PL207202B1 - Modyfikowany propeptyd GDF-8 i jego zastosowanie, kodująca go cząsteczka kwasu nukleinowego, kompozycja farmaceutyczna, rekombinowana komórka oraz sposób wytwarzania modyfikowanego propeptydu GDF-8 - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest modyfikowany propeptyd GDF-8 i jego zastosowanie, kodująca go cząsteczka kwasu nukleinowego, kompozycja farmaceutyczna, rekombinowana komórka oraz sposób wytwarzania modyfikowanego propeptydu GDF-8. Modyfikowane i stabilizowane propeptydy białek GDF-8 według wynalazku hamują aktywność GDF-8. Rozwiązania według wynalazku są szczególnie przydatne do zapobiegania lub leczenia chorób u ludzi lub zwierząt, w których zwiększenie tkanki mięśnia szkieletowego byłoby terapeutycznie korzystne. Takie choroby obejmują choroby mięśniowe i neuromięśniowe (takie jak stwardnienie zanikowe boczne, dystrofia mięśniowa, atrofia mięśni, zastoinowa czopująca choroba płuc, zespół wyniszczenia mięśniowego, sarkopenia albo kacheksja), choroby albo zaburzenia metaboliczne (takie jak cukrzyca typu II, cukrzyca insulinoniezależna, hiperglikemia lub otyłość), zaburzenia tkanki tłuszczowej (takie jak otyłość) albo choroby degeneracyjne kości (takie jak osteoporoza).

Czynnik różnicowania wzrostu-8 (GDF-8), znany również jako miostatyna, jest członkiem nadrodziny transformujących czynników wzrostu beta (TGF-β, ang. Transforming Growth Factor-beta) złożonej ze strukturalnie spokrewnionych czynników wzrostu, z których każdy posiada ważne właściwości regulowania wzrostu i morfogenetyczne (Kingsley i wsp. (1994) Genes Dev. 8:133-46; Hoodless i wsp. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-72). GDF-8 to negatywny regulator masy mięśni szkieletowych i istnieje znaczne zainteresowanie identyfikacją czynników, które regulują jego aktywność biologiczną. Przykładowo, GDF-8 jest wyrażany na wysokim poziomie w rozwijającym się i dorosłym mięśniu szkieletowym. Mutacja null GDF-8 u myszy transgenicznych charakteryzuje się znaczącym przerostem i rozrostem mięśni szkieletowych (McPherron i wsp. (1997) Nature 387:83-90). Podobny wzrost masy mięśni szkieletowych jest widoczny w przypadku naturalnie występujących mutacji GDF-8 u bydła (Ashmore i wsp. (1974) Growth 38:501-507; Swatland i Kieffer (1994) J. Anim. Sci. 38:752-757; McPherron i Lee (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:12457-12461 oraz Kambadur i wsp. (1997) Genome Res. 7:910-915). Ostatnie badania wykazały również, że wyniszczeniu mięśni związanemu z infekcją HIV u ludzi towarzyszy wzrost ekspresji białka GDF-8 (Gonza1ez-Cadavid i wsp. (1998) PNAS 95:14938-43). Dodatkowo, GDF-8 może modulować wytwarzanie enzymów specyficznych wobec mięśni (np. kinazy kreatynowej) i moduluje proliferację komórek mioblastycznych (WO 00/43781).

Poza właściwościami regulowania wzrostu i morfogenetycznymi w mięśniach szkieletowych, GDF-8 może również uczestniczyć w wielu innych procesach fizjologicznych (np. homeostazie glukozowej), jak również stanach nieprawidłowych, takich jak rozwój cukrzycy typu II oraz zaburzeniach tkanki tłuszczowej, takich jak otyłość. Przykładowo, GDF-8 moduluje różnicowanie prekursorowych komórek tłuszczowych w komórki tłuszczowe (Kim i wsp. (2001) B.B.R.C. 281:902-906).

Podobnie jak TGF-e-1, -2 i -3, białko GDF-8 jest syntetyzowane jako białko prekursorowe składające się z amino-końcowego propeptydu i karboksykońcowej domeny dojrzałej (McPherron i Lee, 1997, jak wyżej), jak również sekwencji sygnałowej, która kieruje białko do domeny zewnątrzkomórkowej i jest również odcinana od białka. Uważa się, że przed odcięciem propeptydu, prekursorowe białko GDF-8 tworzy homodimer. Amino-końcowy propeptyd jest następnie odcinany od dojrzałej domeny i odcięty propeptyd może pozostawać związany niekowalencyjnie z dimerem dojrzałej domeny, hamując jej aktywność biologiczną (Miyazono i wsp. (1988) J. Biol. Chem. 263:6407-6415; Wakefield i wsp. (1988) J. Biol. Chem. 263:7646-7654 oraz Brown i wsp. (1990) Growth Factors 3:35-43). Uważa się, że dwa propeptydy GDF-8 wiążą się z dojrzałym dimerem GDF-8 (Thies i wsp. (2001) Growth Factors 18:251-259). Na skutek tej właściwości inaktywacyjnej, propeptyd jest znany jako „peptyd związany z latencją (LAP, ang. latency-associated peptide), a kompleks dojrzałej domeny i propeptydu jest powszechnie określany jako „mały kompleks w stanie latencji” (Gentry and Nash (1990) Biochemistry 29:6851-6857; Derynck i wsp. (1995) Nature 316:701-705 oraz Massague (1990) Ann. Rev. Cell. Biol. 12:597-641). Uważa się, że dojrzała domena jest aktywna jako homodimer po usunięciu propeptydu. Znane są również inne białka, które wiążą się z GDF-8 albo spokrewnionymi strukturalnie białkami i hamują ich aktywność biologiczną. Takie hamujące białka obejmują folistatynę (Gamer i wsp. (1999) Dev. Biol. 208:222-232) i białka spokrewnione z folistatyną.

Ponadto, wielu chorobom ludzkim i zwierzęcym towarzyszy utrata albo funkcjonalne uszkodzenie tkanki mięśniowej, włączając w to dystrofię mięśniową, atrofię mięśni, zastoinową czopującą chorobę płuc, zespół wyniszczenia mięśniowego, sarkopenię i kacheksję. Jak dotąd istnieje bardzo niewiele wiarygodnych i skutecznych terapii dla tych schorzeń. Straszliwe objawy związane z tymi choroPL 207 202 B1 bami można znacząco zmniejszyć poprzez zastosowanie terapii, które zwiększają ilość tkanki mięśniowej u pacjentów cierpiących na te choroby. Takie terapie znacząco poprawiłyby jakość życia tych pacjentów i mogłyby złagodzić wiele efektów tych chorób. A zatem, istnieje potrzeba w tej dziedzinie zidentyfikowania nowych terapii, które przyczyniłyby się do ogólnego zwiększenia tkani mięśniowej u pacjentów cierpią cych na te choroby.

Niniejszy wynalazek zaspakaja tę potrzebę poprzez dostarczenie zmodyfikowanych i stabilizowanych propeptydów GDF, które zachowują swoją aktywność biologiczną i hamują aktywność białek GDF. Zmodyfikowane propeptydy według wynalazku można zastosować do leczenia chorób ludzkich lub zwierzęcych, w których zwiększenie tkanki mięśnia szkieletowego byłoby terapeutycznie korzystne.

GDF-8 uczestniczy w regulacji wielu krytycznych procesów biologicznych. Na skutek jego kluczowej roli w tych procesach, GDF-8 może być pożądanym celem dla interwencji terapeutycznej. Jakkolwiek naturalnie występujący propeptyd GDF-8 może być atrakcyjnym środkiem do modulacji GDF z perspektywy skuteczności i toksyczności, twórcy stwierdzili, że okres półtrwania w obiegu naturalnego propeptydu może być zbyt krótki, aby cząsteczka mogła mieć zastosowanie terapeutyczne lub profilaktyczne.

A zatem, niniejszy wynalazek opiera się, co najmniej po części, na ujawnieniu, że propeptyd czynnika różnicowania wzrostu-8 (GDF-8) hamuje aktywność białka GDF-8 i że inne białka transformujących czynników wzrostu beta (TGF-β), które są spokrewnione strukturalnie z GDF-8, takie jak białko morfogenezy kości-11 (BMP-11, ang. Bone Morphogenic Protein-11, znane również jako GDF-11) są również hamowane przez propeptyd GDF-8. Niniejszy wynalazek dostarcza zatem kompozycji i sposobów hamowania białek GDF, jak również sposobów identyfikowania, wytwarzania i stosowania takich inhibitorów.

Jak zaznaczono powyżej, niniejszy wynalazek jest również oparty, po części, na ujawnieniu, że naturalny propeptyd GDF-8 ma stosunkowo krótki okres półtrwania in vivo, co może przeszkadzać w jego praktycznym zastosowaniu terapeutycznym lub profilaktycznym. A zatem niniejszy wynalazek dostarcza zmodyfikowane propeptydy GDF-8 o lepszych właściwościach farmakokinetycznych, takie jak zwiększony okres półtrwania w obiegu albo zwiększoną ochronę przed degradacją proteolityczną.

Ujawnione tu propeptydy GDF-8 mogą być stabilizowane dowolnymi sposobami znanymi w tej dziedzinie. Przykładowo, w jednym z wykonań, zmodyfikowanym propeptydem jest białko fuzyjne zawierające propeptyd GDF-8 i region Fc cząsteczki IgG. Białka fuzyjne propeptydydu GDF-8 mogą zawierać, jako podjednostkę aktywną propeptyd białka GDF-8 albo aktywną część propeptydydu GDF-8, połączoną z regionem Fc cząsteczki IgG. W innych wykonaniach albo dodatkowo, propeptyd GDF-8 może być glikozylowany albo połączony z albuminą lub niebiałkowym polimerem.

Zmodyfikowane propeptydy GDF-8 według wynalazku mają zdolność do hamowania aktywności, ekspresji, obróbki albo sekrecji białka GDF-8, dojrzałego GDF-8 albo homodimeru GDF-8 lub innej aktywnej cząsteczki GDF-8. Zmodyfikowane propeptydy GDF-8 według wynalazku mogą być podawane pacjentowi w skutecznej terapeutycznie dawce w celu leczenia albo zapobiegania stanom medycznym, w których zwiększenie tkanki mięśnia szkieletowego byłoby terapeutycznie korzystne. Choroby i zaburzenia, które mogą być leczone przy użyciu zmodyfikowanych propeptydów GDF-8 obejmują między innymi choroby mięśniowe i neuromięśniowe (takie jak stwardnienie zanikowe boczne, dystrofia mięśniowa, atrofia mięśni, zastoinowa czopująca choroba płuc, zespół wyniszczenia mięśniowego, sarkopenia albo kacheksja), choroby albo zaburzenia metaboliczne (takie jak cukrzyca typu II, cukrzyca insulinoniezależna, hiperglikemia lub otyłość), zaburzenia tkanki tłuszczowej (takie jak otyłość) albo choroby degeneracyjne kości (takie jak osteoporoza).

W szczególności przedmiotem wynalazku jest modyfikowany propeptyd GDF-8 obejmujący sekwencję aminokwasową, która zawiera mutację w reszcie odpowiadającej pozycji 76 SEK NR ID: 5, przy czym modyfikowany propeptyd GDF-8 ma zwiększony okres półtrwania in vivo albo in vitro w stosunku do odpowiadającego mu niezmodyfikowanego propeptydu GDF-8. Korzystnie sekwencja aminokwasowa jest w co najmniej 75% identyczną z SEK NR ID: 5 albo jej funkcjonalnym fragmentem. Korzystniej sekwencja aminokwasowa jest w co najmniej 75%, 80%, 85%, 90%, 95% lub 98% identyczna z SEK NR ID: 5.

Modyfikowany propeptyd GDF-8 według wynalazku korzystnie zawiera sekwencję aminokwasową albo jej funkcjonalny fragment, z tą różnicą, że obejmuje mutację w reszcie odpowiadającej pozycji 76 SEK NR ID: 5. Korzystnie mutacją w sekwencji aminokwasowej modyfikowanego propeptydu GDF-8 w reszcie odpowiadającej pozycji 76 SEK NR ID: 5 jest delecja lub substytucja. Korzystniej substytucją reszty odpowiadającej pozycji 76 SEK NR ID: 5 jest substytucja do alaniny.

PL 207 202 B1

Miejsce cięcia proteolitycznego w modyfikowanym propeptydzie GDF-8 według wynalazku jest inaktywowane korzystnie przez mutację w tym miejscu.

Według wynalazku modyfikowany propeptyd GDF-8 może ponadto zawierać modyfikację stabilizującą. W jednej postaci wykonania modyfikacja stabilizująca obejmuje fuzję regionu Fc cząsteczki IgG do propeptydu. Korzystnie propeptyd jest połączony z regionem Fc cząsteczki IgG poprzez peptyd łącznikowy. Również korzystnie cząsteczką IgG jest IgG1 albo IgG4 albo ich pochodne. Korzystniej cząsteczką IgG jest IgG1. Bardziej korzystnie sekwencja aminokwasowa cząsteczki IgG jest w co najmniej 75% identyczna z SEK NR ID: 15 lub SEK NR ID: 16. Najkorzystniej sekwencją aminokwasową cząsteczki IgG jest SEK NR ID: 15 lub SEK NR ID: 16.

W dalszych postaciach wykonania stabilizują ca modyfikacja propeptydu GDF-8 wedł ug wynalazku obejmuje korzystnie zmienione miejsce glikozylacji, co najmniej jedną resztę węglowodanową, albuminę albo jej pochodną, lub niebiałkopodobny polimer.

Korzystnie modyfikowany propeptyd według wynalazku zawiera ponadto umożliwiający oczyszczanie znacznik.

Przedmiotem wynalazku jest także modyfikowany propeptyd GDF-8 według wynalazku do zastosowania jako lek. Wynalazek dotyczy w szczególności zastosowania modyfikowanego propeptydu GDF-8 według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia jednego albo większej liczby stanów chorobowych wybranych spośród choroby mięśniowej, choroby neuromięśniowej, choroby metabolicznej albo choroby degeneracyjnej kości, stwardnienia zanikowego bocznego, dystrofii mięśniowej, atrofii mięśni, zastoinowej czopującej choroby płuc, zespołu wyniszczenia mięśniowego, sarkopenii, kacheksji lub osteoporozy.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca modyfikowany propeptyd GDF-8 według wynalazku. Korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera co najmniej 20 ciągłych nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 6, SEK NR ID: 8 lub SEK NR ID: 12. Korzystniej cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku zawiera co najmniej 50 ciągłych nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 2, SEK NR ID: 6, SEK NR ID: 8 lub SEK NR ID: 12.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca modyfikowany propeptyd według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę lub cząsteczkę kwasu nukleinowego według wynalazku i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik albo wektor.

Wynalazek dostarcza również sposobu wytwarzania modyfikowanego propeptydu GDF-8 według wynalazku obejmującego etapy:

(a) wytwarzania cząsteczki cDNA kodującej propeptyd według wynalazku, w której miejsce cięcia proteolitycznego jest zmienione;

(b) wytwarzania cząsteczki cDNA kodującej region Fc cząsteczki IgG; oraz (c) połączenia cząsteczek cDNA z etapów (a) i (b) z wytworzeniem zmodyfikowanego propeptydu GDF-8.

Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje ponadto wytworzenie dwuniciowego oligonukleotydu kodującego peptyd łącznikowy i przyłączenie cząsteczek cDNA z etapów (a) i (b) do któregoś z koń ców dwuniciowego oligonukleotydu kodującego peptyd łącznikowy. Korzystnie peptyd łącznikowy stosowany w sposobie według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową składającą się z GSGS.

Dalszym przedmiotem wynalazku jest rekombinowana komórka zawierająca kwas nukleinowy kodujący modyfikowany propeptyd GDF-8 według wynalazku.

Krótki opis figur

Figura 1 przedstawia względne aktywności biologiczne GDF-8, BMP-11 i aktywiny w teście genu reporterowego.

Figura 2 przedstawia właściwości wiązania oczyszczonego biotynylowanego ludzkiego GDF-8 w te ś cie wią zania ActRIIB.

Figura 3 przedstawia indukcję wskaźnikowej aktywności pGL3(CAGA)12 przy ED50 dla GDF-8, BMP-11 i aktywiny w obecności propeptydu GDF-8.

Figur 4 przedstawia zależne od dawki liamowanie przez propeptyd GDF-8 wiązania się biotynylowanego GDF-8 z ActRIIB.

Figura 5 przedstawia wiązanie się GDF-8 do komórek L6.

Figura 6 przedstawia zależne od dawki hamowanie przez propeptyd GDF-8 specyficznego dla GDF-8 wiązania się z komórkami L6.

Figura 7A przedstawia sekwencję aminokwasową fuzji białkowej mysi propeptyd GDF-8-Fc.

PL 207 202 B1

Figura 7B przedstawia fuzję białkową mysi propeptyd GDF-8-Fc z krótkim łącznikiem glicyna-seryna-glicyna-seryna (GSGS) oddzielającym propeptyd GDF od regionu Fc.

Figura 8A przedstawia efekt ludzkiego propeptydu GDF i dwóch fuzji białkowych mysi propeptyd GDF-8-Fc na wiązanie się GDF-8 z ActRIIB w kompetycyjnym teście ELISA.

Figura 8B przedstawia tabelę porównującą IC50 dla ludzkiego propeptydu GDF i dwóch fuzji białkowych mysi propeptyd GDF-8-Fc.

Figura 9 przedstawia względne aktywności biologiczne ludzkiego propeptydu GDF i dwóch fuzji białkowych mysi propeptyd GDF-8-Fc w teście genu reporterowego.

Figura 10 przedstawia farmakokinetykę jodowanego propeptydu GDF-8 i fuzji białkowej mysi propeptyd GDF-8-Fc po pojedynczym dożylnym podaniu 0,2 μg/mysz albo 2 μg/mysz, odpowiednio.

Figura 11A przedstawia sekwencję aminokwasową fuzji białkowej ludzki propeptyd GDF-8-Fc

IgG1.

Figura 11B przedstawia sekwencję aminokwasową fuzji białkowej ludzki propeptyd GDF-8-Fc IgGl zmodyfikowanej w celu zmniejszenia funkcji efektorowej.

Figura 12 przedstawia zależne od dawki hamowanie wiązania się GDF-8 z ActRIIB w kompetycyjnym teście ELISA przez ludzki propeptyd GDF-8 i dwie fuzje białkowe ludzki propeptyd GDF-8-Fc.

Figura 13 to wykres przedstawiający, że zmodyfikowany propeptyd GDF-8 podawany in vivo zwięk-sza masę mięśnia brzuchatego łydki i czworogłowego i zmniejsza masę tłuszczową, ale nie ma wpływu na masę nerki albo wątroby w porównaniu do myszy nie traktowanych albo myszy traktowanych białkiem kontrolnym, IgG2aFc.

Figury 14A-P przedstawiają sekwencje aminokwasowe i sekwencje nukleotydowe odpowiadające SEK NR ID 1-16 i dotyczące ich adnotacje.

Definicje

Terminy „GDF-8”, „białko GDF-8” albo „polipeptyd GDF-8” dotyczą specyficznego czynnika różnicowania wzrostu, włączając w to między innymi ten przedstawiony w SEK NR ID: 1 i dowolne znane obecnie lub opisane później homologi, włączając w to homologi z innych gatunków. Szczególnie korzystne są homologi ssacze, najkorzystniej ludzkie. Niniejszy wynalazek obejmuje również cząsteczki GDF-8 i homologi ze wszystkich innych źródeł, włączając w to między innymi GDF-8 z wołu, psa, kota, kury, myszy, szczura, świni, indyka, pawiana i ryby. Różne cząsteczki GDF-8 zostały opisane w McPherron i wsp. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:12457-12461. Homologi są dobrze znane w dziedzinie. Homologię można ustalić dowolną metodą znaną w dziedzinie, jak tu opisano. GDF-8 lub białko GDF-8 może być występującym naturalnie albo syntetycznym. Terminy obejmują nie poddaną obróbce prekursorową postać białka („białko prekursorowe GDF-8”), jak również postaci dojrzałe będące wynikiem potranslacyjnego cięcia propeptydu. Termin dotyczy również dowolnych fragmentów albo wariantów GDF-8, które zachowują jedną albo więcej aktywności biologicznych związanych z białkiem GDF-8, jak tu opisano, włączając w to sekwencje, które zostały zmodyfikowane przez konserwatywne albo niekonserwatywne zmiany w sekwencji aminokwasowej.

„Dojrzały GDF-8” dotyczy części białka albo polipeptydu, która jest odcinana od karboksykońcowej domeny białka prekursorowego GDF-8. Ludzka postać dojrzałego białka GDF-8 jest przedstawiona w SEK NR ID: 3. Dojrzały GDF-8 może być występującym naturalnie albo syntetycznym. Dojrzały GDF-8 może być obecny jako monomer, homodimer albo może być obecny w kompleksie GDF-8 w stanie latencji. W zależności od warunków in vivo albo in vitro dojrzały GDF-8 może być w równowadze z dowolnym albo wszystkimi tymi różnymi postaciami. Bez ograniczania się do mechanizmu, uważa się, że GDF-8 jest aktywny biologicznie jako homodimer. W swojej postaci aktywnej, dojrzały GDF-8 jest określany również jako „aktywny GDF-8”.

Określenie „aktywność GDF-8” dotyczy jednej albo więcej fizjologicznych aktywności regulowania wzrostu albo morfogenetycznych związanych z aktywnym białkiem GDF-8. Przykładowo, aktywny GDF-8 jest negatywnym regulatorem masy mięśni szkieletowych. Aktywny GDF-8 może również modulować wytwarzanie enzymów specyficznych dla mięśni (np. kinazy kreatynowej), stymulować proliferację komórkową mioblastów i modulować różnicowanie prekursorów komórek tłuszczowych do komórek tłuszczowych. Uważa się również, że GDF-8 zwiększa wrażliwość na pobieranie insuliny w tkankach obwodowych, a w szczególności w mięśniu szkieletowym lub komórkach tłuszczowych. A zatem aktywności biologiczne GDF-8 obejmują miedzy innymi hamowanie tworzenia się mięśnia, hamowanie wzrostu komórki mięśniowej, hamowanie rozwoju mięśnia, zmniejszenie masy mięśniowej, regulację enzymów specyficznych wobec mięśni, hamowanie proliferacji, regulację komórkową mioblastów, modulowanie różnicowania się prekursorów komórek tłuszczowych do komórek tłuszczo6

PL 207 202 B1 wych, zwiększenie wrażliwości na insulinę, regulowanie pobierania glukozy, hemostazy glukozowej oraz modulowanie rozwoju i podtrzymywania komórek neuronowych. Ludzka postać białka prekursorowego GDF-8 pełnej długości jest przedstawiona w SEK NR ID: 1.

„Propeptyd GDF-8” dotyczy polipeptydu, który jest odcinany od aminokońcowej domeny białka prekursorowego GDF-8. Propeptyd GDF-8 jest związany z jedną albo większą liczbą aktywności biologicznych, włączając w to między innymi zdolność do wiązania się z dojrzałym białkiem GDF-8 albo homodimerem, zdolność do hamowania jednej albo większej liczby aktywności biologicznych GDF-8, zdolność do zwiększania rozwoju mięśnia, zdolność do zwiększania masy mięśniowej, zdolność do promowania tworzenia się mięśnia i zdolność do promowania proliferacji komórek mięśniowych. Propeptyd GDF-8 może być występującym naturalnie albo syntetycznym. Przykład propeptydu GDF-8 obejmuje między innymi ludzką postać propeptydu GDF-8 przedstawioną w SEK NR ID: 5. W jednym z wykonań , propeptyd GDF-8 ma zdolność do wią zania się z domeną wiążąc ą propeptyd dojrza ł ego GDF-8. W innym wykonaniu, propeptyd GDF-8 ma zdolność do hamowania jednej albo większej liczby aktywności dojrzałego GDF-8.

Termin „inhibitor GDF-8” obejmuje dowolny czynnik zdolny do hamowania aktywności, ekspresji, obróbki albo sekrecji białka GDF-8, dojrzałego GDF-8 albo homodimeru GDF-8 lub innej aktywnej cząsteczki GDF-8, włączając w to między innymi zmodyfikowane propeptydy GDF-8 i zmodyfikowane propeptydy BMP-11. Inhibitor GDF-8 obejmuje również dowolny czynnik zdolny do zwiększania wiązania się propeptydu GDF-8 do dojrzałej cząsteczki GDF-8 albo do homodimeru GDF-8. Takie inhibitory obejmują między innymi białka, przeciwciała, peptydy, peptydomimetyki, rybozymy, oligonukleotydy antysensowne, dwuniciowe RNA i inne małe cząsteczki. W jednym z wykonań, aktywność białka GDF-8 jest hamowana przez zmodyfikowany propeptyd GDF-8 jak opisano w przykładach 3-6.

„Kompleks GDF-8 w stanie latencji” dotyczy kompleksu białek utworzonego pomiędzy dojrzałym homodimerem GDF-8 a propeptydem GDF-8. Bez ograniczania się do mechanizmu, uważa się że dwa propeptydy GDF-8 łączą się z dwiema cząsteczkami dojrzałego GDF-8 w homodimerze z wytworzeniem nieaktywnego kompleksu tetrametycznego albo w stanie latencji. Kompleks w stanie latencji może zawierać inne inhibitory GDF w miejsce albo dodatkowo poza jednym albo większą liczbą propeptydów GDF-8.

Termin „zmodyfikowany propeptyd GDF-8” dotyczy inhibitora GDF-8, który obejmuje zmodyfikowany propeptyd GDF-8, jego fragment albo wariant, który zachowuje jedną albo więcej aktywności biologicznych propeptydu GDF-8, a ponadto zawiera stabilizującą modyfikację, jak tu przedstawiono. Wariantowe postaci propeptydu GDF-8 obejmują miedzy innymi, na przykład propeptydy GDF-8, które zostały tak zmodyfikowane, że zawierają mutację (włączając w to insercję, delecję i podstawienie aminokwasów) w peptydzie sygnałowym albo miejscach cięcia proteolicznego propeptydu, dla uczynienia tych miejsc mniej podatnymi na ciecie proteolityczne. W korzystnym wykonaniu, zmodyfikowany propeptyd GDF-8 ma zasadniczo zwiększony okres półtrwania w stosunku do niezmodyfikowanego propeptydu GDF-8. W wysoce korzystnym wykonaniu zmodyfikowany propeptyd GDF-8 według wynalazku ma zwiększony okres półtrwania in vivo (mierzony na przykład metodą przedstawioną w przykładzie 8). W innym wykonaniu, zmodyfikowany propeptyd GDF-8 ma zdolność do hamowania jednej albo większej liczby aktywności dojrzałego GDF-8.

Terminy „BMP-11”, „białko BMP-11” albo „polipeptyd BMP-11” dotyczą specyficznego czynnika różnicowania wzrostu, włączając w to miedzy innymi ten przedstawiony w SEK NR ID: 7 i dowolne znane obecnie lub opisane później homologi, włączając w to homologi z innych gatunków. Szczególnie korzystne są homologi ssacze, najkorzystniej ludzkie. Różne cząsteczki BMP-11 zostały opisane w McPherron i wsp. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94:12457-12461. Homologi są dobrze znane w tej dziedzinie. Homologię można ustalić dowolną metodą znaną w tej dziedzinie, jak tu opisano. BMP-11 lub białko BMP-11 może być występującym naturalnie albo syntetycznym. Terminy obejmują nie poddaną obróbce prekursorową postać białka („białko prekursorowe BMP-11”) jak również postaci dojrzałe będące wynikiem potranslacyjnego cięcia propeptydu. Termin dotyczy również dowolnych fragmentów albo wariantów BMP-11, które zachowują jedną albo więcej aktywności biologicznych związanych z białkiem BMP-11, jak tu opisano, włączają c w to sekwencje, które został y zmodyfikowane przez konserwatywne albo niekonserwatywne zmiany w sekwencji aminokwasowej.

„Dojrzały BMP-11” dotyczy części białka albo polipeptydu, która jest odcinana od karboksykońcowej domeny białka prekursorowego BMP-11. Ludzka postać dojrzałego białka BMP-11 jest przedstawiona w SEK NR ID: 9. Dojrzały BMP-11 może być występującym naturalnie albo syntetycznym. Dojrzały BMP-11 może być obecny jako monomer, homodimer albo może być obecny w kompleksie

PL 207 202 B1

BMP-11 w stanie latencji. W zależności od warunków in vivo albo in vitro dojrzały BMP-11 może być w równowadze z dowolnym albo wszystkimi tymi różnymi postaciami. Bez ograniczania się do mechanizmu, uważa się, że BMP-11 jest aktywny biologicznie jako homodimer. W swojej postaci aktywnej, dojrzały BMP-11 jest określany również jako „aktywny BMP-11”.

„Propeptyd BMP-11 dotyczy polipeptydu, który jest odcinany od aminokońcowej domeny białka prekursorowego BMP-11. Propeptyd BMP-11 jest związany z jedną albo większą liczbą aktywności biologicznych, włączając w to między innymi zdolność do wiązania się z dojrzałym białkiem GDF-8 albo homodimerem, zdolność do hamowania jednej albo większej liczby aktywności biologicznych GDF-8, zdolność do zwiększania rozwoju mięśnia, zdolność do zwiększania masy mięśniowej, zdolność do promowania tworzenia się mięśnia i zdolność do promowania proliferacji komórek mięśniowych. Propeptyd BMP-11 może być występującym naturalnie albo syntetycznym. Przykład propeptydu BMP-11 obejmuje między innymi ludzką postać propeptydu BMP-11 przedstawioną w SEK NR ID: 11.

Termin „zmodyfikowany propeptyd BMP-11” dotyczy inhibitora GDF-8, który zawiera zmodyfikowany propeptyd BMP-11, jego fragment albo wariant, który zachowuje jedną albo więcej aktywności biologicznych propeptydu BMP-11, a ponadto zawiera stabilizującą modyfikację, jak tu przedstawiono. Wariantowe postaci propeptydu BMP-11 obejmują miedzy innymi, na przykład propeptydy BMP-11, które zostały tak zmodyfikowane, że zawierają mutację (włączając w to insercję, delecję i podstawienie aminokwasów) w peptydzie sygnałowym albo miejscach cięcia proteolicznego propeptydu, dla uczynienia tych miejsc mniej podatnymi na ciecie proteolityczne. Propeptydy GDF-8 według wynalazku są określane razem jako „propeptydy GDF”.

Białka GDF-8 według wynalazku są określane razem jako „polipeptydy GDF” albo „białka GDF”.

Sposoby i kompozycje według wynalazku dostarczają inhibitorów GDF, które zmniejszają aktywność białka GDF w stosunku do aktywności GDF porównując to samo białko GDF nie związane przez inhibitor. W pewnych wykonaniach, aktywność białka DGF po związaniu z jednym albo większą liczbą zmodyfikowanych propeptydów GDF jest zmniejszona o co najmniej około 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, a korzystniej co najmniej około 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86% i 88%, jeszcze korzystniej co najmniej około 90%, 91%, 92%, 93% lub 94%, a nawet jeszcze korzystniej co najmniej około 95% do 100%, w stosunku do tego samego białka GDF, które nie jest związane przez te zmodyfikowane propeptydy. W jednym z korzystnych wykonań, inhibitorem GDF jest zmodyfikowany propeptyd GDF-8 połączony kowalencyjnie z regionem Fc cząsteczki IgG.

Termin „modyfikacja stabilizująca” to dowolna modyfikacja znana w tej dziedzinie albo tu przedstawiona zdolna do stabilizowania białka, zwiększania czasu półtrwania białka in vitro, zwiększania czasu półtrwania białka w układzie krążenia i/lub zmniejszenia proteolitycznej degradacji białka. Takie stabilizujące modyfikacje obejmują między innymi, ale nie ograniczają się do białek fuzyjnych (włączając w to, na przykład białko fuzyjne zawierające propeptyd GDF i drugie białko), modyfikacji miejsca glikozylacji (włączając w to, na przykład dodawanie miejsca glikozylacji do propeptydu GDF) i modyfikacji reszty węglowodanowej (włączając w to, na przykład usunięcie reszty węglowodanowej z propeptydu GDF). W przypadku modyfikacji stabilizującej, która obejmuje białko fuzyjne (np. taką, że z propeptydem GDF połączone jest drugie białko), drugie białko może być określane jako „część stabilizująca” albo „białko stabilizujące”. Przykładowo, w jednym z wykonań, zmodyfikowany propeptyd GDF-8 według wynalazku zawiera fuzję pomiędzy ludzkim propeptydem GDF-8 (ze zinaktywowanym miejscem cięcia) i cząsteczką IgG (gdzie IgG działa jako białko stabilizujące albo część stabilizująca). Stosowany tu termin „część stabilizująca” poza tym, że odnosi się do drugiego białka białka fuzyjnego, obejmuje również niebiałkowe modyfikacje, takie jak reszta węglowodanowa albo niebiałkowy polimer.

Terminy „wyizolowany” lub „oczyszczony” dotyczą cząsteczki, która jest zasadniczo wolna od swojego naturalnego środowiska. Przykładowo, wyizolowane białko jest zasadniczo wolne od materiału komórkowego lub innych zanieczyszczających białek ze źródła komórkowego albo tkankowego, z którego pochodzi. Określenie „zasadniczo wolne od materiału komórkowego” dotyczy preparatów, gdzie izolowane białko jest w co najmniej 70% do 80% (wag./wag.) czyste, korzystniej w co najmniej 80%-89% (wag./wag.) czyste, jeszcze korzystniej w co najmniej 90%-95%) (wag./wag.) czyste, a najkorzystniej w co najmniej 96%, 97%, 98%, 99% lub 100% (wag./wag.) czyste.

Termin „miejsce cięcia” dotyczy miejsca proteolitycznego w białku albo polipeptydzie, które działa poprzez enzym proteolityczny, przecinający wiązanie peptydowe. W jednym z wykonań, miejsce cięcia według wynalazku to „RSRR” przedstawione przy użyciu jednoliterowego kodu aminokwasowego.

PL 207 202 B1

Termin „region Fc cząsteczki IgG” dotyczy domeny Fc immunoglobuliny o izotypie IgG, co jest dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Region Fc cząsteczki IgG to część cząsteczki IgG (IgG1, IgG2, IgG3 i IgG), która jest odpowiedzialna za zwiększanie okresu półtrwania cząsteczki IgG in vivo w surowicy. Korzystnie, jeżeli cząsteczką IgG jest IgG1.

„Okres półtrwania in vitro” dotyczy stabilności białka mierzonej poza kontekstem żywego organizmu. Testy do mierzenia okresu półtrwania in vitro są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują miedzy innymi SDS-PAGE, ELISA, testy komórkowe, puls-śledzenie, technikę Western, technikę Northern, itd. Te i inne przydatne testy są dobrze znane w tej dziedzinie.

„Okres półtrwania in vivo” dotyczy stabilności białka w organizmie. Okres półtrwania in vivo można mierzyć przy zastosowaniu wielu metod znanych w tej dziedzinie obejmujących między innymi okresu półtrwania in vivo w surowicy, okresu półtrwania w obiegu oraz testów przedstawionych tu w przykładach.

„Okres półtrwania in vivo w surowicy” dotyczy okresu półtrwania białka krążącego we krwi organizmu. W jednym z wykonań okres półtrwania in vivo mierzy się jak przedstawiono w przykładzie 8. Do mierzenia okresu półtrwania in vivo można zastosować inne metody znane w tej dziedzinie.

Termin „ssak” obejmuje definicje znane w tej dziedzinie, a także dotyczy dowolnego zwierzęcia zaklasyfikowanego jako ssak, włączając w to ludzi, zwierzęta udomowione i hodowlane oraz zwierzęta w zoo, sportowe lub domowe, takie jak psy, koty, owce, świnie, krowy itd. W korzystnym wykonaniu ssakiem jest człowiek.

Termin „nadrodzina TGF-β” dotyczy rodziny strukturalnie spokrewnionych czynników wzrostu, z których każdy posiada ważne fizjologicznie właściwości regulowania wzrostu i morfogenetyczne. Ta rodzina strukturalnie spokrewnionych czynników wzrostu jest dobrze znana w tej dziedzinie (Kingsley i wsp. (1994) Genes Dev. 8:133-46 oraz Hoodless i wsp. (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-72). Nadrodzina TGF-β obejmuje białka morfogenezy kości (BMP), aktywiny, inhibiny, substancję hamującą Mullerian, czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego oraz ciągle rosnącą liczbę czynników wzrostu i różnicowania (GDF), takich jak GDF-8 (miostatyna). Wiele z tych białek jest spokrewnionych GDF-8 pod względem struktury, tak jak BMP-11 (znany również jako GDF-11) i/lub aktywności, tak jak aktywina.

Termin „leczenie” dotyczy zarówno traktowania terapeutycznego jak i postępowania profilaktycznego i zapobiegawczego. Wymagający leczenia mogą obejmować osobniki już mające konkretne zaburzenie medyczne, jak również te, które mogą ostatecznie zostać dotknięte chorobą (tj. te wymagające postępowania zapobiegawczego).

Terminy „transformacja” i „transfekcja” dotyczą rozmaitych znanych w tej dziedzinie technik do wprowadzania obcego kwasu nukleinowego (np. DNA i RNA) do komórki gospodarza, włączając w to miedzy innymi współwytrącanie fosforanem wapniowym lub chlorkiem wapniowym, transfekcję za pośrednictwem DEAE-dekstran, lipofekcję i elektroporację.

T a b e l a 1

SEK NR ID:	Nazwa	Typ
1	2	3
1	ludzkie białko prekursorowe GDF-8	białko
2	ludzkie białko prekursorowe GDF-8	DNA
3	ludzki dojrzały GDF-8	białko
4	ludzki dojrzały GDF-8	DNA
5	ludzki propeptyd GDF-8	białko
6	ludzki propeptyd GDF-8	DNA
7	ludzkie białko prekursorowe BMP-11	białko
8	ludzkie białko prekursorowe BMP-11	DNA
9	ludzki dojrzały BMP-11	białko
10	ludzki dojrzały BMP-11	DNA
11	ludzki propeptyd BMP-11	białko

PL 207 202 B1 cd. tabeli 1

1	2	3
12	ludzki propeptyd BMP-11	DNA
13	sekwencja sygnałowa GDF-8	białko
14	sekwencja sygnałowa BMP-11	białko
15	IgG-Fc	białko
16	zmodyfikowana IgG-Fc	białko

Szczegółowy opis wynalazku

Niniejszy wynalazek opiera się, co najmniej po części, na ujawnieniu, że propeptydy GDF-8 mają krótki okres półtrwania in vivo, co zmniejsza ich skuteczność jako farmakologicznych inhibitorów aktywności GDF-8 i BMP-11. A zatem, w jednym z wykonań, wynalazek przedstawia zmodyfikowane i stabilizowane propeptydy GDF-8 mające lepsze właściwości farmakokinetyczne, a w szczególności zwiększony okres półtrwania w obiegu.

Niniejszy wynalazek dostarcza nowych zmodyfikowanych propeptydów GDF. które tworzą nieaktywne kompleksy z białkami GDF (np. białkami GDF-8 i BMP-11) in vitro i in vivo. Korzystnie, jeżeli zmodyfikowane propeptydy GDF według wynalazku wiążą się z domeną wiążącą propeptyd dojrzałego białka GDF. A zatem, w pewnych wykonaniach wynalazku, zmodyfikowany propeptyd GDF obejmuje białko fuzyjne pomiędzy propeptydem GDF a białkiem stabilizującym. Białkiem stabilizującym może być dowolne białko, które zwiększa ogólną stabilność zmodyfikowanego propeptydu GDF. Co będzie wiadome dla specjalisty w tej dziedzinie, takie białka fuzyjne mogą ewentualnie zawierać łącznik peptydowy pomiędzy częścią propeptydową a częścią stabilizującą. Jak dobrze wiadomo w tej dziedzinie, białka fuzyjne wytwarza się w taki sposób, aby drugie białko było połączone w ramce z pierwszą częścią, tak, że uzyskane w rezultacie w wyniku translacji białko zawiera obydwa, pierwsze i drugie białko. Przykładowo, w niniejszym wynalazku białko fuzyjne można wytworzyć tak, aby część będąca propeptydem GDF była połączona z drugim białkiem (np., częścią będącą białkiem stabilizującym). Takie białko fuzyjne wytwarza się tak, że uzyskane w rezultacie w wyniku translacji białko zawiera obydwa, część propeptydową i część stabilizującą.

W innych wykonaniach, propeptyd GDF obejmuje propeptyd GDF, który jest zmodyfikowany, aby mieć dłuższy okres półtrwania w obiegu w porównaniu z niezmodyfikowanym propeptydem GDF. Jakkolwiek precyzyjny mechanizm i czas wiązania zmodyfikowanego propeptydu GDF jest nieznany, uważa się, że zmodyfikowane propeptydy GDF-8 według wynalazku wiążą się z dojrzałym GDF-8 i BMP-11. W korzystnym wykonaniu niniejszy wynalazek dostarcza zmodyfikowanych propeptydów GDF, które tworzą nieaktywne kompleksy z białkami GDF-8 i BMP-11 in vivo lub in vitro. W jednym z wykonań propeptydy GDF wiążą się preferencyjnie z domeną wiążącą propeptyd dojrzałego białka GDF-8 lub dojrzałego białka BMP-11. Takie wiązania mogą następować, na przykład, po uwolnieniu natywnego propeptydu z miejsca aktywnego GDF-8 i BMP-11, po wymianie natywnego propeptydu na zmodyfikowany GDF-8 i/lub po odcięciu propeptydu z białka prekursorowego GDF-8 i BMP-11. Niezależnie od mechanizmu, wiązanie zmodyfikowanego propeptydu GDF-8 prowadzi do zmniejszenia jednej albo większej liczby aktywności biologicznych związanych z GDF-8 w stosunku do dojrzałego białka GDF-8, które nie jest związane z tym samym zmodyfikowanym propeptydem. W jednym z korzystnych wykonań zmodyfikowane propeptydy GDF-8 zmniejszają aktywność GDF-8 i BMP-11 związaną z negatywną regulacją masy mięśni szkieletowych.

W innym korzystnym wykonaniu niniejszy wynalazek dostarcza zmodyfikowanych propeptydów GDF, które tworzą nieaktywne kompleksy z białkami BMP-11 in vivo lub in vitro. W jednym z wykonań propeptydy GDF wiążą się preferencyjnie z domeną wiążącą propeptyd dojrzałego białka BMP-11. W jeszcze innym wykonaniu zmodyfikowany propeptyd GDF to biał ko fuzyjne zawierają ce propeptyd GDF i region Fc cząsteczki IgG (białko stabilizujące). Takie inhibitory GDF mogą zawierać propeptyd GDF (na przykład jak przedstawiono w SEK NR ID: 5 lub 11) albo fragment lub wariant takiego propeptydu, który zachowuje jedną albo więcej aktywności biologicznych propeptydu GDF. Takie zmodyfikowane propeptydy GDF są zdolne do hamowania aktywności białek GDF. Propeptydy GDF-8 zastosowane w wynalazku mogą być wytwarzane syntetycznie, pochodzić z naturalnie występujących (natywnych) propeptydów GDF-8, albo mogą być wytwarzane poprzez rekombinowanie DNA, z zastosowaniem rozmaitych odczynników, komórek gospodarzy i sposobów, które są dobrze znane w dziedzinie inżynierii genetycznej. W jednym z wykonań zmodyfikowany propeptyd GDF-8 zawiera ludzki

PL 207 202 B1 propeptyd GDF-8 połączony kowalencyjnie z cząsteczką IgG albo jej fragmentem. Propeptyd GDF-8 może być połączony w bezpośrednio z regionem Fc cząsteczki IgG albo może być połączony z regionem Fc cząsteczki IgG poprzez łącznik polipeptydowy. Zastosowanie takich łączników jest dobrze znane w tej dziedzinie.

W niektórych wykonaniach gdzie zmodyfikowane propeptydy GDF według wynalazku obejmują białka fuzyjne, część będąca propeptydem GDF w białku fuzyjnym jest korzystnie w co najmniej około 75%-80% identyczna z SEK NR ID: 5, korzystniej, w co najmniej około 81% do około 85% identyczna z SEK NR ID: 5, jeszcze bardziej korzystnie, w co najmniej około 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% lub 94% identyczna z SEK NR ID: 5, a jeszcze korzystniej, w co najmniej około 95%, 96%, 97%, 98%, 99% lub 100% identyczna z SEK NR ID: 5. W korzystnym wykonaniu propeptydy GDF-8 zawierają sekwencję identyczną z sekwencjami przedstawionymi w SEK NR ID: 5. W jeszcze innym korzystnym wykonaniu część będąca propeptydem GDF białka fuzyjnego według wynalazku może zawierać fragment wariantu propeptydu GDF przedstawionego w SEK NR ID: 5, o ile fragment albo wariant zachowuje jedną albo więcej aktywności biologicznych propeptydu GDF. W innym korzystnym wykonaniu zmodyfikowane propeptydy GDF-8 obejmują zmutowane wersje SEK NR ID: 5, przy czym mutant został zmodyfikowany, tak, że zawiera jedną albo więcej mutacji (włączając w to insercję, delecje lub podstawienie), o ile fragment albo wariant zachowuje jedną albo więcej aktywności biologicznych propeptydu GDF.

Istotnie, w wykonaniach według wynalazku obejmujących białka fuzyjne zawierające zmodyfikowane GDF ważne jest, aby białko fuzyjne było wytworzone albo zaprojektowane tak, aby w uzyskanym w rezultacie białku fuzyjnym natywne miejsce cięcia proteolitycznego (np. RSRR) w propeptydzie GDF było przerwane, zniszczone, zinaktywowane albo usunięte. Jak specjalista w tej dziedzinie będzie mógł się zorientować, wynikiem niepowodzenia w dokonaniu tego byłoby odcięcie drugiego białka (np. części stabilizującej) białka fuzyjnego od pierwszego białka (części propeptydowej) białka fuzyjnego. A zatem istotny aspekt wynalazku dotyczy dokonania inaktywacji albo eliminacji natywnego miejsca cięcia w propeptydach GDF, kiedy stosuje się taki propeptyd do wytworzenia białka fuzyjnego, który jest zmodyfikowanym propeptyd GDF według wynalazku. Sposoby inaktywowania takiego miejsca proteolitycznego są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują miedzy innymi mutację, delecję albo insercję sekwencji aminokwasowej lub nukleotydowej proteolitycznego miejsca cięcia.

W jeszcze innych wykonaniach wynalazku, można dokonać mutacji w sekwencji GDF aby uczynić te miejsca mniej podatnymi na cięcie proteolityczne. Na przykład, w jednym z wykonań, taki mutant może zawierać mutację punktową w pozycjach aminokwasowych 45, 46, 49, 50, 52, 53, 63, 64, 65, 66, 98 lub 99 SEK NR ID: 1. W korzystnym wykonaniu mutacją punktową jest mutacja punktowa aminokwasu 99 w SEK NR ID: 1 z Asp na Ala. W innym korzystnym wykonaniu takiej mutacji punktowej można dokonać dla aminokwasów z SEK NR ID: 11. Analizę komputerową (przy użyciu dostępnego handlowo oprogramowania np. MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) można również zastosować do identyfikowania miejsc cięcia proteolitycznego. Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że dowolną z opisanych mutacji, wariantów albo modyfikacji można uzyskać na poziomie kwasu nukleinowego. Takie techniki są dobrze znane w tej dziedzinie.

T a b e l a 2

Przykładowe aminokwasy, które można zmutować aby zapobiec cięciu propeptydu GDF-8 (Numery aminokwasów odnoszą się do SEK NR ID: 1)

Arg-45	Lys-63
Gln-46	Leu-64
Lys-49	Arg-65
Ser-50	Leu-66
Arg-52	Arg-98
Ile-53	ASP-99

Jak zaznaczono powyżej, wynalazcy stwierdzili, że propeptydy GDF mają krótki okres półtrwania in vivo. A zatem, aby być przydatnym farmaceutycznie albo jako czynnik terapeutyczny lub profilaktyczny, propeptyd GDF musi być stabilizowany chemicznie albo fizycznie w celu zwiększenia trwałości w warunkach fizjologicznych.

PL 207 202 B1

Propeptydy GDF mogą być stabilizowane lub modyfikowane dowolnymi metodami znanymi w tej dziedzinie, tak długo jak zmodyfikowany propeptyd GDF zachowuje zdolność do hamowania białka GDF albo dojrzałego białka GDF. W korzystnym wykonaniu, zmodyfikowany propeptyd GDF zachowuje zdolność do wiązanie się z docelowym miejscem wiązania w białku GDF albo propeptydzie GDF. W jednym z korzystnych wykonań , zmodyfikowany propeptyd GDF stanowi propeptyd GDF-8 połączony bezpośrednio albo poprzez łącznik z regionem Fc cząsteczki IgG. Region Fc cząsteczki IgG ma efekt ochronny albo stabilizujący wobec propeptydu (a zatem działa jako modyfikacja stabilizująca), co znajduje odzwierciedlenie w polepszeniu właściwości farmakokinetycznych (tj. zwiększonym okresie półtrwania w surowicy) białka fuzyjnego w porównaniu z odpowiednim niezmodyfikowanym propeptydem GDF-8.

W konkretnym wykonaniu zmodyfikowany propeptyd GDF-8 stanowi ludzki propeptyd GDF-8 albo zmutowany ludzki propeptyd GDF-8, a cząsteczką IgG jest region Fc IgG1 lub IgG4 albo region Fc IgG1 zmodyfikowany w celu zmniejszenia funkcji efektorowej. W jednym z wykonań fragmentem IgG jest IgG1 (SEK NR ID: 15). W innym wykonaniu fragmentem IgG jest IgG1 zmodyfikowany w celu zmniejszenia funkcji efektorowej (SEK NR ID: 16). Przykłady cząsteczek zmodyfikowanych w celu zmniejszenia funkcji efektorowej obejmują modyfikację fuzji ludzkiej IgG1-Fc z włączoną alaniną (A) w pozycjach aminokwasowych 14 i 17, jak przedstawiono w SEK NR ID: 16.

Zmodyfikowane propeptydy GDF-8 można izolować albo oczyszczać zgodnie ze standardowymi procedurami izolacji i oczyszczania białka dobrze znanymi w tej dziedzinie.

Niniejszy wynalazek dostarcza również sposobów wytwarzania zmodyfikowanych propeptydów GDF mających zwiększony okres półtrwania in vivo lub in vitro. W jednym z korzystnych wykonań sposób obejmuje wytwarzanie zmodyfikowanego propeptydu GDF stanowiącego białko fuzyjne GDF-8/Fc IgG1 poprzez wytworzenie cząsteczki cDNA kodującej:

(1) propeptyd GDF (na przykład ludzki propeptyd GDF-8, SEK NR ID: 5), który jest zmodyfikowany tak, aby zinaktywować miejsce cięcia proteolitycznego i region Fc cząsteczki IgG (na przykład region Fc ludzkiej cząsteczki IgG SEK NR ID: 15);

(2) wyrażenie cDNA w odpowiednim prokariotycznym albo eukariotycznym systemie ekspresji z zastosowaniem odpowiednich plazmidów ekspresyjnych i komórek; oraz (3) izolowanie i oczyszczenie wyrażonych białek fuzyjnych zawierających zmodyfikowany propeptyd GDF, przy czym zmodyfikowany propeptyd GDF ma zwiększony okres półtrwania in vivo lub in vitro w porównaniu z niezmodyfikowanym propeptydem GDF.

Przykład takiego korzystnego zmodyfikowanego propeptydu GDF jest przedstawiony na fig. 11 A.

Systemy do ekspresji cDNA są dobrze znane w biologii molekularnej, podobnie jak sposoby izolowania i oczyszczania wyrażanych białek (przykłady 2 i 7, tutaj, dostarczają przykładów takich wykonań).

W alternatywnym wykonaniu, konstrukty cDNA zastosowane do ekspresji takich biał ek fuzyjnych mogą zawierać nukleotydy kodujące peptyd łącznikowy pomiędzy nukleotydami kodującymi propeptyd GDF-8 i regionem Fc IgG (albo częścią stabilizującą). Orientacja peptydu łącznikowego w stosunku do GDF albo regionu Fc IgG jest nieważna. Peptyd łącznikowy mogą stanowić nukleotydy kodujące odcinek o długości 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 lub więcej aminokwasów. W konkretnym wykonaniu, peptyd łącznikowy mogą stanowić nukleotydy kodujące sekwencję aminokwasową składającą się z glicyny-seryny-glicyny-seryny (GSGS).

W innym wykonaniu plazmidy ekspresyjne mog ą zawierać ewentualnie znacznik dla dogodnej izolacji i oczyszczania wyrażanych białek. Zastosowanie takich plazmidów do ekspresji ze znacznikiem i sposoby izolowania i oczyszczania produktów białkowych ze znacznikiem są dobrze znane w tej dziedzinie.

Propeptydy GDF według wynalazku obejmują w szczególności białka fuzyjne, w których część będąca propeptydem GDF cząsteczki jest identyczna albo w ponad 60% homologiczna z sekwencjami odpowiadającymi GDF z poszczególnych gatunków, podczas gdy część stabilizująca, taka jak region Fc cząsteczki IgG może być identyczna albo w ponad 60% homologiczna z sekwencjami odpowiadającymi IgG z innych gatunków. Przykładowo, ludzki propeptyd GDF-8 albo jego fragment można połączyć z regionem Fc mysiej cząsteczki IgG, albo odwrotnie, o ile otrzymane w rezultacie białko fuzyjne wykazuje pożądaną aktywność biologiczną, a mianowicie hamowanie biologicznej aktywności GDF, jak przedstawiono w przykładach 3-6. W korzystnych wykonaniach wynalazku białkami fuzyjnymi według wynalazku są chimery białek ludzkich. Co będzie zrozumiałe w tej dziedzinie, ludzkie białka chimerowe albo białka fuzyjne będą korzystne przy leczeniu ludzi.

PL 207 202 B1

Jako alternatywa albo dodatkowo w stosunku do opisanych powyżej białek fuzyjnych z Fc, propeptydy GDF mogą być stabilizowanie przy zastosowaniu wielu innych metod i zasobów materiałowych, które są dobrze znane i łatwo dostępne w dziedzinie dotyczącej białek. Takie metody i materiały obejmują na przykład glikozylację albo połączenie z albuminą lub polimerem niebiałkowym, jak opisano szczegółowo poniżej. Zmodyfikowane propeptydy GDF-8 można wyizolować i oczyszczać stosując standardowe techniki izolowania i oczyszczania dobrze znane w dziedzinie dotyczącej białek.

Propeptydy GDF albo zmodyfikowane propeptydy GDF można wytwarzać przy zastosowaniu wielu znanych w tej dziedzinie technik. Przykładowo, takie propeptydy można syntetyzować (np. chemicznie albo poprzez rekombinowanie DNA), izolować i oczyszczać i testować pod kątem ich zdolności do tworzenia kompleksów z dojrzałym białkiem GDF-8 albo dojrzałym białkiem BMP-11 stosując metody tu opisane albo metody znane w tej dziedzinie. Propeptydy można syntetyzować stosując standardowe techniki chemii białek, jak te opisane w Bodansky, M. Principles ol Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) oraz Grant G.A. (wyd.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W.H. Freeman and Company, New York (1992). Ponadto, dostępne handlowo są automatyczne syntetyzatory peptydów (np. Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600).

Alternatywnie, zmodyfikowane lub niezmodyfikowane propeptydy GDF albo ich fragmenty można wytwarzać poprzez rekombinowanie DNA stosując różne systemy ekspresyjne (np. E. coli, komórki jajnika chomika chińskiego, komórki COS, bakulowirusy) dobrze znane w tej dziedzinie. Przykładowo, wyrażony propeptyd GDF-8 można oczyścić, na przykład, stosując metodę opisaną w Bottinger i wsp. (1996) PNAS 93:5877-5882 oraz Gentry i Nash (1990) Biochemistry 29:6851-6857, albo dowolną inną znaną w tej dziedzinie metodą oczyszczania peptydów. Alternatywnie, do zmodyfikowanego lub niezmodyfikowanego propeptydu GDF albo jego fragmentu można dodać znacznik, na przykład FLAG lub 6-His w celu ich oczyszczenia przy zastosowaniu technik znanych w dziedzinie dotyczącej białek.

Zmodyfikowane lub niezmodyfikowane propeptydy GDF-8 można ponadto wytwarzać poprzez trawienie GDF-8 występujących naturalnie albo wytworzonych poprzez rekombinowanie DNA stosując na przykład proteazę, np., trypsynę, termolizynę, chymotrypsynę, pepsynę albo enzym konwertujący pary aminokwasów zasadowych (PACE, od ang. paired basie amino acid converting enzyme). Analizę komputerową (z użyciem dostępnego handlowo oprogramowania, np. MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) można zastosować do identyfikacji miejsc cięcia proteolitycznego. Alternatywnie, takie propeptydy GDF można wytworzyć z GDF-8 występujących naturalnie albo wytworzonych poprzez rekombinowanie DNA stosując standardowe techniki znane w tej dziedzinie, takie jak cięcie chemiczne (np., z użyciem cyjanobromku, hydroksylaminy).

Proteolityczne albo syntetyczne części propeptydów GDF-8 zmodyfikowanego propeptydu GDF mogą zawierać tyle reszt aminokwasowych ile jest niezbędnych dla wiązania się z docelowym białkiem GDF, hamując w ten sposób, częściowo albo całkowicie, aktywność GDF-8 lub BMP-11. Przykłady 4-6, tutaj, ilustrują wykonania testów wiązania i hamowania. Konkretnie, fragmenty funkcjonalne sekwencji propeptydów GDF-8, które zachowują zdolność do modulowania albo hamowania GDF-8 są objęte zakresem wynalazku. Korzystne jest jeżeli części propeptydu GDF mają długość co najmniej 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 lub 90 aminokwasów, korzystniej co najmniej 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 lub 190 aminokwasów, a najkorzystniej co najmniej 200, 210, 220, 230 lub 240 albo więcej aminokwasów. W korzystnym wykonaniu część propeptydu GDF-8 zmodyfikowanego propeptydu GDF-8 ma długość 243 aminokwasów, tj. odpowiadającą SEK NR ID: 5. Sekwencja sygnałowa ludzkiego GDF-8 jest przedstawiona w SEK NR ID: 13 i obejmuje pierwszych 23 aminokwasów z SEK NR ID: 1.

Zidentyfikowanie częściowej sekwencji propeptydu GDF-8 jako fragmentu funkcjonalnego można łatwo uzyskać, na przykład stosując testy opisane tu w przykładach 4-6.

Poza sekwencjami skróconych propeptydów, warianty propeptydów obejmują tu w szczególności propeptydy GDF mające mutacje punktowe lub inne modyfikacje (włączając w to insercię, delecję i podstawienie) o ile takie warianty zawierają jedną lub wię cej pożądanych aktywnoś ci biologicznych albo hamujących propeptydu GDF. Taką aktywność można mierzyć na przykład jak opisano w przykładach 4-6. Takie modyfikacje można wprowadzić do cząsteczki dla zwiększenia aktywności, okresu półtrwania w obiegu albo przy przechowywaniu lub wytwarzania propeptydu GDF-8. Przykładowo, można wprowadzić mutacje punktowe do jednego albo większej liczby miejsc cięcia proteolitycznego w celu zapobieżenia albo zahamowania degradacji proteolitycznej zmodyfikowanego propeptydu GDF-8

PL 207 202 B1 in vivo. Analizę komputerową (przy użyciu dostępnego handlowo oprogramowania np. MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) można zastosować do identyfikowania miejsc cięcia proteolitycznego.

A zatem, sposoby wytwarzania propeptydów GDF według wynalazku obejmują w szczególności, poza sekwencjami kodującymi cDNA typu dzikiego, sekwencje kodujące cDNA, które kodują propeptydy GDF typu dzikiego, ale które różnią się od sekwencji cDNA GDF typu dzikiego na skutek degeneracji kodu genetycznego albo zmienności allelicznej (naturalnie występujące zmiany zasad u gatunków w populacji, które mogą prowadzić albo nie do zmiany aminokwasowej). Wynalazek bierze również pod uwagę sekwencje DNA, które hybrydyzują w ostrych warunkach hybrydyzacji (w jednym z wykonań jak opisano w T. Maniatis i wsp. (1982) Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, str. 387-389) z kwasem nukleinowym kodującym propeptyd GDF albo kwasem nukleinowym kodującym białko lub polipeptyd mające zdolność do wiązania się z konkretnym białkiem GDF, jak przedstawiono w przykładach 4-6. Warianty sekwencji cDNA będące wynikiem mutacji punktowych albo indukowanych modyfikacji (np. insercji, delecji i podstawienia) dla zwiększenia aktywności, okresu półtrwania albo wytwarzania kodowanych przez nie propeptydów GDF-8 są również przydatne w niniejszym wynalazku. Programy komputerowe przydatne do określania homologii sekwencji DNA są znane w tej dziedzinie i tu opisane.

Zdolność zmodyfikowanego propeptydu GDF do tworzenia niekowalencyjnego kompleksu z białkiem GDF można oceniać różnymi metodami znanymi w tej dziedzinie, włączając w to sączenie molekularne i analizę z zastosowaniem połączeń krzyżowych jak tu opisano w przykładzie 2. Jak pokazano w przykładzie 2, propeptyd GDF-8 tworzy niekowalencyjne połączenie z dojrzałym białkiem GDF-8. Kompleks dojrzały GDF-8/propeptyd GDF-8 ma widoczną masę cząsteczkową około 75 kD.

Jak nadmieniono powyżej, poza metodą fuzji z Fc, propeptydy GDF można stabilizować przy zastosowaniu wielu innych technik. W jednym z wykonań część stabilizująca jest połączona kowalencyjnie z częścią będącą propeptydem GDF z wytworzeniem białka fuzyjnego. Przykładowo, propeptyd GDF-8 może być połączony z jednym albo większą liczbą niebiałkowych polimerów, np. glikolem polietylenowym, glikolem polipropylenowym lub polioksyalkilenami w sposób przedstawiony w patentach USA nr 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 lub 4179337. W pewnych wykonaniach propeptydy GDF mogą być zmodyfikowane chemicznie poprzez kowalencyjne połączenie z polimerem dla zwiększenia ich okresu półtrwania w obiegu. Korzystne polimery i sposoby ich przyłączania do peptydów są również opisane w patentach USA nr 4766106, 4179337, 4495285 i 4609546.

W innym wykonaniu propeptyd GDF-8 może być zmodyfikowany tak, aby miał zmieniony wzór glikozylacji (tj. odmienny od wzoru glikozylacji typu dzikiego). Zgodnie ze stosowanym tu terminem, „zmieniony” oznacza posiadanie jednej albo więcej reszt węglowodanowych dodanych do albo usuniętych z propeptydu GDF typu dzikiego. Glikozylacja białek i polipeptydów ma miejsce zazwyczaj poprzez połączenie przez N lub połączenie przez O. Połączenie przez N oznacza przyłączenie reszty węglowodanowej do łańcucha bocznego reszty asparaginowej. Sekwencje tripeptydów asparagina-X-seryna i asparagina-X-treonina, gdzie X to dowolny aminokwas oprócz proliny, są rozpoznawanymi sekwencjami dla enzymatycznego przyłączenia reszty węglowodanowej do łańcucha bocznego reszty asparaginowej. A zatem obecność w polipeptydzie jednej z tych sekwencji tripeptydów tworzy potencjalne miejsce glikozylacji. Glikozylacja poprzez O oznacza przyłączenie jednego z cukrów N-acetylogalaktozaminy, galaktozy lub ksylozy, do kwasu hydroksyaminowego, najczęściej seryny lub treoniny, jakkolwiek może zostać wykorzystana 5-hydroksyprolina lub 5-hydroksylizyna.

Dodanie lub delecję miejsc glikozylacji do propeptydu GDF dogodnie jest przeprowadzić poprzez zmianę sekwencji aminokwasowej, tak że zawiera ona lub brak w niej jednego albo większej liczby opisanych powyżej sekwencji tripeptydów (dla miejsc N-glikozylacji). Zmiany można również dokonać poprzez dodanie albo zastąpienie jednej albo większej liczby reszt serynowych lub treoninowych w sekwencji propeptydu GDF typu dzikiego (dla miejsc O-glikozylacji). Ze względu na łatwość, sekwencję aminokwasową propeptydu GDF korzystnie jest zmieniać poprzez zmiany na poziomie DNA, które to techniki są dobrze znane w tej dziedzinie.

Innymi sposobami zwiększania liczby reszt węglowodanowych na propeptydzie GDF jest połączenie chemiczne albo enzymatyczne glikozydów z propeptydem GDF. Procedury te są korzystne z tego względu, że nie wymagają wytwarzania propeptydu GDF w komórce gospodarza, która ma zdolności glikozylacyjne dla przeprowadzenia N-glikozylacji i O-glikozylacji. W zależności od zastosowanego sposobu łączenia cukier(y) może być przyłączony do (a) argininy i histydyny; (b) wolnych grup karboksylowych; (c) wolnych grup sulfhydrylowych, takich jak te w cysteinie; (d) wolnych grup hydroksylowych,

PL 207 202 B1 takich jak te w serynie, treoninie lub hydroksyprolinie; (e) reszt aromatycznych, takich jak te w fenyloalaninie, tyrozynie lub tryptofanie; lub (f) grup amidowych glutaminy. Metody te są opisane w WO 87/05330 opublikowanym 11 września 1987 i w Aplin i Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Blochem., str. 259-306.

Usunięcia dowolnej z reszt węglowodanowych na propeptydzie GDF można również dokonać chemicznie albo enzymatycznie. Deglikozylacja chemiczna wymaga wystawienia propeptydu GDF na działanie związku - kwasu trifluorometanosulfonowego lub ekwiwalentnego związku. Takie traktowanie prowadzi do cięcia większości albo wszystkich cukrów z wyjątkiem cukru łączącego (N-acetyloglukozaminy lub N-acetylogalaktozaminy), pozostawiając sekwencję aminokwasową nienaruszoną.

Deglikozylacja chemiczna jest opisana przez Hakimuddin i wsp. (1987) Arch. Blochem. Biophys. 259:52 oraz przez Edge i wsp. (1981) Anal. Biochem. 118:131. Cięcia enzymatycznego reszty węglowodanowej na propeptydach GDF można dokonać poprzez zastosowanie rozmaitych egzo- i endoglikozydaz jak opisano w Thotakura i wsp. (1987) Meth. Enzymol. 138:350.

Kiedy zmodyfikowanym propeptydem GDF jest białko fuzyjne propeptyd GDF-Fc, jak opisano powyżej, region Fc cząsteczki IgG może być również zmodyfikowany, tak aby miał zmieniony wzór glikozylacji.

W innym wykonaniu propeptyd GDF jest połączony z albuminą albo pochodną albuminy. Sposoby łączenia białek i polipeptydów z albuminą albo pochodną albuminy są dobrze znane w tej dziedzinie. Patrz np. patent USA 5116944 (Sivam i wsp.).

Jest zrozumiałe dla specjalisty w tej dziedzinie, że pewne aminokwasy mogą być zastąpione innymi aminokwasami w strukturze białka bez szkodliwego wpływu na aktywność białka. Jest zatem brane pod uwagę przez wynalazców, że można dokonać rozmaitych zmian w sekwencjach aminokwasowych zmodyfikowanych lub niezmodyfikowanych propeptydów GDF albo sekwencjach DNA, kodujących takie propeptydy bez znaczącej utraty ich przydatności lub aktywności biologicznej. W jednym z wykonań taką aktywność mierzy się w przykładach 4-6. Takie zmiany obejmują między innymi delecje, insercje, skrócenia, podstawienia, fuzje i temu podobne. Przykładowo, zmiany w sekwencjach aminokwasowych w miejscach cięcia proteolitycznego w obrębie zmodyfikowanego propeptydu GDF są konkretnie objęte niniejszym wynalazkiem.

Przy dokonywaniu takich zmian, można uwzględnić wskaźnik hydropatyczny aminokwasów. Znaczenie wskaźnika hydropatycznego aminokwasów dla nadawania czynnej funkcji biologicznej białka jest ogólnie zrozumiałe w tej dziedzinie (Kyte i Doolittle, 1982, włączone tu w całości jako odniesienie). Przyjmuje się, że względny charakter hydropatyczny aminokwasu przyczynia się do struktury drugorzędowej otrzymanego w rezultacie białka, co z kolei definiuje oddziaływanie białek z innymi cząsteczkami, na przykład enzymami, substratami, receptorami, DNA, przeciwciałami, antygenami i temu podobnymi.

Każdemu aminokwasowi przypisano wskaźnik hydropatyczny w oparciu o jego właściwości hydropatyczne i ładunek (Kyte i Doolittle, 1982). Wartości te są następujące: izoleucyna (+4,5); walina (+4,2); leucyna (+3,8); fenyloalanina (+2,8); cysteina/cystyna (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicyna (-0,4); treonina (-0,7); seryna (-0,8); tryptofan (-0,9); tyrozyna (-1,3); prolina (-1,6); histydyna (-3,2); glutaminian (-3,5); glutamina (-3,5); asparaginian (-3,5); asparagina (-3,5); lizyna (-3,9) oraz arginina (-4,5).

Przy dokonywaniu takich zmian, korzystne są podstawienia aminokwasowe, których wskaźniki hydropatyczne mieszczą się w zakresie ±2, szczególnie korzystne są w zakresie ±1 a jeszcze korzystniej są w zakresie ±0,5.

Jest również zrozumiałe w tej dziedzinie, że podstawienia podobnych aminokwasów mogą być dokonane skutecznie na podstawie ich hydrofilowości. Przykładowo, patent USA 4554101 głosi, że największa lokalna hydrofilowość białka, określona poprzez hydrofilowość sąsiadujących aminokwasów, koreluje z właściwościami biologicznymi białka.

Jak przedstawiono szczegółowo w patencie USA 4554101, resztom aminokwasowym przypisuje się następujące wartości hydrofilowości: arginina (+3,0); lizyna (+3,0); kwas asparaginowy (+3,0 ±1); glutaminian (+3,0 ±1); seryna (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicyna (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ±1); alanina (-0,5); histydyna (-0,5); cysteina (-1,0); metionina (-1,3); walina (-1,5); leucyna (-1,8); izoleucyna (-1,8); tyrozyna (-2,3); fenyloalanina (-2,5); tryptofan (-3,4).

Przy dokonywaniu takich zmian, korzystne są podstawienia aminokwasowe, których wartości hydrofilowości mieszczą się w zakresie ±2, szczególnie korzystne są w zakresie ±1, a jeszcze korzystniej są w zakresie ±0,5.

PL 207 202 B1

Modyfikacje mogą być konserwatywne, tak że zmiana nie wpływa na strukturę albo funkcję biologiczną białka. Takie podstawienia aminokwasowe opierają się na względnym podobieństwie podstawników w łańcuchach bocznych aminokwasów, na przykład ich hydrofobowości, hydrofilowości, ładunku, wielkości i temu podobnych. Przykładowe podstawienia, przy których bierze się pod uwagę powyższe właściwości są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie i obejmują argininę i lizynę, glutaminian i asparaginian, serynę i treoninę, glutaminę i asparaginę; oraz walinę, leucynę i izoleucynę. Sekwencja aminokwasową zmodyfikowanych propeptydów GDF może być modyfikowana, tak aby zawierać dowolną liczbę konserwatywnych zmian o ile nie wpływa to niekorzystnie na wiązanie się zmodyfikowanego propeptydu GDF do jego docelowego białka GDF.

Względne podobieństwo albo identyczność sekwencji (znane również w dziedzinie dotyczącej białek i biologii molekularnej jako homologia sekwencji) ustala się korzystnie stosując programy „Best Fit” lub „Gap” z oprogramowania do analizy sekwencji Sequence Analysis Software Package™ (Wersja 10; Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI). „Gap” wykorzystuje algorytm Needlemana i Wunscha (Needleman i Wunsch, 1970) w celu takiego dopasowania dwóch sekwencji, aby uzyskać maksymalną liczbę pasujących par i minimalną liczbę przerw. „BestFif” przeprowadza optymalne dopasowanie najlepszego odcinka podobieństwa między dwiema sekwencjami. Optymalne dopasowanie znajduje się poprzez wstawianie przerw w celu uzyskania maksymalnej liczby pasujących par stosując algorytm lokalnej homologii Smitha i Watermana (Smith i Waterman, 1981; Smith, i wsp., 1983).

Opisane powyżej oprogramowanie do analizy sekwencji Sequence Analysis Software Package zawiera wiele innych przydatnych narzędzi analizy sekwencji do identyfikowania homologii ujawnionych tu sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych. Przykładowo program „BLAST” (Altschul i wsp., 1990) przeszukuje określone bazy danych (np., bazy danych o sekwencjach przechowywane w National Center for Biotechnology Information (NCBI) w Bethesda, Maryland, USA) pod kątem sekwencji podobnych do sekwencji stanowiącej zapytanie (bądź peptydu bądź kwasu nukleinowego); „FastA” (Lipman i Pearson, 1985; patrz również Pearson i Lipman, 1988; Pearson i wsp., 1990) przeprowadza przeszukiwanie według Pearsona i Lipmana pod kątem podobieństwa pomiędzy sekwencją stanowiącą zapytanie a grupą sekwencji tego samego typu (kwasu nukleinowego lub peptydu); „TfastA” przeprowadza przeszukiwanie według Pearsona i Lipmana pod kątem podobieństwa pomiędzy sekwencją stanowiącą zapytanie a dowolną grupą sekwencji nukleotydowych (dokonuje on translacji sekwencji nukleotydowych we wszystkich sześciu ramkach odczytu przed przeprowadzeniem porównania); „FastX” przeprowadza przeszukiwanie według Pearsona i Lipmana pod kątem podobieństwa pomiędzy sekwencją stanowiącą zapytanie a grupą sekwencji białkowych, biorąc pod uwagę przesunięcia ramek odczytu. „TfastX” przeprowadza przeszukiwanie według Pearsona i Lipmana pod kątem podobieństwa pomiędzy sekwencją stanowiącą zapytanie a dowolną grupą sekwencji nukleotydowych, biorąc pod uwagę przesunięcia ramek odczytu (dokonuje on translacji obydwu nici sekwencji nukleotydowych przed przeprowadzeniem porównania).

Specjalista w tej dziedzinie będzie wiedział, że zmodyfikowane lub niezmodyfikowane propeptydy GDF mogą zawierać dowolną liczbę podstawień w sekwencji aminokwasowej bez zmiany ich właściwości biochemicznych. W korzystnym wykonaniu takie zmiany są konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi, które są dobrze znane w tej dziedzinie. Przykładowymi podstawieniami aminokwasowymi, które biorą pod uwagę różne powyższe uwarunkowania są dobrze znane specjalistom w dziedzinie biochemii białek i obejmują między innymi argininę i lizynę, glutaminian i asparaginian, serynę i treoninę, glutaminę i asparaginę; oraz walinę, leucynę i izoleucynę.

W pewnych wykonaniach wynalazku, stabilność białka in vivo można mierzyć wieloma sposobami. W jednym z wykonań, pobiera próbki surowicy albo tkanki w punktach czasowych po dostarczaniu białka bądź dożylnie bądź dootrzewnowo albo białko znakuje się radioaktywnie, tj. jodem-125 stosując metody dobrze znane w tej dziedzinie. Ilość radioaktywności obecną w każdej próbce surowicy albo tkanki można ustalić przy użyciu licznika gamma. W innym wykonaniu, integralność/stabilność białka w surowicy można zbadać poprzez SDS-PAGE, a następnie bądź autoradiografię bądź analizę Western. W innym wykonaniu aktywność biologiczną białka można zmierzyć przy zastosowaniu dowolnego z wielu testów funkcjonalnych, włączając w to test ELISA albo test oparty na komórkach znany w tej dziedzinie.

Sposoby leczenia choroby

Propeptydy GDF według wynalazku są przydatne do zapobiegania albo leczenia różnych chorób ludzkich u ludzi i zwierząt. Korzystne jest stosowanie propeptydów GDF do hamowania albo zmniej16

PL 207 202 B1 szania jednej albo większej liczby aktywności związanych z białkiem GDF. W jednym z wysoce korzystnych wykonań zmodyfikowany propeptyd GDF hamuje albo zmniejsza jedną albo większą liczbę aktywności dojrzałego GDF-8 w stosunku do dojrzałego białka GDF-8, który nie jest związany przez ten sam propeptyd. W korzystnym wykonaniu, aktywność dojrzałego białka GDF-8, po związaniu z jednym albo większą liczbą zmodyfikowanych propeptydów GDF jest zahamowana w co najmniej 50%, korzystniej w co najmniej 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 i 88%, jeszcze korzystniej w co najmniej 90, 91, 92, 93 lub 94%, a nawet jeszcze korzystniej w co najmniej 95% do 100%, w stosunku do dojrzałego białka GDF-8, które nie jest związane przez jeden albo większą liczbę zmodyfikowanych propeptydów GDF.

Korzystne jest, jeżeli zaburzeniem medycznym, które ma być leczone albo któremu ma się zapobiegać przy użyciu zmodyfikowanych propeptydów GDF jest choroba mięśniowa lub neuromięśniowa (taka jak stwardnienie zanikowe boczne, dystrofia mięśniowa, atrofia mięśni, zastoinowa czopująca choroba płuc, zespół wyniszczenia mięśniowego, sarkopenia albo kacheksja), choroba metaboliczna (taka jak cukrzyca typu II, cukrzyca insulinoniezależna, hiperglikemia lub otyłość), zaburzenie tkanki tłuszczowej (takie jak otyłość) albo choroba degeneracyjna kości (taka jak osteoporoza). Najkorzystniej, jeżeli stanem medycznym jest choroba mięśniowa lub neuromięśniowa, taka jak stwardnienie zanikowe boczne, dystrofia mięśniowa, atrofia mięśni, zastoinowa czopująca choroba płuc, zespół wyniszczenia mięśniowego, sarkopenia albo kacheksja. W innym korzystnym wykonaniu stanem medycznym jest choroba lub zaburzenie metaboliczne, takie jak to będące wynikiem zaburzenia metabolizmu glukozy i/lub oporności na insulinę, takie jak cukrzyca typu II lub cukrzyca insulinoniezależna albo choroby metaboliczne, takie jak hiperglikemia lub otyłość. Korzystne jest, jeżeli propeptydy GDF stosuje się do zapobiegania albo leczenia takich schorzeń medycznych u ssaków, najkorzystniej u ludzi.

Propeptydy GDF albo kompozycje propeptydów według niniejszego wynalazku podaje się w terapeutycznie skutecznych ilościach. Stosowany tu termin „skuteczna ilość” zmodyfikowanego propeptydu GDF to dawka, która jest wystarczająca dla zmniejszenia aktywności białek GDF w celu osiągnięcia pożądanego rezultatu biologicznego (np. zwiększenia masy mięśni szkieletowych). Pożądanym rezultatem biologicznym może być dowolna korzyść terapeutyczna, włączając w to zwiększenie masy mięśni, zwiększenie siły mięśni, lepszy metabolizm, zmniejszenie otłuszczenia, lepsza homeostaza glukozowa. Takie polepszenia można mierzyć wieloma metodami włączając w to te, które mierzą beztłuszczową masę ciała (takie jak podwójną analizę skaningową promieniami X), siłę mięśni, lipidy w surowicy, leptynę w surowicy, glukozę w surowicy, glikowaną hemoglobinę, tolerancję glukozy i polepszenie we wtórnych komplikacjach cukrzycy. Ogólnie, terapeutycznie skuteczna ilość może być zróżnicowana w zależności od wieku, wagi, kondycji fizycznej i płci osobnika, jak również ostrości stanu medycznego osobnika. Dawka może być ustalona przez lekarza i dopasowana, jeśli to niezbędne do obserwowanych efektów leczenia. Generalnie, kompozycje podaje się tak, aby propeptydy GDF były podawane w dawce pomiędzy 50 μg/kg a 20 mg/kg. Korzystne jest, jeżeli propeptydy GDF są podawane jako jedna duża dawka w celu maksymalizacji poziomów propeptydów GDF w obiegu dla jak najdłuższego czasu trwania po podaniu dawki. Po podaniu jednej dużej dawki można zastosować ciągły wlew.

Niniejszym ujawniono również sposoby zapobiegania albo leczenia różnych chorób metabolicznych albo schorzeń będących wynikiem nieprawidłowej homeostazy glukozowej. Prawidłowa homeostaza glukozowa wymaga między innymi precyzyjnego zgrania wydzielenia insuliny przez komórki wysepek beta w odpowiedzi na subtelne zmiany w poziomach glukozy we krwi. Jednym z podstawowych działań insuliny jest stymulowanie pobierania glukozy z krwi do tkanek, a w szczególności mięśni i tłuszczu.

A zatem, ujawniono niniejszym sposób leczenia cukrzycy i spokrewnionych chorób, takich jak otyłość lub hiperglikemia poprzez podawanie osobnikowi zmodyfikowanego propeptydu GDF albo kompozycji zmodyfikowanego propeptydu GDF w ilości dostatecznej dla złagodzenia objawów choroby. Konkretnie, cukrzyca typu 2 albo cukrzyca insulinoniezależna (NIDDM, od ang. noninsulin-dependent diabetes mellitus), charakteryzuje się trzema cechami (1) opornością na działanie insuliny na pobieranie glukozy w tkankach obwodowych, a w szczególności mięśniach szkieletowych i komórkach tłuszczowych, (2) zaburzonym działaniem insuliny dla hamowania wytwarzania glukozy przez wątrobę i (3) rozregulowaniem wydzielenia insuliny (DeFronzo, (1997) Diabetes Rev.5:177-269). A zatem, osoby cierpiące na cukrzycę typu 2 można leczyć poprzez podawanie zmodyfikowanego propeptydu GDF w celu zwiększenia wrażliwości na insulinę i pobierania glukozy przez komórki.

Podobnie, inne choroby i zaburzenia metaboliczne charakteryzujące się nieprawidłowym działaniem insuliny (np. oporność, nieaktywność lub brak) i/lub niewystarczającym transportem glukozy do

PL 207 202 B1 komórek można również leczyć poprzez podawanie zmodyfikowanego propeptydu GDF, który zwiększa wrażliwość na insulinę i pobieranie glukozy przez komórki.

Zmodyfikowany propeptyd GDF albo kompozycje zmodyfikowanego propeptydu GDF według wynalazku podaje się w terapeutycznie skutecznych ilościach. Przy stosowaniu do leczenia cukrzyc i chorób spokrewnionych, „skuteczna ilość” zmodyfikowanego propeptydu GDF to dawka, która jest wystarczająca dla zmniejszenia aktywności białek GDF w celu osiągnięcia pożądanych rezultatów terapeutycznych, takich jak, na przykład, zwiększenie wrażliwości na insulinę i pobierania glukozy przez komórki, zmniejszenie masy tłuszczu w ciele albo pożądane zmiany lipidów w surowicy, leptyny w surowicy, glukozy w surowicy, glikowanej hemoglobiny, tolerancji glukozy lub polepszenie we wtórnych komplikacjach cukrzycy. Ogólnie, terapeutycznie skuteczna ilość może być zróżnicowana w zależności od wieku, wagi, kondycji fizycznej i płci osobnika, jak również ostrości stanu medycznego osobnika. Dawka może być ustalona przez lekarza i dopasowana, jeśli to niezbędne do obserwowanych efektów leczenia. Generalnie, kompozycje podaje się tak, aby propeptydy GDF były podawane w dawce pomiędzy 50 μg/kg a 20 mg/kg. Korzystne jest, jeżeli propeptydy GDF są podawane jako jedna duża dawka w celu maksymalizacji poziomów propeptydów GDF w obiegu dla jak najdłuższego czasu trwania po podaniu dawki. Po podaniu jednej dużej dawki można zastosować ciągły wlew.

Niniejszym ujawniono też terapię genową do wytwarzania propeptydów GDF in vivo. Taka terapia mogłaby wywrzeć swój efekt terapeutyczny poprzez wprowadzenie sekwencji polinukleotydowych propeptydów GDF do komórek albo tkanek mających wymienione powyżej nieprawidłowości. Dostarczenie sekwencji polinukleotydowych propeptydów GDF można uzyskać poprzez zastosowanie zrekombinowanego wektora ekspresyjnego, takiego jak wirus chimerowy albo koloidalny system dyspersyjny. Szczególnie korzystne dla dostarczania terapeutycznego sekwencji polinukleotydowych propeptydów GDF jest zastosowanie kierowanych do celu liposomów.

Różne wektory wirusowe, które można zastosować do terapii genowej, jak tu opisano, obejmują adenowirusa, wirusa opryszczki, wirusa krowianki, albo, korzystnie, wirusa RNA, takiego jak retrowirus. Korzystne jest, jeżeli wektorem retrowirusowym jest pochodna retro wirusa mysiego albo ptasiego. Przykłady wektorów retrowirusowch, do których mogą być wstawione pojedyncze obce geny obejmują miedzy innymi: wirusa białaczki Moloneya (MoMuLV, od ang. Moloney murine leukemia wirus), mysiego wirusa mięsaka Harveya (HaMuSV, od ang. Harvey murine sarcoma wirus), mysiego wirusa raka gruczołu mlecznego (MuMTV, od ang. murine mammary tumor wirus) oraz wirusa mięsaka Rousa (RSV, od ang. Rous Sarcoma Wirus). Wiele dodatkowych wektorów retrowirusowych może wstawiać wiele genów. Wszystkie te wektory mogą przenosić albo wstawiać gen dla markera selekcyjnego, tak że transdukowane komórki można zidentyfikować i wytwarzać. Poprzez wstawienie sekwencji polinukleotydowej propeptydu GDF będącej przedmiotem zainteresowania do wektora wirusowego razem z innym genem, który koduje na przykład ligand dla receptora na specyficznej komórce docelowej, wektor jest teraz specyficzny wobec miejsca docelowego. Wektory retrowirusowe mogą być uczynione specyficznymi poprzez przyłączenie na przykład cukru, glikolipidu albo białka. Korzystne kierowanie do celu uzyskuje się poprzez zastosowanie przeciwciała. Specjaliści w tej dziedzinie zorientują się, że specyficzne sekwencje polinukleotydowe można wstawiać do genomu wirusowego albo przyłączać do otoczki wirusowej dla umożliwienia specyficznego wobec miejsca docelowego dostarczania wektora retrowirusowego zawierającego polinukleotyd GDF. Wektor może być kierowany do komórek mięśniowych albo tkanki mięśniowej.

Ponieważ rekombinowane retrowirusy są defektywne, wymagają one wspomagających linii komórkowych, które zawierają plazmidy kodujące wszystkie geny strukturalne retrowirusa pod kontrolą sekwencji regulacyjnych w obrębie LTR. Plazmidom tym brak sekwencji nukleotydowej, która umożliwia mechanizmowi pakowania rozpoznanie transkryptu RNA, który ma być pakowany. Wspomagające linie komórkowe, które mają delecję sygnału pakującego obejmują między innymi PSI.2, PA317 i PA12. Te linie komórkowe wytwarzają puste wiriony, ponieważ żaden genom nie jest pakowany. Jeżeli wektor wirusowy jest wprowadzany do takich komórek, w których sygnał pakujący jest nienaruszony, ale geny strukturalne są zastąpione przez inne geny będące przedmiotem zainteresowania, wektor może być zapakowany i wiriony wektora wytwarzane.

Alternatywnie, inne komórki w hodowli tkankowej można transfekować bezpośrednio plazmidami kodującymi geny struktury gag pol i env poprzez zastosowanie konwencjonalnej transfekcji fosforanem wapniowym. Komórki te transfekuje się następnie wektorem plazmidowym zawierającym geny będące przedmiotem zainteresowania. Otrzymane w rezultacie komórki uwalniają wektor wirusowy do podłoża hodowlanego.

PL 207 202 B1

Innym kierowanym do celu system dostarczania dla polinukleotydu lub propeptydu GDF jest koloidalny system dyspersyjny. Koloidalne systemy dyspersyjne obejmują kompleksy makrocząsteczkowe, nanokapsułki, mikrokulki, kulki i systemy oparte o lipidy, obejmujące emulsje oleju w wodzie, micele, micele mieszane i liposomy. Korzystnym system koloidalnym według tego wynalazku jest liposom. Liposomy to sztuczne pęcherzyki błonowe, które są przydatne jako cząsteczka transportowa in vitro i in vivo. RNA, DNA i nienaruszone wiriony moż na w wodnym wnętrzu dostarczać do komórek w aktywniej biologicznie postaci (Patrz np., Fraley, i wsp., Trends Blochem. Sci., 6:77, 1981). Sposoby skutecznego przenoszenia genów przy użyciu nośnika liposomowego są dobrze znane w tej dziedzinie, patrz np. Mannino, i wsp., Biotechniques, 6:682, 1988. Skład liposomu to zwykle kombinacja fosfolipidów, zazwyczaj w połączeniu ze steroidami, w szczególności cholesterolem. Można również zastosować inne fosfolipidy lub inne lipidy. Właściwości fizyczne liposomów zależą od pH, siły jonowej i obecności kationów dwuwartościowych.

Przykłady lipidów przydatnych przy wytwarzaniu liposomów obejmują związki fosfatydylowe, takie jak fosfatydyloglicerol, fosfatydylocholina, fosfatydyloseryna, fosfatydyloetanolamina, sfingolipidy, cerebrozydy i gangliozydy. Ilustracyjne fosfolipidy obejmują fosfatydylocholinę jaja, dipalmitoilofosfatydylocholinę oraz distearoilofosfatydylocholinę.

Kierowanie liposomów do celu jest również możliwe w oparciu na przykład o swoistość wobec narządu, swoistość komórkową oraz swoistość organellarną i jest znane w tej dziedzinie.

Sposoby zapobiegania albo leczenia powyższych stanów medycznych przy użyciu zmodyfikowanych propeptydów GDF można również zastosować do hamowania innych białek w nadrodzinie

TGF-e1. Wiele z tych białek jest spokrewnionych strukturalnie z GDF-8, tak jak BMP-11. A zatem, w niniejszym opisie ujawniono sposoby leczenia wspomnianych powyżej schorzeń poprzez podawanie zmodyfikowanego propeptydu GDF zdolnego do hamowania ciała innego niż GDF-8, samego albo w kombinacji ze zmodyfikowanym propeptydem GDF wobec GDF-8.

Kompozycje modyfikowanych propeptydów GDF

Niniejszy wynalazek dostarcza kompozycji zawierających zmodyfikowane propeptydy GDF. Takie kompozycje mogą być odpowiednie do zastosowania farmaceutycznego i podawania pacjentom. Kompozycje zawierają zazwyczaj jeden albo większą liczbę zmodyfikowanych propeptydów według niniejszego wynalazku i dopuszczalną farmaceutycznie zaróbkę. Stosowany tu określenie „farmaceutycznie dopuszczalna zaróbka” ma obejmować dowolny i wszystkie rozpuszczalniki, podłoża dyspersyjne, powłoki, czynniki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybowe, czynniki izotoniczne i opóźniające absorpcję i tym podobne, odpowiednie do podawania farmaceutycznego. Stosowanie takich podłóż i czynników dla substancji farmaceutycznie czynnych jest dobrze znane w tej dziedzinie. Przykładowe farmaceutycznie dopuszczalne zaróbki można znaleźć w „The Handbook of Pharmaceutical Excipients” wyd. 3, 2000, Am. Pharmaceutical Press, A.E. Kibbe, wyd. Kompozycje mogą również zawierać inne związki aktywne dostarczające uzupełniających, dodatkowych albo wzmocnionych funkcji terapeutycznych. Kompozycje farmaceutyczne mogą być zawarte w pojemniku, opakowaniu lub dozowniku razem z instrukcjami podawania.

Kompozycję farmaceutyczną według wynalazku wytwarza się tak, aby była odpowiednia do zamierzonej drogi jej podawania. Sposoby przeprowadzania podawania są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie. Możliwe może być również otrzymywanie kompozycji, które można podawać miejscowo albo doustnie albo które mogą mieć zdolność przechodzenia przez błony śluzowe. Podawanie może być, na przykład dożylne (I.V.), dootrzewnowe (I.P.), domięśniowe (I.M.), dojamowe, podskórne (S.C.) albo przezskórne. Korzystne wykonania obejmują zastrzyki I.V., I.P., I.M. i S.C. W jednym z korzystnych wykonań kompozycje farmaceutyczne według wynalazku podaje się dożylnie.

Rozwory lub zawiesiny stosowanie przy podawaniu doskórnym lub podskórnym zawierają zazwyczaj jeden albo więcej następujących składników: sterylny rozcieńczalnik, taki jak woda do zastrzyków, roztwór soli fizjologicznej, utrwalone oleje, glikole polietylenowe, gliceryna, glikol polietylenowy i inne rozpuszczalniki syntetyczne; czynniki przeciwbakteryjne, takie jak alkohol benzylowy lub metyloparabeny; przciwutleniacze, takie jak kwas askorbinowy lub wodorosiarczyn sodowy; czynniki chelatujące, takie jak kwas etylenodiaminotetraoctowy; bufory, takie jak octany, cytryniany lub fosforany oraz czynniki do ustalania ciśnienia osomotycznego, takie jak chlorek sodowy lub dekstroza. pH może być ustalone przy użyciu kwasów lub zasad, takich jak kwas solny lub wodorotlenek sodowy. Preparaty pozajelitowe mogą być zamknięte w ampułkach, jednorazowych strzykawkach albo wielodawkowych fiolkach wykonanych ze szkła albo plastyku.

PL 207 202 B1

Kompozycje farmaceutyczne odpowiednie do stosowania w zastrzykach obejmują jałowe roztwory wodne lub zawiesiny i sterylne proszki do przygotowania jałowych roztworów lub zawiesin bezpośrednio przed wstrzyknięciem. Do podawania dożylnego odpowiednie nośniki obejmują sól fizjologiczną, wodę bakteriostatyczną, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) lub roztwór soli buforowany fosforanem (PBS). We wszystkich przypadkach kompozycje muszą być jałowe i powinny być płynne, tak aby mogły być łatwo podawane strzykawką. Muszą być one stabilne w warunkach produkcji oraz przechowywania i muszą być chronione przed zanieczyszczającym działaniem mikroorganizmów, takich jak bakterie i grzyby. Nośnikiem może być rozpuszczalnik lub podłoże rozpraszające zawierające na przykład wodę, etanol, poliol (na przykład glicerol, glikol propylenowy oraz płynny glikol polietylenowy i tym podobne) oraz odpowiednie ich mieszaniny. Może być utrzymana odpowiednia płynność na przykład poprzez zastosowanie powlekania, takiego jak lecytyną, przez utrzymanie pożądanej wielkości cząstek w przypadku zawiesin i przez stosowanie związków powierzchniowo czynnych. Zapobieganie działaniu mikroorganizmów można uzyskać za pomocą różnych czynników przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybowych, na przykład parabenów, chlorobutanolu, fenolu, kwasu askorbinowego, timerosalu i tym podobnych. W wielu przypadkach będzie korzystne włączenie do kompozycji czynników izotonicznych, na przykład cukrów, polialkoholi, takich jak mannitol, sorbitol, chlorek sodu. Przedłużoną absorpcję związków w zastrzykach można uzyskać poprzez włączenie do kompozycji czynnika, który opóźnia absorpcję, na przykład monostearynianu glinu i żelatyny.

Kompozycje doustne generalnie zawierają bierny rozcieńczalnik lub jadalny nośnik. Na przykład, mogą być one zamknięte w żelatynowych kapsułkach albo sprasowane w tabletki. Dla celów terapeutycznego podawania doustnego, propeptydy GDF mogą być włączone razem z zaróbkami i używany w postaci tabletek, kołaczyków lub kapsułek. Odpowiednie farmaceutycznie czynniki wiążące i/lub materiały adiuwantowe mogą być włączone jako część kompozycji. Tabletki, pigułki, kapsułki, kołaczyki i temu podobne mogą zawierać dowolny z następujących lub związki o podobnej naturze: czynnik wiążący, taki jak celuloza mikrokrystaliczna, guma tragakantowa lub żelatyna; zaróbkę, taką jak skrobia lub laktoza, środek rozpraszający, taki jak kwas alginowy, Primogel lub skrobia kukurydziana; smar, taki jak stearynian magnezowy lub Sterotes; środek poślizgowy, taki jak koloidalny dwutlenek silikonu; środek słodzący, taki jak sacharoza lub sacharyna albo środek smakowy, taki jak mięta pieprzowa, salicynian metylowy albo aromat pomarańczowy.

Przy podawaniu przez inhalację propeptydy GDF można dostarczać w postaci aerozolu z pojemnika ciśnieniowego albo dozownika, który zawiera odpowiednie propelenty, np. gaz, taki jak dwutlenek węgla, albo nebulizatora.

Podawanie ogólnoustrojowe może odbywać się również sposobami przezśluzówkowymi lub przezskórnymi. Przy podawaniu przezśluzówkowym lub przezskórnym w kompozycji stosuje się czynniki penetrujące odpowiednie dla bariery, która ma być pokonywana. Takie czynniki penetrujące są generalnie znane w tej dziedzinie i obejmują na przykład, do podawania przezskórnego, detergenty, sole żółciowe i pochodne kwasu fusydowego. Podawanie przezśluzówkowe można przeprowadzić poprzez zastosowanie rozpylaczy i czopków donosowych. Do podawania przezskórnego, związki aktywne mogą być przygotowane w postaci maści, balsamów, żeli, kremów, jak jest to ogólnie znane w tej dziedzinie.

Propeptydy GDF można również wytwarzać w postaci czopków (np. z konwencjonalnymi podłożami podstawowymi do czopków, takimi jak masło kakaowe lub inne glicerydy) lub utrzymujące się wlewy do podawania doodbytowego.

W jednym z wykonań , propeptydy GDF są przygotowywane z noś nikami, które bę dą chronić związek przed szybką eliminacją z ciała, takie jak kompozycje o kontrolowanym uwalnianiu, włączając w to implanty i systemy dostarczania w mikrokapsułkach. Można zastosować ulegające biodegradacji, zgodne biologicznie polimery, takie jest octan etylenowinylowy, polianhydrydy, kwas poliglikolowy, kolagen, poliortoestry i kwas polimlekowy. Sposoby wytwarzania takich kompozycji będą oczywiste dla specjalisty w tej dziedzinie. Materiały można również nabyć w Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc. Jako farmaceutycznie dopuszczalne nośniki można również zastosować zawiesiny liposomowe zawierające zmodyfikowane propeptydy GDF. Mogą być one wytwarzane według znanych metod specjalistom w tej dziedzinie, na przykład jak opisano w patencie USA nr 4522811.

Jest szczególnie korzystne wytwarzanie kompozycji doustnych lub pozajelitowych w postaci jednostkowych dawek dla łatwości podawania i jednorodności dawkowania. Stosowane tu dawki w formie jednostkowej dotyczą fizycznie odrębnych jednostek odpowiednich jako jednostkowe dawki dla osobnika, który ma być leczony; każda jednostka zawiera z góry ustaloną ilość związku aktywnego

PL 207 202 B1 wyliczoną tak, by dała pożądany efekt terapeutyczny w połączeniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym. Ustalenie postaci dawki jednostkowej według wynalazku jest dyktowane i bezpośrednio uzależnione od unikatowych właściwości związku aktywnego i konkretnego efektu terapeutycznego, który ma zostać osiągnięty oraz ograniczeń właściwych dziedzinie wytwarzania takiego aktywnego związku w celu leczenia osobników.

Toksyczność i leczniczą skuteczność takich związków można określić dzięki standardowym procedurom farmaceutycznym w hodowlach komórek lub na zwierzętach doświadczalnych, np. poprzez określenie LD50 (dawka letalna dla 50% populacji) i ED50 (dawka skuteczna leczniczo dla 50% populacji). Proporcja pomiędzy toksycznością a skutecznością leczniczą dawki stanowi wskaźnik terapeutyczny i można go wyrazić jako stosunek LD50/ED50. Korzystne są propeptydy GDF, które wykazują wysokie wskaźniki terapeutyczne.

Dane otrzymane z testów na hodowlach komórkowych i badań na zwierzętach można użyć w ustalaniu zakresu dawki, która jest nietoksyczna przy stosowaniu u ludzi. Korzystne jest, jeżeli dawka takich związków mieści się w zakresie stężeń w obiegu, które obejmują ED50 o małej lub bez toksyczności. Dawka może być zróżnicowana w tym zakresie, w zależności od postaci zastosowanej dawki i użytej drogi podawania. Dla dowolnego propeptydu GDF stosowanego w niniejszym wynalazku skuteczną leczniczo dawkę można ustalić wyjściowo z testów opartych na hodowlach komórkowych. Dawkę można ustalić w modelach zwierzęcych, tak aby uzyskać stężenie w krążącym osoczu w zakresie, który obejmuje IC50 (tj. stężenie testowanego propeptydu GDF, przy którym uzyskuje się połowę maksymalnego zahamowania objawów) jak określono w hodowli komórkowej. Poziomy w osoczu można mierzyć na przykład poprzez wysokosprawną chromatografię cieczową. Efekty poszczególnych dawek można śledzić przy zastosowaniu odpowiedniego testu biologicznego. Przykłady odpowiednich testów biologicznych obejmują testy oparte na replikacji DNA, testy w oparciu o transkrypcję, testy wiązania białko GDF/receptor, testy dla kinazy kreatynowej, testy oparte na różnicowaniu prekursorów komórek tłuszczowych, testy oparte na pobieraniu glukozy przez komórki tłuszczowe oraz testy immunologiczne.

Następujące przykłady dostarczają korzystnych wykonań wynalazku.

Przykłady

P r z y k ł a d 1

Oczyszczanie GDF-8

Kondycjonowaną pożywkę z wybranych linii komórkowych wyrażających zrekombinowane ludzkie białko GDF-8 (dojrzały GDF-8 + propeptyd GDF-8) zakwaszono do pH 6,5 i naniesiono na kolumnę anionowymienną POROS HQ 80 x 50 mm w tandemie z kolumną kationowymienną POROS SP 80 x 50 mm (Perseptive Biosystems). Wypływ doprowadzano do pH 5,0 i nakładano na kolumnę kationowymienną POROS SP 75 x 20 mm (Perseptive Biosystems) i wymywano gradientem NaCl. Frakcje zawierające GDF-8, co wykazano poprzez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym z siarczanem dodecylu (SDS-PAGE), połączono, zakwaszono kwasem trifluorooctowym (TFA) do pH 2-3, a następnie doprowadzono do 200 ml 0,1% TFA w celu obniżenia lepkości. Pulę nałożono następnie na kolumnę C5 250 x 21,2 mm (Phenomenex), co było poprzedzone przez kolumnę wstępną (guard) 60 x 21,2 mm (Phenomenex) i wymywano gradientem TFA/CH3CN, w celu oddzielenia dojrzałego GDF-8 od propeptydu GDF-8. Połączone frakcje zawierające dojrzały GDF-8 zatężono poprzez liofilizację w celu usunięcia acetonitrilu i dodano 20 ml 0,1% TFA. Próbkę nałożono następnie na kolumnę C5 250 x 10 mm (Phenomenex) ogrzaną do 60°C w celu ułatwienia rozdziału. Powtarzano to do czasu, kiedy nie uzyskiwano już dalszego rozdziału. Frakcje zawierające dojrzały GDF-8 łączono następnie i doprowadzano do 40% acetonitrylu nakładano na kolumnę do sączenia molekularnego BioSep S-3000 600 x 21,2 (Phenomenex) co było poprzedzone przez kolumnę wstępną 60 x 21,2. Frakcje zawierające oczyszczony dojrzały GDF-8 łączono i zatężano do użycia w kolejnych doświadczeniach. Typowy uzysk dimeru dojrzałego GDF-8 wynosił 0,33 mg białka na litr kondycjonowanej pożywki.

Frakcje z kolumny C5 zawierające propeptyd GDF-8 łączono i usuwano acetonitryl poprzez odparowanie, dodawano 20 ml 0,1% TFA i próbkę wstrzykiwano na kolumnę C5 250 x 10 mm w 60°C. Powtarzano to do czasu, kiedy nie uzyskiwano już dalszego rozdziału. Frakcje zawierające propeptyd GDF-8 łączono następnie i doprowadzano do 40% acetonitrylu nakładano na kolumnę do sączenia molekularnego BioSep S-3000 600 x 21,2 (Phenomenex) co było poprzedzone przez kolumnę wstępną 60 x 21,2. Frakcje zawierające oczyszczony propeptyd GDF-8 łączono i zatężano do użycia w kolejnych doświadczeniach. Typowy uzysk propeptyd GDF-8 wynosił 0,24 mg białka na litr kondycjonowanej pożywki.

PL 207 202 B1

Na SDS-PAGE, oczyszczony dojrzały GDF-8 migrował jako szeroki prążek o wielkości 25 kDa w warunkach nieredukujących i 13 kD w warunkach redukujących. Podobny profil SDS-PAGE opisano dla mysiego GDF-8 (McPherron i wsp. (1997) Nature 387:83-90) i odzwierciedla to dimerową naturę dojrzałego białka.

Widoczna masa cząsteczkowa oczyszczonego propeptydu GDF-8 wynosiła 38 kDa zarówno w warunkach redukujących jak i nieredukujących. Wskazuje to, że propeptyd GDF-8 jest monomeryczny. Różnica w widocznej masie cząsteczkowej i przewidywanej masie cząsteczkowej propeptydu GDF-8, ~ 26 kDa może odzwierciedlać dodanie węglowodanu, ponieważ sekwencja aminokwasowa zawiera potencjalne miejsce glikozylacji poprzez N (McPherron i wsp. (1997) Proc. Natl. Acad Sci. USA 94:12457-12461). A zatem, powyższy proces doprowadził do wytworzenia oczyszczonego i aktywnego dimeru dojrzałego GDF-8 i propeptydu GDF-8.

P r z y k ł a d 2

Charakterystyka oczyszczonego zrekombinowanego ludzkiego GDF-8 μg każdego, oczyszczonego dojrzałego GDF-8 i oczyszczonego propeptydu GDF-8 zmieszano i dializowano w 50 mM fosforanie sodowym, pH 7,0 i poddano chromatografii na kolumnie do sączenia molekularnego BioSep S-3000 300 x 7,8 mm (Phenomenex). Masę cząsteczkową kompleksu dojrzały GDF-8/propeptyd ustalono na podstawie czasu wymywania stosując standardy masy molekularnej (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) poddane chromatografii na tej samej kolumnie.

Kiedy oczyszczony propeptyd GDF-8 inkubowano z oczyszczonym dojrzałym GDF-8 w pH obojętnym, dwa białka wydawały się tworzyć kompleks, na co wskazywał profil sączenia molekularnego. Pierwszy pik białkowy wymywany po 12,7 minutach miał szacunkową masę cząsteczkową 78 kDa, na podstawie ciężaru molekularnego standardów (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) poddane chromatografii na tej samej kolumnie. Wielkość kompleksu odpowiada najlepiej jednemu dimerowi dojrzałego GDF-8 połączonemu z dwoma monomerami propeptydu, tworzącym kompleks tetrameryczny.

W celu potwierdzenia tej obserwacji, preparat zawierający zarówno dojrzały GDF-8 jaki i propeptyd GDF-8 inkubowano z lub bez 100 mM chlorowodorku 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodiamidowego (EDC, Pierce) przez 1 godz. w temperaturze pokojowej, zakwaszano HCl do pH 2-3 i zatężano na zatężaczu Micron-10 (Amicon) do SDS-PAGE, stosując 10% żel akryloamidowy buforowany tricyną. Białka uwidaczniano poprzez barwienie błękitem Coomassie. Pasmo odpowiadające masie cząsteczkowej około 75 kD obserwowano jedynie w próbce z dodanym EDC, ale nie w ścieżce kontrolnej, co potwierdza obecność kompleksu dojrzały GDF-8/propeptyd. To uwiarygodnia test jako przydatny do mierzenia aktywności i stężenia oczyszczonego dimeru dojrzałego GDF-8.

P r z y k ł a d 3

Aktywność biologiczna oczyszczonego GDF-8 in vitro

W celu wykazania aktywności GDF-8, opracowano test genu reporterowego (RGA) z zastosowaniem sekwencji wektora reporterowego pGL3(CAGA)12 połączonej z lucyferazą. Wcześniej opisano, że sekwencja CAGA jest sekwencją odpowiadającą na TGF-β w obrębie promotora genu indukowanego TGF-β, PAI-1 (Dennler i wsp. (1998) EMBO J. 17:3091-3100).

Wektor reporterowy zawierający 12 bloków CAGA wytworzono przy użyciu podstawowego wektora reporterowego pGL3 (Promega Corporation, Madison, WI, USA, Nr kat. E1751). Blok TATA i miejsce inicjacji transkrypcji z głównego późnego promotora adenowirusa (-35/+10) wstawiono pomiędzy miejsca Bglll i Hindlll. Oligonukleotydy zawierające dwanaście powtórzeń bloków CAGA, AGCCAGACA, połączono i sklonowano w miejscu XhoI. Linię komórkową ludzkiego mięsakomięśniaka prążkowanego, A204(ATCC HTB-82), transfekowano przejściowo pGL3(CAGA) stosując odczynnik do transfekcji FuGENE 6 (Roche Diagnostics, Indianapolis, USA, Nr kat. 1814443). Po transfekcji, komórki hodowano na 48-studzienkowych płytkach w pożywce McCoy's 5A (Life Technologies, Rockville, Maryland, USA, Nr kat. 21500-079) uzupełnionej 2 mM glutaminą, 100 jend./ml streptomycyny, 100 μg/ml penicyliną i 10% płodową surowicą cielęcą przez 16 godz. Komórki traktowano następnie GDF-8, BMP-11 lub aktywiną w pożywce McCoy's 5A z glutaminą, streptomycyną, penicyliną i 1 mg/ml albuminy z surowicy bydlęcej przez 6 godz. w 37°C. Lucyferazę oceniano ilościowo w traktowanych komórkach stosując system do testowania lucyferazy Luciferase Assay System (Promega Corporation, Madison, WI, USA, Nr kat. E1483). Wyniki są przedstawione na fig. 1. Dla GDF-8, wyniki są wyrażone jako średnia ±S.E. dla trzech odrębnych doświadczeń. Dla BMP-11 i aktywiny, wyniki są reprezentatywne dla dwóch odrębnych doświadczeń.

Wyniki pokazują, że GDF-8 maksymalnie aktywował konstrukt reporterowy 10-krotnie, z ED50 wynoszącą 10 ng/ml dla GDF-8, co wskazuje że oczyszczony zrekombinowany GDF-8 był aktywny bio22

PL 207 202 B1 logicznie. BMP-11, który jest w 90% identyczny z GDF-8 na poziomie aminokwasowym (Garner i wsp. (1999) Dev. Biol. 208:222-232 i Nakashima i wsp. (1999) Mech. Dev. 80:185-189) oraz aktywina wzbudzały podobną odpowiedź biologiczną, co wskazuje, że test dla genu reporterowego jest odpowiednim testem do wykrywania aktywności biologicznej GDF-8, BMP-11 lub aktywiny.

P r z y k ł a d 4

Właściwości wiązania oczyszczonego GDF-8

Kompleks GDF-8 w stanie latencji poddano biotynylacji przy stosunku 20 moli EZ-link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce, Rockford, Illinois, USA, Nr kat. 21217) do 1 mola kompleksu GDF-8 przez 2 godziny na lodzie, inaktywowano 0,5% TFA i poddano chromatografii na kolumnie C4 Jupiter 250 x 4,6 mm (Phenomenex) w celu oddzielenia dojrzałego GDF-8 od propeptydu GDF-8. Frakcje biotynylowanego dojrzałego GDF-8 wymyte gradientem TFA/CH3CN gradient łączono, zatężano i oceniano ilościowo przy użyciu zestawu MicroBCA protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, IL, USA, Cało No. 23235).

Zrekombinowaną chimerą ActRIIB-Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA Nr kat. 339-RB/CF) powlekano 96-studzienkowe płaskodenne płytki testowe (Costar, NY, Nr kat. 3590) w stężeniu μg/ml w 0,2 M węglanie sodowym przez noc w 4°C. Płytki blokowano następnie 1 mg/ml albuminy z surowicy bydlęcej i przemywano postępując zgodnie ze standardowym protokołem ELISA. 100 μl próbki biotynylowanego GDF-8 w różnych stężeniach dodawano do blokowanej płytki ELISA, inkubowano przez 1 godz., przemywano i ilość związanego GDF-8 wykrywano przy użyciu streptawidynaperoksydaza chrzanowa (SA-HRP, BD PharMingen, San Diego, CA, USA, Nr kat. 13047E), z następującym po tym dodaniem TMB (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA, Nr kat. 50-76-04). Pomiary kolorymetryczne wykonywano przy 450 nM w czytniku płytek Molecular Devices microplate reader.

Jak pokazano na fig. 2, biotynylowany GDF-8 wiąże się z ActRIIB, przypuszczalnym receptorem GDF-8 typu II z ED50 12 ng/ml, co wskazuje, że test wiązania ActRII jest czułym testem wiązania in vitro dla GDF-8.

P r z y k ł a d 5

Hamowanie GDF-8 i BMP-11 przez propeptyd GDF-8

Kiedy GDF-8 inkubowano wstępnie z propeptydem GDF-8 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aktywność biologiczna GDF-8 była zmniejszona. Fig. 3 pokazuje indukcję aktywności reportera pGL3(CAGA)12 przy ED50 dla GDF-8, 10 ng/ml, w obecności propeptydu GDF-8. Propeptyd GDF-8 zmniejszał indukcję GDF-8 w sposób zależny od dawki, z IC50 wynoszącą 25 ng/ml (0,6 nM). Propeptyd GDF-8 hamował również w tym samym stopniu aktywność biologiczną BMP-11. W przeciwieństwie do tego, propeptyd GDF-8 nie miał wpływu na aktywność aktywiny w tym teście prawdopodobnie na skutek stosunkowo niskiej homologii pomiędzy GDF-8 i aktywiną, w porównaniu z GDF-8 i BMP-11.

Analogicznie, fig. 4 pokazuje, że inkubacja wstępna propeptydu GDF-8 z biotynylowanym GDF-8 w stężeniu 5 ng/ml hamowała wiązanie się GDF-8 z ActRIIB w teście wiązania ActRIIB, jak opisano w przykładzie 4, z IC50 wynoszącą 0,3 nM. Konkludując, propeptyd GDF-8 według wynalazku jest silnym subnanomolowym inhibitorem aktywności GDF-8 i BMP-11 in vitro, co zmierzono w teście genu reporterowego i teście wiązania ActRIIB. A zatem, test ten pokazuje że propeptyd GDF-8 jest aktywny jako silny inhibitor aktywności GDF-8 w tym teście.

P r z y k ł a d 6

Hamowanie wiązania receptora GDF-8 przez propeptyd GDF-8

GDF-8 połączono z jodem przy użyciu chloraminy T jak opisano w Frolik i wsp. (1984) J Biol. Chem. 259:10995-10999 do aktywności specyficznej 100-200 pCi/pg. Jodowany-GDF-8 wykazywał porównywalną aktywność biologiczną do niewyznakowanego GDF-8 w teście reporterowym (CAGA) opisanym w przykładzie 3. Wyznakowany ¹²⁵l GDF-8 oceniano pod kątem specyficznego wiązania z liną komórkową mioblastów, L6.

Linię komórkową mioblastów L6 (ATCC CRL-1458) hodowano do konfluencji w pożywce Eagla zmodyfikowanej przez Dulbecco uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą na pokrytych żelatyną 24-studzienkowych płytkach. Wiązanie w stanie równowagi przeprowadzono jak opisano w Song i wsp. (1995) Endocrinology 136:4293-4297. 1 ng/ml ¹²⁵I GDF-8 (z lub bez wyznakowanego GDF-8) inkubowano z konfluentnymi komórkami L6 przez 4 godziny w 4°C. Po przemyciu komórek, związany [¹²⁵I]GDF-8 ekstrahowano i oceniano ilościowo w liczniku gamma. Wyniki są wyrażone jako średnia ±S.E. z trzech oznaczeń i reprezentują trzy odrębne doświadczenia.

Jak pokazano na fig. 5, ¹²⁵I-GDF-8 wiąże się z komórkami L6 z wysokim powinowactwem. Warto zaznaczyć, że BMP-11, ale nie TGF-e1, zastępuje wiązanie ¹²⁵I-GDF-8, co wskazuje, że GDF-8 i BMP-11 (ale nie TGF-e1) mają wspólny receptor na tych komórkach (dane nie pokazane). Na podstawie analizy

PL 207 202 B1

Scatchard wiązania GDF-8, Kd oceniono na 140 pM. Ponadto, kiedy 1 ng/ml ¹²⁵I-GDF-8 inkubowano wstępnie z propeptydem GDF-8 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej specyficzne wiązanie GDF-8 z komórkami L6 mogło być hamowane wraz ze wzrastającymi stężeniami niewyznakowanego propeptydu GDF-8 propeptyd (fig. 6). Wyniki są wyrażone jako średnia ±S.E. z trzech oznaczeń i reprezentują dwa odrębne doświadczenia. IC50 dla 1 ng/ml GDF-8 wynosiło 140 ng/ml propeptydu GDF-8. Co widać z tych danych propeptyd GDF-8 hamuje aktywność biologiczną GDF-8 poprzez blokowanie wiązania receptora GDF-8.

P r z y k ł a d 7

Hamowanie aktywności GDF-8 przez białko fuzyjne propeptyd GDF-8-Fc

Jak pokazano w przykładzie 8 poniżej, propeptyd mysiego GDF-8 miał stosunkowo krótki okres półtrwania in vivo. W celu zwiększenia dostępności biologicznej propeptydu GDF-8, skonstruowano białka fuzyjne między propeptydem GDF-8 i regionem Fc mysiej IgG2a przy zastosowaniu standardowych technik inżynierii genetycznej.

Do regionu Fc wprowadzono cztery mutacje w celu zmniejszenia funkcji efektorowych, jak opisano w Steurer i wsp. (1995) J: Immunol. 155:1165-1174. Stosując standardową metodologię PCR wytworzono dwa konstrukty fuzyjne poprzez połączenie cDNA kodującego propeptyd mysiego GDF-8 (aminokwasy 1-267) regionem Fc mysiej IgG2a (fig. 7). Fuzja 1 (fig. 7A) koduje pierwszych 265 aminokwasów propeptydu mysiego GDF-8 (włączając w to 24-aminokwasowy lider sekrecyjny) połączonych w ramce z 233 aminokwasami regionu Fc mysiej IgG2a począwszy od pierwszego aminokwasu w części zawiasowej. Fuzja 2 (fig. 7B) jest skonstruowana w podobny sposób co Fuzja 1, z tą różnicą, że krótki łącznik glicyna-seryna-glicyna-seryna (GSGS) oddziela propeptyd GDF-8 od mysiego regionu Fc.

Dwie chimery wprowadzono do eukariotycznego wektora ekspresyjnego, pED (Kaufman i wsp. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4485-4490) i wyrażono przejściowo w komórkach COS-1 M6 (Horowitz i wsp. (1983) Journal of Molecular and Applied Genetics 2:147-159), stosując odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000 (Gibco BRL, Life Technologies, Rockviile, Maryland, USA, Nr kat. 11668-019) zgodnie z protokołem producenta. Po 24 godzinach inkubacji dodano R1CD1 (zmodyfikowana wolna od surowicy pożywka hodowlana DMEM/F12). Kondycjonowaną pożywkę (CM, od ang. conditioned media) zabrano, zastąpiono świeżą R1CD1 i CM zabrano ponownie 60 godzin później. Kondycjonowaną pożywkę połączono i oczyszczono przy użyciu Protein A Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, England, Nr kat. 17-07080-01) po dodaniu 1/10 objętości 1 M Tris pH 8,0. Oczyszczone białko wymyto w 0,1 M kwasie octowym, 150 mM NaCl i natychmiast zobojętniano 1/20 objętości 3M Tris pH 9,0. Białka oceniano ilościowo stosując standardowy protokół ELISA dla mysiej IgG, i testowano w kompetycyjnym teście ELISA dla wiązania ActRIIB razem z oczyszczonym propeptydem ludzkiego GDF-8, jak opisano w przykładzie 5. Wyniki są pokazane na fig. 8. IC50 dla fuzji propeptyd GDF-8-Fc są w niskim nanomolowym zakresie i nie ma różnicy między fuzją 1 i 2. Fuzję 1 (bez łącznika pomiędzy propeptydem GDF-8 i mysią IgG2a) wybrano do użycia przy wytwarzaniu stabilnej linii komórek CHO i testowano pod kątem hamowania GDF-8 w teście RGA.

cDNA propeptyd GDF-8-Fc klonowano w plazmidzie pHTop do ekspresji CHO i transfekowano do komórek CHO/A2, jak opisano w Thies i wsp. (2001) Growth Factors 18:251-259.

Wyprowadzono stabilną linię (PF-4/0,02) poprzez selekcjonowanie komórek w 0,02 M metotreksanie. Kondycjonowaną pożywkę zawierającą białko fuzyjne propeptyd GDF-8-Fc z wyselekcjonowanej linii zebrano i jego pH doprowadzono poprzez dodanie 10% obj./obj. 1 M Tris pH 8,0 i oczyszczono nad złożem Pharmacia rProteinA Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, England. Nr kat. 17-1279-02) zrównoważonym uprzednio 50 mM Tris 150 mM NaCl pH 7,5. Frakcje wymywano 100 mM kwasem octowym, 150 mM NaCl pH 2,5 i natychmiast zobojętniano 5% obj./obj. 3M Tris pH 9,0. Frakcje z piku łączono i nakładano na kolumnę do sączenia molekularnego Pharmacia Superdex 200 Size Exclusion Column (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA. England, Nr kat. 17-1069-01). Do frakcji dodawano 0,05% Tween 80 w celu zapobiegania agregacji. Frakcje oceniano ilościowo poprzez SDS-PAGE na żelach Novex 10% Tricine (Novex, San Diego, CA, USA, Nr kat. EC66755).

Połączone frakcje oceniano ilościowo poprzez spektrofotometrię i testowano pod kątem aktywności w teście wiązania ActRIIB jak opisano w przykładzie 4, jak również w teście genu reporterowego (fig. 9). IC50 oczyszczonej fuzji propeptyd GDF-8-Fc wynosiło 1,3 nM. Dane pokazują, że zmodyfikowany propeptyd GDF według wynalazku będący białkiem fuzyjnym propeptyd GDF-8-Fc ma zachowaną silną aktywność hamującą (neutralizującą) w porównaniu z propeptydem GDF-8.

PL 207 202 B1

P r z y k ł a d 8

Farmakokinetyka

Farmakokinetykę (PK) propeptydu GDF-8 (określanego tu jako „GDF8-Pro”) i białka fuzyjnego propeptyd GDF-8-Fc (określanego tu jako „GDFS-ProFc”) oceniano u myszy C57B1/6J w dawce 0,2 pg/mysz (GDF8-Pro) lub 2 pg/mysz (GDF8-ProFc) po pojedynczym podaniu dożylnym. Zwierzęta otrzymywały mieszaninę niewyznakowanego i wyznakowanego ¹²⁵l GDF8-Pro lub GDF8-ProFc w dawkach

125 wymienionych powyżej i stężenie w surowicy oceniano na podstawie radioaktywności l¹²⁵ w surowicy i aktywności specyficznej wstrzykiwanej dawki. Fig. 10 pokazuje stężenie w surowicy względem czasu dla obydwu, GDF8-Pro i GDF8-ProFc. Tabela 1 pokazuje parametry PK dla GDF8-Pro i GDF8-ProFc) po pojedynczym podaniu dożylnym w ilości 2 pg/mysz. Stężenia w surowicy i parametry PK dla GDF8-Pro normalizowano do dawki 2 pg/mysz dla celów porównania.

T a b e l a 3

	T 1(godz.)	Cmax (ng/ml)	Zanik (ml/godz.)	MRT (godz.)	V1 (ml)	Vss (ml)
GDF8-ProFc	232	1392	0,03	286	1,4	8,7
GDF-8-Pro	2,2	390	12,4	2,3	5,1	28,3

T1: czas trwania w fazie ostatecznej eliminacji

Cmax: pik stężenia w surowicy

MRT: średni czas obecności

V1: wyjściowa objętość dystrybucji

Vss: objętość dystrybucji w stanie równowagi.

Uwaga: Parametry PK dla GDF 8-Pro normalizowane dla dawki 2 pg/mysz.

Jak można zobaczyć na fig. 10, zanik jest 400-krotnie wolniejszy i okres półtrwania 100-krotnie dłuższy dla GDF8-ProFc w porównaniu z GDF8-Pro. Zarówno wyjściowa objętość dystrybucji jak i objętość dystrybucji w stanie równowagi są około 3-krotnie większe dla GDF8-Pro w porównaniu z GDF8-ProFc, co wskazuje, że większy zasięg dystrybucji GDF8-Pro poza przestrzeń naczyniową w porównaniu z GDF8-ProFc.

Jakkolwiek efekt stabilizacyjny regionu Fc cząsteczki IgG na propeptyd GDF jest pokazany na przykładzie białka fuzyjnego propeptyd mysiego GDF-8-Fc (tj. obydwa składniki pochodzące z myszy), sposoby według niniejszego wynalazku można zastosować w dowolnej kombinacji składników: propeptyd GDF i IgG, bez względu na konkretne białko prekursorowe i gatunek zwierzęcia z którego składniki pochodzą, przy założeniu, że białko fuzyjne jest prawidłowo skonstruowane w celu zachowania aktywności (tj., jak tu opisano).

P r z y k ł a d 9

Pochodzenie i aktywność dwóch ludzkich białek fuzyjnych propeptyd GDF-8-Fc

Przygotowano dwa konstrukty fuzji GDF-8-Fc, stosując standardową metodologię PCR, w celu oceny potencjału terapeutycznego. cDNA kodujący ludzki propeptyd GDF-8 (SEK NR ID: 5) połączono z regionem Fc ludzkiej IgG2a (SEK NR ID: 15; fig. 11A) lub Fc ludzkiej IgG1 zmodyfikowanym dla zmniejszenia funkcji efektorowych (SEK NR ID: 16; fig. 11B).

1. Białko fuzyjne ludzki propeptyd GDF-8-wt Fc IgG1 (fig. 11A)

Pierwszych 264 aminokwasów propeptydu ludzkiego GDF-8 (włączając w to aminokwasy 1-241 z SEK NR ID: 5 i 23-aminokwasowy lider sekrecyjny jak przedstawiono w SEK NR ID: 13) połączono w ramce z 232 aminokwasami regionu stałego ludzkiej IgG1 począwszy od pierwszego aminokwasu w części zawiasowej (SEK NR ID: 15).

2. Ludzki propeptyd GDF-8-mutant IgG1 (fig. 11B)

Pierwszych 264 aminokwasów propeptydu ludzkiego GDF-8 jak opisano powyżej połączono w ramce z 227 aminokwasami zmutowanego regionu Fc ludzkiej IgG1 (SEK NR ID: 16). Wprowadzono dwie mutacje, reszty alaninowe (Ala-14 i Ala-17), jak przedstawiono w SEK NR ID: 16 w celu order zmniejszenia funkcji efektorowej jak opisano w Lund i wsp. (1991) J. Immun. 147:2657-2662 oraz Morgan i wsp. (1995) Immunology 86:319-324.

Białka fuzyjne wprowadzono do wektora eukariotycznego, pED (Kaufman i wsp. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4485-4490) i wyrażono przejściowo w komórkach COS-1 M6 (Horowitz i wsp. (1983) Journal of Molecular and Applied Genetics 2:147-159), stosując odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000 (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, Maryland, USA, Nr kat. 11668-019) zgodnie z protokołem producenta. Po 24 godzinach inkubacji dodano R1CD1 (zmodyfikowana wolna od surowicy

PL 207 202 B1 pożywka hodowlana DMEM/F12). Kondycjonowaną pożywkę (CM) zebrano, zastąpiono świeżą R1CD1 i CM zabrano ponownie 60 godzin później. Kondycjonowaną pożywkę połączono i oczyszczono przy użyciu Protein A Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, Anglia, Nr kat. 17-07080-01) po dodaniu 1/10 objętości 1 M Tris pH 8,0. Oczyszczone białko wymyto w 0,1 M kwasie octowym, 150 mM NaCl i natychmiast zobojętniano 1/20 objętości 3M Tris pH 9,0. Białka oceniano ilościowo stosując standardowy protokół ELISA dla ludzkiej IgG i testowano w teście wiązania ActRIIB razem z oczyszczonym propeptydem ludzkiego GDF-8, jak opisano w przykładzie 5. Wyniki są pokazane na fig. 8. Konkludując, obydwie fuzje ludzki propeptyd-Fc są silnymi inhibitorami wiązania się GDF-8 z ActRIIB.

P r z y k ł a d 10

Testowanie fuzji białkowych propeptyd GDF-8-Fc in vivo

Białko fuzyjne propeptyd mysiego GDF-8-Fc (z przykładu 9) testowano u dorosłych myszy. Dorosłe samice myszy BALB/c, w wieku siedmiu do dziewięciu tygodni, dobrano pod względem wagi ciała i umieszczono w grupach po siedem ( z wyjątkiem grupy nie traktowanej, która miała sześć myszy). Myszom podawano dwa razy w tygodniu poprzez zastrzyk I.P. dawkę 10 pg, 100 pg lub 1000 pg na zwierzę przez pięć tygodni. Zastrzyki kontrolne były z Fc mysiej IgG2a w stężeniu molowym ekwiwalentnym do wysokiej dawki propeptydu-Fc. Na zakończenie badania, pobierano i ważono mięsień brzuchaty łydki, mięsień czworogłowego, najądrzowe poduszeczki tłuszczowe, nerkę i wątrobę. Fig. 13 pokazuje średnią masę tkanki, z odcinkiem błędu oznaczającym błąd standardowy średniej. Gwiazdka (*) wskazuje na różnicę znaczącą statystycznie (p<0,01 stosując test studenta T) przy porównaniu z myszami traktowanymi białkiem kontrolnym, IgG2aFc. Blokowanie aktywności GDF-8 in vivo poprzez zastrzyk I.P. białka fuzyjnego propeptyd GDF-8-Fc w dawce 1 mg/tydzień (myszy traktowane) prowadziła do 6,6% wzrostu masy mięśnia brzuchatego łydki i 6,6% wzrostu masy mięśnia czworogłowego w porównaniu z myszami kontrolnymi nie otrzymującymi białka fuzyjnego propeptyd GDF-8-Fc. Ponadto, blokowanie aktywności GDF-8 in vivo poprzez zastrzyk I.P. białka fuzyjnego propeptyd GDF-8-Fc w dawce 100 pg/tydzień (myszy traktowane) prowadziła do 23,0% wzrostu masy poduszek tłuszczowych. Wysoka dawka (1 mg/tydzień) leczenia prowadziła również do zmniejszenia masy poduszek tłuszczowych, ale z powodu zróżnicowania masy poduszek tłuszczowych, różnica nie była wysoce znacząca statystycznie (p=0,047). Nie było wpływu traktowania na masę innych testowanych tkanek, włączając w to wątrobę i nerkę. Podsumowując, blokowanie aktywności GDF-8 in vivo poprzez zastrzyk I.P. białka fuzyjnego propeptyd GDF-8-Fc w dawce 1 mg/tydzień (myszy traktowane) prowadziła do wzrostu masy mięśnia brzuchatego łydki i mięśnia czworogłowego w porównaniu z myszami kontrolnymi nie otrzymującymi białka fuzyjnego propeptyd GDF-8-Fc.

PL 207 202 B1

Lista sekwencji <110> American Home Products Corporation <12 0> Modyfikowane i stabilizowane propeptydy GDF i ich zastosowanie <130> 01997.002000 <140> nie przekazane <141> 2001-02-07 <150> US 60/267,509 <151> 2001-02-08 <160> 16 <170> Patentln wersja 3.1 <210> 1 <211> 375 <212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Met Gin Lys Leu Gin Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile

10 15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu Asn Glu Asn Ser Glu Gin Lys Glu Asn 20 25 30

Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gin Asn Thr 35 40 45

Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala Ile Lys Ile Gin Ile Leu Ser Lys Leu 50 55 60

Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gin Leu

PL 207 202 B1

Val

His

Leu

Ser

Leu

160

Leu

Leu

Val

Gly

Thr

240

Lys

Cys

Val

Tyr

Lys

320

PL 207 202 B1

<400> 2 atgcaaaaac	tgcaactctg	tgtttatatt	tacctgttta	tgctgattgt	tgctggtcca	60
gtggatctaa	atgagaacag	tgagcaaaaa	gaaaatgtgg	aaaaagaggg	gctgtgtaat	120
gcatgtactt	ggagacaaaa	cactaaatct	tcaagaatag	aagccattaa	gatacaaatc	180
ctcagtaaac	ttcgtctgga	aacagctcct	aacatcagca	aagatgttat	aagacaactt	240
ttacccaaag	ctcctccact	ccgggaactg	attgatcagt	atgatgtcca	gagggatgac	300
agcagcgatg	gctctttgga	agatgacgat	tatcacgcta	caacggaaac	aatcattacc	360
atgcctacag	agtctgattt	tctaatgcaa	gtggatggaa	aacccaaatg	ttgcttcttt	420
aaatttagct	ctaaaataca	atacaataaa	gtagtaaagg	cccaactatg	gatatatttg	480
agacccgtcg	agactcctac	aacagtgttt	gtgcaaatcc	tgagactcat	caaacctatg	540
aaagacggta	caaggtatac	tggaatccga	tctctgaaac	ttgacatgaa	cccaggcact	600
ggtatttggc	agagcattga	tgtgaagaca	gtgttgcaaa	attggctcaa	acaacctgaa	660
tccaacttag	gcattgaaat	aaaagcttta	gatgagaatg	gtcatgatct	tgctgtaacc	720
ttcccaggac	caggagaaga	tgggctgaat	ccgtttttag	aggtcaaggt	aacagacaca	780
ccaaaaagat	ccagaaggga	ttttggtctt	gactgtgatg	agcactcaac	agaatcacga	840
tgctgtcgtt	accctctaac	tgtggatttt	gaagcttttg	gatgggattg	gattatcgct	900
cctaaaagat	ataaggccaa	ttactgctct	ggagagtgtg	aatttgtatt	tttacaaaaa	960

PL 207 202 B1

tatcctcata ctcatctggt acaccaagca aaccccagag gttcagcagg cccttgctgt	1020
actcccacaa agatgtctcc aattaatatg ctatatttta atggcaaaga acaaataata	1080
tatgggaaaa ttccagcgat ggtagtagac cgctgtgggt gctca	1125
<210> 3
<211> 109
<212> PRT
<213> Homo sapiens

<400> 3

Asp Phe Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Thr Glu Ser Arg Cys Cys

10 15

Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30

Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Glu Cys Glu 35 40 45

Phe Val Phe Leu Gin Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val His Gin Ala 50 55 50

Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser

70 75 80

Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gin Ile Ile Tyr Gly

90 95

Lys Ile Pro Ala Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 4 <211> 327 <212> DNA <213> Horno sapiens <400> 4 gattttggtc ttgactgtga tgagcactca acagaatcac gatgctgtcg ttaccctcta 60 actgtggatt ttgaagcttt tggatgggat tggattatcg ctcctaaaag atataaggcc 120

PL 207 202 B1

aattactgct	ctggagagtg tgaatttgta tttttacaaa aatatcctca tactcatctg	180
gtacaccaag	caaaccccag aggttcagca ggcccttgct gtactcccac aaagatgtct	240
ccaattaata	tgctatattt taatggcaaa gaacaaataa tatatgggaa aattccagcg	300
atggtagtag	accgctgtgg gtgctca	327

<210> 5 <211> 243 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 5

Asn Glu Asn Ser Glu Gin Lys Glu Asn Val Glu Lys Glu Gly Leu Cys 15 10 15

Asn Ala Cys Thr Trp Arg Gin Asn Thr Lys Ser Ser Arg Ile Glu Ala 20 25 30

Ile Lys Ile Gin Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Glu Thr Ala Pro Asn 35 40 45

Ile Ser Lys Asp Val Ile Arg Gin Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu 50 55 60

Arg Glu Leu Ile Asp Gin Tyr Asp Val Gin Arg Asp Asp Ser Ser Asp 65 70 75 80

Gly Ser Leu Glu Asp Asp Asp Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Ile Ile 85 90 95

Thr Met Pro Thr Glu Ser Asp Phe Leu Met Gin Val Asp Gly Lys Pro 100 105 110

Lys Cys Cys Phe Phe Lys Phe Ser Ser Lys Ile Gin Tyr Asn Lys Val 115 120 125

Val Lys Ala Gin Leu Trp Ile Tyr Leu Arg Pro Val Glu Thr Pro Thr 130 135 140

Thr Val Phe Val Gin Ile Leu Arg Leu Ile Lys Pro Met Lys Asp Gly 145 150 155 160

PL 207 202 B1

<400> 6

aatgagaaca	gtgagcaaaa	agaaaatgtg	gaaaaagagg	ggctgtgtaa	tgcatgtact	60
tggagacaaa	acactaaatc	ttcaagaata	gaagccatta	agatacaaat	cctcagtaaa	120
cttcgtctgg	aaacagctcc	taacatcagc	aaagatgtta	taagacaact	tttacccaaa	180
gctcctccac	tccgggaact	gattgatcag	tatgatgtcc	agagggatga	cagcagcgat	240
ggctctttgg	aagatgacga	ttatcacgct	acaacggaaa	caatcattac	catgcctaca	300
gagtctgatt	ttctaatgca	agtggatgga	aaacccaaat	gttgcttctt	taaatttagc	360
tctaaaatac	aatacaataa	agtagtaaag	gcccaactat	ggatatattt	gagacccgtc	420
gagactccta	caacagtgtt	tgtgcaaatc	ctgagactca	tcaaacctat	gaaagacggt	480
acaaggtata	ctggaatccg	atctctgaaa	cttgacatga	acccaggcac	tggtatttgg	540
cagagcattg	atgtgaagac	agtgttgcaa	aattggctca	aacaacctga	atccaactta	600
ggcattgaaa	taaaagcttt	agatgagaat	ggtcatgatc	ttgctgtaac	cttcccagga	660
ccaggagaag	atgggctgaa	tccgttttta	gaggtcaagg	taacagacac	accaaaaaga	720

tccagaagg 729

PL 207 202 B1 <210> 7' <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7

Met Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Ala Leu 15 10 15

Glu Leu Arg Pro Arg Gly Glu Ala Ala Glu Gly Pro Ala Ala Ala Ala 20 25 30

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Gly Gly Glu Arg Ser 35 40 45

Ser Arg Pro Ala Pro Ser Val Ala Pro Glu Pro Asp Gly Cys Pro Val 50 55 60

Cys Val Trp Arg Gin His Ser Arg Glu Leu Arg Leu Glu Ser Ile Lys ⁶⁵ 70 75 80

Ser Gin Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Lys Glu Ala Pro Asn Ile Ser 65 90 95

Arg Glu Val Val Lys Gin Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gin Gin 100 105 no

Ile Leu Asp Leu His Asp Phe Gin Gly Asp Ala Leu Gin Pro Glu Asp 115 120 125

Phe Leu Glu Glu Asp Glu Tyr His Ala Thr Thr Glu Thr Val Ile Ser 130 135 140

Met Ala Gin Glu Thr Asp Pro Ala Val Gin Thr Asp Gly Ser Pro Leu 145 150 155 160

Cys Cys His Phe His Phe Ser Pro Lys Val Met Phe Thr Lys Val Leu 165 170 175

Lys Ala Gin Leu Trp Val Tyr Leu Arg Pro Val Pro Arg Pro Ala Thr 180 185 190

PL 207 202 B1

Val Tyr Leu Gin Ile Leu Arg Leu Lys Pro Leu Thr Gly Glu Gly Thr 195 200 205

Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Arg His Ile Arg Ile Arg Ser Leu 210 215 220

Lys Ile Glu Leu His Ser Arg Ser Gly His Trp Gin Ser Ile Asp Phe 225 230 235 240

Lys Gin Val Leu His Ser Trp Phe Arg Gin Pro Gin Ser Asn Trp Gly 245 250 255

Ile Glu Ile Asn Ala Phe Asp Pro Ser Gly Thr Asp Leu Ala Val Thr 260 265 270

Ser Leu Gly Pro Gly Ala Glu Gly Leu His Pro Phe Met Glu Leu Arg 275 280 285

Val Leu Glu Asn Thr Lys Arg Ser Arg Arg Asn Leu Gly Leu Asp Cys 290 295 300

Asp Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val 305 310 315 320

Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr 325 330 335

Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gin Cys Glu Tyr Met Phe Met Gin Lys 340 345 350

Tyr Pro His Thr His Leu Val Gin Gin Ala Asn Pro Arg Gly Ser Ala 355 360 365

Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro Ile Asn Met Leu Tyr 370 375 380

Phe Asn Asp Lys Gin Gin Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Gly Met Val 385 390 395 400

Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 405 <210> 8 <211> 1221

PL 207 202 B1 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 8 atggtgctcg	cggccccgct	gctgctgggc	ttcctgctcc	tcgccctgga	gctgcggccc	60
cggggggagg	cggccgaggg	ccccgcggcg	gcggcggcgg	cggcggcggc	ggcggcagcg	120
gcgggggtcg	ggggggagcg	ctccagccgg	ccagccccgt	ccgtggcgcc	cgagccggac	180
ggctgccccg	tgtgcgtttg	gcggcagcac	agccgcgagc	tgcgcctaga	gagcatcaag	240
tcgcagatct	tgagcaaact	gcggctcaag	gaggcgccca	acatcagccg	cgaggtggtg	300
aagcagctgc	tgcccaaggc	gccgccgctg	cagcagatcc	tggacctaca	cgacttccag	360
ggcgacgcgc	tgcagcccga	ggacttcctg	gaggaggacg	agtaccacgc	caccaccgag	420
accgtcatta	gcatggccca	ggagacggac	ccagcagtac	agacagatgg	cagccctctc	480
tgctgccatt	ttcacttcag	ccccaaggtg	atgttcacaa	aggtactgaa	ggcccagctg	540
tgggtgtacc	tacggcctgt	accccgccca	gccacagtct	acctgcagat	cttgcgacta	600
aaacccctaa	ctggggaagg	gaccgcaggg	ggagggggcg	gaggccggcg	tcacatccgt	660
atccgctcac	tgaagattga	gctgcactca	cgctcaggcc	attggcagag	catcgacttc	720
aagcaagtgc	tacacagctg	gttccgccag	ccacagagca	actggggcat	cgagatcaac	780
gcctttgatc	ccagtggcac	agacctggct	gtcacctccc	tggggccggg	agccgagggg	840
ctgcatccat	tcatggagct	tcgagtccta	gagaacacaa	aacgttcccg	gcggaacctg	900
ggtctggact	gcgacgagca	ctcaagcgag	tcccgctgct	gccgatatcc	cctcacagtg	960
gactttgagg	ctttcggctg	ggactggatc	atcgcaccta	agcgctacaa	ggccaactac	1020
tgctccggcc	agtgcgagta	catgttcatg	caaaaatatc	cgcataccca	tttggtgcag	1080
caggccaatc	caagaggctc	tgctgggccc	tgttgtaccc	ccaccaagat	gtccccaatc	1140
aacatgctct	acttcaatga	caagcagcag	attatctacg	gcaagatccc	tggcatggtg	1200
gtggatcgct	gtggctgctc	t				1221

<210>	9
<211>	109
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens
<400>	9

PL 207 202 B1

Asn Leu Gly Leu Asp Cys Asp Glu His Ser Ser Glu Ser Arg Cys Cys 15 10 15

Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Ala Phe Gly Trp Asp Trp Ile 20 25 30

Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Asn Tyr Cys Ser Gly Gin Cys Glu 35 40 45

Tyr Met Phe Met Gin Lys Tyr Pro His Thr His Leu Val Gin Gin Ala 50 55 60

Asn Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser 65 70 75 80

Pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Asp Lys Gin Gin Ile Ile Tyr Gly 85 90 95

Lys Ile Pro Gly Met Val Val Asp Arg Cys Gly Cys Ser 100 105 <210> 10 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens

<400> 10
aacctgggtc	tggactgcga	cgagcactca	agcgagtccc	gctgctgccg	atatcccctc	60
acagtggact	ttgaggcttt	cggctgggac	tggatcatcg	cacctaagcg	ctacaaggcc	120
aactactgct	ccggccagtg	cgagtacatg	ttcatgcaaa	aatatccgca	tacccatttg	180
gtgcagcagg	ccaatccaag	aggctctgct	gggccctgtt	gtacccccac	caagatgtcc	240
ccaatcaaca	tgctctactt	caatgacaag	cagcagatta	tctacggcaa	gatccctggc	300
atggtggtgg	atcgctgtgg	ctgctct				327

<210>	11
<211>	274
<212>	PRT
<213>	Homo sapiens

PL 207 202 B1 <400> 11

Ala Glu Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 15 10 15

Ala Gly Val Gly Gly Glu Arg Ser Ser Arg Pro Ala Pro Ser Val Ala 20 25 30

Pro Glu Pro Asp Gly Cys Pro Val Cys Val Trp Arg Gin His Ser Arg 35 40 45

Glu Leu Arg Leu Glu Ser Ile Lys Ser Gin Ile Leu Ser Lys Leu Arg 50 55 60

Leu Lys Glu Ala Pro Asn Ile Ser Arg Glu Val Val Lys Gin Leu Leu 65 70 75 80

Pro Lys Ala Pro Pro Leu Gin Gin Ile Leu Asp Leu His Asp Phe Gin 85 90 95

Gly Asp Ala Leu Gin Pro Glu Asp Phe Leu Glu Glu Asp Glu Tyr His 100 105 110

Ala Thr Thr Glu Thr Val Ile Ser Met Ala Gin Glu Thr Asp Pro Ala 115 120 125

Val Gin Thr Asp Gly Ser Pro Leu Cys Cys His Phe His Phe Ser Pro 130 135 140

Lys Val Met Phe Thr Lys Val Leu Lys Ala Gin Leu Trp Val Tyr Leu 145 150 155 160

Arg Pro Val Pro Arg Pro Ala Thr Val Tyr Leu Gin Ile Leu Arg Leu 165 170 175

Lys Pro Leu Thr Gly Glu Gly Thr Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg 180 185 190

Arg His Ile Arg Ile Arg Ser Leu Lys Ile Glu Leu His Ser Arg Ser 195 200 205

Gly His Trp Gin Ser Ile Asp Phe Lys Gin Val Leu His Ser Trp Phe 210 215 220

Arg Gin Pro Gin Ser Asn Trp Gly Ile Glu Ile Asn Ala Phe Asp Pro

PL 207 202 B1

<400> 12

gccgagggcc	ccgcggcggc	ggcggcggcg	gcggcggcgg	cggcagcggc	gggggtcggg	60
ggggagcgct	ccagccggcc	agccccgtcc	gtggcgcccg	agccggacgg	ctgccccgtg	120
tgcgtttggc	ggcagcacag	ccgcgagctg	cgcctagaga	gcatcaagtc	gcagatcttg	180
agcaaactgc	ggctcaagga	ggcgcccaac	atcagccgcg	aggtggtgaa	gcagctgctg	240
cccaaggcgc	cgccgctgca	gcagatcctg	gacctacacg	acttccaggg	cgacgcgctg	300
cagcccgagg	acttcctgga	ggaggacgag	taccacgcca	ccaccgagac	cgtcattagc	360
atggcccagg	agacggaccc	agcagtacag	acagatggca	gccctctctg	ctgccatttt	420
cacttcagcc	ccaaggtgat	gttcacaaag	gtactgaagg	cccagctgtg	ggtgtaccta	480
cggcctgtac	cccgcccagc	cacagtctac	ctgcagatct	tgcgactaaa	acccctaact	540
ggggaaggga	ccgcaggggg	agggggcgga	ggccggcgtc	acatccgtat	ccgctcactg	600
aagattgagc	tgcactcacg	ctcaggccat	tggcagagca	tcgacttcaa	gcaagtgcta	660
cacagctggt	tccgccagcc	acagagcaac	tggggcatcg	agatcaacgc	ctttgatccc	720
agtggcacag	acctggctgt	cacctccctg	gggccgggag	ccgaggggct	gcatccattc	780
atggagcttc	gagtcctaga	gaacacaaaa	cgttcccggc	99		822

<210>	13
<211>	23
<212>	PRT

PL 207 202 B1 <213> Homo sapiens <400> 13

Met Gin Lys Leu Gin Leu Cys Val Tyr Ile Tyr Leu Phe Met Leu Ile 15 10 15

Val Ala Gly Pro Val Asp Leu 20 <210> 14 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14

Met Val Leu Ala Ala Pro Leu Leu Leu Gly Phe Leu Leu Leu Ala Leu 15 10 15

Glu Leu Arg Pro Arg Gly Glu Ala 20 <210> 15 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <40Q> 15

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 15 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60

PL 207 202 B1

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 115 120 125

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140

Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 16 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu Gly 15 10 15

PL 207 202 B1

Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser 130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220

Pro Gly Lys

Claims (47)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Modyfikowany propeptyd GDF-8 obejmujący sekwencję aminokwasową, która zawiera mutację w reszcie odpowiadającej pozycji 76 SEK NR ID: 5, przy czym modyfikowany propeptyd GDF-8 ma zwiększony okres półtrwania in vivo albo in vitro w stosunku do odpowiadającego mu niezmodyfikowanego propeptydu GDF-8.
2. 2. Modyfikowany propeptyd GDF-8 według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja aminokwasowa jest (a) sekwencją aminokwasową w co najmniej 75% identyczną z SEK NR ID: 5 albo (b) funkcjonalnym fragmentem (a).
3. 3. Modyfikowany propeptyd GDF-8 według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja aminokwasowa jest w co najmniej 75% identyczna z SEK NR ID: 5.
4. 4. Modyfikowany propeptyd GDF-8 według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że sekwencja aminokwasowa jest w co najmniej 80% identyczna z SEK NR ID: 5.
5. 5. Modyfikowany propeptyd GDF-8 według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że sekwencja aminokwasowa jest w co najmniej 85% identyczna z SEK NR ID: 5.
6. 6. Modyfikowany propeptyd GDF-8 według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że sekwencja aminokwasowa jest w co najmniej 90% identyczna z SEK NR ID: 5.
7. 7. Modyfikowany propeptyd GDF-8 według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że sekwencja aminokwasowa jest w co najmniej 95% identyczna z SEK NR ID: 5.
8. 8. Modyfikowany propeptyd GDF-8 według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że sekwencja aminokwasowa jest w co najmniej 98% identyczna z SEK NR ID: 5.
9. 9. Modyfikowany propeptyd GDF-8 według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera sekwencję SEK NR ID: 5 albo jej funkcjonalny fragment, z tą różnicą, że obejmuje mutację w reszcie odpowiadającej pozycji 76 SEK NR ID: 5.
10. 10. Modyfikowany propeptyd GDF-8 według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera sekwencję SEK NR ID: 5, z tą różnicą, że obejmuje mutację w reszcie odpowiadającej pozycji 76 SEK NR ID: 5.
11. 11. Modyfikowany propeptyd GDF-8 według jednego z zastrz. 1-10, znamienny tym, że jest mutacją w sekwencji aminokwasowej w reszcie odpowiadającej pozycji 76 SEK NR ID: 5 jest delecja.
12. 12. Modyfikowany propeptyd GDF-8 według jednego z zastrz. 1-10, znamienny tym, że mutacją w sekwencji aminokwasowej w reszcie odpowiadającej pozycji 76 SEK NR ID: 5 jest substytucja.
13. 13. Modyfikowany propeptyd GDF-8 według zastrz. 12, znamienny tym, że resztą odpowiadającą pozycji 76 SEK NR ID: 5 jest alanina.
14. 14. Modyfikowany propeptyd GDF-8 według jednego z zastrz. 1 do 13, znamienny tym, że miejsce cięcia proteolitycznego jest inaktywowane przez mutację w tym miejscu.
15. 15. Modyfikowany propeptyd GDF-8 według jednego z zastrz. 1 do 14, znamienny tym, że zawiera ponadto modyfikację stabilizującą.
16. 16. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 15, znamienny tym, że modyfikacja stabilizująca obejmuje fuzję regionu Fc cząsteczki IgG do propeptydu.
17. 17. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 16, znamienny tym, że cząsteczką IgG jest IgG1 albo IgG4 albo ich pochodne.
18. 18. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 17, znamienny tym, że cząsteczką IgG jest IgG1.
19. 19. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 16, znamienny tym, że sekwencja aminokwasowa cząsteczki IgG jest w co najmniej 75% identyczna z SEK NR ID: 15.
20. 20. Modyfikowany propeptyd GDF-8 według zastrz. 16, znamienny tym, że sekwencją aminokwasową cząsteczki IgG jest SEK NR ID: 15.
21. 21. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 16, znamienny tym, że sekwencja aminokwasowa cząsteczki IgG jest w co najmniej 75% identyczna z SEK NR ID: 16.
22. 22. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 16, znamienny tym, że sekwencją aminokwasową cząsteczki IgG jest SEK NR ID: 16.
23. 23. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 16, znamienny tym, że propeptyd jest połączony z regionem Fc cząsteczki IgG poprzez peptyd łącznikowy.
24. 24. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 15, znamienny tym, że stabilizująca modyfikacja obejmuje zmienione miejsce glikozylacji.
25. 25. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 15, znamienny tym, że stabilizująca modyfikacja obejmuje co najmniej jedną resztę węglowodanową.

    PL 207 202 B1
26. 26. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 15, znamienny tym, że stabilizująca modyfikacja obejmuje albuminę albo pochodną albuminy.
27. 27. Modyfikowany propeptyd według zastrz. 15, znamienny tym, że stabilizująca modyfikacja obejmuje niebiałkopodobny polimer.
28. 28. Modyfikowany propeptyd według jednego z zastrz. 1 do 27, znamienny tym, że zawiera ponadto umożliwiający oczyszczanie znacznik.
29. 29. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca modyfikowany propeptyd GDF-8 określony w jednym z zastrz. 1-28.
30. 30. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 29, znamienna tym, że zawiera co najmniej 20 ciągłych nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 2.
31. 31. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 29, znamienna tym, że zawiera co najmniej 20 ciągłych nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 6.
32. 32. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 29, znamienna tym, że zawiera co najmniej 50 ciągłych nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 2.
33. 33. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 29, znamienna tym, że zawiera co najmniej 50 ciągłych nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 6.
34. 34. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 29, znamienna tym, że zawiera co najmniej 20 ciągłych nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 8.
35. 35. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 29, znamienna tym, że zawiera co najmniej 20 ciągłych nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 12.
36. 36. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 29, znamienna tym, że zawiera co najmniej 50 ciągłych nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 8.
37. 37. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 29, znamienna tym, że zawiera co najmniej 50 ciągłych nukleotydów przedstawionych w SEK NR ID: 12.
38. 38. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera modyfikowany propeptyd określony w jednym z zastrz. 1-28 i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.
39. 39. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera cząsteczkę kwasu nukleinowego określoną w jednym z zastrz. 29-37 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik albo wektor.
40. 40. Sposób wytwarzania modyfikowanego propeptydu GDF-8 określonego w jednym z zastrz. 1-28, znamienny tym, że obejmuje:

    (a) wytwarzanie cząsteczki cDNA kodującej propeptyd, określonej w jednym z zastrz. 29-37, w której miejsce cięcia proteolitycznego jest zmienione;

    (b) wytwarzanie cząsteczki cDNA kodującej region Fc cząsteczki IgG; oraz (c) połączenie cząsteczek cDNA z etapów (a) i (b) z wytworzeniem zmodyfikowanego propeptydu GDF-8.
41. 41. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że obejmuje ponadto wytworzenie dwuniciowego oligonukleotydu kodującego peptyd łącznikowy i przyłączenie cząsteczek cDNA z etapów (a) i (b) do któregoś z końców dwuniciowego oligonukleotydu kodującego peptyd łącznikowy.
42. 42. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że peptyd łącznikowy zawiera sekwencję aminokwasową składającą się z GSGS.
43. 43. Rekombinowana komórka zawierająca kwas nukleinowy kodujący modyfikowany propeptyd GDF-8 określony w jednym z zastrz. 1-28.
44. 44. Modyfikowany propeptyd według jednego z zastrz. 1-28 do zastosowania jako lek.
45. 45. Zastosowanie modyfikowanego propeptydu określonego w jednym z zastrz. 1-28 do wytwarzania leku do leczenia jednego albo większej liczby stanów chorobowych wybranych spośród choroby mięśniowej, choroby neuromięśniowej, choroby metabolicznej albo choroby degeneracyjnej kości.
46. 46. Zastosowanie modyfikowanego propeptydu określonego w jednym z zastrz. 1-28 do wytwarzania leku do leczenia jednego albo większej liczby stanów chorobowych wybranych spośród stwardnienia zanikowego bocznego, dystrofii mięśniowej, atrofii mięśni, zastoinowej czopującej choroby płuc, zespołu wyniszczenia mięśniowego, sarkopenii albo kacheksji.
47. 47. Zastosowanie modyfikowanego propeptydu określonego w jednym z zastrz. 1-28 do wytwarzania leku do leczenia osteoporozy.