WO2004046356A1

WO2004046356A1 - ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１β及びその利用

Info

Publication number: WO2004046356A1
Application number: PCT/JP2003/014528
Authority: WO
Inventors: Masaya Imoto; Yusuke Minato; Etsu Tashiro
Original assignee: Keio University
Priority date: 2002-11-15
Filing date: 2003-11-14
Publication date: 2004-06-03
Also published as: KR20050085006A; EP1574574A4; EP1574574A1; US20060211638A1; JPWO2004046356A1; AU2003302135A1; CN1729291A; CA2506245A1

Abstract

特定の癌細胞において発現するＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βの塩基配列、又はその一部のポリペプチドを基に作製したアンチセンスヌクレオチド、リボザイム、マキシザイム、又はＲＮＡｉを用いて、ＰＤＧＦ受容体α遺伝子のエキソン１βから転写されるｍＲＮＡの翻訳を抑制する。また、アンチセンスヌクレオチド、リボザイム、マキシザイム、又はＲＮＡｉなどの発現抑制物質を有効成分とする発現抑制剤は、癌の治療剤として有効である。

Description

P D G F受容体 α遺伝子のェキソン 1 及びその利用関連文献とのクロスリファレンス

本願は、 2 0 0 2年 1 1 月 1 5 日に出願した特願 2 0 0 2 _ 3 3 2 1 4 2 号に基づく優先権を主張する。その文献をこの明細書明

中に援用する。技術分野書

本発明は、 P D G F受容体ひ遺伝子のェキソン 1 ]3 又はその一部を有するポリヌクレオチド、並びに P D G F受容体 α遺伝子の m R N Aのうちェキソン 1 /3 を含む ra R N Aを標的とする P D G F受容体ひの発現抑制方法、発現抑制物質、及び発現抑制剤、並びに癌の治療剤に関する。背景技術

血小板由来増殖因子（ P D G F ) は、細胞の増殖や発生■分化、創傷治癒、さらには癌悪性化や動脈硬化などにおいて重要な役割を果たしている。したがって、 P D G Fシグナルを制御することはこれら疾患の治療薬となることが期待されている。実際には、治療薬として P D G Fの発現抑制剤（例えば、特開平 1 0 — 5 9 8 5 0 号公報参照）や、 P D G F と P D G F受容体 a との結合阻害剤（例えば、特表平 8 — 5 0 0 0 1 0号公報参照）や、 P D G F受容体ひのチロシンキナーゼ阻害剤（例えば、特表 2 0 0 2 — 5 1 4 2 2 8 号公報参照）が提案されている。

しかしながら、これらの抑制剤や阻害剤は癌特異的な P D G F シグナルだけではなく、正常な P D G Fシグナルにも影響を与える恐れがある。そこで、本発明は癌細胞に特異的な P D G Fシグナルだけを選択的に抑制できる発現抑制方法に用いるためのポリヌクレオチド、発現抑制物質、発現抑制剤、及び癌の治療剤を提供することを目的とする。発明の開示

本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号 2 に示される塩基配列、又はその一部を有することを特徴とする。配列番号 2 に示される塩基配列の一部を有するポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号 1 に示される塩基配列を有するものが挙げられる。

また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号 2 に示される塩基配列において、 1 個若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加され、 P D G F受容体ひ遺伝子のセンス鎖の塩基配列に含まれる塩基配列、又はその一部を有することを特徴とする。

ここで、「 P D G F受容体 α遺伝子」とは、 GenBank ァクセッシヨン番号 A C 0 2 6 5 8 0 及び A C 0 2 5 0 1 3 に示される塩基配列により構成されているもの及びそのホモ口グをいう。

さらに、本発明にかかるポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレォチドと相補的な塩基配列、又はその一部を有するポリヌクレオチドであってもよい。

これらのポリヌクレオチドは、 2本鎖 D N A、 1 本鎖 D N A、 2本鎖 R N A、 1 本鎮 R N Aのいずれであってもよい。また、 1 個若しくは数個の塩基の欠失、置換、若しくは付加等の遺伝的多型 (genetic polymorphism) をもち、 P D G F受容体 α遺伝子のセンス鎖の塩基配列に含まれる塩基配列を有するポリべプチドも本発明の範囲内であるが、同等の機能をもつものが好ましく、 Ε 2 F — 1 により転写調節されるものが特に好ましい。

本発明の P D G F受容体ひの発現抑制方法は、 P D G F受容体ひ遺伝子の m R N Aのうちェキソン 1 j3 を含む m R N Aを標的とすることを特徴とする。ここで、「m R N A」とは、転写されてできた h n R N Aからイントロン部分が除去され、ェキソン部分が結合して形成された R N Aをいう。また、「 m R N Aを標的とする」とは、直接的又は間接的に、特異的に該 m R N Aから、そのコードされるタンパク質を生成しないようにすることをいう。なお、「タンパク質の発現」とは、 D N A上の遺伝情報が m R N Aから正確に翻訳されてタンパク質を産生することを意味する。

本発明の P D G F受容体 α の発現抑制方法は、アンチセンスヌクレオチド、リボザィム、マキシザィム、又は R N A i を用いた方法であってもよい。

ここで、「 P D G F受容体ひ遺伝子のアンチセンスヌクレオチ

J とは、 P D G F受容体ひ遺伝子の m R N Aの塩基配列に対し相補的なヌクレオチドをいい、アンチセンス R N A又はァンチセンス D N Aであってもよく、ヌクレオチドが修飾されていてもよい上記アンチセンス R N A又は D N Aは、対象となる、虫

m伝子から転写される m R N Aの配列に対し相補的な R N A又は D N A をいレ、、細胞内での遺伝情報の発現を遮断し、目的とするタンパク質への産生を特異的に抑制するために用いられる。

Γジボザィム」とは、酵素活性をもつ R N Aの総称でめり、生物由来の R N Aを特異的に切断する酵素をいう。細胞内に取り込まれると標的 R N A配列を切断する機能を有する。その結果として的 R N Aからのタンパク質の発現が抑制される。標的 R N A 配列に対する特異性が高いため、タンパク質の発現抑制物質としては好ましい。リボザィムには、ノヽンマーへッド型リボザィムや、ヘアピン型リボザィム（hairpin ribozyme) などが含まれる。

「マキシザィム」とは、一般的に WO 9 9 / 4 6 3 8 8 号公報の明細書に記載のように、二量体の構造を形成する R N A分子であって、例えば、その 2本の R N A分子が、正常細胞における m R N Aを認識しないで、癌細胞に特異的な m R N Aを認識するようにマキシザィムを構成することにより、癌細胞に特異的な m R

N Aのみを切断することができる。

Γ R N A i 」とは、 R N A干渉 (RNA interference) と称される現象を誘導する二重鎖 R N A ( d s R N A) を利用した方法をいう「 R N A干渉と称される現象」とは、上記二重鎖 R N Aを細胞内に導入すると標的となる遺伝子の発現が抑制される現象であ、現在、ホストの内在する機構により 2 ；!〜 2 3塩基対に短く切断され、短く切断された R N A分子はホストの遺伝子から転写される m R N Aを認識して配列特異的に分解し、その果としてホストの遺伝子がコードするタンパク質の発現を特異的に抑制するためとされている。

本発明の P D G F受容体ひの発現抑制方法は、アンチセンス R

N Aヽリボザィム、マキシザィム、又は R N A i のいずれかをコ一ドする D N Aを用いた方法であってもよい。

本発明にかかる P D G F受容体 α の発現抑制物質は、 Ρ D G F 受容体 α 遺伝子の： m R N Aのうちェキソン 1 /3 を含む m R N A を標的とすることを特徴とする。それは、例えば、発現抑制物質が該 m R N Aに結合したり、該 m R N Aを分解したりするとによるが、発現抑制物質が間接的に、他の物質を該 m R N Aに結合させたり、他の物質により該 m R N Aを分解したりしてもよい。なお、「 P D G F受容体 _α の発現抑制物質」とは、 P D G F受容体 α遺伝子からの P D G F受容体 α タンパク質の産生を抑制する物質をいう。

本発明にかかる P D G F受容体ひの発現抑制物質としては、ァンチセンスヌクレオチド、リボザィム、マキシザィム、又は R N A i などを具体的に挙げることができる。

本発明にかかる P D G F受容体の発現抑制物質としては、了ンチセンス R N A、リボザィム、マキシザィム、又は R N A i のいずれかをコードする D N Aなどを具体的に挙げることができる。

本発明にかかる P D G F受容体 α の発現抑制剤は、前記発現抑制物質を有効成分とすることを特徴とする。

本発明にかかる癌の治療薬は、前記発現抑制剤を含有することを特徴とする。

本発明にかかる癌の治療方法は、前記発現抑制剤を含有することを特徴とする。図面の簡単な説明

図 1 は、本発明の実施例 2 において、 R Τ— P C Rを用いて調ベた P D G F受容体 α 遺伝子のェキソン l j3 〜 4 の発現パターンを示す図である。

図 2 は、リポザィムにおける構造を示す図である。

図 3 は、マキシザィムにおける構造を示す図である。

図 4 は、本発明の実施例 1 において、一 1 3 9 5 力、ら + 3 1 2 までの塩基配列を含むレポーターコンストラクトを用いたルシフェラーゼアツセィの結果を示す図である。なお、図中の「十」は一 1 3 9 5 力ら + 3 1 2 までの塩基配列を含むレポーターコンストラクトを 1 0 0 n g 導入した結果を示し、「一」は、 'ー 1 3 9 5 力ら + 3 1 2 までの塩基配列を含まないレポーターコンストラクトを 1 0 O n g導入した結果を示す。

図 5 は、本発明の実施例 1 において、一 5 1 7力ら + 1 4 4 5 までの塩基配列を含むレポーターコンストラクトを用いたルシフェラーゼアツセィの結果を示す図である。

図 6 は、本発明の実施例 1 において、転写開始点を欠失した様々な長さの deletion mutant を用いたノレシフェラーゼァッセィの結果を示す図である。

図 7 は、基本転写因子により転写される P D G F R ひの m R N

Aと、 E 2 F — 1 により転写される P D G F R o: の m R N Aの概略を示す図である。発明を実施するための最良の形態

癌細胞においては、ほとんどの場合、 R B タンパク質などの癌抑制タンパク質が関与するシグナル伝達経路に異常が起きている'ことが知られている。例えば、 R B タンパク質の上流で働くサイクリン D 1 の過剰発現は、増殖因子に対する感受性を亢進させることにより、癌細胞の悪性化に寄与すると考えられている。 in vitro での細胞培養系では、サイクリン D 1 を過剰発現させた細胞株に F G F (fibroblast growth factor; 繊'維芽細月包増殖因子）を加えることにより、その細胞は悪性化する。本願発明者は、 P D G F (platelet-derived growth factor；血小板由来増殖因子）も同様の働きをする、即ちサイクリン D 1 を過剰発現させた細胞株を悪性化させることを見いだした。

サイタリン D 1 — R B経路の下流には、転写因子 E 2 F— 1 力 S 存在し、 F G F受容体の発現を亢進することにより、 F G F に対する感受性を亢進させる。実施例で詳細に後述するように、 E 2 F — 1 は P D G F受容体 α の発現も亢進するが、本願発明者は、従来知られているプロモーターに作用するのではなく、従来のィントロン 1 中に新たな Ε 2 F — 1 によって制御される新規プロモーター領域を見いだし、その新規プロモーターによって転写される際に用いられる新規ェキソン l i3 を同定した。 ' このように、 E 2 F — 1 と P D G Fが関与する癌の悪性化において、これらの因子のターゲットの一つは、 P D G F受容体ひのェキソン 1 /3 を有する m R N Aであることが明らかになった。従つて、このェキソン 1 ;3 を有する転写産物からの P D G F受容体 α の産生を特異的に阻害することにより、癌細胞の悪性化につながるシグナル経路を断つことができ、癌細胞の増殖を抑制できる。なお、サイクリン D 1 — Ε 2 F — 1 経路に限らず、癌細胞の増殖が、ェキソン i ]3 を有する m R N Aを過剰に転写させることにより、 P D G F受容体 _α と共同して癌の悪性化をひきおこす因子によるのであれば、その癌細胞の増殖阻害に本発明を適用できる。以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明力 Sなレヽ場合に ίま、 J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed. ) , Molecu丄 ar c丄 oning, a laboratory manual (2nd edition) , Cold S ring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) ； F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Se i dman, J . A. Smith, K. Struh 1 (Ed. ) , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd. などの標準的なプ口トコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットゃ測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用レヽる。

なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されてレ、るのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。

配列番号 2 に示されるヒト P D G F受容体 _α遺伝子のェキソン 1 の塩基配列、又はその一部を有するポリヌクレオチドは、配列番号 2 に示される塩基配列情報に基づき、 c D Ν Αライブラリーやゲノムライブラリーなどのヒト遺伝子ライブラリー力ら調製することができる。また、マウス、ラット、ニヮトリ、ブタ、ィヌ、サルなどヒト以外の生物種由来の P D G F受容体 α 1E卞のェキソン 1 β も Ε 2 F — 1 によって転写制御されることで特定されるが、例えば、ヒト P D G F受容体 α遺伝子のェキソン 1 β とのハイプリダイゼーションゃ、従来のイントロン 1 中の配列のち新たなェキソンを調べることなどによっても同定でき、これらも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。

ここで、「ヒト P D G F受容体ひ遺伝子のェキソン 1 J3 J とは、配列番号 2 に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含んで構成されているェキソンをいい、「 P D G F受容体ひ遺伝子のェキソン 1 3 」とは、配列番号 2 に示される塩基配列を有するポリヌクレオチドを含んで構成されているェキソン及びヒト以外の生物種においてそれに対応するェキソンをいう。

Ρ D G F受容体ひ遺伝子のェキソン 1 ]3 は、 m R N A上の非翻訳領域であるため、ヒト以外の生物種において、必ずしも塩基配列のレベルで高い相同性を有する必要はなく、特定の細胞種で転写されるという機能的な面は保存されている必要があり、例えば、

Ε 2 F — 1 によって転写が制御されるとレ、うもう一方のェキソン 1 に見られない特徴を必要とする。

図 1·に示すように、 P D G F受容体ひ遺伝子の m R N Aのうちェキソン 1 ]3 を含む m R N Aは、特定の癌細胞にしか検出されなレヽ従って、 P D G F受容体ひ遺伝子の； m R N Aのうちェキソン

1 β を含む m R N Aを標的とした発現抑制方法、並びに本発明のポ V ヌクレオチド、発現抑制物質、及び発現抑制剤などは、特定の癌細胞（例えば、ヒト大腸癌細胞 S W 4 8 0ゃヒト食道癌細胞

Τ Τ 11 などを具体的に挙げることができる。）を攻撃するための癌の治療方法や癌の治療剤として有用である。

本発明における発現抑制方法としては、 P D G F受容体ひ遍子の m R N Aのうちェキソン 1 ]3 を含む m R N Aを標的とするのであって、例えば P D G F受容体 0；遺伝子の m R N Aのうちェキソン 1 を含む m R N Aに結合し、翻訳を抑制して P D G F 受容体 _α の発現を抑制する方法や、上記 m R N Aを分解又は切断して P D G F受容体 _α の発現を抑制する方法であってもよい。以下にアンチセンスヌクレオチド、リボザィム、マキシザィム、又は R N A i などの発現抑制物質を用いた発現抑制方法について例を挙げて説明する。

( 1 ) アンチセンスヌクレオチドの調製

本発明の発現抑制方法に用いるアンチセンスヌクレオチドとしては、 P D G F受容体 a遺伝子の m R N Aのうちェキソン 1 β に対応する部分の塩基配列又はその一部に相捕的な塩基配列を含むアンチセンス R N A又はアンチセンス D N Aを具体的に例示することができる。また、 1 5〜 3 0 の塩基配列からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。

本発明のアンチセンスヌクレオチドは、構造上、その配列の位置、長さ、修飾化、ミスマッチの存在等には制限されるものではない。上記修飾したアンチセンスヌクレオチドとしては、体内又は細胞内においてアンチセンスヌクレオチドを安定化させるために、ホスホジエステノレ結合のリン酸基の酸素原子の一つを硫黄原子又はメチル基に修飾したアンチセンスヌクレオチドゃ、モルフォリノ（morpholino) で修飾したァンチセンスヌクレオチドを具体的に例示することができる。

本発明のアンチセンス D N Aはヽ S 1 ヌクレアーゼなどの D N

A依存性 D N Aポリメラーゼを用レ、て、プライマ一■ エタステンシヨン法により in vitro で合成できまた、アンチセンス鎖の一部をプライマーとして P C Rを行うことにより、アンチセンス鎮だけを合成することができるまた、 D N A合成機を用いることなどによって、人工的に合成してもよい。アンチセンスォ V ゴヌクレオチドの合成もアンチセンス D N Aに準じるが、人工的に合成するのが最も好ましい。一方、本発明のアンチセンス R N Aは、例えば、 R N A合成機や固相合成法などにより容易に合成することができる。その後、 H P L Cを用いて N H ₃ O HZ E t O Hで溶出することにより、目的の R N Aを単離することができる。

本発明のアンチセンス R N Aは、このように人工的に合成してもよいが、 T 7 R N Aポリメラ一ゼが特異的に認識するプロモーター酉己歹 ( 5 ' 一 TAATACGACTCACTATA— 3 ' ：酉己歹 U番号 3 ) の下流に、アンチセンス R N Aに対応する D N A配列をもつ 2 重鎖 D N A を挿入したベクターを作製し、 T 7 R N Aポリメラーゼを用いて in vitro転写系によって合成してもよい。

また、アンチセンス R N Aに対応する D N Aを組み込んだクルスベクタ一又はプラスミド'などの発現ベクターを用レ、てァチセンス R N Aを細胞内で発現させてもよい。ウィルスベクタとしては、アデノウィルスベクター又はレト口ウイノレスベクタなどであってもよい。

( 2 ) リボザィムを挿入したプラスミドの調製

y ポザィムは、図 2 に示すように、標的の m R N Aの塩基配に相補的な塩基配列（リボザィムの 5 ' 末端部分と 3 ' 末端部分の塩基配列を示す。）と、触媒活性部位（〇印で示した塩基）を有する 2 4 の塩基配列とを有する。リボザィムの 5 ' 末端部分と 3 ' 末端部分の塩基配列が標的の m R N Aの塩基配列と特異的に結合すると、 m R N A上にある N U X配列（ Nは任意の塩基であって、 Xは a 、 u、 c のいずれかの塩基を意味する。）で切断して標的の m R N Aを分解させることができる。すなわち、 P D G F受容体遺伝子の m R N Aのうちェキソン 1 ]3 に対応する部分の塩基配列を基にリボザィムを合成して細胞内に投与すれば、 P D G F受容体ひ遺伝子の m R N Aのうちェキソン 1 β を含む m R N Aを特異的に切断することができると考えられる。

従って、本発明の発現抑制物質であるリボザィムは、配列番号 2 に示されるヒト P D G F受容体 _α遺伝子のェキソン 1 /3 の塩基配列から、 N U X配列に対応する配列を選択してその配列を含む 1 5 〜 2 0 の塩基配列に相補的な塩基配列と、触媒活性部位 (〇印で示した塩基）を有する 2 4 の塩基配列とを含むようにすればよい。 N U X配列に対応する配列としては、例えば、配列番号 2 に示される 3 4〜 3 6番目の G T Cや、 7 5 〜 7 7番目の 0 T Cや、 7 8 〜 8 0番目の G T Cや、 8 1 〜 8 3番目の G T Cや、

1 7 2 〜 1 7 4番目の G T Cや、 2 6 7 〜 2 6 9番目の 0丁〇を挙げることができる。なお、上記リボザィムは、ハンマーヘッド型リボザィムや、へァピン型ジボザィム (hairpin ribozyme) であつてもよレ、

実際の合成方法は、人工合成、 in vitro 合成、発現ベクターによる細胞内合成などがあり、（ 1 ) のアンチセンス R N Aの場合と同様なので、ここでは説明は省略する。

( 3 ) マキシザィムの設計及び調製

マキシザィムは、図 3 に示すように、二量体の構造を形成する

R N A分子からなり、両方の R N A分子には標的 R N Aを特異的に 5忍識 "9 センサー部位（図中に X · ■ · Xの部分を示し、 Xは任意の塩基を意味する。なお、上段の X と下段の Xはそれぞれ相補性の塩 ¾を意味する。）と、触媒活性部位（図中において二重鎖を形成しない部分を示す。）と、標的 R N Aを含む m R N A上にある N U X配列（ Nは任意の塩基であって、 Xは A、 U、 C のレヽずれかの塩基を意味する。図中においては G U C配列の部分を示す。）及びその上流（図中においては G U C配列の部分の上流を示す。）又は下流（図中においては G U C配列の部分の下流を示す。）を認識する部位を有する。マキシザィムのセンサー部位が標的 R N Aを特異的に認識して結合し、また、マキシザィムのもう一方の部分が標的 R N Aを含む m R N A上にある N U X配列の上流及び下流を特異的に認識して結合すると、標的 R N Aを含む m R N A上にある N U X配列を切断して標的の m R N Aを特異的に分解することができる。すなわち、 P D G F受容体 α遺伝子の m R N Aのうちェキソン 1 β に対応する部分の塩基配列を基にマキシザィムを合成して細胞内に投与すれば、 P D G F受容体 a 遺伝子の： m R N Aのうちェキソン 1 を含む m R N Aを特異的に切断することができると考えられる。

例えば、 P D G F受容体 α遺伝子のェキソン 1 を標的 R N A として、その標的 R Ν Αに相補的な塩基配列をセンサー部位とする。また、標的 R N Aの下流に存在する N U X配列を P D G F受容体 a の m R N Aから選択して、 N U X配列の上流と下流の配列に相補的な塩基配列を決定する。 N U X配列は、 P D G F受容体ひ遺伝子のェキソン 1 j3 の m R N A上のものであってもよい。これらの情報から、マキシザィムの各 R N A分子を R N A合成機に合成することにより、マキシザィムを作製することができる。なお、図中の Xの領域は 1 又は数個の増減があってもよい。

実際の合成方法は、人工合成、 in vitro合成、発現ベクターによる細胞内合成などがあり、（ 1 ) のアンチセンス R N Aの場合と同様なので、ここでは説明は省略する。ただし、マキシザィムは 2分子の R N Aを用いるため、発現べクターを用いて細胞内で発現させる場合、 2 分子の R N Aを一つのベクターに組み込んでも、二つのべクターに別々に組み込んでも構わない。

( 4 ) R N A i の調製

目的の遺伝子に対応する二重鎖 R N Aが生体内に導入されると、対応する m R N Aが分解するという報告がある（Bass, B. L. (2000) Cell 101, 235-238、 Fire, A. (1999) Trends Genet. 15, 358-363、 Sharp, P. A. (2001) Genes Dev. 15， 485 - 490)。従つて、 P D G F受容体遺伝子のェキソン 1 、 '又はその一部を有する m R N Aに対応する二重鎖 R N A ( R N A i ) を細胞内又は生体内に導入すれば、 P D G F受容体 α遺伝子の m R N Aのうちェキソン 1 を含む m R N Aが分解されると考えられる。

本発明の発現抑制物質である R N A i は以下のように調製することができる。 P D G F受容体ひ遺伝子のェキソン 1 /3 のセンス鎖ヽ又はその一部の塩基配列に対応する R N A と、その R N A に相補的な R N Aとを、 R N A合成機を用いて人工的に合成することができる。また、 HiScribe RNAi Transcription Kit ( N E

B社製 ) を用いて、 in vitro及び in v i vo で合成してもよい。その他、 P D G F受容体ひ遺伝子のェキソン 1 ;3 又はその一部を正と負の両方向にクローニングしたウイ /レスベクター又はプラスなどの発現べクターをそれぞれ細胞内に導入し、 D N A の両鎖を細胞内で発現させることによって、細胞内で R N A i ができるようにし、標的の m R N Aを分解させるようにしてもよいまたヽ P D G F受容体 α遺伝子のェキソン 1 β 又はその一部に対応する一重鎖の各鎖の D N A配列を融合した配列を持つ D N A、すなわち、センス鎖の D N Aの 3 ' 末端とアンチセンス鎖の D N

A t

の 5 末端を融合させた配列を持つ D N A、又は相補的な D N

Aの 3 / 末端とセンス鎖の D N Aの 5 ' 末端を融合させた配列を持つ D N Aを発現べクターに組み込んだものを用いてもよい。上記ウィルスベクターとしては、アデノウィルスベクター又はレトロウイノレスベタターなどであってもよい。なお、これらの R N A i は 3 0ベース以内のものが望ましく、 2 1 ベースが最も望ましい。

( 5 ) 発現抑制物質の導入

in vitro の細胞培養系において発現抑制物質を細胞内へ導入する際、調製したアンチセンスヌクレオチド、リポザィム、マキシザィム、 R N A i などの発現抑制物質を、対象の癌細胞に対し、エレクロポレーシヨン法、マイクロインジェクション法、リポフエクシヨン法、アデノウイノレス、レトロウイルス等のウイノレスべクターなどを用いたウィルス感染法、又はカルシウムを用いたトランスフエクション法等を用いる。

一方、 in vivo で行う発現抑制剤の個体への導入方法としては、前記調製したアンチセンスヌクレオチド、リボザィム、マキシザィム、 R N A i などの発現抑制物質を有効成分とする発現抑制剤を、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物において、導入対象の癌細胞の近傍に直接投与する力発現抑制剤によっては非経口、経口、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、又は腹腔内に投与する方法であつてもよい。この場合発現抑制剤は、使用する部位又は目的に応じて、薬理学的に許容された適切な賦形剤又は基剤をさらに含有してもよい。

個体に投与する発現抑制剤としては、発現抑制物質が細胞内に取り込まれやすいように調製されているものが好ましい。例えば、前記アンチセンスヌクレオチド、リボザィム、マキシザィム、 R N A i をコードする D N Aをゥイノレスベクターに組み込んだ発現ベクターを in vitro で適当な細胞株に感染させ、ウィルスを産生し、そのウィルスを注射（inject) して感染させる方法であつてもよい。ウィルスベクターとしては、細胞内で発現するアデノウイノレスベクターや、レトロウイノレスベクターを用いてもよい。

また、前記発現ベクターをリポソームの中に入れて癌細胞と融合されることによって、プラスミドを細胞内に導入させてもよい。また、 Trans IT In Vivo Gene Delivery System ( TaKaRa の商品名）を用いて、 in vivo トランスフエクションを行ってもよい。この場合、発現抑制剤は、患部に直接注射しても、静脈注射してもよレヽ

また、前記調製したアンチセンスヌクレオチド、リボザィム、マキシザィム、 R N A i などの R N Aを、 in vitro selection 法により細胞内に導入されやすい H I Vの T A Tなどのぺプチドと結合させた R N Aアブタマ一を発現抑制剤として注射してちょい。対象の癌細胞としては、ヒト大腸癌細胞 S W 4 8 0ゃヒト食道癌細胞 T T 11 を具体的に例示することができるが、 P D G F受容体ひ遺伝子のェキソン 1 β から転写される m R Ν Αが確認できる癌細胞であれば、どのようなものでもよい。

( 6 ) 発現抑制物質による発現抑制の評価

前記（ 5 ) 記載の方法により、 i n vi tro で培養された特定の癌細胞に発現抑制物質を導入したものと、導入していないものについて、 R T— P C R法により P D G F受容体ひ遺伝子のェキソン 1 ]3 から転写された m R N Aの量を比較評価することにより、発現抑制物質による発現抑制の評価を行うことができる。その他、ノザン · ブロッティング法などにより P D G F受容体 α遺伝子のェキソン 1 ]3 から転写された m R N Aの量を評価する方法であつてもよい。この結果を用いて、 P D G F受容体 α遺伝子のェキソン 1 ;3 から転写された m R Ν Αの翻訳をより有効に抑制することができるアンチセンスヌクレオチドが見出せる。

上記は in vitro による実験であるが、 in vivo における実験においても評価することが可能である。

in V i _V0 での評価方法としては、以下の方法を具体的に例示することができる。正常マウスに前記特定の癌細胞を皮下注射し、一定期間をおいて腫瘍を拡大させ、その後、（ 5 ) の導入方法により前記調製した発現抑制剤を 1 〜数回投与する。投与後、発現抑制剤を導入したマウスと、導入していないマウスとの癌の大きさや生存率を比較評価することにより、発現抑制物質による発現抑制の評価を行うことができる。 ·

以下、本発明の実施例について詳細に述べる。

く実施例 1 〉

本実施例では、 P D G F受容体 α遺伝子において、転写因子 Ε 2 F— 1 により制御されている新規ェキソンを同定した。

まず、本願発明者は、マウス N I Η 3 Τ 3細胞が P D G Fの添加によって、足場に非依存的に増殖することを見いだした。そこで、これらの細胞株において、 P D G F受容体ひ ( P D G F R - a ) の発現を調べたところ、 P D G F受容体 α の発現は上昇し、これが転写レべルでの制御であることが明らかになった。

サイクリン D 1 は、細胞周期依存的に p R b のリン酸化を介して転写因子 E 2 F _ 1 を活性化するため、この上昇が、 E 2 F — 1 によるヒト P D G F受容体ひのプロモーターの調節のためであるかどうか調べた。転写開始点の _ 1 3 9 5 から + 3 1 2 までの酉己歹 U (Genomics, Vol. 30, 224— 232, 1995 に報告されている転写開始点をもとに塩基の番号付けをした。 GenBank ァクセッション番号 D 5 0 0 0 1 S 0 1 参照）からなるプロモーター領域を、 p G L 3 ルシフェラ一ゼべクターを用いて /レシフェラーゼ遗伝子の上流にクローニングし、サイクリン D 1 を過剩発現させた N I H 3 T 3 細胞に、 E 2 F — 1 の発現ベクターと共にトランスフェクシヨンによって導入した。 2 4 _ 7 2 時間培養した後、ルシフェラーゼアツセィを行い、上記プロモーターによる転写活性を調べた。ポジティブ ' コントローノレとしては、 m F G F R _ l のプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を挿入したプラスミドを用いた。その結果、 m F G F R — l プロモーターの転写活性は上昇するものの、 P D G F受容体 α のプロモーターの転写活性は上昇しなかった（図 4 )。従って、従来知られていた P D G F受容体 α のプロモーターは、サイクリン D 1 を過剰発現させたマウス N I Η 3 Τ 3 細胞における P D G F受容体 ο; の努現の上昇に関与していないことがわかった。

そこで、転写因子結合配列検索（TF search) により、ヒト P D G F R — ひ遺伝子のェキソン 1 下流に E 2 F - 1 と結合するコンセンサス配列があるか否かを調べたところ、 E 2 F - 1 が結合すると考えられる配列が、報告された転写開始点の下流約 1 k b p付近に 4 ケ所かたまって存在することがわかった。そこで一 2 9 5 力、ら + 1 4 4 5 までの塩基配列力らなる D N Aを、ノレシフエラーゼ遗伝子の上流に結合し、得られたレポーターコンストラタトを用いて前記記載の方法と同様にルシフェラーゼアツセィを行い、 E 2 F — 1 による転写活性を調べた。その結果、この領域の転写活性は E 2 F — 1 によって上昇することが確認できた (図 5 )。さらに、 E 2 F — 1 の転写活性化能を欠失させた変異 E 2 F— 1 ( 1 力、ら 3 6 8 までのアミノ酸配列）、あるレヽは 1 3 2番目のロイシンをグルタミン酸に置換して D N A結合能を欠失させた変異 E 2 F — 1 では、転写活性が見られないことから、この領域が実際に E 2 F — 1 によって制御されていることが示唆された。

しかし、推定される E 2 F - 1 結合サイトは報告されている転写開始点の約 1 . 2 k b p 下流に存在し、このプロモーター活性が従来報告されていた転写開始点に作用するとは考えにくい。そこで、この領域が従来報告されている転写開始点に働いているかどうかを調べるために、この転写開始点を欠失した様々な長さの deletion mutant を作製して、上記の方法と同様にルシフェラーゼアツセィを行い、 E 2 F — 1 による転写活性を調べた。その結果、転写開始点の下流約 1 k b p まで欠失させたコンストラクトでもプロモーター活性を有し、さらに E 2 F— 1 による転写活性の上昇も見られた。これらのこと力、ら、 P D G F R— α の E 2 F 一 1 で制御される m R Ν Αは、新たな転写開始点から発現する可能性が示唆された（図 6 )。

そこで、 E 2 F— 1 による転写開始点の決定を 5 ' - R A C E 法により行った。一 2 9 5 力、ら + 1 4 4 5 までの塩基配列からなる D N Aを、ノレシフェラーゼ遺伝子の上流に結合したレポーターコンストラタトをトランスフエクシヨンによって導入した N I H 3 T 3細胞株力、ら m R N Aを抽出し、 5' -Full RACE Core Set ( TaKaRa の商品名）を用い、ルシフェラーゼ遺伝子配列に特異的なプライマー [フォーヮ一ドプライマ一 1 (配列番号 4 ： 5 ' -CCT TAATTAAGGGATTCTCGCATGCCAGAGATCCTA-3' ) と、リノースプライマー 1 (配列番号 5 ： 5' -CCTTAATTAAGGGGCGCAACTGCAACTCCGATAAA T-3 ' ) を用いて P C R を行なったところ、增幅産物が得られた。そこで、この増幅産物の D N A配列を調べ'た結果、従来イントロンだと思われていた領域に、新規ェキソンの存在が見出された。このようにして、従来イントロンと思われていた領域に、 E 2 F 一 1 によって転写制御される新規ェキソンが存在することが明らかになった。

<実施例 2 >

本実施例では、 P D G F受容体 α遺伝子のェキソン 1 /3 が癌細胞において特異的に発現しているかどうかを確認した。

P D G F受容体 α 遺伝子のェキソン 1 β と既知のェキソン 4 の配列からプライマー [フォーヮードプライマ一 2 (配列番号 6 ： 5' -CCTTAATTAAGGAACCGCACACCAAGGGGCCCTCATT-3' ) と、ジバースプライマー 2 (配歹 IJ番号 7 ： 5' -AACAGCACAGGTGACCACAATCG-3 ' ) ] を設計し、図 1 に示される各癌細胞から抽出した全 R Ν Αを用いて R T — P C R法を行った。図 1 に示されるように、ヒト大腸癌細胞 S W 4 8 0 とヒト食道癌細胞 T T n においてシグナルが検出された。そこで、これらの増幅バンドを回収し、 D N A配列を調べた結果、これらのバンドが P D G F受容体遺伝子のェキソン 1 β と既知のェキソン 2〜 4 の配列が連結したヒト P D G F R — ひの m R Ν Α断片であることがゎカゝり、同時に配列番号 1 に示される全長 3 3 8 b p のェキソン 1 ;3 の配列を決定した。すなわち、新たに見出されたプロモーター領域はヒト P D G F R の m R N A 2 のものであることがわかった（図 7 )。

<実施例 3 >

ェキソン 1 β の 5 末端のより正確な位置を 5 ' - R A C E 法により検討を行った。ェキソン 1 を含む P D G F R — o; m R N Aを発現しているヒト骨肉腫細胞 M G — 6 3 から m R N A を抽出し、 5 ' — Full RACE Core Set を用い、ェキソン 1 |3 に特異的なプライマー [フォーワードプライマー 2 (配列番号 6 ) と、リノースプライマー 3 (酉己列番号 8 ： 5' -CCGCTCGAGGCGACGACGACT TCTTCACTCAGG-3' ) ]を用いて P C Rを行った。この P C R により得られた増幅産物の D N A配列を決定した結果、配列番号 2 に示される 3 6 3 b p の塩基配列が得られ、ェキソン 1 β の 5 ' 末端が少なくとも + 1 2 1 0 まで伸びていることが明らかになつた。産業上の利用の可能性

以上のように、本発明によると、癌特異的な P D G F シグナルだけを選択的に抑制できる発現抑制方法に用いられるためのポリヌクレオチド、発現抑制物質、発現抑制剤、及び癌の治療剤を提供することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号 2 に示される塩基配列、又はその一部を有するポリヌクレオチド。

2 . 配列番号 2 に示される塩基配列において、 1 個若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加され、 P D G F受容体 _α遺伝子のセンス鎖の塩基配列に含まれる塩基配列、又はその一部を有するポリヌクレオチド。

3 . 請求項 1 又は 2 に記載のポリヌクレオチドと相補的な塩基配列、又はその一部を有するポリヌクレオチド。

4 . P D G F受容体 α遺伝子の m R N Aのうちェキソン l j3 を含む m R N Aを標的とすることを特徴とする P D G F受容体 α の発現抑制方法。

5 . アンチセンスヌクレオチド、リボザィム、マキシザィム、又は R N A i を用いることを特徴とする請求項 4 記載の P D G

F受容体ひの発現抑制方法。

6 . アンチセンス R N A、リボザィム、マキシザィム、又は R N A i のいずれかをコードする D N Aを用いることを特徴とする請求項 4記載の P D G F受容体ひの発現抑制方法。

7 . P D G F受容体 α遺伝子の m R N Aのうちェキソン l i3 を含む m R N Aを標的とすることを特徴とする P D G F受容体 _α の発現抑制物質。

8 . アンチセンスヌクレオチド、リボザィム、マキシザィム、又は R N A ί であることを特徴とする請求項 7記載の P D G F 受容体 α の発現抑制物質。

9 . アンチセンス R N A、リボザィム、マキシザィム、又は R N A i のいずれかをコードする D N Aであることを特徴とする請求項 7記載の P D G F受容体 α の発現抑制物質。

1 0 . 請求項 7 に記載の発現抑制物質を有効成分とすることを特徴とする P D G F受容体 α の発現抑制剤。

1 1 . 請求項 1 0 に記載の発-現抑制剤を含有することを特徴とする癌の治療剤。

1 2 . 請求項 1 0 に記載の発現抑制剤を用いることを特徴とする癌の治療方法。