NO333427B1 - Modifiserte GDF-8-propeptider, fremgangsmate for fremstilling og anvendelse derav, nukleinsyremolekyl kodende for modifisert GDF-8-propeptid, samt farmasoytisk preparat - Google Patents
Modifiserte GDF-8-propeptider, fremgangsmate for fremstilling og anvendelse derav, nukleinsyremolekyl kodende for modifisert GDF-8-propeptid, samt farmasoytisk preparat Download PDFInfo
- Publication number
- NO333427B1 NO333427B1 NO20033456A NO20033456A NO333427B1 NO 333427 B1 NO333427 B1 NO 333427B1 NO 20033456 A NO20033456 A NO 20033456A NO 20033456 A NO20033456 A NO 20033456A NO 333427 B1 NO333427 B1 NO 333427B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- gdf
- propeptide
- modified
- seq
- protein
- Prior art date
Links
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 title claims abstract description 338
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 58
- 102000004472 Myostatin Human genes 0.000 title claims description 337
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 134
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 122
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 208000011623 Obstructive Lung disease Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 208000001076 sarcopenia Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000018360 neuromuscular disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 117
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 50
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 46
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 32
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 29
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 28
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 24
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 24
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 19
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 claims description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 11
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 10
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 8
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 8
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 8
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 102100040898 Growth/differentiation factor 11 Human genes 0.000 abstract description 72
- 101710194452 Growth/differentiation factor 11 Proteins 0.000 abstract description 72
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 20
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 13
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 abstract description 12
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 abstract description 12
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 abstract description 10
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 abstract description 10
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 abstract description 10
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 abstract description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 9
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract description 6
- 208000026062 Tissue disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000003387 muscular Effects 0.000 abstract description 5
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 102100039939 Growth/differentiation factor 8 Human genes 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 55
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 51
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 51
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 31
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 27
- 101000886562 Homo sapiens Growth/differentiation factor 8 Proteins 0.000 description 25
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 23
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 17
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 16
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 15
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 15
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 13
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 13
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101100437153 Rattus norvegicus Acvr2b gene Proteins 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 12
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 12
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 10
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 10
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Chemical group 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 8
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 7
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 7
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 7
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 7
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 7
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- -1 antibodies Proteins 0.000 description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 5
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 5
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 5
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 101001075141 Mus musculus Growth/differentiation factor 8 Proteins 0.000 description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001002 morphogenetic effect Effects 0.000 description 4
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000000229 preadipocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 4
- PFEIMYTUIFVDPO-NVKWYWNSSA-N 2-aminoacetic acid (2S)-2-amino-3-hydroxypropanoic acid Chemical compound NCC(O)=O.NCC(O)=O.OC[C@H](N)C(O)=O.OC[C@H](N)C(O)=O PFEIMYTUIFVDPO-NVKWYWNSSA-N 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004420 Creatine Kinase Human genes 0.000 description 3
- 108010042126 Creatine kinase Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 3
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000001246 colloidal dispersion Methods 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000014101 glucose homeostasis Effects 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 238000012900 molecular simulation Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 230000009753 muscle formation Effects 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 2
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 102000017011 Glycated Hemoglobin A Human genes 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102400000401 Latency-associated peptide Human genes 0.000 description 2
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 2
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 2
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 108091005995 glycated hemoglobin Proteins 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 2
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N methyl salicylate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1O OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 2
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- UBWXUGDQUBIEIZ-UHFFFAOYSA-N (13-methyl-3-oxo-2,6,7,8,9,10,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl) 3-phenylpropanoate Chemical compound CC12CCC(C3CCC(=O)C=C3CC3)C3C1CCC2OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 UBWXUGDQUBIEIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KYBXNPIASYUWLN-WUCPZUCCSA-N (2s)-5-hydroxypyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC1CC[C@@H](C(O)=O)N1 KYBXNPIASYUWLN-WUCPZUCCSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 1,2,3-triazine Chemical compound C1=CN=NN=C1 JYEUMXHLPRZUAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 1
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 125000000979 2-amino-2-oxoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940117976 5-hydroxylysine Drugs 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000011732 Abnormal glucose homeostasis Diseases 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N Cyanamide Chemical compound NC#N XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000016970 Follistatin Human genes 0.000 description 1
- 108010014612 Follistatin Proteins 0.000 description 1
- 102000019203 Follistatin-Related Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010012820 Follistatin-Related Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 101000893545 Homo sapiens Growth/differentiation factor 11 Proteins 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 206010020880 Hypertrophy Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000002746 Inhibins Human genes 0.000 description 1
- 108010004250 Inhibins Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 101800001155 Latency-associated peptide Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 244000246386 Mentha pulegium Species 0.000 description 1
- 235000016257 Mentha pulegium Nutrition 0.000 description 1
- 235000004357 Mentha x piperita Nutrition 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010022233 Plasminogen Activator Inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100039418 Plasminogen activator inhibitor 1 Human genes 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 1
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102400000716 Transforming growth factor beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 102400001359 Transforming growth factor beta-2 Human genes 0.000 description 1
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 102400000398 Transforming growth factor beta-3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000097 Transforming growth factor beta-3 Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-XXSWNUTMSA-N [125I][125I] Chemical compound [125I][125I] PNDPGZBMCMUPRI-XXSWNUTMSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000009858 acid secretion Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000823 artificial membrane Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 1
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 229930183167 cerebroside Natural products 0.000 description 1
- 150000001784 cerebrosides Chemical class 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 229940075614 colloidal silicon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940079360 enema for constipation Drugs 0.000 description 1
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 210000002468 fat body Anatomy 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N fusidic acid Chemical class O[C@@H]([C@@H]12)C[C@H]3\C(=C(/CCC=C(C)C)C(O)=O)[C@@H](OC(C)=O)C[C@]3(C)[C@@]2(C)CC[C@@H]2[C@]1(C)CC[C@@H](O)[C@H]2C IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000009229 glucose formation Effects 0.000 description 1
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000006377 glucose transport Effects 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000001050 hortel pimenta Nutrition 0.000 description 1
- 102000054677 human MSTN Human genes 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 125000002349 hydroxyamino group Chemical group [H]ON([H])[*] 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- XMGQYMWWDOXHJM-UHFFFAOYSA-N limonene Chemical compound CC(=C)C1CCC(C)=CC1 XMGQYMWWDOXHJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960001047 methyl salicylate Drugs 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 239000006218 nasal suppository Substances 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 230000007672 negative regulation of muscle organ development Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 239000007968 orange flavor Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000010603 pastilles Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 239000012660 pharmacological inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000001095 phosphatidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000008389 polyethoxylated castor oil Substances 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000019464 regulation of glucose import Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 238000013391 scatchard analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N triflic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C(F)(F)F ITMCEJHCFYSIIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000012762 unpaired Student’s t-test Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/06—Anabolic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Modifiserte og stabiliserte propeptider av vekstdifferensierende faktorproteiner, slik som GDF-8 og benmorfogenetisk protein-11 beskrives. Fremgangsmåter for å fremstille og anvende de modifiserte propeptidene for å forhindre og behandle humane og animalske sykdommer, hvori en økning i muskelvev ville være terapeutisk fordelaktig beskrives også. Slike sykdommer inkluderer muskel- eller nevromuskulære sykdommer (slik som amyotrofisk lateral sklerose, muskulær dystrofi, muskelatropi, kongestiv obstruktiv lungesykdom, muskelsvinnsyndrom, sarkopeni eller cachexia), metabolske sykdommer og tilstander (slik som type 2 diabetes, ikke-insulinavhengig diabetes mellitus, hyperglykemi eller overvekt), fettvevssykdommer (slik som overvekt) og bendegenerative sykdommer (slik som osteoporose).
Description
Oppfinnelsens område
Denne oppfinnelsen angår inhibitorer av vekstdifferensieringsfaktor-8 (GDF-8)-proteiner og fremgangsmåter for anvendelse derav. Nærmere bestemt tilveiebringer oppfinnelsen modifiserte og stabiliserte propeptider av GDF-8-proteiner som hemmer GDF-8-aktiviteten. Oppfinnelsen er spesielt anvendelig for forebygging eller behandling av humane eller animalske sykdommer hvori en økning i skjelettmuskelvev vil være terapeutisk fordelaktig. Slike sykdommer inkluderer muskel- og nevromuskulære sykdommer (slik som amyotrofisk lateral sklerose, muskeldystrofi, muskelatropi, kongestiv obstruktiv lungesykdom, muskelsvinnsyndrom, sarkopeni eller cachexia), metabolske sykdommer eller tilstander (slik som type 2 diabetes, ikke-insulinavhengig diabetes mellitus, hyperglykemi eller overvekt), fettvevssykdommer (slik som overvekt) eller degenererende bensykdommer (slik som osteoporose).
Bakgrunn for oppfinnelsen
Vekst- og differensieringsfaktor-8 (GDF-8), også kjent som myostatin, er et medlem av den transformerende vekstfaktor-beta (TGF-J3) superfamilien av strukturelt beslektede vekstfaktorer, hvor alle utøver viktige vekstregulatoriske og morfogenetiske egenskaper (Kingsley et al. (1994) Genes Dev. 8: 133-146; Hoodless et al., (1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228: 235-72). GDF-8 er en negativ regulator av skjelettmuskelmasse og det er betydelig interesse for å identifisere faktorer som regulerer dens biologiske aktivitet. For eksempel uttrykkes GDF-8 i høy grad i den utviklende og voksne skjelettmuskelen. GDF-8-nullmutasjon i transgene mus er karakterisert ved en markert hypertrofi og hyperplasi i skjelettmuskelen (McPherron et al. (1997) Nature 387: 83-90). Lignende økning i skjelettmuskelmasse er tydelig i naturlig forekommende mutasjoner av GDF-8 i kveg (Ashmore et al. (1974) Growth 38: 501-507; Swatland og Kieffer (1994) J. Anim. Sei. 38: 752-757; McPherron og Lee (1997) Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 94: 12457-12461; og Kambadur et al. (1997) Genome Res. 7: 910-915). Nyere studier har også vist at muskelsvinn assosiert med HIV-infeksjon i mennesker er etterfulgt av økt GDF-8 proteinekspresjon (Gonzalez-Cadavid et al.
(1998) PNAS 95: 14938-43). I tillegg kan GDF-8 modulere fremstillingen av muskelspesifikke enzymer (for eksempel kreatinkinase) og modulere myoblastcelleproliferasjon (WO 00/43781).
I tillegg til dets vekstregulatoriske og morfogenetiske egenskaper i skjelettmuskulatur, kan GDF-8 også være involvert i et antall andre fysiologiske prosesser (for eksempel glukosehomeostase), så vel som unormale tilstander slik som i utviklingen av type 2 diabetes og fettvevssykdommer slik som overvekt. For eksempel modulerer GDF-8 preadipocyttdifferensiering til adipocytter (Kim et al.
(2001) B. B. R. C. 281: 902-906).
Som TGF-P-1, -2 og -3 syntetiseres GDF-8-proteinet som et forløperprotein som består av et aminoterminalt propeptid og et karboksyterminalt modent domene (McPherron og Lee, 1997, supra) så vel som en signalsekvens som dirigerer proteinet til det ekstracellulære domenet og som også kløyves fra proteinet. Det antas at forløper GDF-8-proteinet danner en homodimer for kløyving av propeptidet. Det aminoterminale propeptidet kløyves deretter fra det modne domenet og det kløyvde propeptidet kan forbli ikke-kovalent bundet til det modne dimerdomenet, og hemme dets biologiske aktivitet (Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 6407-6415; Wakefield et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 7646-7654; og Brown et al. (1990) Growth Factors 3: 35-43). Det antas at to GDF-8-propeptider binder seg til den modne GDF-8-dimeren (Thies et al. (2001) Growth Factors 18: 251-259). Som følge av de inaktiverende egenskapene er propeptidet kjent som det "latensassosierte peptidet" (LAP), og komplekset av modent domene og propeptid henvises vanligvis til som det "lille latente komplekset" (Gentry og Nash (1990) Biochemistry 29: 6851-6857; Derynck et al. (1995) Nature 316: 701-705; og Massague (1990) Ann. Rev. Cell Biol. 12: 597-641). Det modne domenet antas å være aktivt som en homodimer når propeptidet fjernes. Andre proteiner er også kjent for å binde seg til GDF-8 eller strukturelt beslektede proteiner og hemme deres biologiske aktivitet. Slike inhibitoriske proteiner inkluderer follistatin (Garner et al. (1999) Dev. Biol. 208: 222-232) og follistatinbeslektede proteiner.
Et antall humane og animalske sykdommer er videre assosiert med tap av eller funksjonelt svekket muskelvev, inkludert muskulær dystrofi, muskelatropi, kongestiv obstruktiv lungesykdom, muskelsvinnsyndrom, sarkopeni og cachexia. I dag eksisterer det svært få pålitelige eller effektive terapier for disse sykdommene. De forferdelige symptomene som er assosiert med disse sykdommene kunne vesentlig reduseres ved å anvende terapier som øker mengden muskelvev i pasienter som lider av sykdommene. Slike terapier ville signifikant forbedre livskvaliteten for disse pasientene og kunne lindre mange virkninger av disse sykdommene. Det er følgelig et behov for å identifisere nye terapier som bidrar til en total økning i muskelvev hos pasienter som lider av disse sykdommene.
Den foreliggende oppfinnelsen fyller dette behovet ved å tilveiebringe modifiserte og stabiliserte GDF-propeptider som bibeholder deres biologiske aktivitet og hemmer aktiviteten til GDF-proteinene. De modifiserte propeptidene ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å behandle humane eller animalske sykdommer hvori en økning i muskelvev ville være terapeutisk fordelaktig.
Sammendrag av oppfinnelsen
GDF-8 er involvert i reguleringen av mange kritiske biologiske prosesser. Som følge av deres nøkkelfunksjon i disse prosessene, kan GDF-8 være et ønsket mål for terapeutisk intervensjon. Selv om naturlig forekommende GDF-8-propeptid kan være et attraktivt middel for GDF-modulering fra et virkeevne- og toksisitetsperspektiv, har de foreliggende oppfinnerne oppdaget at den sirkulatoriske halveringstiden til det naturlige propeptidet kan være for kort for at molekylet skal kunne ha praktisk terapeutisk eller profylaktisk anvendelse.
Følgelig er den foreliggende oppfinnelsen basert, i det minste delvis, på oppdagelsen av at propeptidet til vekstdifferensieringsfaktor-8 (GDF-8) hemmer aktiviteten til GDF-8-proteinet, og at andre transformerende vekstfaktor-beta (TGF-P)-proteiner som er beslektet i struktur med GDF-8 og slik som benmorfogenetisk protein-11 (BMP-11; også kjent som GDF-11) og også inhiberes av GDF-8-propeptid. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer følgelig preparater og fremgangsmåter for å inhibere GDF-proteiner så vel som fremgangsmåter for å identifisere, danne og anvende slike inhibitorer.
Som angitt ovenfor, er den foreliggende oppfinnelsen også delvis basert på oppdagelsen av at det naturlige GDF-8-propeptidet har en relativt kort in vivo halveringstid som kan forhindre praktisk terapeutisk eller profylaktisk anvendelse. Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer følgelig modifiserte GDF-8-propeptider med forbedrede farmakokinetiske egenskaper, slik som økt sirkulatorisk halveringstid eller økt beskyttelse mot proteolytisk degradering.
Nærmere bestemt tilveiebringes et modifisert GDF-8-propeptid omfattende en aminosyresekvens som er i det minste 95 % identisk med SEKV ID NR. 5 og som har en mutasjon i resten tilsvarende posisjon 76 ifølge SEKV.ID. NR. 5, der det modifiserte GDF-8-propeptidet har økt in vivo- eller in vitro-halveringstid sammenliknet med et ikke-modifisert GDF-8-propeptid som har den samme sekvensen bortsett fra at resten tilsvarende posisjon 76 i SEKV ID NR. 5 ikke er mutert.
Videre tilveiebringes videre et nukleinsyremolekyl som koder for modifisert GDF-8-propeptid i følge oppfinnelsen, samt et farmasøytisk preparat omfattende det modifiserte propeptidet i følge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel eksipient, og et farmasøytisk preparat omfattende nukleinsyren i følge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer eller vektor.
I følge enda et aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes videre en fremgangsmåte for å fremstille et modifisert GDF-8-propeptid ifølge oppfinnelsen, omfattende trinnene o
a:
(a) fremstille et cDNA-molekyl som koder for det modifiserte GDF-8-propeptidet ifølge krav 1, hvori det proteolytiske kløyvingssetet er modifisert; (b) fremstille et cDNA-molekyl som koder for Fc-regionen i et IgG-molekyl; og (c) smelte sammen cDNA-molekylene fra trinn (a) og (b) for å fremstille et
modifisert GDF-8-propeptid.
De etter hvert beskrevne GDF-8-propeptidene kan stabiliseres ved hjelp av et hvilket som helst middel kjent i teknikkens stand. I en utførelsesform er for eksempel det modifiserte propeptidet et fusjonsprotein som omfatter et GDF-8-propeptid og Fc-regionen til et IgG-molekyl. GDF-8-propeptidfusjonsproteinet kan omfatte, som den aktive underenheten, propeptidet til et GDF-8-protein eller en aktiv del av GDF-8-propeptidet, sammensmeltet til en Fc-region til et IgG-molekyl. I andre utførelsesformer, eller i tillegg, kan GDF-8-propeptidet være glykosylert eller bundet til albumin eller en ikke-proteinaktig polymer.
De modifiserte GDF-8-propeptidene ifølge oppfinnelsen er i stand til å inhibere aktiviteten, ekspresjonen, prosesseringen eller sekresjonen av et GDF-8-protein, modent GDF-8 eller en GDF-8-homodimer eller andre aktive GDF-8-molekyler. De modifiserte GDF-8-propeptidene ifølge oppfinnelsen kan administreres til en pasient i en terapeutisk effektiv dose for å behandle eller forebygge medisinske tilstander hvor en økning i muskelvev ville være terapeutisk fordelaktig. Sykdommer eller tilstander som kan behandles ved hjelp av de modifiserte GDF-8-propeptidene inkluderer, men er ikke begrenset til, muskel- eller nevromuskulære sykdommer (slik som amyotrofisk lateral sklerose, muskulær dystrofi, muskelatropi, kongestiv obstruktiv lungesykdom, muskelsvinnsyndrom, sarkopeni eller cachexia), metabolske sykdommer eller tilstander (slik som type 2 diabetes, ikke-insulinavhengig diabetes mellitus, hyperglykemi eller overvekt), fettvevssykdommer (slik som overvekt) og degenerative bensykdommer (slik som osteoporose).
Følgelig tilveiebringes også et modifisert propeptid i følge oppfinnelsen for anvendelse som et medikament.
Ytterligere utførelsesformer av de ulike aspekter ved den foreliggende oppfinnelse fremgår av følgende beskrivelse og patentkrav.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser de relative biologiske aktivitetene til GDF-8, BMP-11 og aktivin i en rapportørgenanalyse. Figur 2 viser bindingsegenskapene til renset biotinylert humant GDF-8 i en ActRIIB-bindingsanalyse. Figur 3 viser induksjon av pGL3(CAGA)i2 rapportøraktivitet ved ED5o for GDF-8, BMP-11 og aktivin i nærværet av GDF-8-propeptid. Figur 4 viser doseavhengig inhibering av biotinylert GDF-8-binding til ActRIIB ved hjelp av GDF-8-propeptid.
Figur 5 viser bindingen av GDF-8 til L6-celler.
Figur 6 viser den doseavhengige inhiberingen av GDF-8-spesifikk binding til L6-celler ved hjelp av GDF-8-propeptid. Figur 7A viser aminosyresekvensen til et murint GDF-8-propeptid-Fc-fusjonsprotein. Figur 7B viser et murint GDF-8-proptid-Fc-fusjonsprotein med en kort glysin-serin-glysin-serin (GSGS)-linker som separerer GDF-8-propeptidet fra Fc-regionen. Figur 8A viser virkningene av humant GDF-8-propeptid og to GDF-8-Fc-fusjonsproteiner fra mus på GDF-8-binding i en ActRIIB-konkurrerende ELISA. Figur 8B er en tabell som sammenligner ICso-verdiene til humant GDF-8-propeptid og to GDF-8-propeptid-Fc-fusjonsproteiner fra mus. Figur 9 viser de relative biologiske aktivitetene til humant GDF-8-propeptid og murint GDF-8-propeptid-Fc-fusjonsprotein i en rapportørgenanalyse. Figur 10 viser farmakokinetikken til jodmerket GDF-8-propeptid og et GDF-8-propeptid-Fc-fusjonsprotein etter en enkel intravenøs administrering av henholdsvis 0,2 ug/mus eller 2 u,g/mus. Figur 1 IA viser aminosyresekvensen til et humant GDF-8-propeptid-IgGl-Fc-fusjonsprotein. Figur 1 IB viser aminosyresekvensen til et humant GDF-8-propeptid-IgGl-Fc-fusjonsprotein som er modifisert for å redusere effektorfunksjon. Figur 12 viser den doseavhengige inhiberingen av GDF-8-binding i en ActRIIB konkurrerende ELISA ved hjelp av humant GDF-8-propeptid og to humane GDF-8-propeptid-Fc-fusjonsproteiner. Figur 13 er en graf som viser at modifisert GDF-8-propeptid administrert in vivo øker gastrocnemius og kvadricepsmasse og reduserer fettmasse, men som ikke påvirker nyre- eller levermasse sammenlignet med ubehandlede mus eller mus behandlet med kontrollproteinet IgG2aFc. Figurene 14A-P illustrerer aminosyre- og nukleinsyresekvensene som tilsvarer SEKV.ID. NR. 1-16 og kommentarene dertil.
Definisjoner
Uttrykkene "GDF-8", "GDF-8-protein" eller "GDF-8-polypeptid" henviser til en spesifikk vekst- og differensieringsfaktor inkludert, men ikke begrenset til, det beskrevet i SEKV.ID. NR. 1, og enhver nå kjente eller senere beskrevne homologer derav, inkludert homologer fra andre arter. Spesielt foretrukket er pattedyrhomologer, mest foretrukket humane. GDF-8-molekyler og homologer fra alle andre kilder, inkludert men ikke begrenset til, GDF-8 fra kveg, hund, katt, kylling, mus, rotte, gris, fugl, kalkun, bavian og fisk er også omfattet av ovennevnte uttrykk. Forskjellige GDF-8-molekyler har blitt beskrevet i McPherron et al. (1997) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94: 12457-12461. Homologer er velkjente i teknikkens stand. Homologi kan bestemmes ved hjelp av enhver fremgangsmåte som er kjent i teknikkens stand eller som beskrevet heri. GDF-8 eller GDF-8-protein kan være naturlig forekommende eller syntetisk. Disse uttrykkene inkluderer fullengde ubearbeidet forløperform av proteinet ("GDF-8-forløperprotein"), så vel som de modne formene som er et resultat av posttranslasjonell kløyving av propeptidet. Uttrykkene refererer også til alle fragmenter eller varianter av GDF-8 som opprettholder en eller flere biologiske aktiviteter assosiert med et GDF-8-protein, som diskutert heri, inkludert sekvenser som har blitt modifisert med konservative eller ikke-konservative endringer i aminosyresekvensen.
"Modent GDF-8" henviser til proteinet eller polypeptidet som er kløyvet fra det karboksyterminale domenet til GDF-8-forløperproteinet. En human form av modent GDF-8-protein er tilveiebrakt i SEKV.ID. NR. 3. Det modne GDF-8 kan være naturlig forekommende eller syntetisk. Det modne GDF-8 kan være tilstede som en monomer, homodimer, eller kan være tilstede i et GDF-8-latent kompleks. Avhengig av in vivo- eller in vitro-betingelsene, kan modent GDF-8 etableres i likevekt blant enhver eller alle disse ulike formene. Uten begrensning i forhold til mekanismen, er det antatt at modent GDF-8 er biologisk aktivt som homodimer. I dets biologisk aktive form er det modne GDF-8 også kalt "aktivt GDF-8".
Uttrykket "GDF-8-aktivitet" viser til en eller flere fysiologiske vekstregulatoriske eller morfogenetiske aktiviteter som er assosiert med aktivt GDF-8-protein. Aktivt GDF-8 er for eksempel en negativ regulator av skjelettmuskelmasse. Aktivt GDF-8 kan også modulere fremstillingen av muskelspesifikke enzymer (for eksempel kreatinkinase), stimulerer myoblastproliferering og modulerer preadipocyttdifferensiering til adipocytter. GDF-8 er også antatt å øke følsomheten for insulin og glukoseopptak i perifert vev, spesielt i skjelettmuskulatur eller adipocytter. GDF-8's biologiske aktiviteter inkluderer følgelig, men er ikke begrenset til, inhibering av muskeldannelse, inhibering av muskelcellevekst, inhibering av muskelutvikling, reduksjon i muskelmasse, regulering av muskelspesifikke enzymer, inhibering av myoblastcelleproliferasjon, modulering av preadipocyttdifferensiering til adipocytter, økning av insulinfølsomhet, regulering av glukoseopptak, glukosehemostase og modulering av nervecelleutvikling og opprettholdelse. En human form av fullengde GDF-8-forløperprotein er tilveiebrakt i SEKV.ID. NR. 1.
"GDF-8-propeptid" henviser til et polypeptid som kløyves fra det aminoterminale domenet av GDF-8-forløperproteinet. GDF-8-propeptidet er assosiert med en eller flere biologiske aktiviteter, inkludert men ikke begrenset til, evnen til å binde seg til et modent GDF-8-protein eller homodimer, evnen til å hemme en eller flere GDF-8 biologiske aktiviteter, evnen til å øke muskelutvikling, evnen til å øke muskelmasse, evnen til å fremme muskeldannelse og evnen til å fremme muskelcelleproliferering. GDF-8-propeptidet kan være naturlig forekommende eller syntetisk. Et eksempel på et GDF-8-propeptid inkluderer, men er ikke begrenset til, en human form av GDF-8-propeptidet tilveiebrakt i SEKV.ID. NR. 5. Et GDF-8-propeptidet kan blant annet være i stand til å binde seg til det propeptidbindende domenet til modent GDF-8. GDF-8-propeptidet kan også være i stand til å hemme en eller flere aktiviteter av et modent GDF-8.
Uttrykket "GDF-8-inhibitor" inkluderer ethvert middel som er i stand til å inhibere aktiviteten, ekspresjonen, prosesseringen eller sekresjonen av et GDF-8-protein, modent GDF-8 eller en GDF-8-homodimer eller annet aktivt GDF-8-molekyl inkludert, men ikke begrenset til, modifisert GDF-8-propeptider og modifiserte BMP-11-propeptider. En GDF-8-inhibitor inkluderer også ethvert middel som er i stand til å øke bindingen av et GDF-8-propeptid til et modent GDF-8-molekyl, eller til en GDF-8-homodimer. Slike inhibitorer inkluderer, men er ikke begrenset til, proteiner, antistoffer, peptider, peptidomener ("peptidomimetics"), ribozymer, antisens oligonukleotider, dobbelttrådet RNA eller andre små molekyler. I en utførelsesform hemmes aktiviteten til et GDF-8-protein av et modifisert GDF-8-propeptid som beskrevet i eksemplene 3-6.1 en annen utførelsesform inhiberes aktiviteten til et GDF-8-protein av et modifisert BMP-11-propeptid.
"GDF-8 latent kompleks" henviser til et kompleks av proteiner dannet mellom en moden GDF-8-homodimer og et GDF-8-propeptid. Uten begrensning i forhold til mekanismen, er det antatt at to GDF-8-propeptider assosierer med to modne GDF-8-molekyler i homodimeren for å danne en inaktiv tetramer eller et latent kompleks. Det latente komplekset kan inkludere andre GDF-inhibitorer i stedet for eller i tillegg til ett eller flere av GDF-8-propeptidene.
Uttrykket "modifisert GDF-8-propeptid" henviser til en GDF-8-inhibitor som omfatter et modifisert GDF-8-propeptid, fragment eller variant derav som bibeholder en eller flere biologiske aktiviteter til et GDF-8-propeptid og ytterligere omfatter en stabiliserende modifisering som beskrevet heri. Variantformer av GDF-8-propeptid inkluderer, men er ikke begrenset til, for eksempel GDF-8-propeptider som har blitt modifisert for å inkludere mutasjoner (inkludert innsettinger, delesjoner og substitusjoner av aminosyrer) i signalpeptidet eller proteolytiske propeptidkløyvingssetet for å gjøre setet mindre mottakelig for proteolytisk kløyving. I en foretrukket utførelsesform har det modifiserte GDF-8-propeptidet en vesentlig økt halveringstid i forhold til det korresponderende umodifiserte GDF-8-propeptidet. I en svært foretrukket utførelsesform, har det modifiserte GDF-8-propeptidet ifølge oppfinnelsen en økt in vivo halveringstid (som målt for eksempel gjennom en fremgangsmåte som beskrevet i eksempel 8). I en annen utførelsesform er det modifiserte GDF-8-propeptidet i stand til å inhibere en eller flere aktiviteter til et modent GDF-8.
Uttrykkene "BMP-11", "BMP-11-protein" eller "BMP-ll-polypeptid" henviser til en spesifikk vekst- og differensieringsfaktor inkludert, men ikke begrenset til, den som er beskrevet i SEKV.ID. NR. 7, og alle nå kjente eller senere beskrevne homologer derav, inkludert homologer fra andre arter. Spesielt foretrukket er pattedyrhomologer, mest foretrukket humane. Uttrykket er også ment å omfatte BMP-11-molekyler og homologer fra alle andre kilder, inkludert men ikke begrenset til, BMP-11 fra kveg, hund, katt, kylling, rotte, gris, fugl, kalkun, bavian og fisk. Ulike BMP-11-molekyler har blitt beskrevet i McPherron et al. (1997) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94: 12457-12461. Homologer er velkjente i teknikkens stand. Homologi kan bestemmes ved hjelp av enhver fremgangsmåte kjent i teknikkens stand eller som beskrevet heri. BMP-11 eller BMP-11-protein kan være naturlig forekommende eller syntetisk. Disse uttrykkene inkluderer fullengde ubearbeidet forløperform av proteinet ("BMP-11-forløperprotein"), så vel som de modne formene som er et resultat av posttranslasjonell kløyving av propeptidet. Uttrykkene viser også til alle fragmenter eller varianter av BMP-11 som opprettholder en eller flere biologiske aktiviteter assosiert med et BMP-11-protein som diskutert heri, inkludert sekvenser som er blitt modifisert med konservative eller ikke-konservative endringer i aminosyresekvensen.
"Modent BMP-11" henviser til proteinet eller polypeptidet som er kløyvet fra det karboksyterminale domenet til BMP-11-forløperproteinet. En human form av modent BMP-11-protein er tilveiebrakt i SEKV.ID. NR. 9. Det modne BMP-11 kan være naturlig forekommende eller syntetisk. Det modne BMP-11 kan være tilstede som en monomer, homodimer eller kan være tilstede i et BMP-11-latent kompleks. Avhengig av in vivo- eller in vitro-betingelsene, kan modent BMP-11 etablere en likevekt blant enhver eller alle disse ulike formene. Uten begrensning i forhold til mekanismen, er det antatt at modent BMP-11 er biologisk aktivt som homodimer. I dets biologisk aktive form kalles det modne BMP-11 også "aktivt BMP-11".
"BMP-11-propeptid" henviser til et polypeptid som er kløyvet fra det aminoterminale domenet til BMP-11-forløperproteinet. BMP-11-propeptidet er assosiert med en eller flere biologiske aktiviteter, inkludert men ikke begrenset til, evnen til å binde seg til et modent GDF-8-protein eller homodimer, evnen til å
inhibere en eller flere GDF-8 biologiske aktiviteter, evnen til å øke muskelutvikling, evnen til å øke muskelmasse, evnen til å fremme muskeldannelse og evnen til å fremme muske lcelleproliferering. BMP-11-propeptidet kan være naturlig forekommende eller syntetisk. Et eksempel på at et BMP-11-propeptid inkluderer, men ikke er begrenset til, en human form av BMP-11- er tilveiebrakt i SEKV.ID. NR. 11.
Uttrykket "modifisert BMP-11-propeptid" henviser til en GDF-8-inhibitor som omfatter et modifisert BMP-11-propeptid eller et fragment eller variant derav som bibeholder en eller flere biologiske aktiviteter til et BMP-11-propeptid og ytterligere omfatter en stabiliserende modifikasjon som beskrevet heri. Variantformer av BMP-11-propeptid inkluderer, men er ikke begrenset til, BMP-11-propeptider som har blitt modifisert til å inkludere mutasjoner (inkludert innsettinger, delesjoner og substitusjoner av aminosyrer) i signalpeptidet eller det proteolytiske propeptidkløyvesetet for å danne seter som er mer eller mindre mottakelige for proteolytisk kløyving. GDF-8-propeptidene ifølge oppfinnelsen kalles samlet "GDF-propeptider".
GDF-8-proteinene ifølge oppfinnelsen kalles samlet "GDF-polypeptider" eller "GDF-proteiner".
Fremgangsmåtene og sammensetningene ifølge oppfinnelsen tilveiebringer GDF-inhibitorer som reduserer GDF-proteinets aktivitet i forhold til aktiviteten til et
GDF-protein sammenlignet med det samme GDF-proteinet som ikke er bundet til en inhibitor. I visse utførelsesformer reduseres aktiviteten til et GDF-protein, når det er bundet til en eller flere av de modifiserte GDF-propeptidet med i det minste omtrent 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% eller 55%, fortrinnsvis i det minste omtrent 60%, 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 82%, 84%, 86% eller 88%, mer foretrukket i det minste omtrent 90%, 91%, 92%, 93% eller 94%, og enda mer foretrukket i det minste omtrent 95% til 100%, i forhold til det samme GDF-proteinet som ikke er bundet gjennom nevnte modifiserte propeptider. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er GDF-inhibitoren et modifisert GDF-8-propeptid som er kovalent bundet til en Fc-region til et IgG-molekyl.
Uttrykket "stabiliserende modifisering" er enhver modifisering kjent i teknikkens stand eller beskrevet heri som er i stand til å stabilisere et protein, øke in vitro halveringstiden til et protein, øke den sirkulatoriske halveringstiden til et protein og/eller å redusere den proteolytiske degraderingen av et protein. Slike stabiliserende modifiseringer inkluderer, men er ikke begrenset til, fusjonsproteiner (inkludert for eksempel fusjonsproteiner som omfatter et GDF-propeptid og et andre protein), modifikasjoner av et glykosyleringssete (inkludert for eksempel tilføring av et glykosyleringssete til et GDF-propeptid) og modifisering av karbohydratenhet
(inkludert for eksempel fjerning av karbohydratenheter fra et GDF-propeptid). I tilfellet av en stabiliserende modifisering som omfatter et fusjonsprotein (for eksempel slik at et andre protein er sammensmeltet til et GDF-propeptid), kan det andre proteinet henvises til som en "stabiliserende porsjon" eller "stabiliserende protein". I en utførelsesform omfatter for eksempel et modifisert GDF-8-propeptid ifølge oppfinnelsen en fusjon mellom et humant GDF-8-propeptid (med et inaktivert kløyvingssete) og et IgG-molekyl (hvor IgG virker som det stabiliserende proteinet eller den stabiliserende delen). Som anvendt heri, i tillegg til å henvise til et andre protein av et fusjonsprotein, inkluderer en "stabiliserende del" også ikke-proteinaktige modifiseringer slik som en karbohydratenhet eller ikke-proteinaktig polymer.
Uttrykket "isolert" eller "renset" henviser til et molekyl som i alt vesentlig er fritt for sitt naturlige miljø. Et isolert protein er for eksempel i alt vesentlig fritt for cellulært materiale eller andre kontaminerende proteiner fra cellen eller vevskilden hvorfra det er utledet. Uttrykket "i alt vesentlig fritt for cellulært materiale" henviser til fremstillinger hvor det isolerte proteinet er i det minste 70% til 80%
(vekt/vekt) rent, mer foretrukket i det minste 80-89% (vekt/vekt) rent, enda mer foretrukket 90-95% rent og mest foretrukket i det minste 96%, 97%, 98%, 99% eller 100% (vekt/vekt) rent.
Uttrykket "kløyvingssete" henviser til et proteolytisk sete i et protein eller polypeptid som et proteolytisk enzym virker på og resulterer i kløyvingen av peptidbindingen. I en utførelsesform er et kløyvingssete ifølge oppfinnelsen "RSRR" som representert gjennom enbokstav- aminosyrekoden.
Uttrykket "Fc-region av et IgG-molekyl" henviser til et Fc-domene av et immunoglobulin av isotypen IgG som er velkjent for fagfolk på området. Fc-regionen av et IgG-molekyl er den delen av IgG-molekylet (IgGl, IgG2, IgG3 og IgG4) som er ansvarlig for økning av in vivo serumhalveringstiden til IgG-molekylet. Fortrinnsvis er IgG-molekylet IgGl.
"In vitro halveringstid" henviser til stabiliteten til et protein målt utenfor sammenhengen til en levende organisme. Analyser for å måle in vitro halveringstid er velkjent innen teknikkens stand og inkluderer, men er ikke begrenset til SDS-PAGE, ELISA, cellebaserte analyser, pulsfelt, western blotting, northern blotting osv. Det finnes andre anvendelige analyser som er velkjente i teknikkens stand.
"In vivo halveringstid" henviser til stabiliteten til et protein i en organisme. In vivo halveringstid kan måles ved hjelp av en rekke fremgangsmåter som er kjent for fagfolk på området, inkludert men ikke begrenset til, in vivo serumhalveringstid, sirkulatorisk halveringstid og analyser beskrevet i eksemplene heri.
"In vivo serumhalveringstid" henviser til halveringstiden til et protein som sirkulerer i blodet til en organisme. I en utførelsesform måles in vivo halveringstiden som beskrevet i eksempel 8. Andre fremgangsmåter som er kjent i teknikkens stand kan anvendes for å måle in vivo halveringstid.
Uttrykket "pattedyr" inkluderer definisjoner kjent for fagfolk på området og henviser også til ethvert dyr klassifisert som et pattedyr, inkludert mennesker, tamme dyr og gårdsdyr, og zoo-, sports- eller kjæledyr så som hunder, katter, sauer, griser, kyr osv. I en foretrukket utførelsesform er pattedyret et menneske.
Uttrykket "TGF-P superfamilie" henviser til en familie av strukturelt beslektede vekstfaktorer hvor alle utøver fysiologisk viktige vekstregulerende og morfogenetiske egenskaper. Denne familien av beslektede vekstfaktorer er velkjent for fagfolk på området (Kingsley et al. (1994) Genes Dev. 8: 133-35; og Hoodless et al. (1998) Curr. Topics Mircobiol. Immunol. 228: 235-72). TGF-P superfamilien inkluderer morfogenetiske benproteiner (BMP), aktiviner, inhibiner, Mulleria inhiberende substans, glialutledet nevrotrofisk faktor og et ytterligere voksende antall vekst- og differensieringsfaktorer (GDF), slik som GDF-8 (myostatin). Mange av disse proteinene er beslektet i struktur til GDF-8, slik som BMP-11 (også kalt GDF-11) og/eller aktivitet, slik som aktivin.
Uttrykket "behandling" henviser til både terapeutisk behandling og profylaktiske eller forebyggende formål. De med behov for behandling kan inkludere individer som allerede har en spesifikk medisinsk sykdom så vel som de som omsider erverver sykdommen (det vil si de med behov for forebyggende formål).
Uttrykket "transformering" og "transfeksjon" henviser til mange kjente teknikker for å introdusere fremmed nukleinsyre (for eksempel DNA og RNA) i en vertscelle, inkludert men ikke begrenset til, kalsiumfosfat eller kalsiumklorid sampresipitering, DEAE-dekstrankontrollert transfeksjon, lipofeksjon og elektroporering.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Den foreliggende oppfinnelsen er basert, delvis, på oppdagelsen av at GDF-propeptider har en kort in vivo halveringstid som derved reduserer deres effektivitet som farmakologiske inhibitorer av GDF-8- eller BMP-11-aktivitet. I ett aspekt har det modifiserte GDF-8-propeptidet ifølge oppfinnelsen forbedrede farmakokinetiske egenskaper, spesielt en økt sirkulatorisk halveringstid.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer nye modifiserte GDF-propeptider som danner inaktive komplekser med GDF-proteiner (for eksempel GDF-8- og BMP-11-proteiner) in vitro og in vivo. De modifiserte GDF-propeptidene ifølge oppfinnelsen binder seg fortrinnsvis til et propeptidbindende domene på det modne GDF-proteinet. I visse utførelsesformer av oppfinnelsen omfatter følgelig det modifiserte GDF-propeptidet et fusjonsprotein mellom et GDF-propeptid og et stabiliserende protein. Et stabiliserende protein kan være ethvert protein som øker den totale stabiliteten til det modifiserte GDF-propeptidet.
Som fagfolk på området vil forstå, kan slike fusjonsproteiner eventuelt omfatte et linkerpeptid mellom propeptiddelen og den stabiliserende delen. Som velkjent i teknikkens stand, fremstilles fusjonsproteiner slik at det andre proteinet sammensmeltes i rammen med det første proteinet slik at det resulterende translaterte proteinet omfatter både det første og det andre proteinet. I den foreliggende oppfinnelsen kan for eksempel et fusjonsprotein fremstilles slik at GDF-propeptiddelen er sammensmeltet til et andre protein (for eksempel en stabiliserende proteindel). Et slikt fusjonsprotein fremstilles slik at det resulterende translaterte proteinet inneholder både propeptiddelen og den stabiliserende delen.
I andre utførelsesformer omfatter GDF-propeptidet et GDF-propeptid som er modifisert for å ha større in vivo sirkulatorisk halveringstid sammenlignet med umodifisert GDF-propeptid. Selv om den nøyaktige mekanismen og timingen for modifisert GDF-propeptidbinding er ukjent, er det antatt at de modifiserte GDF-8-propeptidene ifølge oppfinnelsen binder seg til det modne GDF-8 og modne BMP-11.1 en foretrukket utførelsesform tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen modifiserte GDF-propeptider som danner inaktive komplekser med GDF-8- eller BMP-11-proteiner in vivo eller in vitro. I en utførelsesform, binder fortrinnsvis GDF-propeptidene seg til et propeptidbindingsdomene på det modne GDF-8- eller modne BMP-11-proteinet. Slik binding kan for eksempel skje etter frigjøring av nativt propeptid ved GDF-8- og BMP-11 aktivitetssetet, etter frigjøring av det native propeptidet ved setet til GDF-8- og BMP-11-aktivitet, etter forskyvning av det native propeptidet gjennom det modifiserte GDF-8- propeptidet, og/eller etter kløyving av propeptidet fra GDF-8- og BMP-11-forløperproteinet. Uavhengig av mekanismen, resulterer bindingen av modifisert GDF-8-propeptid i en reduksjon av en eller flere av de biologiske aktivitetene assosiert med GDF-8, i forhold til et modent GDF-8-protein som ikke er bundet til det samme modifiserte propeptidet. I en foretrukket utførelsesform, reduserer de modifiserte GDF-8-propeptidene GDF-8- og BMP-11-aktivitet som er assosiert med den negative reguleringen av skjelettmuskelmasse.
I en annen foretrukket utførelsesform, tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen modifiserte GDF-propeptider som danner inaktive komplekser med BMP-11-proteiner in vivo eller in vitro. I en utførelsesform binder fortrinnsvis GDF-propeptidene seg til et propeptid bindingsdomene på det modne BMP-11-proteinet. I ytterligere en annen utførelsesform, er det modifiserte GDF-propeptidet et fusjonsprotein som omfatter et GDF-propeptid og en Fc-region fra et IgG-molekyl (som et stabiliserende protein). Slike GDF-inhibitorer kan omfatte et GDF-propeptid (for eksempel som beskrevet i SEKV.ID. NR. 5) eller et fragment eller en variant av nevnte propeptid som bibeholder en eller flere av de biologiske aktivitetene til et GDF-propeptid. Slike modifiserte GDF-propeptider er i stand til å inhibere aktiviteten til GDF-proteiner. GDF-8- propeptidene som er anvendt i oppfinnelsen, kan produseres syntetisk, utledes fra naturlig forekommende (native) GDF-8- propeptider eller kan fremstilles rekombinant ved anvendelse av enhver av de mange reagensene, vertscellene og fremgangsmåtene som er velkjente for fagfolk på genteknologiområdet. I en utførelsesform omfatter det modifiserte GDF-8-propeptidet et humant GDF-8- propeptid som er kovalent bundet til et IgG-molekyl eller et fragment derav. GDF-8- propeptidet kan være sammensmeltet tilstøtende til Fc-regionen til IgG-molekylet eller bundet til Fc-regionen til IgG-molekylet via et linkerpeptid. Anvendelse av slike linkerpeptider er velkjent for fagfolk på proteinbiokjemiområdet.
I visse utførelsesformer hvor de modifiserte GDF-propeptidene ifølge oppfinnelsen kan omfatter fusjonsproteiner, er GDF-propeptiddelen i nevnte fusjonsprotein fortrinnsvis i det minste omtrent 95% identisk til SEKV.ID. NR. 5,., og enda mer foretrukket i det minste omtrent 95%, 96%, 97%, 98%, 99% eller 100% identisk til SEKV.ID. NR. 5.1 en foretrukket utførelsesform, omfatter GDF-8- propeptidene en sekvens som er identisk med sekvensene beskrevet i SEKV.ID. NR. 5.1 enda en annen foretrukket utførelsesform, omfatter GDF-propeptiddelen til et fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen et fragment av variant av GDF-propeptidet beskrevet i SEKV.ID. NR. 5, så lengde som fragmentet eller varianten bibeholder en eller flere av de biologiske aktivitetene til et GDF-propeptid. I en annen foretrukket utførelsesform, omfatter de modifiserte GDF-8- en mutantversjon av SEKV.ID. NR. 5, hvori mutanten har blitt modifisert for å inkludere en eller flere mutasjoner (inkludert innsetting, delesjon eller substitusjon) så lengde som fragmentet eller varianten bibeholder en eller flere av de biologiske aktivitetene til et GDF-propeptid.
I utførelsesformer ifølge oppfinnelsen som involverer modifiserte GDF-propeptider som omfatter fusjonsproteiner, er det kritisk essensielt at fusjonsproteinet fremstilles eller konstrueres slik at det native proteolytiske kløyvingssetet (for eksempel RSRR) i GDF-propeptidet avbrytes, ødelegges, inaktiveres eller fjernes i det resulterende fusjonsproteinet. Som fagfolk på området vil vite, vil en svikt i å gjøre dette resultere i at det andre proteinet (for eksempel den stabiliserende delen) av fusjonsproteinet kløyves fra det første proteinet (propeptiddelen) av fusjonsproteinet. Et kritisk aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringer følgelig inaktivering eller eliminering av det native kløyvingssetet til GDF-propeptidene når slik propeptid anvendes for å fremstille et fusjonsprotein som er et modifisert GDF-propeptid ifølge oppfinnelsen. Fremgangsmåter for å inaktivere slik proteolytisk kløyvingssete er kjent for fagfolk på området og inkluderer, men er ikke begrenset til, mutasjon, delesjon eller innsetting av aminosyren eller nukleotidsekvensen til det proteolytiske kløyvingssetet.
I enda andre utførelsesformer av oppfinnelsen kan mutasjoner dannes i GDF-sekvensen for å lage seter som er mindre mottakelige for proteolytisk kløyving. I en utførelsesform kan for eksempel slik mutant inneholde en punktmutasjon ved aminosyrene 45, 46, 49, 50, 52, 53, 63, 64, 65, 66, 98, 99 i SEKV.ID. NR. 1.1 en foretrukket utførelsesform er punktmutasjonen en punktmutasjon ved aminosyre 99 i SEKV.ID. NR. 1.1 en spesielt foretrukket utførelsesform, er punktmutasjonen en punktmutasjon i aminosyre 99 i SEKV.ID. NR. 1 fra Asp til Ala. I en annen foretrukket utførelsesform kan en slik punktmutasjon dannes i aminosyrene i SEKV.ID. NR. 11. Dataanalyse (ved anvendelse av en kommersielt tilgjengelig programvare, for eksempel MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.), kan også anvendes for å identifisere proteolytiske kløyvingsseter. Som det vil forstås av fagfolk på området, kan enhver annen av de beskrevne mutasjonene, variantene eller modifikasjonene dannes på nukleinsyrenivå. Slike teknikker er velkjente i teknikkens stand.
Tabell 1
Eksempler på aminosyrer som kan muteres for å forebygge kløyving av propeptid:
GDF- 8 (aminosyrenummer henviser til SEKV.ID. NR. 1)
Arg-45
Gln-46
Lys-49
Ser-50
Arg-52
Ile-53
Lys-63
Leu-64
Arg-65
Leu-66
Arg-98
Asp-99
BMP- 11 (aminosyrenummer henviser til SEKV.ID. NR. 7)
Asp-122
Ala-123
Glu-286
Leu-287
Som angitt ovenfor, har de foreliggende oppfinnerne oppdaget at GDF-propeptidet har en kortere in vivo halveringstid. For å være farmasøytisk anvendelig som et terapeutisk eller profylaktisk middel, må følgelig GDF-propeptidet bli kjemisk eller fysisk stabilisert for å øke levetiden under fysiologiske betingelser.
GDF-propeptidene kan stabiliseres eller modifiseres ved hjelp av enhver fremgangsmåte kjent for fagfolk på området så lengde det modifiserte GDF-propeptidet opprettholder en evne til å inhibere et GDF-protein eller modent GDF-protein. I en foretrukket utførelsesform, opprettholder det modifiserte GDF-propeptidet sin evne til å binde sitt GDF målprotein eller et GDF-propeptid bindingssete. I en foretrukket utførelsesform omfatter det modifiserte GDF-propeptidet et GDF-8-propeptid sammensmeltet tilstøtende til eller via en linker til en Fc-region til et IgG-molekyl. Fc-regionen til IgG-molekylet tilveiebringer en beskyttende eller stabiliserende effekt på propeptidet (og derved virker som en stabiliserende modifikasjon), som reflekteres i de forbedrede farmakokinetiske egenskapene (det vil si økt halveringstid i serum) av fusjonsproteinet sammenlignet med det korresponderende umodifiserte GDF-8-propeptidet.
I en spesifikk utførelsesform, omfatter det modifiserte GDF-8-propeptidet et humant GDF-8-propeptid eller en mutant av humant GDF-8-propeptid og IgG-molekylet er Fc-regionen til et IgGl eller et IgG4, eller en Fc-region til IgGl modifisert for å redusere effektorfunksjon. I en utførelsesform er IgG-fragmentet IgGl (SEKV.ID. NR. 15). I en annen utførelsesform er IgG-fragmentet IgGl modifisert for å redusere effektorfunksjon (SEKV.ID. NR. 16). Eksempler på molekyler som er modifisert for å redusere effektorfunksjon inkluderer modifisering av humant IgGl-Fc-fusjon som inkluderer alanin (A) ved aminosyreposisjonene 14 og 17 som beskrevet i SEKV.ID. NR. 16.
Modifiserte GDF-8- propeptider kan isoleres eller renses i henhold til standard proteinisolerings- og rensefremgangsmåter som er velkjente for fagfolk på området.
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for å danne modifiserte GDF-propeptider med økt in vivo eller in vitro halveringstid. I en foretrukket utførelsesform, omfatter fremgangsmåten fremstilling av et modifisert GDF-propeptid som omfatter et GDF-8/IgGl Fc -fusjonsprotein ved fremstilling av et cDNA-molekyl som koder for: (1) et GDF-propeptid (for eksempel humant GDF-8-propeptid, SEKV.ID. NR. 5) som er modifisert for å inaktivere det proteolytiske kløyvingssetet og Fc-regionen til et IgG-molekyl (for eksempel human IgGl-region, SEKV.ID. NR. 15); (2) uttrykke cDNA i et passende prokaryotisk eller eukaryotisk ekspresjonssystem ved anvendelse av passende ekspresjonsplasmider og celler; og (3) isolere og rense det uttrykte fusjonsproteinet som inneholder det modifiserte GDF-propeptidet, hvori det modifiserte GDF-propeptidet har en økt in vivo eller in vitro halveringstid sammenlignet med et umodifisert GDF-propeptid.
Et eksempel slikt foretrukket modifisert GDF-propeptid ifølge oppfinnelsen, er vist i figur 1 IA.
cDNA ekspresjonssystemer er velkjente i molekylærbiologien så vel som fremgangsmåter for å isolere og rense de uttrykte proteinene (eksemplene 2 og 7 heri tilveiebringer eksempler på slike utførelsesformer).
I en alternativ utførelsesform, kan cDNA-konstruktene som er anvendt for ekspresjon av slike fusjonsproteiner inneholde nukleotider som koder for et linkerpeptid mellom nukleotidene som koder for GDF-propeptidet og IgG Fc-regionen (eller stabiliserende del). Orienteringen av linkerpeptidet i forhold til GDF eller IgG Fc-regionen er uviktig. Linkerpeptidet kan omfatte nukleotider som koder for 2, 4, 6, 8, 10, 13, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 eller flere aminosyrer i lengde. I en spesifikk utførelsesform, omfatter linkerpeptidet nukleotider som koder for aminosyresekvensen som består av glysin-serin-glysin-serin (GSGS).
I en annen utførelsesform kan ekspresjonsplasmidene eventuelt inneholde merker som tillater passende isolering og rensing av de uttrykte proteinene. Anvendelsen av slike merkede ekspresjonsplasmider og fremgangsmåter for å isolere og rense de merkede proteinproduktene er velkjente på området.
GDF-propeptidene ifølge oppfinnelsen inkluderer spesielt fusjonsproteiner hvori GDF-propeptiddelen til molekylet er identisk eller større enn 60% homolog til GDF-korresponderende sekvenser fra en spesifikk art, mens stabilisatordelen slik som Fc-regionen til IgG-molekylet kan være identisk eller mer enn 60% homolog med IgG-korresponderende sekvenser fra en forskjellig art. Det humane GDF-8-propeptidet eller fragment derav kan for eksempel være sammensmeltet til en Fc-region til et muse IgG-molekyl eller omvendt så lenge som det resulterende fusjonsproteinet utøver den ønskede biologiske aktiviteten, nemlig inhiberingen av GDF-biologisk aktivitet som vist i eksemplene 3-6.1 foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen, er fusjonsproteinene ifølge oppfinnelsen kimeriske humane proteiner. Som fagfolk vil forstå, vil humane proteinkimærer eller fusjonsproteiner være foretrukne i behandlingen av humane individer.
Som et alternativ eller i tillegg til de ovenfor beskrevne Fc-fusjonsproteinene, kan GDF-propeptidene stabiliseres gjennom mange andre fremgangsmåter og kildematerialer som er velkjente og lett tilgjengelige på proteinområdet. Slike fremgangsmåter og materialer inkluderer for eksempel glykosylering eller binding til albumin eller en ikke-proteinaktig polymer som beskrevet i detalj nedenfor. De modifiserte GDF-propeptidene kan isoleres og renses ved anvendelse av standard proteinisolerings- og renseteknikker som er velkjente for fagfolk på området.
GDF-propeptider eller modifiserte GDF-propeptider kan fremstilles ved hjelp av en rekke velkjente teknikker. For eksempel kan slike propeptider syntetiseres (for eksempel kjemisk eller rekombinant), isoleres og renses og testes for deres evne til å danne komplekser med modent GDF-8- eller modent BMP-11-protein ved anvendelse av fremgangsmåtene beskrevet heri eller fremgangsmåter som er velkjente på området. Propeptidene kan syntetiseres ved anvendelse av standard proteinkjemiteknikker slik som de som er beskrevet i Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) og Grant G.A. (ed.), Synthetic Peptides: A User' s Guide, W.H. Freeman and Company, New York, (1992), hvor innholdet er inkorporert heri ved referanse. I tillegg er automatiserte peptidsynteseanordninger kommersielt tilgjengelige (for eksempel Advanced ChemTech Modell 396; Milligen/Biosearch 9600).
De modifiserte eller umodifiserte GDF-propeptidene eller fragmentene derav kan alternativt fremstilles rekombinant ved anvendelse av ulike ekspresjonssystemer
(for eksempel E. coli, kinesiske hamstereggstokkceller, COS-celler og baculovirus)
som er velkjente på området. Det uttrykte GDF-8- propeptidet kan renses ved hjelp av for eksempel anvendelse av fremgangsmåten som er beskrevet i Bottinger et al.
(1996) PNAS 93: 5877-5882 og Gentry og Nash (1990), Biochemistry 29: 6851-6857, hvor innholdet er inkorporert heri ved referanse eller enhver annen anerkjent fremgangsmåte for rensing av peptider. Alternativt kan det modifiserte eller umodifiserte GDF-propeptidet eller fragmentet derav være merket med for eksempel FLAG eller 6-His for påfølgende rensing ved anvendelse av proteinteknikk etablerte teknikker.
De modifiserte eller umodifiserte GDF-8- propeptidene kan ytterligere produseres ved fordøyelse av naturlig forekommende eller rekombinant produsert GDF-8 eller BMP-11 ved anvendelse av for eksempel en protease, for eksempel trypsin, termolysin, kymotrypsin, pepsin eller parede basiske aminosyreomdannende enzym (PACE). Dataanalyse (ved anvendelse av kommersiell tilgjengelig programvare, for eksempel MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) kan anvendes for å identifisere proteolytiske kløyvingsseter. Alternativt kan slike GDF-propeptider fremstilles fra naturlig forekommende eller rekombinant fremstilte GDF-8 eller BMP-11 slik som standardteknikker kjent for fagfolk, slik som kjemisk kløyving (for eksempel cyanogenbromid, hydroksylamin).
De proteolytiske eller syntetiske GDF-8- og BMP-11-propeptiddelene av det modifiserte GDF-propeptidet kan omfatte så mange aminosyrerester som er nødvendig for å binde mål-GDF-proteinet, og derved inhibere, delvis eller fullstendig, GDF-8- eller BMP-11-aktivitet. Eksemplene 4-6 heri illustrerer utførelsesformer av bindings- og inhiberingsanalyser. Spesielt er funksjonelle fragmenter av GDF-8- propeptidsekvenser som opprettholder evnen til å modulere eller inhibere GDF-8, inkludert innenfor rammen av oppfinnelsen. GDF-8-propeptiddelene omfatter fortrinnsvis i det minste 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 eller 90 aminosyrer; mer foretrukket i det minste 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 eller 190 aminosyrer; og mest foretrukket i det minste 200, 210, 220, 230 eller 240 eller flere aminosyrer i lengde. I en foretrukket utførelsesform, er GDF-8-propeptiddelen av det modifiserte GDF-8-propeptidet 243 aminosyrer langt, det vil si at det tilsvarer SEKV.ID. NR. 5; og BMP-11-propeptiddelen til BMP-11-propeptidet er 274 aminosyrer langt, det vil si at det tilsvarer SEKV.ID. NR. 11. Signalsekvensen til humant GDF-8 er vist i SEKV.ID. NR. 13 og inkluderer de første 23 aminosyrene i SEKV.ID. NR. 1.1 en utførelsesform begynner sekvensen til BMP-11-propeptidet med aminosyresekvensen AEGPAAA.
Signalsekvensen til humant BMP-11 er vist i SEKV.ID. NR. 14 og inkluderer de første 24 aminosyrene i SEKV.ID. NR. 7. Identifiseringen av en delvis GDF-8- eller BMP-11-propeptidsekvens som et funksjonelt fragment av GDF-8- eller BMP-11-propeptidet kan lett bestemmes ved anvendelse av for eksempel analysene beskrevet i eksemplene 4-6 heri.
I tillegg til trunkerte propeptidsekvenser, inkluderer propeptidvariantene heri spesielt GDF-propeptider med punktmutasjoner eller andre modifikasjoner (inkludert innsettinger, delesjoner og substitusjoner); så lenge som variantene inneholder en eller flere ønskede biologiske eller inhibitoriske aktiviteter av et GDF-propeptid. Slik aktivitet kan måles for eksempel som beskrevet i eksemplene 4-6. Slike modifikasjoner kan introduseres i molekylet for å øke aktiviteten, sirkulatorisk eller lagringshalveringstid, eller produksjon av GDF-8- propeptid. For eksempel kan punktmutasjoner introduseres inn i ett eller flere proteolytiske kløyvingsseter for å forbygge eller hemme proteolytisk nedbrytning av det modifiserte GDF-8-propeptidet in vivo. Dataanalyser (ved anvendelse av kommersielt tilgjengelig programvare, for eksempel MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) kan anvendes for å identifisere proteolytiske kløyvings-seter.
Fremgangsmåter for å danne GDF-propeptider ifølge oppfinnelsen inkluderer følgelig spesielt i tillegg til villtype cDNA-kodende sekvenser, cDNA-kodende sekvenser som koder for villtype GDF-propeptider men som er forskjellig i cDNA-sekvens fra villtype GDF cDNA-sekvensen som følge av degenerering av den genetiske koden eller alleliske variasjoner (naturlig forekommende base endringer i artspopulasjonen som kan eller ikke kan resultere i en aminosyreendring). Oppfinnelsen omfatter også DNA-sekvenser som hybridiserer under stringente hybridiseringsbetingelser (i en utførelsesform som beskrevet i T. Maniatis et al.
(1982) Molecular Cloning ( A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, sidene 387-389) til en nukleinsyre som koder for et GDF-propeptid eller en nukleinsyre som koder for et protein eller et polypeptid med evnen til å binde seg til et spesifikt GDF-protein, som utført i eksemplene 4-6. Variasjoner i cDNA-sekvensene forårsaket av punktmutasjoner eller ved hjelp av induserte modifikasjoner (for eksempel innsettinger, delesjoner eller substitusjoner) for å øke aktiviteten, halveringstiden eller produksjonen av GDF-8- propeptider kodet for derav, er også anvendelige for den foreliggende oppfinnelsen. Dataprogram som er anvendelige for bestemmelsen av DNA sekvenshomologi er kjent for fagfolk og er beskrevet heri.
Et modifisert GDF-propeptid sin evne til å danne et ikke-kovalent kompleks med et GDF-protein kan vurderes ved hjelp av en rekke fremgangsmåter som er kjent på området, inkludert størrelsesekslusjonskromatografi og/eller kryssbindingsanalyser som beskrevet i eksempel 2 heri. Som vist i eksempel 2, danner GDF-8-propeptidet en ikke-kovalent assosiasjon med modent GDF-8-protein. Det modne GDF-8/GDF-8-propeptidkomplekset har en tydelig molekylvekt på tilnærmingsvis 75 kDa.
Som angitt ovenfor, i tillegg til Fc-fusjonsfremgangsmåten, kan GDF-propeptider stabiliseres ved hjelp av en rekke andre teknikker. I en utførelsesform bindes en stabiliserende del kovalent til en GDF-propeptiddel for å danne et fusjonsprotein. For eksempel kan GDF-8-propeptidet binde seg til en eller flere forskjellige ikke-proteinaktige polymerer, for eksempel polyetylenglykol, polypropylenglykol eller polyoksyalkylener på den måten som er beskrevet i U.S. patent nr. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 eller4,179,337.1 visse utførelsesformer er GDF-propeptider kjemisk modifisert ved hjelp av kovalent konjugering til en polymer for å øke deres sirkulatoriske halveringstid. Foretrukne polymerer og fremgangsmåter for å binde dem til peptider er også beskrevet i U.S. patent nr. 4,766,106; 4,179,337; 4,495,285; og 4,609,546.
I en annen utførelsesform kan GDF-8-propeptidet modifiseres slik at det har et endret glykosyleringsmønster (det vil si endret fra villtype glykosylerings-mønsteret). Som anvendt heri, betyr "endret" å ha en eller flere karbohydratenheter tilsatt eller fjernet, til/fra villtype GDF-propeptidet. Glykosylering av proteiner og polypeptider er typisk enten N-bundet eller O-bundet. N-bundet henviser til binding av karbohydratenheten til sidekjeden til en asparaginrest. Tripeptidsekvensen asparagin-X-serin og asparagin-X-treonin hvor X er enhver aminosyre bortsett fra prolin, er gjenkjennelsessekvensen for enzymatisk binding av karbohydratenheten til asparaginsidekjeden. Nærværet av en av disse tripeptidsekvensene i et polypeptid danner følgelig et potensielt glykosyleringssete. O-bundet glykosylering henviser til binding av en av sukkerne N-acetylgalaktosamin, galaktose eller xylose til en hydroksyaminosyre, vanligvis serin eller treonin, selv om 5-hydroksyprolin eller 5-hydroksylysin også kan anvendes.
Tilsetning eller delesjon av glykosyleringsseter til GDF-propeptidet er vanligvis fulgt av endring av aminosyresekvensen slik at den inneholder eller unngår en eller flere av de ovenfor beskrevne tripeptidsekvensene (for N-bundede glykosyleringsseter). Endringen kan også utføres ved tilsetningen av eller substitusjonen av en eller flere serin- eller treoninrester til sekvensen til villtype GDF-propeptidet (for O-bundede glykosyleringsseter). For enkelhets skyld endres GDF-propeptidamino-syresekvensen fortrinnsvis gjennom endringer på DNA-nivået, hvis teknikker er velkjente på området.
Andre midler for å øke antallet karbohydratenheter på GDF-propeptidet er ved hjelp av kjemisk eller enzymatisk kobling av glykosider til GDF-propeptidet. Disse fremgangsmåtene er fordelaktige i det at de ikke krever produksjon av GDF-propeptidet i en vertscelle som har glykosyleringsevner for N- eller O-bundet glykosylering. Avhengig av koblingsmåten som anvendes, kan sukkeret/sukkerne bindes til (a) arginin eller histidin; (b) frie karboksylgrupper; (c) frie sulfhydrylgrupper slik som de i cystein; (d) frie hydroksylgrupper slik som de i serin, treonin eller hydroksyprolin; (e) aromatiske rester slik som de i fenylalanin, tyrosin eller tryptofan; eller (f) amidgruppen i glutamin. Disse fremgangsmåtene er beskrevet i WO 87/05330 publisert 11. september 1987 og i Aplin og Wriston
(1981) CRC Crit. Rev. Biochem., sidene 259-306.
Fjerning av eventuelle karbohydratenheter som er tilstede på GDF-propeptidet kan utføres kjemisk eller enzymatisk. Kjemisk deglykosylering krever at GDF-propeptidet eksponeres for forbindelsen trifluormetansulfonsyre eller en tilsvarende forbindelse. Denne behandlingen resulterer i kløyvingen av mesteparten eller alle sukkere, bortsett fra bindingssukkeret (N-acetylglukosamin eller N-acetylgalaktosamin), mens aminosyresekvensen etterlates intakt.
Kjemisk deglykosylering er beskrevet av Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 og av Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118: 131. Enzymatisk kløyving av karbohydratenheter på GDF-propeptider kan oppnås ved hjelp av anvendelsen av en rekke endo- og eksoglykosidaser som beskrevet av Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138: 350.
Når det modifiserte GDF-propeptidet er et GDF-propeptid Fc-fusjonsprotein som beskrevet ovenfor, kan Fc-regionen til IgG-molekylet også være modifisert med et endret glykosyleringsmønster.
I en annen utførelsesform er et GDF-propeptid bundet til proteinet albumin eller et derivat av albumin. Fremgangsmåter for å binde proteiner og polypeptider til albuminprotein eller albuminderivater er velkjente på området. Se for eksempel U.S. patent nr. 5,116,944 (Sivam et al.).
Fagfolk på området vil forstå at visse aminosyrer kan substitueres for andre aminosyrer i en proteinstruktur uten negativt å påvirke proteinets aktivitet. Oppfinnerne oppfatter følgelig at ulike endringer kan gjøres i aminosyresekvensen til de modifiserte eller umodifiserte GDF-propeptidene eller DNA-sekvensene som koder for slike propeptider uten vesentlig tap av deres biologiske nytte eller aktivitet. I en utførelsesform måles slik aktivitet i eksemplene 4-6. Slike endringer kan inkludere, men er ikke begrenset til, delesjoner, innsettinger, trunkeringer, substitusjoner, fusjoner og lignende. For eksempel er endringer av aminosyresekvenser ved proteolytiske kløyvingsseter innenfor det modifiserte GDF-propeptidet eksplisitt omfattet av den foreliggende oppfinnelsen.
Ved å gjøre slike endringer, kan den hydropatiske indeksen til aminosyrene betraktes. Viktigheten av den hydropatiske aminosyreindeksen ved betraktning av interaktiv biologisk funksjon til et protein er vanligvis forstått av fagfolk (Kyte og Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157: 105-132). Det aksepteres at den relativt hydropatiske karakteren til aminosyren bidrar til den sekundære strukturen til det resulterende proteinet som igjen definerer proteinets interaksjon med andre molekyler, for eksempel enzymer, substrater, reseptorer, DNA, antistoffer, antigener og lignende.
Hver aminosyre har blitt tilegnet en hydropatisk indeks på basis av sin hydrofobisitet og ladningskarakteristika (Kyte og Doolittle, 1982, supra); disse er isoleukin (+4,5), valin (+4,2), leukin (+3,8), fenylalanin (+2,8), cystein/cystin (+2,5), metionin (+1,9), alanin (+1,8), glysin (-0,4), treonin (-0,7), serin (-0,8), tryptofan (-0,9), tyrosin (-1,3), prolin (-1,6), histidin (-3,2), glutamat (-3,5), glutamin (-3,5), aspartat (-3,5), asparagin (-3,5), lysin (-3,9) og arginin (-4,5).
Ved å gjøre slike endringer, er substitusjoner av aminosyrer hvis hydropatiske indeks er innenfor ±2 foretrukne, de som er innenfor ±1 er spesielt foretrukne, og de innenfor +0,5 er enda mer spesifikt foretrukne.
Det er også forstått i teknikkens stand at substitusjonen av like aminosyrer kan være effektiv på basis av hydrofilisiteten. U. S. patent 4,554,101 angir for eksempel at jo større lokal gjennomsnittlig hydrofilisitet til et protein, som bestemt ved hjelp av hydrofilisiteten til dets tilstøtende aminosyrer, korrelerer med en biologisk egenskap ved proteinet.
Som detaljert beskrevet i U.S. patent nr. 4,554,101, har de følgende hydrofilisitetsverdiene blitt bestemt for aminosyrerestene: Arginin (+3,0), lysin (+3,0), aspartat, +3,0±1), glutamat (+3,0±1), serin (+0,3), asparagin (+0,2), glutamin (+0,2), glysin (0), treonin (-0,4), prolin (-0,5+1), alanin (-0,5), histidin (-0,5), cystein (-1,0), metionin (-1,3), valin (-1,5), leukin (-1,8), isoleukin (-1,8), tyrosin (-2,3), fenylalanin (-2,5) og tryptofan (-3,4).
Ved å gjøre slike endringer, er substitusjonen av aminosyrer hvis hydrofilisitets-verdier er innenfor ±2 foretrukne, de som er innenfor ±1 er spesielt foretrukne og de som er innenfor +0,2 er enda mer spesifikt foretrukne.
Modifikasjonene kan være konservative slik at strukturen eller biologisk funksjon til proteinet ikke påvirkes ved endringen. Slike konservative aminosyremodifika-sjoner er basert på den relative likheten av aminosyresidekjedesubstituentene, for eksempel deres hydrofobisitet, hydrofilisitet, ladning, størrelse og lignende. Eksempler på konservative substitusjoner som tar flere av de foregående karakteristika i betraktning, er velkjente for fagfolk på området og inkluderer: Arginin og lysin; glutamat og aspartat; serin og treonin; glutamin og asparagin; og valin, leukin og isoleukin. Aminosyresekvensen til de modifiserte GDF-propeptidene kan være modifisert og ha ethvert antall av konservative endringer så lenge som bindingen av det modifiserte GDF-propeptidet til dets mål-GDF-protein ikke påvirker negativt.
Relativ sekvenslikhet eller identitet (også kjent på det protein- og molekylærbiologiske området som sekvenshomologi) bestemmes fortrinnsvis ved anvendelse av "Best Fit"- eller "Gap"-programmene til "the Sequence Analysis Software Package™" (Versjon 10; Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI). "Gap" utnytter algoritmen til Needleman og Wunsch (Needleman og Wunsch, 1970) for å finne sammenstillingen av to sekvenser som maksimerer antallet treff og minimaliserer antallet gap. "BestFit" utfører en optimal sammenstilling av det beste segmentet for likhet mellom to sekvenser. Optimale sammenstillinger finnes ved å sette inn gap for å maksimalisere antallet treff ved anvendelse av den lokale homologialgoritmen til Smith og Waterman (Smith og Waterman, 1981; Smith, et al, 1983).
Sekvensanalyseprogramvarepakken ("Sequence Analysis Software Package") som beskrevet ovenfor inneholder en rekke andre anvendelige sekvensanalyseverktøy for å identifisere homologer av de heri beskrevne nukleotid- og aminosyresekvensene. "BLAST"-programmet (Altschul, et al., 1990) søker for eksempel etter sekvenser som ligner en forespørselssekvens (enten peptid eller nukleinsyre) i en spesifikk database (for eksempel sekvensdatabaser opprettholdt ved "National Center for Biotechnology Information (NCBI)" i Bethesda, Maryland, USA); "FastA" (Lipman og Pearson, 1985; se også Pearson og Lipman, 1988; Pearson, et al, 1990) som utfører et Pearson og Lipman-søk etter likhet mellom en forespørselssekvens og en gruppe av sekvenser av den samme typen (nukleinsyre eller protein), "TfastA" utfører et Pearson og Lipman-søk for likheten mellom en proteinforespørsels-sekvens og enhver gruppe av nukleotidsekvenser (det oversetter nukleotidsekvensen i alle seks leserammene før sammenligningen utføres); "FastX" utfører et Pearson og Lipman-søk for likhet mellom en nukleotidforespørselssekvens og en gruppe av proteinsekvenser hvor rammeskift tas i betraktning. "TfastX" utfører et Pearson og Lipman-søk for likhet mellom en proteinforespørselssekvens og enhver gruppe av nukleotidsekvenser, hvor rammeskift tas i betraktning (det oversetter begge nukleinsekvenstråder før sammenligningen utføres).
Fagfolk på området vil gjenkjenne at de modifiserte eller umodifiserte GDF-propeptidene kan inneholde ethvert antall substitusjoner i deres aminosyresekvenser uten å endre deres biologiske egenskaper. I en foretrukket utførelsesform er slike endringer konservative aminosyresubstitusjoner som er velkjente på området. Eksempler på konservative substitusjoner som tar forskjellige av de foregående egenskapene i betraktning, er velkjente for fagfolk på området innen proteinbio-kjemi og inkluderer, men er ikke begrenset til: Arginin og lysin; glutamat og aspartat; serin og treonin; glutamin og asparagin; og valin, leukin og isoleukin.
I visse utførelsesformer av oppfinnelsen, kan in vivo stabiliteten til et protein måles på en rekke forskjellige måter. I en utførelsesform høstes serum- eller vevsprøver ved ulike tidspunkter etterfulgt av levering av proteinet enten intravenøst eller intraperitonealt eller proteinet radiomerkes, det vil si med jod-125 ved anvendelse av fremgangsmåter som er velkjente for fagfolk på området. Mengden av radioaktivitet som er tilstede i hver serum- eller vevsprøve kan bestemmes ved anvendelse av en gammateller. I en annen utførelsesform kan integriteten/ stabiliteten til proteinet i serumet vurderes ved hjelp av SDS-PAGE etterfulgt av enten autoradiografi eller Western blot-analyser. I en annen utførelsesform kan proteinets biologiske aktivitet måles ved anvendelse av enhver av en rekke funksjonelle analyser, inkludert en ELISA- eller cellebasert analyse som er kjent på området.
Metoder for å behandle sykdom
GDF-propeptidene ifølge den foreliggende oppfinnelsen er anvendelige for å forhindre eller behandle forskjellige medisinske lidelser i mennesker eller dyr. GDF-propeptidene anvendes fortrinnsvis for å hemme eller redusere en eller flere aktiviteter som er assosiert med et GDF-protein. I en svært foretrukket utførelsesform inhiberer eller reduserer det modifiserte GDF-propeptidet en eller flere av aktivitetene til modent GDF-8 i forhold til et modent GDF-8-protein som ikke er bundet av det samme propeptidet. I en foretrukket utførelsesform inhiberes aktiviteten til det modne GDF-8-proteinet når det er bundet til et eller flere av de modifiserte GDF-propeptidene, i det minste 50%, fortrinnsvis i det minste 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 eller 88%, mer fortrinnsvis i det minste 90, 91, 92, 93 eller 94%, og enda mer foretrukket i det minste 95% til 100% i forhold til et modent GDF-8-protein som ikke er bundet til ett eller flere av de modifiserte GDF-propeptidene.
Den medisinske lidelsen som behandles eller forebygges ved hjelp av de modifiserte GDF-propeptidene er fortrinnsvis en muskel- eller nevromuskulær lidelse (slik som amyotrofisk lateral sklerose, muskulær dystrofi, muskelatropi, kongestiv obstruktiv lungesykdom, muskelsvinnsyndrom, sarkopeni eller cachexia), en metabolsk sykdom (slik som type 2 diabetes, ikke-insulinavhengig diabetes mellitus, hyperglykemi eller overvekt), en fettvevssykdom (slik som overvekt) eller bendegenererende sykdommer (slik som osteoporose). Den medisinske tilstanden er mest foretrukket en muskel- eller nevromuskulær lidelse slik som amyotrofisk lateral sklerose, muskulær dystrofi, muskelatropi, kongestiv obstruktiv lungesykdom, muskelsvinnsyndrom, sarkopeni eller cachexia. I en annen foretrukket utførelsesform er den medisinske tilstanden en metabolsk sykdom eller lidelse slik som den som er et resultat av ikke-fungerende glukosemetabolisme og/eller insulinresistens, slik som type 2 diabetes eller ikke-insulinavhengig diabetes mellitus eller metabolske sykdommer slik som hyperglykemi eller overvekt. GDF-propeptidene anvendes fortrinnsvis for å forebygge eller behandle slike medisinske lidelser i pattedyr, mest foretrukket i mennesker.
GDF-propeptidene eller propeptidsammensetningene ifølge den foreliggende oppfinnelsen administreres i terapeutisk effektive mengder. Som anvendt heri er en "effektiv mengde" av det modifiserte GDF-propeptidet en dose som er tilstrekkelig til å redusere GDF-proteinenes aktivitet for å oppnå et ønskelig biologisk utfall (for eksempel økt skjelettmuskelmasse). I en utførelsesform kan det ønskede biologiske utfallet være enhver terapeutisk fordel inkludert en økning i muskelmasse, en økning i muskelstyrke, forbedret metabolisme, redusert fedme eller forbedret glukosehomeostase. Slike forbedringer kan måles ved hjelp av en rekke forskjellige fremgangsmåter inkludert de som måler mager og fet kroppsmasse (slik som tosidig røntgenskanninganalyse), muskelstyrke, serumlipider, serumleptin, serumglukose, glykert hemoglobin, glukosetoleranse og forbedringer i de sekundære komplikasjonene ved diabetes. En terapeutisk effektiv mengde vil vanligvis variere med individets alder, vekt, fysiske tilstand og kjønn, så vel som med den medisinske tilstandens alvorlighetsgrad i individet. Dosen kan bestemmes ved hjelp av en lege og justeres om nødvendig for å passe observerte virkninger av behandlingen. Preparatene administreres vanligvis slik at GDF-propeptidene er gitt i en dose på mellom 50 u,g/kg og 20 mg/kg. GDF-propeptidene gis fortrinnsvis som en bolusdose for å maksimalisere de sirkulerende nivåene av GDF-propeptider i det største tidsrommet etter dosen. Kontinuerlig infusjon kan også anvendes etter bolusdosen.
Det beskrives videre også fremgangsmåter for å forebygge eller behandle metabolske sykdommer eller lidelser som er et resultat av unormal glukosehomeostase. Normal glukosehomeostase krever blant annet den fininnstilte balansen mellom insulinsekresjon av betaceller i bukspyttkjertelen som svar på subtile endringer i blodglukosenivåer. En av de fundamentale virkningene av insulin er å stimulere glukoseopptaket fra blodet inn i vev, spesielt muskel og fett.
Det beskrives heri følgelig en fremgangsmåte for å behandle diabetes mellitus og beslektede lidelser slik som overvekt eller hyperglykemi gjennom administrering til et individ et modifisert GDF-propeptid eller modifiserte GDF-propeptidpreparater i en mengde som er tilstrekkelig til å lindre symptomene på sykdommen. Spesielt type 2- eller ikke-insulinavhengig diabetes mellitus (NIDDM) er karakterisert gjennom en triade av (1) resistens mot insulinvirkning på glukoseopptak i perifere vev, spesielt skjelettmuskulatur og adipocytter, (2) svekket insulinvirkning for å hemme hepatisk glukoseproduksjon og (3) feilregulert insulinsekresjon (DeFronzo,
(1997) Diabetes Rev. 5: 177-269). Individer som lider av type 2 diabetes kan derfor bli behandlet i henhold til den foreliggende oppfinnelsen gjennom administrering av et modifisert GDF-propeptid som øker følsomheten overfor insulin og glukoseopptak av celler. Andre sykdommer og metabolske lidelser karakterisert gjennom insulindysfunksjon (for eksempel resistens, inaktivitet eller svikt) og/eller utilstrekkelig glukosetransport inn i celler, kan på samme måte behandles ifølge den foreliggende oppfinnelsen gjennom administrering av et modifisert GDF-propeptid som øker cellens følsomhet overfor insulin og glukoseopptak.
Det modifiserte GDF-propeptidet eller modifiserte GDF-propeptidpreparatene ifølge den foreliggende oppfinnelsen administreres i terapeutisk effektive mengder. En "effektiv mengde" av det modifiserte GDF-propeptidet er, når det anvendes for behandlingen av diabetes og beslektede lidelser, en dose som er tilstrekkelig for å redusere GDF-proteinenes aktivitet for å oppnå en eller flere ønskede terapeutiske resultater slik som for eksempel en økning i insulinfølsomheten eller glukoseopptaket av celler, en reduksjon i kroppsfettmasse eller en ønsket endring i serumlipider, serumleptin, serumglukose, glysert hemoglobin, glukosetoleranse eller forbedring i de sekundære komplikasjonene ved diabetes. Generelt kan en terapeutisk effektiv mengde variere med individets alder, tilstand og kjønn, så vel som alvorligheten av insulindysfunksjonen i individet. Dosen kan bestemmes av en lege og justeres om nødvendig for å passe observerte virkninger ved behandlingen. Preparatene administreres vanligvis slik at GDF-propeptidene gis ved en dose på mellom 50 u,g/kg og 20 mg/kg. Fortrinnsvis gis GDF-propeptidene som en bolusdose for å maksimalisere de sirkulerende nivåene av GDF-propeptidene i det største tidsrommet etter dosen. Kontinuerlig infusjon kan også anvendes etter bolusdosen.
Det beskrives videre også genterapi for in vivo produksjon av GDF-propeptider. Slik terapi ville oppnå sin terapeutiske virkning gjennom introduksjon av GDF-propeptidpolynukleotidsekvensene inn i celler eller vev med lidelser som angitt ovenfor. Levering av GDF-propeptidpoly-nukleotidsekvenser kan oppnås ved anvendelse av en rekombinant ekspresjons-vektor slik et kimært virus eller et kolloidalt dispersjonssystem. Spesielt foretrukket for terapeutisk levering av GDF-propeptidpolynukleotidsekvenser er anvendelsen av målrettede liposomer.
Forskjellige virusvektorer kan anvendes for genterapi som beskrevet heri, inkludert adenovirus, herpesvirus, vaccinia eller fortrinnsvis et RNA-virus slik som et retrovirus. Retrovirusvektoren er fortrinnsvis et derivat av et retrovirus fra mus eller fugl. Eksempler på retrovirusvektorer hvori et enkelt fremmed gen kan settes inn inkluderer, men er ikke begrenset til: Moloney muse leukemi virus (MoMuLV), Harvey musesarkomvirus (HaMuSV), brysttumorvirus fra mus (MuMTV) og Rous sarkomvirus (RSV). Et antall ytterligere retrovirusvektorer kan inkorporere flere gener. Alle disse vektorene kan overføre eller inkorporere et gen for en valgt markør slik at omformede celler kan identifiseres ved å sette inn en GDF-propeptidpolynukleotidsekvens av interesse inn i virusvektoren, for eksempel sammen med andre gener som koder for en reseptorligand på en spesifikk målcelle hvor vektoren så spesifikt er målrettet. Retrovirusvektorer kan lages spesifikt målrettede ved å feste for eksempel et sukker, et glykolipid eller et protein til det. Foretrukket målretting utføres ved anvendelse av et antistoff. Fagfolk på området vil gjenkjenne at spesifikke polynukleotidsekvenser kan settes inn i retrovirus-genomet eller festes til en viruskappe for å tillate målrettet spesifikk levering av retrovirusvektoren som inneholder GDF-propeptidpolynukleotidet. I en foretrukket utførelsesform er vektoren målrettet for muskelceller eller muskelvev.
Ettersom rekombinante retrovirus er defekte, krever de hjelpercellelinjer som inneholder plasmider som koder for alle de strukturelle genene til retroviruset under kontrollen av regulatoriske sekvenser inne i LTR. Disse plasmidene mangler en nukleotidsekvens som gjør at pakkemekanismen gjenkjenner et RNA-transkript for innkapsling. Hjelpercellelinjer som har delesjoner i pakkesignalet inkluderer for eksempel, men er ikke begrenset til, PSI.2, PA317 og PA12. Disse cellelinjene produserer tomme viioner, ettersom intet genom blir pakket. Dersom en retrovirusvektor introduseres i slike celler og hvori pakkesignalet er intakt, men hvor de strukturelle genene er erstattet med andre gener av interesse, kan vektoren pakkes og vektorvirion produseres.
Alternativt kan andre vevskulturceller transfekteres direkte med plasmider som koder for de retrovirale strukturelle genene gag, pol og env ved hjelp av konvensjonell kalsiumfosfattransfeksjon. Disse cellene transfekteres deretter med vektorplasmidet som inneholder genene av interesse. De resulterende cellene frigjør retrovirusvektorer i kulturmediet.
Andre målrettede leveringssystemer for GDF-propeptidpolynukleotider er et kolloidalt dispersjonssystem. Kolloidale dispersjonssystemer inkluderer makromolekylkomplekser, nanokapsler, mikrosfærer, kuler og lipidbaserte systemer inkludert olje-i-vann-emulsjoner, miceller, blandede miceller og liposomer. Det foretrukne kolloidale systemet ifølge oppfinnelsen er et liposom. Liposomer er kunstige membranvesikler som er anvendelige for levering av vesikler in vitro og in vivo. RNA, DNA og intakte virioner kan innkapsles i det vandige indre og leveres til celler på en biologisk aktiv form (se for eksempel Fraley, et al., Trends Biochem. Sei., 6: 77, 1981). Fremgangsmåter for tilstrekkelig genoverføring ved anvendelse av en liposomvesikkel er kjent på området, se for eksempel Mannino, et al., Biotechniques, 6: 682, 1988. Liposomsammensetningen er vanligvis en kombinasjon av fosfolipider, vanligvis i kombinasjon med steroider, spesielt kolesterol. Andre fosfolipider eller andre lipider kan også anvendes. De fysikalske egenskapene til liposomer avhenger av pH, ionestyrke og nærværet av divalente kationer.
Eksempler på lipider som er anvendelige i liposomproduksjon inkluderer fosfatidylforbindelser slik som fosfatidylglyserol, fosfatidylkolin, fosfatidylserin, fosfatidyletanolamin, sfingolipider, cerebrosider og gangliosider. Illustrative fosfolipider inkluderer eggfosfatidylkolin, dipalmitoylfosfatidylkolin og distearoylfosfatidylkolin.
Målrettingen av liposomer er også muligens basert på for eksempel organspesifisitet, cellespesifisitet og organellespesifisitet og er kjent på området.
Fremgangsmåtene for å behandle eller forebygge de ovenfor nevnte medisinske tilstandene med de modifiserte GDF-propeptidene kan også anvendes for å inhibere andre proteiner i TGF-P 1-superfamilien. Mange av disse proteinene er beslektet i struktur til GDF-8, slik som BMP-11.1 en annen utførelsesform tilveiebringer følgelig oppfinnelsen fremgangsmåter til å behandle de tidligere nevnte lidelsene gjennom administrering til et individ modifisert GDF-propeptid som er i stand til å inhibere et ikke-GDF-8-protein, enten alene eller i kombinasjon med et modifisert GDF-propeptid mot GDF-8.
Modifiserte GDF- propeptidsammensetninger
Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer sammensetninger som omfatter de modifiserte GDF-propeptidene. Slike preparater kan være egnet for farmasøytisk anvendelse og administrering til pasienter. Preparatene omfatter vanligvis en eller flere modifiserte GDF-propeptider ifølge den foreliggende oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel eksipient. Som anvendt heri, inkluderer uttrykket "farmasøytisk akseptabel eksipient" enhver og alle løsningsmidler, dispersjonsmedier, belegg, antibakterielle og antisoppmidler, isotone og absorpsjonsforsinkelsesmidler og lignende som er kompatible med farmasøytisk administrering. Anvendelsen av slike medier og midler for farmasøytisk aktive forbindelser er velkjente på området. Eksempler på farmasøytisk akseptable eksipienter kan finnes i "The Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3. utgave 2000, Am. Pharmaceutical Press, A.E. Kibbe, red. Sammensetningene kan også inneholde andre aktive forbindelser som tilveiebringer supplementerende, ytterligere eller økte terapeutiske funksjoner. De farmasøytiske preparatene kan også være inkludert i en beholder, pakke eller dispenser sammen med instruksjoner for administrering.
Et farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen formuleres for å være kompatibelt med den tilsiktede administreringsruten. Fremgangsmåter for å oppnå administreringen er kjent for fagfolk på området. Det kan også være mulig å oppnå preparater som kan være topisk eller oralt administrerte eller som kan være i stand til å gå over slimhinnemembraner. Administreringen kan for eksempel være intravenøs (LV.), intraperitoneal (I.P.), intramuskulær (LM.), intrakavial, subkutan (S.C.) eller transdermal. Foretrukne utførelsesformer inkluderer I.V., I.P., I.M. og S.C.-injeksjon. I en foretrukket utførelsesform administreres de farmasøytiske preparatene ifølge oppfinnelsen intravenøst.
Løsninger eller suspensjoner som er anvendt for intradermal eller subkutan påføring inkluderer typisk en eller flere av de følgende komponentene: Et sterilt fortynningsmiddel slik som vann for injeksjon, saltoppløsning, fikserte oljer, polyetylenglykoler, glyserin, propylenglykol eller andre syntetiske løsningsmidler; antibakterielle midler slik som benzylalkohol eller metylparabener; antioksidanter slik som askorbinsyre eller natriumbisulfitt; gelaterende midler slik som etylendiamintetraeddiksyre; buffere slik som acetater, citrater eller fosfater; og midler for justeringen av tonisitet slik som natriumklorid eller dekstrose. pH kan justeres med syrer eller baser slik som saltsyre eller natriumhydroksid. Slike preparater kan være innelukket i ampuller, engangs sprøyter eller multiple doserør laget av glass eller plast.
Farmasøytiske preparater som er egnet for injeksjon inkluderer sterile vandige løsninger eller dispersjoner og sterile pulvere for den ekstemporære fremstillingen av sterile injiserbare løsninger eller dispersjoner. For intravenøs administrering inkluderer egnede bærere fysiologisk saltoppløsning, bakteriostatisk vann, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) eller fosfatbufret saltoppløsning (PBS). I alle tilfeller må preparatet være sterilt og bør være flytende i den grad at enkelt sprøytbarhet eksisterer. Det må være stabilt under fremstillings- og lagringsbetingelser og må konserveres mot den kontaminerende virkningen av mikroorganismer slik som bakterier og sopp. Bæreren kan være et løsningsmiddel eller dispersjonsmedium som inneholder for eksempel vann, etanol, polyol (for eksempel glyserol, propylenglykol og flytende polyetylenglykol og lignende) og egnede blandinger derav. Den passende fluiditeten kan opprettholdes for eksempel gjennom anvendelsen av et belegg slik som lecitin gjennom opprettholdelsen av den krevede partikkelstørrelse i tilfellet av dispersjon og gjennom anvendelsen av overflateaktive midler. Forebygging av virkningen av mikroorganismer kan oppnås gjennom en rekke antibakterielle og antisoppmidler, for eksempel parabener, klorbutanol, fenol, askorbinsyre, timerosal og lignende. I mange tilfeller vil det være fordelaktig å inkluderer isotone midler, for eksempel sukkere, polyalkoholer slik som mannitol, sorbitol, natriumklorid i preparatet. Forlenget absorpsjon av de injiserbare preparatene kan oppnås gjennom å inkludere i preparatet et middel som forsinker absorpsjon, for eksempel aluminiummonostearat og gelatin.
Orale sammensetninger inkluderer generelt et inert fortynningsmiddel eller en spiselig bærer. For eksempel kan de være innkapslet i gelatinkapsler eller komprimert til tabletter. For formålet ved oral terapeutisk administrering, kan GDF-propeptidene være inkorporert med eksipienter og anvendes i form av tabletter, pastiller eller kapsler. Farmasøytisk kompatible bindemidler og/eller adjuvansmaterialer kan være inkludert som en del av preparatet. Tablettene, pillene, kapslene, pastillene og lignende kan inneholde enhver av de følgende ingrediensene eller forbindelsene av en lignende natur; et bindemiddel slik som mikrokrystallinsk cellulose, gummi tragakant eller gelatin; en eksipient slik som stivelse eller laktose, et oppløsningsmiddel slik som algininsyre, Primogel eller maisstivelse; et smøremiddel slik som magnesiumstearat eller Sterotes; et glidemiddel slik som kolloidalt silisiumdioksid; et søtningsmiddel slik som sukrose eller sakkarin; eller et smaksmiddel slik som peppermynte, metylsalicylat eller appelsinsmak.
For administrering gjennom inhalering, kan GDF-propeptidene leveres i form av en aerosolpray fra trykkbeholdere eller dispensere som inneholder et egnet drivmiddel, for eksempel en gass slik som karbondioksid eller en forstøver.
Systemisk administrering kan også skje ved transmukosale eller transdermale midler. For transmukosal- eller transdermal administrering anvendes penetrerende midler tilpasset barrieren som skal penetreres i formuleringen. Slike penetrerende midler er vanligvis kjent i teknikkens stand og inkluderer for eksempel for transmukosal administrering, rensemidler, gallesalter og fusidinsyrederivater. Transmukosal administrering kan oppnås gjennom anvendelse av nesepray eller stikkpiller. For transdermal administrering formuleres de aktive forbindelsene i salver, geler eller krem som generelt er kjent i teknikkens stand.
GDF-propeptidene kan også fremstilles i form av stikkpiller (for eksempel med konvensjonelle stikkpillebaser slik som kakaosmør og andre glyserider) eller retensjonsklyster for rektal levering.
I en utførelsesform fremstilles de modifiserte GDF-propeptidene med bærere som vil beskytte forbindelsen mot rask eliminering fra kroppen slik som en kontrollert frigjøringsformulering, inkludert implantater og mikroinnkapslede leveringssystemer. Biodegraderbare, biokompatible polymerer kan anvendes, slik som etylenvinylacetat, polyanhydrider, polyglykolsyre, collagen, polyortoestere og polymelkesyre. Fremgangsmåter for fremstilling av slike preparater vil være tydelig for fagfolk på området. Materialer kan også oppnås kommersielt fra Alza Corporation og Nova Pharmaceuticals, Inc. Liposomale suspensjoner som inneholder de modifiserte GDF-propeptidene kan også anvendes som farmasøytisk akseptable bærere. Disse kan fremstilles i henhold til fremgangsmåter kjent for fagfolk på området, for eksempel som beskrevet i U.S. patent nr. 4,522,811.
Det er spesielt fordelaktig å formulere orale eller parenterale preparater i enhetsdoseringsformer for lett administrering og enhetlig dosering. Enhetsdoseringsformen som anvendes heri henviser til fysisk atskilte enheter som er egnet som enhetsdoseringer for individet som behandles; hver enhet inneholder en på forhånd bestemt mengde av aktiv forbindelse beregnet for å gi den ønskede terapeutiske virkningen i assosiasjon med den påkrevde farmasøytiske bæreren. Spesifikasjonen for enhetsdoseringsformene ifølge oppfinnelsen dikteres av og er direkte avhengig av de unike egenskapene til den aktive forbindelsen og den spesifikke terapeutiske virkningen som skal oppnås og begrensningene i teknikkene for å fremstille en slik aktiv forbindelse for behandling av individer.
Toksisitet og terapeutisk virkning av slike forbindelser kan bestemmes ved hjelp av standard farmasøytiske fremgangsmåter i cellekulturer eller forsøksdyr, for eksempel for å bestemme LD5o (den dødelige dosen for 50% av populasjonen) og ED5o (den terapeutisk effektive dosen for 50% av populasjonen). Doseforholdet mellom toksiske og terapeutiske virkninger i den terapeutiske indeksen kan uttrykkes som forholdet LD50/ED50. GDF-propeptider som utøver større terapeutisk indeks er foretrukket.
De oppnådde data fra cellekulturanalysene og dyrestudiene kan anvendes i formulering av et doseområde for anvendelse i mennesker. Dosen av slike forbindelser ligger fortrinnsvis innenfor et sirkulerende konsentrasjonsområde som inkluderer ED50 med liten eller ingen toksistet. Dosen kan variere innenfor dette området avhengig av den anvendte doseringsformen og administreringsruten som utnyttes. For ethvert modifisert GDF-propeptid som anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelsen, kan den terapeutisk effektive dosen beregnes initielt fra cellekulturanalyser. En dose kan formuleres i dyremodeller for å oppnå et sirkulerende plasmakonsentrasjonsområde som inkluderer IC50 (det vil si konsentrasjonen av det modifiserte GDF testpropeptidet som oppnår en halvveis maksimal inhibering av symptomer) som bestemt i cellekultur. Nivåer i plasma kan måles for eksempel ved hjelp av høytrykks væskekromatografi. Virkningene av enhver spesifikk dose kan overvåkes ved hjelp av en egnet bioanalyse. Eksempler på egnede bioanalyser inkluderer DNA replikasjonsanalyser, transkripsjonsbaserte analyser, GDF-protein/reseptorbindingsanalyser, kreatinkinaseanalyser, analyser basert på differensieringen av pre adipocytter, analyser basert på glukoseopptak i adipocytter og immunologiske analyser.
De følgende eksemplene tilveiebringer foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen.
EKSEMPLER
Eksempel 1: Rensing av GDF-8
Kondisjonert medium fra en valgt cellelinje som uttrykker rekombinant humant GDF-8-protein (modent GDF-8 + GDF-8-propeptid) ble surgjort til pH 6,5 og påført på en 80 x 50 mm porøs HQ anionbyttekolonne i tandem til en 80 x 50 mm porøs SP kationbyttekolonne (Perseptive Biosystems). Gjennomstrømningen ble juster til pH 5,0 og påført til en 75 x 20 porøs SP kationbyttekolonne (Perseptive Biosystems) og eluert med en NaCl-gradient. Fraksjoner som inneholdt GDF-8, som indikert ved hjelp av natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgeleketroforese (SDS-PAGE) ble samlet, surgjort med trifluoreddiksyre (TFA) til pH 2-3, deretter brakt opp til 200 ml med 0,1% TF A for å senke viskositeten. Prøven ble detter påført på en 250 x 21,2 mm Cs-kolonne (Phenomenex) innledet av en 60 x 21,2 beskyttelseskolonne (Phenomenex) og eluert med en TFA/CHaCN-gradient for å separere modent GDF-8 fra GDF-8-propeptid. Samlede fraksjoner som inneholdt modent GDF-8 ble konsentrert gjennom lyofilisering for å fjerne acetonitrilet og 20 ml av 0,1% TF A ble tilsatt. Prøven ble deretter påført på en 250 x 10 mm C5-kolonne (Phenomenex) oppvarmet til 60°C for å lette separering. Dette ble gjentatt inntil ytterligere separering ikke lenger kunne oppnås. Fraksjoner som inneholdt modent GDF-8 ble deretter samlet og brakt opp til 40% acetonitril og påført på en 600 x 21,2 BioSep S-3000 størrelseseksklusjonskolonne (Phenomenex) innledet av en 60 x 21,2 beskyttelseskolonne. Fraksjoner som inneholdt renset modent GDF-8 ble samlet og konsentrert for anvendelse i påfølgende eksperimenter. Typiske utbytter av den modne GDF-8-dimeren var 0,33 mg protein pr liter kondisjonert medium.
C5 kolonnefraksjoner som inneholdt GDF-8-propeptid ble samlet, acetonitril ble
fjernet ved hjelp av fordampning, 20 ml 0,1% TFA ble tilsatt og prøven ble deretter injisert på en 250 x 10 mm Cs-kolonne ved 60°C. Dette ble gjentatt inntil ytterligere separering ikke lenger kunne oppnås. Fraksjoner som inneholdt GDF-8-propeptidet ble deretter samlet og brakt opp til 40% acetonitril og påført på en 600 x 21,2 BioSep S-3000 størrelseseksklusjonskolonne (Phenomenex) innledet av en 60 x 21,2 beskyttelseskolonne. Fraksjoner som inneholdt det rensede GDF-8-propeptidet ble samlet og konsentrert for anvendelse i påfølgende eksperimenter. Et typisk utbytte av GDF-8-propeptidet var 0,24 mg protein pr liter kondisjonert medium.
På SDS-PAGE vandret renset modent GDF-8 som et bredt bånd ved 25 kDa under ikke-reduserende betingelser og 13 kDa under reduserende betingelser. En lignende SDS-PAGE-profil har blitt rapportert for GDF-8 fra mus (McPherron et al. (1997) Nature 387: 83-90) og reflekterer den dimere naturen til det modne proteinet.
Den tilsynelatende molekylvekten til renset GDF-8-propeptid var 38 kDa under både reduserende og ikke-reduserende betingelser. Dette indikerer at GDF-8-propeptid er monomert. Forskjellen mellom den tilsynelatende molekylvekten og den forutsagte molekylvekten til GDF-8-propeptid, ~26 kDa, kan reflektere tilsetningen av karbohydrat, ettersom dets aminosyresekvens inneholder et potensielt N-bundet glykosyleringssete (McPherron et al. (1997) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 94: 12457-12461). Den ovenfor angitte prosessen medførte følgelig fremstillingen av renset og aktivt modent GDF-8-dimer og GDF-8-propeptid.
Eksempel 2: Egenskaper ved renset rekombinant humant GDF-8
50 u,g av hver av renset modent GDF-8 og renset GDF-8-propeptid ble blandet og dialysert i 50 mM natriumfosfat, pH 7,0 og kromatografert på en 300 x 7,8 BioSep S-3000 størrelseseksklusjonskolonne (Phenomenex). Molekylvekten til det modne GDF-8/propeptidkomplekset ble bestemt fra elueringstid ved anvendelse av molekylvektstandarder (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) kromatografert på den samme kolonnen.
Når renset GDF-8-propeptid ble inkubert med renset modent GDF-8 ved nøytral pH, synes disse to proteinene å danne komplekser som indikert gjennom størrelseseksklusjonsprofilen. Den primære proteintoppen eluert ved 12,7 minutter hadde en estimert molekylvekt på 78 kDa fra molekylvektstandarder (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) kromatografert på den samme kolonnen. Størrelsen på komplekset er mest samsvarende med en dimer av modent GDF-8 assosiert med to monomerer av propeptid for på denne måten å danne et tetramært kompleks.
For å bekrefte denne observasjonen ble et preparat som inneholdt både modent GDF-8 og GDF-8-propeptid inkubert med eller uten 100 mM 1-etyl 3-[3-dimetylaminopropyl]karbodiamidhydroklorid (EDC, Pierce) i 1 time ved romtemperatur, surgjort med HC1 til pH 2-3 og konsentrert med en Mircon-10 konsentrator (Amicon) for SDS-PAGE ved anvendelse av en triacinbufret 10% akrylamidgel. Proteiner ble visualisert ved hjelp av Coomassie blåfarging. Et bånd som tilsvarer en molekylvekt på omkring 75 kD ble observert kun i prøven hvor EDC var tilsatt og ikke i kontrollsporet, hvilket bekrefter nærværet av GDF-8-modent/GDF-8-propeptidkomplekset. Dette gjør analysen troverdig for anvendelse for måling av aktiviteten og konsentrasjonen av renset modent GDF-8-dimer.
Eksempel 3: In vitro biologisk aktivitet til renset GDF-8
For å demonstrere GDF-8-aktiviteten ble en rapportørgenanalyse (RGA) utviklet ved anvendelse av en rapportørvektor pGL3(CAGA)]2-sekvens koblet til luciferase. CAGA-sekvensen er tidligere blitt rapportert å være en TGF-|3-responsiv sekvens inne i promotoren til det TGF-p-induserte genet, PAI-1 (Dennler et al. (1998) EMBOJ. 17: 3091-3100).
Rapportørvektoren som inneholder 12 CAGA-bokser ble dannet ved anvendelse av det grunnleggende rapportørplasmidet pGL3 (Promega Corporation, Madison, WI, USA, katalognr. E1751). TATA-boksen og transkripsjonsinitieringssetet fra adenovirus hoved sen promotor (-35/+10) ble satt inn mellom Bgffl- og Hindlll-setene. Oligonukleotider som inneholdt 12 repeterende enheter av CAGA-boksene AGCCAGACA ble avherdet og klonet inn i XhoI- seteX. Den humane rhabdomyosar-komcellelinjen, A204 (ATCC HTB-82), ble forbigående transfektert med pGL3(CAGA)i2 ved anvendelse av FuGENE 6 transfeksjonsreagens (Roche Diagnostics, Indianapolis, USA, katalognr. 1814443). Etter transfeksjon ble cellene dyrket på plater med 48 brønner i McCoy's 5A-medium (Life Technologies, Rockville, Maryland, USA, katalognr. 21500-079) supplert med 2 mM glutamin, 100 U/ml streptomycin, 100 u,g/ml penicillin og 10% føtalt kalveserum i 16 timer. Celler ble deretter behandlet med GDF-8, BMP-11 eller aktivin i McCoy's 5A-medium med glutamin, streptomycin, penicillin og 1 mg/l storfe serumalbumin i 6 timer ved 37°C. Luciferase ble kvantifisert i de behandlede cellene ved anvendelse av luciferase analysesystem (Promega Corporation, Madison, WI, USA, katalognr. El483). Analyseresultatene er illustrert i figur 1. For GDF-8 uttrykkes resultatene som gjennomsnitt +S.E. for tre separate eksperimenter. For BMP-11 og aktivin, er resultatene representative for to separate eksperimenter.
Resultatene viser at GDF-8 maksimalt aktiverte rapportørkonstruktet 10 ganger med en ED5o på 10 ng/ml GDF-8, hvilket indikerer at det rensede rekombinante GDF-8 var biologisk aktivt. BMP-11 som er 90% identisk med GDF-8 på aminosyrenivået (Garner et al. (1999) Dev. Biol. 208: 222-232 og Nakashima et al. (1999) Mech. Dev. 80: 185-189) og aktivin utøvet en lignende biologisk respons, hvilket indikerer at rapportørgenanalysen er en egnet analyse for å påvise GDF-8, BMP-11 eller aktivin sin biologiske aktivitet in vitro.
Eksempel 4: Bindingsegenskaper til renset GDF-8
Det GDF-8 latente komplekset ble biotinylert ved et forhold på 20 mol EZ-link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce, Rockford, Illinois, USA, katalognr. 21217) 1 mol av GDF-8-komplekset i 2 timer på is, inaktivert med 0,5% TFA og utsatt for kromatografi på en C4 Jupiter 250 x 4,6 kolonne (Phenomenex) for å separere modent GDF-8 fra GDF-8-propeptid. Biotinylerte modne GDF-8-fraksjoner eluerte med en TFA/CHaCN-gradient ble samlet, konsentrert og kvantifisert ved hjelp av MicroBCA proteinanalysereagenssett (Pierce, Rockford, IL, USA, katalognr. 23235).
Rekombinant ActRIIB-Fc-kimerer (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA, katalognr. 339-RB/CF) ble belagt på 96-brønners flatbunnede analyseplater (Costar, NY, katalognr. 3590) ved 1 u,g/ml i 0,2 M natriumkarbonatbuffer over natten ved 4°C. Plater ble deretter blokkert med 1 mg/ml storfe serumalbum og vasket etterfulgt av standard ELISA-protokoll. 100 ul biotinylerte GDF-8-porsjoner ved forskjellige konsentrasjoner ble tilsatt den blokkerte ELISA-platen, inkubert i 1 time, vasket og mengden av bundet GDF-8 ble påvist ved hjelp av Streptavidin-pepperrotperoksidase (SA-HRP, BD PharMingen, San Diego, CA, USA, katalognr. 13047E) etterfulgt av tilsettningen av TMB (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA, katalognr. 50-76-04). Kolorimetriske målinger ble utført ved 450 nm i en molekylær mikroplateleseranordning.
Som vist på figur 2, er biotinylert GDF-8 bundet til ActRIIB, den antatte GDF-8 type II-reseptoren med en ED5o på 12 ng/ml, noe som indikerer at ActRII-bindingsanalysen er en sensitiv in vitro bindingsanalyse for GDF-8.
Eksempel 5: Inhibering av GDF-8 og BMP-11 av GDF-8-propeptid Når GDF-8 ble preinkubert med GDF-8-propeptid i 1 time ved romtemperatur, ble den biologiske aktiviteten til GDF-8 redusert. Figur 3 viser induksjon av pGL3(CAGA)i2 rapportøraktivitet ved ED5o for GDF-8, 10 ng/ml i nærværet av GDF-8-propeptid. GDF-8-propeptid reduserer GDF-8-induksjonen på en doseresponsiv måte med en IC50 på 25 ng/ml (0,5 nM). GDF-8-propeptid inhiberer også den biologiske aktiviteten til BMP-11 i samme grad. I kontrast til dette, ble aktivinakti vite ten i denne analysen ikke påvirket av GDF-8-propeptid, antageligvis som følge av den relativt lave homologien mellom GDF-8 og aktivin sammenlignet med GDF-8 og BMP-11.
På samme måte viser figur 4 at preinkubering av GDF-8-propeptid med det biotinylerte GDF-8 ved 5 ng/ml inhiberte GDF-8-binding til ActRIIB i ActRIIB bindingsanalysen som beskrevet i eksempel 4 med en IC50 på 0,3 nM. Avslutningsvis ble GDF-8-propeptidet ifølge oppfinnelsen vist å være en kraftig subnanomolar inhibitor av GDF-8- og BMP-11-aktivitet in vitro, som målt i rapportørgenanalysen og ActRIIB bindingsanalysen. Følgelig viser denne analysen at GDF-8-propeptidet er aktivt og at det er en kraftig inhibitor av GDF-8-aktivitet i denne analysen.
Eksempel 6: Inhibering GDF-8-reseptorbinding gjennom GDF-8-propeptid GDF-8 ble jodinert med kloarmin T som beskrevet av Frolik et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 10995-10999 til en spesifikk aktivitet på 100-200^Ci/^g. Jodinert GDF-8 viste sammenlignbar biologisk aktivitet med umerket GDF-8 i (CAGA)]2 rapportøranalysen beskrevet i eksempel 3. <I25>I-merket GDF-8 ble vurdert for spesifikk binding til en myoblastcellelinje, L6.
L6 myoblastceller (ATCC CRL-1458) ble dyrket til sammenflytning i Dulbeccos modifiserte Eagles medium supplert med 10% varmeinaktivert fosterkalveserum på gelatiniserte 24 brønners plater. Likevektsbinding ble utført som beskrevet i Song et al. (1995) Endocrinology 136: 4293-4297, som er inkorporert ved referanse i sin helhet heri. 1 ng/ml <125>I GDF-8 (med eller uten umerket GDF-8) ble inkubert med sammenflytende L6-celler i 4 timer ved 4°C. Etter vasking av celler, ble bundt [<I25>I]GDF-8 ekstrahert og kvantifisert med en gammateller. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt + S.E. av triplikate bestemmelser og er representative for tre separate eksperimenter.
Som vist i figur 5, binder <125>I-GDF-8 seg til L6-celler med høy affinitet. BMP-11, men ikke TGF-pi, erstatter bemerkelsesverdig nok <I25>I-GDF-8-binding, hvilket indikerer at GDF-8 og BMP-11 (men ikke TGF-P 1) deler en felles reseptor på disse cellene (data ikke vist). Fra en Scatchardanalyse av GDF-8-bindingen, ble Ka estimert til å være 140 pM. Videre kunne spesifikk GDF-8-binding til L6-celler inhiberes med økende konsentrasjoner av umerket GDF-8-propeptid (figur 6) når 1 ng/ml I25I-GDF-8 ble preinkubert med GDF-8-propeptid i 1 time ved romtemperatur. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± S.E. av triplikate bestemmelser og er representative for to separate eksperimenter. IC50 for 1 ng/ml GDF-8 ble 140 ng/ml GDF-8-propeptid. Som bevist gjennom disse dataene, inhiberer GDF-8-propeptid dne biologiske aktiviteten til GDF-8 gjennom blokkering av GDF-8 reseptorbinding.
Eksempel 7: Inhibering av GDF-8-aktivitet gjennom GDF-8-propeptid-Fc-fusjonsproteiner
Som vist i eksempel 8 nedenfor, har GDF-8-propeptid fra mus en relativt kort in vivo halveringstid. For å øke biotilgjengeligheten av GDF-8-propeptidet, ble fusjoner mellom GDF-8-propeptidet og en IgG2a Fc-region fra mus konstruert ved anvendelse av standard genteknologiske teknikker.
Fire mutasjoner ble introdusert i Fc-regionen for å redusere effektorfunksjonen som beskrevet i Steurer et al. (1995) J. Immunol. 155: 1165-1174. Ved å bruke standard PCR-metode ble to fusjonskonstrukter fremstilt ved å sammensmelte et cDNA som koder for GDF-8-propeptid fra mus (aminosyrene 1-267) til IgG2a Fc-regionen fra mus (figur 7). Fusjon 1 (figur 7A) koder for de første 265 aminosyrene av GDF-8-propeptidet fra mus (inkludert et 24 aminosyrer langt sekresjonssignal) sammensmeltet i ramme til 233 aminosyrer fra IgG2a Fc-regionen fra mus som starter ved den første aminosyren i hengselseksjonen. Fusjon 2 (figur 7B) er konstruert på en lignende måte som fusjon 1, bortsett fra at en kort glysin-serin-glysin-serin (GSGS) linker separerer GDF-8-propeptidet fra Fc-regionen fra mus.
De to kimerene ble introdusert inn i en eukaryot ekspresjonsvektor, pED (Kaufman et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4485-4490) og forbigående uttrykt i COS-1 M6-celler (Horowitz et al. (1983) Journal of Molecular and Applied Genetics 2: 147-159) ved anvendelse av Lipofectamin 2000 transfeksjonsreagens (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, Maryland, USA, katalognr. 11668-019) i henhold til forhandlerens protokoll. Etter 24 timers inkubering ble R1CD1 (et modifisert DMEM/F12 serumfritt kulturmedium) tilsatt. Kondisjonert medium (CM) ble samlet, friskt R1CD1 erstattet og CM ble høstet på nytt 60 timer senere. Kondisjonert medium ble deretter samlet og renset over Protein A Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, England, katalognr. 17-07080-01) etter tilsetning av 1/10 volum av 1 M Tris pH 8,0. Det rensede proteinet ble eluert i 0,1 M eddiksyre, 150 mM NaCl og umiddelbart nøytralisert med 1/20 volum av 3 M Tris pH 9,0. Proteiner ble kvantifisert ved anvendelse av en standard IgG ELISA museprotokoll og analysert i ActRIIB-konkurrerende ELISA sammen med et renset humant GDF-8-propeptid som beskrevet i eksempel 5. Resultatene er vist i figur 8. ICso-verdiene til GDF-8-propeptid-Fc-fusjonene er i det lave nanomolare området og det er ingen forskjell mellom fusjon 1 og 2. Fusjon 1 (ingen linker mellom GDF-8-propeptid og IgG2a fra mus) ble samlet for anvendelse for å danne en stabil CHO-cellelinje og testet for inhibering av GDF-8 i RGA-analysen.
GDF-8-propeptid-Fc cDNA ble subklonet inn i CHO-ekspresjonsplasmidet pHTop og transfektert inn i CHO/A2-celler som beskrevet i Thies et al. (2001) Growth Factors 18: 251-259 som er inkorporert ved referanse i sin helhet heri.
En stabil cellelinje (PF-4/0,02) ble etablert ved å velge celler i 0,02 M metotreksat. Kondisjonert medium som inneholdt GDF-8-propeptid-Fc-fusjonsproteinet fra en valgt linje ble høstet og dets pH ble justert ved tilsetning av 10% volum/volum 1 M Tris pH 8,0 og renset over Pharmacia rProteinA Sepharose Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, England, katalognr. 17-1279-02) på forhånd ekvilibrert med 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5. Fraksjoner ble eluert med 100 mM eddiksyre, 150 mM NaCl, pH 2,5 og umiddelbart nøytralisert ved tilsetning av 5% volum/volum 3 M Tris pH 9,0. Topp fraksjoner ble samlet og lastet på en Pharmacia Superdex 200 størrelseseksklusjonskolonne (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, England, katalognr. 17-1069-01). 0,05% Tween 80 ble tilsatt til fraksjonene for å forhindre aggregering. Fraksjoner ble evaluert ved hjelp av SDS-PAGE på Novex 10% Tricingeler (Novex, San Diego, CA, USA, katalognr. EC66755).
Samlede fraksjoner ble kvantifisert ved hjelp av spektrofotometri og analysert for aktivitet i ActRIIB bindingsanalyse som beskrevet i eksempel 4, så vel som i rapportørgenanalysen (figur 9). ICso-verdien for den rensede GDF-8-propeptid-Fc-fusjonen var 1,3 nM. Dataene viser at det modifiserte GDF-propeptidet ifølge oppfinnelsen omfatter et GDF-8-propeptid-Fc-fusjonsprotein som har bibeholdt kraftig inhibitorisk (nøytraliserende) aktivitet sammenlignet med GDF-8-propeptid.
Eksempel 8: Farmakokinetikker
Farmakokinetikken (PK) til GDF-8-propeptid (referert til heri som "GDF-8-Pro") og GDF-8-propeptid-Fc-fusjonsprotein (referert til heri som "GDF-8-ProFc") ble evaluert i C57Bl/6J-mus ved en dose på 0,2 u,g/mus (GDF-8-Pro) eller 2 u,g/mus (GDF-8-ProFc) etter en enkel intravenøs administrering. Dyrene mottok en blanding av umerket og <I25>I-merket GDF-8-Pro eller GDF-8-ProFc ved dosene som er angitt ovenfor og serumkonsentrasjoner ble bestemt basert på I<125> radioaktivitet i serum og den spesifikke aktiviteten til den injiserte dosen. Figur 10 viser serumkonsentrasjonen mot tidskurven for både GDF-8-Pro og GDF-8-ProFc. Tabell 1 viser PK-parameterne for GDF-8-Pro og GDF-8-ProFc etter en enkel intravenøs administrering av 2 u.g/mus. Serumkonsentrasjonene og PK-parameterne for GDF-8-Pro er normalisert til en dose på 2 u,g/mus for komparative formål.
T1/2: Halveringstiden i løpet den terminale elimineringsfasen.
Cmax: Topp serumkonsentrasjon.
MRT: Gjennomsnittlig residenstid.
Vi: Initialt distribusjonsvolum.
Vss: Distribusjonsvolum ved likevekt.
Bemerk: GDF-8-Pro PK-parametere normalisert til en dose på 2 u.g/mus.
Som det kan ses i figur 10, er "clearance" 400 ganger saktere og halveringstiden lenger for GDF-8-ProFc sammenlignet med GDF-8-Pro. Både det initiale distribusjonsvolumet og distribusjons volumet ved likevekt er tilnærmingsvis 3 ganger større for GDF-8-Pro sammenlignet med GDF-8-ProFc, hvilket indikerer at GDF-8-Pro i en større grad distribueres på utsiden av det vaskulære rom sammenlignet med GDF-8-ProFc.
Selv om stabiliseringseffekten av Fc-regionen til et IgG-molekyl på et GDF-propeptid er eksemplifisert ved anvendelse av GDF-propeptid-Fc-fusjonsprotein fra mus (det vil si at begge komponentene er utledet fra mus), kan fremgangsmåtene ifølge den foreliggende oppfinnelsen anvendes til enhver kombinasjon av GDF-propeptid og IgG-komponenter uavhengig av det spesifikke forløperproteinet eller dyrearten hvorfra komponentene er utledet, forutsatt at fusjonsproteinet er konstruert riktig for å bibeholde aktivitet (det vil si som beskrevet heri). Eksempel 9: Utledning og aktivitet av to humane GDF-8-propeptid-Fc-fusjoner To GDF-8-propeptid-Fc-fusjonskonstrukter ble fremstilt ved anvendelse av standard PCR-metodologi for vurdering av terapeutisk potensiale. Et cDNA som koder for det humane GDF-8-proeptidet (SEKV.ID. NR. 5) ble sammensmeltet til den humane IgGl Fc-regionen (SEKV.ID. NR. 15; figur 1 IA) eller humant IgGl Fc modifisert for å redusere effektorfunksjon (SEKV.ID. NR. 16; figur 1 IB).
1. Humant GDF-8-propeptid-IgGl villtype Fc-fusjonsprotein (figur 11A):
De første 264 aminosyrene til det humane GDF-8-propeptidet (inkludert aminosyrene 1-241 av SEKV.ID. NR. 5 og det 23 aminosyrer lange signalpeptidet som angitt i SEKV.ID. NR. 13) ble sammensmeltet i ramme med de 232 aminosyrene fra den humane IgGl-konstante regionene som starter ved den første aminosyren i hengselregionen (SEKV.ID. NR. 15).
2. Humant GDF-8-propeptid-IgGl-mutant (figur 1 IB):
De første 264 aminosyrene i det humane GDF-8-propeptidet som beskrevet ovenfor ble sammensmeltet i ramme med de 227 aminosyrene til en mutert human IgGl Fc-region (SEKV.ID. NR. 16). To mutasjoner, alaninrester (Ala-14 og Ala-17) som vist i SEKV.ID. NR. 16 ble introdusert for å redusere effektorfunksjonen som beskrevet i Lund et al. (1991) J. Immun. 147: 2657-2662 og Morgan et al. (1995) Immunology 86: 319-324.
De to fusjonsproteinene ble introdusert i en eukaryot ekspresjonsvektor, pED (Kaufman et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4485-4490) og forbigående uttrykt i COS-1 M6-celler (Horowitz et al. (1983) Journal of Molecular and Applied Genetics 2: 147-159) ved anvendelse av Lipofectamin 2000 transfeksjonsreagens
(Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, Maryland, USA, katalognr. 11668-019)
i henhold til forhandlerens protokoll. Etter 24 timers inkubering ble R1CD1 (et modifisert DMEM/F12 serumfritt kulturmedium) tilsatt. Kondisjonert medium (CM) ble høstet, friskt R1CD1 tilsatt og CM ble igjen høstet 60 timer senere. Kondisjonert medium ble deretter høstet og renset over Protein A Sepharose CL-4B (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, HP7 9NA, England, katalognr. 17-07080-01) etter tilsetning av 1/10 volum av 1 M Tris pH 8,0. Det rensede proteinet ble eluert i 0,1 M eddiksyre, 150 mM NaCl og umiddelbart nøytralisert med 1/20 volum av 3 M Tris pH 9,0. Proteiner ble kvantifisert ved anvendelse av en standard human IgG ELISA-protokoll og analysert i ActRIIB bindingsanalyse sammen med et renset humant GDF-8-propeptid som beskrevet i eksempel 5. Resultatene er vist i figur 12. Det kan konkluderes med at begge de humane propeptid-Fc-fusjonsproteinene er kraftige inhibitorer av GDF-8-binding til ActRIIB.
Eksempel 10: In vivo testing av GDF-8-propeptid-Fc-fusjonsprotein GDF-8-propeptid-Fc-proteinet fra mus (fra eksempel 9) ble testet i voksne mus. 7 til 9 uker gamle, voksne, BALB/c-hunnmus ble vilkårlig spredt med hensyn til kroppsvekt og plassert i grupper på 7 (bortsett fra den ikke-behandlede gruppen som hadde 6 mus). Mus ble dosert to ganger i uken ved hjelp av I.P. injeksjon med en total ukentlig dose på 10 u,g, 100 u,g eller 1000 u,g pr dyr i 5 uker. Kontrollinjeksjoner var IgG2a-Fc fra mus ved en molar ekvivalent til den høye dosen med propeptid-Fc. Ved slutten av studien ble gastrocnemius, kvadriceps, epididymal fettpute, nyre og lever fjernet og veid. Figur 13 viser den gjennomsnittlige vevsmassen hvor feilmarginslinjen indikerer standardavviket. Stjernen (<*>) indikerer en statistisk signifikant forskjell (p < 0,01 ved avendelse av en students T-test) sammenlignet med musen behandlet med kontrollproteinet IgG2aFc. Blokkering av GDF-8-aktivitet in vivo ved I.P. injeksjon av GDF-8-propeptid-Fc-fusjonprotein ved 1 mg/uke (behandlede mus) resulterte i en 6,2% økning i gastrocnemius og 11,3% økning i kvadricepsmuskelmasse sammenlignet med kontrollmus som ikke mottok GDF-8-propeptid-Fc-fusjonsprotein. I tillegg, resulterer blokkering av GDF-8-aktivitet in vivo med I.P. injeksjon av GDF-8-propeptid-Fc-fusjonsprotein ved 100 u,g/uke (behandlede mus) i 23,0% økning i fettputemasse. Høydosebehandlingen (1 mg/uke) første også til en økning i fettputemasse, men som følge av variabiliteten i putemasse, var forskjellen ikke svært statistisk signifikant (p = 0,047). Det var ingen effekt av behandling på massen til annet testet vev, inkludert lever og nyre. Det oppsummeres med at det modifiserte GDF-8-propeptidet blokkerte GDF-8-aktivitet in vivo og medfører en økning i muskelmasse og en reduksjon i fettmasse. Blokkering av GDF-8-aktivitet in vivo ved hjelp av I.P. injeksjon av GDF-8-propeptid-Fc-fusjonsprotein (behandlede mus) resulterte i økt gastrocnemius og kvadricepsmuskelmasse sammenlignet med kontrollmus som ikke mottok GDF-8-propeptid-Fc-fusjonsprotein.
Ekvivalenter
Fagfolk på området vil gjenkjenne eller være i stand til å fastslå mange ekvivalenter til de spesifikke utførelsesformene ifølge oppfinnelsen beskrevet heri uten å anvende noe annet enn rutineforsøk.
Claims (32)
1. Modifisert GDF-8-propeptid omfattende en aminosyresekvens som er i det minste 95 % identisk med SEKV ID NR. 5 og som har en mutasjon i resten tilsvarende posisjon 76 ifølge SEKV.ID. NR. 5, der det modifiserte GDF-8-propeptidet har økt in vivo- eller in vitro-halveringstid sammenliknet med et ikke-modifisert GDF-8-propeptid som har den samme sekvensen bortsett fra at resten tilsvarende posisjon 76 i SEKV ID NR. 5 ikke er mutert.
2. Modifisert GDF-8-propeptid ifølge krav 1, hvori mutasjonen som modifiserer aminosyresekvensen i resten tilsvarende posisjon 76 i SEKV.ID. NR. 5 er valgt fra en substitusjons-, delesjons- eller innskuddsmutasjon.
3. Modifisert GDF-8-propeptid ifølge krav 2, hvori resten tilsvarende posisjon 76 i SEKV.ID. NR. 5 er alanin.
4. Modifisert propeptid ifølge ethvert av kravene 1-3, hvori et proteolytisk kløyvingssete er inaktivert ved mutasjonen på nevnte sete.
5. Modifisertpropeptid ifølge ethvert av kravene 1-4, hvori det modifiserte propeptidet ytterligere omfatter en stabilisatordel fusjonert til propeptidet.
6. Modifisert propeptid ifølge krav 5, hvori stabilisatordelen omfatter en Fc-region fra et IgG-molekyl.
7. Modifisert propeptid ifølge krav 6, hvori IgG-molekylet omfatter en IgGl - eller IgG4-Fc-region.
8. Modifisert propeptid ifølge krav 6, hvori IgG-molekylet er IgGl eller IgG4.
9. Modifisert propeptid ifølge krav 6, hvori aminosyresekvensen til IgG-molekylet er minst 75 % identisk med SEKV.ID. NR. 15.
10. Modifisert propeptid ifølge krav 6, hvori aminosyresekvensen til IgG-molekylet er SEKV.ID. NR. 15.
11. Modifisert propeptid ifølge krav 6, hvori aminosyresekvensen til IgG-molekylet er minst 75 % identisk med SEKV.ID. NR. 16.
12. Modifisert propeptid ifølge krav 6, hvori aminosyresekvensen til IgG-molekylet er SEKV.ID. NR. 16.
13. Modifisert propeptid ifølge krav 6,
hvori propeptidet er fusjonert til Fc-regionen på IgG-molekylet via et linker-peptid.
14. Modifisert propeptid ifølge krav 1,
hvori det modifiserte propeptidet har et endret glykosyleringssete.
15 Modifisert propeptid ifølge ethvert av kravene 1-3,
hvori det modifiserte propeptidet omfatter minst én karbohydratenhet.
16. Modifisert propeptid ifølge krav 5,
hvori stabilisatordelen omfatter albumin eller et derivat av albumin.
17. Modifisert propeptid ifølge krav 5,
hvori stabilisatordelen omfatter en ikke-proteininneholdende polymer.
18. Modifisert propeptid ifølge ethvert av kravene 1-3,
hvori det modifiserte propeptidet ytterligere omfatter et rensemerke.
19. Nukleinsyremolekyl,
karakterisert ved at det koder for modifisert GDF-8-propeptid ifølge krav 1.
20. Nukleinsyremolekyl ifølge krav 19,
karakterisert ved at det omfatter nukleinsyresekvensen som vist i SEKV.ID. NR. 2 eller SEKV ID NR.6.
21. Farmasøytisk preparat,
karakterisert ved å omfatte det modifiserte propeptidet ifølge ethvert av kravene 1-18 og en farmasøytisk akseptabel eksipient.
22. Farmasøytisk preparat,
omfattende nukleinsyren ifølge ethvert av kravene 19-20 og en farmasøytisk akseptabel bærer eller vektor.
23. Fremgangsmåte for å fremstille et modifisert GDF-8-propeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter: (a) fremstilling av et cDNA-molekyl som koder for det modifiserte GDF-8-propeptidet ifølge krav 1, hvori det proteolytiske kløyvingssetet er modifisert; (b) fremstilling av et cDNA-molekyl som koder for Fc-regionen i et IgG-molekyl;
og (c) sammensmelting av cDNA-molekylene fra trinn (a) og (b) for å fremstille et modifisert GDF-8-propeptid.
24. Fremgangsmåte ifølge krav 23,
karakterisert ved at fremgangsmåten ytterligere omfatter fremstilling av et dobbelttrådet oligonukleotid som koder for et linkerpeptid og sammensmelte cDNA-molekylene fra trinn (a) og (b) til hver ende av det dobbelttrådede oligonukleotidet som koder for linkerpeptidet.
25. Fremgangsmåte ifølge krav 24,
karakterisert ved at linkerpeptidet omfatter aminosyresekvensen bestående av GSGS.
26. Isolert rekombinant celle,
omfattende en nukleinsyre som koder for et modifisert GDF-8-propeptid ifølge ethvert av kravene 1-18.
27. Isolert rekombinant celle ifølge krav 26,
omfattende nevnte nukleinsyre omfatter en nukleinsyresekvens som koder for en stabiliserende del.
28. Modifisert propeptid ifølge ethvert av kravene 1-18,
for anvendelse som et medikament.
29. Anvendelse av et modifisert propeptid ifølge ethvert av kravene 1-18 i fremstillingen av et medikament for å øke muskelmassen eller til behandlingen av én eller flere tilstander som er valgt fra muskulære forstyrrelser, nevromuskulære forstyrrelser, metabolske forstyrrelser, bendegenererende forstyrrelser, amytrof lateral sclerosis, muskulær dystrofi, muskelatrofi, kongestiv obstruktiv lungesykdom, muskelsvinnsyndrom, sarcopenia, kakeksi og osteoporose.
30. Modifisert GDF-8-propeptide omfattende aminosyrene 1-241 som vist i SEKV ID NR. 5 fusjonert med en human IgGl Fc region, hvori aminosyreresten tilsvarende til posisjon 76 i SEKV ID NR. 5 er mutert til alanin.
31. Modifisert GDF-8 propeptide i følge krav 30, hvori nevnte humane IgGl Fc-region er aminosyresekvensen i følge SEKV ID NR. 15 eller SEKV ID NO. 16.
32. Modifisert GDF-8-propeptid i følge krav 30 eller 31, hvori hengselsregionen til nevnte IgGl Fc region er modifisert for å redusere Fc-regionefektorfunksjon.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US26750901P | 2001-02-08 | 2001-02-08 | |
PCT/US2002/003467 WO2002068650A2 (en) | 2001-02-08 | 2002-02-08 | Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO20033456D0 NO20033456D0 (no) | 2003-08-04 |
NO20033456L NO20033456L (no) | 2003-10-06 |
NO333427B1 true NO333427B1 (no) | 2013-06-03 |
Family
ID=23019083
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO20033456A NO333427B1 (no) | 2001-02-08 | 2003-08-04 | Modifiserte GDF-8-propeptider, fremgangsmate for fremstilling og anvendelse derav, nukleinsyremolekyl kodende for modifisert GDF-8-propeptid, samt farmasoytisk preparat |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US7202210B2 (no) |
EP (1) | EP1397492B1 (no) |
JP (3) | JP4280071B2 (no) |
AR (1) | AR032567A1 (no) |
AT (1) | ATE357519T1 (no) |
AU (1) | AU2002243852B2 (no) |
BR (1) | BR0207110A (no) |
CA (2) | CA2437218A1 (no) |
CL (1) | CL2009000648A1 (no) |
CY (1) | CY1106629T1 (no) |
DE (1) | DE60219006T2 (no) |
DK (1) | DK1397492T3 (no) |
ES (1) | ES2284828T3 (no) |
HK (1) | HK1062457A1 (no) |
MX (1) | MXPA03007063A (no) |
NO (1) | NO333427B1 (no) |
NZ (2) | NZ527286A (no) |
PL (2) | PL212078B1 (no) |
PT (1) | PT1397492E (no) |
SG (2) | SG187989A1 (no) |
TW (2) | TW200526779A (no) |
WO (1) | WO2002068650A2 (no) |
ZA (2) | ZA200508954B (no) |
Families Citing this family (81)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TW200526779A (en) | 2001-02-08 | 2005-08-16 | Wyeth Corp | Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof |
US7320789B2 (en) | 2001-09-26 | 2008-01-22 | Wyeth | Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof |
EP1572909A4 (en) | 2002-02-21 | 2007-06-06 | Wyeth Corp | PROTEIN CONTAINING A DOMAINE OF FOLLISTATIN |
US7572763B2 (en) * | 2002-02-21 | 2009-08-11 | Wyeth | Follistatin domain containing proteins |
DE60331778D1 (de) * | 2002-09-16 | 2010-04-29 | Univ Johns Hopkins | Metalloproteaseaktivierung von myostatin und verfahren zur modulation der myostatinaktivität |
AR047392A1 (es) | 2002-10-22 | 2006-01-18 | Wyeth Corp | Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines |
US20040223966A1 (en) * | 2002-10-25 | 2004-11-11 | Wolfman Neil M. | ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor |
AU2003225410A1 (en) | 2003-03-21 | 2004-10-11 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure |
UA85055C2 (ru) | 2003-06-02 | 2008-12-25 | Уайт | Применение ингибиторов миостатика (gdf8) в сочетании с кортикостероидами для лечения нервно-мышечных заболеваний |
CA2574777C (en) | 2004-07-23 | 2015-09-01 | Acceleron Pharma Inc. | Actrii receptor polypeptides, methods and compositions |
BRPI0514253A (pt) * | 2004-08-12 | 2008-06-03 | Wyeth Corp | terapia de combinação para diabetes, obesidade e doenças cardiovasculares usando composições contendo inibidores de gdf-8 |
TWI374935B (en) | 2004-08-27 | 2012-10-21 | Pfizer Ireland Pharmaceuticals | Production of α-abeta |
US7300773B2 (en) | 2004-08-27 | 2007-11-27 | Wyeth Research Ireland Limited | Production of TNFR-Ig |
TWI384069B (zh) | 2004-08-27 | 2013-02-01 | Pfizer Ireland Pharmaceuticals | 多胜肽之製法 |
US20060216279A1 (en) * | 2005-03-22 | 2006-09-28 | Glass David J | Myostatin inhibiting fusion polypeptides and therapeutic methods thereof |
MX2007011405A (es) * | 2005-03-23 | 2007-10-11 | Wyeth Corp | Deteccion de una respuesta inmune para agentes moduladores de crecimiento y la diferenciacion del factor 8 (gdf 8). |
JP2008537488A (ja) * | 2005-03-23 | 2008-09-18 | ワイス | Gdf−8モジュレート物質の検出 |
CN103432568A (zh) | 2005-11-23 | 2013-12-11 | 阿塞勒隆制药公司 | Activin-ActRIIa拮抗剂及其促进骨骼生长的应用 |
US8128933B2 (en) * | 2005-11-23 | 2012-03-06 | Acceleron Pharma, Inc. | Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody |
US20070190056A1 (en) * | 2006-02-07 | 2007-08-16 | Ravi Kambadur | Muscle regeneration compositions and uses therefor |
DK2032701T3 (da) * | 2006-06-23 | 2014-02-10 | Alethia Biotherapeutics Inc | Polynukleotider og polypeptider, der er inddraget i cancer |
PT2049664E (pt) * | 2006-08-11 | 2012-01-03 | Prosensa Technologies Bv | Oligonucleotídeos de cadeia simples complementares dos elementos repetitivos para tratar perturbações genéticas associadas à instabilidade das repetições do adn |
US20100028332A1 (en) * | 2006-12-18 | 2010-02-04 | Acceleron Pharma Inc. | Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels |
CA2672758C (en) * | 2006-12-18 | 2019-07-30 | Acceleron Pharma Inc. | Activin-actrii antagonists and uses for increasing red blood cell levels |
US8895016B2 (en) * | 2006-12-18 | 2014-11-25 | Acceleron Pharma, Inc. | Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels |
MX2009008222A (es) * | 2007-02-01 | 2009-10-12 | Acceleron Pharma Inc | Antagonistas de activina-actriia y usos para tratar o prevenir cancer de mama. |
TW202021980A (zh) * | 2007-02-02 | 2020-06-16 | 美商艾瑟勒朗法瑪公司 | 衍生自ActRIIB的變體與其用途 |
KR20200054317A (ko) | 2007-02-09 | 2020-05-19 | 악셀레론 파마 인코포레이티드 | 액티빈-ActRⅡA 길항제 및 암 환자에서 골 생장을 촉진시키기 위한 이의 용도 |
CA2693048C (en) * | 2007-07-12 | 2016-10-18 | Prosensa Technologies B.V. | Molecules for targeting compounds to various selected organs or tissues |
WO2009008725A2 (en) * | 2007-07-12 | 2009-01-15 | Prosensa Technologies B.V. | Molecules for targeting compounds to various selected organs, tissues or tumor cells |
AR068332A1 (es) | 2007-08-03 | 2009-11-11 | Summit Corp Plc | Combinaciones de drogas para el tratamiento de la distrofia muscular de duchenne |
GB0715087D0 (en) | 2007-08-03 | 2007-09-12 | Summit Corp Plc | Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy |
CN103877564A (zh) | 2007-09-18 | 2014-06-25 | 阿塞勒隆制药公司 | 活化素-actriia拮抗剂和减少或抑制fsh分泌的用途 |
USRE48468E1 (en) | 2007-10-26 | 2021-03-16 | Biomarin Technologies B.V. | Means and methods for counteracting muscle disorders |
CA2704049A1 (en) | 2007-10-26 | 2009-04-30 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Means and methods for counteracting muscle disorders |
NZ587178A (en) * | 2008-02-08 | 2011-11-25 | Prosensa Holding Bv | Methods and means for treating dna repeat instability associated genetic disorders |
EP2119783A1 (en) | 2008-05-14 | 2009-11-18 | Prosensa Technologies B.V. | Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means |
EP2303311B1 (en) | 2008-05-14 | 2018-08-01 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd | Angiogenin for use in treating skeletal muscle disorders |
EP2315602A4 (en) * | 2008-06-26 | 2011-11-02 | Acceleron Pharma Inc | METHOD OF DOSING AN ACTRIIB ANTAGONIST AND MONITORING TREATED PATIENTS |
TW201919685A (zh) | 2008-08-14 | 2019-06-01 | 美商艾瑟勒朗法瑪公司 | 使用gdf阱以增加紅血球水平 |
US8216997B2 (en) | 2008-08-14 | 2012-07-10 | Acceleron Pharma, Inc. | Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators |
MX336869B (es) | 2008-11-03 | 2016-02-04 | Alethia Biotherapeutics Inc | Anticuerpos que bloquean espicificamente la actividad biologica de un antigeno de tumor. |
CA2749544A1 (en) * | 2009-01-13 | 2010-07-22 | Acceleron Pharma Inc. | Methods for increasing adiponectin |
AU2010239779A1 (en) | 2009-04-24 | 2011-11-17 | Prosensa Technologies B.V. | Oligonucleotide comprising an inosine for treating DMD |
CA2764890A1 (en) * | 2009-06-08 | 2010-12-16 | Acceleron Pharma Inc. | Methods for increasing thermogenic adipocytes |
AU2010263182B2 (en) | 2009-06-12 | 2016-05-12 | Acceleron Pharma Inc. | Truncated ActRIIB-Fc fusion proteins |
WO2011031901A1 (en) * | 2009-09-09 | 2011-03-17 | Acceleron Pharma Inc. | Actriib antagonists and dosing and uses thereof |
EP3260130B1 (en) * | 2009-11-03 | 2021-03-10 | Acceleron Pharma Inc. | Methods for treating fatty liver disease |
TW201120210A (en) * | 2009-11-05 | 2011-06-16 | Hoffmann La Roche | Glycosylated repeat-motif-molecule conjugates |
US8710016B2 (en) | 2009-11-17 | 2014-04-29 | Acceleron Pharma, Inc. | ActRIIB proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy |
JP6141018B2 (ja) | 2009-12-24 | 2017-06-07 | バイオマリン テクノロジーズ ベー.フェー. | 炎症性障害を治療するための分子 |
JP2013535981A (ja) | 2010-08-20 | 2013-09-19 | ワイス・エルエルシー | 成長因子不含適合細胞の細胞培養 |
WO2012064771A1 (en) | 2010-11-08 | 2012-05-18 | Acceleron Pharma, Inc. | Actriia binding agents and uses thereof |
HUE045943T2 (hu) | 2011-03-31 | 2020-02-28 | Adc Therapeutics Sa | Veseasszociált antigén 1 és antigénkötõ fragmensei elleni antitestek |
US20140322758A1 (en) | 2011-10-21 | 2014-10-30 | Pfizer Inc. | Addition of iron to improve cell culture |
AU2013209234B2 (en) | 2012-01-09 | 2017-11-09 | Adc Therapeutics Sa | Method for treating breast cancer |
CA2862628C (en) | 2012-01-27 | 2021-08-24 | Prosensa Technologies B.V. | Rna modulating oligonucleotides with improved characteristics for the treatment of duchenne and becker muscular dystrophy |
US9550819B2 (en) | 2012-03-27 | 2017-01-24 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders |
AU2013204740C1 (en) | 2012-05-10 | 2015-10-01 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd | Methods of treating cancer using angiogenin or an angiogenin agonist |
WO2014000042A1 (en) * | 2012-06-27 | 2014-01-03 | Prince Henry's Institute Of Medical Research | COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODIFYING TGF-β FAMILY LIGANDS |
PL2880053T3 (pl) | 2012-08-01 | 2021-01-11 | Ikaika Therapeutics, Llc | Łagodzenie uszkodzenia tkanek i włóknienia przez przeciwciało przeciwko ltbp4 |
WO2014062535A1 (en) | 2012-10-15 | 2014-04-24 | Bristol-Myers Squibb Company | Mammalian cell culture processes for protein production |
CN112957462A (zh) | 2012-10-24 | 2021-06-15 | 细胞基因公司 | 用于治疗贫血的方法 |
AU2013334659B2 (en) * | 2012-10-24 | 2019-07-11 | Celgene Corporation | Biomarker for use in treating anemia |
KR102279522B1 (ko) | 2012-11-02 | 2021-07-19 | 셀진 코포레이션 | 골 및 다른 장애를 치료하기 위한 액티빈-actrii 길항제 및 용도 |
US9161966B2 (en) | 2013-01-30 | 2015-10-20 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | GDF15 mutein polypeptides |
JP6272907B2 (ja) | 2013-01-30 | 2018-01-31 | エヌジーエム バイオファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 代謝障害の処置における組成物及び使用方法 |
WO2014119753A1 (ja) * | 2013-01-31 | 2014-08-07 | 学校法人 東京薬科大学 | マイオスタチン阻害ペプチド |
US10092627B2 (en) | 2013-04-08 | 2018-10-09 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for rejuvenating skeletal muscle stem cells |
US20160220640A1 (en) * | 2013-06-11 | 2016-08-04 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and compositions for increasing neurogenesis and angiogenesis |
NZ754961A (en) * | 2013-07-31 | 2022-04-29 | Amgen Inc | Growth differentiation factor 15 (gdf-15) constructs |
CN104725513A (zh) * | 2013-12-20 | 2015-06-24 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 融合蛋白及其在治疗多发性硬化中的用途 |
TN2016000553A1 (en) | 2014-06-13 | 2018-04-04 | Acceleron Pharma Inc | Methods and compositions for treating ulcers |
JP6704358B2 (ja) | 2014-07-30 | 2020-06-03 | エヌジーエム バイオファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 代謝障害を治療するための組成物および使用方法 |
MA41052A (fr) | 2014-10-09 | 2017-08-15 | Celgene Corp | Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii |
US9920118B2 (en) | 2014-10-31 | 2018-03-20 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods of use for treating metabolic disorders |
RS64214B1 (sr) | 2014-12-03 | 2023-06-30 | Celgene Corp | Antagonisti aktivin-actrii i njihova primena u lečenju mijelodisplastičnog sindroma |
CA3010799A1 (en) * | 2016-01-06 | 2017-07-13 | President And Fellows Of Harvard College | Treatment with gdf11 prevents weight gain, improves glucose tolerance and reduces hepatosteatosis |
JP7021099B2 (ja) | 2016-03-31 | 2022-02-18 | エヌジーエム バイオファーマシューティカルス,インコーポレーテッド | 結合タンパク質及びその使用方法 |
AU2019406214A1 (en) | 2018-12-21 | 2021-08-05 | Northwestern University | Use of annexins in preventing and treating muscle membrane injury |
US20220062299A1 (en) | 2018-12-26 | 2022-03-03 | Northwestern University | Use of glucocorticoid steroids in preventing and treating conditions of muscle wasting, aging and metabolic disorder |
Family Cites Families (91)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
EP0105014B1 (en) | 1982-09-24 | 1992-05-20 | THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce | Repair of tissue in animals |
US4588684A (en) | 1983-04-26 | 1986-05-13 | Chiron Corporation | a-Factor and its processing signals |
NZ210699A (en) | 1984-01-04 | 1989-06-28 | Int Genetic Eng | Isolation of an osteogenic protein of the p3 immunologically related family |
ZA848495B (en) | 1984-01-31 | 1985-09-25 | Idaho Res Found | Production of polypeptides in insect cells |
CA1341617C (en) * | 1984-06-08 | 2011-06-28 | Henry George Burger | Inhibin isolated from ovarian follicular fluid |
WO1986000639A1 (en) | 1984-07-06 | 1986-01-30 | Sandoz Ag | Lymphokine production and purification |
EP0169016B2 (en) | 1984-07-16 | 2004-04-28 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Polypeptide cartilage-inducing factors found in bone |
US4740587A (en) | 1985-07-18 | 1988-04-26 | The Salk Institute For Biological Studies | Inhibin and method of purifying same |
US4798885A (en) * | 1986-02-07 | 1989-01-17 | Genentech, Inc. | Compositions of hormonally active human and porcine inhibin containing an α chain and 62 chain |
US5089396A (en) * | 1985-10-03 | 1992-02-18 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
NZ231899A (en) | 1985-10-03 | 1991-07-26 | Genentech Inc | Human or porcine inhibin peptide compositions and dna encoding them |
US5215893A (en) * | 1985-10-03 | 1993-06-01 | Genentech, Inc. | Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid |
US4737578A (en) * | 1986-02-10 | 1988-04-12 | The Salk Institute For Biological Studies | Human inhibin |
US5013649A (en) * | 1986-07-01 | 1991-05-07 | Genetics Institute, Inc. | DNA sequences encoding osteoinductive products |
IL83003A (en) | 1986-07-01 | 1995-07-31 | Genetics Inst | Factors that soak bone formation |
US5106748A (en) * | 1986-07-01 | 1992-04-21 | Genetics Institute, Inc. | Dna sequences encoding 5 proteins |
ZA874681B (en) * | 1986-07-01 | 1988-04-27 | Genetics Inst | Novel osteoinductive factors |
US5187076A (en) * | 1986-07-01 | 1993-02-16 | Genetics Institute, Inc. | DNA sequences encoding BMP-6 proteins |
US5041538A (en) * | 1987-08-28 | 1991-08-20 | The Salk Institute For Biological Studies | Mammalian follistatin |
WO1989010409A1 (en) | 1988-04-08 | 1989-11-02 | Genetics Institute, Inc. | Bone and cartilage inductive compositions |
US5071834A (en) * | 1988-09-16 | 1991-12-10 | Genentech, Inc. | Purified activin B composition |
ATE162223T1 (de) | 1989-03-28 | 1998-01-15 | Genetics Inst | Osteoinduktive zusammensetzungen |
EP0394827A1 (en) * | 1989-04-26 | 1990-10-31 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Chimaeric CD4-immunoglobulin polypeptides |
CA2020729A1 (en) | 1989-07-19 | 1991-01-20 | Michael C. Kiefer | Bone morphogenetic protein |
US5194596A (en) * | 1989-07-27 | 1993-03-16 | California Biotechnology Inc. | Production of vascular endothelial cell growth factor |
US5350836A (en) * | 1989-10-12 | 1994-09-27 | Ohio University | Growth hormone antagonists |
US5116944A (en) * | 1989-12-29 | 1992-05-26 | Neorx Corporation | Conjugates having improved characteristics for in vivo administration |
US5166190A (en) | 1990-01-08 | 1992-11-24 | Genentech, Inc. | Method for increasing fertility in males |
DE69132823T2 (de) | 1990-05-16 | 2002-07-18 | Genetics Inst | Knochen- und knorpel-bildung hervorrufende proteine |
EP0550625B1 (en) | 1990-09-26 | 2003-11-05 | Genetics Institute, LLC | Bmp-5 derivatives |
CA2071912C (en) | 1990-11-30 | 2002-10-15 | Hanne Bentz | Use of a bone morphogenetic protein in synergistic combination with tgf-beta for bone repair |
US5208219A (en) | 1991-02-14 | 1993-05-04 | Celtrix Pharmaceuticals Inc. | Method for inducing bone growth |
AU662155B2 (en) | 1991-05-10 | 1995-08-24 | Celtrix Pharmaceuticals, Inc. | Targeted delivery of bone growth factors |
US6162896A (en) | 1991-05-10 | 2000-12-19 | The Salk Institute For Biological Studies | Recombinant vertebrate activin receptors |
CA2108770C (en) | 1991-06-25 | 2007-04-03 | John M. Wozney | Bmp-9 compositions |
DE69226871T3 (de) * | 1991-06-27 | 2009-09-24 | Bristol-Myers Squibb Co. | CTL4A-Rezeptor, ihn enthaltenden Fusionsproteine und deren Verwendung |
US5171579A (en) * | 1991-10-11 | 1992-12-15 | Genetics Institute, Inc. | Formulations of blood clot-polymer matrix for delivery of osteogenic proteins |
WO1993009229A1 (en) * | 1991-11-04 | 1993-05-13 | Genetics Institute, Inc. | Recombinant bone morphogenetic protein heterodimers, compositions and methods of use |
DK0653942T3 (da) | 1992-07-31 | 2003-10-20 | Curis Inc | Morphogen-induceret nerve-regenerering og -reparation |
US6465239B1 (en) * | 1993-03-19 | 2002-10-15 | The John Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptides from aquatic species and non-human transgenic aquatic species |
US20030074680A1 (en) * | 1993-03-19 | 2003-04-17 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor-8 |
CA2157577C (en) | 1993-03-19 | 2009-11-17 | Se-Jin Lee | Growth differentiation factor-8 |
US7393682B1 (en) * | 1993-03-19 | 2008-07-01 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides |
US5994618A (en) | 1997-02-05 | 1999-11-30 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor-8 transgenic mice |
US6673534B1 (en) * | 1995-10-26 | 2004-01-06 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods for detection of mutations in myostatin variants |
US6607884B1 (en) * | 1993-03-19 | 2003-08-19 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods of detecting growth differentiation factor-8 |
EP1378572B1 (en) | 1993-05-12 | 2006-10-25 | Genetics Institute, LLC | Bmp-11 compositions |
DE69434739T2 (de) | 1993-08-26 | 2007-05-10 | Genetics Institute, LLC, Cambridge | Menschliche Knochen-morphogenetische Proteine zur Verwendung bei neuronaler Rehgeneration |
US7332575B2 (en) * | 1994-03-18 | 2008-02-19 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptide from aquatic species, and transgenic aquatic species |
US5914234A (en) | 1994-07-08 | 1999-06-22 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods of detecting growth differentiation factor-11 |
US6008434A (en) | 1994-07-08 | 1999-12-28 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor-11 transgenic mice |
US5466190A (en) * | 1994-07-25 | 1995-11-14 | Deere & Company | Precleaner for a cleaning shoe |
US5545616A (en) * | 1994-09-22 | 1996-08-13 | Genentech, Inc. | Method for predicting and/or preventing preterm labor |
JPH10262688A (ja) * | 1994-11-30 | 1998-10-06 | Univ Rockefeller | 体重のモジュレーター、対応する核酸およびタンパク質、ならびにそれらの診断および治療用途 |
US5723125A (en) * | 1995-12-28 | 1998-03-03 | Tanox Biosystems, Inc. | Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide |
CA2249596C (en) | 1996-03-22 | 2011-11-08 | Creative Biomolecules, Inc. | Methods for enhancing functional recovery following central nervous system ischemia or trauma |
US6696557B1 (en) * | 1996-04-19 | 2004-02-24 | Genentech, Inc. | AL-2 neurotrophic factor nucleic acid |
AR008077A1 (es) * | 1996-07-26 | 1999-12-09 | Talarico Salinas Laura Beatriz | Un polipeptido de fusion o una sal del mismo, su uso, un proceso para prepararlos, una composicion farmaceutica que los comprende, y un vector. |
AU6274298A (en) | 1997-02-05 | 1998-08-25 | Johns Hopkins University School Of Medicine, The | Growth differentiation factor-8 |
EP1002068B1 (en) * | 1997-07-14 | 2009-09-09 | University of Liège | Mutations in the myostatin gene cause double-muscling in mammals |
US6656475B1 (en) | 1997-08-01 | 2003-12-02 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same |
US6891082B2 (en) * | 1997-08-01 | 2005-05-10 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor |
US6696260B1 (en) | 1997-08-01 | 2004-02-24 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Methods to identify growth differentiation factor (GDF) binding proteins |
AU8666398A (en) | 1997-08-01 | 1999-02-22 | Johns Hopkins University School Of Medicine, The | Methods to identify growth differentiation factor (gdf) receptors |
GB2345397B (en) * | 1997-08-19 | 2001-10-31 | Citizen Watch Co Ltd | Piezoelectric vibrator |
JP2001513982A (ja) | 1997-08-29 | 2001-09-11 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ, インコーポレイテッド | フォリスタチン−3 |
AU1276399A (en) * | 1997-11-07 | 1999-05-31 | Genetics Institute Inc. | Neuronal uses of bmp-11 |
AU1390999A (en) | 1997-11-10 | 1999-05-31 | Johns Hopkins University School Of Medicine, The | Methods for detection of mutations in myostatin variants |
CA2319703C (en) | 1998-02-05 | 2005-09-20 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Growth differentiation factor-8 |
US6369201B1 (en) | 1998-02-19 | 2002-04-09 | Metamorphix International, Inc. | Myostatin multimers |
US6004937A (en) | 1998-03-09 | 1999-12-21 | Genetics Institute, Inc. | Use of follistatin to modulate growth and differentiation factor 8 [GDF-8] and bone morphogenic protein 11 [BMP-11] |
WO1999056768A1 (en) | 1998-05-06 | 1999-11-11 | Metamorphix, Inc. | Methods for treating diabetes by inhibiting gdf-8 |
WO2000011163A1 (en) * | 1998-08-20 | 2000-03-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Dcr5, a bmp-binding protein, and applications thereof |
DE60027135T2 (de) | 1999-01-21 | 2007-01-11 | Metamorphix, Inc. | Inhibitoren für wachstumdifferenzierungsfaktor und ihre anwendungen |
WO2000073337A1 (en) * | 1999-06-01 | 2000-12-07 | Biogen, Inc. | Polymer conjugates of hedgehog proteins and uses |
KR100750695B1 (ko) | 1999-07-20 | 2007-08-22 | 파멕사 에이/에스 | Gdf-8 활성을 하향-조절하는 방법 |
AU2001241817A1 (en) | 2000-02-29 | 2001-09-12 | Zymogenetics Inc. | Kunitz domain polypeptide zkun8 |
US7037501B2 (en) * | 2001-01-04 | 2006-05-02 | Regents Of The University Of Minnesota | Myostatin immnoconjugate |
TW200526779A (en) * | 2001-02-08 | 2005-08-16 | Wyeth Corp | Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof |
US7320789B2 (en) | 2001-09-26 | 2008-01-22 | Wyeth | Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof |
PL350983A1 (en) * | 2001-11-30 | 2003-06-02 | Advanced Digital Broadcast Ltd | Method of scanning a high-frequency signal band and apparatus therefor |
US7572763B2 (en) | 2002-02-21 | 2009-08-11 | Wyeth | Follistatin domain containing proteins |
EP1572909A4 (en) | 2002-02-21 | 2007-06-06 | Wyeth Corp | PROTEIN CONTAINING A DOMAINE OF FOLLISTATIN |
DE60331778D1 (de) | 2002-09-16 | 2010-04-29 | Univ Johns Hopkins | Metalloproteaseaktivierung von myostatin und verfahren zur modulation der myostatinaktivität |
AR047392A1 (es) | 2002-10-22 | 2006-01-18 | Wyeth Corp | Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines |
US20040223966A1 (en) | 2002-10-25 | 2004-11-11 | Wolfman Neil M. | ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor |
KR101304718B1 (ko) | 2002-12-20 | 2013-09-05 | 암겐 인코포레이티드 | 미오스타틴을 저해하는 결합제 |
UA85055C2 (ru) | 2003-06-02 | 2008-12-25 | Уайт | Применение ингибиторов миостатика (gdf8) в сочетании с кортикостероидами для лечения нервно-мышечных заболеваний |
MX2007011405A (es) | 2005-03-23 | 2007-10-11 | Wyeth Corp | Deteccion de una respuesta inmune para agentes moduladores de crecimiento y la diferenciacion del factor 8 (gdf 8). |
JP2008537488A (ja) | 2005-03-23 | 2008-09-18 | ワイス | Gdf−8モジュレート物質の検出 |
-
2002
- 2002-02-07 TW TW094108366A patent/TW200526779A/zh unknown
- 2002-02-07 TW TW091102268A patent/TWI329129B/zh not_active IP Right Cessation
- 2002-02-08 US US10/071,499 patent/US7202210B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-08 ZA ZA200508954A patent/ZA200508954B/en unknown
- 2002-02-08 SG SG2010040194A patent/SG187989A1/en unknown
- 2002-02-08 NZ NZ527286A patent/NZ527286A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-02-08 ES ES02709366T patent/ES2284828T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-08 AR ARP020100421A patent/AR032567A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-02-08 WO PCT/US2002/003467 patent/WO2002068650A2/en active IP Right Grant
- 2002-02-08 JP JP2002568744A patent/JP4280071B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-08 CA CA002437218A patent/CA2437218A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-08 CA CA002674673A patent/CA2674673A1/en not_active Abandoned
- 2002-02-08 PT PT02709366T patent/PT1397492E/pt unknown
- 2002-02-08 BR BR0207110-0A patent/BR0207110A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-02-08 PL PL390369A patent/PL212078B1/pl unknown
- 2002-02-08 SG SG200506783-0A patent/SG165982A1/en unknown
- 2002-02-08 AT AT02709366T patent/ATE357519T1/de active
- 2002-02-08 DE DE60219006T patent/DE60219006T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-08 MX MXPA03007063A patent/MXPA03007063A/es active IP Right Grant
- 2002-02-08 NZ NZ550297A patent/NZ550297A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-02-08 EP EP02709366A patent/EP1397492B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-08 AU AU2002243852A patent/AU2002243852B2/en not_active Ceased
- 2002-02-08 DK DK02709366T patent/DK1397492T3/da active
- 2002-02-08 PL PL372888A patent/PL207202B1/pl unknown
-
2003
- 2003-08-04 NO NO20033456A patent/NO333427B1/no not_active IP Right Cessation
- 2003-08-06 ZA ZA200306064A patent/ZA200306064B/en unknown
-
2004
- 2004-07-08 HK HK04104973A patent/HK1062457A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-07-19 JP JP2005209321A patent/JP2006001938A/ja not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-12-21 US US11/614,702 patent/US7737116B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-12-21 US US11/614,594 patent/US7560441B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-05-29 CY CY20071100719T patent/CY1106629T1/el unknown
-
2008
- 2008-11-21 JP JP2008298812A patent/JP5013618B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-03-18 CL CL2009000648A patent/CL2009000648A1/es unknown
- 2009-05-04 US US12/434,758 patent/US8222384B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-06-14 US US13/523,391 patent/US8710025B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-09-19 US US14/032,079 patent/US20140228289A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO333427B1 (no) | Modifiserte GDF-8-propeptider, fremgangsmate for fremstilling og anvendelse derav, nukleinsyremolekyl kodende for modifisert GDF-8-propeptid, samt farmasoytisk preparat | |
AU2002243852A1 (en) | Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof | |
JP2020158546A (ja) | 筋ジストロフィー治療のためのユートロフィン誘導に関するactriibタンパク質およびその改変体およびその使用 | |
JP2020073604A (ja) | ActRII受容体ポリペプチド、方法、および組成物 | |
CN105884880B (zh) | 由actriib衍生的变体及其用途 | |
MXPA05004224A (es) | Polipeptidos de fusion de actriib, y sus usos. | |
NO336528B1 (no) | Antistoffinhibitorer av GDF-8 og anvendelse derav | |
EP1790726B1 (en) | Modified and stabilized GDF propeptides and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |