemplo, el útero puede tratarse con
HBGF para promover el crecimiento y desarrollo de las membranas
placentarias o el crecimiento del endometrio. También se describe
en este documento cómo el tratamiento con los HBGF puede ser
utilizado para promover y mantener un embarazo facilitando la
interacción entre el endometrio y el trofoblasto. Alternativamente,
los anticuerpos, moléculas antisentido y ribozimas de la invención
se administran para modular afecciones que implican un
creci-
miento endometrial excesivo en las que el nivel de HBGF es excesivo en comparación con un estado biológico normal.
miento endometrial excesivo en las que el nivel de HBGF es excesivo en comparación con un estado biológico normal.
La invención también describe aplicaciones según
se define en las reivindicaciones para el tratamiento de afecciones
caracterizadas por un trastorno de la proliferación celular tratando
la afección con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente
reactivo con HBGF, según se define en las reivindicaciones. El
término "tratar" indica una reducción del efecto perjudicial
de la afección en el sujeto que recibe el agente reactivo. Cuando
la afección se debe a un sobrecrecimiento de células, un antagonista
de HBGF es terapéuticamente eficaz a la hora de disminuir la
cantidad de factor de crecimiento que puede unirse a un receptor
específico de un HBGF en una célula. Este antagonista es un
anticuerpo específico de HBGF de la invención o sus fragmentos
funcionales (p.ej., Fab, F(ab)_{2}). El tratamiento
requiere poner en contacto o administrar al sitio de la afección el
antagonista del polipéptido HBGF. Cuando el trastorno de la
proliferación celular es debido a una disminución de la cantidad de
crecimiento celular, se ponen en contacto o se administra en el
sitio de la afección un agente reactivo con HBGF que es
estimulador. Por ejemplo, este agente reactivo puede ser el
TGF-\beta (u otro miembro de la superfamilia del
TGF-\beta). Los expertos en la materia conocerán
otros agentes biológicos.
Cuando un trastorno de la proliferación celular
se asocia con la expresión de los HBGF, es posible una aproximación
terapéutica que interfiera directamente con la transcripción del gen
HBGF a ARNm o la traducción del ARNm de HBGF a proteína. Por
ejemplo, también se incluyen en la invención ácidos nucleicos
complementarios o ribozimas que se unen al ARNm de HBGF o lo
escinden. Las moléculas de ARN o ADN complementario se unen
específicamente con un ARN mensajero del gen diana, interrumpiendo
la expresión del producto proteico de este gen. La molécula
antisentido se une al ARNm formando una molécula de doble cadena que
no puede ser traducido por la célula. Se prefieren oligonucleótidos
complementarios de aproximadamente 15 a 25 nucleótidos ya que son
fáciles de sintetizar y tienen efectos inhibidores similares a los
de las moléculas de ARN complementario. Además, pueden unirse a un
oligonucleótido complementario grupos químicamente reactivos, como
el ácido etilendiaminotetraacético unido a hierro
(EDTA-Fc), lo que hace que el ARN se escinda en el
lugar de hibridación. Estas y otras aplicaciones de procedimientos
complementarios para inhibir la traducción de genes in vivo
son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, De Mesmaeker y col.,
1995, Backbone modifications in oligonucleotides and peptide nucleic
acid systems. Curr. Opin. Struct. Biol.
5:343-355; Gewirtz, A.M. y col., 1996b. Facilitating
delivery of antisense oligodeoxynucleotides: Helping antisense
deliver on its promise; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
93:3161-3163; Stein, C.A. A discussion of
G-tetrads 1996. Exploiting the potential of
antisense: beyond phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Chem.
and Biol. 3:319-323).
Otra aproximación terapéutica incluida dentro de
la invención implica la administración directa de reactivos o
composiciones que incluyen los HBGF de la invención mediante
cualquier técnica de administración convencional (por ejemplo, pero
sin restricciones, inyección local, inhalación o administración
sistémica) a un sujeto con un trastorno fibrótico, esclerótico o de
la proliferación celular, o aterosclerosis. La administración de
los HBGF, como se describe anteriormente, acelera la curación de
heridas, puede inducir la formación de tejidos para su reparación o
regeneración o el crecimiento y desarrollo del endometrio. El
reactivo, formulación o composición también puede dirigirse a
células o receptores específicos mediante cualquier procedimiento
descrito en este documento o mediante cualquier procedimiento
conocido en la técnica de administración, señalización y expresión
de los genes que codifican HBGF. La dosis real de reactivo,
formulación o composición que modula un trastorno fibrótico, un
trastorno esclerótico, un trastorno de la proliferación celular,
aterosclerosis o curación de heridas depende de muchos factores,
incluyendo el tamaño y el estado de salud de un organismo. Sin
embargo, un experto en la materia puede usar las siguientes
explicaciones que describen los procedimientos y técnicas para
determinar las dosis clínicas (Spilker B.Guide to Clinical
Studies and Developing Protocols, Raven Press Books, Ltd.,
Nueva York, 1984, pág. 7-13, 54-60;
Spilker B., Guide to Clinical Trials, Raven Press, Ltd.,
Nueva York, 1991, pág. 93-101; Craig C. y R.
Stitzel, eds., Modern Pharmacology, 2ª ed., Little, Brown y
Co.; Boston, 1986, pág. 127-33; T. Speight, ed.,
Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical
Pharmacology and Therapeutics, 3ª ed., Williams y Wilkins,
Baltimore, 1987, pág. 50-56; R. Tallarida, R. Raffa
y P. McGonigle, Principles in General Pharmacology,
Springer-Verlag, Nueva York, 1988, pág.
18-20) o para determinar la dosis apropiada que se
va a utilizar; pero, generalmente, en el intervalo aproximadamente
entre una concentración final de 0,5 \mug/ml y 500 \mul/ml
inclusive se administran por día a un adulto en cualquier vehículo
farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también proporciona un
procedimiento diagnóstico como se define en las reivindicaciones;
la detección de la presencia de niveles anómalos de HBGF en un
sujeto se usa, desde un punto de vista diagnóstico, para determinar
la presencia de afecciones o patologías asociadas con niveles
anómalos de HBGF. Estas afecciones incluyen, pero sin limitación,
trastornos de la proliferación celular, diversas afecciones
fibróticas que incluyen escleroderma, artritis, cirrosis hepática y
fibroides uterinos. Por ejemplo, se obtiene una muestra de un
sujeto que se sospecha que contiene HBGF, se determina el nivel de
polipéptido HBGF y se compara con el nivel de polipéptido HBGF en
una muestra de tejido normal. El nivel de HBGF puede determinarse,
por ejemplo, mediante inmunoensayo utilizando anticuerpos
anti-polipéptido HBGF. Otras variaciones de estos
ensayos incluyen radioinmunoensayos (RIA), ELISA e
inmunofluorescencia. Alternativamente, pueden usarse sondas de ácido
nucleico para detectar y cuantificar el ARNm del polipéptido HBGF
con el mismo objetivo.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención.
Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud de los valores
usados (por ejemplo, cantidades, tiempo, temperatura, etc.) pero ha
de tenerse en cuenta que podrían darse algunos errores y
desviaciones experimentales. A no ser que se indique lo contrario,
partes indican partes en peso, peso molecular es el peso molecular
medio, la temperatura se indica en grados centígrados y la presión
es la atmosférica o próxima.
Se recogieron úteros al azar de cerdos de un
matadero que tenían aproximadamente 8 meses de edad o menos. Cada
trompa uterina se lavó con solución salina tamponada con fosfato
fría (4ºC) para recoger los componentes de la luz del útero. La
purificación del factor de crecimiento se realizó a partir de
mezclas de 4 litros de LLU obtenidos de hasta 120 animales. Los
lavados de la luz del útero (LLU) se aclararon mediante
centrifugación a 13.500xg durante 30 minutos a 4ºC y el
sobrenadante se pasó a través de lana de vidrio.
Se aplicaron cuatro litros de muestra de
sobrenadante de LLU aclarado a 4ºC en una columna de intercambio
catiónico BioRex 70 (5 x 6 cm; Bio-Rad) que se había
equilibrado previamente en PBS, NaCl 0,2 M. Tras la aplicación de
la muestra, la columna se lavó con 500 ml de PBS, NaCl 0,2 M y las
proteínas unidas a la misma se eluyeron usando un gradiente de 500
ml de NaCl de 0,2-2 M en PBS. El flujo fue de 3,5
ml/min durante todo el proceso, y se recogieron fracciones de 10 ml
durante el tratamiento de la columna con el gradiente de NaCl. Las
fracciones que mostraban actividad mitogénica sobre fibroblastos
3T3 de Balb/c se seleccionaron para su uso posterior. Todas las
etapas cromatográficas posteriores se realizaron a temperatura
ambiente.
La cromatografía de intercambio iónico del LLU
mostraba la presencia de actividad de factor de crecimiento
catiónico sobre las células 3T3 de Balb/c en el eluído de las
columnas de BioRex 70 a 0,3-0,6 NaCl. La
cromatografía de afinidad en heparina mostraba la presencia de un
polipéptido HBGF no identificado adicional que necesitaba NaCl 0,8
M para su elución a partir de una columna EconoPac de heparina. En
términos de la cantidad de bioactividad recuperada de la columna,
la fracción que necesitaba NaCl 0,8 M para su elución parecía
contener un factor de crecimiento de unión a heparina catiónico
principal sobre las células 3T3. La posición de elución de los
polipéptidos HBGF a partir de las columnas de afinidad era
claramente diferente de la de PDGF, HB-EGF, PTN,
aFGF, bFGF y anfirregulina. La actividad mitogénica de HBGF se
destruía mediante la exposición al calor (100ºC durante 2 minutos o
56ºC durante 30 minutos) o al ácido (pH 2,0 durante 2 minutos).
Se utilizó cromatografía de filtración en gel
para demostrar que los HBGF tenían una masa molecular relativa
aparente de aproximadamente 10.000 daltons. Para estos estudios, se
aplicaron 0,5 ml de una fracción que contenía el eluído con NaCl
0,8 M de la cromatografía FPLC de afinidad en EconoPac de heparina
del LLU obtenido a partir de 30 animales a 0,5 ml/min, a una
columna TSK G2000 SW de FPLC (30 cm x 8 mm, tamaño de partícula
de
10 \mum, intervalo de fraccionamiento de 500-100.000; TosoHaas) equipada con una precolumna SW (4 cm x 8 mm; 10 \mum; TosoHaas). Las proteínas se eluyeron con PBS que contenía NaCl 0,3 M. Se recogieron fracciones de 200 \mul y se comprobó su capacidad para estimular la síntesis de ADN en células 3T3. El calibrado de la columna se realizó usando EGF (6.000 PM), lactoalbúmina (14.200 PM), inhibidor de la tripsina (20.100 PM) y ovoalbúmina (45.000 PM). Se ensayó la capacidad de las fracciones para estimular la síntesis de ADN en células 3T3 a 40 \mul/ml, como se describe anteriormente.
10 \mum, intervalo de fraccionamiento de 500-100.000; TosoHaas) equipada con una precolumna SW (4 cm x 8 mm; 10 \mum; TosoHaas). Las proteínas se eluyeron con PBS que contenía NaCl 0,3 M. Se recogieron fracciones de 200 \mul y se comprobó su capacidad para estimular la síntesis de ADN en células 3T3. El calibrado de la columna se realizó usando EGF (6.000 PM), lactoalbúmina (14.200 PM), inhibidor de la tripsina (20.100 PM) y ovoalbúmina (45.000 PM). Se ensayó la capacidad de las fracciones para estimular la síntesis de ADN en células 3T3 a 40 \mul/ml, como se describe anteriormente.
Las fracciones que contenían la actividad HBGF
(fracciones 16-19 recogidas tras la cromatografía de
intercambio catiónicos y de la cromatografía de afinidad en
heparina) se mezclaron, diluyeron y sometieron a un segundo ciclo
de FPLC de afinidad en heparina usando una columna TSK de heparina
5PW. Para realizar la segundaetapa de purificación por afinidad en
heparina, se mezclaron las fracciones con HBGF biológicamente activo
que contenían el eluído de NaCl 0,8 M de laetapa de purificación en
EconoPac de heparina, se diluyeron 3 veces con
Tris-HCl 20 mM (pH 7,4) y se aclararon mediante
paso a través de un filtro de 0,2 \mum. La muestra se aplicó a de
2 ml/min sobre una columna TSK de heparina 5PW (0,8 x 7,5 cm;
TosoHaas, Filadelfia, PA) que se lavó y eluyó como se describe
anteriormente, excepto porque se omitió el tampón CHAPS de los
tampones utilizados y se recogieron fracciones de 0,5 ml. Las
fracciones que contenían las proteínas eluidas con NaCl 0,8 M y que
mostraban actividad mitogénica sobre células 3T3 se dividieron en
dos grupos compuestos por las fracciones 31-34 (pico
1) y las fracciones 35 y 36 (pico 2). El polipéptido HBGF se eluyó
de nuevo con NaCl 0,8 M (fracciones 31-36), pero se
dividía en dos picos de actividad mitogénica que tenían propiedades
de unión a heparina diferentes. Los picos de actividad se
denominaron HGBF-0,8-P1 en el caso
de las fracciones 31-34 y
HGBF-0,8-P2 en el caso de las
fracciones 35 y 36.
HBGF-0,8-P1 y P2
se ajustaron a una concentración de acetonitrilo al 10% y ácido
trifluoroacético al 0,1% y se sometieron individualmente a
cromatografía HPLC en fase inversa en C_{8}. La cromatografía HPLC
en fase inversa se realizó en un sistema HPLC de Hitachi (Hitachi
Instruments Inc., Danbury CT) usando una columna C_{8} (0,46 x 25
cm, tamaño de partícula = 5 \mum; Rainin Instrument Co., Woburn,
MA) que se equilibró con agua que contenía acetonitrilo al 10%
(v/v) y ácido trifluoroacético al 0,1% (v/v). Las fracciones
mezcladas que contenían los picos 1 y 2 de la etapa de purificación
en TSK heparina se ajustaron individualmente de modo que
contuvieran acetonitrilo al 10% y ácido trifluoroacético al 0,1% y
se aclararon mediante filtración a través de un filtro de 0,2
\mum. Las condiciones para la elución de las proteínas unidas
fueron acetonitrilo al 10% del minuto cero al minuto 10 tras la
inyección de la muestra y al 10-90% del minuto 10 al
minuto 146. La velocidad de flujo era de 1 ml/min durante todo el
proceso y el cromatograma (A_{214}) se archivó como se describe
(Bray y Brigstock, (1994) Amer. Lab. 26, 38). El eluído se
recogió en fracciones de 0,5 ml sobre tubos siliconados que
contenían 50 \mul de NaOH 125 mM para neutralizar inmediatamente
el ácido trifluoroacético. Las alícuotas de 80 \mul de las
fracciones seleccionadas se evaporaron hasta sequedad en un
concentrador al vacío Speed Vac (Savant Instruments, Farmingdale,
NY) y se reconstituyeron en 25 \mul de Tris-HCl 10
mM (pH 7,4). Se ensayó la capacidad de 10 \mul de este
concentrado para estimular la síntesis de ADN en las células 3T3 y
se usaron 10 \mul para un PAGE-SDS analítico. En
la segunda etapa de purificación por HPLC en C_{8}, se mezclaron
dos fracciones activas de la primera etapa de HPLC (volumen total de
1 ml), se diluyeron 5 veces con agua, ácido trifluoroacético al
0,1% y se sometieron a las mismas condiciones de elución
cromatográfica descritas en este documento. Las posiciones de
elución de HGBF-0,8-P1 y P2 se
determinaron mediante bioensayo de alícuotas de las fracciones que
contenían el eluído de la columna después de que se hubieron
evaporado y reconstituido con PBS, lo que demostró que había
suficiente actividad en las muestras de HGBF purificado como para
que pudiera detectarse y caracterizarse adicionalmente a pesar de la
prolongada exposición a pH = 2 (aproximadamente 30 a 40 minutos)
durante la etapa de HPLC.
Tras la HPLC, se realizó análisis en
PAGE-SDS teñido con plata de las fracciones que
contenían HBGF-0,8-P1 o P2 en
condiciones reductoras, utilizando minigeles de poliacrilamida al
18% según se ha descrito (Kim, G.Y. y col. (1995) Biol.
Reprod. 52, 561-571). Posteriormente, se realizó
la tinción con plata de las proteínas como se ha descrito (Wray, W.
y col, (1981) Anal. Biochem. 118, 197-203).
El PAGE-SDS se realizó con (i) factores de
crecimiento purificados por HPLC, (ii) 8 \mul de LLU no
fraccionado o (iii) 100 \mul de LLU después del paso a través de
20 \mul de perlas de Sepharosa-heparina en
presencia de Tris-HCl 10 mM, NaCl 0,5 M (pH 7,4) y
la posterior extracción de las perlas de heparina con el tampón de
la muestra del PAGE-SDS. A continuación, los geles
se prepararon según se ha descrito (Kim, G.Y. y col., (1995)
Biol. Reprod. 52, 561-571). El análisis
posterior revelaba la presencia de una única proteína de 10 kDa que
se purifica conjuntamente con una actividad mitogénica sobre 3T3 de
Balb/c. Los niveles de actividad mitogénica estaban directamente
correlacionados con los de la proteína de 10 kDa, que estaba
completamente pura como se demostraba mediante la tinción con
plata. Los resultados de 18 purificaciones por HPLC individuales
confirmaron una relación causal directa entre la proteína o
proteínas de 10 kDa y la actividad mitogénica de
HBGF-0,8-P1 y P2.
El análisis de las etapas de purificación
individuales mostraba que se purificaba cada de 0,5 a 1,1 \mug de
cada actividad HBGF-0,8-P1 o P2 a
partir de 342 mg de proteína del extracto en crudo de LLU y que se
recuperaban de 10 a 22 unidades de actividad de
HBGF-0,8-P1 o P2 después de la
primera etapa de HPLC en comparación con las 66,666 unidades por
litro del material de partida (Tabla 1). Debe apreciarse que la
aparente baja recuperación de actividad péptido
HBGF-0,8 era atribuible a (i) una contribución
principal de IGF, EGF, PDGF, bFGF, H-EGF y PTN a la
actividad mitogénica global sobre las células 3T3 de las muestras de
extracto en crudo y parcialmente purificadas (2, 8, 9, 12,
25-27) y (ii) la labilidad en ácido de la actividad
mitogénica del péptido HBGF-0,8 durante las etapas
de separación por HPLC.Aunque se ha intentado recuperar factores de
crecimiento purificados de mayor actividad específica con
estrategias alternativas, no ha sido posible evitar el uso de HPLC
en fase inversa o de ácido trifluoroacético para apareamiento de
iones sin que se viera afectada la pureza del producto final.
Mientras, en términos de su actividad biológica, la recuperación de
HBGF-0,8-P1 y P2 se vio hasta cierto
punto comprometida, se conseguió fácilmente la caracterización
estructural de las proteínas ya que retienen actividad suficiente
para que ésta puede atribuirse inequívocamente a la banda homogénea
única de 10 kDa de los geles de poliacrilamida en presencia de SDS
y se aislaron cantidades suficientes de cada proteína a partir de
varios litros de LLU (Tabla 1).
Las fracciones que contienen los factores de
crecimiento purificados por HPLC se mezclaron, secaron y aplicaron
en PAGE-SDS preparativo. Las proteínas del gel se
transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno
durante 90 min a 300 mA, usando tampón CAPS (pH 11). La localización
de las proteínas de interés se determinó mediante la tinción de las
transferencias con Coomassie R250 al 0,1% en metanol al 50% durante
2 minutos, seguida de la decoloración con metanol al 50% y ácido
acético al 10%. Se cortó la mitad de cada una de las bandas de
proteína de 10 kDa y se envió para la secuenciación de aminoácidos
del extremo N-terminal en un secuenciador de fase
gaseosa modelo 470A (Applied BioSystems, Foster City, CA). Los
derivados feniltiohidantoina se identificaron mediante HPLC en fase
inversa en C_{18}. Se obtuvo una secuencia de 16 restos para
HBGF-0,8-P1 con un resto
indeterminado en la posición 10 y una secuencia de 12 restos para
HBGF-0,8-P2 con un resto
indeterminado en la posición 8 (Tabla 2). Estos datos mostraban que
HBGF-0,8-P1 y P2 presentaban
extremos N-terminales idénticos excepto por la
presencia de un resto Glu adicional en el extremo
N-terminal de
HBGF-0,8-P1. Una búsqueda realizada
en GenBank^{TM} reveló que estas secuencias se alineaban
perfectamente con las secuencias internas previstas de hCTGF y de
fisp-12 de ratón (también denominado
\betaIG-M2), el homólogo murino de CTGF (Bradham,
DM, y col. (1991) J. Cell Biol. 114,
1285-1294; Ryseck, R-P., y col.,
(1991) Cell Growth Differ. 2, 225-233;
Brunner, A., y col., (1991) DNA Cell Biol. 10,
293-300). Los restos no asignados en el ciclo 10 de
HBGF-0,8-P1 y en el ciclo 9 de
HBGF-0,8-P2 se correspondían con
Cys^{256} de hCTGF y Cys^{255} de fisp-12 (Tabla 2).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Para verificar que las secuencias parciales de
HBGF-0,8-P1 y P2 estaban realmente
presentes en la molécula del CTGF porcino (pGTGF), se aisló el ADNc
del pCTGF de longitud completa mediante un análisis de hibridación
de una colección de ADNc endometrial de cerdo usando una sonda de
hCTGF marcada con ^{32}P. Para estos estudios, se obtuvo el ARN
total del endometrio de cerdo como se ha descrito (Kim, G.Y. y col.
(Biol. Reprod. 52.561-571, (1995)). Se usó
un sistema de aislamiento de ARNm poli(A) Tract (Promega,
Madison, WI) para aislar el ARN poli(A^{+}), del cual se
utilizaron 5 \mug para la síntesis de la primera cadena del ADNc
usando una transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de
Moloney y el cebador enlazador oligo (dT) que contiene XhoI.
La síntesis de la segunda cadena se cebó tratando el complejo
ARNm-ADNc con ARNasa. Los extremos del ADNc de
doble cadena se rellenaron usando el fragmento Klenow y se ligaron a
adaptadores EcoRI que se fosforilaron posteriormente con la
polinucleótido quinasa de T4. Se ligaron 100 ng de ADNc digeridos
con XhoI, purificado en una columna de Sephacryl
S-400, en 1 \mug de los brazos del vector
Uni-ZAP XR en el sitio de clonación múltiple
XhoI-EcoRI y el producto se empaquetó usando el
extracto de empaquetamiento Gigapack II (Stratagene, La Jolla, CA).
La colección principal se amplificó en células
XL1-Blue MRF hasta un valor de 1,4x10^{10}
unidades formadoras de placa/ml.
Se obtuvo una sonda para CTGF marcada con
^{32}P verificada, que se correspondía con el extremo 3' del
producto principal de traducción de hCTGF previsto, mediante
reacción en cadena de la polimerasa con la transcriptasa inversa
del ARN de fibroblastos de prepucio humano usando los cebadores
sentido y complementario,
5'-GCCGTCTA
GAGCGGCCGCATGGAAGAGAACATTAAGAAGGG-3' (SEC ID Nº 3) y 3'-CCTCTGTACCGTACTTAAGCGCC
GGCGACC-5' (SEC ID Nº 4), respectivamente. La sonda se usó para analizar 10^{6} placas, dos de las cuales mostraban hibridación reproducible y se aislaron usando un kit de escisión rápida (Stratagene). Se obtuvieron dos clones de CTGF de cerdo pBluescript SK de \sim5,0 kilo pares de bases, denominados pBSK-pBSK-pCTGF1 y pBSK-p-pCTGF2 y se usaron para las reacciones iniciales de secuenciación. A continuación, pBSK-pCTGF1 se secuenció por completo mediante una combinación de secuenciación manual y automática por terminadores de cadena dideoxi (Sanger, F. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467 (1977)). Se obtuvieron los datos de secuencia de ambas cadenas de ADN. Las secuencias de HBGF-0,8-P1 y P2 se enumeran en la Tabla 2.
GAGCGGCCGCATGGAAGAGAACATTAAGAAGGG-3' (SEC ID Nº 3) y 3'-CCTCTGTACCGTACTTAAGCGCC
GGCGACC-5' (SEC ID Nº 4), respectivamente. La sonda se usó para analizar 10^{6} placas, dos de las cuales mostraban hibridación reproducible y se aislaron usando un kit de escisión rápida (Stratagene). Se obtuvieron dos clones de CTGF de cerdo pBluescript SK de \sim5,0 kilo pares de bases, denominados pBSK-pBSK-pCTGF1 y pBSK-p-pCTGF2 y se usaron para las reacciones iniciales de secuenciación. A continuación, pBSK-pCTGF1 se secuenció por completo mediante una combinación de secuenciación manual y automática por terminadores de cadena dideoxi (Sanger, F. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467 (1977)). Se obtuvieron los datos de secuencia de ambas cadenas de ADN. Las secuencias de HBGF-0,8-P1 y P2 se enumeran en la Tabla 2.
Se determinó que el ADNc de CTGF de cerdo
clonado tenía 1,51 kilopares de bases, con una fase de lectura
abierta de 1.047 pares de bases. Se prevé que el producto de
traducción principal de pCTGF comprenda 349 aminoácidos y contenga
la secuencia del péptido HBGF-0,8 entre los restos
247 y 262 (Tabla 2). A nivel de aminoácidos, pCTGF es
aproximadamente \sim92% idéntico a fisp-12
y a hCTGF. Tras la escisión de su supuesto péptido señal de 26
restos, se prevé que pCTGF comprenda 323 aminoácidos y contenga 38
restos de Cys que estén muy conservadas en hCTGF y
fisp-12.
Puesto que los HBGF representan formas
microheterogéneas del CTGF truncado, se investigó la relación entre
HBGF y CTGF. La presencia de la proteína de 10 kDa en el material
inicial se confirmó mediante inmunotransferencia de las muestras de
LLU no fraccionadas usando un anticuerpo anti-CTGF
que reaccionaba con los polipéptidos HBGF purificados por HPLC.
Para obtener el anticuerpo se sintetizó un
péptido de CTGF antigénico múltiple de cuatro ramas
(247-260) que comprendía la secuencia
EENIKKGKKCIRTP (restos 247-260) (SEC ID Nº 5) en un
sintetizador de péptidos Synergy 432A (Applied BioSystems) y se
purificó mediante HPLC en fase inversa usando una columna C_{18}
(0,46 x 36 cm; Rainin Instruments) que se desarrolló con un
gradiente de acetonitrilo del 5 al 95% durante 90 min en agua, con
ácido trifluoroacético al 0,1%. Las fracciones que contenían los
polipéptidos purificados se mezclaron, evaporaron hasta la sequedad
y reconstituyeron en agua estéril. Se inyectaron dos conejos blancos
New Zealand (conejos A y B), que habían sido sangrados para recoger
el suero preinmune, subcutáneamente con 1 mg de polipéptido en
adyuvante completo de Freund, seguido 3 semanas después de una
inyección intramuscular de 250 \mug del polipéptido en adyuvante
incompleto de Freund. Los animales se sangraron 7 días después para
recoger el antisuero. La reactividad de los antisueros se validó
mediante inmunotransferencia e inmunoprecipitación. El suero
preinmune y el antisuero del conejo A se usaron en estos
experimentos.
La inmunotransferencia se realizó como se ha
descrito previamente (Harlow y Lane, 1988, Antibodies, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York,
última edición). Brevemente, el PAGE-SDS se realizó
en condiciones reductoras usando minigeles de poliacrilamida al 18%
como se ha descrito (Kim G.Y. y col., Biol. Reprod. 52,
561-571 (1995)). La tinción con plata de las
proteínas se realizó como se ha descrito (Wray, W. y col, (1981)
Anal Biochem. 118, 197-203 (1981)). La
inmunotransferencia se realizó en (i) factores de crecimiento
purificados por HPLC, (ii) 8 \mul de LLU no fraccionado o (iii)
100 \mul de LLU después de su paso a través de 20 \mul de
perlas de Sepharosa heparina en presencia de
Tris-HCl 10 mM, NaCl 0,5 M (pH 7,4) y la posterior
extracción de las perlas de heparina con el tampón de la muestra del
PAGE-SDS. Los geles se transfirieron y bloquearon
como se ha descrito (Kim, G.Y. y col., Biol Reprod. 52,
561-571 (1995)) y se incubaron con una dilución
1:1.000 de suero preinmune de conejo o una dilución 1:100 de
antisuero anti-péptido pCTGF
(247-260) de conejo (conejo A). Las bandas
inmunorreactivas se visualizaron usando IgG de cabra
anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalina
seguido de los sustratos cromogénicos azul de nitro
tetrazolio/5-bromo-4-cloro-3-indolin
fosfato.
Además de la proteína de 10 kDa, también se
encontraron en el LLU dos formas de CTGF de masa adicionales (16 y
20 kDa) pero no se observaron evidencias convincentes del CTGF de 38
kDa. La inmunotransferencia verificó además que el HBGF purificado
por HPLC comprendía una única proteína inmunoreactiva de 10 kDa. La
comparación de la intensidad de tinción del HBGF a partir de
volúmenes definidos de fluido uterino no diluido (es decir,
0,7-2,3 \mul) con la intensidad de tinción de
cantidades mitogénicas de HGBF purificado indicaban que se
encontraban concentraciones mitogénicas de HBGF en el fluido uterino
in vivo. Considerados en conjunto, los datos mostraban que
LLU no contenía niveles detectables de CTGF de 38 kDa sino que
contenía HBGF en cantidades probablemente mitogénicas, lo que
demostraba que los HBGF aparecían de forma natural in vivo y
no eran el resultado de una degradación del CTGF de 38 kDa durante
su purificación.
La presencia de un resto Glu ácido adicional en
el extremo N-terminal del polipéptido HBGF
0,8-P1 se correlacionó con la menor afinidad por
heparina de esta molécula en comparación con
HBGF-0,8-P2, lo que sugiere que el
extremo N-terminal del péptido
HBGF-0,8 puede ser parte de un dominio de unión a
heparina. Para comprobar las propiedades de unión a heparina de la
región N-terminal así como de otras porciones de la
molécula CTGF, se estudió la capacidad de 18 polipéptidos que
abarcaban los 103 restos del extremo C-terminal
completo de hCTGF para unirse a
[^{3}H]-heparina.
Se sintetizaron 18 polipéptidos sintéticos que
abarcaban los 103 restos del extremo C-terminal
completo de CTGF y se recibieron como PepSet^{TM} escindidos de
Chiron Mimotopes (Clayton, Victoria, Australia). Todos los
polipéptidos se sintetizaron con extremos
N-terminales acetilados y extremos
C-terminales amidados excepto
CTGF-(247-225) y CTGF-(247-26O), que
se sintetizaron con las aminas de los extremos
N-terminales libres y
CTGF-(326-349) y CTGF-(339-349), que
se sintetizaron con los extremos C-terminales ácido
(Tabla 3).
Todos los polipéptidos contenían uno o ningún
resto de Cys; los restos Cys^{292} en
CTGF-(285-292) y Cys^{325} en
CTGF-(318-328) se sustituyeron por Ser para prevenir
la formación de puentes disulfuro intracatenarios con Cys^{287} o
Cys^{323} dentro de los respectivos polipéptidos. Las propiedades
de unión a heparina se determinaron usando una adaptación del
procedimiento de Baird y col. (Baird, A., y col. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 85, 2324-2328 (1988)).
Brevemente, se absorbieron 37,5 nmol de cada polipéptido por
duplicado a nitrocelulosa usando un aparato de transferencia en
puntos. La transferencia se bloqueó durante 30 min con
Tris-HCl 10 mM, NaCl 0,15 M, albúmina sérica bovina
al 0,1% (pH 7,4) y, a continuación, se incubó durante 3 h a
temperatura ambiente en esta solución que contenía 10 \muCi/ml de
[^{3}H]-Heparina (NEN Life Science Products). La
transferencia se lavó cuatro veces con Tris-HCl 10
mM, NaCl 0,15 M y los puntos independientes se mezclaron con
líquido de centelleo para el recuento de [^{3}H].
La tabla 3 resumen los resultados obtenidos con
los polipéptidos sintéticos. El nivel de unión a heparina más alto
se obtuvo con los polipéptidos que contenían los restos
247-260, 274-286 y
318-328. Debe apreciarse que ninguno de estos
polipéptidos tenía actividad agonista o antagonista sobre el
polipéptido HBGF en un ensayo de síntesis de ADN en células
3T3.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Estudios previos han mostrado que la heparina
modula la unión y la actividad biológica de varios polipéptidos
HBGF incluyendo bFGF, HB-EGF y anfirregulina
(Besner, G.E. y col., Growth Factors 7,
289-296 (1992); Higashiyama, S. y col., J. Cell.
Biol., 122, 933-940 (1993); Rapraeger, A.C. y
col., Science 252, 1705-1708 (1991); Olwin,
B.B., y col. J. Cell Biol. 118, 631-639
(1992); Cook, P. y col. J. Cell Physio. 163,
418-429 (1995); Yayon, A., y col., Cell 64,
841-848 (1991); Aviezer, D., y col. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 91, 12173-12177 (1994)). Puesto
que el péptido HBGF-0,8 mostraba una afinidad mayor
por heparina, examinamos el efecto de este glicosaminoglicano sobre
la actividad mitogénica del péptido HBGF-0,8. La
actividad de una dosis estimuladora alta del péptido
HBGF-0,8 se potenciaba significativamente con
1-3 \mug/ml de heparina pero se inhibía con
30-100 \mug/ml de heparina. La misma dosis de
heparina no tenía efecto sobre la síntesis de ADN basal o
estimulada por suero de ternera en las células 3T3.
Para evaluar la capacidad mitogénica relativa de
los HBGF en comparación con IGF-1, EGF, bFGF y
PDGF-AB, se realizó un ensayo de síntesis de ADN en
células 3T3 (Tabla 4). Las fracciones biológicamente activas que
contienen el eluído con NaCl 0,3-0,6 M a partir de
la columna de Bio-Rex se mezclaron, diluyeron 3
veces con Tris-HCl 20 mM (pH 7,4) que contenía
CHAPS al 0,1%, se pasó a través de un filtro de membrana de 0,45
\mum, se colocó en un vaso de polipropileno siliconado y se
aplicó con una bomba peristáltica en una columna EconoPac de
heparina (0,7 x 3,6 cm; Bio-Rad) a 2 ml/min. A
continuación, la columna de heparina se lavó con 50 ml de tampón
Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,2 M, CHAPS al 0,1% y se
desarrolló a 1 ml/min con un gradiente de 40 ml de NaCl de
0,1-2,0 M en Tris-HCl
20 mM, CHAPS al 0,1% (pH 7,4) usando un sistema de cromatografía líquida rápida (FPLC) de proteínas (Pharmacia Biotech Inc.). Durante la elución con el gradiente de NaCl se recogieron fracciones (1 ml) en tubos siliconados y se comprobó su actividad mitogénica sobre células 3T3.
20 mM, CHAPS al 0,1% (pH 7,4) usando un sistema de cromatografía líquida rápida (FPLC) de proteínas (Pharmacia Biotech Inc.). Durante la elución con el gradiente de NaCl se recogieron fracciones (1 ml) en tubos siliconados y se comprobó su actividad mitogénica sobre células 3T3.
Se ensayó la capacidad de las fracciones de la
columna para estimular la síntesis de ADN medida como la
incorporación de [^{3}H]-timidina al ADN de
células 3T3 de Balb/c en crecimiento confluente quiescente en 200
\mul de medio de Eagle modificado por Dulbecco, suero bovino al
10% en placas de cultivo de 96 pocillos como se ha descrito (Kim,
G.Y. y col., Biol. Reprod. 52, 561-571
(1995)). Se establecieron curvas dosis-respuesta
para los factores de crecimiento purificados a partir de LLU
ensayando cada dosis por triplicado, con los datos calculados como
media \pm DT. La significación estadística de los efectos de
heparina porcina (Sigma) a 1-100 \mug/ml sobre la
actividad del factor de crecimiento se determinó mediante la prueba
de la t de Students.
La incorporación de
[^{3}H]-timidina por el péptido HBGF era
comparable con la del suero de ternera o la de PDGF o bFGF
purificados y no tanto con la de mitógenos menos activos como IGF o
EGF. Además, se encontró que la actividad mitogénica y biológica en
3T3 de los HBGF se potenciaba de manera sinérgica con 10 ng/ml de
IGF-I,
10 ng/ml de PDGF, 3 ng/ml de EGF o 0,3 ng/ml de bFGF.
10 ng/ml de PDGF, 3 ng/ml de EGF o 0,3 ng/ml de bFGF.
La especificidad de la célula diana se estudió
usando células 3T3 del Balb/c, células endoteliales capilares
bovinas (CECB) y células de músculo liso vascular. Las células 3T3
se utilizaron como se describe anteriormente. Las CECB se
obtuvieron a partir del Dr. J. Folkman (Children's Hospital, Boston,
MA) y se mantuvieron en frascos de cultivo tratadas con gelatina en
medio de Eagle modificado por Dulbecco que contenía 3 ng/ml de bFGF
y suero bovino inactivado por calor al 10%. Las células de músculo
liso se aislaron de un fragmento de aorta torácica de cerdo de
2-3 cm de longitud utilizando procedimientos
establecidos (Weich, H.A. y col., Growth Factors 2,
313-320 (1990) y se mantuvieron en medio de Eagle
modificado por Dulbecco al 10% con suero bovino fetal al 10%. Los
ensayos de síntesis de ADN en CECB y en células de músculo liso se
realizaron en placas de 48 o 96 pocillos esencialmente como se ha
descrito (Besner, G.E., Higashiyama, S. y Kagsbrun, M. Cell.
Regul. 1, 811-819 (1990)). Los ensayos de
síntesis de ADN en CECB también se realizaron en presencia de 100
\mug/ml de heparina porcina. Se encontró que HGBF era mitogénico
en células de músculo liso y producía un nivel de estimulación que
excedía el de una cantidad máxima de EGF pero menor que el de bFGF.
Los HBGF carecían de actividad mitogénica en las células
endoteliales cuando se ensayaban solos o en presencia de 100 \mug
de heparina (véase la Tabla 4).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (28)
1. Un polipéptido factor de crecimiento de unión
a heparina (HBGF) caracterizado porque:
(a) tiene una secuencia de aminoácidos de los
aminoácidos del extremo carboxilo terminal de una proteína factor
de crecimiento de tejido conectivo (CTGF), en el que la secuencia de
dicho polipéptido HBGF comienza con la secuencia mostrada en la SEC
ID Nº 1 ó 2;
(b) se une a heparina y empieza a eluir de la
heparina con NaCl 0,8 M; y
(c) tiene un peso molecular de aproximadamente
10 kDa en PAGE-SDS en condiciones reductoras.
2. Una secuencia polinucleotídica que codifica
el polipéptido de la reivindicación 1.
3. Un vector de expresión recombinante que
contiene el polinucleótido de la reivindicación 2.
4. Una célula hospedadora que contiene el vector
de expresión de la reivindicación 3.
5. La célula hospedadora de la reivindicación 4,
que es una célula procariota.
6. La célula hospedadora de la reivindicación 4,
que es una célula eucariota.
7. Un anticuerpo o fragmento del mismo, en el
que dicho anticuerpo o fragmento del mismo se une específicamente a
un epítopo del polipéptido de la reivindicación 1.
8. El anticuerpo de la reivindicación 7, en el
que el anticuerpo es policlonal.
9. El anticuerpo de la reivindicación 7, en el
que el anticuerpo es monoclonal.
10. Una composición farmacéutica que comprende
un polipéptido de la reivindicación 1 en un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
11. Uso de un anticuerpo de una cualquiera de
las reivindicaciones 7 a 9 o de una molécula antisentido o ribozima
específica del polinucleótido de la reivindicación 2 para la
preparación de una composición farmacéutica para tratar
aterosclerosis o un trastorno fibrótico, esclerótico o de la
proliferación celular.
12. Uso de un polipéptido de la reivindicación 1
para la preparación de una composición farmacéutica que se pone en
contacto con una célula para acelerar la curación de heridas.
13. El uso de la reivindicación 11 ó 12, en el
que la célula se selecciona entre el grupo constituido por una
célula epitelial, una célula muscular, una célula de tejido
conectivo y una célula endotelial.
14. El uso de la reivindicación 13, en el que
la célula de tejido conectivo se selecciona entre el grupo
constituido por una célula de astroglía, una célula de fibroblasto,
una célula de osteoclasto, una célula de osteoblasto y una célula
de condrocito, y/o en el que la célula muscular es una célula de
músculo liso o una célula de músculo cardiaco, y/o en el que la
célula endotelial es una célula de endotelio capilar y/o en el que
la célula epitelial es una célula epitelial secretora.
15. El uso de una cualquier de las
reivindicaciones 11 a 14 que además comprende el uso de un factor
de crecimiento seleccionado entre el grupo constituido por: factor
de crecimiento similar a insulina (IGF-I), factor de
crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento
epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante beta
(TGF-\beta) y factor de crecimiento de
fibroblastos básico (bFGF) para la preparación de dicha composición
farmacéutica.
16. El uso de la reivindicación 15, que además
comprende el uso de heparina para la preparación de dicha
composición farmacéutica.
17. El uso de la reivindicación 16, en el que la
heparina está en una concentración dentro del intervalo de
aproximadamente 1 \mug/ml a 100 \mug/ml.
18. Un procedimiento para identificar un
compuesto que afecte a la actividad mitogénica del polipéptido de
la reivindicación 1 que comprende:
(a) incubar el compuesto con un polipéptido de
la reivindicación 1, o con una célula recombinante que expresa un
polipéptido de la reivindicación 1, en condiciones suficientes para
permitir la interacción entre los componentes; y
\newpage
(b) determinar el efecto del compuesto sobre la
actividad mitogénica o expresión de un polipéptido de la
reivindicación 1.
19. El procedimiento de la reivindicación 18, en
el que el efecto es la inhibición de la actividad mitogénica o de
la expresión de un polipéptido de la reivindicación 1.
20. El procedimiento de la reivindicación 18, en
el que el efecto es la estimulación de la actividad mitogénica o de
la expresión de un polipéptido de la reivindicación 1.
21. Un procedimiento para diagnosticar una
afección asociada con un polipéptido factor de crecimiento de unión
a heparina (HBGF) de la reivindicación 1, comprendiendo el
procedimiento la determinación del nivel de HBGF en una muestra
obtenida de un sujeto; y la comparación del nivel de HBGF en la
muestra con el nivel de HBGF en una muestra estándar normal.
22. El procedimiento de la reivindicación 21, en
el que la afección se selecciona entre el grupo constituido por
aterosclerosis, un trastorno fibrótico, esclerótico o de la
proliferación celular.
23. Uso de un agente reactivo de HBGF en un
vehículo farmacéuticamente aceptable para la preparación de una
composición farmacéutica para el tratamiento de una afección
asociada con HBGF, en el que dicha afección se selecciona entre el
grupo constituido por curación de heridas, aterosclerosis,
escleroderma, artritis, cirrosis hepática, osteoporosis,
crecimiento excesivo del endometrio, embarazo o un trastorno
proliferativo celular, en el que dicho agente reactivo con HBGF se
selecciona entre el grupo constituido por:
(a) una molécula antisentido o ribozima
específica para el polinucleótido de la reivindicación 2; y
(b) un anticuerpo que se une específicamente a
polipéptidos HBGF de la reivindicación 1.
24. El uso de la reivindicación 23, en el que la
afección es un trastorno de proliferación celular
caracterizado por un exceso de crecimiento celular.
25. El uso de la reivindicación 24, en el que el
exceso de crecimiento celular se debe a un exceso de células de
tejido conectivo.
26. El uso de la reivindicación 23, en el que la
afección es un trastorno de la proliferación celular
caracterizado por una deficiencia de crecimiento
celular.
27. Uso de un polipéptido de la reivindicación 1
para la preparación de una composición farmacéutica para promover
el crecimiento del endometrio o de las membranas de la placenta.
28. Uso de un anticuerpo de la reivindicación 7,
o una molécula antisentido o una ribozima específica del
polinucleótido de la reivindicación 2 para la preparación de una
composición farmacéutica para disminuir un crecimiento excesivo del
endometrio.
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