PT1003545E - Polipéptidos de factor de crescimento que se liga à heparina (hbgf) - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "POLIPÉPTIDOS DE FACTOR DE CRESCIMENTO QUE SE LIGA À HEPARINA (HBGF) " 1. Domínio da Invenção

Esta invenção diz respeito em geral ao dominio dos factores de crescimento, mais especificamente aos factores de crescimento que se ligam à heparina (HBGF). 2. Estado a técnica à data da Invenção

Os factores de crescimento são uma classe de polipéptidos- que estimulam células alvo a proliferar, diferenciar-se e organizar-se em tecidos em desenvolvimento. Ã actuação dos factores de. crescimento depende da sua ligação a receptores específicos que. estimula um acontecimento de sinalização dentro da célula. Incluem-se nos exemplos de factores de crescimento o factor de crescimento dependente de plaquetas (PDGF), os factores de crescimento semelhantes à insulina (IGF-I, IGF-II), o factor de crescimento beta transformante (TGF-β), o factor de crescimento alfa transformante (TGF-α), o factor de crescimento epidérmico (EGF), os factores de crescimento fibroblásticos ácido e básico (aFGF, bFGF) e o factor de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF), que se sabem estimular células para proliferar. 0 PDGF é uma proteína catiónica estável ao calor que se encontra nos grânulos alfa de plaquetas em 2 circulação e que se sabe ser um mitogénio e um agente quimiotáctico para as células do tecido conjuntivo tais como os fibroblastos e as células de músculo liso. Atentas as actividades desta molécula, crê-se que o PDGF é . um factor principal envolvido na cicatrização normal de feridas e contribuindo patologicamente para estados tais como a atérosclerose e os estados fibróticos. 0 PDGF é uma molécula dimérica constituída por combinações de cadeias α e/ou β. As cadeias formam heterodímeros ou homodímeros e todas as combinações isoladas até à data são biologicamente activas.

Trabalhos sobre o papel dos diversos factores. de crescimento nâ regeneração e restauro de tecidos levaram à descoberta de proteínas semelhantes a PDGF. Estas proteínas partilham tanto as actividades imunológicas como as biológicas com o PDGF, e podem ser bloqueadas com anticorpos específicos para o PDGF.

Os factores de crescimento polipeptídicos e as citoquinas têm vindo a emergir como uma classe importante de proteínas uterinas que podem constituir caminhos de sinalização de crescimento entre o útero materno e· o embrião em desenvolvimento ou o feto. Trabalhos levados a cabo numa série de espécies sugeriram que o BGF, o factor de crescimento semelhante ao EGF e que se liga a heparina (HB-EGF), os IGF-I e IGF-11, o aFGF, o bFGF, a pleiatrofina (PTN), o factor inibitório da leucemia, o factor 1 estimulante de colónias (CSF-1), e o TGF-α podem estar entre as moléculas uterinas reguladoras do crescimento 3 envolvidas nestes processos. 0 CTGF é um péptido monomérico rico em cisteína com M de 38.000, que é um factor de crescimento com actividade mitogénica e quimiotática face às células do tecido conjuntivo. O CTGF é segregado por células e é activo por interacção com um receptor especifico na superfície celular. 0 CTGF é produzido por um gene não relacionado com os genes α ou β da cadeia de PDGF. Ele é um membro de uma família de reguladores do crescimento que inclui o CTGF murino (também conhecido como fisp-12 ou como PlG-M2)e o CTGF humano, com o Cyr61 (murino), com o CeflO (de frango), e com o Nov (de frango). Com base em comparações de sequências, foi sugerido que os membros desta família têm todos uma estrutura modular, constituída por (1) um factor de crescimento semelhante ao domínio da insulina que é responsável pela ligação, (2) um.domínio de factor de von Willebrand responsável pela formação de complexos, (3) uma unidade repetitiva de trombospondína do tipo I, possivelmente responsável pela ligação a moléculas da matriz, e (4) um módulo no terminal. C que também existe em proteínas da matriz, e que se postula ser responsável pela ligação ao receptor* A sequência do cADN para o CTGF humano (hCTGF) contém um quadro aberto de leitura com 1047 nucleótidos com um local de. iniciação na posição 130 e um local de terminação -de TGA na posição 1177, e codifica para um péptido com 349 aminoácidos. Existe apenas uma homologia de sequências de 40 % entre o cADN do CTGF e o cADN quer da 4 cadeia α, quer da cadeia β do PDGF. 0 quadro aberto de leitura do hCTGF codifica para. um polipéptido que contém 39 resíduos de cisteína, indicando uma proteina que possui múltiplas ligações dissulfureto intramoleculares. 0 terminal amino do.péptido contém uma sequência hidrofóbica de sinalização indicativa de uma proteína segregada e existem dois locais .de glicosilação ligados por N em resíduos de asparagina nas posições 28 e 225 na sequência de aminoácidos. Existe uma homologia de sequência global de. 4 5 % entre o polipéptido CTGF e o polipéptido codificado mARN transcrito de CEF-1Q;· a homologia atinge 52 % quando se suprime uma região putativamente alternativa de corte.

Existe uma relação antigénica entre o CTGF e . o PDGF embora exista uma homologia da sequência peptídica que é pequena ou nula. Os anticorpos anti-PDGF têm uma forte afinidade para as formas não reduzidas de PDGF ou de CTGF, e uma afinidade dez vezes menor para as formas reduzidas destes péptidos, que não possuem actividade biológica. Isto sugere que há regiões com estrutura terciária partilhada entre os isómeros de PDGF e a molécula de CTGF, de que resultam epitopos antigénicos em comum. A síntese e a secreção do CTGF são selectivamente induzidas por TGF-β, BMP-2 e possivelmente por outros membros da superfamília de proteínas TGF-β. Embora o TGF-β possa estimular o crescimento normal de fibroblastos em agar mole, o CTGF por si só não consegue induzir esta 5 propriedade nos fibroblastos. No entanto, demonstrou-se que a sintese e a acção do CTGF são essenciais para a estimulação por parte do TGF-β do crescimento de fibroblastos independente da ancoragem. É provável que o CTGF funcione como um factor de crescimento na cicatrização de feridas. Postulou-se que o CTGF esteja patologicamente envolvido em estados nos quais existe um excesso de crescimento de células do tecido conjuntivo, tais como a esclerose sistémica, o cancro, os estados fibróticos, e a aterosclerose. A actividade biológica principal do polipéptido CTGF é a sua mitogenicidade, ou capacidade de estimular as células alvo para proliferarem. 0 resultado final desta actividade mitogénica in vivo, é o crescimento to tecido alvo. 0 CTGF também possui uma actividade quimiotática, que é o movimento das células induzido quimicamente em resultado da interacção com moléculas especificas.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO A invenção presente é baseada na descoberta, purificação e na caracterização de factores de crescimento que se ligam â heparina (HBGF) nos fluidos segregados do útero. Estes polipéptidos que são factores de crescimento ligam-se à heparina e exibem muitas das caracteristicas funcionais do CTGF de comprimento inteiro.

Num primeiro aspecto, a invenção presente 6 proporciona polipéptidos que se ligam à heparina (polipéptidos HBGF) que foram identificados como tendo actividade mitogénica, e ácidos nucleicos codificando para esses polipéptidos.

Sob mais um aspecto da invenção presente, são proporcionados anticorpos que se ligam aos HBGF.

Sob mais um aspecto ainda da invenção presente, são proporcionados sóndas sob a forma de ácidos nucleicos, contendo moléculas de ácidos nucleicos com comprimento suficiente para hibridizar especificamente a uma sequência de ácidos nucleicos que codifique para HBGF.

De· acordo com ainda mais um aspecto da invenção, proporciona-se um método para se utilizarem HBGF, as moléculas de ácidos nucleicos que codificam para os HBGF, ou sequências de sentido reverso de moléculas de ácidos nucleicos que codificam para HBGF, para afectar a cicatrização de feridas, a formação de -tecidos, as patologias escleróticas ou de proliferação de células, a aterosclerose ou a doença fibrótica.

BREVE DESCRÇÃO DOS DESENHOS

Os desenhos que se seguem são ilustrativos de concretizações da invenção e não se pretende que limitem o âmbito da invenção tal como definido nas reivindicações. A Figura la é uma ilustração na' qual se 7 visualizam os resultados de fracções separadas por cromatografia de afinidade para com a heparina, de lavagens do .lúmen uterino nos quais de testou a estimulação da síntese de ADN. A Figura lb é uma ilustração na qual se visualizam os resultados de cromatografia de afinidade para com a heparina subsequente sobre amostras positivas no que toca à síntese de ADN (da Fig. la) , nas quais os picos das componentes principais (marcados como PI e P2) representam os polipéptidos HBGF-0,8. A Figura 2 é uma ilustração na qual se observa um perfil de cromatografia de filtração em gel dos polipéptidos de HBGF-0,8.

As Figuras 3a e 3b são ilustrações que evidenciam os resultados de HPLC de fase reversa e de SDS-PAGE dos polipéptidos HBGF-0,8, A Figura 4 é uma ilustração na qual se representa uma análise por transferência Western de lavagens do lúmen uterino não purificadas. A Figura 5 é uma ilustração representando o efeito da activídade mitogéníca dos polipéptidos HBGF-0,8'. A Figura 6 é uma ilustração representando a relação entre os polipéptidos HBGF-0,8 e.: o produto principal de tradução de CTGF. 8

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DAS CONCERTIZAÇÕES

PREFERIDAS

Deve entender-se que a terminologia utilizada neste documento tem como objectivo descrever apenas concretizações especificas, e não se pretende que limite o âmbito da invenção presente que se . limitará às reivindicações apensas.

Deve anotar-se que tal como se utilizam neste documento e nas reivindicações apensas, as formas singulares "um" "uma", "o" e "a" incluem referências plurais a não ser quando o contexto dite claramente o contrário. Assim, por .exemplo, uma referência a "um organismo" inclui . um ou mais de entre um conjunto de organismos diferentes, uma .referência a "um aminoácido" inclui um ou mais dos aminoácidos referidos, e uma referência a "um método" inclui referência a passos e a métodos equivalentes conhecidos dos especialistas da técnica, e assim por diante. A não ser aonde se defina algo em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm os mesmos significados que lhes são atribuídos habitualmente e como tal serão entendidos pelos indivíduos com conhecimentos médios. da técnica aos quais esta invenção se destina. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos que se descrevem neste documento possam ser utilizados na prática ou nos 9 testes da invenção, os métodos e os materiais preferidos são descritos em seguida. As publicações descritas acima são proporcionadas apenas por conterem a sua descrição antes da. data de depósito deste pedido. Neste documento não se deve interpretar que qualquer elemento signifique que os autores admitem que a invenção não seja anterior a qualquer descrição em virtude de uma invenção anterior. A invenção presente proporciona factores de crescimento que se ligam à heparina (polipéptidos HBGF ou HBGF) , que são mitogénicos para os fibroblastos e para as células de músculo liso ia^vitro. Os HBGF são sensíveis ao calor e a ácidos, e existem sob duas formas., HBGF-0,8-Pl, e HBGF-0,8-P2, cada uma das quais tem propriedade diferentes de ligação à heparina, e cada uma das quais tem uma Mr de cerca de 10 kDa sob condições redutoras, por SDS-PAGE. Os HBGF estão estruturalmente e funcionalmente relacionados com o CTGF. Tanto o HBGF-0,8-Pl como o HBGF-0,8-P2 necessitam da presença de NaCl 0,8 M para serem eluídos de uma coluna de afinidade para com. a heparina. Uma sequenciação revelou que a sequência do HBGF-0,8-Pl no terminal N correspondia aos resíduos de aminoácidos 247-262 do produto de tradução com 349 resíduos proveniente do factor de crescimento do tecido conjuntivo de suíno (CTGF), enquanto a sequência do terminal N do HBGF-0,8-P2 correspondia aos resíduos dos aminoácidos 248-259 do CTGF. Deste modo, os HBGF correspondem a duas formas N terminais microheterogéneas e altamente truncadas do produto de tradução do CTGF, ambas as quais são biologicamente activas. O HBGF-0,8-P2 é idêntico ao HBGF-0,8-P 1 excepto 10 no que se deve à presença de um residuo Glu adicional no terminal N de HBGF-0,8-Pl.

Os HBGF da· invenção são formas altamente truncadas junto ao terminal N do CTGF, no entanto, não existe nenhuma fronteira intrão/exão que pudesse ter originado directamente o terminal N das duas proteínas. Os HBGF não se alinham com as componentes modulares propostas para o CTGF; as proteinas da invenção não contêm nenhum dos padrões glicoconjugados sulfatados de ligação do CTGF, que se denominam repetições de trombospondina do tipo I, que se-postula serem responsáveis pela ligação de moléculas da matriz. Um módulo do terminal C do CTGF que se encontra em proteinas da matriz, que se postula estar envolvido na ligação a receptores, está integralmente presente nos HBGF. O padrão de ligação proposto para os glicoconjugados sulfatados entre os resíduos 206 e 214 de aminoácidos de CTGF está ausente dos HBGF, e no entanto os HBGF ligam-se à. heparina, e as interacções com a heparina são funcionalmente significabivas. O terminal N do HBGF-0,8-Pl e o do HBGF-0,8-P2 podem estar envolvidos na ligação á heparina, uma vez que as duas.proteínas da invenção apenas diferem uma da outra por um único Glu no terminal N, evidenciando no entanto uma ligação diferencial à heparina.

Os HBGF da . invenção são segregados tanto por fibroblastos humanos cultivados como pelos murinos. A produção dos HBGF não se limita a determinadas espécies ou sistemas biológicos. Os HBGF ' da invenção são preferivelmente mitogénicos e quimiotáticos para células 11 provenientes do mesênquíma (por exemplo fibroblastos, condrócitos, osteoclastos, osteoblastos, e astrogliais) , no entanto, há outros tipos de células (por exemplo, células musculares, células do tecido conjuntivo, células epiteliais e células segregadoras) que também respondem aos HBGF. Os HBGF podem desempenhar um papel significativo no desenvolvimento normal, no crescimento e na reparação do tecido humano. Os HBGF estão presentes nas lavagens uterinas, e podem desempenhar um papel adicional no crescimento e. na remodelação do endométrio, e, durante a gravidez, podem afectar o crescimento e o desenvolvimento das. membranas extra-embriónicas ou placentais.

Os agentes terapêuticos derivados dos HBGF podem ser úteis para incrementar os processos de crescimento normais ou deficientes que envolvam tecido conjuntivo, em certos estados de doença (por exemplo, na cicatrização de feridas). Quando estes HBGF estão envolvidos em estados patológicos, os desenvolvimentos terapêuticos destas proteínas podem ser utilizados para controlar ou para modular o crescimento não controlado de tecido. A expressão "substancialmente puro", tal como é utilizada neste documento, refere-se a HBGF que estejam substancialmente isentos de outras proteínas, de lípidos, de hidratos de carbono ou de outros materiais aos quais eles estejam naturalmente associados..Um polipéptido HBGF substancialmente puro originará uma única banda principal num gel de poliacrilamida não redutor. A pureza dos HBGF pode também ser determinada por análise de sequência de 12 aminoácidos a partir do terminal amino. Os HBGF, tal como se definem neste documento, incluem fragmentos funcionais do polipéptido, desde que seja mantida a actividade biológica do HBGF (por exemplo, induzindo uma resposta biológica em fibroblastos, tal como se determina utilizando os testes habituais conhecidos na técnica e tais como se ensinam neste documento). Estão incluídos na invenção polipéptidos ruais pequenos possuindo actividade biológica de HBGF. Adicionalmente, estão incluídos também polipéptidos HBGF mais eficazes produzidos, por exemplo, por mutagénese dirigida ao local de CADN de polipéptidos HBGF. Os HBGF "recombinantes" referem-se a polipéptidos HBGF produzidos por técnicas de ADN recombinante; isto é, produzidos a partir de células transformadas com uma construção de ADN exógeno que codifique para o polipéptido HBGF que se pretenda. Os HBGF "sintéticos" são aqueles que são preparados por síntese química. Uma "sequência de codificação de" ADN ou uma "sequência de nucleótidos que codifique para” um polipéptido de HBGF especifico, é -uma sequência de ADN que se venha a ser transcrita e traduzida num polipéptido de HBGF quando for colocada sob o controlo das sequências de regulação apropriadas. A invenção proporciona ácidos nucleicos que codificam para polipéptidos de HBGF. Estes ácidos nucleicos incluem sequências de ADN, cADN e ARN que codificam para os HBGF.. Deve entender-se que todos os ácidos nucleicos que codifiquem para a totalidade ou uma parte dos polipéptidos de HBGF também estão incluídos neste documento, desde que codifiquem para um polipéptido com actividade biológica de 13 HBGF. Incluem-se nestes ácidos nucleicos tanto aqueles que ocorrem na natureza como os ácidos nucleicos .intencionalmente manipulados. Por exemplo, os polipéptidos de HBGF podem ser submetidos a mutagénese dirigida ao local.

Os ácidos nucleicos da invenção incluem sequências que são degeneradas em resultado do código genético. Só existem 20 aminoácidos naturais, a maior parte dos quais são especificados, por mais do que um códon. Nestas condições, desde que a sequência de aminoácidos de um polpéptido de HBGF esteja funcionalmente não alterada, todas as sequências nucleotidicas · degeneradas estão incluídas na invenção. O fragmento,· derivado ou análogo dos polipéptidos de HBGF pode ser (i) um.no qual um ou mais dos resíduos de aminoácidos sejam substituídos por um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (preferivelmente por um resíduo de aminoácido conservado) e em que esse resíduo de aminoácido que se- substituiu possa ser, ou não ser codificado' pelo código genético, ou se encontre adentro das variantes mais preferidas que são aquelas em que a variação em relação a uma , referência se limite a .substituições conservadoras de resíduos de aminoácidos, (estas substituições são aquelas em que se substitui um aminoácido determinado de· um polipéptido por outro aminoácido com características semelhantes. As substituições conservadoras são tipicamente as que envolvem a substituição de uns por outros, dos aminoácidos alifáticos Ala, Vai, Leu e Ile; o intercâmbio dos resíduos hidroxilados Ser e Thr, a permuta dos resíduos ácidos Asp e 14

Glu, a substituição entre os residuos amida Asn e Gin, a permuta dos resíduos básicos Lys e Arg e as substituições entre os resíduos aromáticosPhe, Tyr); (ii) um no qual um ou mais dos resíduos de aminoácidos inclua um grupo substituinte.; (iii) um em que um polipéptido de HBGF seja fundido a outro composto, tal como um composto que aumente a vida média dos polipéptidos de HBGF (por exemplo, polietilenoglicol); ou (iv) um no qual estejam fundidos aminoácidos adicionais aos polipéptidos de HBGF, tais como os que constituam uma sequência líder ou segregatória, ou uma sequência que seja empregue para a purificação dos polipéptidos de HBGF ou ainda uma sequência pro-proteica. Estes fragmentos, derivados e análogos são· considerados como estando ao alcance dos especialistas da técnica, · a partir dos ensinamentos contidos neste documento. Os HBGF da invenção presente e os ácidos nucleicos que codificam para eles são preferivelmente proporcionados sob uma forma isolada, e são preferivelmente purificados até à homogeneidade.

As sequências de. ADN que codificam para os polipéptidos de HBGF da invenção podem ser obtidas por diversos métodos. Por exemplo, pode isolar-se o ADN utilizando processos de hibridização que são bem conhecidos. Nestes incluem-se, sem que a estes eles se limitem: 1) a hibridização de sondas a bibliotecas genómicas ou de cADN para detectar sequências de nucleótidos partilhadas (veja-se, por exemplo: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F. M. et al. (Editores) Green Publishing Company Assoe, e John Wiley 15

Interscience, New York, edição actual) e 2) o despiste com anticorpos de bibliotecas de expressão para detectar aspectos estruturais partilhados. Um indivíduo especializado na técnica entenderá que os ácidos nucleicos (incluindo pelo menos. 12 nucleótidos contíguos) que codificam para os HBGF, são especialmente úteis a título de sondas. "Hibridização selectiva", tal como se utiliza neste documento, refere-se â hibridização em condições fisiológicas moderadamente restritivas ou altamente restritivas (Veja-se J. Sambrook' et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (Edição Corrente)) que' distinguem os HBGF relacionados dos não relacionados com base no .grau· de identidade entre as sequências de nucleótidos na proximidade da hibridização a ocorre. Para além disto, entende-se que um fragmento de uma sequência cóm 100 pb que tenha 95 pb de comprimento tem uma identidade de 95 % com a sequência de 100 pb. a partir da qual foi obtido. Tal como se utiliza neste documento, uma primeira sequência de ADN (ARN) será pelo menos 70 % e preferivelmente pelo menos 80 % idêntica a outra sequência de ADN (ARN) quando existir pelo menos 70 % e preferivelmente pelo menos 80 % ou 90 % de identidade, respectivamente, entre as bases da primeira sequência e as bases de outra sequência, quando estiverem adequadamente alinhadas uma com a outra, por exemplo, quando forem alinhadas por BLASTN. "Identidade", tal como este termo é utilizado 16 - neste documento, refere-se a uma sequência de um polinucleótido que inclua uma percentagem das mesmas bases que existam num polinucleótido- de referência. Por exemplo, um polinucleótido que seja pelo menos 90 % idêntico a um polinucleótido de referência, terá bases de polinucleótido que sejam idênticas a 90 % das bases das quais é constituído o polinucleótido de referência (isto é, quando se alinham adequadamente as sequências uma com a outra utilizando os ajustamentos padrão de alinhamento e de homologia que são habituais na técnica (por exemplo, NetBlast ou GRAIL)), e podendo ter bases diferentes em 10 % das bases que constituem a sequência do polinucleótido.

Os procedimentos de despiste que se baseiam na hibridização de ácidos nucleicos tornam possível isolar qualquer sequência de um gene a partir de um organismo qualquer, desde que esteja disponível uma sonda apropriada. Por exemplo, . as sondas para oligonucleótidos, que correspondem a uma parte da sequência que codifica para a proteína em questão, .podem ser sintetizadas quimicamente. Para isto é necessário que sejam conhecidas as sequências de aminoácidos, oligopeptídicas, curtas. A sequência de ADN que codifica para a proteína pode ser deduzida a partir -do código genético, no' entanto, a degenerescência do código deve ser tomada em conta.· è possível levar a cabo uma reacção de adição mista quando a sequência é degenerada. Isto inclui uma mistura heterogénea de ADN desnaturado com as duas hélices. Para um tal despiste, leva-se a cabo a hibridização· preferivelmente que sobre um ADN de hélice única quer sobre um ADN de -dupla hélice mas desnaturado. A 17 hibridização é especialmente útil para a detecção de clones de cADN derivados de fontes em que esteja presente uma quantidade extremamente pequena de sequências de mARN que se relacionem com o polipéptido de interesse. Por outras palavras, ao utilizar condições de hibridização selectiva dirigidas para evitar a ligação não especifica, é possível, por exemplo, permitir uma visualização auto-radiográfica de um clone de cADN específico pela hibridização do ADN alvo ADN à sonda única na mistura, que é o seu complemento completo (Wallace, et al., Nucleic Acid Research, 9: 879, 1981). Também se entende que estas sondas de hibridização selectivas podem ser, e são de preferência, marcadas com um reagente analiticamente detectável para facilitar a identificação da sonda. Incluem-se nos reagentes úteis, sem que a estes eles. se limitem, a radioactividade, os pigmentos fluorescentes, ou os enzimas capazes de catalisar a formação de um produto detectável. As sondas de hibridização selectiva são portanto úteis para. isolar cópias complementares de ADN a partir de outras fontes ou para despistar em tais fontes sequências relacionadas.

Uma biblioteca de expressão de cADN, tal como a lambda gtll, pode sofrer um despiste indirecto para se encontrarem HBGF que possuam pelo menos um epítopo, utilizando anticorpos específicos para polipéptidos de HBGF ou anticorpos para ' o CTGF que reajam cruzadamente com polipéptidos de HBGF, ou anticorpos para PDGF que reajam cruzadamente com polipéptidos de HBGF. Tais anticorpos podem ser derivados por policlonagem ou monoclonais e podem ser utilizados para detectar produtos de expressão 18 indicativos da presença de cADN de polipéptidos de HBGF.

Podem expressar-se sequências de ADN codificando para polipéptidos de HBGF in vitro por transferência de ADN para uma célula hospedeira adequada. "Células hospedeiras " são células submetidas a engenharia genética (traduzidas ou transformadas ou transfectadas) com os vectores desta invenção que podem ser, por exemplo, um vector de clonagem ou um vector de expressão. 0 vector pode assumir, por exemplo, a forma de um plasmideo, de uma partícula virai, um fago, etc. As células hospedeiras de engenharia genética podem ser cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados tal como seja apropriado para activar promotores, seleccionar transformantes ou amplificar os genes da invenção presente. As condições de cultura, tais como a temperatura, o pH e outras semelhantes, são aquelas que se utilizaram anteriormente para a célula hospedeira que se seleccionou para a expressão, e serão aparentes ao técnico com conhecimentos médios. 0 termo também inclui quaisquer descendentes da célula hospedeira em questão. Entende-se que estes descendentes podem não ser todos eles idênticos à célula mãe uma vez que podem ocorrer mutações durante a replicação. No entanto, incluem-se esses descendentes quando o termo "célula hospedeira " é utilizado. A introdução da construção genética na célula hospedeira pode ser levada a cabo por transfecção com fosfato de cálcio, por transfecção mediada por DEAE-Dextrana, por electroporação ou por qualquer outro método, da técnica (Davis, L. et al., Basic .Methods in Molecular Biology, (Edição Corrente)). 19

Os ácidos nucleicos da invenção presente podem ser empregues para a produção de HBGF por técnicas recombinantes. Deste modo, por exemplo, pode incluir-se o polinucleótido pode ser incluído num de entre uma diversidade de vectores de expressão, para expressar os polipéptidos de HBGF. Incluem-se nesses vectores sequências cromossómicas, não cromossómicas e sintéticas de ADN, por exemplo derivados de SV40; plasmídeos bacterianos; ADN de fagos; baculovírus; plasmídeos de levedura; vectores derivados de combinações de ADN de plasmídeos e de fagos, ADN virai tal como o de vaccinia, adenovirus, vírus de difteria aviária, e pseudo-raiva. No entanto, pode utilizar-se qualquer outro vector desde que ele seja replicável e viável no hospedeiro.

Pode inserir-se a sequência de ADN apropriada no vector por diversos processos.. Em geral, a sequência de ADN é inserida num o.u mais locais de endonuclease de restrição por processos conhecidos na. técnica. Entende-se que estes processos e outros se encontram dentro do âmbito dos conhecimento dos especialistas da técnica. As sequências de ADN que codificam para HBGF podem ser expressas in vivo quer em procariotas, quer em eucariotas. São bem conhecidos na técnica os processos de expressar sequências de ADN com sequências de codificação eucarióticas, em procariotas. Incluem-se nos hospedeiros organismos microbianos, leveduras e organismos mamíferos. São conhecidos na técnica vectores de ADN plasmidicos e virais biologicamente funcionais capazes de 20 expressão e replicação num hospedeiro. Utilizam-se esses vectores para incorporar sequências de ADN da invenção. Em geral, utilizam-se· em ligação com o hospedeiro vectores. de' expressão· contendo sequências promotoras que facilitam a transcrição eficiente da sequência genética, eucariota. O vector de expressão contém tipicamente uma origem de replicação, um promotor, e um terminador,. bem como genes específicos capazes de proporcionar uma selecção fenotípica das células transformadas.

Para além dos vectores de expressão que são conhecidos na técnica tais como os sistemas de expressão bacterianos, de leveduras e de mamíferos, podem também utilizar-se vectores de baculovírus. Uma vantagem da expressão de genes estranhos neste vector d expressão de vírus invertebrado é que ele é capaz de expressar altos teores de proteínas recombinantes, que são antigenicamente e funcionalmente similares às correspondentes naturais. Os vectores de baculovírus e as células hospedeiras de insectos apropriadas que se utilizam em conj unto com os vectores são conhecidos dos especialistas da técnica. 0 isolamento e a purificação de polipéptidos expressos em células hospedeiras da invenção pode ser levado a cabo por qualquer metodologia convencional tal como, por exemplo, por separações cromatográficas preparativas e por separações imunológicas tais como aquelas que envolvem a utilização de anticorpos monoclonais ou policlonais. A invenção proporciona anticorpos que reagem especificamente com os polipéptidos de HBGF ou com seus 21 fragmentos. Embora estes polipéptidos possam apresentar reactividade cruzada com anticorpos contra PDGF ou CTGF, nem todos os anticorpos contra HBGF também serão reactivos com PDGF, e nem todos os anticorpos contra CTGF serão reactivos com os HBGF. São proporcionados anticorpos que constituídos essencialmente por Conjuntos de anticorpos monoclonais com diferentes especificidades epitópicas, bem como preparações de anticorpos monoclonais diferentes. Os anticorpos monoclonais são feitos a partir de fragmentos de proteína contendo antigénios por métodos que são bem conhecidos na técnica (Kohler, et al., Nature 256: 495, 1975; Current Protocols in Molecular Biology,. Ausubel, et al ., ed., 1989). Os anticorpos policlonais contra os HBGF da invenção também estão 'incluídos, utilizando-se métodos conhecidos pelos especialistas da técnica (veja-se Harlow e Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold .Spring Harbor Laboratory, New York, Edição corrente). podem seleccionar-se anticorpos monoclonais específicos para os HBGF, por exemplo, despistando sobrenadantes de culturas de hibridomas que reajam com polipéptidos de HBGF, mas que não reajam com PDGF. Os anticorpos gerados contra os HBGF correspondentes à invenção presente podem ser obtidos por injecção directa dos . polipéptidos num animal ou por administração dos polipéptidos a um animal, preferivelmente um não humano. 0 anticorpo que desta forma se obtém ligar-se-á então ao polipéptido ele próprio. Deste modo, mesmo uma sequência que codifique apenas para um fragmento de um polipéptido pode ser utilizada para gerar anticorpos que se ligam . aos polipéptidos originais. Estes anticorpos podem então ser utilizados para isolar os polipéptidos a partir 22 de células que expressem esses polipéptidos.

Para a preparação de anticorpos monoclonais, pode utilizar-se qualquer técnica que proporcione anticorpos produzidos por culturas contínuas de linhas de células. Incluem-se nos exemplos a técnica de hibridomas (Kohler, et al., Nature 256: 495,1975), a técnica de trioma, a.técnica de hibridoma de. célula B humana (Kozbor et al.f 1983, Immunology Today 4: 72), e a técnica de hibridoma de EBV para se produzirem anticorpos monoclonais humanos (Cole, et al., 1985, em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., páginas.77-96).

Podem adaptar-se as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (Patente U.· S. 4.946.778) para produzir anticorpos de cadeia única contra os produtos peptídicos ímunogénicos desta invenção. Adicionalmente incluídos no âmbito da invenção estão a produção e a utilização para finalidades de diagnóstico e terapêuticas anticorpos tanto "humanos" como "humanizados" dirigidos contra . os polipéptidos de HBGF ou seus fragmentos. Os anticorpos humanizados são anticorpos, ou fragmentos de anticorpos, que apresentam a mesma especificidade de ligação, do que um anticorpo relacionado (isto é, tipicamente de origem murina), mas que apresentam mais caracter.ísticas humanas.. Os anticorpos humanizados podem ser obtidos baralhando cadeias, ou utilizando tecnologia de apresentação de fagos. Por exemplo, um polipéptido que inclua um. domínio variável com uma cadeia leve ou pesada, de um anticorpo não humano específico 23 contra HBGF é combinado com um reportório de cadeias de domínios variáveis (leves ou pesadas) complementares humanas. Podem então seleccionar-se os emparelhamentos híbridos que sejam específicos para o antigénio de interesse. Podem em seguida combinar-se as cadeias humanas dos emparelhamentos seleccionados com um repertório de cadeias de domínios . variáveis (leves ou pesadas) complementares humanas, e em seguida seleccionar-se os dímeros de anticorpos humanizados pela sua especificidade de ligação a um antigénio. Técnicas deste tipo estão descritas na Patente U. S. 5.565.332, ou eles podem ser obtidos comercialmente (Scotgene, Escócia, ou Oxford Molecular, Paio Alto, CA, EUA). Para além disto, as técnicas descritas para a produção de anticorpos "humanos" (isto é, anticorpos de novo com sequências regionais constantes humanas) também podem ser adaptados para se produzirem anticorpos "Humanos" contra HBGF, ou seus fragmentos, ou podem ainda ser adquiridos por contrato comercial (GenPharm International, Inc. Mountain View, CA, EUA) .

Os anticorpos gerados contra os polipéptidos da invenção presente podem . ser utilizados em despiste de polipéptidos de HBGF semelhantes, de outros organismos e amostras. Estas metodologias de despiste são conhecidas na técnica.' A invenção proporciona utilizações tais como se definem nas reivindicações, para acelerar a cicatrização de uma ferida num sujeito, por exemplo um ser humano. 24

Descreve-se a aplicação na. ferida de uma quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico de uma composição que contenha polipéptidos de HBGF purificados. PDGF, uma molécula relacionada com PDGF, ou suas combinações. Os polipéptidos de HBGF desta invenção são valiosos como terapêuticos em casos em que exista uma cicatrizaçâo deficiente das feridas na pele ou em . que exista uma necessidade de incrementar os mecanismos normais de cicatrizaçâo. Os polipéptidos de HBGF, ou os seus fragmentos funcionais, são mais estáveis e menos susceptíveis de degradação por proteases do que o PDGF e outros factores de crescimento que se sabe estarem envolvidos na cicatrizaçâo de feridas, para além disto, os polipéptidos de HBGF podem apresentar uma actividade biológica especifica maior do que oCTGF.

Os polipéptidos de HBGF são derivados de células fibroblásticas, que estão presentes no local de uma- ferida. Por essa razão, agentes que estimulem a produção de polipéptidos de HBGF podem ser adicionados a uma composição que seja utilizada para acelerar a cicatrizaçâo de feridas. Preferivelmente, o agente é um membro da família dos factores de crescimento tais como o factor de crescimento semelhante à insulina (IGF-I), o factor de crescimento derivado de plaquetas (PGF) , o factor de crescimento epidérmico (EGF), o factor de crescimento transformante beta (TGF-β} e o factor de crescimento básico de fibroblastos (bFGF). Mais preferivelmente, o agente é o factor de crescimento transformante beta- (TGF-β) ou outro membro da superfamilia TGF-β. Para além disto, o efeito 25 biológico de HBGF pode ser modulado pela adição de heparina' numa gama de concentrações de entre cerca de 1 μg,/mL e- 100 μ5/πι1. ' As . composições de HBGF da invenção ajudam á cicatrização da ' ferida, em parte, por promoverem o crescimento de tecido conjuntivo. As composições de HBGF são preparadas combinando, em qualquer substância aceitável do ponto de vista farmacêutico, por exemplo em géis inertes ou em líquidos, os polipéptidos purificados de HBGF da invenção. Podem incluir-se outras composições moduladoras tais como a heparina, ou factores'de crescimento tais como TGF-β nas composições de HBGF. A expressão "patologia proliferâtiva de células " refere-se a um estado caracterizado por um número anormal de células. O estado pode incluir quer o .crescimento hipertrófico (a multiplicação contínua de células de que resulta um crescimento demasiado da população de células adentro de um tecido) que o hipotrófico (uma falta ou uma deficiência de células num tecido) bem como um. influxo excessivo ou migração de células para uma área do corpo. As populações de células' não são necessariamente transformadas, tumorigénicas ou malignas, mas podem incluir células normais também. Por exemplo, os HBGF podem estar envolvidos num estado patológico por induzirem uma lesão proliferativa na camada íntima de uma parede arterial, resultando em aterosclerose. Em vez de tentar diminuir os factores de risco desse estado, por exemplo diminuendo a tensão arterial ou diminuindo níveis elevados de colesterol, os anticorpos, as moléculas de sentido reverso e os ribozimas da invenção seriam úteis para interferir com 26 a actividade in vivo dos HBGF associados à aterosclerose. Os anticorpos, as moléculas de sentido reverso e os ribozimas da invenção também são úteis para tratar outras patologias associadas com um crescimento demasiado dos tecidos conjuntivos, tais como diversos estados fibróticos, incluindo e escleroderma, a artrite e a cirrose hepática.

Estas doenças, estados ou padecimentos modulados por HBGF incluem a reparação de tecidos subsequente a lesões traumáticas ou a estados em que se inclui a. artrite, a osteoporose e outras patologias dos ossos, e as queimaduras. Uma vez que estes problemas são devidos a uma resposta de crescimento insuficiente dos fibroblastos, células estaminais, condrócitos, osteoblastos ou fibroblastos no local da· lesão, a adição de um agente biológico ac.tivo que estimula ou induz o crescimento destas células, é benéfica. 0.termo "induz" ou "indução", tal como são utilizados neste documento, referem-se à activação, estimulação, incrementaçâo, iniciação e/ou manutenção dos mecanismos celulares ou dos processos necessários ' para a formação de qualquer um destes tecidos, dos processos de reparação ou desenvolvimento, tal como se descreveram neste documento. A invenção presente proporciona também utilizações tais. como se definem nas suas reivindicações, para modular a função do aparelho reprodutor feminino. Demonstrou-se que os factores de crescimento desempenham um papel na mitose cíclica e na diferenciação das componentes celulares do endométrio, no recrutamento de macrófagos na 27 decidualização do endométrio, nas interacções entre o endométrio e trofoblastos, na manutenção das primeiras fases da gravidez, e na regeneração funcional do endométrio. 0 termo "modular", tal como se utiliza neste documento, denota uma modificação de um estado ou de umas condições biológicas existentes. A modulação de um estado, tal como se define neste documento, inclui tanto um aumento como um decréscimo dos determinantes que afectam o estado existente. Por exemplo, a administração de HBGF pode ser utilizada para aumentar as funções uterinas num estado em que a promoção do crescimento seja pretendida. Por exemplo, pode tratar-se o útero com HBGF para promover o crescimento e o desenvolvimento das membranas da placenta ou do endométrio. Também se descreve neste documento o tratamento com HBGF que pode ser utilizado para promover e parâ manter uma gravidez facilitando a interacção entre o endométrio é os trofoblastos. Em alternativa, os anticorpos, as moléculas de sentido reverso e os ribozimas da invenção podem ser administrados para modular estados em que exista crescimento excessivo do endométrio nos quais o teor em HBGF seja excessivo em comparação com o de um estado biológico normal. A invenção também descreve utilizações tal como se definem nas reivindicações, para tratar estados caracterizados por uma patologia proliferativa de células, tratando esse estado pela administração de uma quantidade eficaz do ponto de vista terapêutico de um agente reactivo de HBGF tal como se define nas reivindicações. 0 termo "tratar" denota uma diminuição do efeito prejudicial do 28 estado no sujeito que recebe o agente reactivo. Quando o estado for devido a um crescimento excessivo de células, um antagonista de HBGF é eficaz do ponto de vista terapêutico para diminuir a quantidade, de factor de crescimento que se pode ligar a um receptor especifico de HBGF numa célula. Um tal antagonista é um anticorpo especifico contra HBGF da invenção, ou um seu fragmento funcional {por exemplo, Fab, F(ab)2)* 0 tratamento necessita que se proporcione um contacto ou uma veiculação ao local em que se verifica o estado, do antagonista do polipéptido de HBGF. Quando a patologia proliferativa de células for devida a uma intensidade diminuída do crescimento ' das células, proporciona-se o contacto ou a veiculação ao local em que se verifica o estado de um agente reactivo de HBGF que seja estimulante. Por exemplo, um tal agente reactivo pode ser o TGF-β (ou um outro elemento da superfamília dos TGF-β). Os especialistas da técnica conhecerão outros agentes biológicos.

Quando uma patologia' proliferativa de células estiver associada à expressão dos HBGF, tem que se utilizar uma metodologia terapêutica que interfira direçtamente com a transcrição de HBGF no mARN ou é possível a tradução do ARN do HBGF em proteína. Por exemplo, também se incluem na invenção ácidos nucleicos de sentido reverso ou ribozimas que se ligam ao mARN do HBGF ou que o clivam. As moléculas de AFN ou ARN de sentido reverso ligam-se especificamente à mensagem de um ARN de um gene alvo especificado, interrompendo a expressão do produto proteico desse gene.. 0 produto de sentido reverso liga-se ao mARN formando uma 29 molécula com duas cadeias que não pode ser traduzida pela célula. Os oligonucleótido de sentido reverso com cerca de 15-25 nucleótidos são. preferidos uma vez que são facilmente sintetizados e possuem um efeito inibidor tal como as moléculas de ARN de sentido .reverso, para além disto, os grupos quimicamente reactivos, tais como o ácido etilenodiaminotetra-acético ligado a ferro (EDTA-FÇ) podem ser ligados a um oligonucleótido de sentido reverso, provocando a clivagem do ARN no local de hibridizagão. Estas e outras utilizações de métodos· de · sentido reverso para inibir a tradução In vivo de genes são bem conhecidas na técnica (por exemplo, De Mesmaeker, et al., 1995. Backbone modifications in oligonucleotides and peptide nucleic acid systems. Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 343-355; Gewirtz, A. M., et al.f 1996b. Eacilitating delivery of antisense oligodeoxynucleotides: Helping antisense deliver on its promise; Proc. Natl. Acad Sei. USA. 93-; 3161-3163; Stein, C, A. A discussion of G-tetrads 1996. Exploiting the potential of antisense: beyond \ phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Chem. and Biol. 3: 319-323).

Outra metodologia terapêutica incluída na invenção envolve a administração directa de reagentes ou de composições que incluam os HBGF da invenção por qualquer das técnicas de administração convencionais (por exemplo, mas sem que se limite a, injecção local, inalação, ou administração sistémica) , a um sujeito com uma patologia fibrótica, esclerótica, ou de proliferação celular, aterosclerose. A administração dos HBGF, tal como se descreveu acima, acelera a cicatrização de feridas, pode 30 induzir a formação de tecidos reparados ou a sua regeneração, ou o crescimento e desenvolvimento do endométrio. O reagente, a formulação ou a composição podem também ser alvejados a células específicas ou a receptores, por qualquer um dos métodos descritos neste documento ou por qualquer método conhecido na técnica de veicular, alvejar e expressar genes que codifiquem para HBFG. A dosagem real do reagente, da formulação ou da composição què modula uma patologia fibrótica, uma patologia esçlerótica, uma patologia de proliferação celular, a aterosclerose ou a cicatrização de feridas depende de muitos factores, incluindo a dimensão e o estado de saúde de um organismo. No entanto, um indivíduo com conhecimentos médios da técnica pode utilizar os seguintes ensinamentos que descrevem os métodos e as técnicas para determinar as dosagens clínicas (Spilker B., Guide to Clinicai Studies and Developing Protocols, Raven Press Books, Ltd., New York, 1984,, páginas 7-13, 54-60; Spilker B., Guide to Clinicai Trials, Raven Press, Ltd., New York, 1991, páginas 93-101; Craig C., e R. Stitzel, editores., Modern Pharmacology, 2a edição, Little, Brown and Co., Boston, 1986, páginas .127-33; T. Speight, editor, Avery's Drug Treatment: Principies and Practice of Clinicai Pharmacology and Therapeutics, 3 a edição', Williams and Wilkins, Baltimore, 1987, páginas 50-56; R.. Tallarida, R. . Raffa e P. McGonigle, Principies in General Pharmacology, Springer-Verlag, New York, 1988, páginas 18-20) ou para determinar a dosagem apropriada para ser utilizada; mas em geral, administram-se por dia a um adulto entre cerca de 0,5 \x,q/mL e 500 μq/mL em termos de concentração final inclusiva, em 31 qualquer veiculo aceitável do ponto de vista farmacêutico. A invenção presente também proporciona um método para detectar a presença de teores anormais de HBGF num sujeito, para ser utilizado a titulo de diagnóstico para determinar a presença de estados ou de patologias .associadas a teores anormais de HBGF. Incluem-se nestes estados, sem que eles a estes se limitem, as patologias proliferativas das células, diversos estados fibróticos incluindo o escleroderma, a artrite a cirrose hepática, e os fibróides uterinos. Por exemplo, obtém-se uma amostra de um sujeito, que se suspeite conter HBGF, determina-se o teor de polipéptido de HBGF e compara-se com o teor de polipéptido de HBGF numa amostra de tecido normal. Pode determinar-se o teor de HBGF por imuhoensaios utilizando anticorpos contra polipéptido de HBGF, por exemplo. Incluem-se em outras variantes destes ensaios o radioimunoensaio (RIA), o ELISA e a imunofluorescência. Em alternativa, podem utilizar-se sondas de ácidos nucleicos para detectar e para quantificar o mARN de polipéptido de HBGF, com.o mesmo objectivo.

Os exemplos que se seguem ilustram a invenção. Fizeram-se esforços no sentido de assegurar precisão em quanto diz respeito aos números utilizados (por exemplo quantidades, tempo, temperatura, etc.), mas devem considerar-se alguns erros e desvios experimentais. A não ser aonde se indicar algo em contrário, as partes são partes em peso, a massa molecular é a massa molecular média em massa, a temperatura é em graus Centígrados, e a pressão 32 é atmosférica ou próxima. EXEMPLO 1

CARACTERIZAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE POLIPÉPTIDOS DE

HBGF

Obtiveram-se úteros aleatoriamente, provenientes de porcas com uma idade de cerca de 8 meses ou menos, no matadouro.' Lavou-se cada cavidade uterina com soro salino-tamponizado com fosfato (PBS) frio (4°C) para .se obterem componentes do lúmen uterino. A purificação do factor. de crescimento, foi evada a cabo sobre quantidades de 4 litros de lavagens (ULF) obtidas de- até cerca de 120 animais. Clarificaram-se os ULF por centrifugação a 13.500 X g durante 30 minutos a 4°C, e passou-se o sobrenadante através de lã de vidro.

Aplicaram-se amostras de quatro litros de sobrenadante clarificado de ULF a 4°C sobre uma coluna de permuta catiónica BioRex 70 (5 x 6 cm; Bio-Rad) que havia sido previamente equilibrada em PBS, 0,2 M em NaCl. Depois da aplicação da amostra, lavou-se a coluna com 500 mL de PBS, 0,2 M em NaCl, e eluíram-se as proteínas ligadas utilizando 500 mL de um gradiente de NaCl de 0,2-2 M, em PBS. O caudal era de 3,5 mL/minutos durante toda a operação, e obtiveram-se fracções de 10 mL durante o tratamento da coluna com o gradiente de NaCl. Seleccionaram-se para utilização posterior as fracções que demonstraram actividade mitogénica face -a fibroblastos 33

Balb/c 3T3. Todos os passos cromatográficos ulteriores foram levados a cabo à temperatura ambiente. A cromatografia de permuta iónica do ULF mostrava a presença de uma actividade de um factor de crescimento catiónico face a células Balb/c 3T3, eluido da coluna BioRex 70 por NaCl 0,3-0,6 M. Uma cromatografia de afinidade para a heparina revelou a presença de mais um polipéptido de HBGF não identificado que necessitava de

NaCl 0,8 M para eluir de uma coluna EconoPac de heparina. Em termos da quantidade da actividade biológica recuperada da coluna, a fracção que necessitava de NaCl 0,8 MN para eluir aparentava ser um factor de crescimento catiónico principal, que. se ligava á heparina, para as células 3T3. A posição de eluição dos.· polipéptidos de HBGF das colunas de afinidade para heparina era claramente diferente para PDGF, HB-EGF, PTN, aFGF, bFGF, e anfirregulina. A actividade mitogénica do HBGF era destruída por exposição ao calor (100°C durante 2 minutos ou 56°C durante 30 minutos) ou a ácido (pH 2,0 durante 2 minutos}.

Utilizou-se uma cromatografia de filtração em gel. para mostrar que os HBGF tinham uma massa molecular relativa aparente de aproximadamente 10.000 Dalton, para estes estudos aplicou-se 0,5 mL de uma fracção contendo o eluído a NaCl 0,8 . M obtido, na FPLC de afinidade para heparina em coluna EconoPac, do ULF proveniente de 30 animais, a 0,5 mL/minuto, a uma coluna de FPLC TSK G2000 SW (30 cm x 8 mm, dimensão de partícula 10 pm, M, gama de fraccionamento de 500-100.000; TosoHaas) equipada com uma 34 coluna de guarda SW (4cm x 8 mm, 10 μια; TosoHaas) . As proteínas foram eluídas com PBS contendo NaCl 0,3 M. Recolheram-se fracções de 200 μΐι e testaram-se quanto à sua capacidade de estimular a síntese de ADN em células 3T3. Levou-se a cabo a calibração da coluna usando EGF (MM de 6.000), lactalbumina (MM de 14.200), inibidor de tripsina (MM de 20.100), e ovalbumina (MM de 45.000). Testou-se nas facções a sua capacidade de estimular a síntese de ADN na células 3T3, a 40 μΤ/πΛ, tal como se descreveu acima.

Juntaram-se as fracções que apresentavam actividade de HBGF (fracções 16-19 obtidas após a cromatografia de permuta catiónica e da cromatografia de afinidade para a heparina), diluiu-se, e submeteu-se a um segundo ciclo de FPLC de afinidade para a heparina utilizando uma coluna TSK 5PW de heparina. Para se levar a cabo o segundo passo de purificação por afinidade com a heparina, juntaram-se as fracções biologicamente 'activas como HBGF contendo o eluído a NaCl 0,8 M do passo de purificação com heparina EconoPac, diluiu-se 3 vezes com Tris-HCl 20 mM (pH ,.4), e clarificou-se por uma passagem através de um filtro de 0,2 μιη. Aplicou-se a amostra a 2 mL/minuto à coluna TSK 5PW de heparina (0,8 x 7,5 cm; TosoHaas, Philadelphia, PA) , que se lavou e eluiu tal como se descreveu acima, excepto que não se utilizou CHAPS nos tampões, e recolheram-se fracções de 0,5 mL. Repartiu-se em dóis lotes o conjunto das fracções que continham proteínas que haviam sido eluídas a NaCl 0,8 M e que haviam demonstrado actividade mitogénica para células 3T3, e que eram as fracções 31-34 (pico 1) e as fracções 35 e 36 (pico 35 2). Eluiu-se de novo o polipéptido de HBGF com NaCl 0,8 M (fracções 31-36), mas o eluído era constituído por duas fracções (picos) com actividade mitogénica que apresentavam propriedades diferentes de ligação à heparina. Denominaram-se os picos com actividade HGBF-0,8-Pl para as fracções 31-34 e HGBF-0,8-P2 para as fracções 35 e 36.

As fracções HBGF-0,8-Pl e -P2 foram ajustadas a 10 % de acetonitrilo, 0,1 % de ácido, trifluroacético e submetidas individualmente a uma HPLC de fase reversa sobre Cs. A HPLC de fase reversa foi levada a cabo num sistema de HPLC· Hitachi (Hitachi Instruments Inc ., Danbury, CT) utilizando uma. coluna C8 (0,46 x 25 cm, dimensão de partícula 5 μη; Rainin Instrument 0 0 Woburn, MA) que havia sido equilibrada com- água contendo 10 % (em volume) de acetonitrilo e 0,1 % (em volume) de ácido trifluoroacético. Ajustaram-se individualmente conjuntos de fracções contendo os picos 1 e 2 do passo de purificação com heparina na coluna TSK, de modo a conterem 10 % de acetonitrilo, 0,1 % de ácido trifluoroacético, e clarificaram-se por uma passagem através de um filtro de 0,2 μητί. As condições de eluição das proteínas ligadas foram 10 % de acetonitrilo entre zero e 10 minutos depois da injecção da amostra, e 10 a 90 % dos 10 minutos até aos 146 minutos. 0 caudal constante foi de 1 mL/minuto, e o cromatograma (A214) foi arquivado tal como se descreveu (Bray e Brigstock, (1994) Amer. Lab. 26, 38). Recolheu-se o eluído em fracções de 0,5 mL em tubos siliconizados contendo 50 μΕ de NaOH 125 mM para neutralizar de imediato o ácido trifluoroacético. Evaporaram-se à secura as 36 alíquotas de 80 μΐί de fracções seleccionadas num concentrador SpeedVac (Savant Instruments, Farmingdale, NY) e reconstituíram-se em 25 pL de Tris-HCl 10 mM (pH 7,4). Avaliou-se em 10 μΐ deste concentrado o seu poder de estimulação da síntese de ADN em células 3T3, e utilizaram-se outros. 10 μΐ para SDS-PAGE analítico. Para o segundo passo de purificação por HPLC em C8, juntaram-se duas fracções activas do primeiro passo de HPLC (volume total de 1 ml), diluiu-se 5 vezes com água com 0,1 % - de ácido trifluoroacético, e submeteu-se às mesmas condições de eluição cromatográfica que se descreveram neste documento. As posições de eluição dos HGBF-0/8-P1 e -P2 foram determinadas por bioensaio de aliquotas das fracções contendo o. eluido da coluna depois de haverem sido evaporadas e reconstituídas em PBS, demonstrando que existia actividade suficiente nas amostras de HGBF purificadas para permitir a sua detecção, e uma caracterização suplementar., apesar da sua exposição prolongada (entre , cerca de 30 e 40 minutos) a pH = 2 durante o passo de HPLC.

Depois do HPLC, levou-se a cabo uma análise por SDS-PAGE contrastado a prata, das fracções- que continham quer HBGF-0,8-Pl quer -P2, em . condições redutoras, utilizando mini-géis de 18 % de poliacrilamida tal como foi descrito (Kim, G. Y., et al., (1995), Biol. Reprod. 52,561- 571). Levou-se a cabo em seguida a contrastação das proteínas com prata, tal como foi descrito (Wray, W.., et al., (1981) Anal. Biochem. 118, 197-203) . A SDS-PAGE foi levada a cabo em (i) factores de crescimento purificados 37 por HPLC, (ii) 8 μΐ de ULF não fraccionado, ou (iii) 100 μϊ, de ULF depois de uma passagem através de leitos de heparina-Sepharose de 20 pi, na the presença de Tris-HCl 0,1 M, 0,5 M em. NaCl (pH 7,4) e da subsequente extracção das pérolas de heparina com tampão das amostras de SDS-PAGE. Prepararam-se então os géis tal como se descreveu (Kim, G. Y., et al.r (1995) Biol. Reprod. 52, 561-571). Uma análise subsequente revelou a presença de uma única proteina com 10 kDa que se co-purificava com actividade mitogénica em relação a Balb/c 3T3. Os niveis da actividade mitogénica foram directamente correlacionados com os da proteina de 10 kDa, que estava completamente pura tal como se demonstrou por contrastação com prata. Os resultados de 18 purificações individuais, por HPLC confirmaram ' uma relação directa, de causa e efeito, entre a{s) proteina(s) de 10 kDa e a actividade mitogénica dos HBGF-0,8-Pl e -P2. A análise dos diversos passos de purificação mostrou que 0,5-1,1 μg de HBGF-0,8-Pl ou -P2 foram cada um deles purificados a partir de 342 mg de proteina de ULF em bruto e que se recuperaram 10-22 unidades de actividade para os HBGF-0,8-Pl ou P2 depois do primeiro passo de HPLC, em comparação com 66.6-66 unidades num litro de matéria-prima (Tabela 1) . Deve anotar-se que a recuperação relativamente modesta da actividade do péptido-0,8 de HGBF' se podia atribuir a (i) uma contribuição principal de IGF, EGF, PDGF, bFGF, HB-EGF, e PTN para a actividade mitogénica global em relação a células 3T3 nas amostras em bruto'e nas parcialmente purificadas (2, 8, 9, 12, 25-27) e (ii) à labilidade em meio ácido, da actividade mitogénica do 38 péptido-0,8 de HGBF durante o(s) passo(s) de separação por HPLC. Embora se tentassem estratégias alternativas para recuperar factores de crescimento purificados com uma actividade especifica superior, não foi possível evitar a utilização da HPLC em fase reversa nem do ácido trifluoroacético para o emparelhamento de iões, sem que resultasse comprometida a pureza do produto final. Embora a recuperação dos HBGF-0,8-Pl e -P2 estivesse de certa forma comprometida, em termos da sua actividade biológica, a recuperação da caracterização estrutural das proteínas tinha sido facilmente conseguida, uma vez que elas haviam retido uma actividade suficiente para poder ser inequivocamente atribuída a uma única banda homogénea de 10 kDa em géis de SDS-poliacrilamida, e que se lograram isolar quantidades suficientes de cada proteína a partir de diversos litros de ULF (Tabela 1). TABELA 1

Purificação Proteína EDsoa Total Actividade Purificação ng ng/ml unidades % - ULF em 3,4 x 25,650 66, 666 100 bruto 10s BioRex 70 2,2 x 3825 28,649 43 7 107 EconoPac 4,8 x 3225 744 1,1 8 Hep 105 HBGF-0.8-P1 TSK-Hep 2,1 x 2230 473 0,7 11 105 HPLC C8, passo ld 1100 250 22 0,03 103 . HPLC C8, 100 25 20 0,03 1026 ocl passo 2 - 39 - - 39 - HBGF-0.8-P1 TSK-Hep 2,9 x 417 347 0,5 62 HPLCd Cs 104 500 250 10 0,015 103 a Concentração de uma preparação de HBFG-0,8 para se obter 50 % do máximo da síntese de ADN. b 1 unidade de actividade é a quantidade de HBGF-0,8 necessária para se obter o ED50. c Comparado com ULF em bruto. d Bioactividade diminuída devido à exposição a ácido._ EXEMPLO 2

SEQUENCIAÇÃO DE POLIPÉPTIDOS DE HBGF

Juntaram-se fracções contendo os factores de crescimento purificados por HPLC, secou-se, e submeteu-se a uma SDS-PAGE preparativa. Transferiram-se as proteínas . do gel durante 90 minutos a 300 mA para uma membrana em difluoreto de polvinilideno utilizando tampão CAPS 10 mM (pH 11) .. Determinou-se a localização das proteínas de e interesse contrastando as transferências com Coomassie R250 a 0,1 % em metanol a 50 %, durante 2 minutos, seguindo-se a eliminação do corante com metanol a 50 % em ácido acético a 10 %. Cortou-se metade de cada banda de proteína de 10 kDa e submeteu-se a uma sequenciação de aminoácidos a partir do terminal N num sequenciador 470A em fase gasosa (Applied BioSystems, Foster City, CA). Identificaram-se os derivados de feniltiohidantoína por HPLC em fase reversa numa coluna Cie·. Obteve-se uma sequência de 16 resíduos para o HBGF-0,8-Pl, com um resíduo não determinado na posição 10, 40 obteve-se uma sequência de 12 resíduos para o HBGF-0,8-P2 com um resíduo não determinado na posição 9 (Tabela 2) . Estes dados mostram que as HBGF-0,8-P1 e -P2 eram idênticas nos seus terminais N excepto devido à presença de um resíduo adicional Glu no terminal N de HBGF-0,8-Pl. Uma pesquisa no GenBank™ revelou que estas sequências se alinham perfeitamente com sequências internas previstas de hCTGF e de fisp-12 murina (também denominada (3IG-M2),· a homóloga murina de CTGF (Bradham, D. M., et al., (1991) J. Cell Biol. 114, 1285-1294; Ryseck, R-P., et al.. , (1991)

Cell Growth Differ. 2, 225-233; Brunner,. A., et al., (1991) DNA Cell Biol. 10, 293-300) O resíduo não identificado no ciclo 10 para HBGF-0,8-Pl e o não identificado no ciclo 9 de HBGF-0,8-P2 correspondiam a Cys256 de hCTGF e a Cys255 de fisp-12 (Tabela 2) . TABELA 2 HBGF-0,8-Pla (SEQ ID NO:l HBGF-0,8-P2b (SEQ ID NO: CTGF-(247-262) humana c fisp-12-(246-261)d CTGF-(247-262) porcina®

Glu-Glu-Asn Lys-Lys-Xaa Lys-Ile 2) Glu-Asn-Ile Lys-Xaa-Ile Glu-Glu-Asn Lys-Lys-Cys Lys-Ile Glu-Glu-Asn • Lys-Lys-Cys Lys-Ile Glu-Glu-Asn Lys-Lys-Cys _Lys-Ile -Ile-Lys-Lys-Gly- -Ile-Arg-Thr-Pro- -Lys-Lys-Gly-Lys- -Arg-Thr -Ile-Lys-Lys-Gly- -Ile-Arg-Thr-Pro- -Ile-Lys-Lys-Gly- -Ile-Arg-Thr-Pro- -Ile-Lys-Lys-Gly- -Ile-Arg-Thr-Pro-

Rendimento repetitivo b Rendimento repetitivo c Veja-se Bradham et al. - 88%; rendimento = 90%; rendimento J. Cell Biol. 114 inicial - 7 pmol·, inicial - 3 pmol, :1285-1294, 1991, 41 dVeja-se Ryseck et al. Cell Growth Differ. 2:225-233, 1991. e Da análise de cADN neste trabalho.

Para verificar se as sequências parciais de HBGF-0,8-Pl e -P2 estavam de facto presentes na molécula de CTGF porcina (pCTGF), isolou-se um cADN de comprimento inteiro de pCTGF por despiste por hibridização de uma biblioteca de cADN do endométrio utilizando uma sonda marcada 32P-hCTGF. Para estes estudos, obteve-se ARN total do endométrio porcino tal como descrito (Kim, G. Y., et al., (Biol. Reprod. 52, 561-571 (1995)).Utilizou-se um sistema de isolamento de mARN poli(A)Tract (Promega, Madison, WI)para isolar poli (A+) ARN, submetendo-se 5 do qual a uma síntese da primeira cadeia de cADN utilizando transcriptase reversa do vírus de leucemia murina Moloney e ligante-iniciador oligo(dT) contendo Xhol. Iniciou-se a síntese da segunda cadeia tratando o complexo de mARN-cADN com RNase. Aparou-se o cADN utilizando fragmento de Klenow e ligou-se a adaptadores EcoRl que se fosforilaram subsequentemente com polinucleótido quinase T4. 100 ng de cADN digerido por Xhol, purificado numa coluna de Sephacryl S-400, foram ligados a 1 μρ de braços de vector Uni-ZAP XR no local de clonagem múltiplo de Xhol-FcoRI, e empacotou-se o produto utilizando extracto de empacotamento Gigapack II (Stratagené, La Jolla, CA) . A biblioteca primária foi amplificada em células XL1 Blue MRF a um título de 1,4 xlO10 unidades formadoras de placa por mL.

Obteve-se uma sonda verificada de CTGF marcado com 32P, correspondendo ao terminal 3' do produto primário 42 de translação de hCTGF, por reacção em cadeia de ARN de fibroblastos de prepúcio humano com transcriptase reversa-polimerase utilizando respectivamente os iniciadores de sentido directo e de sentido reverso, 5'-GCCGTCTAGAGCGGCCGCATGGAAGAGAACATTAAGAAGGG-3' (SEQ ID NO: 3) e 31-CCTCTGTACCGTACTTAAGCGCCGGCGACC-5' (SEQ ID NO: 4). Usou-se a sonda para despistar 106 placas, duas das quais evidenciaram hibridização reprodutível, e foram isoladas utilizando um estojo Rapid Excision Kit (Stratagene). Obtiveram-se dois clones de5,0-kilo-pares de bases pBluescript SK de CTGF de porco, denominados pBSK-pBSK-pCTGFl e pBSK-p-pCTGF2, que se utilizaram para as reacções de sequenciação iniciais. 0 pBSK-pCTGFl foi então sequenciado por completo utilizando um conjunto de sequenciações manuais e / automatizadas com terminador metilenodíoxilo (Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 74, 5463-5467. (1977)). Obtiveram-se dados- sobre as sequências de ambas as cadeias de ADN. Listam-se as sequências de HBGF-0,8-Pl e de -P2 na Tabela 2.

Determinou-se que o cADN do CTGF de porco clonado tinha .1,51 quilo pares de bases, com um quadro de leitura aberto de 1.047 pares de bases. Prevê-se que o produto translacional primário do pCTGF contenha 349 aminoácidos e contenha a sequência do péptido de HBGF-0,8 entre os resíduos 247 and 262 (Tabela 2). A nível dos aminoácidos, o pCTGF apresenta uma identidade de cerca de 92 % com o fisp-12 e com hCTGF. Depois de se clivar o peptide presumível de sinalização com 26 resíduos, prevê-se que o pCTGF contenha 323 aminoácidos incluindo 38 resíduos de Cys que 43 se conservam completamente no hCTGF e no fisp-12. EXEMPLO 3

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA HBGF

Uma vez que os HBGF representam formas microheterogéneas de CTGF truncado., a relação entre HBGF e GTGF. foi investigada. A presença da proteína de 10 kDa na matéria-prima. foi. confirmada por transferência Western de amostras de ULF não fraccionadas utilizando um anticorpo contra CTGF que reagia com polipéptidos de HBGF purificados por.HPLC.

Para se produzir o anticorpo, produziu-se um péptido com quatro braços multiplamente antigénico CTGF-(247-260). incluindo a sequência EENIKKGKRCIRTP (resíduos 247-260) (SEQ. ID. No: 5)num sintetizador de péptidos Synergy 432a (Applied BioSystems), e purificou-se por HPLC em fase reversa utilizando uma coluna C18 (0, 46 x 36 cm; Rainin Instruments) que se eluiu com um gradiente de 5 a 95 % de acetonitrilo em água com .0,1 % de ácido trifluoroacético, ao longo de 90 minutos. Juntaram-se as fracções que continham os polipéptidos purificados, evaporou-se à secura, e reconstituiu-se com água estéril. Injectaram-se dois coelhos New Zealand White (coelhos A e B) , a que haviam sido retiradas amostras de sangue para se obter soro antes da imunização, por. via subcutânea, com 1 mg de polipéptido em adjuvante de Freund completo, seguindo-se 3 semanas depois uma injecção intramuscular de 44 250 pg de polipéptido em adjuvante de Freund incompleto. Obtiveram-se amostras do anti-soro do sangue' que se obteve dos animais 7 dias depois. Validou-se a reactividade dos anti-soros por transferência Western e por imunoprecipitaçãoUtilizaram-se nestas experiências soro antes da imunização e anti-soro do coelho A. EXEMPLO 4

GERAÇÃO DOS POLIPÉPTIDOS DE 10-kDa DE HBGF

Levou-se a ,cabo uma' transferência Western tal como havia sido descrito anteriormente (Harlow e Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Edição corrente). Em resumo, levou-se a cabo SDS-PAGE em condições redutoras utilizando mini-géis de poliacrilamida a 18 % tal como descritos {Kim, G. Y. ,· et al., Biol. Reprod. 52, 561-571 {1995)). Levou-se a. cabo a contrastação das proteínas com prata tal como se descreveu (Wray, W., et al. r Anal. Biochem. 118, 197-203 (1981).). A transferência de Western foi levada a cabo sobre (i) factores de crescimento purificados por HPLC, (ii) 8 pL de ULF não fraccionado, ou (iii) 100 pL de ULF depois de uma passagem através de leitos de heparina-Sepharose, de 20 pL, na presença de Tris-HCl 10 mM, 0,5 M em NaCl (pH 7,4) e por extracção subsequente das pérolas de heparina com tampão de amostras de SDS-PAGE. Fizeram-se as transferências aos géis e bloquearam-se tal como se descreveu (Kim, G. Y., et al., Biol. Reprod. 52, 561-571 (1995)) e incubou-se com uma diluição a 1:1.000 de soro de coelho não imunizado ou com 45 uma diluição a 1:1.000 de anti-soro com péptido anti-pCTGF-(247-260) (coelho A). As bandas imuno-reactivas foram visualizadas utilizando· IgG de cabra anti coelho conjugado com fosfatase alcalina, seguido por substratos cromogénicos ao azul de tetrazólio nitrado/fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo.

Para além da proteína- de 10-kDa, estavam também presentes mais duas formas de massas diferentes dé CTGF (16 e 20 kDa) no ULF, mas não se obtiveram dados convincentes para o CTGF de 38 kDa. A transferência Western verificou também que o HBGF purificado por HPLC incluía uma única proteína imuno-reactiva de 10 kDa. Por comparação da intensidade corada de HBGF a partir de volumes conhecidos de fluido uterino não diluído (isto é, 0,7-2,3 μΑ) , com a intensidade da cor de quantidades mitogénicas de HGBF purificado, obteve-se a indicação de que existem no fluido uterino quantidades mitogénicas de HBGF, in vivo. Tomados em conjunto, os dados obtidos que mostram que o ULF não continha teores detectáveis de CTGF de 38 kDa mas continha HBGF em quantidades que eram provavelmente mitogénicas, demonstram que os HBGF ocorrem naturalmente in vivo e não proveem de uma clivagem do CTGF de 38 kDa durante a sua purificação. EXEMPLO 5

PROPRIEDADES DE LIGAÇÃO À HEPARINDOS POLIPÉPTDOS

DE HBGF 46 A presença de um resíduo ácido adicional de Glu no terminal N do polipéptido de HBGF 0,8-Pl foi correlacionada com a menor afinidade para a heparina que esta molécula apresenta, em comparação com HBGF-0,8-P2, sugerindo que o terminal N do péptido de HBGF-0,8 pode fazer parte de um domínio de ligação à heparina.. Para testar as propriedades de ligação à heparina da região do terminal N, bem como de outras porções da molécula de CTGF, investigou-se a capacidade de ligação a [3H]-heparina por parte de.18 polipéptidos que abarcam em conjunto todos os 103 resíduos do terminal C de hCTGF.

Foram sintetizados que abarcam em conjunto todos os 103 resíduos do terminal C de hCTGF, que foram recebidos sob a forma de um PepSet™ clivado, da Chiron Mimo topes (Clayton, Victoria, Austrália). Todos os polipéptidos foram sintetizados com terminais N acetilados e com terminais C amidados,· excepto o CTGF-(247-255) e o CTGF-(247-260) , que foram sintetizados com aminas livres no terminal N, e o CTGF-(326-349) e o CTGF-(339-349), que foram sintetizados com terminais C ácidos (Tabela 3).

Todos os polipéptidos continham um ou nenhum resíduo Cys; substituíram-se o Cys292 no CTGF(285-292) e o Cys325 no CTGF-(318-328) por Ser para impedir ligações dissulfureto intra-cadeia a Cys287 ou a Cys323 nos polipéptidos respectivos. Determinaram-se as propriedades de ligação à heparina utilizando uma adaptação do método de Baird et al. (Baird, Ã., et al. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 85,2324-2328 (1988)). Em resumo, 37,5 nmol de cada 47 polipéptido foi deposto por absorção em duplicado em nitrocelulose, utilizando um aparelho de transferências pontuais (dot-blot). Bloqueou-se a transferência durante 30 minutos com Tris-HCl 10 mM> 0,15 M em NaCl, e com 0,1 % de albumina de soro bovino (pH 7m4) e depois incubou-se durante 3 horas à temperatura ambiente nesta solução, contendo 10 pCi/mL de [3H]heparina (NEN Life Science Products). Lavou-se a transferência quatro vezes com Tris-HC1 1,0 M, 0,15 M em NaCl, e misturaram-se as manchas individuais com fluido de cintilação para a contagem de [3H] . A Tabela 3 sumariza os resultados obtidos com os polipéptidos sintéticos. O nível mais elevado de ligação à heparina foi obtido para os.polipéptidos que continham os resíduos 247-260, 274-286, e 305-328. Deve anotar-se que nenhum destes polipéptidos apresentava actividade agonista ou antagonista de polipéptido de HBGF num ensaio de síntese de ADN em células 3T3. TABELA 3

Domínio peptídico Sequência [3H] Heparina ligada (méd + D.P. ) cpm/]ig Nenhum 11 ± 0.2 CTGF-(247-255) EENIKKGKKa 10 ± 0.3 CTGF-(247-260) . EENIKKGKKCIRTP3 836 ± 1 CTGF-(257-272) IRTPKISKPIKFELSG 70 ± 13 CTGF-(259-275) TPKISKPIKFELSGCTS 124- ± 3 CTGF-(274-283) TSMKTYRAKF 388 ± 12 CTGF-(274-286) TSMKTYRAKFCGV 1108 ± 119 CTGF-(285-291) GVCTDGR 7 ± 0.3 Ser292 CTGF-(285-292) GVCTDGRS 8 ± 0.4 48

Domínio peptídico Sequência [3H] Heparina ligada (méd ± D.P.) cpm/gg CTGF-(293-306) CTPHRTTTLPVEFK. 9 ± 1.1 CTGF-(294-306) TPHRTTTLPVEFK 11 ± 0.4 CTGF-(305-322) FKC P DGEVMKKNMM FIKT 237 ± 22 CTGF-(308-322) PDGEVMKKNMMFIKT 71 + 2 CTGF-(318-324) MFIKTCA 475 ± 116 Ser^5 CTGF-(318-328) MFIKTCASHYN 601 ± 40 CTGF-(324-328) ACHYN 9 + 1 CTGF-(326-349) HYNCPGDNDIFES LYYRKMYG DMAb 10 ± 1 CTGF-(330-340) PGDNDIFESLY 10 ±0.5 CTGF-(339-349) LYYRKMYGDMAb 9 ± 0.5 a Amina livre no terminal N. b Terminal C ácido.

Estudos anteriores demonstraram que a heparina modula á ligação a receptores e a actividade biológica de diversos polipéptidos de HBGF incluindo bFGF, HB-EGF, e anfi-regulina (Besner, G. E., et al., Growth Factors 7,289-296 (1992); Higashiyama, S., et ai., J. Cell Biol., 122, 933-940 (1993); Rapraeger, A. C., et al. , Science 252, 1705-1708 (1991); Olwin, B. B., et al., J. Cell Biol. 118, 631-639 (1992); Cook, P., et al., J. Cell Physio. 163, 418-429 (1995); Yayon, A., et al., Cell 64, 841-848 (1991); Aviezer, D., et al., Proc. Natl.. Acad. Sei. U. S.. A. 91, 12173-12177 (1994)). Uma vez que. o peptide HBGF-0,8 exibia uma forte afinidade para a heparina, examinamos o· : efeito desta glicosaminoglicana sobre a actividade mitogénica do péptido de HBGF-0,8.. A actividade de uma dose altamente estimuladora de péptido HBGF-0,8 sofreu uma potenciação significativa com 1-3 pg/mL de heparina, mas foi inibida por 30-100 pg/mL de heparina. Dosagens iguais de heparina não tinham qualquer efeito sobre a síntese de ADN de base ou a estimulada por soro de vitelo, em células 3T3. 49 EXEMPLO 6

ENSAIO DE MIT06ÉNESE POR HBGF

Para avaliar a actividade mitogénica relativa de HBGF com IGF-1, EGF, bFGF, e com PDGF-AB, levaram-se a cabo ensaios de síntese de ADN em células 3T3 (Tabela 4). Juntaram-se as fracções biologicamente activas contendo o eluído a NaCl 0,3-0,6 MN da coluna Bio-Rex, diluiu-se 3 vezes com Tris-HCl 20 mM (pH 7,4) contendo 0,1 % de CHAPS, passou-se através de um filtro de membrana de 0,4 5 μχη, colocou-se num reactor em polipropilenò siliconizãdo, e serviu-se por intermédio de uma bomba peristáltica a uma coluna EconoPac de heparina (0,7 x 3,6 cm; Bio-Rad) a 2 mL/minuto. Lavou-se então a coluna de heparina com 50 ml de tampão Tris-HCl 20 mM, 0,2 M em NaCl, com 0,1 % de CHAPS, e desenvolveu-se a 1 mL/minuto com 4 0 mL de um gradiente de NaCl 0,1-2,0. M em Tris-HCl 20 mM, com 0,1 % de CHAPS (pH 7,4) utilizando um sistema de cromatografia líquida rápida de proteínas (FPLC) {Pharmacia Biotech Inc.). Recolheram-se as fracções (1 ml) em tubos siliconizados durante a eluição com o gradiente de NaCl e testaram-se quanto à sua actividade mitogénica para células 3T3.

Testaram-se as fracções eluídas da coluna quanto à sua capacidade para estimular a síntese de ADN tal como medida pela incorporação de [3H]timidina no ADN de células confluentes quiescentes Balb/c 3T3 cultivadas em 200 pL de meio Eagle modificado da Dulbecco, com 10 % de soro de vitelo em placas de 96 poços, tal com o foi descrito (Kim, 50 G. Y. , et al.f Biol. Reprod. 52, 561-571 (1995)). As curvas de dose-resposta para factores de crescimento purificados de ULF foram estabelecidas ensaiando cada dose em triplicado, com dados calculados sob a forma de média ± D. P. A significância estatística dos efeitos de 1-100 μρ/ιηΐι de heparina porcina (Sigma) sobre a actividade do factor de crescimento dói determinada pelo teste t de Student. A incorporação de [3H] timidina pelo péptido de HBGF foi comparável com a de PDGF de soro de vitelo, ou purificado, oú de bFGF, . e não com a de mitogénios mais fracos tais como o IGF ou o - EGF.· Para além disto, verificou-se que a actividade mitogénica de 3T3 e a actividade biológica dos HBGF era potenciada de forma sinergística por 10 ng/mL de IGF-I, 10 ng/mL de PDGF, 3 ng/mL de EGF, ou 0,3 ng/mL de bFGF.

Estudou-se a especificidade em relação a células alvo utilizando células Balb/c 3T3, células endoteliais capilares de bovino (BCEC), e células vasculares de músculo liso. As células 3T3 foram utilizadas tal como se descreveu acima. As BCEC foram obtidas junto do Dr. J. Folkman (Children's Hospital, Boston, MA), e foram mantidas em frascos de cultura gelatinizada em meio de Eagle modificado da Dulbecco contendo 3 ng/mL de bFGF e 10 % de soro de vitelo termicamente inactivado. As células de músculo liso foram isoladas a partir de um comprimento de 2 a 3 cm de aorta do tórax de porco utilizando procedimentos conhecidos (Weich, Η. A., et al., Growth Factors 2, 313-320 (1990)) e mantidas em meio de Eagle modificado a 10 %, da Dulbecco, - 51 com 10 % de soro fetal bovino. As células BCEC e de células de músculo liso em ensaios de síntese de ADN foram levadas a cabo em placas de 4-8 ou de 96 poços essencialmente tal como descrito (Besner, G. E., Higashíyama, S., e Kagsbrun, M. Cell Regul. 1, 811-819 (1990}). Também se levaram a cabo ensaios de síntese de ADN em células BCEC na presença de 100 μρ/ιϋΐ de heparina porcina. Verificou-se que o HGBF era mitogénico para as células de músculo liso e originava um nível de estimulação que excedia o obtido com a quantidade máxima de EGF mas era inferior ao de bFGF. Os HBGF não possuíam actividade mitogénica para células endoteliais quando eram testados por si próprios ou na presença de 100 μg de heparina (veja-se a Tabela 4). TABELA 4

Tipo de célula Tratamento

Incorporação de [1H] Timidina

Fibroblastos Balb/c Nenhum 3T3 (média + D.P.)

Cpin/poço 428 + 18 123.820 ±-7.470 4.412 ± 170 11.550 ± 101 73.853 ± 3.122

Soro de vitelo a 20 %

30 ng/mL de IGF-1 30 ng/mL de EGF 10 ng/mL de bFGF

30 ng/mL de PDGF-AB 20 μΙ/mL de HBGF-,.8 Células vasculares Nenhum de músculo liso 110.110 ± 7.077 1.14.730 ± 3.200 680 + 341 Células endoteliais Nenhum 1.343 ± 378 3.082 ± 374 1.709 ± 403 316 + 84 1 ng/mL de EGF 3 ng/mL de bFGF 15 μΙ/mL de HBGF-0,8 52

Tipo de célula Tratamento Incorporação de [3H] Timidiha (média ± D.P.) capilares' Cpin/poço 100 pg/mL de heparina 240 ± 52 3 ng/mL de bFGF 2.865 ± 276 3 ng/mL de bFGF + 100 pg/mL de heparina 1.840 ± 4 3 ng/mL de aFGF 603 ± 46 3 ng/mL de aFGF + 100 pg/mL de heparina 2.232 ± 236 20 pl/mL de HBGF-0,8 243 ± 4 20 pl/mL de HBGF-0,8 + 100 pg/mL de heparina 195 ± 12 53

53 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> CHILDREN'S HOSPITAL RESEARCH FOUNDATION <120> Polipéptidos de factor de crescimento que se liga à heparina (HBGF)

<130> E 1165 EP <140> <141> <160> 23 <170> patente na versão 2.1 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 1

Glu Slu Asn Ile Lys Lys Gly Lys Lys Xaa Ile Wff T^r 1-5 10 15 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Sus scrofa 54 <400> 2

Glu Asn Ile Lys Lys Gly Lys Lys Xaa Ile Arg Thr 1 5 10 <210> 3 <211> 41 <212> ADN <213> Sus scrofa <400> 3 gccgtctaga gcggccgcat ggaagagaac attaagaagg g 41 <210> 4 <211> 30 Λ OJ \—1 (U V ADN <213> Sus scrofa <400> 4 cctctgtacc giacttaagc gccggcgacc 30 <210> 5 <211> 14 <212> PRT. <213> Sus scrofa <400> 5 55

Glu Glu Asn Ile Lys Lys Gly Lys Lys Cys Ile Arg Thr Pro 1 5 10 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 6

Glu Glu Asn Ile Lys Lys Gly Lys Lys 1 5 <210> 7 <211> 16 .

<212> PRT <213> Sus scrofa <4°0> 7

Ile Arg Thr Pro Lys Ile Ser Lys Pro Ile Lys Phe Glu Leu Ser Gly 1 5 10 15 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 8

Thr Pro Lys Ile Ser Lys Pro Ile Lys Pile Glu Leu Ser Gly Cys Thr 1 5 10 -15

Ser 56 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 9

Thr Ser Met Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe 1 5 10 <210> 10 <211>.13 <212> PRT <213> Sus scrofa <4 00> 10

Thr Ser Met Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Vai 1 5 10 <210> 11 <211> 7 < 212 > PRT <213> Sus scrofa <400> 11

Gly Vai Cys Thr Asp Gly Arg 1 5 <210> 12 57 <211> 8 <212> PRT' <213> Sus scrofa <400> 12

Gly Vai Cys Thr Asp Gly Arg Ser 1 5 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Sus scrofa <4 00> 13

Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Vai Glu Plxe Lys 1 5 10 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 14

Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Vai Glu Phe Lys 1 5 10 <210> 15 <211> 18

<212> PRT 58 <213> Sus scrofa <4 00> 15

Phe Lys Cys Pro Asp Gly Glu Vai Met Lys Lys Asn Met Met Phe lie 1 5 10 15

Lys Thr <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 16

Pro Asp Gly Glu Vai Met Lys Lys Asm Met Met Phe Ile Lys Thr 15 10 15 <210> 17 ' <211> 7

<212> PRT <213> Sus scrofa <4 0 0 1 7

Met Phe Ile Lys Thr Cys Ala . 1 5

<210 18 <211> 11 <212> PRT 59 <213> Sus scrofa <400> 18

Met Phe Ile Lys Thr Cys Ala Ser His Tyr Asn 1 5 10 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 19

Ala Cys His Tyr Asn 1 5 <210> .20 <211> 24 <212> PRT <213> Sus scrofa < 4 0 0 > 20

His Tyr Λξπ Cys Pro Gly Asp Asn Asp Ile Pb.a Glu Ser Leu Tyr Tyr 1 5 10 15

Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala 20 <210> 21 <211> 11

<212> PRT 60 <213> Sus scrofa <400> 21

Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe Glu Ser Leu Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 22

Leu Tyr Tyr Arg Lys- Met Tyr Gly Asp Met Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 23

Glu Glu Αεη IIe Lys Lys Gly Lys Lys Cys Ile Arg Thr Pro Lys Ile 1 5 10 15

Lisboa, 4 de Agosto de 2008

Claims (20)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um polipéptido de facto de crescimento que se liga à heparina (HBGF) caracterizado por: (a) possuir a sequência de aminoácidos no terminal carboxilo. da proteína do factor de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF) , .em que a sequência do polipéptido de HGBF .referido se inicia com a sequência descrita nos SEQ ID N°: 1 ou 2. (b) se ligar a heparina e ser eluído da heparina com NaCl 0,8 M; e (c) ter uma massa molecular de cerca de 10-20 kDa, por SDS-PAGE redutor.

2. A sequência de polinucleótido que codifica para o polipéptido da reivindicação 1.

3. Um vector de expressão recombinante que contenha o polinucleótido da reivindicação 2.

4. Uma célula hospedeira que contenha o vector de expressão da.reivindicação 3.

5. A célula hospedeira da reivindicação 4, eu seja uma célula procariota. 2

6. A célula hospedeira da reivindicação 4, eu seja uma célula eucariota.

7. Um anticorpo ou um· seu fragmento, em que o anticorpo referido ou o seu fragmento se ligue especificamente a um epitopo da cadeia do polipéptido da reivindicação 1. 8. 0 anticorpo da reivindicação 7, em que o anticorpo seja policlonal. 9. 0 anticorpo da reivindicação 7, em que o anticorpo seja monoclonal.

10. Uma composição farmacêutica que inclua um polipéptido da reivindicação 1 num veiculo aceitável do ponto de vista farmacêutico. '11. A utilização de um anticorpo de qualquer uma das reivindicações 7 a 9'ou de uma molécula de sentido reverso ou de um ribozima específicos para o polinucleótido da reivindicação 2, para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar a aterosclerose ou uma patologia fibrótica, esclerótica ou de proliferação celular.

12. A utilização de um polipéptido da reivindicação 1 para a preparação de uma composição farmacêutica para levar ao contacto com uma célula para acelerar a cicatrização de feridas. 3 . 13. A utilização das reivindicações 11 ou 12, em. que a células seja seleccionada de entre o conjunto constituído por uma célula epitelial, uma célula muscular, uma célula de tecido conjuntivo e uma célula endotelial.·

14. A utilização da reivindicação 13, em que a célula de tecido conjuntivo seja seleccionada de entre o conjunto constituído por um célula astroglia, uma célula de fibroblasto, uma célula de osteoclasto,. uma célula de osteoblasto e uma célula condrócito, e/ou em que a célula muscular seja uma célula de músculo liso, uma célula de músculo cardíaco, e/ou em que a célula endotelial seja uma célula endotelial capilar, e/ou em que a célula epitelial seja uma célula segregadora,

15. A utilização de qualquer uma das reivindicações 11 a 14 incluindo também a utilização de um factor de crescimento seleccionado de entre o conjunto constituído por: um factor de crescimento semelhante à insulina (IGF-I), um factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), um factor de crescimento epidérmico (EGF), um factor de crescimento transformante beta (TGF-β) e um factor de crescimento básico de fibroblasto (bFGF), para a preparação da composição farmacêutica referida.

16. A utilização da reivindicação 15, incluindo também a utilização de. heparina para a preparação da composição farmacêutica referida. 17. ; A utilização da reivindicação 16, em que a 4 heparina esteja presente numa concentração de entre cerca de 1 pg/mL e 100 μς/mL.

18. Um método para identificar um composto que afecta a actividade mitogénica de um polipéptido da reivindicação 1, que inclua: a) incubar-se o composto com um polipéptido da reivindicação 1, ou com uma célula recombinante que expresse um polipéptido da reivindicação 1, em condições suficientes para permitir que as componentes interactuem; e b) determinar-se o efeito do composto sobre a actividade mitogénica ou a expressão do polipéptido da reivindicação 1. 19, 0 método da reivindicação 18, em que o efeito seja a inibição da actividade mitogénica ou da expressão do polipéptido da reivindicação 1 20. 0 método da reivindicação 18, em que 0 efeito seja a estimulação da actividade mitogénica ou da expressão do polipéptido da reivindicação 1

21. Um método para diagnosticar um estado associado ao polipéptido da reivindicação- 1, factor de crescimento que se liga à heparina (HBGF) , em que o método 5 inclua determinar-se o teor de HBGF numa amostra obtida de um sujeito; e comparar-se o teor de HBGF na amostra com o teor de HBGF numa amostra normal padrão. 22. 0 método da reivindicação 21, em que o estado seja seleccionado de entre o conjunto constituído por aterosclerose, uma patologia fibrótica, esclerótica, ou de proliferação celular.

23. A utilização de um agente reactivo de HBGF num veiculo aceitável do ponto de' vista farmacêutico para. se tratar um estado associado ao íiBGF, em que o estado referido seja seleccionado .de· entre o conjunto constituído por cicatrização de feridas., aterosclerose, escleroderma, artrite, cirrose hepática, osteoporose, crescimento excessivo do endométrio, gravidez, ou uma patologia proliferativa de células, em que o referido agente reactivo de HBGF seja seleccionado de entre o conjunto constituído por: (a) uma molécula de sentido reverso ou um ribozima específicos para o polinucleótido da reivindicação 2; e (b) um anticorpo que se ligue especificamente aos polipéptidos da reivindicação 1.

24. A utilização da reivindicação 23, em que o estado seja uma patologia proliferativa de células, caracterizada por um excesso do crescimento celular. 6

25. A utilização da reivindicação 24, em que o excesso de crescimento celular se deva a um excesso de células de tecido conjuntivo.

26. A utilização da reivindicação 23, na qual o estado seja uma patologia proliferativa de células caracterizada por uma deficiência no crescimento das células.

27. A utilização de um polipéptido da reivindicação 1 para a preparação de uma composição farmacêutica para promover o crescimento do endométrio ou das membranas da placenta.

28. A utilização de um anticorpo da reivindicação 7, ou de uma molécula de sentido reverso ou um ribozima específicos para o polinucleótido da reivindicação 2, para a preparação de uma composição farmacêutica para diminuir o crescimento excessivo do endométrio. Lisboa, 4 de Agosto de 2008