PL212078B1 - Modyfikowany propeptyd BMP-11, jego zastosowanie i sposób wytwarzania, kodująca go cząsteczka kwasu nukleinowego, zawierające je kompozycje farmaceutyczne oraz rekombinowana komórka - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest modyfikowany propeptyd białka morfogenezy kości-11 (BMP-11, ang. bone morphogenetic protein-11), jego zastosowanie i sposób wytwarzania, kodująca go cząsteczka kwasu nukleinowego, zawierające je kompozycje farmaceutyczne oraz rekombinowana komórka.

Rozwiązania według wynalazku są szczególnie przydatne do zapobiegania lub leczenia chorób u ludzi lub zwierząt, w których zwiększenie tkanki mięśnia szkieletowego jest terapeutycznie korzystne. Takie choroby obejmują choroby mięśniowe i neuromięśniowe (takie jak stwardnienie zanikowe boczne, dystrofia mięśniowa, atrofia mięśni, zastoinowa czopująca choroba płuc, zespół wyniszczenia mięśniowego, sarkopenia albo kacheksja), choroby albo zaburzenia metaboliczne (takie jak cukrzyca typu II, cukrzyca insulinoniezależna, hiperglikemia lub otyłość), zaburzenia tkanki tłuszczowej (takie jak otyłość) albo choroby degeneracyjne kości (takie jak osteoporoza).

Czynnik różnicowania wzrostu-8 (GDF-8), znany również jako miostatyna, jest członkiem nadrodziny transformujących czynników wzrostu beta (TGF-β, ang. Transforming Growth Factor-beta) złożonej ze strukturalnie spokrewnionych czynników wzrostu, z których każdy posiada ważne właściwości regulowania wzrostu i morfogenetyczne (Kingsley i wsp. (1994) Genes Dev. 8:133-46; Hoodless i wsp. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-72). GDF-8 to negatywny regulator masy mięśni szkieletowych i istnieje znaczne zainteresowanie identyfikacją czynników, które regulują jego aktywność biologiczną. Przykładowo, GDF-8 jest wyrażany na wysokim poziomie w rozwijającym się i dorosłym mięśniu szkieletowym. Mutacja nuli GDF-8 u myszy transgenicznych charakteryzuje się znaczącym przerostem i rozrostem mięśni szkieletowych (McPherron i wsp. (1997) Nature 387:83-90). Podobny wzrost masy mięśni szkieletowych jest widoczny w przypadku naturalnie występujących mutacji GDF-8 u bydła (Ashmore i wsp. (1974) Growth 38:501-507; Swatland i Kieffer (1994) J. Anim.

Sci. 38:752-757; McPherron i Lee (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:12457-12461 oraz Kambadur i wsp. (1997) Genome Res. 7:910-915). Ostatnie badania wykazały również, że wyniszczeniu mięśni związanemu z infekcją HIV u ludzi towarzyszy wzrost ekspresji białka GDF-8 (Gonzalez-Cadavid i wsp. (1998) PNAS 95:14938-43). Dodatkowo, GDF-8 może modulować wytwarzanie enzymów specyficznych wobec mięśni (np. kinazy kreatynowej) i moduluje proliferację komórek mioblastycznych (WO 00/43781).

Poza właściwościami regulowania wzrostu i morfogenetycznymi w mięśniach szkieletowych, GDF-8 może również uczestniczyć w wielu innych procesach fizjologicznych (np. homeostazie glukozowej), jak również stanach nieprawidłowych, takich jak rozwój cukrzycy typu II oraz zaburzeniach tkanki tłuszczowej, takich jak otyłość. Przykładowo, GDF-8 moduluje różnicowanie prekursorowych komórek tłuszczowych w komórki tłuszczowe (Kim i wsp. (2001) B.B.R.C. 281:902-906).

Podobnie jak TGF-β-Ι, -2 i -3, białko GDF-8 jest syntetyzowane jako białko prekursorowe składające się z amino-końcowego propeptydu i karboksy-końcowej domeny dojrzałej (McPherron i Lee, 1997, jak wyżej), jak również sekwencji sygnałowej, która kieruje białko do domeny zewnątrzkomórkowej i jest również odcinana od białka. Uważa się, że przed odcięciem propeptydu, prekursorowe białko GDF-8 tworzy homodimer. Amino-końcowy propeptyd jest następnie odcinany od dojrzałej domeny i odcięty propeptyd może pozostawać związany niekowalencyjnie z dimerem dojrzałej domeny, hamując jej aktywność biologiczną (Miyazono i wsp. (1988) J. Biol. Chem. 263:6407-6415; Wakefield i wsp. (1988) J. Biol. Chem. 263:7646-7654 oraz Brown i wsp. (1990) Growth Factors 3:35-43). Uważa się, że dwa propeptydy GDF-8 wiążą się z dojrzałym dimerem GDF-8 (Thies i wsp. (2001) Growth Factors 18:251-259). Na skutek tej właściwości inaktywacyjnej, propeptyd jest znany jako „peptyd związany z latencją” (LAP, ang. latency-associated peptid), a kompleks dojrzałej domeny i propeptydu jest powszechnie określany jako „mały kompleks w stanie latencji” (Gentry and Nash (1990) Biochemistry 29:6851-6857; Derynck i wsp. (1995) Nature 316:701-705 oraz Massague (1990) Ann. Rev. Cell. Biol. 12:597-641). Uważa się, że dojrzała domena jest aktywna jako homodimer po usunięciu propeptydu. Znane są również inne białka, które wiążą się z GDF-8 albo spokrewnionymi strukturalnie białkami i hamują ich aktywność biologiczną. Takie hamujące białka obejmują folistatynę (Gamer i wsp. (1999) Dev. Biol. 208:222-232) i białka spokrewnione z folistatyną.

Białko morfogenezy kości-11 (BMP-11, znane również jako GDF-11) stanowi inne białko transformujących czynników wzrostu beta (TGF-13), które jest spokrewnione strukturalnie z GDF-8. Różne cząsteczki BMP-11 zostały opisane w McPherron i wsp. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:12457-12461.

Ponadto, wielu chorobom ludzkim i zwierzęcym towarzyszy utrata albo funkcjonalne uszkodzenie tkanki mięśniowej, włączając w to dystrofię mięśniową, atrofię mięśni, zastoinową czopującą chorobę

PL 212 078 B1 płuc, zespół wyniszczenia mięśniowego, sarkopenię i kacheksję. Jak dotąd istnieje bardzo niewiele wiarygodnych i skutecznych terapii dla tych schorzeń. Straszliwe objawy związane z tymi chorobami można znacząco zmniejszyć poprzez zastosowanie terapii, które zwiększają ilość tkanki mięśniowej u pacjentów cierpiących na te choroby. Takie terapie znacząco poprawiłyby jakość życia tych pacjentów i mogłyby złagodzić wiele efektów tych chorób. A zatem, istnieje potrzeba zidentyfikowania nowych terapii, które przyczyniłyby się do ogólnego zwiększenia tkanki mięśniowej u pacjentów cierpiących na te choroby.

Niniejszy wynalazek zaspakaja tę potrzebę poprzez dostarczenie zmodyfikowanych i stabilizowanych propeptydów BMP-11, które zachowują swoją aktywność biologiczną i hamują aktywność białek GDF. Zmodyfikowane propeptydy według wynalazku można zastosować do leczenia chorób ludzkich lub zwierzęcych, w których zwiększenie tkanki mięśnia szkieletowego byłoby terapeutycznie korzystne.

GDF-8 uczestniczy w regulacji wielu krytycznych procesów biologicznych. Na skutek jego kluczowej roli w tych procesach, GDF-8 może być pożądanym celem dla interwencji terapeutycznej. Jakkolwiek naturalnie występujący propeptyd GDF-8 może być atrakcyjnym środkiem do modulacji GDF z perspektywy skuteczności i toksyczności, twórcy stwierdzili, że okres póltrwania w obiegu naturalnego propeptydu może być zbyt krótki, aby cząsteczka mogła mieć zastosowanie terapeutyczne lub profilaktyczne.

A zatem, niniejszy wynalazek opiera się, co najmniej po części, na ujawnieniu, że propeptyd czynnika różnicowania wzrostu-8 (GDF-8) hamuje aktywność białka GDF-8 i że inne białka transformujących czynników wzrostu beta (TGF-β), które są spokrewnione strukturalnie z GDF-8, takie jak białko morfogenezy kości-11 (BMP-11) są również hamowane przez propeptyd GDF-8. Niniejszy wynalazek dostarcza zatem kompozycji i sposobów hamowania białek GDF, jak również sposobów identyfikowania, wytwarzania i stosowania takich inhibitorów.

Jak zaznaczono powyżej, niniejszy wynalazek jest również oparty, po części, na ujawnieniu, że naturalny propeptyd GDF-8 ma stosunkowo krótki okres półtrwania in vivo, co może przeszkadzać w jego praktycznym zastosowaniu terapeutycznym lub profilaktycznym. A zatem niniejszy wynalazek dostarcza zmodyfikowane propeptydy BMP-11 o lepszych właściwościach farmakokinetycznych, takich jak zwiększony okres półtrwania w krwioobiegu albo zwiększona ochrona przed degradacją proteolityczną.

Ujawnione tu propeptydy BMP-11 mogą być stabilizowane dowolnymi sposobami znanymi w dziedzinie. Przykładowo, zmodyfikowanym propeptydem według wynalazku jest białko fuzyjne zawierające propeptyd BMP-11 i region Fc cząsteczki IgG. Białka fuzyjne propeptydydu BMP-11 mogą zawierać, jako podjednostkę aktywną, propeptyd białka BMP-11 albo aktywną część propeptydydu BMP-11, połączoną z regionem Fc cząsteczki IgG. W innych wykonaniach albo dodatkowo, propeptyd BMP-11 może być glikozylowany albo połączony z albuminą lub niebiałkowym polimerem.

Zmodyfikowane propeptydy BMP-11 według wynalazku mają zdolność do hamowania aktywności, ekspresji, obróbki albo wydzielania białka GDF-8, dojrzałego GDF-8 albo homodimeru GDF-8 lub innej aktywnej cząsteczki GDF-8. Zmodyfikowane propeptydy BMP-11 według wynalazku mogą być podawane pacjentowi w skutecznej terapeutycznie dawce w celu leczenia albo zapobiegania stanom medycznym, w których zwiększenie tkanki mięśnia szkieletowego byłoby terapeutycznie korzystne. Choroby i zaburzenia, które mogą być leczone przy użyciu zmodyfikowanych propeptydów BMP-11 według wynalazku obejmują między innymi choroby mięśniowe i neuromięśniowe (takie jak stwardnienie zanikowe boczne, dystrofia mięśniowa, atrofia mięśni, zastoinowa czopująca choroba płuc, zespół wyniszczenia mięśniowego, sarkopenia albo kacheksja), choroby albo zaburzenia metaboliczne (takie jak cukrzyca typu II, cukrzyca insulinoniezależna, hiperglikemia lub otyłość), zaburzenia tkanki tłuszczowej (takie jak otyłość) albo choroby degeneracyjne kości (takie jak osteoporoza).

W szczególności przedmiotem wynalazku jest modyfikowany propeptyd BMP-11 obejmujący sekwencję aminokwasową, która zawiera mutację modyfikującą sekwencję aminokwasową w reszcie odpowiadającej pozycji 98 SEK NR ID: 11, przy czym modyfikowany propeptyd BMP-11 ma zwiększony okres półtrwania in vivo lub in vitro w stosunku do odpowiadającego mu niezmodyfikowanego propeptydu BMP-11. Korzystnie sekwencja aminokwasową jest (a) sekwencją aminokwasową, która jest w co najmniej 75% identyczna z SEK NR ID: 11 lub (b) funkcjonalnym fragmentem (a). Korzystniej, sekwencja aminokwasową modyfikowanego propeptydu BMP-11 jest w co najmniej 75%, 80%, 85%, 90%, 95% lub 98% identyczna z SEK NR ID.l 1.

PL 212 078 B1

Modyfikowany propeptyd BMP-11 według wynalazku korzystnie obejmuje sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 11 lub jej funkcjonalny fragment, z tym że zawiera mutację w reszcie odpowiadającej pozycji 98 SEK NR ID: 11. Korzystniej mutacją w sekwencji aminokwasowej modyfikowanego propeptydu BMP-11 według wynalazku w reszcie odpowiadającej pozycji 98 SEK NR ID: 11 jest delecja lub substytucja. Najkorzystniej resztą odpowiadającą reszcie w pozycji 98 SEK NR ID: 11 jest alanina.

Miejsce cięcia modyfikowanego propeptydu BMP-11 według wynalazku proteolitycznego jest korzystnie inaktywowane przez mutację w tym miejscu.

Według wynalazku modyfikowany propeptyd BMP-11 może ponadto zawierać modyfikację stabilizującą. W jednej postaci wykonania modyfikacja stabilizująca obejmuje fuzję regionu Fc cząsteczki IgG do propeptydu. Korzystnie propeptyd jest połączony z regionem Fc cząsteczki IgG poprzez peptyd łącznikowy (ang. linker). Także korzystnie cząsteczką IgG jest IgG1 lub IgG4 lub ich pochodne. Korzystniej cząsteczką IgG jest IgG1. Bardziej korzystnie sekwencja aminokwasową cząsteczki IgG jest w co najmniej 75% identyczna z SEK NR ID: 15 lub SEK NR ID: 16. Najkorzystniej, sekwencją aminokwasową cząsteczki IgG jest SEK NR ID: 15 lub SEK NR ID: 16.

W dalszej postaci wykonania stabilizująca modyfikacja modyfikowanego propeptydu BMP-11 obejmuje zmienione miejsce glikozylacji, co najmniej jedną resztę węglowodanową, albuminę, pochodną albuminy, lub niebiałkopodobny polimer.

Korzystnie modyfikowany propeptyd BMP-11 według wynalazku zawiera ponadto umożliwiający oczyszczanie znacznik.

Przedmiotem wynalazku jest również cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca modyfikowany propeptyd BMP-11 według wynalazku.

W jednej postaci wykonania cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca propeptyd BMP-11 obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego, która jest w co najmniej 95% identyczna do SEK NR ID: 12 i koduje propeptyd, który jest modyfikowany w reszcie asparaginianowej odpowiadającej asparaginianowi 98 SEK NR ID: 11, przy czym kodowany propeptyd hamuje co najmniej jedną biologiczną aktywność BMP-11 lub GDF-8.

W innej postaci wykonania cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca propeptyd BMP-11 obejmująca sekwencję kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w ostrych warunkach hybrydyzacji do sekwencji komplementarnej wobec SEK NR ID: 12 i koduje propeptyd z mutacją modyfikującą resztę asparaginianową odpowiadającą asparaginianowi 98 SEK NR ID: 11, przy czym kodowany propeptyd hamuje co najmniej jedną biologiczną aktywność BMP-11.

Innym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca modyfikowany propeptyd BMP-11 i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.

Jeszcze innym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik albo wektor.

Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania modyfikowanego propeptydu BMP-11 według wynalazku obejmującego:

(a) wytwarzanie cząsteczki cDNA kodującej propeptyd według wynalazku, w której miejsce cięcia proteolitycznego jest zmodyfikowane;

(b) wytwarzanie cząsteczki cDNA kodującej region Fc cząsteczki IgG; oraz (c) połączenie cząsteczek cDNA z etapów (a) i (b) z wytworzeniem zmodyfikowanego BMP-11 lub propeptydu BMP-11.

Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje ponadto wytworzenie dwuniciowego oligonukleotydu kodującego peptyd łącznikowy i przyłączenie cząsteczek cDNA z etapów (a) i (b) do któregoś z końców dwuniciowego oligonukleotydu kodującego peptyd łącznikowy. Korzystniej, peptyd łącznikowy zawiera sekwencję aminokwasową składającą się z GSGS.

Przedmiotem wynalazku jest również rekombinowana komórka zawierająca kwas nukleinowy kodujący modyfikowany propeptyd BMP-11 według wynalazku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest modyfikowany propeptyd BMP-11 według wynalazku do zastosowania jako lek. Niniejszy wynalazek dotyczy w szczególności zastosowania modyfikowanego propeptydu BMP-11 według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia jednego lub większej liczby stanów chorobowych wybranych spośród choroby mięśniowej, choroby neuromięśniowej, choroby metabolicznej albo choroby degeneracyjnej kości, stwardnienia zanikowego bocznego, dystrofii mięśniowej, atrofii mięśni, zastoinowej czopującej choroby płuc, zespołu wyniszczenia mięśniowego, sarkopenii, kacheksji i osteoporozy.

PL 212 078 B1

Krótki opis figur

Fig. 1 przedstawia względne aktywności biologiczne GDF-8, BMP-11 i aktywiny teście genu reporterowego.

Fig. 2 przedstawia właściwości wiązania oczyszczonego biotynylowanego ludzkiego GDF-8 w teście wiązania ActRIIB.

Fig. 3 przedstawia indukcję wskaźnikowej aktywności pGL3(CAGA)12 przy ED50 dla GDF-8, BMP-11 i aktywiny w obecności propeptydu GDF-8.

Fig. 4 przedstawia zależne od dawki hamowanie przez propeptyd GDF-8 wiązania się biotynylowanego GDF-8 z ActRIIB.

Fig. 5 przedstawia wiązanie się GDF-8 do komórek L6.

Fig. 6 przedstawia zależne od dawki hamowanie przez propeptyd GDF-8 specyficznego dla GDF-8 wiązania się z komórkami L6.

Fig. 7A przedstawia sekwencję aminokwasową fuzji białkowej mysi propeptyd GDF-8-Fc.

Fig. 7B przedstawia fuzję białkową mysi propeptyd GDF-8-Fc z krótkim łącznikiem glicynaseryna-glicyna-seryna (GSGS) oddzielającym propeptyd GDF od regionu Fc.

Fig. 8A przedstawia efekt ludzkiego propeptydu GDF i dwóch fuzji białkowych mysi propeptyd GDF-8-Fc na wiązanie się GDF-8 z ActRIIB w kompetycyjnym teście ELISA.

Fig. 8B przedstawia tabelę porównującą IC50 dla ludzkiego propeptydu GDF i dwóch fuzji białkowych mysi propeptyd GDF-8-Fc.

Fig. 9 przedstawia względne aktywności biologiczne ludzkiego propeptydu GDF i dwóch fuzji białkowych mysi propeptyd GDF-8-Fc w teście genu reporterowego.

Fig. 10 przedstawia farmakokinetykę jodowanego propeptydu GDF-8 i fuzji białkowej mysi propeptyd GDF-8-Fc po pojedynczym dożylnym podaniu 0,2 μg/mysz albo 2 μg/mysz, odpowiednio.

Fig. 11A przedstawia sekwencję aminokwasową fuzji białkowej ludzki propeptyd GDF-8-Fc IgG1.

Fig. 11B przedstawia sekwencję aminokwasową fuzji białkowej ludzki propeptyd GDF-8-Fc IgG1 zmodyfikowanej w celu zmniejszenia funkcji efektorowej.

Fig. 12 przedstawia zależne od dawki hamowanie wiązania się GDF-8 z ActRIIB w kompetycyjnym teście ELISA przez ludzki propeptyd GDF-8 i dwie fuzje białkowe ludzki propeptyd GDF-8-Fc.

Fig. 13 to wykres przedstawiający, że zmodyfikowany propeptyd GDF-8 podawany in vivo zwiększa masę mięśnia brzuchatego łydki i czworogłowego i zmniejsza masę tłuszczową, ale nie ma wpływu na masę nerki albo wątroby w porównaniu do myszy nie traktowanych albo myszy traktowanych białkiem kontrolnym, IgG2aFc.

Fig. 14A-P przedstawiają sekwencje aminokwasowe i sekwencje nukleotydowe odpowiadające SEK NR ID 1-16 i dotyczące ich adnotacje.

Definicje

Terminy „GDF-8”, „białko GDF-8” albo „polipeptyd GDF-8” dotyczą specyficznego czynnika różnicowania wzrostu, włączając w to między innymi ten przedstawiony w SEK NR ID: l i dowolne znane obecnie lub opisane później homologi, włączając w to homologi z innych gatunków. Szczególnie korzystne są homologi ssacze, najkorzystniej ludzkie. Cząsteczki GDF-8 i homologi mogą być otrzymywane ze wszystkich innych źródeł, włączając w to między innymi GDF-8 z wołu, psa, kota, kury, myszy, szczura, świni, indyka, pawiana i ryby. Różne cząsteczki GDF-8 zostały opisane w McPherron i wsp. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:12457-12461. Homologi są dobrze znane w dziedzinie. Homologię można ustalić dowolną metodą znaną w dziedzinie, jak tu opisano. GDF-8 lub białko GDF-8 może być występującym naturalnie albo syntetycznym. Terminy obejmują nie poddaną obróbce prekursorową postać białka („białko prekursorowe GDF-8”), jak również postaci dojrzałe będące wynikiem potranslacyjnego cięcia propeptydu. Termin dotyczy również dowolnych fragmentów albo wariantów GDF-8, które zachowują jedną albo więcej aktywności biologicznych związanych z białkiem GDF-8, jak tu opisano, włączając w to sekwencje, które zostały zmodyfikowane przez konserwatywne albo niekonserwatywne zmiany w sekwencji aminokwasowej.

„Dojrzały GDF-8” dotyczy części białka albo polipeptydu, która jest odcinana od karboksykońcowej domeny białka prekursorowego GDF-8. Ludzka postać dojrzałego białka GDF-8 jest przedstawiona w SEK NR ID: 3. Dojrzały GDF-8 może być występującym naturalnie albo syntetycznym. Dojrzały GDF-8 może być obecny jako monomer, homodimer albo może być obecny w kompleksie GDF-8 w stanie latencji. W zależności od warunków in vivo albo in vitro dojrzały GDF-8 może być w równowadze z dowolnym albo wszystkimi tymi różnymi postaciami. Bez ograniczania się do mechanizmu, uważa

PL 212 078 B1 się, że GDF-8 jest aktywny biologicznie jako homodimer. W swojej postaci aktywnej, dojrzały GDF-8 jest określany również jako „aktywny GDF-8”.

Określenie „aktywność GDF-8” dotyczy jednej albo więcej fizjologicznych aktywności regulowania wzrostu albo morfogenetycznych związanych z aktywnym białkiem GDF-8. Przykładowo, aktywny GDF-8 jest negatywnym regulatorem masy mięśni szkieletowych. Aktywny GDF-8 może również modulować wytwarzanie enzymów specyficznych dla mięśni (np. kinazy kreatynowej), stymulować proliferację komórkową mioblastów i modulować różnicowanie prekursorów komórek tłuszczowych do komórek tłuszczowych. Uważa się również, że GDF-8 zwiększa wrażliwość na pobieranie insuliny w tkankach obwodowych, a w szczególności w mięśniu szkieletowym lub komórkach tłuszczowych. A zatem aktywności biologiczne GDF-8 obejmują miedzy innymi hamowanie tworzenia się mięśnia, hamowanie wzrostu komórki mięśniowej, hamowanie rozwoju mięśnia, zmniejszenie masy mięśniowej, regulację enzymów specyficznych dla mięśni, hamowanie proliferacji, regulację komórkową mioblastów, modulowanie różnicowania się prekursorów komórek tłuszczowych do komórek tłuszczowych, zwiększenie wrażliwości na insulinę, regulowanie pobierania glukozy, hemostazy glukozowej oraz modulowanie rozwoju i podtrzymywania komórek neuronowych. Ludzka postać białka prekursorowego GDF-8 pełnej długości jest przedstawiona w SEK NR ID: 1.

„Propeptyd GDF-8” dotyczy polipeptydu, który jest odcinany od amino-końcowej domeny białka prekursorowego GDF-8. Propeptyd GDF-8 jest związany z jedną albo większą liczbą aktywności biologicznych, włączając w to między innymi zdolność do wiązania się z dojrzałym białkiem GDF-8 albo homodimerem, zdolność do hamowania jednej albo większej liczby aktywności biologicznych GDF-8, zdolność do zwiększania rozwoju mięśnia, zdolność do zwiększania masy mięśniowej, zdolność do promowania tworzenia się mięśnia i zdolność do promowania proliferacji komórek mięśniowych. Propeptyd GDF-8 może być występującym naturalnie albo syntetycznym. Przykład propeptydu GDF-8 obejmuje między innymi ludzką postać propeptydu GDF-8 przedstawioną w SEK NR ID: 5. Propeptyd GDF-8 wykazuje zdolność do wiązania się z domeną wiążącą propeptyd dojrzałego GDF-8 i hamowania jednej albo większej liczby aktywności dojrzałego GDF-8.

Termin „inhibitor GDF-8” obejmuje dowolny czynnik zdolny do hamowania aktywności, ekspresji, obróbki albo sekrecji białka GDF-8, dojrzałego GDF-8 albo homodimeru GDF-8 lub innej aktywnej cząsteczki GDF-8, włączając w to między innymi zmodyfikowane propeptydy GDF-8 i zmodyfikowane propeptydy BMP-11. Inhibitor GDF-8 obejmuje również dowolny czynnik zdolny do zwiększania wiązania się propeptydu GDF-8 do dojrzałej cząsteczki GDF-8 albo do homodimeru GDF-8. Takie inhibitory obejmują między innymi białka, przeciwciała, peptydy, peptydomimetyki, rybozymy, oligonukleotydy antysensowne, dwuniciowe RNA i inne małe cząsteczki. Aktywność białka GDF-8 jest hamowana przez zmodyfikowany propeptyd GDF-8 jak opisano w przykładach 3-6. Aktywność białka GDF-8 jest także hamowana przez zmodyfikowany propeptyd BMP-11 według wynalazku.

„Kompleks GDF-8 w stanie latencji” dotyczy kompleksu białek utworzonego pomiędzy dojrzałym homodimerem GDF-8 a propeptydem GDF-8. Bez ograniczania się do mechanizmu, uważa się że dwa propeptydy GDF-8 łączą się z dwiema cząsteczkami dojrzałego GDF-8 w homodimerze z wytworzeniem nieaktywnego kompleksu tetrametycznego albo w stanie latencji. Kompleks w stanie latencji może zawierać inne inhibitory GDF w miejsce albo dodatkowo poza jednym albo większą liczbą propeptydów GDF-8.

Termin „zmodyfikowany propeptyd GDF-8” dotyczy inhibitora GDF-8, który obejmuje zmodyfikowany propeptyd GDF-8, jego fragment albo wariant, który zachowuje jedną albo więcej aktywności biologicznych propeptydu GDF-8, a ponadto zawiera stabilizującą modyfikację, jak tu przedstawiono. Wariantowe postaci propeptydu GDF-8 obejmują miedzy innymi, na przykład propeptydy GDF-8, które zostały tak zmodyfikowane, że zawierają mutację (włączając w to insercie, delecję i podstawienie aminokwasów) w peptydzie sygnałowym albo miejscach cięcia proteolicznego propeptydu, dla uczynienia tych miejsc mniej podatnymi na ciecie proteolityczne. Zmodyfikowany propeptyd GDF-8 może mieć zasadniczo zwiększony okres półtrwania w stosunku do niezmodyfikowanego propeptydu GDF-8. Zmodyfikowany propeptyd GDF-8 może mieć zwiększony okres półtrwania in vivo (mierzony na przykład metodą przedstawioną w przykładzie 8). Ponadto zmodyfikowany propeptyd GDF-8 ma zdolność do hamowania jednej albo większej liczby aktywności dojrzałego GDF-8.

Terminy „BMP-11”, „białko BMP-11” albo „polipeptyd BMP-11” dotyczą specyficznego czynnika różnicowania wzrostu, włączając w to miedzy innymi ten przedstawiony w SEK NR ID: 7 i dowolne znane obecnie lub opisane później homologi, włączając w to homologi z innych gatunków. Szczególnie korzystne są homologi ssacze, najkorzystniej ludzkie. Cząsteczki BMP-11 i homologi mogą być otrzymywane ze

PL 212 078 B1 wszystkich innych źródeł, włączając w to między innymi BMP-11 z wołu, psa, kota, kury, myszy, szczura, świni, indyka, pawiana i ryby. Różne cząsteczki BMP-11 zostały opisane w McPherron i wsp. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:12457-12461. Homologi są dobrze znane w dziedzinie. Homologię można ustalić dowolną metodą znaną w dziedzinie, jak tu opisano. BMP-11 lub białko BMP-11 może być występującym naturalnie albo syntetycznym. Terminy obejmują nie poddaną obróbce prekursorawą postać białka („białko prekursorowe BMP-11”) jak również postaci dojrzałe będące wynikiem potranslacyjnego cięcia propeptydu. Termin dotyczy również dowolnych fragmentów albo wariantów BMP-11, które zachowują jedną albo więcej aktywności biologicznych związanych z białkiem BMP-11, jak tu opisano, włączając w to sekwencje, które zostały zmodyfikowane przez konserwatywne albo niekonserwatywne zmiany w sekwencji aminokwasowej.

„Dojrzały BMP-11” dotyczy części białka albo polipeptydu, która jest odcinana od karboksykońcowej domeny białka prekursorowego BMP-11. Ludzka postać dojrzałego białka BMP-11 jest przedstawiona w SEK NR ID: 9. Dojrzały BMP-11 może być występującym naturalnie albo syntetycznym. Dojrzały BMP-11 może być obecny jako monomer, homodimer albo może być obecny w kompleksie BMP-11 w stanie latencji. W zależności od warunków in vivo albo in vitro dojrzały BMP-11 może być w równowadze z dowolnym albo wszystkimi tymi różnymi postaciami. Bez ograniczania się do mechanizmu, uważa się, że BMP-11 jest aktywny biologicznie jako homodimer. W swojej postaci aktywnej, dojrzały BMP-11 jest określany również jako „aktywny BMP-11”.

„Propeptyd BMP-11” dotyczy polipeptydu, który jest odcinany od amino-końcowęj domeny białka prekursorowego BMP-11. Propeptyd BMP-11 jest związany z jedną albo większą liczbą aktywności biologicznych, włączając w to między innymi zdolność do wiązania się z dojrzałym białkiem GDF-8 albo homodimerem, zdolność do hamowania jednej albo większej liczby aktywności biologicznych GDF-8, zdolność do zwiększania rozwoju mięśnia, zdolność do zwiększania masy mięśniowej, zdolność do promowania tworzenia się mięśnia i zdolność do promowania proliferacji komórek mięśniowych. Propeptyd BMP-11 może być występującym naturalnie albo syntetycznym. Przykład propeptydu BMP-11 obejmuje między innymi ludzką postać propeptydu BMP-11 przedstawioną w SEK NR ID: 11. Propeptyd BMP-11 ma zdolność do wiązania się z domeną wiążącą propeptyd dojrzałego GDF-8. Propeptyd BMP-11 ma zdolność do hamowania jednej albo większej liczby aktywności dojrzałego GDF-8.

Termin „zmodyfikowany propeptyd BMP-11” dotyczy inhibitora GDF-8, który zawiera zmodyfikowany propeptyd BMP-11, jego fragment albo wariant, który zachowuje jedną albo więcej aktywności biologicznych propeptydu BMP-11, a ponadto zawiera stabilizująca modyfikację, jak tu przedstawiono. Wariantowe postaci propeptydu BMP-11 obejmują miedzy innymi, na przykład, propeptydy BMP-11, które zostały tak zmodyfikowane że zawierają mutację (włączając insercie, delecję i podstawienie aminokwasów) w peptydzie sygnałowym albo miejscach cięcia proteolicznego propeptydu, w celu uczynienia tych miejsc mniej podatnymi na ciecie proteolityczne. W korzystnym wykonaniu, zmodyfikowany propeptyd BMP-11 ma zasadniczo zwiększony okres półtrwania w stosunku do niezmodyfikowanego propeptydu BMP-11. W wysoce korzystnym wykonaniu zmodyfikowany propeptyd BMP-11 według wynalazku ma zwiększony okres półtrwania in vivo (mierzony w przykładzie 8) w stosunku do odpowiadającego mu niezmodyfikowanego propeptydu BMP-11. W innym wykonaniu, zmodyfikowany propeptyd BMP-11 ma zdolność do hamowania jednej albo większej liczby aktywności dojrzałego GDF-8.

Ujawnione niniejszym_pro peptydy GDF-8 i_pro peptydy BMP-11 według wynalazku są określane razem jako „propeptydy GDF”.

Białka GDF-8 ujawnione niniejszym i białka BMP-11 według wynalazku są określane razem jako „polipeptydy GDF” albo „białka GDF”.

Sposoby i kompozycje według wynalazku dostarczają inhibitorów GDF, które zmniejszają aktywność białka GDF w stosunku do aktywności GDF porównując to samo białko GDF niezwiązane przez inhibitor. W pewnych wykonaniach, aktywność białka GDF po związaniu z jednym albo większą liczbą zmodyfikowanych propeptydów GDF jest zmniejszona o co najmniej około 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, lub 55%, a korzystniej co najmniej około 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86% lub 88%, jeszcze korzystniej co najmniej około 90%, 91%, 92%, 93% lub 94%, a nawet jeszcze korzystniej co najmniej około 95% do 100%, w odniesieniu do tego samego białka GDF, które nie jest związane przez te zmodyfikowane propeptydy. Inhibitorem GDF jest ujawniony niniejszym zmodyfikowany propeptyd GDF-8 lub zmodyfikowany propeptyd BMP-11 według wynalazku połączony kowalencyjnie z regionem Fc cząsteczki IgG.

Termin „modyfikacja stabilizująca” to dowolna modyfikacja znana w dziedzinie albo tu przedstawiona zdolna do stabilizowania białka, zwiększania czasu półtrwania białka in vitro, zwiększania

PL 212 078 B1 czasu półtrwania białka w układzie krążenia i/lub zmniejszenia proteolitycznej degradacji białka. Takie stabilizujące modyfikacje obejmują między innymi, ale nie ograniczają się do białek fuzyjnych (włączając w to, na przykład białko fuzyjne zawierające propeptyd GDF i drugie białko), modyfikacji miejsca glikozylacji (włączając w to, na przykład dodawanie miejsca glikozylacji do propeptydu GDF) i modyfikacji reszty węglowodanowej (włączając w to, na przykład usunięcie reszty węglowodanowej z propeptydu GDF). W przypadku modyfikacji stabilizującej, która obejmuje białko fuzyjne (np. taką, że z propeptydem GDF połączone jest drugie białko), drugie białko może być określane jako „część stabilizująca” albo „białko stabilizujące”. Stosowany tu termin „część stabilizująca” poza tym, że odnosi się do drugiego białka fuzyjnego, obejmuje również niebiałkowe modyfikacje, takie jak reszta węglowodanowa albo niebiałkowy polimer.

Terminy „wyizolowany” lub „oczyszczony” dotyczą cząsteczki, która jest zasadniczo wolna od swojego naturalnego środowiska. Przykładowo, wyizolowane białko jest zasadniczo wolne od materiału komórkowego lub innych zanieczyszczających białek ze źródła komórkowego albo tkankowego, z którego pochodzi. Określenie „zasadniczo wolne od materiału komórkowego” dotyczy preparatów, gdzie izolowane białko jest w co najmniej 70% do 80% (wag./wag.) czyste, korzystniej w co najmniej 80%-89% (wag./wag.) czyste, jeszcze korzystniej w co najmniej 90%-95% (wag./wag.) czyste, a najkorzystniej w co najmniej 96%, 97%, 98%, 99% lub 100% (wag./wag.) czyste.

Termin „miejsce cięcia” dotyczy miejsca proteolitycznego w białku albo polipeptydzie, na które działa enzym proteolityczny, którego wynikiem jest przecięcie wiązania peptydowego. W jednym z wykonań, miejsce cięcia według wynalazku to „RSRR” przedstawione przy użyciu jednoliterowego kodu aminokwasowego.

Termin „region Fc cząsteczki IgG” dotyczy domeny Fc immunoglobuliny o izotypie IgG, i jest dobrze znany specjalistom w dziedzinie. Region Fc cząsteczki IgG to część cząsteczki IgG (IgG1, IgG2, IgG3 i IgG), która jest odpowiedzialna za zwiększanie okresu półtrwania cząsteczki IgG in vivo w surowicy. Korzystnie, cząsteczką IgG jest IgG1.

„Okres półtrwania in vitro” dotyczy stabilności białka mierzonej poza kontekstem żywego organizmu. Testy do mierzenia okresu półtrwania in vitro są dobrze znane w dziedzinie i obejmują miedzy innymi SDS-PAGE, ELISA, testy komórkowe, puls-śledzenie (ang. plus-chase), technikę Western, technikę Northern, itd. Te i inne przydatne testy są dobrze znane w dziedzinie.

„Okres półtrwania in vivo” dotyczy stabilności białka w organizmie. Okres półtrwania in vivo można mierzyć przy zastosowaniu wielu metod znanych w dziedzinie obejmujących między innymi pomiar okresu półtrwania in vivo w surowicy, okresu półtrwania w obiegu oraz testy przedstawionych tu w przykładach.

„Okres półtrwania in vivo w surowicy” dotyczy okresu półtrwania białka krążącego we krwi organizmu. W jednym z wykonań okres półtrwania in vivo mierzy się jak przedstawiono w przykładzie 8. Do mierzenia okresu półtrwania in vivo można zastosować inne metody znane w dziedzinie.

Termin „ssak” obejmuje definicje znane w dziedzinie, a także dotyczy dowolnego zwierzęcia zaklasyfikowanego jako ssak, włączając w to ludzi, zwierzęta udomowione i hodowlane oraz zwierzęta w zoo, sportowe lub domowe, takie jak psy, koty, owce, świnie, krowy itd. W korzystnym wykonaniu ssakiem jest człowiek.

Termin „nadrodzina TGF-β, dotyczy rodziny strukturalnie spokrewnionych czynników wzrostu, z których każdy posiada ważne fizjologicznie właściwości regulowania wzrostu i właściwości morfogenetyczne. Ta rodzina strukturalnie spokrewnionych czynników wzrostu jest dobrze znana w dziedzinie (Kingsley i wsp. (1994) Genes Dev. 8:133-46 oraz Hoodless i wsp. (1998) Curr. Topics Microbiol.

Immunol. 228:235-72). Nadrodzina TGF-β, obejmuje białka morfogenezy kości (BMP), aktywiny, inhibiny, substancję hamującą przewody Mullera (ang. Mullerian Inhibiting Substance), czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego oraz ciągle rosnącą liczbę czynników wzrostu i różnicowania (GDF), takich jak GDF-8 (miostatyna). Wiele z tych białek jest spokrewnionych z GDF-8 pod względem struktury, tak jak BMP-11 (znany również jako GDF-11) i/lub aktywności, tak jak aktywina.

Termin „leczenie” dotyczy zarówno traktowania terapeutycznego jak i postępowania profilaktycznego i zapobiegawczego. Wymagający leczenia mogą obejmować osobniki już mające konkretne zaburzenie medyczne, jak również te, które mogą ostatecznie zostać dotknięte chorobą (tj. te wymagające postępowania zapobiegawczego).

Terminy „transformacja” i „transfekcja” dotyczą rozmaitych znanych w dziedzinie technik do wprowadzania obcego kwasu nukleinowego (np. DNA i RNA) do komórki gospodarza, włączając w to

PL 212 078 B1 miedzy innymi współwytrącanie fosforanem wapniowym lub chlorkiem wapniowym, transfekcję za pośrednictwem DEAE-dekstran, lipofekcję i elektroporację.

SEK NR ID:	Nazwa	Typ
1	ludzkie białko prekursorowe GDF-8	białko
2	ludzkie białko prekursorowe GDF-8	DNA
3	ludzki dojrzały GDF-8	białko
4	ludzki dojrzały GDF-8	DNA
5	ludzki propeptyd GDF-8	białko
6	ludzki propeptyd GDF-8	DNA
7	ludzkie białko prekursorowe BMP-11	białko
8	ludzkie białko prekursorowe BMP-11	DNA
9	ludzki dojrzały BMP-11	białko
10	ludzki dojrzały BMP-11	DNA
11	ludzki propeptyd BMP-11	białko
12	ludzki propeptyd BMP-11	DNA
13	sekwencja sygnałowa GDF-8	białko
14	sekwencja sygnałowa BMP-11	białko
15	IgG-Fc	białko
16	zmodyfikowana IgG-Fc	białko

Szczegółowy opis wynalazku

Niniejszy wynalazek opiera się, co najmniej po części, na ujawnieniu, że propeptydy GDF-8 mają krótki okres półtrwania in vivo, co zmniejsza ich skuteczność jako farmakologicznych inhibitorów aktywności GDF-8 i BMP-11. A zatem, w jednym z wykonań, wynalazek przedstawia zmodyfikowane i stabilizowane propeptydy BMP-11 wykazujące lepsze właściwości farmakokinetyczne, a w szczególności zwiększony okres półtrwania w obiegu.

Niniejszy wynalazek dostarcza nowych zmodyfikowanych propeptydów GDF, które tworzą nieaktywne kompleksy z białkami GDF (np. białkami GDF-8 i BMP-11) in vitro i in vivo. Korzystnie, jeżeli zmodyfikowane propeptydy GDF według wynalazku wiążą się z domeną wiążącą propeptyd dojrzałego białka GDF. A zatem, w pewnych wykonaniach wynalazku, zmodyfikowany propeptyd GDF obejmuje białko fuzyjne pomiędzy propeptydem GDF a białkiem stabilizującym. Białkiem stabilizującym może być dowolne białko, które zwiększa ogólną stabilność zmodyfikowanego propeptydu GDF. Co będzie wiadome dla specjalisty w dziedzinie, takie białka fuzyjne mogą ewentualnie zawierać łącznik peptydowy pomiędzy częścią propeptydową a częścią stabilizującą. Jak dobrze wiadomo w dziedzinie, białka fuzyjne wytwarza się w taki sposób, aby drugie białko było połączone w ramce z pierwszą częścią, tak, że uzyskane w rezultacie w wyniku translacji białko zawiera obydwa, pierwsze i drugie białko. Przykładowo, w niniejszym wynalazku białko fuzyjne można wytworzyć tak, aby część będąca propeptydem GDF była połączona z drugim białkiem (np., częścią będącą białkiem stabilizującym). Takie białko fuzyjne wytwarza się tak, że uzyskane w rezultacie w wyniku translacji białko zawiera obydwa, część propeptydową i część stabilizującą.

W innych wykonaniach, propeptyd GDF obejmuje propeptyd GDF, który jest zmodyfikowany, aby mieć dłuższy okres półtrwania w obiegu w porównaniu z niezmodyfikowanym propeptydem GDF. Jakkolwiek precyzyjny mechanizm i czas wiązania zmodyfikowanego propeptydu GDF jest nieznany, uważa się, że zmodyfikowane propeptydy BMP-11 według wynalazku wiążą się z dojrzałym GDF-8 i BMP-11. W korzystnym wykonaniu niniejszy wynalazek dostarcza zmodyfikowanych propeptydów GDF, które tworzą nieaktywne kompleksy z białkami GDF-8 i BMP-11 in vivo lub in vitro. W jednym z wykonań propeptydy GDF wiążą się preferencyjnie z domeną wiążącą propeptyd dojrzałego białka GDF-8 lub dojrzałego białka BMP-11. Takie wiązania mogą następować, na przykład, po uwolnieniu

PL 212 078 B1 natywnego propeptydu z miejsca aktywnego GDF-8 i BMP-11, po wymianie natywnego propeptydu na zmodyfikowany BMP-11 i/lub po odcięciu propeptydu z białka prekursorowego GDF-8 i BMP-11. Niezależnie od mechanizmu, wiązanie zmodyfikowanego propeptydu BMP-11 prowadzi do zmniejszenia jednej albo większej liczby aktywności biologicznych związanych z GDF-8 w stosunku do dojrzałego białka GDF-8, które nie jest związane z tym samym zmodyfikowanym propeptydem. W jednym z korzystnych wykonań zmodyfikowane propeptydy BMP-11 zmniejszają aktywność GDF-8 i BMP-11 związaną z negatywną regulacją masy mięśni szkieletowych.

W innym korzystnym wykonaniu niniejszy wynalazek dostarcza zmodyfikowanych propeptydów GDF, które tworzą nieaktywne kompleksy z białkami BMP-11 in vivo lub in vitro. W jednym z wykonań propeptydy GDF wiążą się preferencyjnie z domeną wiążącą propeptyd dojrzałego białka BMP-11. W jeszcze innym wykonaniu zmodyfikowany propeptyd GDF to białko fuzyjne zawierające propeptyd GDF i region Fc cząsteczki IgG (białko stabilizujące). Takie inhibitory GDF mogą zawierać propeptyd GDF (na przykład jak przedstawiono w SEK NR ID: 11) albo fragment lub wariant takiego propeptydu, który zachowuje jedną albo więcej aktywności biologicznych propeptydu GDF. Takie zmodyfikowane propeptydy GDF są zdolne do hamowania aktywności białek GDF.

Propeptydy BMP-11 zastosowane w wynalazku mogą być wytwarzane syntetycznie, pochodzić z naturalnie występujących (natywnych) propeptydów BMP-11, albo mogą być wytwarzane poprzez rekombinowanie DNA, z zastosowaniem rozmaitych odczynników, komórek gospodarzy i sposobów, które są dobrze znane w dziedzinie inżynierii genetycznej. W jednym z wykonań zmodyfikowany zmodyfikowany propeptyd BMP-11 zawiera ludzki propeptyd BMP-11 połączony kowalencyjnie z cząsteczką IgG albo jej fragmentem. Propeptyd BMP-11 może być połączony w bezpośrednio z regionem Fc cząsteczki IgG albo może być połączony z regionem Fc cząsteczki IgG poprzez łącznik polipeptydowy. Zastosowanie takich łączników jest dobrze znane w dziedzinie.

W niektórych wykonaniach gdzie zmodyfikowane propeptydy GDF według wynalazku obejmują białka fuzyjne, część będąca propeptydem GDF w białku fuzyjnym jest korzystnie w co najmniej około 75%-80% identyczna z SEK NR ID: 11, korzystniej, w co najmniej około 81% do około 85% identyczna z SEK NR ID: 11, jeszcze bardziej korzystnie, w co najmniej około 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% lub 94% identyczna z SEK NR ID: 11, a jeszcze korzystniej, w co najmniej około 95%, 96%, 97%, 98%), 99% lub 100%) identyczna z SEK NR ID: 11. W korzystnym wykonaniu propeptydy BMP-11 zawierają sekwencję identyczną z sekwencją przedstawioną w SEK NR ID: 11. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu część będąca propeptydem GDF białka fuzyjnego według wynalazku może zawierać fragment wariantu propeptydu GDF przedstawionego w SEK NR ID: 11, o ile fragment albo wariant zachowuje jedną albo więcej aktywności biologicznych propeptydu GDF. W innym korzystnym wykonaniu zmodyfikowane propeptydy BMP-11 obejmują zmutowane wersje SEK NR ID: 11, przy czym mutant został zmodyfikowany, tak, że zawiera jedną albo więcej mutacji (włączając w to insercję, delecje lub podstawienie) o ile fragment albo wariant zachowuje jedną albo więcej aktywności biologicznych propeptydu GDF.

Istotnie, w wykonaniach według wynalazku obejmujących białka fuzyjne zawierające zmodyfikowane GDF ważne jest, aby białko fuzyjne było wytworzone albo zaprojektowane tak, aby w uzyskanym w rezultacie białku fuzyjnym natywne miejsce cięcia proteolitycznego (np. RSRR) w propeptydzie GDF było przerwane, zniszczone, zinaktywowane albo usunięte. Jak specjalista w dziedzinie będzie mógł się zorientować, wynikiem niepowodzenia w dokonaniu tego byłoby odcięcie drugiego białka (np. części stabilizującej) białka fuzyjnego od pierwszego białka (części propeptydowej) białka fuzyjnego. A zatem istotny aspekt wynalazku dotyczy dokonania inaktywacji albo eliminacji natywnego miejsca cięcia w propeptydach GDF, kiedy stosuje się taki propeptyd do wytworzenia białka fuzyjnego, który jest zmodyfikowanym propeptyd GDF według wynalazku. Sposoby inaktywowania takiego miejsca proteolitycznego są dobrze znane w dziedzinie i obejmują miedzy innymi mutację, delecję albo insercję sekwencji aminokwasowej lub nukleotydowej proteolitycznego miejsca cięcia.

W jeszcze innych wykonaniach wynalazku, można dokonać mutacji w sekwencji GDF aby uczynić te miejsca mniej podatnymi na cięcie proteolityczne. Na przykład, taki mutant może zawierać mutację punktową w pozycjach 122, 123, 286 lub 287 z SEK NR ID: 7. W jednym wykonaniu, takich mutacji punktowych można dokonać dla aminokwasów z SEK NR ID: 11. Analizę komputerową (przy użyciu dostępnego handlowo oprogramowania np. MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) można również zastosować do identyfikowania miejsc cięcia proteolitycznego. Specjalista w dziedzinie będzie wiedział, że dowolną z opisanych mutacji, wariantów albo modyfikacji można uzyskać na poziomie kwasu nukleinowego. Takie techniki są dobrze znane w dziedzinie.

PL 212 078 B1

T a b e l a 2

Przykładowe aminokwasy, które można zmutować aby zapobiec cięciu pro peptydu BMP-11 (Numery aminokwasów odnoszą się do SEK NR ID: 7)

Asp-122

Ala-123

Glu-286

Leu-287

Jak zaznaczono powyżej, wynalazcy stwierdzili, że propeptydy GDF mają krótki okres półtrwania in vivo. A zatem, aby być przydatnym farmaceutycznie albo jako czynnik terapeutyczny lub profilaktyczny, propeptyd GDF musi być stabilizowany chemicznie albo fizycznie w celu zwiększenia trwałości w warunkach fizjologicznych.

Propeptydy GDF mogą być stabilizowane lub modyfikowane dowolnymi metodami znanymi w dziedzinie, tak długo jak zmodyfikowany propeptyd GDF zachowuje zdolność do hamowania białka GDF albo dojrzałego białka GDF. W korzystnym wykonaniu, zmodyfikowany propeptyd GDF zachowuje zdolność do wiązanie się z docelowym miejscem wiązania w białku GDF albo propeptydzie GDF. W jednym z korzystnych wykonań, zmodyfikowany propeptyd GDF stanowi propeptyd BMP-11 połączony bezpośrednio albo poprzez łącznik z regionem Fc cząsteczki IgG. Region Fc cząsteczki IgG ma efekt ochronny albo stabilizujący wobec propeptydu (a zatem działa jako modyfikacja stabilizująca), co znajduje odzwierciedlenie w polepszeniu właściwości farmakokinetycznych (tj. zwiększonym okresie półtrwania w surowicy) białka fuzyjnego w porównaniu z odpowiednim niezmodyfikowanym niezmodyfikowanym propeptydem BMP-11.

Zmodyfikowane propeptydy BMP-11 można izolować albo oczyszczać zgodnie ze standardowymi procedurami izolacji i oczyszczania białka dobrze znanymi w dziedzinie.

Według wynalazku zmodyfikowany propeptyd GDF stanowi ludzki propeptyd BMP-11 albo zmutowany ludzki propeptyd BMP-11, a cząsteczką IgG jest region Fc IgGl lub IgG4 albo region Fc IgG1 zmodyfikowany w celu zmniejszenia funkcji efektorowej. W jednym z wykonań stabilizatorem jest region Fc ludzkiej IgG1 (SEK NR ID: 15) albo region Fc ludzkiej IgGl zmodyfikowany w celu zmniejszenia funkcji efektorowej (SEK NR ID: 16). Propeptyd BMP-11 może być połączony bezpośrednio albo poprzez łącznik z regionem Fc cząsteczki IgG, jak tu opisano.

Niniejszy wynalazek dostarcza również sposobów wytwarzania zmodyfikowanych propeptydów GDF mających zwiększony okres półtrwania in vivo lub in vitro. W jednym z korzystnych wykonań sposób obejmuje wytwarzanie zmodyfikowanego propeptydu GDF stanowiącego białko fuzyjne BMP-11/Fc IgG1 poprzez wytworzenie cząsteczki cDNA kodującej:

(1) propeptyd GDF (ludzki propeptyd BMP-11, SEK NR ID: 11), który jest zmodyfikowany tak, aby zinaktywować miejsce cięcia proteolitycznego i region Fc cząsteczki IgG (na przykład region Fc ludzkiej cząsteczki IgG SEK NR ID: 15);

(2) wyrażenie cDNA w odpowiednim prokariotycznym albo eukariotycznym systemie ekspresji z zastosowaniem odpowiednich plazmidów ekspresyjnych i komórek; oraz (3) izolowanie i oczyszczenie wyrażonych białek fuzyjnych zawierających zmodyfikowany propeptyd GDF, przy czym zmodyfikowany propeptyd GDF ma zwiększony okres półtrwania in vivo lub in vitro w porównaniu z niezmodyfikowanym propeptydem GDF.

Układy ekspresji cDNA są dobrze znane w biologii molekularnej, podobnie jak sposoby izolowania i oczyszczania wyrażanych białek (przykłady 2 i 7, tutaj, dostarczają takich przykładów).

W alternatywnym wykonaniu, konstrukty cDNA zastosowane do ekspresji takich białek fuzyjnych mogą zawierać nukleotydy kodujące peptyd łącznikowy pomiędzy nukleotydami kodującymi propeptyd GDF i regionem Fc IgG (albo częścią stabilizującą). Orientacja peptydu łącznikowego w stosunku do GDF albo regionu Fc IgG jest nieważna. Peptyd łącznikowy mogą stanowić nukleotydy kodujące odcinek o długości 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 lub więcej aminokwasów. W konkretnym wykonaniu, peptyd łącznikowy mogą stanowić nukleotydy kodujące sekwencję aminokwasową składającą się z glicyny-seryny-glicyny-seryny (GSGS).

W innym wykonaniu plazmidy ekspresyjne mogą zawierać ewentualnie znacznik dla dogodnej izolacji i oczyszczania wyrażanych białek. Zastosowanie takich plazmidów do ekspresji ze znacznikiem i sposoby izolowania i oczyszczania produktów białkowych ze znacznikiem są dobrze znane w dziedzinie.

Propeptydy GDF według wynalazku obejmują w szczególności białka fuzyjne, w których część będąca propeptydem GDF cząsteczki jest identyczna albo w ponad 60% homologiczna z sekwencjami

PL 212 078 B1 odpowiadającymi GDF z poszczególnych gatunków, podczas gdy część stabilizująca, taka jak region Fc cząsteczki IgG może być identyczna albo w ponad 60% homologiczna z sekwencjami odpowiadającymi IgG z innych gatunków. W korzystnych wykonaniach wynalazku białkami fuzyjnymi według wynalazku są chimery białek ludzkich. Co będzie zrozumiałe w dziedzinie, ludzkie białka chimerowe albo białka fuzyjne będą korzystne przy leczeniu ludzi.

Jako alternatywa albo dodatkowo w stosunku do opisanych powyżej białek fuzyjnych z Fc, propeptydy GDF mogą być stabilizowanie przy zastosowaniu wielu innych metod i zasobów materiałowych, które są dobrze znane i łatwo dostępne w dziedzinie dotyczącej białek. Takie metody i materiały obejmują na przykład glikozylację albo połączenie z albuminą lub polimerem niebiałkowym, jak opisano szczegółowo poniżej. Zmodyfikowane propeptydy GDF-8 można wyizolować i oczyszczać stosując standardowe techniki izolowania i oczyszczania dobrze znane w dziedzinie dotyczącej białek.

Propeptydy GDF albo zmodyfikowane propeptydy GDF można wytwarzać przy zastosowaniu wielu znanych w dziedzinie technik. Przykładowo, takie propeptydy można syntetyzować (np. chemicznie albo poprzez rekombinowanie DNA), izolować i oczyszczać i testować pod kątem ich zdolności do tworzenia kompleksów z dojrzałym białkiem GDF-8 albo dojrzałym białkiem BMP-11 stosując metody tu opisane albo metody znane w dziedzinie. Propeptydy można syntetyzować stosując standardowe techniki chemii białek, jak te opisane w Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) oraz Grant G.A. (wyd.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman and Company, New York (1992). Ponadto, dostępne handlowo są automatyczne syntetyzatory peptydów (np. Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600).

Alternatywnie, zmodyfikowane lub niezmodyfikowane propeptydy GDF albo ich fragmenty można wytwarzać poprzez rekombinowanie DNA stosując różne systemy ekspresyjne (np. E. coli, komórki jajnika chomika chińskiego, komórki COS, bakulowirusy) dobrze znane w dziedzinie. Przykładowo, wyrażony propeptyd BMP-11 można oczyścić na przykład stosując metodę opisaną w Bottinger i wsp. (1996) PNAS 93:5877-5882 oraz Gentry i Nash (1990) Biochemistry 29:6851-6857, albo dowolną inną znaną w dziedzinie metodą oczyszczania peptydów. Alternatywnie, do zmodyfikowanego lub niezmodyfikowanego propeptydu GDF albo jego fragmentu można dodać znacznik, na przykład FLAG lub 6-His w celu ich oczyszczenia przy zastosowaniu technik znanych w dziedzinie dotyczącej białek.

Zmodyfikowane lub niezmodyfikowane propeptydy BMP-11 można ponadto wytwarzać poprzez trawienie BMP-11 występujących naturalnie albo wytworzonych poprzez rekombinowanie DNA stosując na przykład proteazę, np., trypsynę, termolizynę, chymotrypsynę, pepsynę albo enzym konwertujący pary aminokwasów zasadowych (PACE, od ang. paired basie amino acid converting enzyme). Analizę komputerową (z użyciem dostępnego handlowo oprogramowania, np. MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) można zastosować do identyfikacji miejsc cięcia proteolitycznego. Alternatywnie, takie propeptydy GDF można wytworzyć z GDF-8 lub BMP-11 występujących naturalnie albo wytworzonych poprzez rekombinowanie DNA stosując standardowe techniki znane w dziedzinie, takie jak cięcie chemiczne (np., z użyciem cyjanobromku, hydroksylaminy).

Proteolityczne albo syntetyczne części propeptydów BMP-11 zmodyfikowanego propeptydu GDF mogą zawierać tyle reszt aminokwasowych ile jest niezbędnych dla wiązania się z docelowym białkiem GDF, hamując w ten sposób, częściowo albo całkowicie, aktywność GDF-8 lub BMP-11. Przykłady 4-6, tutaj, ilustrują testy wiązania i hamowania. Konkretnie, fragmenty funkcjonalne sekwencji propeptydów BMP-11, które zachowują zdolność do modulowania albo hamowania GDF-8 są objęte zakresem wynalazku. Część propeptydu BMP-11 zmodyfikowanego propeptydu BMP-11 według wynalazku ma długość 274 aminokwasów, tj. odpowiadając SEK NR ID: 11. Sekwencja propeptydu BMP-11 rozpoczyna się od sekwencji aminokwasowej AEGPAAA.

Sekwencja sygnałowa ludzkiego BMP-11 jest przedstawiona w SEK NR ID: 14 i obejmuje pierwszych 24 aminokwasów z SEK NR ID: 7. Zidentyfikowanie częściowej sekwencji propeptydu BMP-11 jako fragmentu funkcjonalnego można łatwo uzyskać, na przykład stosując testy opisane tu w przykładach 4-6.

Poza sekwencjami skróconych propeptydów, warianty propeptydów obejmują tu w szczególności propeptydy GDF mające mutacje punktowe lub inne modyfikacje (włączając w to insercie, delecję i podstawienie) o ile takie warianty zawierają jedną lub więcej pożądanych aktywności biologicznych albo hamujących propeptydu GDF. Taką aktywność można mierzyć na przykład jak opisano w Przykładach 4-6. Takie modyfikacje można wprowadzić do cząsteczki dla zwiększenia aktywności, okresu półtrwania w obiegu albo przy przechowywaniu lub wytwarzania propeptydu BMP-11. Przykładowo, można wprowadzić mutacje punktowe do jednego albo większej liczby miejsc cięcia proteolitycznego

PL 212 078 B1 w celu zapobieżenia albo zahamowania degradacji proteolitycznej zmodyfikowanego propeptydu in vivo. Analizę komputerową (przy użyciu dostępnego handlowo oprogramowania np. MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) można zastosować do identyfikowania miejsc cięcia proteolitycznego.

A zatem, sposoby wytwarzania propeptydów GDF według wynalazku obejmują w szczególności, poza sekwencjami kodującymi cDNA typu dzikiego, sekwencje kodujące cDNA, które kodują propeptydy GDF typu dzikiego, ale które różnią się od sekwencji cDNA GDF typu dzikiego na skutek degeneracji kodu genetycznego albo zmienności allelicznej (naturalnie występujące zmiany zasad u gatunków w populacji, które mogą prowadzić albo nie do zmiany aminokwasowej). Wynalazek bierze również pod uwagę sekwencje DNA, które hybrydyzują w ostrych warunkach hybrydyzacji (w jednym z wykonań jak opisano, na przykład, w T. Maniatis i wsp. (1982) Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, str. 387-389) z kwasem nukleinowym kodującym propeptyd GDF albo kwasem nukleinowym kodującym białko lub polipeptyd mające zdolność do wiązania się z konkretnym białkiem GDF, jak przedstawiono w przykładach 4-6. Warianty sekwencji cDNA będące wynikiem mutacji punktowych albo indukowanych modyfikacji (np. insercji, delecji i podstawienia) dla zwiększenia aktywności, okresu półtrwania albo wytwarzania kodowanych przez nie propeptydów BMP-11 są również przydatne w niniejszym wynalazku. Programy komputerowe przydatne do określania homologii sekwencji DNA są znane w dziedzinie i tu opisane.

Zdolność zmodyfikowanego propeptydu GDF do tworzenia niekowalencyjnego kompleksu z białkiem GDF można oceniać różnymi metodami znanymi w dziedzinie, włączając w to sączenie molekularne i analizę z zastosowaniem połączeń krzyżowych jak tu opisano w przykładzie 2.

Jak nadmieniono powyżej, poza metodą fuzji z Fc, propeptydy GDF można stabilizować przy zastosowaniu wielu innych technik. W jednym z wykonań część stabilizująca jest połączona kowalencyjnie z częścią będącą propeptydem GDF z wytworzeniem białka fuzyjnego. Przykładowo, propeptyd może być połączony z jednym albo większą liczbą niebiałkowych polimerów, np. glikolem polietylenowym, glikolem polipropylenowym lub polioksyalkilenami w sposób przedstawiony w patentach USA nr 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 lub 4179337. W pewnych wykonaniach propeptydy GDF mogą być zmodyfikowane chemicznie poprzez kowalencyjne połączenie z polimerem dla zwiększenia ich okresu półtrwania w obiegu. Korzystne polimery i sposoby ich przyłączania do peptydów są również opisane w patentach USA nr 4766106, 4179337, 4495285 i 4609546.

Propeptyd może być zmodyfikowany, tak aby miał zmieniony wzór glikozylacji (tj. odmienny od wzoru glikozylacji typu dzikiego). Zgodnie ze stosowanym tu terminem, „zmieniony” oznacza posiadanie jednej albo więcej reszt węglowodanowych dodanych do albo usuniętych z propeptydu GDF typu dzikiego. Glikozylacja białek i polipeptydów ma miejsce zazwyczaj poprzez połączenie przez N lub połączenie przez O. Połączenie przez N oznacza przyłączenie reszty węglowodanowej do łańcucha bocznego reszty asparaginowej. Sekwencje tripeptydów asparagina-X-seryna i asparagina-X-treonina, gdzie X to dowolny aminokwas oprócz proliny, są rozpoznawanymi sekwencjami dla enzymatycznego przyłączenia reszty węglowodanowej do łańcucha bocznego reszty asparaginowej. A zatem obecność w polipeptydzie jednej z tych sekwencji tripeptydów tworzy potencjalne miejsce glikozylacji. Glikozylacja poprzez O oznacza przyłączenie jednego z cukrów N-acetylogalaktozaminy, galaktozy lub ksylozy, do kwasu hydroksyaminowego, najczęściej seryny lub treoniny, jakkolwiek może zostać wykorzystana

5-hydroksyprolina lub 5-hydroksylizyna.

Dodanie lub delecję miejsc glikozylacji do propeptydu GDF dogodnie jest przeprowadzić poprzez zmianę sekwencji aminokwasowej, tak że zawiera ona lub brak w niej jednego albo większej liczby opisanych powyżej sekwencji tripeptydów (dla miejsc N-glikozylacji). Zmiany można również dokonać poprzez dodanie albo zastąpienie jednej albo większej liczby reszt serynowych lub treoninowych w sekwencji propeptydu GDF typu dzikiego (dla miejsc O-glikozylacji). Ze względu na łatwość, sekwencję aminokwasową propeptydu GDF korzystnie jest zmieniać poprzez zmiany na poziomie DNA, które to techniki są dobrze znane w dziedzinie.

Innymi sposobami zwiększania liczby reszt węglowodanowych na propeptydzie GDF jest połączenie chemiczne albo enzymatyczne glikozydów z propeptydem GDF. Procedury te są korzystne z tego względu, że nie wymagają wytwarzania propeptydu GDF w komórce gospodarza, która ma zdolności glikozylacyjne dla przeprowadzenia N-glikozylacji i O-glikozylacji. W zależności od zastosowanego sposobu łączenia cukier(y) może być przyłączony do (a) argininy i histydyny; (b) wolnych grup karboksylowych; (c) wolnych grup sulfhydrylowych, takich jak te w cysteinie; (d) wolnych grup hydroksylowych, takich jak te w serynie, treoninie lub hydroksyprolinie; (e) reszt aromatycznych, takich jak te

PL 212 078 B1 w fenyloalaninie, tyrozynie lub tryptofanie; lub (f) grup amidowych glutaminy. Metody te są opisane w WO 87/05330 opublikowanym 11 września 1987 i w Aplin i Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., str. 259-306.

Usunięcia dowolnej z reszt węglowodanowych na propeptydzie GDF można również dokonać chemicznie albo enzymatycznie. Deglikozylacja chemiczna wymaga wystawienia propeptydu GDF na działanie związku - kwasu trifluorometanosulfonowego lub ekwiwalentnego związku. Takie traktowanie prowadzi do cięcia większości albo wszystkich cukrów z wyjątkiem cukru łączącego (N-acetyloglukozaminy lub N-acetylogalaktozaminy), pozostawiając sekwencję aminokwasową nienaruszoną.

Deglikozylacja chemiczna jest opisana przez Hakimuddin i wsp. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 oraz przez Edge i wsp. (1981) Anal. Biochem. 118:131. Cięcia enzymatycznego reszty węglowodanowej na propeptydach GDF można dokonać poprzez zastosowanie rozmaitych egzo- i endoglikozydaz jak opisano w Thotakura i wsp. (1987) Meth. Enzymol. 138:350.

Kiedy zmodyfikowanym propeptydem GDF jest białko fuzyjne propeptyd GDF-Fc, jak opisano powyżej, region Fc cząsteczki IgG może być również zmodyfikowany, tak aby miał zmieniony wzór glikozylacji.

W innym wykonaniu propeptyd GDF jest połączony z albuminą albo pochodną albuminy. Sposoby łączenia białek i polipeptydów z albuminą albo pochodną albuminy są dobrze znane w dziedzinie. Patrz np. patent USA 5116944 (Sivam i wsp.).

Jest zrozumiałe dla specjalisty w dziedzinie, że pewne aminokwasy mogą być zastąpione innymi aminokwasami w strukturze białka bez szkodliwego wpływu na aktywność białka. Jest zatem brane pod uwagę przez wynalazców, że można dokonać rozmaitych zmian w sekwencjach aminokwasowych zmodyfikowanych lub niezmodyfikowanych propeptydów GDF albo sekwencjach DNA, kodujących takie propeptydy bez znaczącej utraty ich przydatności lub aktywności biologicznej. Taką aktywność mierzy się w przykładach 4-6. Takie zmiany obejmują między innymi delecje insercje, skrócenia, podstawienia, fuzje i temu podobne. Przykładowo, zmiany w sekwencjach aminokwasowych w miejscach cięcia proteolitycznego w obrębie zmodyfikowanego propeptydu GDF są konkretnie objęte niniejszym wynalazkiem.

Przy dokonywaniu takich zmian, można uwzględnić wskaźnik hydropatyczny aminokwasów. Znaczenie wskaźnika hydropatycznego aminokwasów dla nadawania czynnej funkcji biologicznej białka jest ogólnie zrozumiałe w dziedzinie (Kyte i Doolittle, 1982). Przyjmuje się, że względny charakter hydropatyczny aminokwasu przyczynia się do struktury drugorzędowej otrzymanego w rezultacie białka, co z kolei definiuje oddziaływanie białek z innymi cząsteczkami, na przykład enzymami, substratami, receptorami, DNA, przeciwciałami, antygenami i temu podobnymi.

Każdemu aminokwasowi przypisano wskaźnik hydropatyczny w oparciu o jego właściwości hydropatyczne i ładunek (Kyte i Doolittle, 1982). Wartości te są następujące: izoleucyna (+4,5); walina (+4,2); leucyna (+3,8); fenyloalanina (+2,8); cysteina/cystyna (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicyna (-0,4); treonina (-0,7); seryna (-0,8); tryptofan (-0,9); tyrozyna (-1,3); prolina (-1,6); histydyna (-3,2); glutaminian (-3,5); glutamina (-3,5); asparaginian (-3,5); asparagina (-3,5); lizyna (-3,9) oraz arginina (-4,5).

Przy dokonywaniu takich zmian, korzystne są podstawienia aminokwasowe, których wskaźniki hydropatyczne mieszczą się w zakresie +2, szczególnie korzystne są w zakresie ±1 a jeszcze korzystniej są w zakresie ±0,5.

Jest również zrozumiałe w dziedzinie, że podstawienia podobnych aminokwasów mogą być dokonane skutecznie na podstawie ich hydrofilowości. Przykładowo, patent USA 4554101 głosi, że największa lokalna hydrofilowość białka, określona poprzez hydrofilowość sąsiadujących aminokwasów, koreluje z właściwościami biologicznymi białka.

Jak przedstawiono szczegółowo w patencie USA 4554101, resztom aminokwasowym przypisuje się następujące wartości hydrofilowości: arginina (+3,0); lizyna (+3,0); kwas asparaginowy (+3,0 ± 1); glutaminian (+3,0 ± 1); seryna (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicyna (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histydyna (-0,5); cysteina (-1,0); metionina (-1,3); walina (-1,5); leucyna (-1,8); izoleucyna (-1,8); tyrozyna (-2,3); fenyloalanina (-2,5); tryptofan (-3,4).

Przy dokonywaniu takich zmian, korzystne są podstawienia aminokwasowe, których wartości hydrofilowości mieszczą się w zakresie ±2, szczególnie korzystne są w zakresie ±1, a jeszcze korzystniej są w zakresie ±0,5.

Modyfikacje mogą być konserwatywne, tak że zmiana nie wpływa na strukturę albo funkcję biologiczną białka. Takie podstawienia aminokwasowe opierają się na względnym podobieństwie podstawników

PL 212 078 B1 w łańcuchach bocznych aminokwasów, na przykład ich hydrofobowości, hydrofilowości, ładunku, wielkości i temu podobnych. Przykładowe podstawienia, przy których bierze się pod uwagę powyższe właściwości są dobrze znane specjalistom w dziedzinie i obejmują argininę i lizynę, glutaminian i asparaginian, serynę i treoninę, glutaminę i asparaginę; oraz walinę, leucynę i izoleucynę. Sekwencja aminokwasowa zmodyfikowanych propeptydów GDF może być modyfikowana, tak aby zawierać dowolną liczbę konserwatywnych zmian o ile nie wpływa to niekorzystnie na wiązanie się zmodyfikowanego propeptydu GDF do jego docelowego białka GDF.

Względne podobieństwo albo identyczność sekwencji (znane również w dziedzinie dotyczącej białek i biologii molekularnej jako homologia sekwencji) ustala się korzystnie stosując programy „Best Fit” lub „Gap” z oprogramowania do analizy sekwencji Sequence Analysis Software Package™ (Wersja 10; Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI). „Gap” wykorzystuje algorytm Needlemana i Wunscha (Needleman i Wunsch, 1970) w celu takiego dopasowania dwóch sekwencji, aby uzyskać maksymalną liczbę pasujących par i minimalną liczbę przerw. „BestFit” przeprowadza optymalne dopasowanie najlepszego odcinka podobieństwa między dwiema sekwencjami. Optymalne dopasowanie znajduje się poprzez wstawianie przerw w celu uzyskania maksymalnej liczby pasujących par stosując algorytm lokalnej homologii Smitha i Watermana (Smith i Waterman, 1981; Smith, i wsp., 1983).

Opisane powyżej oprogramowanie do analizy sekwencji Sequence Analysis Software Package zawiera wiele innych przydatnych narzędzi analizy sekwencji do identyfikowania homologii ujawnionych tu sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych. Przykładowo program „BLAST” (Altschul i wsp., 1990) przeszukuje określone bazy danych (np., bazy danych o sekwencjach przechowywane w National Center for Biotechnology Information (NCBI) w Bethesda, Maryland, USA) pod kątem sekwencji podobnych do sekwencji stanowiącej zapytanie (bądź peptydu bądź kwasu nukleinowego); „FastA” (Lipman i Pearson, 1985; patrz również Pearson i Lipman, 1988; Pearson i wsp., 1990) przeprowadza przeszukiwanie według Pearsona i Lipmana pod kątem podobieństwa pomiędzy sekwencją stanowiącą zapytanie a grupą sekwencji tego samego typu (kwasu nukleinowego lub peptydu); „TfastA” przeprowadza przeszukiwanie według Pearsona i Lipmana pod kątem podobieństwa pomiędzy sekwencją stanowiącą zapytanie a dowolną grupą sekwencji nukleotydowych (dokonuje on translacji sekwencji nukleotydowych we wszystkich sześciu ramkach odczytu przed przeprowadzeniem porównania); „FastX” przeprowadza przeszukiwanie według Pearsona i Lipmana pod kątem podobieństwa pomiędzy sekwencją stanowiącą zapytanie a grupą sekwencji białkowych, biorąc pod uwagę przesunięcia ramek odczytu. „TfastX” przeprowadza przeszukiwanie według Pearsona i Lipmana pod kątem podobieństwa pomiędzy sekwencją stanowiącą zapytanie a dowolną grupą sekwencji nukleotydowych, biorąc pod uwagę przesunięcia ramek odczytu (dokonuje on translacji obydwu nici sekwencji nukleotydowych przed przeprowadzeniem porównania).

Specjalista w dziedzinie będzie wiedział, że zmodyfikowane lub niezmodyfikowane propeptydy GDF mogą zawierać dowolną liczbę podstawień w sekwencji aminokwasowej bez zmiany ich właściwości biochemicznych. W korzystnym wykonaniu takie zmiany są konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, które są dobrze znane w dziedzinie. Przykładowymi podstawieniami aminokwasowymi, które biorą pod uwagę różne powyższe uwarunkowania są dobrze znane specjalistom w dziedzinie biochemii białek i obejmują między innymi argininę i lizynę, glutaminian i asparaginian, serynę i treoninę, glutaminę i asparaginę; oraz walinę, leucynę i izoleucynę.

W pewnych wykonaniach wynalazku, stabilność białka in vivo można mierzyć wieloma sposobami. W jednym z wykonań, pobiera próbki surowicy albo tkanki w punktach czasowych po dostarczaniu białka bądź dożylnie bądź dootrzewnowo albo białko znakuje się radioaktywnie, tj. jodem-125 stosując metody dobrze znane w dziedzinie. Ilość radioaktywności obecną w każdej próbce surowicy albo tkanki można ustalić przy użyciu licznika gamma. W innym wykonaniu, integralność/stabilność białka w surowicy można zbadać poprzez SDS-PAGE, a następnie bądź autoradiografię bądź analizę Western. W innym wykonaniu aktywność biologiczną białka można zmierzyć przy zastosowaniu dowolnego z wielu testów funkcjonalnych, włączając w to test ELISA albo test oparty na komórkach znany w dziedzinie.

Sposoby leczenia choroby

Propeptydy GDF według wynalazku są przydatne do zapobiegania albo leczenia różnych chorób ludzkich u ludzi i zwierząt. Korzystne jest stosowanie propeptydów GDF do hamowania albo zmniejszania jednej albo większej liczby aktywności związanych z białkiem GDF. Zmodyfikowany propeptyd GDF hamuje albo zmniejsza jedną albo większą liczbę aktywności dojrzałego GDF-8

PL 212 078 B1 w stosunku do dojrzałego białka GDF-8, który nie jest związany przez ten sam propeptyd. Aktywność dojrzałego białka GDF-8, po związaniu z jednym albo większą liczbą zmodyfikowanych propeptydów GDF może być zahamowana w co najmniej 50%, korzystniej w co najmniej 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 i 88%, jeszcze korzystniej w co najmniej 90, 91, 92, 93 lub 94%, a nawet jeszcze korzystniej w co najmniej 95% do 100%, w stosunku do dojrzałego białka GDF-8, które nie jest związane przez jeden albo większą liczbę zmodyfikowanych propeptydów GDF.

Korzystne jest, jeżeli zaburzeniem medycznym, które ma być leczone albo któremu ma się zapobiegać przy użyciu zmodyfikowanych propeptydów GDF jest choroba mięśniowa lub neuromięśniowa (taka jak stwardnienie zanikowe boczne, dystrofia mięśniowa, atrofia mięśni, zastoinowa czopująca choroba płuc, zespół wyniszczenia mięśniowego, sarkopenia albo kacheksja), choroba metaboliczna (taka jak cukrzyca typu II, cukrzyca insulinoniezależna, hiperglikemia lub otyłość), zaburzenie tkanki tłuszczowej (takie jak otyłość) albo choroba degeneracyjna kości (taka jak osteoporoza). Najkorzystniej, jeżeli stanem medycznym jest choroba mięśniowa lub neuromięśniowa, taka jak stwardnienie zanikowe boczne, dystrofia mięśniowa, atrofia mięśni, zastoinowa czopująca choroba płuc, zespół wyniszczenia mięśniowego, sarkopenia albo kacheksja. Stanem medycznym może być choroba lub zaburzenie metaboliczne, takie jak to będące wynikiem zaburzenia metabolizmu glukozy i/lub oporności na insulinę, takie jak cukrzyca typu II lub cukrzyca insulinoniezależna albo choroby metaboliczne, takie jak hiperglikemia lub otyłość. Korzystne jest, jeżeli propeptydy GDF stosuje się do zapobiegania albo leczenia takich schorzeń medycznych u ssaków, najkorzystniej u ludzi.

Propeptydy GDF albo kompozycje propeptydów według niniejszego wynalazku podaje się w terapeutycznie skutecznych ilościach. Stosowany tu termin „skuteczna ilość” zmodyfikowanego propeptydu GDF to dawka, która jest wystarczająca dla zmniejszenia aktywności białek GDF w celu osiągnięcia pożądanego rezultatu biologicznego (np. zwiększenia masy mięśni szkieletowych). Pożądanym rezultatem biologicznym może być dowolna korzyść terapeutyczna, włączając w to zwiększenie masy mięśni, zwiększenie siły mięśni, lepszy metabolizm, zmniejszenie otłuszczenia, lepsza homeostaza glukozowa. Takie polepszenia można mierzyć wieloma metodami włączając w to te, które mierzą beztłuszczową masę ciała (takie jak podwójną analizę skaningową promieniami X), siłę mięśni, lipidy w surowicy, leptynę w surowicy, glukozę w surowicy, glikowaną hemoglobinę, tolerancję glukozy i polepszenie we wtórnych komplikacjach cukrzycy. Ogólnie, terapeutycznie skuteczna ilość może być zróżnicowana w zależności od wieku, wagi, kondycji fizycznej i płci osobnika, jak również ostrości stanu medycznego osobnika. Dawka może być ustalona przez lekarza i dopasowana, jeśli to niezbędne do obserwowanych efektów leczenia. Generalnie, kompozycje podaje się tak, aby propeptydy GDF były podawane w dawce pomiędzy 50 μg/kg a 20 mg/kg. Korzystne jest, jeżeli propeptydy GDF są podawane jako jedna duża dawka w celu maksymalizacji poziomów propeptydów GDF w obiegu dla jak najdłuższego czasu trwania po podaniu dawki. Po podaniu jednej dużej dawki można zastosować ciągły wlew.

Niniejszym ujawniono sposoby zapobiegania albo leczenia różnych chorób metabolicznych albo schorzeń będących wynikiem nieprawidłowej homeostazy glukozowej. Prawidłowa homeostaza glukozowa wymaga między innymi precyzyjnego zgrania wydzielenia insuliny przez komórki wysepek beta w odpowiedzi na subtelne zmiany w poziomach glukozy we krwi. Jednym z podstawowych działań insuliny jest stymulowanie pobierania glukozy z krwi do tkanek, a w szczególności mięśni i tłuszczu.

A zatem, ujawniono tu sposoby leczenia cukrzycy i spokrewnionych chorób, takich jak otyłość lub hiperglikemia poprzez podawanie osobnikowi zmodyfikowanego propeptydu GDF albo kompozycji zmodyfikowanego propeptydu GDF w ilości dostatecznej dla złagodzenia objawów choroby. Konkretnie, cukrzyca typu 2 albo cukrzyca insulinoniezależna (NIDDM, od ang. noninsulin-dependent diabetes mellitus), charakteryzuje się trzema cechami (1) opornością na działanie insuliny na pobieranie glukozy w tkankach obwodowych, a w szczególności mięśniach szkieletowych i komórkach tłuszczowych, (2) zaburzonym działaniem insuliny dla hamowania wytwarzania glukozy przez wątrobę i (3) rozregulowaniem wydzielenia insuliny (DeFronzo,( 1997) Diabetes Rev.5.T77-269). A zatem, osoby cierpiące na cukrzycę typu 2 można leczyć poprzez podawanie zmodyfikowanego propeptydu GDF w celu zwiększenia wrażliwości na insulinę i pobierania glukozy przez komórki.

Podobnie, inne choroby i zaburzenia metaboliczne charakteryzujące się nieprawidłowym działaniem insuliny (np. oporność, nieaktywność lub brak) i/lub niewystarczającym transportem glukozy do komórek można również leczyć poprzez podawanie zmodyfikowanego propeptydu GDF, który zwiększa wrażliwość na insulinę i pobieranie glukozy przez komórki.

PL 212 078 B1

Zmodyfikowany propeptyd GDF albo kompozycje zmodyfikowanego propeptydu GDF według wynalazku podaje się w terapeutycznie skutecznych ilościach. Przy stosowaniu do leczenia cukrzyc i chorób spokrewnionych, „skuteczna ilość” zmodyfikowanego propeptydu GDF to dawka, która jest wystarczająca dla zmniejszenia aktywności białek GDF w celu osiągnięcia pożądanych rezultatów terapeutycznych, takich jak, na przykład, zwiększenie wrażliwości na insulinę i pobierania glukozy przez komórki, zmniejszenie masy tłuszczu w ciele albo pożądane zmiany lipidów w surowicy, leptyny w surowicy, glukozy w surowicy, glikowanej hemoglobiny, tolerancji glukozy lub polepszenie we wtórnych komplikacjach cukrzycy. Ogólnie, terapeutycznie skuteczna ilość może być zróżnicowana w zależności od wieku, wagi, kondycji fizycznej i płci osobnika, jak również ostrości stanu medycznego osobnika. Dawka może być ustalona przez lekarza i dopasowana, jeśli to niezbędne do obserwowanych efektów leczenia. Generalnie, kompozycje podaje się tak, aby propeptydy GDF były podawane w dawce pomiędzy 50 μg/kg a 20 mg/kg. Korzystne jest, jeżeli propeptydy GDF są podawane jako jedna duża dawka w celu maksymalizacji poziomów propeptydów GDF w obiegu dla jak najdłuższego czasu trwania po podaniu dawki. Po podaniu jednej dużej dawki można zastosować ciągły wlew.

Poniżej omówiona została terapia genowa, której celem jest wytwarzanie propeptydów GDF in vivo. Taka terapia mogłaby wywrzeć swój efekt terapeutyczny poprzez wprowadzenie sekwencji polinukleotydowych propeptydów GDF do komórek albo tkanek mających wymienione powyżej nieprawidłowości. Dostarczenie sekwencji polinukleotydowych propeptydów GDF można uzyskać poprzez zastosowanie zrekombinowanego wektora ekspresyjnego, takiego jak wirus chimerowy albo koloidalny system dyspersyjny. Szczególnie korzystne dla dostarczania terapeutycznego sekwencji polinukleotydowych propeptydów GDF jest zastosowanie kierowanych do celu liposomów.

Różne wektory wirusowe, które można zastosować do terapii genowej, jak tu opisano, obejmują adenowirusa, wirusa opryszczki, wirusa krowianki, albo, korzystnie, wirusa RNA, takiego jak retrowirus. Korzystne jest, jeżeli wektorem retrowirusowym jest pochodna retrowirusa mysiego albo ptasiego. Przykłady wektorów retrowirusowch, do których mogą być wstawione pojedyncze obce geny obejmują miedzy innymi: wirusa białaczki Moloneya (MoMuLV, od ang. Moloney murine leukemia wirus), mysiego wirusa mięsaka Harveya (HaMuSV, od ang. Harvey murine sarcoma wirus), mysiego wirusa raka gruczołu mlecznego (MuMTV, od ang. murine mammary tumor wirus) oraz wirusa mięsaka Rousa (RSV, od ang. Rous Sarcoma Wirus). Wiele dodatkowych wektorów retrowirusowych może wstawiać wiele genów. Wszystkie te wektory mogą przenosić albo wstawiać gen dla markera selekcyjnego, tak że transdukowane komórki można zidentyfikować i wytwarzać. Poprzez wstawienie sekwencji polinukleotydowej propeptydu GDF będącej przedmiotem zainteresowania do wektora wirusowego razem z innym genem, który koduje na przykład ligand dla receptora na specyficznej komórce docelowej, wektor jest teraz specyficzny wobec miejsca docelowego. Wektory retrowirusowe mogą być uczynione specyficznymi poprzez przyłączenie na przykład cukru, glikolipidu albo białka. Korzystne kierowanie do celu uzyskuje się poprzez zastosowanie przeciwciała. Specjaliści w dziedzinie zorientują się, że specyficzne sekwencje polinukleotydowe można wstawiać do genomu wirusowego albo przyłączać do otoczki wirusowej dla umożliwienia specyficznego wobec miejsca docelowego dostarczania wektora retrowirusowego zawierającego polinukleotyd GDF. Wektor może być kierowany do komórek mięśniowych albo tkanki mięśniowej.

Ponieważ rekombinowane retrowirusy są defektywne, wymagają one wspomagających linii komórkowych, które zawierają plazmidy kodujące wszystkie geny strukturalne retrowirusa pod kontrolą sekwencji regulacyjnych w obrębie LTR. Plazmidom tym brak sekwencji nukleotydowej, która umożliwia mechanizmowi pakowania rozpoznanie transkryptu RNA, który ma być pakowany. Wspomagające linie komórkowe, które mają delecje sygnału pakującego obejmują między innymi PSI.2, PA317 i PA12. Te linie komórkowe wytwarzają puste wiriony, ponieważ żaden genom nie jest pakowany.

Jeżeli wektor wirusowy jest wprowadzany do takich komórek, w których sygnał pakujący jest nienaruszony, ale geny strukturalne są zastąpione przez inne geny będące przedmiotem zainteresowania, wektor może być zapakowany i wiriony wektora wytwarzane.

Alternatywnie, inne komórki w hodowli tkankowej można transfekować bezpośrednio plazmidami kodującymi geny struktury gag pol i env poprzez zastosowanie konwencjonalnej transfekcji fosforanem wapniowym. Komórki te transfekuje się następnie wektorem plazmidowym zawierającym geny będące przedmiotem zainteresowania. Otrzymane w rezultacie komórki uwalniają wektor wirusowy do podłoża hodowlanego.

Innym kierowanym do celu system dostarczania dla polinukleotydu lub propeptydu GDF jest koloidalny system dyspersyjny. Koloidalne systemy dyspersyjne obejmują kompleksy makrocząsteczkowe,

PL 212 078 B1 nanokapsułki, mikrokulki, kulki i systemy oparte o lipidy, obejmujące emulsje oleju w wodzie, micele, micele mieszane i liposomy. Korzystnym system koloidalnym według tego wynalazku jest liposom. Liposomy to sztuczne pęcherzyki błonowe, które są przydatne jako cząsteczka transportowa in vitro i in vivo. RNA, DNA i nienaruszone wiriony można w wodnym wnętrzu i dostarczać do komórek w aktywniej biologicznie postaci (Patrz np., Fraley, i wsp., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Sposoby skutecznego przenoszenia genów przy użyciu nośnika liposomowego są dobrze znane w dziedzinie, patrz np. Mannino, i wsp., Biotechniąues, 6:682, 1988. Skład liposomu to zwykle kombinacja fosfolipidów, zazwyczaj w połączeniu ze steroidami, w szczególności cholesterolem. Można również zastosować inne fosfolipidy lub inne lipidy. Właściwości fizyczne liposomów zależą od pH, siły jonowej i obecności kationów dwuwartościowych.

Przykłady lipidów przydatnych przy wytwarzaniu liposomów obejmują związki fosfatydylowe, takie jak fosfatydyloglicerol, fosfatydylocholina, fosfatydyloseryna, fosfatydyloetanolamina, sfingolipidy, cerebrozydy i gangliozydy. Ilustracyjne fosfolipidy obejmują fosfatydylocholinę jaja, dipalmitoilofosfatydylocholinę oraz distearoilofosfatydylocholinę.

Kierowanie liposomów do celu jest również możliwe w oparciu na przykład o swoistość wobec narządu, swoistość komórkową oraz swoistość organellarną i jest znane w dziedzinie.

Sposoby zapobiegania albo leczenia powyższych stanów medycznych przy użyciu zmodyfikowanych propeptydów GDF można również zastosować do hamowania innych białek w nadrodzinie TGF-31. Wiele z tych białek jest spokrewnionych strukturalnie z GDF-8, tak jak BMP-11. A zatem, opisano niniejszym sposoby leczenia wspomnianych powyżej schorzeń poprzez podawanie zmodyfikowanego propeptydu GDF zdolnego do hamowania biała innego niż GDF-8, samego albo w kombinacji ze zmodyfikowanym propeptydem GDF wobec GDF-8.

Kompozycje zmodyfikowanych propeptydów GDF

Niniejszy wynalazek dostarcza kompozycji zawierających zmodyfikowane propeptydy GDF. Takie kompozycje mogą być odpowiednie do zastosowania farmaceutycznego i podawania pacjentom. Kompozycje zawierają zazwyczaj jeden albo większą liczbę zmodyfikowanych propeptydów według niniejszego wynalazku i dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę. Stosowany tu określenie „farmaceutycznie dopuszczalna zaróbka” ma obejmować dowolny i wszystkie rozpuszczalniki, podłoża dyspersyjne, powłoki, czynniki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybowe, czynniki izotoniczne i opóźniające absorpcję i tym podobne, odpowiednie do podawania farmaceutycznego. Stosowanie takich podłóż i czynników dla substancji farmaceutycznie czynnych jest dobrze znane w dziedzinie. Przykładowe farmaceutycznie dopuszczalne zarobki można znaleźć w „The Handbook of Pharmaceutical Excipients” wyd. 3, 2000, Am. Pharmaceutical Press, A.E. Kibbe, wyd. Kompozycje mogą również zawierać inne związki aktywne dostarczające uzupełniających, dodatkowych albo wzmocnionych funkcji terapeutycznych. Kompozycje farmaceutyczne mogą być zawarte w pojemniku, opakowaniu lub dozowniku razem z instrukcjami podawania.

Kompozycję farmaceutyczną według wynalazku wytwarza się tak, aby była odpowiednia do zamierzonej drogi jej podawania. Sposoby przeprowadzania podawania są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. Możliwe może być również otrzymywanie kompozycji, które można podawać miejscowo albo doustnie albo które mogą mieć zdolność przechodzenia przez błony śluzowe. Podawanie może być, na przykład dożylne (I.V.), dootrzewnowe (I.P.). domięśniowe (I.M.), dojamowe, podskórne (S.C.) albo przezskórne. Korzystne wykonania obejmują zastrzyki LV., I.P., I.M. i S.C. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku mogą być podawane dożylnie.

Rozwory lub zawiesiny stosowanie przy podawaniu doskórnym lub podskórnym zawierają zazwyczaj jeden albo więcej następujących składników: sterylny rozcieńczalnik, taki jak woda do zastrzyków, roztwór soli fizjologicznej, utrwalone oleje, glikole polietylenowe, gliceryna, glikol polietylenowy i inne rozpuszczalniki syntetyczne; czynniki przeciwbakteryjne, takie jak alkohol benzylowy lub metyloparabeny; przciwutleniacze, takie jak kwas askorbinowy lub wodorosiarczyn sodowy; czynniki chelatujące, takie jak kwas etylenodiaminotetraoctowy; bufory, takie jak octany, cytryniany lub fosforany oraz czynniki do ustalania ciśnienia osomotycznego, takie jak chlorek sodowy lub dekstroza. pH może być ustalone przy użyciu kwasów lub zasad, takich jak kwas solny lub wodorotlenek sodowy. Preparaty pozajelitowe mogą być zamknięte w ampułkach, jednorazowych strzykawkach albo wielodawkowych fiolkach wykonanych ze szkła albo plastyku.

Kompozycje farmaceutyczne odpowiednie do stosowania w zastrzykach obejmują jałowe roztwory wodne lub zawiesiny i sterylne proszki do przygotowania jałowych roztworów lub zawiesin bezpośrednio przed wstrzyknięciem. Do podawania dożylnego odpowiednie nośniki obejmują sól fizjologiczną, wodę

PL 212 078 B1 bakteriostatyczną, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) lub roztwór soli buforowany fosforanem (PBS). We wszystkich przypadkach kompozycje muszą być jałowe i powinny być płynne, tak aby mogły być łatwo podawane strzykawką. Muszą być one stabilne w warunkach produkcji oraz przechowywania i muszą być chronione przed zanieczyszczającym działaniem mikroorganizmów, takich jak bakterie i grzyby. Nośnikiem może być rozpuszczalnik lub podłoże rozpraszające zawierające na przykład wodę, etanol, poliol (na przykład glicerol, glikol propylenowy oraz płynny glikol polietylenowy i tym podobne) oraz odpowiednie ich mieszaniny. Może być utrzymana odpowiednia płynność na przykład poprzez zastosowanie powlekania, takiego jak lecytyną, przez utrzymanie pożądanej wielkości cząstek w przypadku zawiesin i przez stosowanie związków powierzchniowo czynnych. Zapobieganie działaniu mikroorganizmów można uzyskać za pomocą różnych czynników przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybowych, na przykład parabenów, chlorobutanolu, fenolu, kwasu askorbinowego, timerosalu i tym podobnych. W wielu przypadkach będzie korzystne włączenie do kompozycji czynników izotonicznych, na przykład cukrów, polialkoholi, takich jak mannitol, sorbitol, chlorek sodu. Przedłużoną absorpcję związków w zastrzykach można uzyskać poprzez włączenie do kompozycji czynnika, który opóźnia absorpcję, na przykład monostearynianu glinu i żelatyny.

Kompozycje doustne generalnie zawierają bierny rozcieńczalnik lub jadalny nośnik. Na przykład, mogą być one zamknięte w żelatynowych kapsułkach albo sprasowane w tabletki. Dla celów terapeutycznego podawania doustnego, propeptydy GDF mogą być włączone razem z zarobkami i używany w postaci tabletek, kołaczyków lub kapsułek. Odpowiednie farmaceutycznie czynniki wiążące i/lub materiały adiuwantowe mogą być włączone jako część kompozycji. Tabletki, pigułki, kapsułki, kołaczyki i temu podobne mogą zawierać dowolny z następujących lub związki o podobnej naturze: czynnik wiążący, taki jak celuloza mikrokrystaliczna, guma tragakantowa lub żelatyna; zaróbkę, taką jak skrobia lub laktoza, środek rozpraszający, taki jak kwas alginowy, Primogel lub skrobia kukurydziana; smar, taki jak stearynian magnezowy lub Sterotes; środek poślizgowy, taki jak koloidalny dwutlenek silikonu; środek słodzący, taki jak sacharoza lub sacharyna albo środek smakowy, taki jak mięta pieprzowa, salicynian metylowy albo aromat pomarańczowy.

Przy podawaniu przez inhalację propeptydy GDF można dostarczać w postaci aerozolu z pojemnika ciśnieniowego albo dozownika, który zawiera odpowiednie propelenty, np. gaz, taki jak dwutlenek węgla, albo nebulizatora.

Podawanie ogólnoustrojowe może odbywać się również sposobami przezśluzówkowymi lub przezskórnymi. Przy podawaniu przezśluzówkowym lub przezskórnym w kompozycji stosuje się czynniki penetrujące odpowiednie dla bariery, która ma być pokonywana. Takie czynniki penetrujące są generalnie znane w dziedzinie i obejmują na przykład, do podawania przezskórnego, detergenty, sole żółciowe i pochodne kwasu fusydowego. Podawanie przezśluzówkowe można przeprowadzić poprzez zastosowanie rozpylaczy i czopków donosowych. Do podawania przezskórnego, związki aktywne mogą być przygotowane w postaci maści, balsamów, żeli, kremów, jak jest to ogólnie znane w dziedzinie.

Propeptydy GDF można również wytwarzać w postaci czopków (np. z konwencjonalnymi podłożami podstawowymi do czopków, takimi jak masło kakaowe lub inne glicerydy) lub utrzymujące się wlewy do podawania doodbytowego.

W jednym z wykonań, propeptydy GDF są przygotowywane z nośnikami, które będą chronić związek przed szybką eliminacją z ciała, takie jak kompozycje o kontrolowanym uwalnianiu, włączając w to implanty i systemy dostarczania w mikrokapsułkach. Można zastosować ulegające biodegradacji, zgodne biologicznie polimery, takie jest octan etylenowinylowy, polianhydrydy, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Sposoby wytwarzania takich kompozycji będą oczywiste dla specjalisty w dziedzinie. Materiały można również nabyć w Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc. Jako farmaceutycznie dopuszczalne nośniki można również zastosować zawiesiny liposomowe zawierające zmodyfikowane propeptydy GDF. Mogą być one wytwarzane według znanych metod znanych specjalistom w dziedzinie, na przykład jak opisano w patencie USA nr 4522811.

Jest szczególnie korzystne wytwarzanie kompozycji doustnych lub pozajelitowych w postaci jednostkowych dawek dla łatwości podawania i jednorodności dawkowania. Stosowane tu dawki w formie jednostkowej dotyczą fizycznie odrębnych jednostek odpowiednich jako jednostkowe dawki dla osobnika, który ma być leczony; każda jednostka zawiera z góry ustaloną ilość związku aktywnego wyliczoną tak, by dała pożądany efekt terapeutyczny w połączeniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym. Ustalenie postaci dawki jednostkowej według wynalazku jest dyktowane i bezpośrednio uzależnione od unikatowych właściwości związku aktywnego i konkretnego efektu terapeutycznego,

PL 212 078 B1 który ma zostać osiągnięty oraz ograniczeń właściwych dziedzinie wytwarzania takiego aktywnego związku w celu leczenia osobników.

Toksyczność i leczniczą skuteczność takich związków można określić dzięki standardowym procedurom farmaceutycznym w hodowlach komórek lub na zwierzętach doświadczalnych, np. poprzez określenie LD50 (dawka letalna dla 50% populacji) i ED50 (dawka skuteczna leczniczo dla 50% populacji). Proporcja pomiędzy toksycznością a skutecznością leczniczą dawki stanowi wskaźnik terapeutyczny i można go wyrazić jako stosunek LD50/ED50. Korzystne są propeptydy GDF, które wykazują wysokie wskaźniki terapeutyczne.

Dane otrzymane z testów na hodowlach komórkowych i badań na zwierzętach można użyć w ustalaniu zakresu dawki, która jest nietoksyczna przy stosowaniu u ludzi. Korzystne jest, jeżeli dawka takich związków mieści się w zakresie stężeń w obiegu, które obejmują ED50 o małej lub bez toksyczności. Dawka może być zróżnicowana w tym zakresie, w zależności od postaci zastosowanej dawki i użytej drogi podawania. Dla dowolnego propeptydu GDF stosowanego w niniejszym wynalazku skuteczną leczniczo dawkę można ustalić wyjściowo z testów opartych na hodowlach komórkowych. Dawkę można ustalić w modelach zwierzęcych, tak aby uzyskać stężenie w krążącym osoczu w zakresie, który obejmuje IC50 (tj. stężenie testowanego propeptydu GDF, przy którym uzyskuje się połowę maksymalnego zahamowania objawów) jak określono w hodowli komórkowej. Poziomy w osoczu można mierzyć na przykład poprzez wysokosprawną chromatografię cieczową. Efekty poszczególnych dawek można śledzić przy zastosowaniu odpowiedniego testu biologicznego. Przykłady odpowiednich testów biologicznych obejmują testy oparte na replikacji DNA, testy w oparciu o transkrypcję, testy wiązania białko GDF/receptor, testy dla kinazy kreatynowej, testy oparte na różnicowaniu prekursorów komórek tłuszczowych, testy oparte na pobieraniu glukozy przez komórki tłuszczowe oraz testy immunologiczne.

Następujące przykłady dostarczają korzystnych wykonań wynalazku.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1: Oczyszczanie GDF-8

Kondycjonowaną pożywkę z wybranych linii komórkowych wyrażających zrekombinowane ludzkie białko GDF-8 (dojrzały GDF-8 + propeptyd GDF-8) zakwaszono do pH 6,5 i naniesiono na kolumnę anionowymienną POROS HQ 80 x 50 mm w tandemie z kolumną kationowymienną POROS SP 80 x 50 mm (Perseptive Biosystems). Wypływ doprowadzano do pH 5,0 i nakładano na kolumnę kationowymienną POROS SP 75 x 20 mm (Perseptive Biosystems) i wymywano gradientem NaCl. Frakcje zawierające GDF-8, co wykazano poprzez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z siarczanem dodecylu (SDS-PAGE), połączono, zakwaszono kwasem trifluorooctowym (TFA) do pH 2-3, a następnie doprowadzono do 200 ml 0,1% TFA w celu obniżenia lepkości. Pulę nałożono następnie na kolumnę C5 250 x 21,2 mm (Phenomenex), co było poprzedzone przez kolumnę wstępną (guard) 60 x 21,2 mm (Phenomenex) i wymywano gradientem TFA/CH3CN, w celu oddzielenia dojrzałego GDF-8 od propeptydu GDF-8. Połączone frakcje zawierające dojrzały GDF-8 zatężono poprzez liofilizację w celu usunięcia acetonitrilu i dodano 20 ml 0,1% TFA. Próbkę nałożono następnie na kolumnę C5 250 x 10 mm (Phenomenex) ogrzaną do 60°C w celu ułatwienia rozdziału. Powtarzano to do czasu, kiedy nie uzyskiwano już dalszego rozdziału. Frakcje zawierające dojrzały GDF-8 łączono następnie i doprowadzano do 40% acetonitrylu nakładano na kolumnę do sączenia molekularnego BioSep S-3000 600 x 21,2 (Phenomenex) co było poprzedzone przez kolumnę wstępną 60 x 21,2. Frakcje zawierające oczyszczony dojrzały GDF-8 łączono i zatężano do użycia w kolejnych doświadczeniach. Typowy uzysk dimeru dojrzałego GDF-8 wynosił 0,33 mg białka na litr kondycjonowanej pożywki.

Frakcje z kolumny C5 zawierające propeptyd GDF-8 łączono i usuwano acetonitryl poprzez odparowanie, dodawano 20 ml 0,1% TFA i próbkę wstrzykiwano na kolumnę C5 250 x 10 mm w 60°C. Powtarzano to do czasu, kiedy nie uzyskiwano już dalszego rozdziału. Frakcje zawierające propeptyd GDF-8 łączono następnie i doprowadzano do 40% acetonitrylu nakładano na kolumnę do sączenia molekularnego BioSep S-3000 600 x 21,2 (Phenomenex) co było poprzedzone przez kolumnę wstępną 60 x 21,2. Frakcje zawierające oczyszczony propeptyd GDF-8 łączono i zatężano do użycia w kolejnych doświadczeniach. Typowy uzysk propeptyd GDF-8 wynosił 0,24 mg białka na litr kondycjonowanej pożywki.

Na SDS-PAGE, oczyszczony dojrzały GDF-8 migrował jako szeroki prążek o wielkości 25 kDa w warunkach nieredukujących i 13 kD w warunkach redukujących. Podobny profil SDS-PAGE opisano dla mysiego GDF-8 (McPherron i wsp. (1997) Nature 387:83-90) i odzwierciedla to dimerową naturę dojrzałego białka.

PL 212 078 B1

Widoczna masa cząsteczkowa oczyszczonego propeptydu GDF-8 wynosiła 38 kDa zarówno w warunkach redukujących jak i nieredukujących. Wskazuje to, że propeptyd GDF-8 jest monomeryczny. Różnica w widocznej masie cząsteczkowej i przewidywanej masie cząsteczkowej propeptydu GDF-8, ~ 26 kDa może odzwierciedlać dodanie węglowodanu, ponieważ sekwencja aminokwasową zawiera potencjalne miejsce glikozylacji poprzez N (McPherron i wsp. (1997) Proc. Natl. Acad Sci. USA 94:12457-12461). A zatem, powyższy proces doprowadził do wytworzenia oczyszczonego i aktywnego dimeru dojrzałego GDF-8 i propeptydu GDF-8.

P r z y k ł a d 2: Charakterystyka oczyszczonego zrekombinowanego ludzkiego GDF-8 μg każdego, oczyszczonego dojrzałego GDF-8 i oczyszczonego propeptydu GDF-8 zmieszano i dializowano w 50 mM fosforanie sodowym, pH 7,0 i poddano chromatografii na kolumnie do sączenia molekularnego BioSep S-3000 300 x 7,8 mm (Phenomenex). Masę cząsteczkową kompleksu dojrzały GDF-8/propeptyd ustalono na podstawie czasu wymywania stosując standardy masy molekularnej (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) poddane chromatografii na tej samej kolumnie.

Kiedy oczyszczony propeptyd GDF-8 inkubowano z oczyszczonym dojrzałym GDF-8 w pH obojętnym, dwa białka wydawały się tworzyć kompleks, na co wskazywał profil sączenia molekularnego. Pierwszy pik białkowy wymywany po 12,7 minutach miał szacunkową masę cząsteczkową 78 kDa, na podstawie ciężaru molekularnego standardów (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) poddane chromatografii na tej samej kolumnie.

Wielkość kompleksu odpowiada najlepiej jednemu dimerowi dojrzałego GDF-8 połączonemu z dwoma monomermi propeptydu, tworzącym kompleks tetrameryczny.

W celu potwierdzenia tej obserwacji, preparat zawierający zarówno dojrzały GDF-8 jaki i propeptyd GDF-8 inkubowano z lub bez 100 mM chlorowodorku 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodiamidowego (EDC, Pierce) przez 1 godz. w temperaturze pokojowej, zakwaszano HCl do pH 2-3 i zatężano na zatężaczu Micron-10 (Amicon) do SDS-PAGE, stosując 10% żel akryloamidowy buforowany tricyną. Białka uwidaczniano poprzez barwienie błękitem Coomassie. Pasmo odpowiadające masie cząsteczkowej około 75 kD obserwowano jedynie w próbce z dodanym EDC, ale nie w ścieżce kontrolnej, co potwierdza obecność kompleksu dojrzały GDF-8/propeptyd. To uwiarygodnia test jako przydatny do mierzenia aktywności i stężenia oczyszczonego dimeru dojrzałego GDF-8.

P r z y k ł a d 3: Aktywność biologiczna oczyszczonego GDF-8 in vitro

W celu wykazania aktywności GDF-8, opracowano test genu reporterowego (RGA) z zastosowaniem sekwencji wektora reporterowego pGL3(CAGA)12 połączonej z lucyferazą. Wcześniej opisano, że sekwencja CAGA jest sekwencją odpowiadającą na TGF-β, w obrębie promotora genu indukowanego TGF-β, PAI-1 (Dennler i wsp. (1998) EMBO J. 17:3091-3100).

Wektor reporterowy zawierający 12 bloków CAGA wytworzono przy użyciu podstawowego wektora reporterowego pGL3 (Promega Corporation, Madison, WI, USA, Nr kat. El751). Blok TATA i miejsce inicjacji transkrypcji z głównego późnego promotora adenowirusa (-35/+10) wstawiono pomiędzy miejsca Bglll i Hindlll. Oligonukleotydy zawierające dwanaście powtórzeń bloków CAGA, AGCCAGACA, połączono i sklonowano w miejscu XhoI. Linię komórkową ludzkiego mięsakomięśniaka prążkowanego, A204 (ATCC HTB-82), transfekowano przejściowo pGL3(CAGA) stosując odczynnik do transfekcji FuGENE 6 (Roche Diagnostics, Indianapolis, USA, Nr kat. 1814443). Po transfekcji, komórki hodowano na 48-studzienkowych płytkach w pożywce McCoy's 5A (Life Technologies, Rockville, Maryland, USA, Nr kat. 21500-079) uzupełnionej 2 mM glutaminą, 100 jend./ml streptomycyny, 100 μg/ml penicyliną i 10%) płodową surowicą cielęcą przez 16 godz. Komórki traktowano następnie GDF-8, BMP-11 lub aktywiną w pożywce McCoy's 5A z glutaminą, streptomycyną, penicyliną i 1 mg/ml albuminy z surowicy bydlęcej przez 6 godz. w 37°C. Lucyferazę oceniano ilościowo w traktowanych komórkach stosując system do testowania lucyferazy Luciferase Assay System (Promega Corporation, Madison, WI, USA, Nr kat. El483). Wyniki są przedstawione na fig. 1. Dla GDF-8, wyniki są wyrażone jako średnia ±S.E. dla trzech odrębnych doświadczeń. Dla BMP-11 i aktywiny, wyniki są reprezentatywne dla dwóch odrębnych doświadczeń.

Wyniki pokazują, że GDF-8 maksymalnie aktywował konstrukt reporterowy 10-krotnie, z ED50 wynoszącą 10 ng/ml dla GDF-8, co wskazuje że oczyszczony zrekombinowany GDF-8 był aktywny biologicznie. BMP-11, który jest w 90% identyczny z GDF-8 na poziomie aminokwasowym (Garner i wsp. (1999) Dev. Biol. 208:222-232 i Nakashima i wsp. (1999) Mech. Dev. 80:185-189) oraz aktywina wzbudzały podobną odpowiedź biologiczną, co wskazuje, że test dla genu reporterowego jest odpowiednim testem do wykrywania aktywności biologicznej GDF-8, BMP-11 lub aktywiny.

PL 212 078 B1

P r z y k ł a d 4: Właściwości wiązania oczyszczonego GDF-8

Kompleks GDF-8 w stanie latencji poddano biotynylacji przy stosunku 20 moli EZ-link SulfoNHS-Biotin (Pierce, Rockford, Illinois, USA, Nr kat. 21217) do 1 mola kompleksu GDF-8 przez 2 godziny na lodzie, inaktywowano 0,5% TFA i poddano chromatografii na kolumnie C4 Jupiter 250 x 4,6 mm (Phenomenex) w celu oddzielenia dojrzałego GDF-8 od propeptydu GDF-8. Frakcje biotynylowanego dojrzałego GDF-8 wymyte gradientem TFA/CH3CN gradient łączono, zatężano i oceniano ilościowo przy użyciu zestawu MicroBCA protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, IL, USA, Calo No. 23235).

Zrekombinowaną chimerą ActRIIB-Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA Nr kat. 339-RB/CF) powlekano 96-studzienkowe płaskodenne płytki testowe (Costar, NY, Nr kat. 3590) w stężeniu μg/ml w 0,2 M węglanie sodowym przez noc w 4°C. Płytki blokowano następnie 1 mg/ml albuminy z surowicy bydlęcej i przemywano postępując zgodnie ze standardowym protokołem ELISA. 100 μΐ próbki biotynylowanego GDF-8 w różnych stężeniach dodawano do blokowanej płytki ELISA, inkubowano przez 1 godz., przemywano i ilość związanego GDF-8 wykrywano przy użyciu streptawidynaperoksydaza chrzanowa (SA-HRP, BD PharMingen, San Diego, CA, USA, Nr kat. 13047E), z następującym po tym dodaniem TMB (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA, Nr kat. 50-76-04). Pomiary kolorymetryczne wykonywano przy 450 nM w czytniku płytek Molecular Devices microplate reader.

Jak pokazano na fig. 2, biotynylowany GDF-8 wiąże się z ActRIIB, przypuszczalnym receptorem GDF-8 typu II z ED50 12 ng/ml, co wskazuje, że test wiązania ActRII jest czułym testem wiązania in vitro dla GDF-8.

P r z y k ł a d 5: Hamowanie GDF-8 i BMP-11 przez propeptyd GDF-8

Kiedy GDF-8 inkubowano wstępnie z propeptydem GDF-8 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aktywność biologiczna GDF-8 była zmniejszona. Fig. 3 pokazuje indukcję aktywności reportera pGL3(CAGA)12 przy ED50 dla GDF-8, 10 ng/ml, w obecności propeptydu GDF-8. Propeptyd GDF-8 zmniejszał indukcję GDF-8 w sposób zależny od dawki, z IC50 wynoszącą 25 ng/ml (0,6 nM). Propeptyd GDF-8 hamował również tym samym stopniu aktywność biologiczną BMP-11 w. W przeciwieństwie do tego, propeptyd GDF-8 nie miał wpływu na aktywność aktywiny w tym teście prawdopodobnie na skutek stosunkowo niskiej homologii pomiędzy GDF-8 i aktywiną, w porównaniu z GDF-8 i BMP-11.

Analogicznie, fig. 4 pokazuje, że inkubacja wstępna propeptydu GDF-8 z biotynylowanym GDF-8 w stężeniu 5 ng/ml hamowała wiązanie się GDF-8 z ActRIIB w teście wiązania ActRIIB, jak opisano w przykładzie 4, z IC50 wynoszącą 0,3 nM. Konkludując, propeptyd GDF-8 według wynalazku jest silnym subnanomolowym inhibitorem aktywności GDF-8 i BMP-11 in vitro, co zmierzono w teście genu repotretowego i teście wiązania ActRIIB. A zatem, test ten pokazuje że propeptyd GDF-8 jest aktywny jako silny inhibitor aktywności GDF-8 w tym teście.

P r z y k ł a d 6: Hamowanie wiązania receptora GDF-8 przez propeptyd GDF-8

GDF-8 połączono z jodem przy użyciu chloraminy T jak opisano w Frolik i wsp. (1984) J Biol. Chem. 259:10995-10999 do aktywności specyficznej 100-200 uCi^g. Jodowany-GDF-8 wykazywał porównywalną aktywność biologiczną do niewyznakowanego GDF-8 w teście reporterowym (CAGA) opisanym w Przykładzie 3. Wyznakowany 125I GDF-8 oceniano pod kątem specyficznego wiązania z liną komórkową mioblastów, L6.

Linię komórkową mioblastów L6 (ATCC CRL-1458) hodowano do konfluencji w pożywce Eagla zmodyfikowanej przez Dulbecco uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą na pokrytych żelatyną 24-studzienkowych płytkach. Wiązanie w stanie równowagi przeprowadzono jak opisano w Song i wsp. (1995) Endocrinology 136:4293-4297. 1 ng/ml ¹²⁵I GDF-8 (z lub bez wyznakowanego GDF-8) inkubowano z konfluentnymi komórkami L6 przez 4 godziny w 4°C. Po przemyciu

125 komórek, związany [¹²⁵I]GDF-8 ekstrahowano i oceniano ilościowo w liczniku gamma. Wyniki są wyrażone jako średnia ±S.E. z trzech oznaczeń i reprezentują trzy odrębne doświadczenia.

125

Jak pokazano na fig. 5, ¹²⁵I-GDF-8 wiąże się z komórkami L6 z wysokim powinowactwem. War125 to zaznaczyć, że BMP-11, ale nie TGF-βΗ zastępuje wiązanie I-GDF-8, co wskazuje, że GDF-8 i BMP-11 (ale nie TGF-βΏ mają wspólny receptor na tych komórkach (dane nie pokazane). Na pod125 stawie analizy Scatchard wiązania GDF-8, Kd oceniono na 140 pM. Ponadto, kiedy 1 ng/ml ¹²⁵I-GDF-8 inkubowano wstępnie z propeptydem GDF-8 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej specyficzne wiązanie GDF-8 z komórkami L6 mogło być hamowane wraz ze wzrastającymi stężeniami niewyznakowanego propeptydu GDF-8 propeptyd (fig. 6). Wyniki są wyrażone jako średnia +S.E. z trzech oznaczeń i reprezentują dwa odrębne doświadczenia. IC50 dla 1 ng/ml GDF-8 wynosiło 140 ng/ml

PL 212 078 B1 propeptydu GDF-8. Co widać z tych danych propeptyd GDF-8 hamuje aktywność biologiczną GDF-8 poprzez blokowanie wiązania receptora GDF-8.

P r z y k ł a d 7: Hamowanie aktywności GDF-8 przez białko fuzyjne propeptyd GDF-8-Fc

Jak pokazano w przykładzie 8 poniżej, propeptyd mysiego GDF-8 miał stosunkowo krótki okres półtrwania in vivo. W celu zwiększenia dostępności biologicznej propeptydu GDF-8, skonstruowano białka fuzyjne między propeptydem GDF-8 i regionem Fc mysiej IgG2a przy zastosowaniu standardowych technik inżynierii genetycznej.

Do regionu Fc wprowadzono cztery mutacje w celu zmniejszenia funkcji efektorowych, jak opisano w Steurer i wsp. (1995) J: Immunol. 155:1165-1174. Stosując standardową metodologię PCR wytworzono dwa konstrukty fuzyjne poprzez połączenie cDNA kodującego propeptyd mysiego GDF-8 (aminokwasy 1-267) regionem Fc mysiej IgG2a (fig. 7). Fuzja 1 (fig. 7A) koduje pierwszych 265 aminokwasów propeptydu mysiego GDF-8 (włączając w to 24-aminokwasowy lider sekrecyjny) połączonych w ramce z 233 aminokwasami regionu Fc mysiej IgG2a począwszy od pierwszego aminokwasu w części zawiasowej. Fuzja 2 (fig. 7B) jest skonstruowana w podobny sposób co Fuzja 1, z tą różnicą, że krótki łącznik glicyna-seryna-glicyna-seryna (GSGS) oddziela propeptyd GDF-8 od mysiego regionu Fc.

Dwie chimery wprowadzono do eukariotycznego wektora ekspresyjnego, pED (Kaufman i wsp. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4485-4490) i wyrażono przejściowo w komórkach COS-1 M6 (Horowitz i wsp. (1983) Journal of Molecular and Applied Genetics 2:147-159), stosując odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000 (Gibco BRL, Life Technologies, Rockviile, Maryland, USA, Nr kat. 11668-019) zgodnie z protokołem producenta. Po 24 godzinach inkubacji dodano R1CD1 (zmodyfikowana wolna od surowicy pożywka hodowlana DMEM/F12). Kondycjonowaną pożywkę (CM, od ang. conditioned media) zebrano, zastąpiono świeżą R1CD1 i CM zabrano ponownie 60 godzin później. Kondycjonowaną pożywkę połączono i oczyszczono przy użyciu Protein A Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, England, Nr kat. 17-07080-01) po dodaniu 1/10 objętości 1 M Tris pH 8,0. Oczyszczone białko wymyto w 0,1 M kwasie octowym, 150 mM NaCl i natychmiast zobojętniano 1/20 objętości 3M Tris pH 9,0. Białka oceniano ilościowo stosując standardowy protokół ELISA dla mysiej IgG, i testowano w kompetycyjnym teście ELISA dla wiązania ActRIIB razem z oczyszczonym propeptydem ludzkiego GDF-8, jak opisano w przykładzie 5. Wyniki są pokazane na fig. 8. IC50 dla fuzji propeptyd GDF-8-Fc są w niskim nanomolowym zakresie i nie ma różnicy między fuzją 1 i 2. Fuzję 1 (bez łącznika pomiędzy propeptydem GDF-8 i mysią IgG2a) wybrano do użycia przy wytwarzaniu stabilnej linii komórek CHO i testowano pod kątem hamowania GDF-8 w teście RGA.

cDNA propeptyd GDF-8-Fc klonowano w plazmidzie pHTop do ekspresji CHO i transfekowano do komórek CHO/A2, jak opisano w Thies i wsp. (2001) Growth Factors 18:251-259.

Wyprowadzono stabilną linię (PF-4/0,02) poprzez selekcjonowanie komórek w 0,02 M metotreksanie. Kondycjonowaną pożywkę zawierającą białko fuzyjne propeptyd GDF-8-Fc z wyselekcjonowanej linii zebrano i jego pH doprowadzono poprzez dodanie 10% obj./obj. 1 M Tris pH 8,0 i oczyszczono nad złożem Pharmacia rProteinA Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, England. Nr kat. 17-1279-02) zrównoważonym uprzednio 50 mM Tris 150 mM NaCl pH 7,5. Frakcje wymywano 100 mM kwasem octowym, 150mM NaCl pH 2,5 i natychmiast zobojętniano 5% obj./obj. 3M Tris pH 9,0. Frakcje z piku łączono i nakładano na kolumnę do sączenia molekularnego Pharmacia Superdex 200 Size Exclusion Column (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA. England, Nr kat. 17-1069-01). Do frakcji dodawano 0,05% Tween 80 w celu zapobiegania agregacji. Frakcje oceniano ilościowo poprzez SDS-PAGE na żelach Novex 10% Tricine (Novex, San Diego, CA, USA, Nr kat. EC66755).

Połączone frakcje oceniano ilościowo poprzez spektrofotometrię i testowano pod kątem aktywności w teście wiązania ActRIIB jak opisano w przykładzie 4, jak również w teście genu reporterowego (fig. 9). IC50 oczyszczonej fuzji propeptyd GDF-8-Fc wynosiło 1,3 nM. Dane pokazują, że zmodyfikowany propeptyd GDF według wynalazku będący białkiem fuzyjnym propeptyd GDF-8-Fc ma zachowaną silną aktywność hamującą (neutralizującą) w porównaniu z propeptydem GDF-8.

P r z y k ł a d 8: Farmakokinetyka

Farmakokinetykę (PK) propeptydu GDF-8 (określanego tu jako „GDF8-Pro”) i białka fuzyjnego propeptyd GDF-8-Fc (określanego tu jako „GDFS-ProFc”) oceniano u myszy C57B1/6J w dawce 0,2 ^g/mysz (GDF8-Pro) lub 2 μg/mysz (GDF8-ProFc) po pojedynczym podaniu dożylnym. Zwierzęta

125 otrzymywały mieszaninę niewyznakowanego i wyznakowanego ¹²⁵I GDF8-Pro lub GDF8-ProFc 125 w dawkach wymienionych powyżej i stężenie w surowicy oceniano na podstawie radioaktywności ¹²⁵I w surowicy i aktywności specyficznej wstrzykiwanej dawki. Fig. 10 pokazuje stężenie w surowicy

PL 212 078 B1 względem czasu dla obydwu, GDF8-Pro i GDF8-ProFc. Tabela 1 pokazuje parametry PK dla GDF8-Pro i GDF8-ProFc ) po pojedynczym podaniu dożylnym w ilości 2 μg/mysz. Stężenia w surowicy i parametry PK dla GDF8-Pro normalizowano do dawki 2 (ig/mysz dla celów porównania.

T a b e l a 1

	T 1/2 (godz.)	Cmax (ng/ml)	Zanik (ml/godz.)	MRT (godz.)	VI (ml)	Vss (ml)
GDF8-ProFc	232	1392	0,03	286	1,4	8,7
GDF-8-Pro	2,2	390	12,4	2,3	5,1	28,3

T1/2: czas trwania w fazie ostatecznej eliminacji.

Cmax: pik stężenia w surowicy

MRT: średni czas obecności

V1: wyjściowa objętość dystrybucji

Vss: objętość dystrybucji w stanie równowagi

Uwaga: Parametry PK dla GDF8-Pro normalizowane dla dawki 2 μg/mysz.

Jak można zobaczyć na Fig. 10, zanik jest 400-krotnie wolniejszy i okres półtrwania 100-krotnie dłuższy dla GDF8-ProFc w porównaniu z GDF8-Pro. Zarówno wyjściowa objętość dystrybucji jak i objętość dystrybucji w stanie równowagi są około 3-krotnie większe dla GDF8-Pro w porównaniu z GDF8-ProFc, co wskazuje, że większy zasięg dystrybucji GDF8-Pro poza przestrzeń naczyniową w porównaniu z GDF8-ProFc.

Jakkolwiek efekt stabilizacyjny regionu Fc cząsteczki IgG na propeptyd GDF jest pokazany na przykładzie białka fuzyjnego propeptyd mysiego GDF-8-Fc (tj. obydwa składniki pochodzące z myszy), sposoby według niniejszego wynalazku można zastosować w dowolnej kombinacji składników: propeptyd GDF i IgG, bez względu na konkretne białko prekursorowe i gatunek zwierzęcia z którego składniki pochodzą, przy założeniu, że białko fuzyjne jest prawidłowo skonstruowane w celu zachowania aktywności (tj., jak tu opisano).

P r z y k ł a d 9: Pochodzenie i aktywność dwóch ludzkich białek fuzyjnych propeptyd GDF-8-Fc

Przygotowano dwa konstrukty fuzji GDF-8-Fc, stosując standardową metodologię PCR, w celu oceny potencjału terapeutycznego. cDNA kodujący ludzki propeptyd GDF-8 (SEK NR ID:5) połączono z regionem Fc ludzkiej IgG2a (SEK NR ID: 15; fig. 11 A) lub Fc ludzkiej IgG1 zmodyfikowanym dla zmniejszenia funkcji efektorowych (SEK NR ID: 16; fig. 11B).

1. Białko fuzyjne ludzki propeptyd GDF-8-wt Fc IgG1 (fig. 11A):

Pierwszych 264 aminokwasów propeptydu ludzkiego GDF-8 (włączając w to aminokwasy 1-241 z SEK NR ID: 5 i 23-aminokwasowy lider sekrecyjny jak przedstawiono w SEK NR ID: 13) połączono w ramce z 232 aminokwasami regionu stałego ludzkiej IgGl począwszy od pierwszego aminokwasu w części zawiasowej (SEK NR ID: 15).

2. Ludzki propeptyd GDF-8-mutant IgG1 (fig. 11B):

Pierwszych 264 aminokwasów propeptydu ludzkiego GDF-8 jak opisano powyżej połączono w ramce z 227 aminokwasami zmutowanego regionu Fc ludzkiej IgGl (SEK NR ID:16). Wprowadzono dwie mutacje, reszty alaninowe (Ala-14 i Ala-17), jak przedstawiono w SEK NR ID: 16 w celu order zmniejszenia funkcji efektorowej jak opisano w Lund i wsp. (1991) J. Immun. 147:2657-2662 oraz Morgan i wsp. (1995) Immunology 86:319-324.

Białka fuzyjne wprowadzono do wektora eukariotycznego, pED (Kaufman i wsp. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4485-4490) i wyrażono przejściowo w komórkach COS-1 M6 (Horowitz i wsp. (1983) Journal of Molecular and Applied Genetics 2:147-159), stosując odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000 (Gibco BRL, Life Technologies, Rockviile, Maryland, USA, Nr kat. 11668-019) zgodnie z protokołem producenta. Po 24 godzinach inkubacji dodano R1CD1 (zmodyfikowana wolna od surowicy pożywka hodowlana DMEM/F12). Kondycjonowaną pożywkę (CM) zebrano, zastąpiono świeżą R1CD1 i CM zabrano ponownie 60 godzin później. Kondycjonowaną pożywkę połączono i oczyszczono przy użyciu Protein A Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, Anglia, Nr kat. 17-07080-01) po dodaniu 1/10 objętości 1 M Tris pH 8,0. Oczyszczone białko wymyto w 0,1 M kwasie octowym, 150 mM NaCl i natychmiast zobojętniano 1/20 objętości 3M Tris pH 9,0. Białka oceniano ilościowo stosując standardowy protokół ELISA dla ludzkiej IgG i testowano w teście wiązania ActRIIB razem z oczyszczonym propeptydem ludzkiego GDF-8, jak opisano w przykładzie 5.

PL 212 078 B1

Wyniki są pokazane na Fig. 8. Konkludując, obydwie fuzje ludzki propeptyd-Fc są silnymi inhibitorami wiązania się GDF-8 z ActRIIB.

P r z y k ł a d 10: Testowanie fuzji białkowych propeptyd GDF-8-Fc in vivo

Białko fuzyjne propeptyd mysiego GDF-8-Fc (z przykładu 9) testowano u dorosłych myszy. Dorosłe samice myszy BALB/c, w wieku siedmiu do dziewięciu tygodni, dobrano pod względem wagi ciała i umieszczono w grupach po siedem (z wyjątkiem grupy nie traktopwanej, która miała sześć myszy). Myszom podawano dwa razy w tygodniu poprzez zastrzyk I.P. dawkę 10 μg, 100 μg lub 1000 μg na zwierzę przez pięć tygodni. Zastrzyki kontrolne były z Fc mysiej IgG2a w stężeniu molowym ekwiwalentnym do wysokiej dawki propeptydu-Fc. Na zakończenie badania, pobierano i ważono mięsień brzuchaty łydki, mięsień czworogłowego, najądrzowe poduszeczki tłuszczowe, nerkę i wątrobę. Fig. 13 pokazuje średnią masę tkanki, z odcinkiem błędu oznaczającym błąd standardowy średniej. Gwiazdka (*) wskazuje na różnicę znaczącą statystycznie (p<0,01 stosując test studenta T) przy porównaniu z myszami traktowanymi białkiem kontrolnym, IgG2aFc. Blokowanie aktywności GDF-8 in vivo poprzez zastrzyk I.P. białka fuzyjnego propeptyd GDF-8-Fc w dawce 1 mg/tydzień (myszy traktowane) prowadziła do 6,6% wzrostu masy mięśnia brzuchatego łydki i 6,6% wzrostu masy mięśnia czworogłowego w porównaniu z myszami kontrolnymi nie otrzymującymi białka fuzyjnego propeptyd GDF-8-Fc. Ponadto, blokowanie aktywności GDF-8 in vivo poprzez zastrzyk I.P. białka fuzyjnego propeptyd GDF-8-Fc w dawce 100 μg/tydzień (myszy traktowane) prowadziła do 23,0%) wzrostu masy poduszek tłuszczowych. Wysoka dawka (1 mg/tydzień) leczenia prowadziła również do zmniejszenia masy poduszek tłuszczowych, ale z powodu zróżnicowania masy poduszek tłuszczowych, różnica nie była wysoce znacząca statystycznie (p=0,047). Nie było wpływu traktowania na masę innych testowanych tkanek, włączając w to wątrobę i nerkę. Podsumowując, blokowanie aktywności GDF-8 in vivo poprzez zastrzyk I.P. białka fuzyjnego propeptyd GDF-8-Fc w dawce 1 mg/tydzień (myszy traktowane) prowadziła do wzrostu masy mięśnia brzuchatego łydki i mięśnia czworogłowego w porównaniu z myszami kontrolnymi nie otrzymującymi białka fuzyjnego propeptyd GDF-8-Fc.

PL 212 078 B1

Lista sekwencji <110 > American Home Products Corporation <120> Modyfikowane i stabilizowane propeptydy GDF i ich zastosowanie <130> 01997.002000 <140> nie przekazane <141> 2001-02-07 <150> US 60/267,509 <151> 2001-02-08 <160> 16 <170> Patentln wersja 3.1 <210> 1 <211> 375 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Met Gin Lys Leu Gin Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile 15 10 15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gin Lys Glu Asn 20 25 30

Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gin Asn Thr 35 40 45

Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gin Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gin Leu

PL 212 078 B1

PL 212 078 B1

<400> 2
atgcaaaaac	tgcaactctg	tgtttatatt	tacctgttta	tgctgattgt	tgctggtcca	60
gtggatctaa	atgagaacag	tgagcaaaaa	gaaaatgtgg	aaaaagaggg	gctgtgtaat	120
gcatgtactt	ggagacaaaa	cactaaatct	tcaagaatag	aagccattaa	gatacaaatc	180
ctcagtaaac	ttcgtctgga	aacagctcct	aacatcagca	aagatgttat	aagacaactt	240
ttacccaaag	ctcctccact	ccgggaactg	attgatcagt	atgatgtcca	gagggatgac	300
agcagcgatg	gctctttgga	agatgacgat	tatcacgcta	caacggaaac	aatcattacc	360
atgcctacag	agtctgattt	tctaatgcaa	gtggatggaa	aacccaaatg	ttgcttcttt	4 20
aaatttagct	ctaaaataca	atacaataaa	gtagtaaagg	cccaactatg	gatatatttg	480
agacccgtcg	agactcctac	aacagtgttt	gtgcaaatcc	tgagactcat	caaacctatg	540
aaagacggta	caaggtatac	tagaatccga	tctctgaaac	ttgacatgaa	cccaggcact	600
ggtatttggc	agagcattga	tgtgaagaca	gtgttgcaaa	attggctcaa	acaacctgaa	650
tccaacttag	gcattgaaat	aaaagcttta	gatgagaatg	gtcatgatct	tgctgtaacc	720
ttcccaggac	caggagaaga	tgggctgaat	ccgtttttag	aggtcaaggt	aacagacaca	780
ccaaaaagat	ccagaaggga	ttttggtctt	gactgtgatg	agcactcaac	agaatcacga	840
tgctgtcgtt	accctctaac	tgtggatttt	gaagcttttg	gatgggattg	gattatcgct	900
cctaaaagat	ataaggccaa	ttactgctct	ggagagtgtg	aatttgtatt	tttacaaaaa	960

PL 212 078 B1

tatcctcara	ctcatctggt	acaccaagca	aaccccagag	gttcagcagg cccttgctgt	1020
actcccacaa	agatgtctcc	aattaatatg	4 ·-%*“ n P p t L c b. —· d *<_· d L- t. L.· L, d	atggcaaaga acaaataata	108 0
tatgggaaaa	ttccagcgat	ggtagtagac	cgctgtgggt	g o t c a	1125

<210>	3
<2łl>	109
<212>	PRT
<213>	Homo

<4C0> 3

Asp Phe Gly Leu .Asp Cys Asp Giu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys 15 10 15

Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30 ’

Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45

Phe Val Phe Leu Gin Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gin Ala 50 55 60

Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80

Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gin Ile Ile Tyr Gly 85 90 95

Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg 100 1GS lys Gly Cys Ser <210> 4 <2il> 327 <212> DMA <213> Homo sapiens <400> i gattttggtc ttgactgtga tgagcactca acagaatcac gatgctgtcg ttaccctcta 60 actgtggatt ttgaagcttt tggatgggat tggattatcg ctcctaaaag atataaggcc 120

PL 212 078 B1

aattactgct	ctggagagtg	tgaatttgta	tttttacaaa	aatatcctca	tactcatctg	180
gtacaccaag	caaaccccag	aggttcagca	ggcccttgct	gtactcccac	aaagatgtct	240
ccaattaata	tgctatattt	taatggcaaa	gaaoaaataa	tatatgggaa	aattccagcg	300
atggtagtag	accgctgtgg	gtgctca				32 7

<210	5
<211>	243
<212>	PRT
<213>	Homo
<400>	5

Asn Glu

Asn

Ser

Glu c

Gin

Lys

Glu

Asn

Val 10

Glu

Lys

Glu

Gly

Leu 15

Cys

Asn

Ala

Cys

Thr

Trp

Arg

Gin

Asn

Thr

Lys

Ser

Ser

Arg

Ile

Glu

Ala

20

25

30

Ile

Lys

Ile

Gin

Ile

Leu

Ser

Lys

Leu

Arg

Leu

Glu

Thr

Ala

Pro

Asn

35

4 0

45

Ile

Ser

Lys

Asp

Val

Ile

Arg

Gin

Leu

Leu

Pro

Lys

Ala

Pro

Pro

Leu

50

55

60

Arg

Glu

Leu

Ile

Asp

Gin

Tyr

Asp

Val.

Gin

Arg

Asp

Asp

Ser

Ser

Asp

65

70

7 5

80*

Gly

Ser

Leu

Glu

Asp

Asp

Asp

Tyr

His

Al a.

Thr

Thr

Glu

Thr

Ile

Ile

85

90

95

Thr

Met

Pro

Thr

Glu

Ser

Asp

Phe

Leu

Met

Gin

Val

Asp

Gly

Lys

Pro

100

105

110

Lys

Cys

Cys

Phe

Phe

Lys

Phe

Ser

Ser

Lys

Ile

Gin

Tyr

Asn

Lys

Val

115

120

125

Val

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

Ile

Tyr

Leu

Arg

Pro

Tal

Glu

Thr

Pro

Thr

130

135

140

Thr

Val

Phe

Val

Gin

Ile

Leu

Arg

Leu

Ile

Lys

Pro

Met

Lys

Asp

cly

145

150

155

160

PL 212 078 B1

<400> 6 aatgagaaca	gtgagcaaaa	agaaaatgtg	gaaaaagagg	ggctgtgtaa	tgcatgtact	60
tggagacaaa	acactaaatc	ttcaagaata	gaagccatta	agatacaaat	cctcagtaaa	120
cttcgtctgg	aaacagctcc	taacatcagc	aaagatgtta	taagacaact	tttacccaaa	180
gctcctccac	tccgggaact	aattgatcag	tatgatgtcc	agagggatga	cagcagcgat	24 0
ggctctttgg	aagatgacga	ttatcacgct	acaacggaaa	caaccatfcac	catgcctaca	300
gagtctgatt	ttctaatgca	agtggatgga	asacccdaat	ęttgcttctt	taastttagc	360
tctaaaatac	aatacaataa	agtagtaaag	gcccaactat	ggatatattt	gagacccgtc	420
gagactccta	caacagtgtt	tgtgcaaatc	ctgagactca	tcaaacctat	gaaagacggt	480
acaaggfcata	ctggaatccg	atctctgaaa	cttgacatga	acccaggcac	tggtatttgg	540
cagagcattg	atgtgaagac	agtgttgcaa	aattggctca	aacaacctga	atccaactta	600
ggcattgaaa	taaaagcttt	agatgagaat	ggtcatgatc	ttgctgtaac	cttcccagga	660
ccaggaeaag	atgggctgaa	tccgttttta	gaggtcaagg	taacagacac	accaaaaaga	720
tccagaagg						72 9

PL 212 078 B1 <210> 7 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7

Met Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15

Glu Leu Arg Pro Arg Gly Glu Ala Ala Glu Gly Pro Ala Ala Ala Ala 20 25 30

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Gly Gly Glu Arg Ser 35 40 45

Ser Arg Pro Ala Pro Ser Val Ala Pro Glu Pro Asp Gly Cys Pro Val 50 55 60

Cys Val Trp Arg Gin His Ser Arg Glu Leu Arg Leu Glu Ser Ile Lys 65 70 75 S0

Ser Gin Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Lys Glu Ala Pro Asn Ile Ser 85 90 95

Arg Glu Val Val Lys Gin Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gin Gin 100 105 110 ile Leu Asp Leu Kis Asp Phe Gin Gly Asp Ala Leu Gin Pro Glu Asp 115 120 125

Phe Leu Glu Glu Asp Glu Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Val Ile Ser 130 * 135 140

Met Ala Gin Glu Thr Asp Pro Ala Val Gin Thr Asp Gly Ser Pro Leu 145 150 155 160

Cys Cys His Phe His Phe Ser Pro Lys Yal Met Phe Thr Lys Val Leu 165 170 175

Lys Ala Gin Leu Trp Yal Tyr Leu Arg Pro Val Pro Arg Pro Ala Thr 180 185 190

PL 212 078 B1

<210> 8 <211> 1221

PL 212 078 B1 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3

atggtgctcg	cgqccccqct	gctgctgggc	ttcctgctcc	tcgccctgga	gctgcggccc	60
cggggggagg	cggccgaggg	ccccgcggcg	gcggcggcgg	cggcggcggc	ggcggcagcg	120
gcgggggtcg	ggggggagcg	ctccagccgg	ccagccccgt	ccgtggcgcc	cgagccggac	180
ggctgccccg	tgtgcgtttg	gcggcagcac	agccgcgagc	tgcgectaga	gagcatcaag	240
tcgcagatct	tgagcaaact	gcggctcaag	gaggcgccca	acatcagccg	cgaggtggtg	300
aagcagct gc	tgeccaaggc	gccgccgctg	cagcagatcc	tggacctaca	cgacttccag	360
ggcga cgcgc	t gcagcccga	ggacttcctg	gaggaggacg	agtaccacgc	caccaccgag	420
accgtcatta	gcatggccca	ggagacggac	ccagcagtac	agacagatgg	cagccctctc	480
tgctgccatt	ttcacttcag	ccccaaggtg	atgttcacaa	aggtactgaa	ggcccagctg	540
tgggtgtacc	tacggcctgt	accccgccca	gccaeagtet	acctgcagat	cttgc.gacta	600
aaacccctaa	ctggggaagg	gaccgcaggg	ggagggggcg	gaggccggcg	tcacatccgt	660
atccgctcac	tgaagattga	gctgcactca	cgctcaggcc	attggcagag	catcgact.tc	720
aagcaagtgc	tacacagctg	gttccgccag	ccacagagca	aetggggcat	cgagatcaac	780
gectttgatc	ccagtggcac	agacctggct	gtcacctccc	tggggccggg	agccgagggg	840
ctgcatccat	t. cat gga gct	tcgagtccta	CJ 3 Cf 3. -3 C 3. C3 3,	aacgttcccg	gcggaacctg	900
ggtctggact	gcgacgagca	ctcaagcgag	tcccgctgct	gccgatatcc	cctcacagtg	960
gactttgagg	ctttcggctg	ggactggatc	atcgcaccta	agcgctacaa	ggccaactac	1020
tgctccggcc	agcgegagta	catgttcatg	caaaaatatc	cgcataccca	tttggtgcag	1080
caggccaatc	caagaggctc	tgctgggccc	tgttgtaccc	ccaccaagat	gtccccaatc	1140
aacatgctcc	acttcaatga	caagcagcag	attatctacg	gcaagatccc	tggcatggtg	1200
gtggatcgct	gtggctgctc	t				1221

<210> 9 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

PL 212 078 B1

Asn 1

Leu

Gly

Leu

Asp 5

Cys

Asp

Glu

His

Ser 10

Ser

Glu

Ser

Arg

Cys 15

Cys

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Val

Asp

Phe

Glu

Ala

Phe

Gly

Trp

Asp

Trp

Ile

20

25

30

Ile

Ala

Pro

Lys

Arg

Tyr

Lys

Ala

Asn

Tyr

Cys

Ser

Gly

Gin

Cys

Glu

35

40

45

Tyr

Met

Phe

Met

Gin

Lys

Tyr

Pro

His

Thr

His

Leu

Val

Gin

Gin

Ala

50

55

60

Asn

Pro

Arg

Gly

Ser

Ala

Gly

Pro

Cys

Cys

Thr

Pro

Thr

Lys

Met

Ser

65

70

75

80

Pro

I le

Asn

Met

Leu

Tyr

Phe

Asn

Asp

Lys

Gin

Gin

Ile

Ile

Tyr

Gly

85

90

95

Lys

Ile

Pro

Gly

Met

Val

Val

Asp

Arg

Cys

Gly

Cys

Ser

100 105 ··:.'·· 1 10 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10

aacetgggtc	tggactgcga	cgagcactca	agcgagtccc	gctgctgccg	atatcccctc	60
acagtggact	ttgaggcttt	cggctęggac	tggatcatcg	cacctaagcg	ctacaaggcc	120
aactactgct	ccggccagtg	cgagtacatg	tccatgcaaa	aatatccgca	tacccatttg	180
gtgcagcagg	ccaatccaag	aggctctgct	gggccctgtt	gtacccccac	caagatgtcc	240
ccaatcaaca	tgctctactt	caatgacaag	cagcagatta	tctacggcaa	gatccctggc	300
atggtggtgg	atcgctgtgg	ctgctct				327

<210> 11 <211> 274 <212> PRT <213> Homo sapiens

PL 212 078 B1

<4oo> :

LI

Ala

Glu

Gly

Pro

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

Ala

1

5

10

15

Ala

Gly

Val

Gly

Gly

Glu

Arg

Ser

A.rg

Pro

Ala

Pro

Ser

Val

Ala

20

25

30

Pro

Glu

Pro

Asp

Gly

Cys

Pro

Val

Cys

Val

Trp

Arq

Gin

His

Ser

Arg

35

40

4 5

Glu

Leu

Arg

Leu

Glu

Ser

Ile

Lys

Ser

C-ln

Ile

Leu

Ser

Lys

Leu

Arg

50

55

60

Leu

Lys

Glu

Ala

Pro

Asn

Ile

Ser

Arg

Glu

Val

Val

Lys

Gin

Leu

Leu

65

70

75

80

Pro

Lys

Ala

Fro

Prc

Leu

Gin

C-ln

Ile

Leu

Asp

Leu

His

Asp

Phe

Gin

85

90

95

Gly

Asp

Ala

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Phe

Leu

Glu

Glu

Asp

Glu

Tyr

His

100

105

110

Ala

Thr

Thr

Glu

Thr

Val

Ile

Ser

Met

Ala

Gin

Glu

Thr

Asp

Pro

Ala

115

120

125

Val

Gin

Thr

Asp

Gly

Ser

Prc

Leu

Cys

Cys

His

Phe

His

Phe

Ser

Pro

130

135

140

Lys

Val

Met

Phe

Thr

Lys

Val

Leu

Lys

Ala

Gin

Leu

Trp

Val

Tyr

Leu

145

150

155

160

Arg

Pro

Val

Pro

Arg

Pro

Ala

Thr

Val

Tyr

Leu

Gin

Ile

Leu

Arg

Leu

165

170

175

Lys

Pro

Leu

Thr

Gly

Glu

Gly-

Thiu

Ala

Gly

Gly

Gly

Gly

Gly

Gly

Arg

180

185

190

Arg

His

Ile

Arg

Ile

Arg

Ser

Leu

Lys

Ile

Glu

Leu

His

Ser

Arg

Ser

195

200

2 05

Gly

His

Trp

Gin

Ser

Ile

Asp

Phe

Lys

Gin

Val

Lgu

His

Ser

Trp

Phe

210

215

220

Arg

Gin

Pro

Gin

Ser

Asn

Trp

Gly

Ile

Glu

Ile

Asn

Al a

Phe

Asp

Pro

PL 212 078 B1

<210> 12 <211> 822 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12

gccgagggcc	ccgcggcggc	ggcggcggcg	gcggcggcgg	cggcagcggc	gggggtcggg	SO
ggggagcgct	ccagccggcc	agccccgtcc	gtggcgcccg	agccggacgg	ctgccccgtg	120
tgcgtttggc	ggcagcacag	ccgcgagctg	cgcctagaga	gcatcaagtc	gcagatcttg	180
agcaaactgc	ggctcaagga	ggcgcccaac	atcagccgcg	aggtggtgaa	gcagctgctg	240
cccaaggcgc	cgccgctgca	gcagatcctg	gacctacacg	acttcoaggg	cgacgcgctg	300
cagcccgagg	acttcctgga	ggaggacgag	taccacgcca	ccac.cgagac	cgtcattagc	360
atggcccagg	agacggaccc	agcagtacag	acagatggca	gccctctctg	ctgccatttt	420
cacttcagcc	ccaaggtgat	gttcacaaag	gtactgaagg	cccagctgtg	ggtgtaccta	480
cggcctgtac	cccgcccagc	cacagtctac	ctgcagatct	tgcgactaaa	acccctaact	540
ggggaaggga	ccgcaggggg	agggggcgga	ggccggcgtc	acatccgtat	ccgctcactg	600
aagactgagc	tgcactcacg	ctcaggccat	tggcagagca	tcgacttcaa	gcaagtgcta	660
cacagctggt	tccgccagcc	scsęsęcsac	tggggcatcg	agatcaacgc	ctttgatccc	720
agtggcacag	acctggctgt	cacctccctg	gggccgggag	ccgagggact	gcatccattc	780
acggagcttc	gagtcctaga	gaacacaaaa	cgttcccggc	gg		822

<210> 13 <211> 23 <212> PRT

PL 212 078 B1 <213> Ηοπιο sapiens <400> 13

Met Gin Lys Leu Gin Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile 15 10 15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu 20 <210> 14 <211> 24 <212> PRT <213> Horno sapiens <400> 14

Met Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15

Glu Leu Arg Pro Arg Gly Glu Ala 20 <210> 15 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 4 5

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50' 55 60

PL 212 078 B1

Asp 65

Gly

Val

Glu

Val

His 70

Asn

Al a

Lys

Thr

Lys 75

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin 80

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Ar g

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

85

90

95

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

100

105

110

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

115

120

125

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Glu

Glu

Met

Thr

130

135

140

Lys

Asn

Gin

Vał

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

dy

Phe

Tyr

Pro

Ser

145

150

155

160

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

165

170

175

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

dy

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

180

185

190

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

195

200

205

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

210

215

220

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

dy

Lys

225 230 <210> 16 <211> 227 <212> PRT

<213> Homo sapiens
<400> 16
Asp Lys Thr	His Thr Cys	Pro Pro Cys Pro Ala	Pro Glu Ala Leu Gly
1	5	10	15

PL 212 078 B1

Pro Gly Lys 225

PL 212 078 B1

Claims (41)

1. Modyfikowany propeptyd BMP-11 obejmujący sekwencję aminokwasową, która zawiera mutację modyfikującą sekwencję aminokwasową w reszcie odpowiadającej pozycji 98 SEK NR JD:11, przy czym modyfikowany propeptyd BMP-11 ma zwiększony okres półtrwania in vivo lub in vitro w stosunku do odpowiadającego mu niezmodyfikowanego propeptydu BMP-11.

2. Modyfikowany propeptyd BMP-11 według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja aminokwasową jest (a) sekwencją aminokwasową, która jest w co najmniej 75% identyczna z SEK NR ID: 11 lub (b) funkcjonalnym fragmentem (a).

3. Modyfikowany propeptyd BMP-11 według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja aminokwasową jest w co najmniej 75% identyczna z SEK NR ID:11.

4. Modyfikowany propeptyd BMP-11 według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że sekwencja aminokwasową jest w co najmniej 80% identyczna z SEK NR ID: 11.

5. Modyfikowany propeptyd BMP-11 według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że sekwencja aminokwasową jest w co najmniej 85% identyczna z SEK NR ID:11.

6. Modyfikowany propeptyd BMP-11 według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że sekwencja aminokwasową jest w co najmniej 90% identyczna z SEK NR ID:11.

7. Modyfikowany propeptyd BMP-11 według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że sekwencja aminokwasową jest w co najmniej 95% identyczna z SEK NR ID:11.

8. Modyfikowany propeptyd BMP-11 według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że sekwencja aminokwasową jest w co najmniej 98% identyczna z SEK NR ID: 11.

9. Modyfikowany propeptyd BMP-11 według zastrz. 1, znamienny tym, że modyfikowany propeptyd BMP-11 obejmuje sekwencję aminokwasową z SEK NR ID: 11 lub jej funkcjonalny fragment, z tym że zawiera mutację w reszcie odpowiadającej pozycji 98 SEK NR ID:11.

10. Modyfikowany propeptyd BMP-11 według zastrz. 9, znamienny tym, że modyfikowany propeptyd BMP-11 obejmuje sekwencję aminokwasową z SEK NR ID:11, z tym że zawiera mutację w reszcie odpowiadającej pozycji 98 SEK NR ID:11.

11. Modyfikowany propeptyd BMP-11 według jednego z zastrz. 1-10, znamienny tym, że mutacją w sekwencji amino kwasowej w reszcie odpowiadającej pozycji 98 SEK NR ID: 11 jest delecja.

12. Modyfikowany propeptyd BMP-11 według jednego z zastrz. 1-10, znamienny tym, że mutacją w sekwencji aminokwasowej w reszcie odpowiadającej pozycji 98 SEK NR ID: 11 jest substytucja.

13. Modyfikowany propeptyd BMP-11 według zastrz. 12, znamienny tym, że resztą odpowiadającą reszcie w pozycji 98 SEK NR ID: 11 jest alanina.

14. Modyfikowany propeptyd BMP-11 według jednego z zastrz. 1-13, znamienny tym, że miejsce cięcia proteolitycznego jest inaktywowane przez mutację w tym miejscu.

15. Modyfikowany propeptyd BMP-11 według jednego z zastrz. 1-14, znamienny tym, że zawiera ponadto modyfikację stabilizującą.

16. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 15, znamienny tym, że modyfikacja stabilizująca obejmuje fuzję regionu Fc cząsteczki IgG do propeptydu.

17. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 16, znamienny tym, że cząsteczką IgG jest IgG1 lub IgG4 lub ich pochodne.

18. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 17, znamienny tym, że cząsteczką IgG jest IgG1.

19. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 16, znamienny tym, że sekwencja aminokwasową cząsteczki IgG jest w co najmniej 75% identyczna z SEK NR ID: 15.

20. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 16, znamienny tym, że sekwencją aminokwasową cząsteczki IgG jest SEK NR ID: 15.

21. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 16, znamienny tym, że sekwencja aminokwasową cząsteczki IgG jest w co najmniej 75% identyczna z SEK NR ID: 16.

22. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 16, znamienny tym, że sekwencją aminokwasową cząsteczki IgG jest SEK NR ID: 16.

23. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 16, znamienny tym, że propeptyd jest połączony z regionem Fc cząsteczki IgG poprzez peptyd łącznikowy.

24. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 15, znamienny tym, że stabilizująca modyfikacja obejmuje zmienione miejsce glikozylacji.

25. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 15, znamienny tym, że stabilizująca modyfikacja obejmuje co najmniej jedną resztę węglowodanową.

PL 212 078 B1

26. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 15, znamienny tym, że stabilizująca modyfikacja obejmuje albuminę albo pochodną albuminy.

27. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 15, znamienny tym, że stabilizująca modyfikacja obejmuje niebiałkopodobny polimer.

28. Modyfikowany propeptyd według jednego z zastrz. 1 do 27, znamienny tym, że zawiera ponadto umożliwiający oczyszczanie znacznik.

29. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca modyfikowany propeptyd BMP-11 określony w jednym z zastrz. 1-28.

30. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca propeptyd BMP-11 obejmująca sekwencję kwasu nukleinowego, która jest w co najmniej 95% identyczna do SEK NR ID: 12 i koduje propeptyd, który jest modyfikowany w reszcie asparaginianowej odpowiadającej asparaginianowi 98 SEK NR ID:11, przy czym kodowany propeptyd hamuje co najmniej jedną biologiczną aktywność BMP-11 lub GDF-8.

31. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca propeptyd BMP-11 obejmująca sekwencję kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w ostrych warunkach hybrydyzacji do sekwencji komplementarnej wobec SEK NR ID: 12 i koduje propeptyd z mutacją modyfikującą resztę asparaginianową odpowiadającą asparaginianowi 98 SEK NR ID: 11, przy czym kodowany propeptyd hamuje co najmniej jedną biologiczną aktywność BMP-11.

32. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera modyfikowany propeptyd określony w jednym z zastrz. 1 do 28 i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.

33. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego określonego w jednym z zastrz. 29-31 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik albo wektor.

34. Sposób wytwarzania modyfikowanego propeptydu BMP-11 określonego w jednym z zastrz. 1-28, znamienny tym, że obejmuje:

(a) wytwarzanie cząsteczki cDNA kodującej propeptyd, jak określono w jednym z zastrz. 29-31, w której miejsce cięcia proteolitycznego jest zmodyfikowane;

(b) wytwarzanie cząsteczki cDNA kodującej region Fc cząsteczki IgG; oraz (c) połączenie cząsteczek cDNA z etapów (a) i (b) z wytworzeniem zmodyfikowanego BMP-11 lub propeptydu BMP-11.

35. Sposób według zastrz. 34, znamienny tym, że obejmuje ponadto wytworzenie dwuniciowego oligonukleotydu kodującego peptyd łącznikowy i przyłączenie cząsteczek cDNA z etapów (a) i (b) do któregoś z końców dwuniciowego oligonukleotydu kodującego peptyd łącznikowy.

36. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że peptyd łącznikowy zawiera sekwencję aminokwasową składającą się z GSGS.

37. Rekombinowana komórka zawierająca kwas nukleinowy kodujący modyfikowany propeptyd BMP-11 określony w jednym z zastrz. od 1 do 28.

38. Modyfikowany propeptyd weałóg jednego z zastrz. 1 do 28 do zastosowania jako lek.

39. Zastosowanie modyfikowanego propeptydu określonego w jednym z zastrz. 1 do 28 do wytwarzania leku do leczenia jednego lub większej liczby stanów chorobowych wybranych spośród choroby mięśniowej, choroby neuromięśniowej, choroby metabolicznej albo choroby degeneracyjnej kości.

40. Zastosowanie modyfikowanego propeptydu określonego w jednym z zastrz. 1 do 28 do wytwarzania leku do leczenia jednego lub większej liczby stanów chorobowych wybranych spośród stwardnienia zanikowego bocznego, dystrofii mięśniowej, atrofii mięśni, zastoinowej czopującej choroby płuc, zespołu wyniszczenia mięśniowego, sarkopenii albo kacheksji.

41. Zastosowanie modyfikowanego propeptydu określonego w jednym z zastrz. 1 do 28 do wytwarzania leku do leczenia osteoporozy.