JP6141018B2 - 炎症性障害を治療するための分子 - Google Patents

Description

本発明は、炎症性障害を治療することができる２種のオリゴヌクレオチド：Ｃ５ａの量を減らすための、Ｃ５をコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを変化させることができる分子、および可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの量を増やすための、ＩＬ−１ＲＡｃＰをコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを変化させることができる分子を提供する。本発明は、さらに、炎症性障害を予防または治療するための前記分子の使用を提供する。

リウマチ様関節炎（ＲＡ）および皮膚炎を含む多数の炎症性疾患において、過剰且つ不適切な補体活性化並びにＩＬ−１の過剰な血漿濃度が生じる。

補体系は先天的免疫系の一部であり、バクテリアのような微生物およびその他の異質で異常な細胞（例えばアポトーシス細胞）から宿主を保護するように作用する。しかしながら、本来保護的な補体活性化は、宿主に損傷をもたらす場合もある。補体系の５番目成分であるＣ５は、１６７９アミノ酸から成る糖タンパク質であり、２つのジスルフィド結合を有したポリペプチド鎖Ｃ５αおよびＣ５βから成る（２）。免疫複合体（ＩＣ）によって活性化されたＣ５転換酵素による活性化の後、Ｃ５はＣ５ａとＣ５ｂとに分割される。Ｃ５ａは、炎症をもたらす強力な生物学的活性を示す（１）（３）。それは、好中球、好酸球、単球およびＴリンパ球といった炎症細胞の動員、食細胞の活性化並びに顆粒ベースの酵素の放出およびオキシダントの生成の誘導に関与する強力な誘引剤であり、全ての機構は、先天的免疫機能だけでなく、組織のダメージにも寄与する可能性がある。過度の補体活性化は、高い血漿濃度のＣ５ａをもたらし、敗血症、成人型呼吸窮迫症候群、リウマチ様関節炎、アルツハイマー病（４）および虚血性心疾患を含む多くの臨床症状に関与することが知られている。

Ｃ５ｂは、他方、その多数の結合部位を通じて、細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）の組み立てを開始させ、それを誘導する。Ｃ５ｂは、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９（Ｃ５ｂ−９として知られている）の組み立てのためのアンカーとして作用し、病原体の細胞膜に挿入され、細胞溶解をもたらす。

したがって、Ｃ５ａを特異的に標的化でき、Ｃ５ｂを標的化しない薬剤のニーズが存在する。抗Ｃ５モノクローナル抗体は、治療における使用のために開発された。この抗体は、コラーゲンに誘導される関節炎を予防し、確立された疾病を改善する（５）（６）。しかしながら、この抗体は、Ｃ５ａおよびＣ５ｂの両方をブロックし、ＭＡＣの形成に必要なＣ５ｂ濃度の減少がこの抗体の欠点である。

それゆえ、Ｃ５ａのみを標的化し、Ｃ５ｂをそのままに維持する、より特異的な治療のニーズがなおも存在する。ここに実証されるように、オリゴヌクレオチドベースの治療は、Ｃ５ａを特異的に標的化する一方で、ＭＡＣの形成に関するＣ５ｂの機能を損なわないと想定される。

炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン１（ＩＬ−１）は、広く様々な標的細胞に対する局所的および全身的効果を制御する重要な介在物質であり、それゆえ、免疫および炎症を制御する（７）。これは、好中球の動員、マクロファージの活性化ならびにＴおよびＢ細胞の刺激によって炎症を仲介する。

ＩＬ−１はＩＬ−１受容体タイプＩ（ＩＬ−１ＲＩ）に結合し、ＩＬ−１受容体アクセサリータンパク質（ＩＬ−１ＲＡｃＰ）の動員をもたらす（８）。ＩＬ−１ＲＡｃＰは、リガンドを認識しないものの、ＩＬ−１ＲＩに結合するＩＬ−１を安定させる。更に、ＩＬ−１ＲＡｃＰは、この複合体における重大な補助受容体であり、ＭｙＤ８８といった細胞内アダプタータンパク質およびＩＬ−１Ｒ関連キナーゼといったキナーゼの動員および結合を可能にし、究極的にＮＦ−κＢ活性化をもたらす。ＩＬ−１ＲＡｃＰの膜貫通型の形態に加えて、３つの細胞外Ｉｇ領域および１つのユニークなＣ−ターミナルの領域を含む、より小さく可溶性のタンパク質が同定された。このｓＩＬ−１ＲＡｃＰは、主に肝臓によって生産され（２９）、全身を循環する。ＩＬ−１受容体ファミリーのもう１つのメンバーはＩＬ−１ＲＩＩであり、これも、ＩＬ−１の結合によりＩＬ−１ＲＡｃＰと会合する；しかしながら、これは情報伝達をもたらさない。したがって、この受容体は、おとり受容体と見なされ、膜貫通の形態および可溶性の形態で確認される（９）。

ＩＬ−１濃度は、リウマチ様関節炎のようなある炎症性疾患にて増加する。したがって、ＩＬ−１の濃度および活性を低下させ且つ制御することが必要である。ｓＩＬ−１ＲＡｃＰは可溶性ＩＬ−１ＲＩＩと相互作用し、高い親和性のＩＬ−１スカベンジャーを形成することができ（８）、マウスにおけるアデノウイルス発現ベクターによるｓＩＬ−１ＲＡｃＰの系統の過剰発現は、コラーゲンに誘導される関節炎（ＣＩＡ）を著しく回復させることが既に示されている（９）。したがって、循環するｓＩＬ−１ＲＡｃＰの量を増加させる薬剤のニーズが存在する。ｓＩＬ−１ＲＡｃＰのアデノウイルスの過剰発現は魅力的ではない。というのは、ウイルスベクターは安全でないとみなされており、作製も容易ではないためである。ここに実証されるように、オリゴヌクレオチドベースの治療は、そのようなウイルスベースの治療と比較して、より特異的で、より安全で、より安いと考えられる。

いくつかの治療はＲＡのような炎症性疾患を治療することが既に知られている。しかしながら、これらの治療の各々には欠点がある。したがって、既存の治療法のすべての欠点を有さない、ＲＡのような炎症性疾患のための新しい治療法を設計するニーズがなお存在する。

本発明者らは、２種の分子を設計した：１つめの種またはファミリーの分子は、Ｃ５ａのレベルを特異的に減少させることができ、第２の分子は、可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰのレベルを増大させることができる。

分子
第１の側面において、Ｃ５ａの量を減らすための、Ｃ５をコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを変化させることができるか、または変化させる分子、好ましくはオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が提供される。ここに定義された分子、好ましくはオリゴヌクレオチドは、Ｃ５ａタンパク質の量を減らすために、Ｃ５ ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを特異的に変化させることができるか、または特異的に修飾することができる。Ｃ５ ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングの前記変化は、好ましくは、ここで同定されるように、患者において、または前記患者の細胞において、または細胞株において、または無細胞インビトロ系において生じる。先に説明されるように、Ｃ５タンパク質は、Ｃ５ａおよびＣ５ｂタンパク質に切断される。

患者における、または前記患者の細胞における、または細胞株における、または無細胞インビトロ系におけるＣ５ａの生成の低下は、ｍＲＮＡのレベルで評価してよく、好ましくは、Ｃ５ａ ｍＲＮＡの初期量の９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％またはそれ以下が、ＲＴ ＰＣＲによりなおも検出できることを意味する。これに関して、Ｃ５ａ ｍＲＮＡは、Ｃ５ａタンパク質の一部をコードするＣ５の標的化エキソンを意味する。好ましくは、Ｃ５ａ ｍＲＮＡは検出されない。

患者における、または前記患者の細胞における、または細胞株における、または無細胞インビトロ系におけるＣ５ａの生成の低下は、ｍＲＮＡのレベルで評価してよく、好ましくは、Ｃ５ａの一部をコードするＣ５の標的化エキソンの初期量の９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％またはそれ以下が、ＲＴ ＰＣＲによりなおも検出できることを意味する。好ましくは、Ｃ５ａ ｍＲＮＡの一部をコードする標的化エキソンは検出されない。

患者における、または前記患者の細胞における、または細胞株における、または無細胞インビトロ系におけるＣ５ａの生成の低下は、（免疫蛍光法および／またはウエスタンブロット分析法により）タンパク質レベルとして評価してよく、好ましくは、Ｃ５ａタンパク質の初期量の９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％またはそれ以下が、免疫蛍光法またはウエスタンブロット分析法によりなおも検出できることを意味する。好ましくは、Ｃ５ａタンパク質は標的化されない。

好ましくは、個体または患者の組織または細胞において、本発明の前記分子または組成物による治療の前に前記個体または患者に存在する量との比較により、減少が評価される。あるいは、治療が局所的である場合に前記分子または組成物による治療をまだ受けていない前記個体または患者の組織または細胞を用いて比較を行うことができる。比較は、好ましくは、Ｃ５が発現または生産されるあらゆる場所において行われる。Ｃ５は、本来、任意の対象の肝臓において発現または生産されるため、前記比較は、肝細胞、および／または肝組織および／または肝臓を使用して実行することが好ましい。好ましい実施形態において、組織は肝組織であり、細胞は肝細胞である。同じことが、後に定義されるＩＬ−ＲＡｃＰに当てはまる。

好ましい実施形態において、分子、好ましくはオリゴヌクレオチドは、Ｃ５ｂの量が変化しないものである。患者における又は前記患者の細胞における又は細胞株における又は無細胞インビトロ系におけるＣ５ｂの量は、先に定義されるように、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルにて評価してよい。好ましい実施形態において、Ｃ５ｂの量は、同じ系における（患者における又は前記患者の細胞における又は細胞株における又は無細胞インビトロ系における）治療前のＣ５ｂの量と比較して変化しない。しかしながら、Ｃ５ｂの量は、治療前のＣ５ｂの初期量と比較して、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％減少してよい。好ましいアッセイは、機能的Ｃ５ｂタンパク質が製造されているかどうか評価するために設計されてよい。このアッセイは実施例の項目にて記載され、いわゆる溶血性補体アッセイである。

好ましい実施形態において、分子、好ましくはオリゴヌクレオチドは、Ｃ５をコードする前記ｍＲＮＡ前駆体のエキソン１７のスキッピングを誘導することができる。このエキソンは、スキップされることが好ましい。なぜならば、これが、アナフィラトキシンドメインを欠く非機能的切断型Ｃ５ａタンパク質の製造をもたらすためである。前記切断型且つ非機能的Ｃ５ａタンパク質は、ユビキチン−プロテアソーム系によって分解されると予想される。あるいは、未成熟な停止コドンがＣ５遺伝子に導入された場合、これは、Ｃ５ａの残りの部分のナンセンス介在崩壊をもたらすだろう。

さらなる側面において、可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの量を増やすための、ＩＬ−１ＲＡｃＰをコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを変化させることができる分子、好ましくはオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が提供される。ここに定義された分子、好ましくはオリゴヌクレオチドは、可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの量を増やすために、ＩＬ−１ＲＡｃＰをコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを特異的に変化させまたは改変することができる。ＩＬ−１ＲＡｃＰｍＲＮＡ前駆体のスプライシングの前記変化は、好ましくは、ここに同定されるような患者において又は前記患者の細胞において又は細胞株において又は無細胞インビトロ系において生じる。

本発明に関して、可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰは、好ましくは、前記ＩＬ−１ＲＡｃＰの分泌型を意味する。分泌型または可溶性タンパク質とは、前記タンパク質が細胞膜に結合していないことを意味する。したがって、当業者に既知の従来のアッセイを用いて細胞膜と相互作用していないと細胞画分において検出される場合、ＩＬ−１ＲＡｃＰは前記可溶性または分泌型であるだろう。そのような細胞画分の例は、細胞上清または血清である。従来のアッセイの例は、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット法である。

分泌型または可溶性タンパク質は、タンパク質の膜結合形態に相対するものとして定義される。膜結合形態タンパク質は、膜の両側にアミノ酸を有しつつ、細胞膜にまたがるアミノ酸配列を有するタンパク質である。したがって、当業者に既知の従来のアッセイを使用して細胞膜と相互作用していると細胞画分において検出される場合、タンパク質は前記膜結合型であるだろう。そのような細胞画分の例は、膜結合タンパク質を含む細胞抽出物である。そのような抽出物は、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０を使用して用意してよい。従来のアッセイの例は、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット法である。

患者における又は前記患者の細胞における又は細胞株における又は無細胞インビトロ系における可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの生産の増大は、ｍＲＮＡレベルによって評価してよく、好ましくは、前記ｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲを用いて検出できる。

患者における又は前記患者の細胞における又は細胞株における又は無細胞インビトロ系における可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの製造の増加は、（免疫蛍光法および／またはウエスタンブロット分析および／またはＥＬＩＳＡによって）タンパク質レベルにて評価してよく、好ましくは、前記タンパク質が検出される。

可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質の製造の評価（タンパク質またはｍＲＮＡの評価）の代わりに、またはそれとの組み合わせで、非結合型または遊離型または可溶性ＩＬ−１の存在を評価してもよい。好ましい実施形態において、非結合型または遊離型ＩＬ−１の量を減少させて、それによりその生物学的活性を低下させるための、ＩＬ−１ＲＡｃＰをコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを変化させることができるオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が提供される。

本発明に関して、非結合型または遊離型ＩＬ−１は、好ましくは、タンパク質に結合しないＩＬ−１を意味する。したがって、当業者に既知の従来のアッセイを使用して、細胞画分において、細胞膜と相互作用しないか、またはタンパク質もしくはタンパク質複合体と相互作用しないと検出できる場合、またはそのように検出された場合、ＩＬ−１は前記遊離型であるだろう。そのような細胞画分の例は細胞上清または血清である。従来のアッセイの例は、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット法である。

患者における又は前記患者の細胞における又は細胞株における又は無細胞インビトロ系における可溶性または遊離型または非結合型ＩＬ−１の量の減少は、（免疫蛍光法および／またはウエスタンブロット分析および／またはＥＬＩＳＡによって）タンパク質レベルにて評価してよく、好ましくは、遊離型ＩＬ−１は、治療前における前記遊離型ＩＬ−１の初期量と比較して１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％減少していることを意味する。ＩＬ−１の量は、実施例の記載において例示されるようにウエスタンブロット法を使用して定量してよい。

可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質の製造の評価の代わりに、またはそれとの組み合わせで、ＩＬ−１によって誘導または活性化されることが既知の分子の存在または発現レベルまたは活性化レベルを評価してよい。例えば、ＩＬ−１は、ＮＦ−κＢの活性化および／またはＩＬ−６／ＩＣＡＭ−１といった複数のケモカインの製造または放出を誘導することが既知である。したがって、可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質の製造の評価の代わりに、またはそれとの組み合わせで、ＮＦ−κＢの活性化および／またはＩＬ−６／ＩＣＡＭ−１の放出を評価してもよい。好ましい実施形態において、ＮＦ−κＢの活性化および／またはＩＬ−６／ＩＣＡＭ−１の放出を減少させる目的で、ＩＬ−１ＲＡｃＰをコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを変化させることができる、オリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が提供される。

患者における又は前記患者の細胞における又は細胞株における又は無細胞インビトロ系におけるＮＦ−κＢの活性化および／またはＩＬ−６／ＩＣＡＭ−１の放出の減少は、実施例の記載に例示されるようにタンパク質レベルにて評価してよく、好ましくは、活性化されたＮＦ−κＢおよび／または放出されたＩＬ−６／ＩＣＡＭ−１は、治療前における前記活性化されたＮＦ−κＢおよび／または放出されたＩＬ−６／ＩＣＡＭ−１の初期量と比較して、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％減少することを意味する。

好ましくは、個体または患者の組織または細胞において、本発明の前記分子または組成物による治療の前に前記個体または患者に存在する量との比較により、増大または減少が評価される。あるいは、治療が局所的である場合に前記分子または組成物による治療をまだ受けていない前記個体または患者の組織または細胞を用いて比較を行うことができる。好ましい実施形態において、Ｃ５に関する限り、ＩＬ−１ＲＡｃＰは、本来肝臓で発現されるか、または製造されるため、組織は肝組織であり、細胞は肝細胞である。

好ましい実施形態において、分子、好ましくはオリゴヌクレオチドは、ＩＬ−１ＲＡｃＰをコードするｍＲＮＡ前駆体のエキソン９のスキッピングを誘導することができる。このエキソンはスキップされることが好ましい。これは、ＩＬ−１ＲＡｃＰの膜貫通ドメインをコードするためであり、そのスキッピングはＩＬ−１ＲＡｃＰのオープンリーディングフレームを妨害しないと期待されるためである。我々は、ＩＬ−１ＲＡｃＰをコードするｍＲＮＡ前駆体のエキソン９のスキッピングは、可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの生産をもたらすと予想する。

本発明の両タイプのオリゴヌクレオチドの一般的技術情報
ここに使用されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴリボヌクレオチド（ＡＯＮとも呼ばれる）を含む。好ましい実施形態において、エキソンスキッピング技術が適用される。エキソンスキッピングは、真核細胞内で生じる本来のスプライシングプロセスを妨げる。より高等な真核生物では、細胞のＤＮＡにおけるタンパク質のための遺伝情報はエキソンにてコードされており、エキソンは、イントロン配列によって互いに分離されている。これらのイントロンは、ある場合には、非常に長い。真核生物の転写機構では、エキソンおよびイントロンの両方を含むｍＲＮＡ前駆体が作られ、一方、しばしばｍＲＮＡ前駆体の生産の際に行われるスプライシング機構では、スプライシングにより、ｍＲＮＡ前駆体に存在するエキソンが結合され、実際のコード領域が作られる。

エキソンスキッピングは、少なくとも１つのエキソンがスキップされて欠損した成熟ｍＲＮＡをもたらす。このため、前記エキソンがアミノ酸をコードした場合、エキソンスキッピングは、変化したタンパク質の発現をもたらす。エキソンスキッピングのための技術は、現在、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の使用に方向づけられている。

エキソンのスキッピングは、好ましくは、スプライスサイトまたはエキソン内部配列の一方または両方を標的化するＡＯＮの結合により誘導される。エキソン内部配列に対するオリゴヌクレオチドは、典型的に、非エキソン配列と重複しない。これは、好ましくは、少なくともこれらがイントロンに存在しない限り、スプライスサイトと重複しない。エキソン内部配列に対するオリゴヌクレオチドは、好ましくは、隣接するイントロンに相補的な配列を含まない。本発明に係るオリゴヌクレオチド、またはその機能的等価物は、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体のエキソンの包含を阻害し、前記エキソンを欠くＣ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質を製造する。

エキソンスキッピング技術は、好ましくは、Ｃ５遺伝子から製造されるｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体におけるエキソンの欠如が、非機能的Ｃ５ａタンパク質のためのコード領域をもたらし、それが分解されると予想されるように適用される。したがって、Ｃ５ｂは変わりなく生産され、理論的に、Ｃ５ａは生産されず、またはほとんど生産されず、一方、ＡＯＮが無い場合、Ｃ５ａおよびＣ５ｂは、同等の量にて生産される。

ＩＬ−１ＲＡｃＰの場合、エキソンスキッピング技術は、好ましくは、前記ｍＲＮＡからのエキソンの欠如により、膜結合形態の代わりに可溶性形態の生産されるように適用される。この文脈において、エキソンの包含の阻害とは、好ましくは、検出される全長もしくはオリジナルのＣ５ａ、または全長もしくは膜結合型ＩＬ−１ＲＡｃＰのｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の量が、前述のように減少することを意味する。

Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体のエキソンは、生産されるｍＲＮＡに唯一包含されるため、両方のスプライスサイトがスプライソソーム複合体によって認識される場合、スプライスサイトはＡＯＮにとって明確な標的である。１つの実施形態は、したがって、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体の非エキソン領域に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物を提供する。１つの実施形態において、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体の非エキソン領域にもっぱら相補的なＡＯＮが使用される。しかしながら、このことは必須ではなく、イントロン特異的配列並びにエキソン特異的配列を含むＡＯＮを使用することも可能である。そのようなＡＯＮは、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体の非エキソン領域に相補的な配列、並びに、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体のエキソン領域に相補的な配列を含む。当然、ＡＯＮは、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰエキソンまたはイントロンの完全な配列に必ずしも相補的ではない。エキソンまたはイントロンの一部に相補的なＡＯＮが好ましい。ＡＯＮは、好ましくはＣ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰエキソンおよび／またはイントロンの少なくとも一部に相補的であり、前記一部は少なくとも８、９、１０，１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチドまたはそれ以上のヌクレオチドを有する。

Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングは、２つの連続したエステル転移反応により生じる。第１に、スプライソソームアッセンブリーの際に定義されるイントロン内の特異的な枝分かれ部位ヌクレオチドの２’ＯＨは、５’スプライスサイトにおけるイントロンの第１のヌクレオチドに対して求核攻撃を行い、ラリアット中間産物を形成する。第２に、放出された５’エキソンの３’ＯＨは、次に、３’スプライスサイトにおけるイントロンの最後のヌクレオチドにおいて求核攻撃を行い、エキソンを繋ぎ、イントロンラリアットを放出する。イントロンの枝分かれ部位およびスプライスサイトは、したがって、スプライシング現象に関与する。それゆえ、そのような枝分かれ部位および／またはスプライスサイトに相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドは、好ましくはエキソンスキッピングに使用される。さらに、したがって、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体のスプライスサイトおよび／または枝分かれ部位に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が提供される。

スプライスサイトはコンセンサス配列を含むため、スプライスサイトに相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物（ここではＡＯＮとも呼ばれる）の使用は、乱雑なハイブリダイゼーションの危険を伴う。スキップされるエキソンの部位以外のスプライスサイトへのＡＯＮのハイブリダイゼーションは、容易にスプライシングプロセスの精度を妨害し得る。これらの問題およびイントロン配列に相補的なＡＯＮの使用に関係するその他の潜在的な問題を克服するために、１つの好ましい実施形態として、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体エキソンに相補的の配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が提供される。好ましくは、前記ＡＯＮは、前記ｍＲＮＡ前駆体中の少なくとも１つのエキソンのエキソン包含シグナルを特異的に阻害することができる。エキソン包含シグナル（ＥＩＳ）を妨害することは、そのような要素がエキソン内に位置しているという長所を持つ。スキップされるエキソンの内部についてのＡＯＮを供給することによって、エキソン包含シグナルを妨害し、これにより、スプライシング装置からエキソンを効果的に覆うことを可能にする。スプライシング装置のスキップされるエキソンの認識の失敗は、最終的なｍＲＮＡからのエキソンの排除をもたらす。この実施形態は、スプライシング機構の酵素的プロセス（エキソンの結合）を直接妨害しない。このことは、方法をより特異的でおよび／または信頼できるものにすると考えられる。ＥＩＳは、スプライスアクセプターおよびドナーに特定の空間的構造をとらせるエキソンの特別な構造であると考えられる。この概念では、特定の空間的構造が、スプライシング機構によるエキソンの認識を可能にする。しかしながら、本発明は、必ずしもこのモデルに限定されない。好ましい実施形態において、エキソンに結合することができ、ＥＩＳを阻害することができるオリゴヌクレオチドが利用される。ＡＯＮは、任意のポイントで特異的に前記エキソンに接触してよく、それでもなお、特異的に前記ＥＩＳを阻害することができる。

本発明に関して、この分子が、ここに同定されるような細胞、組織または個体において、Ｃ５ａの量を減少させるために、Ｃ５をコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングの変更が可能であるか、またはそのように変更する限り、あるいは、可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの量を増加させるために、ＩＬ−１ＲＡｃＰをコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングの変更が可能であるか、またはそのように変更する限り、分子は任意のタイプの分子を意味してよい。前記分子は、したがって、エキソン、Ｃ５ａの場合好ましくはエキソン１７、または、ＩＬ−１ＲＡｃＰの場合エキソン９を欠いたｍＲＮＡの製造を誘導し、対応するｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを変更することによって、タンパク質またはタンパク質アイソフォーム、すなわち、ここに同定されるような非機能的Ｃ５ａタンパク質またはここに同定されるような可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質を生産することができる。したがって、好ましい実施形態において、タンパク質は前記ｍＲＮＡから形成されるか、または生産されるため、前記分子は対応するｍＲＮＡの翻訳を阻止しない。好ましくは、前記分子は、オリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物である。オリゴヌクレオチドの機能的等価物は、好ましくは、ここに定義されたオリゴヌクレオチドを意味し、ここにおいて、１以上のヌクレオチドが置換され、前記機能的等価物の活性は、少なくともある程度まで保持される。好ましくは、前記機能的等価物の活性は、Ｃ５ａの検出可能な減少を提供し、または可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの検出可能な製造を提供する。前記機能的等価物の前記活性は、したがって、好ましくは、Ｃ５ａまたは可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質の量の定量によって、または対応するｍＲＮＡの量の定量によって評価される。オリゴヌクレオチドの前記活性の評価は、好ましくは、ＲＴ−ＰＣＲ（ｍ−ＲＮＡ）によって、または免疫蛍光法もしくはウエスタンブロット分析（タンパク質）によって行われる。前記活性は、好ましくは、機能的等価物の由来となる前記オリゴヌクレオチドの対応する活性の少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％またはそれ以上を示した場合に、少なくともある程度まで保持されている。そのような活性は、機能的等価物の由来となる前記オリゴヌクレオチドの対応するオリゴヌクレオチドの活性と比較して、肝組織において、または個体の肝細胞において、またはインビトロの細胞において測定してよい。本願を通じて、オリゴヌクレオチドという用語が使用される場合、それはここに定義されるようなその機能的等価物と置き換えてもよい。

したがって、好ましくは治療結果を提供するＣ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体のエキソンに相補的な配列またはそれに結合する配列を含むか、またはそれから成るオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が提供される。１つの好ましい実施形態において、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体エキソンの連続したストレッチまたはその少なくとも一部に相補的な配列または結合する配列を含むか、またはそれから成るオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が使用され、前記部分は、少なくとも８ヌクレオチドを有するか、またはそれを含む。しかしながら、前記部分は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ヌクレオチドを有してよい。オリゴヌクレオチドが相補的となるＣ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体のエキソンの一部は、前記ｍＲＮＡ前駆体の連続したストレッチと呼ばれてよい。マウスまたはヒトＣ５について、好ましい連続したストレッチは、ｍＲＮＡ前駆体エキソン１７のストレッチであり、より好ましくは前記エキソンの３’末端に近いｍＲＮＡ前駆体エキソン１７のストレッチである。この文脈において、「近い」とは、前記エキソンの３’末端から１ヌクレオチドであるか、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２ヌクレオチドであることを意味してよい。エキソン１７のマウスおよびヒトｍＲＮＡ前駆体配列は、それぞれ、配列番号１および２に示される。したがって、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１または２の少なくとも８ヌクレオチドのストレッチに相補的であるか、またはそれに結合する。

あるいは、オリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物は、Ｃ５ｍＲＮＡ前駆体のイントロン１７に相補的な配列またはそれに結合する配列を含むか、またはそれから成る。イントロン１７のマウスおよびヒトｍＲＮＡ前駆体配列は、それぞれ、配列番号３および４に示される。したがって、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号３または４の少なくとも８ヌクレオチドのストレッチに相補的であるか、またはそれに結合する。

「Ｃ５ ｍＲＮＡ前駆体のエキソンまたはイントロンに結合する」という表現は、この文脈において、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、患者における、または前記患者の細胞における、または細胞株におけるＣ５ａの生産を減少させることができる。この文脈におけるＣ５ａは、Ｃ５ａタンパク質を意味してよい。「ＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体のエキソンまたはイントロンに結合する」という表現は、この文脈において、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの量を増やすために、ＩＬ−１ＲＡｃＰをコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを変化させることができるか、または無細胞インビトロ系において、ｍＲＮＡレベルにて評価してよいことを意味する。マウスＣ５の好ましいｍＲＮＡ配列は、配列番号７に示される。ヒトＣ５の好ましいｍＲＮＡ配列は、配列番号８に示される。マウスのＩＬ−１ＲＡｃＰの好ましいｍＲＮＡ配列は、配列番号９に示される。ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰの好ましいｍＲＮＡ配列は、配列番号１０に示される。

マウスまたはヒトＩＬ−１ＲＡｃＰについて、好ましい連続したストレッチは、好ましくはＥＳＥ部位を含む、より好ましくはエキソン９の５’末端に近いＥＳＥ部位を含む、ｍＲＮＡ前駆体エキソン９のストレッチである。この文脈において、「近い」とは、前記ｍＲＮＡ前駆体エキソンの５’末端から１ヌクレオチドであるか、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２ヌクレオチドであることを意味してよい。

マウスまたはヒトＩＬ−１ＲＡｃＰについて、別の好ましい連続したストレッチは、ＥＳＥ部位を含むおよび／またはエキソン９の３’末端に近いｍＲＮＡ前駆体エキソン９のストレッチである。さらにより好ましくは、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰについて、連続したストレッチは、ＥＳＥ部位を含むおよび／またはエキソン９の３’末端に近いｍＲＮＡ前駆体エキソン９のストレッチである。この文脈において、「近い」とは、前記ｍＲＮＡ前駆体エキソンの３’末端からの１ヌクレオチドであるか、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２ヌクレオチドであることを意味してよい。ｍＲＮＡ前駆体エキソン９のマウスおよびヒト配列は、配列番号５および６に示される。したがって、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号５または６の少なくとも８ヌクレオチドのストレッチに相補的であるか、または結合する。

あるいは、オリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物は、ＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体のヒトイントロン８または９に相補的な配列またはそれに結合する配列を含むか、またはそれから成る。イントロン８および９のヒトｍＲＮＡ前駆体配列は、それぞれ配列番号６２および６３に示される。したがって、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号６２または６３の少なくとも８ヌクレオチドのストレッチに相補的であるか、またはそれに結合する。

あるいは、オリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物は、ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰのイントロン８の一部およびエキソン９の一部を含むｍＲＮＡ前駆体配列もしくはイントロン８およびエキソン９に重複する配列（すなわちイントロン８−エキソン９の境界）、またはヒトＩＬ−１ＲＡｃＰのエキソン９の一部およびイントロン９の一部を含む配列もしくはエキソン９およびイントロン９に重複する配列（すなわちエキソン９−イントロン９の境界）に相補的な配列またはそれに結合する配列を含むか、またはそれから成る。イントロン８およびエキソン９に重複する好ましいヒトｍＲＮＡ前駆体配列は、配列番号６４に示される。エキソン９およびイントロン９に重複する好ましいヒトｍＲＮＡ前駆体配列は、配列番号６５に示される。したがって、オリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号６４または６５の少なくとも８ヌクレオチドのストレッチに相補的であるか、またはそれに結合する。

最も好ましくは、Ｃ５ ｍＲＮＡ前駆体の少なくとも一部、またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体の少なくとも一部に相補的な配列を含むか、またはそれから成るオリゴヌクレオチドであって、前記部分は少なくとも８ヌクレオチドを有するか、または含むオリゴヌクレオチドが使用される。しかしながら、前記部分は、さらに、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ヌクレオチドを有していてよい。

Ｃ５のためのより好ましいオリゴヌクレオチドは、以下の配列番号１１から配列番号２４の配列の各々を含むか、またはそれから成る配列である：
−配列番号１１、１２、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３および２４（すなわちＰＳ２９５、ＰＳ２９６、ＰＳ３４９、ＰＳ３５０、ＰＳ３５１、ＰＳ３５２、ＰＳ３５３、３７７、３７８および３７９）はＣ５のエキソン１７の一部またはストレッチと相補的であるか、またはそれを標的化するか、またはそれに結合する、
−配列番号１３、１４および２１（すなわちＰＳ３２９、ＰＳ３３０およびＰＳ３５４）は、Ｃ５のエキソン１７−イントロン１７境界の一部またはストレッチと相補的であるか、またはそれを標的化するか、またはそれに結合する、
−配列番号１５（すなわちＰＳ３４８）は、Ｃ５のイントロン１６−エキソン１７境界の一部またはストレッチと相補的であるか、またはそれを標的化するか、またはそれに結合する。

より好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１３（ＰＳ３２９）および配列番号２２（３７７）を含むか、またはそれらから成る。

ＩＬ−１ＲＡｃＰのためのより好ましいオリゴヌクレオチドは、以下の配列番号２５から配列番号４２の配列の各々を含むか、またはそれから成る配列に示される。
−配列番号２５、２６、２８、３３、３４、３５、３６、３９、４０、４１（すなわちＰＳ２９９、ＰＳ３００、ＰＳ３２６、ＰＳ３５７、ＰＳ３５８、ＰＳ３５９、ＰＳ３６０、３７３、３７４および３７５）は、ＩＬ−１ＲＡｃＰのエキソン９の一部またはストレッチと相補的であるか、またはそれを標的化するか、またはそれに結合する、
−配列番号２７、３１、３２および４２（すなわちＰＳ３２５、ＰＳ３５５、ＰＳ３５６および３７６）は、ＩＬ−１ＲＡｃＰのイントロン８−エキソン９境界の一部またはストレッチと相補的であるか、またはそれを標的化するか、またはそれに結合する、
−配列番号２９、３０、３７および３８（すなわちＰＳ３２７、ＰＳ３２８、ＰＳ３６１および３７２）は、ＩＬ−１ＲＡｃＰのエキソン９−イントロン９境界の一部またはストレッチと相補的であるか、またはそれを標的化するか、またはそれに結合する。

より好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号２６（ＰＳ３００）および配列番号３９（３７３）を含むか、またはそれらから成る。

オリゴヌクレオチドの各々は表３に示される。表５には、各オリゴヌクレオチドによって標的化された領域が示される。

好ましい実施形態において、先に記載される本発明のオリゴヌクレオチドは、さらに、少なくとも１つのイノシンおよび／または前記配列に存在するゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を含む。好ましくは、イノシンは、グアニン、アデニンまたはウラシルの１つに導入され、これと置き換えられる。イノシンおよび／また本発明のオリゴヌクレオチドにおいてゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を含むヌクレオチドの使用は、以下に説明されるように非常に魅力的である。イノシンは、例えば、３つの塩基ウラシル、アデニンおよびシトシンと対になることができる既知の改変された塩基である。イノシンは、ヒポキサンチンがβ−Ｎ９−グリコシド結合を介してリボース環（リボフラノースとしても知られる）に結合したときに形成されるヌクレオシドである。イノシンは、一般にｔＲＮＡにて見つかり、ゆらぎ塩基対における遺伝暗号の適切な翻訳にとって不可欠である。ゆらぎ塩基対は、ＲＮＡ二次構造において基本的なＧ−ＵおよびＩ−Ｕ／Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｃの対である。その熱力学的安定性は、ワトソンクリック塩基対のそれに匹敵する。ゆらぎ塩基対は遺伝暗号の適切な翻訳に重要である。遺伝暗号は、アンチコドンの第１塩基において改変された塩基対を使用することにより、トリプレットコドン（６４）のためのアミノ酸の数（２０）における不均衡を補う。同様に、ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマーを設計する場合、イノシンは、アデニン、チミンまたはシトシンでそれが無差別的に対となる点で有用である。

そのような塩基を使用するという第１の利点は、多型がプライマーのアニーリング効率を混乱させることを心配することなく、一塩基多型（ＳＮＰ）にまたがるプライマーを設計できることである。したがって、本発明において、そのような塩基の使用は、本発明のオリゴヌクレオチドによって標的化されるｍＲＮＡ前駆体ストレッチ内にＳＮＰを有する個体に使用してよいオリゴヌクレオチドの設計を可能にする。

イノシンおよび／または本発明のオリゴヌクレオチドにおいてゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を使用することの別の利点は、ここに示されるｍＲＮＡ前駆体ストレッチに相補的に設計した場合に、前記オリゴヌクレオチドが通常ＣｐＧを含むことである。オリゴヌクレオチドにおけるＣｐＧの存在は、通常、前記オリゴヌクレオチド（１０）の増加した免疫原性に関係している。この増加した免疫原性は望ましくない。対応するイノシンおよび／または前記オリゴヌクレオチドにおけるゆらぎ塩基対を形成することができる塩基による１つ、２つまたはそれ以上のＣｐＧの置換は、減少したおよび／または許容できるレベルの免疫原性を有するオリゴヌクレオチドを供給すると期待される。免疫原性は、動物のバイオプシーにおけるＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞および／または炎症性骨髄性細胞の存在の評価により、動物モデルにおいて評価してよい。免疫原性は、本発明のオリゴヌクレオチドで治療された動物またはヒトの血液において、ＥＬＩＳＡのような当業者に既知の標準的イムノアッセイを使用して、中和抗体および／または前記オリゴヌクレオチドを認識する抗体の存在を検出することによって、評価してもよい。

免疫原性の増大は、好ましくはイノシンおよび／またはゆらぎ塩基対を形成することができる少なくとも１つの塩基を有する対応するオリゴヌクレオチドで治療する前後の動物の対応するバイオプシーにおける、各々の細胞種の量の比較における、少なくとも１つのこれらの細胞種の検出可能な増大に対応する。あるいは、免疫原性の増大は、標準的イムノアッセイを使用して、前記オリゴヌクレオチドを認識する抗体の存在または増加量を検出して評価してよい。

免疫原性の減少は、好ましくは、イノシンおよび／またはゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を有さない対応するオリゴヌクレオチドによって治療する前後の動物の対応するバイオプシーにおける、対応する細胞種の数との比較における、少なくとも１つのこれらの細胞種の検出可能な減少に対応する。あるいは、免疫原性の減少は、標準的イムノアッセイを使用して、前記抗体の欠如または減少量によって評価してよい。

イノシンおよび／または本発明のオリゴヌクレオチドにおいてゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を使用することの第３の利点は、オリゴヌクレオチドの潜在的な多量体化または凝集を回避または低減することである。例えば、Ｇ−カルテットモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、４つの一本鎖オリゴヌクレオチドのＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合により形成される４重体、多量体または凝集体を形成する傾向を有することが知られており（１１）、このことは当然望ましくなく、結果として、オリゴヌクレオチドの効率は減少すると予想される。多量体化または凝集は、好ましくは、当業者に既知の標準的ポリアクリルアミド非変性ゲル電気泳動技術によって評価される。好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドの合計量の２０％未満、１５％未満、１０％未満、７％未満もしくは５％未満またはそれ以下が、上述のアッセイを使用した評価により、多量体化または凝集する能力を有する。

さらに、イノシンおよび／または本発明のオリゴヌクレオチドにおいてゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を使用することの第４の利点は、抗トロンビン活性に関係し（１２）並びにマクロファージ・スカベンジャー受容体との結合およびその阻害に関係する（１３）４重構造を回避することである。

イノシンおよび／または本発明のオリゴヌクレオチドにおいてゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を使用することの第５の利点は、改善されたＲＮＡ結合速度論および／または熱力学的性質を有するオリゴヌクレオチドの設計を可能にすることである。ＲＮＡ結合速度論および／または熱力学的性質は、オリゴヌクレオチドの融解温度によって（Ｔｍ；基礎的なＴｍおよび最も近い隣接モデルを使用して一本鎖ＲＮＡについて、オリゴヌクレオチド特性計算器で計算される（http://www.unc.edu/￣cail/biotool/oligo/index.html））および／またはＡＯＮ−標的エキソン複合体の自由エネルギーによって（ＲＮＡ構造バージョン４．５を使用して）、少なくとも部分的に決定される。Ｔｍが高すぎる場合、オリゴヌクレオチドがそれほど特異的でないと予想される。許容できるＴｍおよび自由エネルギーは、オリゴヌクレオチドの配列に依存する。したがって、これらのパラメータの各々に好ましい範囲を与えることは難しい。許容できるＴｍは、少なくとも３５℃且つ６５℃以下であってよく、許容できる自由エネルギーは、少なくとも１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ且つ４５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であってよい。

当業者は、したがって、最初にオリゴヌクレオチドを潜在的な治療の化合物として選択してよい。第２のステップにおいて、その免疫原性を減少させおよび／または凝集および／または４重形成を回避することによって、および／またはそのＴｍおよび／またはＡＯＮ−標的複合体の自由エネルギーを最適化することによって、さらに前記オリゴヌクレオチドを最適化するために本発明を使用してよい。前記オリゴヌクレオチドにおいて、ゆらぎ塩基対を形成することができる少なくとも１つのイノシンおよび／または塩基を適切な位置に導入し、免疫原性および／または凝集および／または４重形成および／またはＴｍおよび／またはＡＯＮ−標的複合体の自由エネルギーが、前記イノシンおよび／またはゆらぎ塩基対を形成することができる塩基の存在によってどのように変化したかを評価しようとしてよい。変化によって、免疫原性および／または凝集および／または４重形成および／またはそのＴｍおよび／またはＡＯＮ−標的複合体の自由エネルギーの好ましい変化または減少が生じない場合、更なるイノシンおよび／または前記オリゴヌクレオチドにゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を導入すること、および／または所定のイノシンおよび／または前記オリゴヌクレオチド内の異なる適切な位置にゆらぎ塩基対を形成することができる塩基を導入することを選択してよい。

好ましい実施形態において、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体の一部に相補的な配列を含む本発明のオリゴヌクレオチドは、相補的な部分は、本発明のオリゴヌクレオチドの長さの少なくとも５０％であり、より好ましくは少なくとも６０％であり、さらにより好ましくは少なくとも７０％であり、さらにより好ましくは少なくとも８０％であり、さらにより好ましくは少なくとも９０％でありまたはさらにより好ましくは少なくとも９５％であり、またはさらにより好ましくは９８％でありまたはさらにより好ましくは少なくとも９９％であり、またはさらにより好ましくは１００％であるオリゴヌクレオチドである。最も好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ここに定義されるようなＣ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体の一部に相補的な配列から成る。例として、オリゴヌクレオチドは、ここに定義されるようなＣ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体および付加的なフランキング配列の一部に相補的な配列を含んでよい。より好ましい実施形態において、前記オリゴヌクレオチドの前記の相補的な部分の長さは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０ヌクレオチドである。好ましくは、付加的なフランキング配列は、オリゴヌクレオチドに対するタンパク質の結合を改変するために、またはオリゴヌクレオチドの熱力学的性質を改変するために、より好ましくは標的ＲＮＡ結合親和性を改変するために使用される。

１つの好ましい実施形態は、次のものを含むオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物を提供する：
−Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体エキソンの領域に相補的な配列であって、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰエキソンの別の部分とハイブリダイズするもの（閉じた構造）、および
−Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰｍＲＮＡ前駆体エキソンの領域に相補的な配列であって、前記Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰｍＲＮＡ前駆体とハイブリダイズしないもの（開いた構造）。

この実施形態については、ＷＯ２００４／０８３４３２が言及され、その全体は本願に援用される。ＲＮＡ分子は、主として、同じＲＮＡ内の相補的なまたは部分的に相補的なストレッチの塩基対合により、強い二次構造を示す。ＲＮＡ中の構造はＲＮＡの機能に役割を果たすと以前から考えられている。理論に拘束されることなく、エキソンのＲＮＡの二次構造はスプライシングプロセスの組み立ての際に役割を果たすと信じられている。エキソンの構造は、ｍＲＮＡにその包含を導くと考えられているパラメータの１つである。しかしながら、他のパラメータがさらにそこに役割を果たす可能性がある。ここにおいて、このシグナリング機能は、エキソン包含シグナルと呼ばれる。この実施形態の相補的オリゴヌクレオチドは、エキソンの構造を妨害し、それによりエキソンのエキソン包含シグナルを妨害することができる。多くの相補的オリゴヌクレオチドは、確かにこの能力を含み、その他のものより多少効率的であることがわかった。この好ましい実施形態のオリゴヌクレオチド、すなわち本来のエキソンＲＮＡにおける開いたまたは閉じた構造に導かれる前記重複を備えたものは、あらゆる可能性のあるオリゴヌクレオチドから選択されたものである。選択は、エキソン包含シグナルを効率的に妨害することができるオリゴヌクレオチドを包含する。理論に拘束されることなく、開いた構造との重複は、オリゴヌクレオチドの侵入効率を改善し、スプライシング要素の結合を防ぎ（すなわち、オリゴヌクレオチドが構造に入ることができる効率を増加させる）、一方で、閉じた構造との重複は、続いて、エキソンのＲＮＡの二次構造を妨害する効率を増加させ、それにより、エキソン包含シグナルを妨害すると考えられる。閉じたおよび開いた構造の両方に対する部分的相補性の長さは極端に制限されないことがわかっている。我々は、いずれかの構造における可変長の相補性を有するオリゴヌクレオチドによる高い効率を観察した。相補性という用語は、生理学的条件下で核酸のその他のストレッチにハイブリダイズすることができる核酸のストレッチを意味するものとしてここに使用される。相補性の領域の全ての塩基は、相対する鎖における塩基と対になることができることが必ずしも要求されない。例えば、オリゴヌクレオチドを設計する場合、例えば、相補鎖における塩基との塩基対を形成しない残基を組込んでもよい。ミスマッチはある程度まで許容されてよく、細胞における環境下では、ヌクレオチドのストレッチは、相補的部分に十分にハイブリダイズすることができる。この文脈において、「十分に」とは、好ましくは、ＥＰ１ ６１９ ２４９の例１に記述されるようなゲル易動度シフトアッセイを使用して、オリゴヌクレオチドの結合を検出することが可能であることを意味する。任意に、前記オリゴヌクレオチドは、さらに、ヒト肝細胞へのトランスフェクションによって試験してよい。標的化されたエキソンのスキッピングは、（ＥＰ１ ６１９ ２４９に記述されるような）ＲＴ−ＰＣＲによって評価してよい。相補的領域は、好ましくは、組み合わせられた場合に、ｍＲＮＡ前駆体におけるエキソンに特異的であるように設計される。そのような特異性は相補的領域の様々な長さで作製してよく、これはシステムにおいて他のｍＲＮＡ（前駆体）における実際の配列に依存する。１以上のその他のｍＲＮＡ前駆体がオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができるというリスクは、オリゴヌクレオチドのサイズを増大することで低下する。相補性の領域にミスマッチを含むが、ｍＲＮＡ前駆体における標的化された領域とハイブリダイズする能力を保持するオリゴヌクレオチドを本発明にて使用できることが明らかである。しかしながら、好ましくは、少なくとも相補的部分は、そのようなミスマッチを含まない。というのも、これらは、典型的に、１以上の相補的領域にそのようなミスマッチを有しているオリゴヌクレオチドよりも高い効率および高い特異性を有しているためである。より高いハイブリダイゼーションの強さ（すなわち相対する鎖との相互作用の数の増大）は、システムのスプライシング機構を妨害する過程の効率を増大させることにおいて都合がよいと考えられる。好ましくは、相補性は９０〜１００％である。一般に、これは２０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに１つまたは２つのミスマッチを許容する。

二次構造は、エキソンが存在するｍＲＮＡ前駆体の状況において最も分析される。そのような構造は実際のＲＮＡにおいて分析してよい。しかしながら、構造−モデル化プログラムを頻繁に使用して、ＲＮＡ分子（最低のエネルギーコスト）の二次構造を予測することが現在可能である。適切なプログラムの非限定的な例は、ＲＮＡ ｍｆｏｌｄバージョン３．１サーバーである（１４）。当業者は、ヌクレオチド配列が与えられた場合、適切な再現性で、エキソンの有望な構造を予測することができるだろう。エキソンおよびフランキングイントロン配列の両方にそのようなモデル化プログラムを提供する場合、最良の予測が得られる。それは、典型的に、全てのｍＲＮＡ前駆体の構造をモデル化するためには必要ない。

オリゴヌクレオチドが導かれる、開いたおよび閉じた構造は、好ましくは互いに隣接している。このように、開いた構造に対するオリゴヌクレオチドのアニーリングは、アニーリングがこの閉じた構造に進むとすぐに、閉じた構造の開放を引き起こすと考えられる。この作用を通じて、以前に閉じた構造は、異なる高次構造をとる。異なる高次構造はエキソン包含シグナルの崩壊をもたらす。しかしながら、潜在的（隠れた）スプライスアクセプターおよび／またはドナー配列が標的化されたエキソン内に存在する場合、たまに、新しいエキソン包含シグナルが作られ、異なる（新たな）エキソン、すなわち異なる５’末端、異なる３’末端またはそれらの両方を有したエキソンが生成される。標的化されたエキソンは、ｍＲＮＡから除外されるため、Ｃ５ａタンパク質が減少し、または可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰが生産される限り、この種の活性は本発明の範囲内である。

さらに、ｍＲＮＡ前駆体のエキソンのＲＮＡにおけるセリン−アルギニン（ＳＲ）タンパク質のための結合部位に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が提供される。ＷＯ２００６／１１２７０５において、我々は、エキソンスキッピングの誘導におけるエキソン−内部アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）の有効性と、前記ＡＯＮの標的ｍＲＮＡ前駆体部位における（例えばＥＳＥファインダーによって）予測されたＳＲ結合部位の存在との間の相関性の存在を開示した。したがって、１つの実施形態においてオリゴヌクレオチドは、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体の標的化されたエキソンのＲＮＡにおけるＳＲ（Ｓｅｒ−Ａｒｇ）タンパク質のための（推定上の）結合部位を決定すること、および前記ＲＮＡに相補的であり、少なくとも部分的に前記（推定上の）結合部位に重複するオリゴヌクレオチドを製造することを含んで製造される。ここにおいて、「少なくとも部分的に重複」という用語は、ＳＲ結合部位の単一ヌクレオチドのみ並びに前記結合部位の複数のヌクレオチドの重複並びに前記結合部位の完全な重複を含むと定義される。この実施形態は、好ましくは、前記ＲＮＡの二次構造から、前記ＲＮＡの別の部分とハイブリダイズする領域（閉じた構造）および前記構造とハイブリダイズしない領域（開いた構造）を決定すること、および続いて、少なくとも部分的に前記（推定上の）結合部位と重複し、前記閉じた構造の少なくとも一部と重複しおよび前記開いた構造の少なくとも一部と重複するオリゴヌクレオチドを生成することをさらに含む。この方法で、我々は、エキソンの、ｍＲＮＡ前駆体からｍＲＮＡへの包含を妨害できるオリゴヌクレオチドを得る可能性を増加させる。第１の選択されたＳＲ−結合領域は、開いた―閉じた構造を有さない可能性があり、この場合、別の（第２の）ＳＲタンパク質結合部位が選択され、その後、開いた−閉じた構造の存在について試験される。このプロセスは、ＳＲタンパク質結合部位並びに（部分的に重複する）開いた−閉じた構造を含む配列が同定されるまで続けられる。その後、この配列は、前記配列に相補的なオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。

オリゴヌクレオチドを生成するためのそのような方法は、記述された順序、すなわち最初にオリゴヌクレオチドを生成するという順序を逆にすることによって実行され、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰエキソンからのＲＮＡの二次構造から、前記ＲＮＡの別の部分にハイブリダイズする構造が想定される領域（閉じた構造）および前記構造においてハイブリダイズしない領域（開いた構造）を決定すること、および続いて、前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つの一部が前記閉じた構造に相補的であり、少なくとも前記オリゴヌクレオチドの別の部分が前記開いた構造に相補的であるオリゴヌクレオチドを生成することを含む。その後、ＳＲタンパク質結合部位が前記開いた／閉じた構造で少なくとも重複するかどうか判断される。このように、ＷＯ２００４／０８３４３２の方法は改良される。さらに別の実施形態において、選択は同時に行なわれる。

任意の理論に束縛されることを期待することなく、ＳＲタンパク質結合部位に向けられたオリゴヌクレオチドの使用は、ＳＲタンパク質の結合部位に対するＳＲタンパク質の結合を（少なくとも部分的に）妨害し、スプライシングを崩壊させるかまたは妨害すると現在考えられている。

好ましくは、開いた／閉じた構造とＳＲタンパク質結合部位とは部分的に重複し、さらにより好ましくは、開いた／閉じた構造は完全にＳＲタンパク質結合部位と重複し、またはＳＲタンパク質結合部位は完全に開いた／閉じた構造と重複する。このことは、エキソン包含の崩壊を向上させる。

コンセンサススプライスサイト配列に加えて、多くの（しかしすべてではない）エキソンは、エキソンスプライシングエンハンサー（エキソンスプライシングエンハンサー、ＥＳＥ）配列のようなスプライシング調節配列を含み、スプライソソームによる真正なスプライスサイトの認識が促進される（１５、１６）。ＳＲタンパク質と呼ばれるスプライシング要素のサブグループは、これらのＥＳＥに結合することができ、Ｕ１およびＵ２ＡＦといったその他のスプライシング要素を（弱く定義される）スプライスサイトにリクルートすることができる。４つの最も豊富なＳＲタンパク質（ＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５、ＳＲｐ４０およびＳＲｐ５５）の結合部位が詳細に分析され、これらの結果は、ＥＳＥファインダー（これらのＳＲタンパク質のための潜在的結合部位を予測するウェブソース）において実行される（１５、１６）。オリゴヌクレオチドの有効性と、ＳＦ２／ＡＳＦ、ＳＣ３５およびＳＲｐ４０結合部位の存在／非存在との間に相関性がある。好ましい実施形態において、したがって、本発明は、上記のような組み合わせを提供し、ここにおいて前記ＳＲタンパク質はＳＦ２／ＡＳＦまたはＳＣ３５またはＳＲｐ４０である。

１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物は、転写物におけるエキソンの正確なスプライシングに必要な調節性ＲＮＡ配列に特異的に結合することができる。いくつかのシス作用性ＲＮＡ配列は、転写物におけるエキソンの正確なスプライシングに必要である。特に、イントロンスプライシングエンハンサー（ｉｎｔｒｏｎｉｃ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｅｎｈａｎｃｅｒ）もしくはエキソンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥおよびＥＳＥ）またはイントロンスプライシングサイレンサー（ｉｎｔｒｏｎｉｃ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｓｉｌｅｎｃｅｒ）もしくはエキソンスプライシングサイレンサー（ｅｘｏｎｉｃ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｓｉｌｅｎｃｅｒ）（ＩＳＳおよびＥＳＥ）のような補足の要素は、構成的および代替性のエキソンの特異的且つ効率的なスプライシングを制御するように識別される。要素に結合する配列特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用して、ＤＭＤに示されるように、エキソンがスキップされるように、それらの制御的機能は妨害される。したがって、１つの好ましい実施形態において、イントロンスプライシングエンハンサー（ＩＳＥ）、エキソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）、イントロンスプライシングサイレンサー（ＩＳＳ）および／またはエキソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）に相補的なオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が使用される。先に記載されたように、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰエキソンは、１つの好ましい実施形態において、前記エキソンのエキソン包含シグナルを特異的に阻害することができる薬剤によりスキップされ、それにより、前記エキソンは、ｍＲＮＡに含める必要のある部分としてスプライシング機構に認識されない。その結果、前記エキソンを欠いたｍＲＮＡが形成される。

ここに使用されるオリゴヌクレオチドは、好ましくは、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰエキソンＲＮＡまたはＣ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰイントロンＲＮＡの８および５０ヌクレオチドの連続した部分または連続したストレッチに相補的である。１つの実施形態において、ここに使用されるオリゴヌクレオチドは、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰエキソンＲＮＡまたはＣ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰイントロンＲＮＡの１４および５０ヌクレオチドの連続した部分または連続したストレッチに相補的である。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、前記エキソンＲＮＡの１４および２５ヌクレオチドの連続した部分または連続したストレッチに相補的である。より好ましくは、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰエキソンＲＮＡまたはＣ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰイントロンＲＮＡの２０および２５ヌクレオチドの連続した部分または連続したストレッチに相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドが使用される。したがって、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰエキソンｍＲＮＡ前駆体の８および５０ヌクレオチドの連続した部分または連続したストレッチに相補的なそのような好ましいオリゴヌクレオチドは、前記エキソンによってコードされた領域を欠いたＣ５ａタンパク質、または前記エキソンによってコードされた領域を欠いたＩＬ−１ＲＡｃＰタンパク質を誘導する。

異なるタイプの核酸モノマーを、オリゴヌクレオチドを生成するために使用してよい。

核酸は、ＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドと比較して、骨格、糖および／または塩基が修飾されていてよい。

好ましい骨格の修飾は、ホスホロジチオネート、ホスホロチオネート、キラルに純粋なホスホロチオネート、ホスホン酸メチル、および／またはＨ−ホスホン酸塩を含むが、これらに限定されない。

骨格の修飾の代わりに、またはそれとの組み合わせで、核酸は、糖の修飾および／または塩基の修飾を有してよい。

好ましい糖の修飾は、ミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）を含むカルバ糖および／またはアザ糖を含む。その他の糖の修飾は、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）および／またはミックスマーを含むそれらの変形を含む。その他の糖の修飾は、２’−ハライドおよび／または２’−Ｏ−アルキルおよび／または２’−Ｏ−（置換）アルキルの修飾、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｆ、２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−ブチニル、２’−Ｏ−プロパルギル、２’−Ｏ−（２−アミノ）エチルを含む。当業者は、それぞれの糖は同様に修飾する必要はないと理解するだろう。いくつかの異なる修飾された糖は、１つの単一核酸と組み合わせられてよい。

好ましい塩基の修飾は、５−ハロゲン化ウラシルおよび／またはシトシン、５−アミノメチル−ウラシル、２，６−ジアミノプリン、５−プロパルギル−シトシン、５−プロパルギル−ウラシル、Ｇ−クランプおよびその誘導体）、５−メチル−シトシン−および／または５−メチル−ウラシルを含む。当業者は、それぞれの塩基は同様に修飾する必要はないと理解するだろう。いくつかの異なる修飾された塩基は、１つの単一核酸と組み合わせられてよい。

好ましくは、ＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖が非常に安定しているため、前記オリゴヌクレオチドはＲＮＡを含む。エキソンスキッピング技術の目的のうちの１つは、対象におけるスプライシングを導くことであるため、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、付加的な特性、例えば、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼおよびＲＮａｓｅＨに対する抵抗性、付加的なハイブリダイゼーションの強さ、増大した安定性（例えば体液における）、増大または低下した柔軟性、低減された毒性、増大した細胞内輸送、組織特異性等を有したＲＮＡを提供する修飾を含むことが好ましい。好ましい修飾は上に示されている。

好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオネート骨格を通して接続された２’−ＯメチルＲＮＡモノマーを含むか、またはそれから成る。１つの実施形態は、したがって、修飾、好ましくは、２’−Ｏメチル修飾リボース（ＲＮＡ）、より好ましくは、２’−Ｏ−メチルホスホロチオネートＲＮＡをさらに含むＲＮＡを含むオリゴヌクレオチドを提供する。

１つの実施形態において、本発明は、２’−Ｏ−メチルホスホロチオネートオリゴリボヌクレオチドの修飾およびロックされた核酸モノマーを含むハイブリッド・オリゴヌクレオチドを提供する。この特定のオリゴヌクレオチドは、ロックされた核酸のみから成る等価物と比較して、よりよい配列特異性を含み、２’−Ｏ−メチルホスホロチオネートオリゴリボヌクレオチドの修飾から成るオリゴヌクレオチドと比較して有効性が改善されている。

したがって好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドはＲＮＡを含み、好ましくは、前記ＲＮＡは、修飾、より好ましくは、２’−Ｏ−メチル修飾リボース（ＲＮＡ）あるいはデオキシリボース（ＤＮＡ）修飾を含み、ここにおいて、前記オリゴヌクレオチドの前記機能的等価物は、ＰＮＡ、カルバボラン含有ペプチド核酸、（ＬＮＡ）、（ＥＮＡ）、ロックされていない核酸（ＵＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、モルホリノホスホロジアミデートまたはそれらの任意の組み合わせを含み、最も好ましくはモルホリノホスホロジアミデートを含む。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドと比較して、骨格、糖および／または塩基の修飾を有し、好ましくは、ここにおいて、オリゴヌクレオチドは、１以上の２’−Ｏ−メチルホスホロチオネートおよび／またはモルホリノホスホロジアミデートヌクレオチドを含むか、またはそれから成る。

確認された各々の骨格、糖、塩基の修飾は、増大するか、標的化されたエキソンのスキッピングを誘導する、オリゴヌクレオチドの能力を増強すると考えられる。

核酸を模倣する技術の出現により、必ずしも量ではなく、核酸自体として同様の、好ましくは同一のハイブリダイゼーション特性を有する分子を製造することが可能になった。そのような機能的等価物は、当然、本発明における使用にも適している。オリゴヌクレオチドの機能的等価物の好ましい例は、ＰＮＡおよび／またはＬＮＡである。最も好ましくは、モルホリノホスホロジアミデートが使用される。本発明のオリゴヌクレオチドの等価物の適しているが、非限定的な例は、１７−２３に見つけることができる。互いに形成するおよび／または核酸とともに形成する１以上の等価物のハイブリッドも当然適している。好ましい実施形態において、ＬＮＡは、より高い標的親和性および低減された毒性を示すため、ＬＮＡはオリゴヌクレオチドの機能的等価物として使用される。ＬＮＡは、さらにエキソンスキッピングのより高い効率を示す。

Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体の第１のエキソンに相補的な少なくとも８、好ましくは１６から８０の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが提供され、ここにおいて、前記Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体の第２のエキソンに相補的な少なくとも８、好ましくは１６から８０の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチドが使用される。

１つの好ましい実施形態において、前記第１および前記第２エキソンは、前記Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体において、前記オリゴヌクレオチドが相補的でない少なくとも１つのエキソンによって分離されている。あるいは、前記第１および前記第２エキソンは隣接している。

２つの相補的オリゴヌクレオチドの間の結合を提供することにより、介在するエキソンのスキッピングを特異的に促進することができる。従って、１つの実施形態において、少なくとも２つのＣ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰエキソンに相補的なヌクレオチドのストレッチは結合成分によって分離される。ヌクレオチドの少なくとも２つのストレッチは、したがって、この実施形態において、単一の分子を形成するように結合される。したがって、さらに、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体における２つのエキソンの少なくとも２つの部分に相補的なオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物であって、前記オリゴヌクレオチドまたは機能的等価物は、少なくとも２つの部分を含み、第１の部分は、前記少なくとも２つのエキソンの１つ目に相補的な少なくとも８、好ましくは１６から８０の連続したヌクレオチドが有するオリゴヌクレオチドを含み、第２の部分は、前記Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体における第２のエキソンに相補的な少なくとも８、好ましくは１６から８０の連続したヌクレオチドが有するオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物が提供される。結合は任意の手段によるものであってよいが、好ましくは、ヌクレオチド結合によって達成される。後者の場合、１つまたはその他の相補的なエキソンの間の重複を含まないヌクレオチドの数は、０、１、２、３または４から４０ヌクレオチドであってよい。結合成分はオリゴヌクレオチドを繋げることができる任意のタイプの成分でありえる。好ましくは、前記結合成分は少なくとも４ウラシルヌクレオチドを含む。現在、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を模倣する様々な化合物が利用可能である。ここではオリゴヌクレオチドの機能的等価物とよばれるそのような化合物もまた、そのような等価物が、量に限らず同様のハイブリダイゼーション特性を含む場合、本発明に適している。適切な機能的等価物は、本明細書に前述される。言及されるように、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的化されたエキソンとのハイブリダイゼーションに寄与するオリゴヌクレオチドのみから成る必要はない。付加的な材料および／またはヌクレオチドが付加されてよい。

本発明によるオリゴヌクレオチドの用量範囲は、好ましくは、厳格なプロトコル必要条件が存在する臨床試験（インビボ使用）における、増大する用量の研究に基づいて設計される。ここに定義された分子またはオリゴヌクレオチドは、０．１〜６０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．５から５５ｍｇ／ｋｇまでの用量にて使用してよい。

好ましい実施形態において、０．１ｎＭから１Ｍまでの、ここに定義されたオリゴヌクレオチドの濃度が使用される。好ましくは、この範囲は、肝細胞または肝組織のような細胞モデルにおけるインビトロの使用のためのものである。より好ましくは、使用される濃度は、０．３から７００ｎＭ、さらにより好ましくは１から６００ｎＭ、さらにより好ましくは５０から５５０ｎＭまでである。いくつかのオリゴヌクレオチドが使用される場合、この濃度または用量は、オリゴヌクレオチドの全濃度または全用量を意味してよく、または添加されるオリゴヌクレオチドの各々の濃度または用量を意味してよい。

上記のようなオリゴヌクレオチドの濃度または用量の範囲は、インビトロまたはエクスビボの用途のための好ましい濃度または用量である。当業者は、使用されるオリゴヌクレオチド、扱われる標的細胞、遺伝子標的およびその発現レベル、使用される培地およびトランスフェクションおよびインキュベーション条件に依存して、使用されるオリゴヌクレオチドの濃度または用量は、更に変化してよく、さらに最適化されてよいということを理解するだろう。

好ましい実施形態において、そのような分子、好ましくはオリゴヌクレオチドは、好ましくは、薬物であり、または薬物としての使用のためのものである。より好ましくは、前記薬物は、その必要のある対象において、炎症性障害を予防または治療するためのものである。本発明に関して、炎症性障害は、任意の炎症性疾患または状態であり、好ましくは、少なくとも部分的にＣ５ａタンパク質またはＩＬ−１シグナリングによってもたらされまたは悪化する疾病、障害またはその他の症状を意味する。炎症性疾患または状態の例は、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、若年性リウマチ様関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、炎症性腸疾患（クローン病または潰瘍性大腸炎を含む）、肝炎、敗血症、アルコール性肝疾患、および非アルコール性脂肪症、腎炎、例えば糸球体腎炎、喘息、心内膜炎、重症筋無力症を含むがこれらに限定されない。

ここに使用される「肝炎」という用語は、少なくとも部分的に肝臓の炎症によって特徴づけられる消化器病学の疾病、症状または障害を意味する。肝炎の例は、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスに関連した肝炎または虚血／再灌流に関連した肝炎を含むが、これらに限定されない。

さらにより好ましくは、前記薬物は、先に定義されるように、Ｃ５ａの量を減少させることができ、または可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの量を増加させることができる。

より好ましい実施形態において、前記薬物は、治療した患者からの１以上の症状を緩和することができ、および／または、本発明の分子または組成物を使用して、治療した患者からの細胞または組織の１以上の特徴またはパラメータを改善することができる。各々の炎症性疾患について、当業者は、少なくとも１つの症状、パラメータまたは特徴、前記疾病が関与する前記パラメータまたは特徴の値およびそれらの各々を評価する方法を知っている。以下に、リウマチ様関節炎に特異的なパラメータを示す。リウマチ様関節炎は、好ましくは、対象のいくつかのパラメータおよび症状の測定を含む、疾病活性スコア（ＤＡＳ）の指数または関連するＤＡＳ２８（van Riel P.L.C.M., (2001), Best Practice & Research Clinical Rheumatology, 15: 67-76）を評価した後に診断された疾病である。前記指数の評価は対象を検査する臨床医によって実行されてよい。より好ましい実施形態において、前記薬物がＤＡＳまたはＤＡＳ２８における重要な変化を引き起こすことができる場合、前記薬物は、治療した患者からの１以上の症状を緩和することができ、および／または治療した患者からの細胞または組織の１以上の特徴またはパラメータは、本発明の分子または組成物を使用して改善される。リウマチ様関節炎を評価する他の方法も、van Riel P. L.C.M., (2001), Best Practice & Research Clinical Rheumatology, 15: 67-76 and in Gester A.M., (1999), Bailliere’s Clinical Immunology, 13: 629-644に記述される。Ｃ５ａの量を減らすためのＣ５をコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを変化させることができ、および／または可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの量を増やすためのＩＬ−１ＲＡｃＰをコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを変化させることができる分子を使用した、少なくとも１週間、１か月、６か月、１年またはそれ以上の期間の治療の後に、前記パラメータの値が、治療の開始前の前記パラメータの値との比較において少なくとも１％、２％、５％、１０％またはそれ以上改善した場合に、ここに定義されるような薬物は１つのパラメータを改善することができる。

ここに定義される薬物は、Ｃ５ａの量を減らすためのＣ５をコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを変化させることができ、および／または可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの量を増やすためのＩＬ−１ＲＡｃＰをコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを変化させることができる分子を使用した、少なくとも１週間、１か月、６か月、１年またはそれ以上の期間の治療の後に、前記症状または特徴がもはや検出されない場合に、患者の、または前記患者の細胞、組織または臓器の１つの症状または１つの特徴を緩和することができる。

本発明による使用のためのここに定義されたオリゴヌクレオチドは、炎症性障害に冒されたまたはそれを発症するリスクのある個体のインビボの細胞、組織および／または臓器への投与に適していてよく、インビボ、エキソビボまたはインビトロの投与に適していてよい。前記オリゴヌクレオチドは、炎症性障害に冒されたまたはそれを発症するリスクのある個体のインビボの細胞、組織および／または臓器に直接的または間接的に投与してよく、インビボ、エキソビボまたはインビトロで直接的または間接的に投与してよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｃ５、ＩＬ−１ＲＡｃＰが発現または製造されるあらゆる部位に送達され得るに違いない。Ｃ５および可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰは、本来、任意の対象の肝臓において発現または製造されるため、本発明のオリゴヌクレオチドは、肝細胞に、および／または肝組織におよび／または肝臓に送達することができることが好ましい。好ましくは、前記細胞は炎症性障害を患う個体の細胞である。好ましくは、前記組織は炎症性障害を患う個体の組織である。好ましくは、前記肝臓は炎症性障害を患う個体の肝臓である。

本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野において既知の適切な手段を使用して、間接的に投与されてよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、発現ベクターの形態で、個体、または前記個体の細胞、組織もしくは臓器に提供されてよく、ここにおいて、発現ベクターは、前記オリゴヌクレオチドを含む転写物をコードする。発現ベクターは、好ましくは、遺伝子送達ベヒクルによって細胞、組織、器官または個体に導入される。好ましい実施形態において、ここに定義される分子の発現または転写を推進する発現カセットまたは転写カセットを含むウイルスベースの発現ベクターが提供される。好ましい送達ベヒクルは、ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）またはレトロウイルスベクター例えばレンチウイルスベクター（２４−２６）等である。プラスミド、人工染色体、細胞のヒトゲノムにおける標的化された相同組換えおよび組み込みに適したプラスミドもまた、ここに定義されたオリゴヌクレオチドの送達に適切に適用してよい。転写はＰｏｌＩＩＩプロモーターにより推進され、および／または転写物は、小さな転写物の送達のために良好な結果をもたらすＵ１またはＵ７転写物との融合の形態である、これらのベクターが、本発明に好ましい。適切な転写物を設計することは当業者の技術的範囲に属す。ＰｏｌＩＩＩで駆動される転写物が好ましい。好ましくは、Ｕ１またはＵ７転写物との融合転写物の形態を有する（２４−２６）。そのような融合は、（２７，２８）に記述されるように、生成してよい。オリゴヌクレオチドはそのまま送達されてよい。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、ウイルスベクターによってコードされてよい。典型的に、これは、転写物の一部にオリゴヌクレオチドの配列を含むＲＮＡ転写物の形態である。

個体または前記個体の細胞、組織もしくは臓器にオリゴヌクレオチドおよび／またはその等価物を供給するための手段における改良は、これまで成し遂げられた進歩を考慮して予測される。そのような将来の改良は、当然、本発明の方法を使用して、ｍＲＮＡの再構築における言及された影響を達成するために組込まれてよい。オリゴヌクレオチドおよび／またはその等価物は、個体、前記個体の細胞、組織または臓器にそのまま送達することができる。オリゴヌクレオチドおよび／またはその等価物を投与する場合、オリゴヌクレオチドおよび／またはその等価物は、送達方法に適合する溶液に溶解することが好ましい。静脈内、皮下、筋肉内、鞘内および／または脳室内の投与については、溶液は生理的食塩水であることが好ましい。本発明において、細胞へのおよび／または細胞内、好ましくは肝細胞内への、ここに定義されるような構成分子の各々の送達を援助する賦形剤の使用は特に好ましい。ここに定義されるような各々の構成分子を送達し、細胞膜を通して小胞またはリポソームにて複合化されまたはトラップされる、複合体、ナノ粒子、ミセル、小胞および／またはリポソームを形成できる賦形剤が好ましい。これらの賦形剤の多くは当該分野において知られている。適切な賦形剤は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、またはポリプロピレンイミンまたはポリエチレンイミンの共重合体（ＰＥＣ）および誘導体を含む、同様のカチオンポリマー、合成両親媒性物質（ＳＡＩＮＴ−１８）、リポフェクチンＴＭ、ＤＯＴＡＰおよび／または、ここに定義されるような各々の構成分子を細胞、好ましくは肝細胞に送達することができる粒子中に自己構築できるウイルスキャプシドタンパク質を含む。そのような賦形剤は、肝細胞を含む種々の培養細胞に対して、アンチセンス核酸のようなオリゴヌクレオチドを効率的に送達することが示された。それらの高いトランスフェクションの可能性は、全細胞の生存の観点で低から中程度の毒性の除外と組み合わせられる。構造の修飾の容易さは、さらなる改良、およびさらなる（インビボ）核酸の送達の特徴および毒性の分析を可能にするために使用できる。

リポフェクチンは、リポソームのトランスフェクション剤の例である。これは、２つの脂質成分、陽イオン性脂質Ｎ−［１−（２，３ジオレオイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム塩化物（ＤＯＴＭＡ）（ｃｐ．硫酸メチル塩であるＤＯＴＡＰ）と、中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）とから成る。中性成分は細胞内放出を媒介する。送達システムの別のグループは重合体のナノ粒子である。

ＤＮＡトランスフェクション剤として周知のジエチルアミノエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストランといったポリカチオンは、ブチルシアノアクリレート（ＰＢＣＡ）およびヘキシルシアノアクリレート（ＰＨＣＡ）と組み合わせて、ここに定義されるような各々の構成分子を、好ましくはオリゴヌクレオチドを、細胞膜を横切って細胞中に送達することができる陽イオン性ナノ粒子を調製することができる。

これらの通常のナノ粒子材料に加えて、陽イオン性ペプチドであるプロタミンは、コロイドによるオリゴヌクレオチドの調製のための代替的なアプローチを提供する。このコロイド性のナノ粒子システムはプロティクル（ｐｒｏｔｉｃｌｅ）と呼ばれ、単純な自己組み立てプロセスによって、オリゴヌクレオチドを包装し、細胞内放出を媒介するように用意することができる。当業者は、ヒトにおける炎症性障害の治療のためにそれを送達する本発明において使用するために、オリゴヌクレオチドを包装し、送達するために、上記の何れかまたはその他の市販の代替となる賦形剤および送達システムを選択してよい。

別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、分子に対して共有結合または非共有結合できる。好ましい分子は、下に定義されるようなリガンドおよび／または前記オリゴヌクレオチドの安定性および／または薬物動態学および／または薬物動力学を変化することができる分子である。これらのパラメータ（すなわち安定性および／または薬物動態学および／または薬物動力学）の各々は、当業者に既知のアッセイを使用して評価することができる。

オリゴヌクレオチドは、細胞、細胞質および／またはその核への取り込みを促進するように特異的に設計されたリガンドに共有結合または非共有結合することができる。そのようなリガンドは（ｉ）細胞取り込みを促進する、細胞、組織または臓器に特異的な要素を認識する化合物（ペプチド（様）構造を含むが、これらに限定されない）および／または（ｉｉ）エンドソームまたはリソソームといった小胞からのオリゴヌクレオチドの細胞への取り込みおよび／または細胞内放出を促進することができる化学的化合物を含む。

したがって、好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、組成物または薬物にて調製され、あるいは送達および／またはその細胞への送達装置および／またはその細胞内送達の増強のために、少なくとも賦形剤および／またはリガンドとともに提供される組成物にて調製される。したがって、本発明は、送達および／またはその細胞への送達装置および／またはその細胞内送達の増強のための、オリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１つの賦形剤および／またはリガンドをさらに含む医薬的に許容可能な組成物をさらに包含する。

それらのアイデンティティーに依存して、当業者は、どの種の調製がここに定義されるような構成成分の各々にとって最も適切であるかを知るだろう。好ましい実施形態において、本発明は、オリゴヌクレオチドおよび後に定義されるようなさらなる補助的化合物を含む部分のキットの形態である組成物または調製物を提供する。

ここに定義された好ましいオリゴヌクレオチドは、個体における炎症性障害を防ぐまたは治療するためのものである。本発明のオリゴヌクレオチドを使用して治療してよい個体は、既に炎症性障害を有していると診断されていてよい。あるいは本発明のオリゴヌクレオチドを使用して治療してよい個体は、まだ炎症性障害を有していると診断されていないものの、将来の所定の彼または彼女の遺伝的背景において炎症性障害の発症リスクが大きな個体であってよい。好ましい個体はヒトである。

組成物
さらなる側面において、ここに定義された分子、好ましくはオリゴヌクレオチドを含む組成物が提供される。好ましくは、前記組成物は、ここに定義されるような少なくとも２つの異なるオリゴヌクレオチドを含む；一方は、Ｃ５ａの量を減少させるために、Ｃ５のｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを変更することができるように設計されており、他方は、可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの量を増加させるために、および／またはＮＦ−κＢの活性を減少させるために、および／またはＩＬ−６／ＩＣＡＭ−１の放出を減少させるために、および／または遊離型ＩＬ−１の量を減少させるために、ＩＬ−１ＲＡｃＰをコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを変更できる。あるいは、これらの異なる２つのオリゴヌクレオチドは、マルチエキソンスキッピングのために、先に定義されるようなＣ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体の異なる２以上のエキソンをスキップするように設計されている。好ましい実施形態において、前記組成物は、好ましくは、医薬組成物であり、前記医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体、希釈剤および／または賦形剤を含む。

そのような医薬組成物は、任意の医薬的に許容可能な担体、充填剤、保存剤、可溶化剤、希釈剤および／または賦形剤を含んでよい。そのような医薬的に許容可能な担体、充填剤、保存剤、可溶化剤、希釈剤および／または賦形剤は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000にて見つけられてよい。前記組成物の特徴はそれぞれ先に定義されている。

いくつかのオリゴヌクレオチドを使用する場合、既にここに定義された濃度または用量は、使用されるすべてのオリゴヌクレオチドの全濃度または用量を意味し、または使用されるまたは添加される各々のオリゴヌクレオチドの濃度または用量を意味する。したがって、１つの実施形態において、使用されるオリゴヌクレオチドの各々または合計の量が０．５ｍｇ／ｋｇから６０ｍｇ／ｋｇの量とされる組成物が提供される。

使用
さらなる側面において、個体における炎症性障害を予防しまたは治療するための薬物の製造のための、ここに定義されるオリゴヌクレオチドまたは組成物の使用が提供される。前記使用の特徴はそれぞれ先に定義されている。

本発明による使用または方法における治療は、少なくとも１週間、少なくとも１か月、少なくとも１年、少なくとも２、３、４、５、６年またはそれ以上である。本発明による使用のための、ここに定義される分子またはオリゴヌクレオチドまたはその等価物の各々は、炎症性障害を患うか、またはその発症のリスクがある個体の細胞、組織および／または臓器にインビボでの直接の投与に適していてよく、インビボ、エキソビボまたはインビトロで直接投与されてよい。本発明のオリゴヌクレオチド、組成物、化合物の投与の頻度は、患者の年齢、患者の変異、分子の数（すなわち用量）、前記分子の調製といった複数のパラメータに依存してよい。頻度は、毎日、毎週であってよく、または少なくとも２週、３週、４週、５週またはそれより長い期間に一度であってよい。

方法
さらなる側面において、個体または前記個体の細胞、組織もしくは臓器において炎症性障害の１以上の症状を緩和する方法、または前記個体の細胞、組織または臓器の１以上の特徴または症状を緩和する方法であって、前記個体にここに定義されるようなオリゴヌクレオチドまたは組成物を投与することを含む方法が提供される。

さらに、炎症性障害を患う個体における前記ｍＲＮＡ前駆体を発現する細胞において、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体からのエキソンのスキッピングを増強、誘導または促進する方法であって、前記個体にここに定義されるようなオリゴヌクレオチドまたは組成物を投与することを含む方法が提供される。

さらに、ＩＬ−１ＲＡｃＰまたはＣ５をコードするｍＲＮＡ前駆体を含む細胞において可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの製造を増加させるためのおよび／またはＣ５ａの製造を減少させるための方法であって、前記細胞に本発明のオリゴヌクレオチドまたは組成物を供給すること、および前記ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングから製造されるｍＲＮＡの翻訳を可能にすることを含む方法が提供される。１つの実施形態において、前記方法は、例えば細胞培養を使用してインビトロで行なわれる。好ましくは、前記方法はインビボである。これらの方法の特徴はそれぞれ既にここに定義されている。本発明の方法において、オリゴヌクレオチドは、個体において炎症性障害の治療のために使用されることが既知の付加的な化合物と組み合わされてよい。そのような化合物は、抗体、ＤＭＡＲＤ（疾病改変抗リューマチ薬）、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症剤）および／または異なるかまたは別のＡＯＮであってよい。可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの製造の増大の代わりに、またはそれとの組み合わせで、ＡＯＮは、ＮＦ−κＢの活性化を減少させてよく、および／またはＩＬ−６／ＩＣＡＭ−１の放出を減少させてよく、および／または先に定義されるような遊離型ＩＬ−１の量を減少させてよい。

本願を通して、ＩＬ−１、ＩＬ−１ＲＡｃＰ、Ｃ５、Ｃ５ａ、ＩＬ−６と呼ばれた場合、特に記載されない限りタンパク質またはペプチドを指す。したがって、ＩＬ−１は、ＩＬ−１タンパク質と置き換えてよい。特に記載されない限り、ここに記述される実施形態はそれぞれここに記述される別の実施形態と組み合わせてよい。

この書面および特許請求の範囲において、「含む」という動詞およびその語形変化は、非限定的な意味で、単語に続く事項を含むが、特に言及されていない事項を除外しないことを意味するものとして使用される。さらに「から成る」とう動詞は、「から本質的に成る」と置換することができ、ここに定義された分子またはオリゴヌクレオチドは、特異的に同定されたもの以外の、本発明の固有の特徴を変化させない付加的な成分を含んでよいことを意味する。

さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素への言及は、文脈が、１つおよびただ１つの要素が存在することを明確に要求しない限り、１つ以上の要素が存在する可能性を除外しない。不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、したがって、通常「少なくとも１つ」を意味する。

「ほぼ」または「約」という単語が、数値に関して使用された場合（ほぼ１０、約１０）、好ましくは、その値は、所定値１０の１％前後の値であることを意味する。

本願明細書にて引用された全ての特許文献および参考文献は、その全体が本願に援用される。特に記載されない限り、ここに定義されるそれぞれの実施形態は、ともに組み合わせてよい。

本発明は、下記の例においてさらに説明される。これらの例は、本発明の範囲を制限せず、単に本発明を明確化するためのものである。

フランキングイントロンを有するマウスＣ５ ｍＲＮＡ前駆体エキソン１７を標的化するＡＯＮ。 Ｌ９２９細胞に、表示されるＡＯＮを終濃度５００ｎＭでトランスフェクトした。２４時間後、ＲＮＡを、エキソンスキッピングのために単離し、ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。 フランキングイントロンを有するマウスＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体エキソン９を標的化するＡＯＮ。 ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に、表示されるＡＯＮを終濃度５００ｎＭでトランスフェクトした。２４時間後、ＲＮＡを、エキソンスキッピングのために単離し、ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。 ヒトＣ５ ｍＲＮＡ前駆体エキソン１７を標的化するＡＯＮ。 フランキングイントロンを有するヒトＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体エキソン９を標的化するＡＯＮ。 ＨＥＰ−Ｇ２細胞に、表示されるＡＯＮを終濃度５００ｎＭでトランスフェクトした。２４時間後、ＲＮＡを、エキソンスキッピングのために単離し、ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。 １−３０； ＩＬ−１ＲＡｃＰエキソン９スキッピングのための種々の濃度の種々のＡＯＮで治療したＮＩＨ−３Ｔ３細胞のＲＴ−ＰＣＲ結果。

１： ３００−２１ｍｅｒ ２０ｎＭ
２： ３００−２１ｍｅｒ ５０ｎＭ
３： ３００−２１ｍｅｒ １００ｎＭ
４： ３００−２１ｍｅｒ ２００ｎＭ
５： ３００−２１ｍｅｒ ５００ｎＭ
６： ３００−２５ｍｅｒ ２０ｎＭ
７： ３００−２５ｍｅｒ ５０ｎＭ
８： ３００−２５ｍｅｒ １００ｎＭ
９： ３００−２５ｍｅｒ ２００ｎＭ
１０： ３００−２５ｍｅｒ ５００ｎＭ
１１： ３２７−２１ｍｅｒ ２０ｎＭ
１２： ３２７−２１ｍｅｒ ５０ｎＭ
１３： ３２７−２１ｍｅｒ １００ｎＭ
１４： ３２７−２１ｍｅｒ ２００ｎＭ
１５： ３２７−２１ｍｅｒ ５００ｎＭ
１６： ３２７−２５ｍｅｒ ２０ｎＭ
１７： ３２７−２５ｍｅｒ ５０ｎＭ
１８： ３２７−２５ｍｅｒ １００ｎＭ
１９： ３２７−２５ｍｅｒ ２００ｎＭ
２０： ３２７−２５ｍｅｒ ５００ｎＭ
２１： ３００−ＬＮＡ １０ｎＭ
２２： ３００−ＬＮＡ ２０ｎＭ
２３： ３００−ＬＮＡ ５０ｎＭ
２４： ３００−ＬＮＡ １００ｎＭ
２５： ３００−ＬＮＡ ２００ｎＭ
２６： ３００−ＬＮＡ ５００ｎＭ
２７： ポジティブコントロール
２８： ネガティブコントロール
２９： トランスフェクトせず
３０： 疑似的トランスフェクト
Ｍ マーカー
３１−５５； Ｃ５エキソン１７スキッピングのための種々の濃度の種々のＡＯＮで治療したＬ９２９細胞のＲＴ−ＰＣＲ結果。

３１： ３２９−２１ｍｅｒ ２０ｎＭ
３２： ３２９−２１ｍｅｒ ５０ｎＭ
３３： ３２９−２１ｍｅｒ １００ｎＭ
３４： ３２９−２１ｍｅｒ ２００ｎＭ
３５： ３２９−２１ｍｅｒ ５００ｎＭ
３６： ３２９−２５ｍｅｒ ２０ｎＭ
３７： ３２９−２５ｍｅｒ ５０ｎＭ
３８： ３２９−２５ｍｅｒ １００ｎＭ
３９： ３２９−２５ｍｅｒ ２００ｎＭ
４０： ３２９−２５ｍｅｒ ５００ｎＭ
４１： ３２９−ＬＮＡ １０ｎＭ
４２： ３２９−ＬＮＡ ２０ｎＭ
４３： ３２９−ＬＮＡ ５０ｎＭ
４４： ３２９−ＬＮＡ １００ｎＭ
４５： ３２９−ＬＮＡ ２００ｎＭ
４６： ３２９−ＬＮＡ ５００ｎＭ
４７： ３５４−２５ｍｅｒ ２０ｎＭ
４８： ３５４−２５ｍｅｒ ５０ｎＭ
４９： ３５４−２５ｍｅｒ １００ｎＭ
５０： ３５４−２５ｍｅｒ ２００ｎＭ
５１： ３５４−２５ｍｅｒ ５００ｎＭ
５２： トランスフェクトせず
５３： 疑似的トランスフェクト
５４： ポジティブコントロール
５５： ネガティブコントロール
種々の濃度におけるＩＬ−１ＲＡｃＰのための種々のＡＯＮのスキッピング効率の、ｑＰＣＲを用いた比較。 種々のＡＯＮ量で治療した肝臓サンプルのＲＴ−ＰＣＲ結果。ＰＳ−３００およびシーケンシングの結果。

ａ）ＩＬ−１ＲＡｃＰ ＡＯＮを８日間、５０ｍｇ／ｋｇでＩＰ注入。注入後１日において犠牲にした。

ｂ）４または３日間の１００ｍｇ／ｋｇでのＩＶ注入。注入後１日において犠牲にした。

ｃ）より低いバンドの配列分析。
種々のＡＯＮ量で治療した肝臓サンプルのＲＴ−ＰＣＲ結果。ＰＳ−３００およびシーケンシングの結果。

ａ）ＩＬ−１ＲＡｃＰ ＡＯＮを８日間、５０ｍｇ／ｋｇでＩＰ注入。注入後１日において犠牲にした。

ｂ）４または３日間の１００ｍｇ／ｋｇでのＩＶ注入。注入後１日において犠牲にした。

ｃ）より低いバンドの配列分析。
種々のＡＯＮ量で治療した肝臓サンプルのＲＴ−ＰＣＲ結果。ＰＳ−３００およびシーケンシングの結果。

ａ）ＩＬ−１ＲＡｃＰ ＡＯＮを８日間、５０ｍｇ／ｋｇでＩＰ注入。注入後１日において犠牲にした。

ｂ）４または３日間の１００ｍｇ／ｋｇでのＩＶ注入。注入後１日において犠牲にした。

ｃ）より低いバンドの配列分析。
種々のＡＯＮ量で治療した肝臓サンプルのＲＴ−ＰＣＲ結果。ＰＳ−３２９およびシーケンシングの結果。

ａ）Ｃ５−ＡＯＮの４日間の１００ｍｇ／ｋｇでのＩＶ注入。注入後１日において犠牲にした。コントロールＡＯＮ（４日間、５０ｍｇ／ｋｇ）。

ｂ）Ｃ５−ＡＯＮの３日間の１００ｍｇ／ｋｇＡＯＮでのＩＶ注入。ｍ１は、注入後１日において犠牲にした。ｍ２は、中入後５日において犠牲にした。

ｃ）シーケンシングの結果。
種々のＡＯＮ量で治療した肝臓サンプルのＲＴ−ＰＣＲ結果。ＰＳ−３２９およびシーケンシングの結果。

ａ）Ｃ５−ＡＯＮの４日間の１００ｍｇ／ｋｇでのＩＶ注入。注入後１日において犠牲にした。コントロールＡＯＮ（４日間、５０ｍｇ／ｋｇ）。

ｂ）Ｃ５−ＡＯＮの３日間の１００ｍｇ／ｋｇＡＯＮでのＩＶ注入。ｍ１は、注入後１日において犠牲にした。ｍ２は、中入後５日において犠牲にした。

ｃ）シーケンシングの結果。
種々のＡＯＮ量で治療した肝臓サンプルのＲＴ−ＰＣＲ結果。ＰＳ−３２９およびシーケンシングの結果。

ａ）Ｃ５−ＡＯＮの４日間の１００ｍｇ／ｋｇでのＩＶ注入。注入後１日において犠牲にした。コントロールＡＯＮ（４日間、５０ｍｇ／ｋｇ）。

ｂ）Ｃ５−ＡＯＮの３日間の１００ｍｇ／ｋｇＡＯＮでのＩＶ注入。ｍ１は、注入後１日において犠牲にした。ｍ２は、中入後５日において犠牲にした。

ｃ）シーケンシングの結果。

発明の詳細な説明

［実施例］
溶血性補体アッセイ
Ｃ５およびＣ５Δ１７（エキソン１７を欠く）のｃＤＮＡを合成し、ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）に結紮する。ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３）に、Ｃ５またはＣ５Δ１７のいずれかを含む発現ベクターをトランスフェクトし、Ｇ−４１８を含む培地で培養しポジティブコロニーを選択する。その後、ポジティブコロニーを無血清条件にて培養し、培養培地を回収し、精製し、ウエスタンブロット法によりＣ５およびＣ５Δ１７の存在を試験する。その後、精製した上清を、無処置のＣ５ｂが存在するかどうか示す溶血性補体アッセイに供する。この機能アッセイにおいて、両方の上清を、Ｃ５を欠く血清で処理し、この溶液を赤血球とともにインキュベートする。Ｃ５ｂ−９を介した溶解の程度を、４１５ｎｍにてＯＤを測定することにより決定する。

材料および方法（全ての例について）
ＡＯＮの設計および化学
ＡＯＮは、Aartsma-Rus et al., 2009にて以前に議論された基準に基づいて設計した（Aartsma-Rus et al., Guidelines for antisense oligonucleotide design and insight in splice modulating mechanisms, Mol Ther. 2009 Mar; 17(3):548-53）。潜在的なエキソンスプライスエンハンサー（ＥＳＥ）の位置、または５’／３’スプライスサイト配列に対する位置は、ＥＳＥファインダー３．０を使用して予測した（http://rulai.cshl.edu/tools/ESE/）。Ｍ−ＦＯＬＤ（http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/）によって予測されるｍＲＮＡ前駆体の二次構造を、さらに考慮に入れた。ＡＯＮは、２’Ｏ−メチルリボース分子および完全なホスホロチオネート骨格（Ｐｒｏｓｅｎｓａ）を備えた２１−２５ｍｅｒだった。ＡＯＮの配列は配列表にて提供される。５’ＦＡＭ標識コントロールＡＯＮを、標的細胞へのトランスフェクションの効率を試験するために使用した。さらに、標的に対するそれらの効率を増加させるために、それらの長さを２５ｍｅｒに増加させることによっておよび／またはいくつかのロックされた核酸（ＬＮＡ）の改変の組み込みによって、選択したＡＯＮを改変した。これらのＡＯＮの設計のために、http://www.exiqon.com/custom-antisense-oligonucleotidesの基準を使用した。

細胞培養:
Ｌ９２９（マウス結合組織）、ＮＩＨ−３Ｔ３（マウス胚性繊維芽細胞）およびＨＥＰＧ２（ヒト肝細胞性肝臓癌）細胞株を、３７℃、５％のＣＯ_２下で、ＤＭＥＭ＋２ｍＭのＬ−グルタミン＋１０％のＦＣＳ＋１ｘＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐに維持した。それらを、それぞれｍＩＬ−１ＲＡｃＰ、ｍＣ５およびｈＩＬ−１ＲＡｃＰ／ｈＣ５についてのＡＯＮを使用してエキソンスキッピングを試験するために使用した。

細胞培養におけるＡＯＮ送達：
Ｌ９２９およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳ＋１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐを含む培地で培養し、６ウェルプレートにおける実験培養のために、０．２５％のトリプシンとともに備えたコンフルエントの状態になるまで培養した。トランスフェクションの日に、細胞（０．５−１×１０^６細胞／ウェルの６ウェルプレート）を、ＤＭＥＭ＋１０％のＦＣＳ（抗生物質を含まない）にて培養した。３−４から５−６時間後、細胞において、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の手順に従って準備したリポフェクタミン２０００＋ＡＯＮ混合物を用いてトランスフェクトした。ＡＯＮの終濃度は、種々の実験において、５００ｎＭ、２００ｎＭまたは１００ｎＭに調節した。それぞれのＡＯＮは３回試験し、スキッピング効率を決定した。６ウェルプレートの１ウェルのためのトランスフェクション溶液は次のように準備した：ＡＯＮを、２５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ血清低減培地に希釈した（細胞に添加したときのＡＯＮの終濃度は、実験の目的に応じて、１００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭまたは１０ｎＭとした）。さらに、５μｌのリポフェクタミンを２５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍに希釈し、両希釈物を室温にて５分間インキュベートした。その後、２つの希釈物を混合し（全容量５００μｌ）、２０分間インキュベートし、細胞プレートに添加し、前後に数回振動させ、５％のＣＯ_２の下３７℃でインキュベートした。６−８時間後、トランスフェクション培地をＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳに交換し、１８−２４時間後、ＲＮＡ単離のために細胞の用意が整った。

ＲＮＡ単離および逆転写ＰＣＲ：
１０^６細胞からのＡＯＮのトランスフェクションの２４時間後、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡは、任意のヘキサマープライマーを使用して、製造者（Ｒｏｃｈｅ）の手順に従って、トランスクリプター一本鎖ｃＤＮＡ合成キットにて合成した。２μＬのｃＤＮＡを、５０μＬの終濃度でＰＣＲ反応に使用した。プライマー配列は、５’から３’の方向で、ｍＣ５ Ｆ（フォワード）：ａａａｃｇｃａｇａｔｇａｃｔｃｃｃａｔｔ、ｍＣ５ Ｒ（リバース）：ａｃｇｃｇａｔｇａａｔｔｔｃｃｃａｔａｇ、ｍＩＬ−１ＲＡｃＰ Ｆ：ｇａｇｇａｔｃｔｃａｇｇｃｇｃａａｃｔａ、ｍＩＬ−１ＲＡｃＰ Ｒ：ｔｃａｇｃａｇｃａｃａａａｔｔｃｃｔｃｔｔ、ｈＣ５ Ｆ：ｔｔｃｔｃａｇｇｃｃａａｇａａｇａａｃｇ、ｈＣ５ Ｒ：ｇｇｇｃａａａｃｔｇｃａａｃｔｇｔｔｔｔ、ｈＩＬ−１ＲＡｃＰ Ｆ：ｃａａｇｃｇｃａｇｃｔａｔｇｔｃｔｇｔｃ、ｈＩＬ−１ＲＡｃＰ Ｒ：ｔｃｔｃｇｇｔｃａａａｇａｔｇｃａｃａｇである。ベータアクチン遺伝子（ＡＣＴＢ）をポジティブコントロールとして使用した：ＡＣＴＢ Ｆ：ａｃｔｇｃｔｃｔｇｇｃｔｃｃｔａｇｃａｃ、ＡＣＴＢ Ｒ：ｃｃａｃｃｇａｔｃｃａｃａｃａｇａｇｔａ。これらのプライマーは配列表において配列番号４３−５２として示されている。ＰＣＲ産物を、ＥｔＢｒで染色した１，５％のアガロースゲルで分析した。シーケンシグのために、ＰＣＲ産物をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ抽出ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）にて精製した。産物の配列分析はＬＧＴＣ（Ｌｅｉｄｅｎ）で行った。肝臓からのＲＮＡ単離のために、１５−３０ｍｇのマウス肝臓を、ＭａｇｎａＬｙｚｅｒ Ｇｒｅｅｎ Ｂｅａｄｓ（Ｒｏｃｈｅ）チューブに移した。５ｕｌの２−メルカプトエタノールを含む５００ｕｌのＰＢＳを添加し、氷上にて、サンプルを、ＭａｇｎａＬｙｚｅｒにて７０００ｒｐｍで２０秒間ホモジネートし、その後、さらに１０秒間、７０００ｒｐｍでホモジネートした。２００μｌのホモジネートした組織を、８００μｌのＴｒｉｚｏｌ試薬に添加し、ＲＮＡ単離を、製造者の手順に従って行った。

リアルタイムＰＣＲ分析：
２．５μＬのｃＤＮＡ（２０倍希釈）、５μＬの２ｘＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（ＲＯＸ．，Ｒｏｃｈｅ）、０，２５μＬの１０ｐｍｏｌｅプライマーを、全１０μＬの反応混合物にて使用した。プライマー配列は、５’から３’の方向で、ｍＩＬ−１ＲＡｃＰ Ｆ：ｔｇｇｔａｇｔｇｇｔｔｃｔｃａｔｔｇｔｇｇｔ、ｍＩＬ−ＲＡｃＰ Ｒ：ｔｃｃａａａｇｔｇａｇｃｔｃｇｇｔａａａａ、ｍＣ５ Ｆ：ａａａｇｃｃｃｃｃａｔａａａｃｃｔｇｔｃ、ｍＣ５ Ｒ：ｔｃｇｇａｔａｔｃｔｇｃｃｔｔｃａｔｃａである。全ての定量的ＰＣＲデータは、ハウスキーピング遺伝子ＡＣＴＢおよびシトクロムｃ−１（Ｃｙｃ１）の発現にて標準化した：ＡＣＴＢ Ｆ：ａｃｔｇｃｔｃｔｇｇｃｔｃｃｔａｇｃａｃ、ＡＣＴＢ Ｒ：ｃｃａｃｃｇａｔｃｃａｃａｃａｇａｇｔａ、Ｃｙｃ１ Ｆ：ｔｇｃｔａｃａｃｇｇａｇｇａａｇａａｇｃ、Ｃｙｃ１ Ｒ：ｃａｔｃａｔｃａｔｔａｇｇｇｃｃａｔｃｃ。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）を、反応を実行するために使用し、データをソフトウェアプログラムｑＢａｓｅ（Ｂｉｏｇａｚｅｌｌｅ ＮＶ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって分析した。これらのプライマーは配列表において配列番号５３−６０として示されている。

ｍＲＮＡレベルでのスキッピングのインビボ検出
オスの６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、３または４日間連続で、インシュリンＭｙｊｅｃｔｏｒ Ｕ−１００インスリンシリンジを使用して、ＩＢまたはＩＰで、５０または１００ｍｇ／ｋｇのＡＯＮを注射した。注射から１日後または５日後に、肝臓を採取し、ＲＮＡの分解を防ぐためにＲＮＡ単離まで液体窒素に維持した。ＲＮＡ単離およびＲＴ−ＰＣＲ処置を先に記載した通りに行った。

細胞からのタンパク質の単離
培養培地を細胞から取り除き、１ｍｌの冷却したＲＩＰＡバッファー（Ｒｏｃｈｅの完全ミニプロテアーゼ阻害剤を含む）を、７５ｃｍ２フラスコにて５ｘ１０^６細胞に対して添加し、揺らしながら５分間氷上に維持した。細胞溶解物を、細胞スクレーパーを使用して集め、マイクロ遠心分離チューブに移した。サンプルは１５分間１４．０００ｘｇで遠心分離し、細胞デブリスを沈殿させた。上清を新しいチューブに移し、タンパク質濃度うぃＱｕａｎｔｉ−ｉｔタンパク質アッセイキットを使用して決定した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
７．９ｍｌの水、５ｍｌの１．５ＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８．８）、６．７０ｍｌのアクリルアミド、２００μｌの１０％ＳＤＳ、８μｌのＴＥＭＥＤおよび２００μｌの１０％ＡＰＳを混合して、１０％ゲルの分離ゲルを作製した。ＴＥＭＥＤおよびＡＰＳを添加した直後、ゲルを注ぎ（７．２ｍｌ／ゲル）、１ｍｌのイソプロピルアルコール／Ｍｉｌｉｑ（５０／５０）をゲルの上部に置き、重合させた。ゲルは約３０分間重合させた。その後、５．５ｍｌの水、１ｍｌの１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１．３３ｍｌのアクリルアミド、８０μｌの１０％ＳＤＳ、８μｌのＴＥＭＥＤおよび８０μｌの１０％ＡＰＳを混合して、スタッキングゲルを準備し、分離ゲルの上にピペットで移し、コームを設置し、重合させた。タンパク質サンプルを準備し（フード下において、１５μｌサンプル＋５μｌローディングバッファー）、サンプルを５分間９５℃で煮沸し、氷上で冷却した。スタッキングゲルの準備を整えて、ランニングバッファーをゲルユニットのチャンバーの上部および下部に添加し、それぞれのスロットに１５μｌ充填した。サンプルが分離ゲルに達するまで、ゲルに８０Ｖの電圧をかけ、その後、青い色がゲルを離れるまで１２０Ｖの電圧をかけた。

ウエスタンブロッティング法
２つの繊維パッドおよび３枚のプリカットされたＷｈａｔｍａｎ３ＭＭ紙を用意し、トランスファーバッファーに浸した。ＰＶＤＦ膜を１００％メタノールに短時間浸し、蒸留水で２度洗浄し、ＰＢＳにてインキュベートした。システムをカセットにて以下の順番で組み立てた：１つの繊維パッド、３つのＷｈａｔｍａｎ紙、ゲル、ＰＶＤＦ膜、３つのＷｈａｔｍａｎ紙、１つの繊維パッド。カセットを電極モジュールに挿入し、膜がゲルと陽極との間に位置するようにトランスファータンクに入れ、冷却室（４℃）にて１時間、サンプルに１００Ｖの電圧をかけた。緩やかに振動する振動プラットフォームにて、室温で１時間または４℃で一晩、膜をＯｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファーにてブロッキングした。一次抗体をＯｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファーにて希釈し、バックグラウンドを低下させるために、０．２％のＴｗｅｅｎ−２０を希釈した抗体に添加し、振動プラットフォームにて一晩穏やかに揺らしながらインキュベートした（最適なインキュベーション時間は、一次抗体ごとに異なる）。ウサギ抗ヒトＩＬ−１ＲＡｃＰ抗体（ＡｂＤ ｓｅｒｏｔｅｃ、製品番号ＡＨＰ５４９）およびチキンポリクローナルベータアクチン抗体（Ａｂｃａｍ、製品番号Ａｂ １３８２２）を使用した。膜を、穏やかに振動させながらＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で室温にて５分間の洗浄を４回行い、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー（０．２％のＴｗｅｅｎ−２０および０．０１％−０．０２％のＳＤＳを添加）に希釈した蛍光標識二次抗体とともに１時間室温で、光を遮りながらインキュベートした。二次抗体は、ヤギ抗ウサギＡｂ（Ｌｉｃｏｒ、製品番号９２６−３２２１１）およびロバ抗チキンＡｂ（Ｌｉｃｏｒ、製品番号９２６−３２２２８）を使用した。膜に対して、穏やかに振動しながら（光を遮断）、ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ−２０にて室温における５分間の洗浄を４回行い、その後、膜を、Ｌｉ−ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステムにてスキャンした。

ＮＦ−κＢ活性アッセイ
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、２４ウェルプレートに４０．０００細胞／ウェルで播種した。翌日、細胞に、上記の手順によってコントロールおよび試験されるＡＯＮをトランスフェクトした。細胞を一晩培養し、リポフェクタミン２０００によりｐＮＦκＢ−ＬｕｃおよびｐＲＬ−ＣＭＶプラスミドをトランスフェクトした。翌朝、細胞を４時間、ｍＩＬ−１βで刺激した。デュアルルシフェラーゼリポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の試薬を、製造者の手順にそって準備した。培養培地を除去し、細胞を１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。２５０μｌの１Ｘ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓバッファーを細胞に添加し、細胞を採取した。細胞溶解物をマイクロ遠心分離チューブに移し、４℃で、１３，０００ｇにて５分間遠心分離することで、デブリスを除去した。３０μｌの溶解物を、９６ウェルプレートのウェルの各々に添加した。１００μｌのＬＡＲＩＩをウェルの各々に添加し、ホタルルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定した。その後、１００μｌの１ＸＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ試薬をウェルの各々に添加し、レニラルシフェラーゼ活性を測定した。ｐＮＦκＢ−Ｌｕｃ活性はｐＲＬ−ＣＭＶにて標準化した。

ＩＬ−１誘導型サイトカイン産生アッセイ
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、１０％ＦＢＳを補ったＤＭＥＭにおいて、６ウェル培養ディッシュにて、０、５ｘ１０^６細胞／ウェルの密度で、培養した。細胞に対して、先に記載するように、５０ｎＭのＡＯＮ ＰＳ−３００ＬＮＡをトランスフェクトした。１６時間後、細胞を１ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−１βで４−５時間刺激した。その後、先に記述するように、全ＲＮＡの単離およびｃＤＮＡ合成を行った。ＩＬ−１に誘導される、ＩＬ−６およびＩＣＡＭ−１といったサイトカインの誘導を、以下のプライマーセットを使用して、先に記述されるようなｑＰＣＲアッセイを行なうことで決定した：マウスＩＬ−６フォワードプライマーＣＣＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＴＴＣＡＣＡＧ、ＩＬ−６リバースプライマーＴＣＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣＣＡＧＡＧＡＡＣ；マウスＩＣＡＭ−１フォワードプライマーＧＧＣＡＴＴＧＴＴＣＴＣＴＡＡＴＧＴＣＴＣＣＧを進める、ＩＣＡＭ−１リバースプライマーＧＣＴＣＣＡＧＧＴＡＴＡＴＣＣＧＡＧＣＴＴＣ。すべてのデータは、ハウスキーピング遺伝子ベータアクチンの発現で標準化した；マウスのベータアクチンフォワードプライマーＡＣＴＧＧＧＡＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧ、リバースプライマーＧＧＴＣＡＴＣＴＴＴＴＣＡＣＧＧＴＴＧＧ。これらのプライマーは配列番号６６−７１として配列表に示される。

例１:炎症性疾患を治療するための、Ｃ５ａタンパク質のエキソン１７のスキッピングまたはｓＩｌ−１ＲＡｃＰタンパク質のエキソン９のスキッピング
炎症性疾患を治療するためのＣ５ａタンパク質のエキソン１７のスキッピング
目的は、Ｃ５ａの量を減少させ、Ｃ５ｂをそのままの状態に維持することである。Ｃ５は肝臓によって生産されるため、Ｃ５特異的ＡＯＮの標的器官は肝臓である。

マウスＣ５エキソン１７を標的エキソンとして選択した。それは、Ｃ５ａのアナフィラトキシンドメインをコードする。ＩＶまたはＩＰ注射後、大部分のＡＯＮは肝臓に行き、肝細胞によって容易に取り込まれる。そこで、それらはＲＮａｓｅＨによる標的の分解を生じることなく、標的ＲＮＡとハイブリダイズする。エキソン１７との結合により、このエキソンは、スプライシング機構によって認識されず、オープンリーディングフレームをそのままに維持しながら、フランキングイントロンとともに除去されるだろう。生じる切断型タンパク質Ｃ５Δ１７は、Ｃ５転換酵素によってＣ５ｂに転換され、Ｃ５ｂは、なおＭＡＣに取り込まれることが可能であり、Ｃ５ａの残る、小さな、非機能的部分は恐らく分解されるだろう。機能的Ｃ５ｂ分子が生産されたか否かを明らかにするために、機能アッセイを設計し、実行した。

種々のＥＳＥ結合部位または５’−３’スプライスサイトをカバーするＡＯＮを設計し（図１）、試験し（表１）、結果を図２に示す。我々は、エキソン１７のスキッピングに使用できるエキソン（およびフランキングイントロン）の可能な部位をすべてカバーするＡＯＮを設計し、ｑＰＣＲ分析によってさらに試験して効率的なものを選択した。選択されたＡＯＮのスキッピング効率を増大するために、それらの長さを２５ｍｅｒまで延長し、限定された数の５−６ＬＮＡ修飾を付加した。ハイブリダイゼーション特性が増強されたかどうかは、インビトロで試験した（図８、３１−５５）。

炎症性疾患を治療するためのｓＩｌ−１ＲＡｃＰタンパク質のエキソン９のスキッピング
目的は、可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの量について、その膜結合形態から可溶性形態に変化させることで増大させることである。それは肝臓によって生産されるため、可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰに特異的なＡＯＮのための標的器官は肝臓である。

マウスＩＬ−１ＲＡｃＰエキソン９は、ＩＬ−１ＲＡｃＰの膜貫通ドメインをコードするため、それを標的エキソンに選択した。エキソン９のスキッピングがオープンリーディングフレームを妨害しないため、我々は、ＩＬ−１ＲＡｃＰΔ９と呼ばれる可溶性形態の取得を提案する。ＩＶまたはＩＰ注射後、ＡＯＮは肝臓に行き、肝細胞によって容易に取り込まれる。そこで、それらはＲＮａｓｅＨによる標的の分解を生じることなく、標的ＲＮＡとハイブリダイズする。エキソン９との結合により、このエキソンは、スプライシング機構によって認識されず、フランキングイントロンとともに除去されるだろう。

異なるＥＳＥ結合部位または５'−３'スプライスサイトをカバーするＡＯＮを設計し（図３）、試験し（表２）、結果を図４に示す。我々は、エキソン９のスキッピングに使用できるエキソン（およびフランキングイントロン）の可能な部位をすべてカバーするＡＯＮを設計し、ｑＰＣＲ分析によってさらに試験して効率的なものを選択した。選択されたＡＯＮのスキッピング効率を増大するために、それらの長さを２５ｍｅｒまで延長し、限定された数の５−６ＬＮＡ修飾を付加した。ハイブリダイゼーション特性が増強されたかどうかは、インビトロで試験した結果を図８に示す（１−３１）。異なる濃度における異なるＡＯＮのスキッピング効率もｑＰＣＲと比較した（図９）。

例２：細胞株におけるオリゴヌクレオチドの機能性の確認
結果：
Ｃ５エキソン−１７スキッピング
Ｃ５ａの濃度を減少させるために、一連のＡＯＮをマウスまたはヒトエキソン１７を標的化するように設計した（例１を参照）。それらは、Ｌ９２９およびＨｅｐＧ２細胞株それぞれでスクリーニングした。細胞株はリポフェクタミン２０００にてＡＯＮをトランスフェクトし、平均トランスフェクション効率を、蛍光性ＡＯＮを使用して決定した。マウス標的エキソンについての１１ＡＯＮおよびヒト標的エキソンについての３ＡＯＮのスクリーニングから、ＡＯＮ ＰＳ３２９およびＰＳ３７７は、スキッピングエキソン１７において最も成功したＡＯＮとして選択された。有効なＡＯＮは、マウスおよびヒト標的について、それぞれ約１７８ｂｐおよび約１５５ｂｐのサイズで、より短い転写物断片を作ると予想された（図２および７）。配列分析は、さらにより短い断片は欠いているエキソン１７であることを示した。ＡＯＮ ＰＳ−３２９，３２９−２５ｍｅｒ，３５４，３２９−ＬＮＡは、異なる濃度において広範囲に試験し、スキッピングにおける効率と比較した。より短い断片のアガロースゲルにおけるバンドの密度の比較に基づいて、ＰＳ−３２９−ＬＮＡはその他のものよりも少し有効であった（図８、３１−５５）。ＡＯＮ ＰＳ−３２９も試験し、パイロット実験において機能的インビボを見出した。１００ｍｇ／ｋｇのＡＯＮを、ＩＶで３または４日間注射し、肝臓試料をＲＴ−ＰＣＲで分析し、エキソンスキッピングを検出した。スキップされた産物は正確なサイズを有しており、配列分析から、それが正確な産物であることが確認された。

ＩＬ−１ＲＡｃＰエキソン９−スキッピング
可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの産生（ＩＬ−１ＲＡｃＰΔ９）を誘導するために、一連のＡＯＮをマウスおよびヒトエキソン９を標的化するように設計した（例２を参照）。それらは、ＮＩＨ−３Ｔ３およびＨｅｐＧ２細胞株にてそれぞれスクリーニングした。細胞株はリポフェクタミン２０００にてＡＯＮをトランスフェクトし、平均トランスフェクション効率を、蛍光性ＡＯＮを使用して決定した。マウス標的エキソンについての１３ＡＯＮおよびヒト標的エキソンについての５ＡＯＮのスクリーニングから、ＡＯＮ ＰＳ３００およびＰＳ３７３は、スキッピングエキソン９において最も成功したＡＯＮとして選択された。有効なＡＯＮは、マウスおよびヒト標的について、それぞれ約１５０ｂｐおよび約２００ｂｐのサイズで、より短い転写物断片を作ると予想された（図４および７）。配列分析は、さらにより短い破片がエキソン９を欠くことを示した。ＡＯＮ ＰＳ−３００，３００−２５ｍｅｒ，３００−ＬＮＡ，３２７および３２７−２５ｍｅｒは、異なる濃度において広範囲に試験し、スキッピングにおける効率と比較した。ＰＳ−３００−ＬＮＡは、特に５０ｎＭの濃度での他のＡＯＮよりも、スキッピングにおいてはるかに有効だった（約８５％）（図８、１−３１）。ｑＰＣＲ分析によって結果を確認した（図９）。ＡＯＮ ＰＳ−３００も、パイロット実験においてインビボで試験した。５０−１００ｍｇ／ｋｇのＡＯＮを３または４日間ＩＰまたはＩＶで注射し、肝臓試料を、エキソンスキッピングのためにＲＴ−ＰＣＲで分析した。スキップされた産物は正確なサイズを有していることが、配列分析で確認された。インビボスキッピング効率は、インビトロスキッピング効率と比較可能だった（図１０）。

例３：本発明のオリゴヌクレオチドの機能性を試験するその他の方法
本発明のオリゴヌクレオチドの有効性を、さらに、ウエスタンブロッティング法により、ｓＩＬ−１ＲＡｃＰ、ＩＬ−１、Ｃ５ａまたはＣ５ｂを定量することによって、タンパク質レベルで試験してよい：例えば、可溶性ｓＩＬ−１ＲＡｃＰの増加および／または遊離型ＩＬ−１の減少および／またはＣ５ａの減少。本発明のオリゴヌクレオチドの有効性は、さらに、分子の活性の存在もしくは濃度またはＩＬ−１によって誘導または活性化された経路を評価することによる、Ｉｌ−１ＲＡｃＰのための機能アッセイによって試験してよい。Ｉｌ−１はＮＦ−κＢ活性化を誘導する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドの有効性は、さらに、ＮＦ−Κｂの活性化、ＮＦ−Κｂの活性の低下を評価することで試験してよい。

ＩＬ−１は、ＩＬ−６またはＩＣＡＭ−１のような細胞からのあるケモカインおよび炎症誘発性サイトカインの産生を誘導する。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドの有効性は、ＩＬ−６またはＩＣＡＭ−１の存在、ＩＬ−６および／またはＩＣＡＭ−１の減少を評価することで試験してよい。

本発明のオリゴヌクレオチドの有効性は、さらに、Van Dijk H. Et al, (1980), J. Immunol. Meth. 39: 257-268に記載されるように、溶血性アッセイのようなＣ５のための機能アッセイによって試験してよい。

以下に、本願の出願当初の請求項の記載を、実施の態様として付記する。
［１］ 可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの量を増やすために、ＩＬ−１ＲＡｃＰをコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを変化させることができる分子、好ましくはオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物。
［２］ 前記オリゴヌクレオチドは、ＩＬ−１ＲＡｃＰをコードする前記ｍＲＮＡ前駆体のエキソン９のスキッピングを誘導することができる、［１］に記載のオリゴヌクレオチド。
［３］ Ｃ５ａの量を減らすために、Ｃ５をコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを変化させることができる分子、好ましくはオリゴヌクレオチドまたはその機能的等価物。
［４］ Ｃ５ｂの量は変化しない、［３］に記載のオリゴヌクレオチド。
［５］ 前記オリゴヌクレオチドは、Ｃ５をコードする前記ｍＲＮＡ前駆体のエキソン１７のスキッピングを誘導することができる、［３］または［４］に記載のオリゴヌクレオチド。
［６］ 前記オリゴヌクレオチドは、ＩＬ−１ＲＡｃＰをコードする前記ｍＲＮＡ前駆体のエキソン９またはＣ５をコードする前記ｍＲＮＡ前駆体のエキソン１７の包含を阻害する、［２］または［５］に記載のオリゴヌクレオチド。
［７］ 前記オリゴヌクレオチドは、前記Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体のエキソンの少なくとも一部または前記Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体の非エキソン領域の少なくとも一部に相補的な配列またはそれに結合する配列を含み、前記一部は、少なくとも８ヌクレオチドを含む連続したストレッチである、［１］から［５］の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
［８］ 前記オリゴヌクレオチドは、Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体のスプライスサイトまたはイントロン配列に相補的な配列またはそれ結合する配列を含む、［１］から［６］の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
［９］ 前記連続したストレッチは、前記Ｃ５またはＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体のエキソンのＲＮＡの８−５０ヌクレオチド、好ましくは１４−２５ヌクレオチドを含む、［７］に記載のオリゴヌクレオチド。
［１０］ 前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１または２に示されるＣ５ ｍＲＮＡ前駆体のエキソンおよび／または配列番号３または４に示されるＩＬ−１ＲＡｃＰのエキソンに相補的であるか、または結合する、［７］または［９］に記載のオリゴヌクレオチド。
［１１］ 前記オリゴヌクレオチドは、配列番号１１−４２の配列を含むか、またはそれから成る、［１］から［１０］の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
［１２］ 前記オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドと比較して、骨格、糖および／または塩基の修飾を有し、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは、１以上の２’−Ｏ−メチルホスホロチオネートを含むか、またはそれから成る、［１］から［１１］の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
［１３］ 前記オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルホスホロチオネートオリゴリボヌクレオチドの修飾およびロックされた核酸モノマーを含む、［１２］に記載のオリゴヌクレオチド。
［１４］ 前記オリゴヌクレオチドは、ゆらぎ塩基対を形成することができる、少なくとも１つのイノシンおよび／または塩基を含む、［１］から［１３］の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
［１５］ 薬物として使用するための、好ましくは、個体における炎症性障害を予防または治療するための、より好ましくは、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、若年性リウマチ様関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病または潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、肝炎、敗血症、アルコール性肝疾患および非アルコール性脂肪症を予防または治療するための、［１］から［１４］の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
［１６］ ［１］から［１５］の何れか１項に少なくとも１つの分子を含む組成物であって、前記組成物は好ましくは医薬組成物であり、前記医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体、アジュバント、希釈剤および／または賦形剤を含む組成物。
［１７］ 少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが存在し、１つ目は［１］から［３］の何れか１項に記載のものであり、２つ目は［４］または［５］に記載されたものである、［１６］に記載の組成物。
［１８］ 個体における炎症性障害を予防または治療するための薬物の製造のための、［１］から［１５］の何れか１項に記載の前記分子の、好ましくはオリゴヌクレオチドの、または［１６］から［１７］の何れか１項に記載の組成物の使用。
［１９］ 個体における、１以上の症状および／または特徴を軽減するための、および／または炎症性障害のパラメータを改善するための方法であって、前記方法は、［１］から［１５］の何れか１項に記載の分子、好ましくはオリゴヌクレオチド、または［１６］から［１８］の何れか１項に記載の組成物を前記個体に投与することを含む方法。

参考文献

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Claims (15)

1. オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドと比較して、骨格、糖および／または塩基の修飾を有するオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドは可溶性ＩＬ−１ＲＡｃＰの量を増やすために、ＩＬ−１ＲＡｃＰをコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを変化させることができ、前記オリゴヌクレオチドは、ＩＬ−１ＲＡｃＰの膜貫通ドメインをコードするエキソンのスキッピングを誘導することができ、ＩＬ−１ＲＡｃＰのオープンリーディングフレームを妨害することがなく、前記オリゴヌクレオチドは配列番号５の少なくとも１４ヌクレオチドの連続したストレッチに相補的である配列を含むか、または相補的である配列からなる、上記オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドと比較して、骨格、糖および／または塩基の修飾を有するオリゴヌクレオチド。
2. 前記オリゴヌクレオチドは、ＩＬ−１ＲＡｃＰをコードする前記ｍＲＮＡ前駆体のエキソン９の包含を阻害する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
3. 前記オリゴヌクレオチドは、ＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体のスプライスサイトまたはイントロン配列に相補的な配列またはそれ結合する配列を含む、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
4. 前記連続したストレッチは、前記ＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体のエキソンのＲＮＡの１４−２５ヌクレオチドを含む、請求項１または請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
5. 前記オリゴヌクレオチドは、配列番号５に示されるＩＬ−１ＲＡｃＰ ｍＲＮＡ前駆体のエキソンに相補的であるか、または結合する、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
6. 前記オリゴヌクレオチドは、配列番号２５−２６、２８、３３−３６、３９または４０の配列を含むか、またはそれから成る、請求項１から５の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
7. １以上の２’−Ｏ−メチルホスホロチオネートを含むか、またはそれから成る、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
8. 前記オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルホスホロチオネートオリゴリボヌクレオチドの修飾およびロックされた核酸モノマーを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
9. 前記オリゴヌクレオチドは、ゆらぎ塩基対を形成することができる、少なくとも１つのイノシンおよび／または塩基を含む、請求項１から８の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
10. 薬物として使用するための、請求項１から９の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
11. 個体における炎症性障害を予防または治療するための、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
12. 前記炎症性障害が、以下からなる群から選択される請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド：
    リウマチ様関節炎（ＲＡ）、若年性リウマチ様関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病または潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、肝炎、敗血症、アルコール性肝疾患および非アルコール性脂肪症。
13. 請求項１から１２の何れか１項に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドおよび医薬的に許容可能な担体、アジュバント、希釈剤および／または賦形剤を含む医薬組成物。
14. 追加のオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡベースのオリゴヌクレオチドと比較して、骨格、糖および／または塩基の修飾を有するオリゴヌクレオチドが存在し、前記オリゴヌクレオチドが、Ｃ５ａの量を減らすために、Ｃ５をコードするｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを変化させることができる、請求項１３に記載の医薬組成物。
15. 個体における炎症性障害を予防または治療するための薬物の製造のための、請求項１から１２の何れか１項に記載のオリゴヌクレオチドの、または請求項１３または１４に記載の組成物の使用。

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