JPH07250684A - 核酸断片及び該断片発現のためのプラスミドベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 産業上有効であり、大規模な細胞培養におい
ても実用に供することが可能な、細胞内でＲｂ蛋白質の
産生を強力に抑制する遺伝子、及びＲｂ蛋白質のｍＲＮ
Ａに対するアンチセンス配列発現プラスミドベクターを
提供する。 【構成】 マウスＲｂ蛋白質ｍＲＮＡの３′側非翻訳領
域の塩基配列又は該塩基配列若しくは該塩基配列の一部
の塩基配列と少なくとも７７．３％の相同性を有する塩
基配列、に相補的な塩基配列を有する核酸断片を含む動
物細胞のＲｂ蛋白質の合成を抑制する機能を有する核酸
断片、配列番号１乃至配列番号３の塩基配列又は該塩基
配列若しくは該塩基配列の一部の塩基配列と少なくとも
７７．３％の相同性を有する核酸断片を含む動物細胞の
Ｒｂ蛋白質の合成を抑制する機能を有するＤＮＡ断片か
らなる核酸断片、及び該核酸断片が組込まれ、該核酸断
片を動物細胞内において発現するプラスミドベクター。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、動物細胞内で網膜芽細
胞腫（retinoblastoma：以下Ｒｂと記載することがあ
る）遺伝子に由来する蛋白質［以下Ｒｂ蛋白質と記載す
ることがある。尚、このＲｂ蛋白質は、後記するように
網膜芽細胞腫の病因として特有な蛋白質ではなく、他の
癌（例えば、乳癌、肺小細胞癌、骨肉芽腫等）の病因と
もなり、更に、正常細胞にも存在する］の合成を強力に
抑制することにより、細胞の増殖を制御する機能を有す
る核酸断片及びその核酸断片を動物細胞内で発現するた
めのプラスミドベクターに関する。

【０００２】本明細書において、百分率の表示は、相同
性の表示を除き、特に断りのない限り、重量による値で
ある。本明細書においてアンチセンスベクターは、マウ
スＲｂ蛋白質ｍＲＮＡの３′側非翻訳領域の塩基配列又
は該塩基配列若しくは該塩基配列の一部の塩基配列と少
なくとも７７．３％の相同性を有する塩基配列、に相補
的な塩基配列を有する核酸断片を含む動物細胞のＲｂ蛋
白質の合成を抑制する機能を有する核酸断片が組込ま
れ、動物細胞内において発現するプラスミドベクター、
又は核酸断片が、配列番号１乃至配列番号３の塩基配列
又は該塩基配列若しくは該塩基配列の一部の塩基配列と
少なくとも７７．３％の相同性を有する核酸断片を含む
動物細胞のＲｂ蛋白質の合成を抑制する機能を有するＤ
ＮＡ断片であるプラスミドベクターをいう。本明細書に
おいて、配列番号１、配列番号２及び配列番号３の遺伝
子を組込んだアンチセンスベクターを、それぞれアンチ
センスベクタ−１、アンチセンスベクタ−２及びアンチ
センスベクタ−３と記載することがあり、核酸断片は、
ＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらの化学的修飾物を示し、ＤＮ
Ａ断片は、ＤＮＡ又はこれの化学的修飾物を示し、一部
の塩基配列は、マウスＲｂ蛋白質ｍＲＮＡの３′側非翻
訳領域の塩基配列、配列番号１、配列番号２又は配列番
号３の配列中にある３１ヌクレオチド以上の配列であっ
て、例えば、配列番号１の１番目から３００番目のヌク
レオチド配列、５０番目から１００番目のヌクレオチド
配列等をいう。

【０００３】

【従来の技術】遺伝子工学の進歩により、最近、細胞増
殖に対して抑制的に作用する癌（又は細胞増殖）抑制遺
伝子が発見されている［サイエンス（Science），第２
５４巻，第１１３８ページ，１９９１年］。その中で
も、ヒト第１３番染色体長腕の１３ｑ１４領域に位置し
ているＲｂ遺伝子［ヒューマン・ジェネティックス(Hum
anGenetics)，第７２巻，第１６４ページ，１９８６
年］は、ｃＤＮＡがクローニングされ、核酸及びアミノ
酸の一次構造が決定され、初めて同定された癌（又は細
胞増殖）抑制遺伝子として知られている。

【０００４】このＲｂ蛋白質は、９２８個のアミノ酸残
基からなり、分子量は約１１０〜１１５ｋＤ（キロダル
トン）であると推定され［ビオメディカ(BIOmedica),第
３巻，第２号，第１３８ページ，１９８８年、実験医
学，第６巻，第５号，第４２９ページ，１９８８年、及
びネイチャー(Nature)，第３２９巻，第６２４ページ，
１９８７年］、核内リン酸化蛋白質をコードしているこ
とが知られている（代謝、第２６巻、臨時増刊号「癌
‘８９」、第６９ページ、１９８９年）。

【０００５】また、マウスＲｂ遺伝子もクローニングさ
れ、この遺伝子に由来する蛋白質は、９２１個のアミノ
酸残基からなり、分子量１０４〜１１０ｋＤであること
及びヒトＲｂ遺伝子とも核酸レベルで高い相同性を有す
ることが知られている［プロシーディングス・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・
ザ・ユー・エス・エー(Proceedings of the National A
cademy of Science ofthe U.S.A.)，第８６巻，第６４
７４ページ，１９８９年］。これらの報告によれば、マ
ウスＲｂ遺伝子のｍＲＮＡとヒトのそれとの相同性は、
アミノ酸翻訳領域及び３′側非翻訳領域において、それ
ぞれ８８．７％及び７７．３％である。

【０００６】Ｒｂ遺伝子が注目されている理由は、この
遺伝子が網膜芽細胞腫ばかりではなく、他の癌（例え
ば、乳癌、肺小細胞癌、骨肉腫等）とも関係があり、更
に正常細胞の増殖及び分化にも関与していること等が報
告されているからである（実験医学，第１１巻，第１８
１４ページ，１９９３年）。

【０００７】このような背景から、Ｒｂ遺伝子に関する
発明もなされており、その抗体（特開平２−９８６６６
号公報）、劣性癌遺伝子Ｒｂ産生物に対する特異抗体及
びこの抗体を含有する癌診断試薬（特開平４−８９５６
９号公報）、ヒト網膜芽細胞腫遺伝子生成物の細胞サイ
クルに依存した制御（特表平５−５０３４２１号公
報）、細胞増殖性疾患に対する遺伝子治療（特表平５−
５０７０６７号公報）等を例示することができる。

【０００８】従来、Ｒｂ遺伝子に着目し、同遺伝子のｍ
ＲＮＡに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを利
用し、株化培養細胞においてその増殖を促進した例［Ｗ
Ｏ９２／５２７２号公報、ＷＯ９３／１３２０４号公報
及びバイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサ
ーチ・コミュニケーション(Biochemical and Biophysic
al Research Communication)，第１７９巻，第５２９ペ
ージ，１９９１年］も知られている。

【０００９】これらの例は、Ｒｂ蛋白質のｍＲＮＡの開
始コドンを含んだヌクレオチド配列に対応した８〜３０
ヌクレオチドからなる合成アンチセンスオリゴヌクレオ
チドを、細胞培養液中に５〜３５μＭ添加する方法であ
る。しかしながら、合成アンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの細胞内での蛋白質合成抑制効果は、一時的であるこ
とから、その効果を持続させるためには、再添加が必要
であり、産業上有効な手段ということはできない。更
に、大規模な細胞の培養においては、合成したヌクレオ
チドを大量に必要とするので、莫大な費用を要し、産業
上望ましくない。

【００１０】また、アンチセンスＲＮＡ発現ベクタ−を
細胞内に組込んだ場合、標的ｍＲＮＡの機能を効果的に
阻害できる場合のあることが公知であり［アニュアル・
レビュ−・オブ・バイオケミストリ−（Annual Review
of Biochemistry），第５５巻，第５６９ペ−ジ，１９
８６年］、これら公知の方法と開始コドンを含む塩基配
列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた方
法が有効であることを組み合わせることにより、細胞増
殖抑制蛋白質ｍＲＮＡの開始コドンを含むアンチセンス
ＲＮＡ発現ベクタ−を細胞内に組込むことは容易に考え
られる。

【００１１】更に、Ｒｂ遺伝子とは全く別個の遺伝子で
あるが、同様に癌抑制遺伝子であることが知られている
ｐ５３遺伝子ｍＲＮＡ（実験医学，第１１巻，第１０４
７ペ−ジ，１９９３年）の開始コドンを含んだ領域に対
応するアンチセンスＲＮＡ発現ベクタ−を細胞内に組込
んだ例も知られている［オンコジ−ン（Oncogene），第
１巻，第２７７ペ−ジ，１９８７年］。これらの従来技
術に基づいて、Ｒｂ蛋白質、ｐ５３及びＥ−カドヘリン
等の細胞増殖抑制蛋白質ｍＲＮＡの開始コドンを含む
５′側領域に対するアンチセンスＲＮＡ発現ベクタ−を
細胞内に組込む発明が特許出願されている（ＷＯ９３／
１３２０４号公報）。

【００１２】しかしながら、この発明は、実質的に前記
の公知の事実に相当するといえるものであって、ほとん
ど新規性が認められないばかりではなく、使用されてい
るＲｂ蛋白質のｍＲＮＡに対応するアンチセンス配列
（以下公知の遺伝子と記載することがある）の一部は、
免疫グロブリンのスイッチ領域又は染色体テロメア領域
で知られている４量体構造をとることが報告されている
配列である［ヌクレイック・アシッズ・リサ−チ（Nucl
eic Acids Research），第２０巻，第４９ペ−ジ，１９
９２年］。

【００１３】このような配列を有する遺伝子を動物細胞
に導入した場合、染色体に組込まれた遺伝子の安定性が
懸念され、物質生産の宿主としては産業上望ましくな
い。更に、公知の配列は、グアニン及びシトシンの含有
量が極端に高く、このような配列は、現在の分子生物学
的手法では、よい結果が得られないことが知られており
〔ミカエル・エー・インニス(Michael A. Innis)ら著，
ピー・シー・アール・プロトコール（PCR Protocol) ，
第５４ページ，アカデミック・プレス(AcademicPres
s)，１９９０年及び村松正実・岡山博人編，「遺伝子工
学ハンドブック」，第１版，第１９４ページ，羊土社，
１９９１年〕、産業上の利用が困難である。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、鋭意研
究を行った結果、Ｒｂ蛋白質のｍＲＮＡの３′側非翻訳
領域に相補的な核酸断片に、極めて強力にＲｂ蛋白質合
成を抑制する効果が存在することを見出し、本発明を完
成した。

【００１５】本発明の目的は、産業上有効であり、大規
模な細胞培養においても実用に供することが可能であ
り、特殊なプロモーターを使用しなくとも、細胞内でＲ
ｂ蛋白質の産生を強力に抑制し、しかも染色体に組込ま
れた状態でも極めて安定な核酸断片（以下遺伝子と記載
することがある）を提供することである。

【００１６】本発明の他の目的は、上記核酸断片を発現
する１種類のベクターのみを細胞内に導入することによ
りＲｂ蛋白質合成を抑制し得るＲｂ蛋白質のｍＲＮＡに
対するアンチセンスＲＮＡ発現プラスミドベクター（以
下アンチセンスベクターと記載することがある）を提供
することである。

【００１７】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決する本発
明の第１の発明は、マウスＲｂ蛋白質ｍＲＮＡの３′側
非翻訳領域の塩基配列又は該塩基配列若しくは該塩基配
列の一部の塩基配列と少なくとも７７．３％の相同性を
有する塩基配列、に相補的な塩基配列を有する核酸断片
を含む動物細胞のＲｂ蛋白質の合成を抑制する機能を有
する核酸断片、であり、核酸断片が、配列番号１乃至配
列番号３の塩基配列又は該塩基配列若しくは該塩基配列
の一部の塩基配列と少なくとも７７．３％の相同性を有
する核酸断片を含む動物細胞のＲｂ蛋白質の合成を抑制
する機能を有するＤＮＡ断片、であることを望ましい態
様としてもいる。

【００１８】前記課題を解決する本発明の第２の発明
は、マウスＲｂ蛋白質ｍＲＮＡの３′側非翻訳領域の塩
基配列又は該塩基配列若しくは該塩基配列の一部の塩基
配列と少なくとも７７．３％の相同性を有する塩基配
列、に相補的な塩基配列を有する核酸断片を含む動物細
胞のＲｂ蛋白質の合成を抑制する機能を有する核酸断片
が組込まれ、核酸断片を動物細胞内において発現するプ
ラスミドベクター、であり、核酸断片が、配列番号１乃
至配列番号３の塩基配列又は該塩基配列若しくは該塩基
配列の一部の塩基配列と少なくとも７７．３％の相同性
を有する核酸断片を含む動物細胞のＲｂ蛋白質の合成を
抑制する機能を有するＤＮＡ断片である前記プラスミド
ベクター、であることを望ましい態様としてもいる。

【００１９】次に本発明について詳述する。本発明の第
１の発明においては、マウスＲｂ蛋白質ｍＲＮＡのヌク
レオチド配列の５′側末端を基準にして３′末端方向に
２８７８番目から４５７５番目、２８７８番目から３７
７８番目、及び３７７９番目から４５７５番目に相当す
る塩基配列に相補的な塩基配列のＤＮＡを有する遺伝子
を用いる（以下ヌクレオチド番号はマウスＲｂ蛋白質ｍ
ＲＮＡの５′側末端を基準にして３′末端方向へのヌク
レオチドの順番を示す）。このようなヌクレオチド配列
からなる遺伝子は、そのヌクレオチド配列が前記の如何
なる公知のものとも異なっており、前記の公知のものの
ように、グアニン及びシトシンの含量が極端には高くな
い。従って、後記のＰＣＲ法等によって、容易に遺伝子
断片を調製することができる。

【００２０】このような遺伝子を調製するには、Ｒｂ蛋
白質を発現している動物組織又は細胞から公知の方法に
よりＲＮＡを抽出し、逆転写酵素によりＤＮＡを合成
し、所望の遺伝子のみをポリメラーゼ・チェイン・リア
クション（Polymerase Chain Reaction、以下ＰＣＲと
記載することがある）法［ヘンリー・エー・エールリッ
チ(Henry A. Erlich)著，ピーシーアール・テクノロジ
ー(PCR Technology)，第８９〜９７ページ，ストックト
ン・プレス(Stochton Press)，１９８９年］により増幅
して調製することができる。

【００２１】また、公知の方法（東京大学医科学研究所
制癌研究部編，「細胞工学実験プロトコ−ル」，第１
版，第５ペ−ジ，秀潤社，１９９１年）により動物組織
又は細胞からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によりＤＮＡの
特定部位のみを増幅し、増幅したＤＮＡを適当なＤＮＡ
切断制限酵素により消化し、適当な核酸断片のみをリガ
ーゼにより再結合させて調製することもできる。更に、
前記の手法を種々組合わせて調製することも可能であ
り、その一例を示せば次のとおりである。

【００２２】即ち、Ｒｂ蛋白質を発現しているマウス培
養細胞からアシッド・グアニジニウム・フェノール・ク
ロロフォルム（Acid Guanidinium-Phenol-Chloroform）
法（東京大学医科学研究所制癌研究部編，「細胞工学実
験プロトコ−ル」，第１版，第２８ペ−ジ，秀潤社，１
９９１年）によりＲＮＡを抽出する。このＲＮＡを鋳型
とし、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素と共に４２
℃で１５分間保温し、ＤＮＡを合成する。その後、所望
の遺伝子の５′及び３′末端からの１５〜４０ヌクレオ
チドに加え、適当なＤＮＡ切断制限酵素認識部位を有す
る５〜１５ヌクレオチドを付加した合成オリゴヌクレオ
チドをセンス及びアンチセンスプライマーとして、例え
ば、配列番号１、配列番号２又は配列番号３の遺伝子を
ＰＣＲ法により増幅する。

【００２３】それぞれの遺伝子を含有したＰＣＲ生成物
を低融点アガロースゲル電気泳動（村松正実編，「ラボ
マニュアル遺伝子工学」，第１版，第１９ペ−ジ，丸善
社，１９８８年）に供し、他の不要成分を除去し、遺伝
子を分離する。フェノール抽出法（村松正実編，「ラボ
マニュアル遺伝子工学」，第１版，第２９ペ−ジ，丸善
社，１９８８年）により低融点アガロースゲルから遺伝
子を回収し、乾固し、所望の遺伝子を得る。以上のよう
にして、この発明の遺伝子は得られるが、本発明の遺伝
子を調製する方法は、前記の方法に限定されるものでは
なく、その他公知の化学的合成法又は通常の遺伝子工学
的方法及び入手可能な出発材料を利用することによって
調製することができる。

【００２４】このようにして得られた遺伝子は、本発明
の第２の発明である、動物細胞のＲｂ蛋白質合成抑制核
酸断片を含んだ動物細胞内において発現するプラスミド
ベクターの調製に用いられる。即ち、前記遺伝子を動物
細胞発現用プラスミドベクターの動物細胞発現用プロモ
ーターの下流に公知の方法（村松正実編，「ラボマニュ
アル遺伝子工学」，第１版，第１１１ペ−ジ，丸善社，
１９８８年）により、次のように組込み、アンチセンス
ベクターを調製する。

【００２５】組込む遺伝子は、その両末端を、次のいず
れかの方法により処理する。 適当なＤＮＡ切断制限酵素により消化する 適当なＤＮＡ修飾酵素により修飾する 適当なＤＮＡ切断制限酵素認識配列を含有する合成Ｄ
ＮＡリンカーをリガーゼにより連結する これらの処理を種々に組み合わせて処理する 一方、プラスミドベクターも適当なＤＮＡ切断制限酵素
により直鎖状となし、遺伝子の場合と同様に両末端を処
理し、遺伝子とプラスミドベクターをリガーゼにより連
結して、遺伝子を組込んだ動物細胞内において発現する
所望のアンチセンスベクターを得ることができる。

【００２６】また、所望の遺伝子を含有する核酸断片の
両末端に前記処理を施し、リガーゼによりプラスミドベ
クターに連結し、適当なＤＮＡ切断制限酵素により不要
な核酸断片を切除し、再びリガーゼにより連結して、ア
ンチセンスベクターを得ることもできる。尚、該プラス
ミドベクターは、動物細胞発現用プロモーターとして、
ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＴＫ
プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＭＭＴＶプロモー
ター、β−アクチンプロモーター等を有する。又は、Ｃ
ＭＶエンハンサー等のエンハンサー機能を持つＤＮＡ配
列を有することが望ましい。また、動物細胞発現用プロ
モ−タ−以外に、次のＤＮＡ配列を含んでいることが望
ましい。

【００２７】ａ）ＳＶ４０初期スプライシング部位等の
スプライシング配列 ｂ）ウシ成長ホルモンｍＲＮＡ等に含有されるポリＡ付
加シグナル ｃ）動物細胞発現用プロモーターにより発現するネオマ
イシン耐性遺伝子、キサンチン・グアニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ遺伝子等、形質転換した動物細胞
に特定の薬剤に対する耐性能を付与する遺伝子 ｄ）アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐
性遺伝子等、形質転換した大腸菌に特定の薬剤に対する
耐性能を付与する遺伝子 ｅ）ＳＶ４０初期プロモーター等の動物細胞内で機能す
るＤＮＡ複製開始点 ｆ）ＣｏｌＥ１等、大腸菌内で機能するＤＮＡ複製開始
点 ｇ）前記機能ＤＮＡ配列の種々の組合せ

【００２８】次に、アンチセンスベクターの調製方法の
一例について示す。プラスミドベクターに存在する動物
細胞発現用プロモーターの下流部位を、適当なＤＮＡ切
断制限酵素により切断し、直鎖状となし、直鎖状にした
プラスミドベクター及び遺伝子をＴ４ ＤＮＡポリメラ
ーゼと共に３７℃で５分間保温し、両末端を平滑化す
る。次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと共に１６℃で３０分
間保温し、プラスミドベクターと遺伝子を連結し、所望
のアンチセンスベクターを得ることができる。以上のよ
うにして、本発明のアンチセンスベクターは得られる
が、本発明のアンチセンスベクターを調製する方法は、
前記の方法に限定されるものではなく、その他公知の化
学的合成法又は通常の遺伝子工学的方法及び入手可能な
出発材料を利用することによって調製することができ
る。

【００２９】次に試験例を示して本発明を更に詳述す
る。 試験例１ この試験は、本発明の配列番号１乃至配列番号３の遺伝
子を含む核酸断片を確認するために行った。 （１）試料の調製 実施例１乃至実施例３と同一の方法により配列番号１乃
至配列番号３の遺伝子を含む核酸断片を調製した。

【００３０】（２）試験方法 前記遺伝子を常法（村松正実編，「ラボマニュアル遺伝
子工学」，第１版、第１９ペ−ジ，丸善社，１９８８
年）によりアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウム
ブロマイド染色（村松正実編，「ラボマニュアル遺伝子
工学」，第１版，第１９ペ−ジ，丸善社，１９８８年）
により可視化した。

【００３１】（３）試験結果 この試験の結果は図１に示すとおりである。図１は、本
発明の遺伝子を含むＤＮＡ断片のアガロース電気泳動図
であり、第１列、第２列、第３列及び第４列はそれぞれ
ＤＮＡサイズマーカー、配列番号１、配列番号２及び配
列番号３を示し、図の左側の数字は塩基対（ｂｐ）の数
を示す。図１から明らかなように、ＤＮＡサイズマーカ
ー（第１列）との比較から、所望の遺伝子を含む核酸断
片、即ち約１７５０ｂｐ、約９２０ｂｐ及び約９１０ｂ
ｐ、が得られたことが確認された。尚、このようにして
得られた核酸断片を全自動ＤＮＡシークエンサー（ＡＢ
Ｉ社製。３７３Ａ）で分析した結果、所望の遺伝子を含
むことが認められた。

【００３２】試験例２ この試験は、本発明の動物細胞のＲｂ蛋白質合成抑制核
酸断片及び該核酸断片発現のためのプラスミドベクター
の各種効果を調べるために行った。 （１）試料の調製 実施例１乃至実施例６と同一の方法により動物細胞のＲ
ｂ蛋白質合成抑制核酸断片及び該核酸断片発現のための
プラスミドベクターを調製した。

【００３３】（２）試験方法 １）動物細胞へのアンチセンスベクターの導入方法 ウシ胎児血清（ハイクローン社製）を１０％含有するダ
ルベッコＭＥＭ（ギブコＢＲＬ社製。以下ダルベッコＭ
ＥＭをＤＭＥＭと記載する）によりＣＯＳ−７細胞（特
殊法人理化学研究所から入手）を、温度３７℃、５％
（容量）のＣＯ₂を含む気相中で継代培養した。継代培
養したＣＯＳ−７細胞に、アンチセンスベクター及びβ
−ガラクトシダ−ゼ発現ベクタ−であるｐａｃｔ−β
ｇａｌ−ＤＮＡ（ニッポンジーン社製）をリポフェクト
アミン試薬（ギブコＢＲＬ社製）により、次のようにし
て導入した。

【００３４】アンチセンスベクター４．５μｇ、ｐａｃ
ｔ−β ｇａｌ−ＤＮＡ０．７５μｇ、リポフェクトア
ミン試薬２２．５μｌ及びＤＭＥＭを混和して最終容量
を０．６ｍｌに調整し、室温で４５分間保温した。更に
ＤＭＥＭ２．４ｍｌを加え、形質転換用溶液を調製し、
この溶液によりＣＯＳ−７細胞約１０⁶ 個を２４時間培
養した。その後、培養液を１０％ウシ胎児血清含有ＤＭ
ＥＭに交換して更に４８時間培養した。尚、ｐａｃｔ−
β ｇａｌ−ＤＮＡをＣＯＳ−７細胞に同時に導入した
のは、導入後得られた細胞の抽出液中のβ−ガラクトシ
ダーゼ活性からアンチセンスベクターの導入効率を試験
するためである。また、対照ベクタ−としてアンチセン
スＲＮＡを発現しないｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロジェ
ン社製）を前記と同様の方法によりＣＯＳ−７細胞に導
入した。

【００３５】２）アンチセンスベクターの導入効率の試
験方法 常法（東京大学医科学研究所制癌研究部編，「細胞工学
実験プロトコール」，第１版，第２７０ページ，秀潤
社，１９９１年）により、次のように実施した。アンチ
センスベクターを導入したＣＯＳ−７細胞から、常法
（東京大学医科学研究所制癌研究部編，「細胞工学実験
プロトコール」，第１版，第１７４ページ，秀潤社，１
９９１年）により細胞抽出液を調製し、一定の総蛋白質
量を含有する抽出液０．１５ｍｌに、基質として１５ｍ
Ｍクロロフェノール・レッド−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド(Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside：ベー
リンガーマンハイム社製）０．０３ｍｌを添加し、混和
して３７℃で１時間保温し、１ＭのＮａ₂ ＣＯ₃ ０．０
７５ｍｌを添加し、反応を停止した。そののち、分光光
度計（バイオ・ラッド社製。３５５０型）により５７０
ｎｍの吸収を測定し、β−ガラクトシダーゼ活性を算出
してアンチセンスベクターの導入効率を試験した。

【００３６】３）細胞内の染色体に組込まれたアンチセ
ンスベクターの効果の試験方法 ウシ胎児血清を５％含有するＤＭＥＭによりマウス乳癌
由来ＦＭ３Ａ細胞（特殊法人理化学研究所より入手）を
３７℃、５％ＣＯ₂ 気相下で継代培養し、前記と同一の
方法によりアンチセンスベクターを導入した。その後、
Ｇ４１８（ギブコＢＲＬ社製）４００μｇ／ｍｌ及びウ
シ胎児血清を５％含有するＤＭＥＭにより培養した。１
０〜１４日後、アンチセンスベクターが有するＧ４１８
耐性能を付与されてコロニー状に増殖した細胞を単離し
（以下クローンと記載することがある）、更に１か月間
以上継代培養し、試験に供した。

【００３７】４）細胞内Ｒｂ蛋白質含量の定量方法 前記アンチセンスベクターを導入したＣＯＳ−７細胞及
びＦＭ３Ａ細胞から、常法（東京大学医科学研究所制癌
研究部編，「細胞工学実験プロトコール」，第１版，第
１７４ページ，秀潤社，１９９１年）により細胞抽出液
を調製した。一定の総蛋白質量の各抽出液に、次の方法
により調製した抗Ｒｂ蛋白質ポリクローナルウサギ抗血
清を添加し、免疫沈降反応（東京大学医科学研究所制癌
研究部編、「細胞工学実験プロトコール」、第１版、第
２３７ページ、秀潤社、１９９１年）を行い、Ｒｂ蛋白
質を濃縮し、そののち、抗Ｒｂ蛋白質ポリクローナルウ
サギ抗血清を用いたウェスタンブロッティング法（東京
大学医科学研究所制癌研究部編，「細胞工学実験プロト
コール」，第１版，第１９１ページ，秀潤社，１９９１
年）によりＲｂ蛋白質を検出し、一定量の細胞総蛋白質
中に含有されるＲｂ蛋白質含量を試験した。

【００３８】実施例１とほぼ同一の方法により、マウス
Ｒｂ蛋白質のＮ末端から２３８番目〜５９８番目のアミ
ノ酸配列をコードする核酸断片を調製し、常法（実験医
学，第９巻，第１０８２ページ，１９９１年）に基づい
て大腸菌内においてＲｂ蛋白質断片を発現させた。該Ｒ
ｂ蛋白質断片を抗原として用い、常法（生体の科学，第
３８巻，第５号，第３６１ページ）によりウサギに投与
し、抗Ｒｂ蛋白質ポリクローナルウサギ抗血清を調製し
た。

【００３９】５）細胞増殖速度の試験方法 形質転換３２時間後に、直径３５ｍｍの培養皿に前記Ｃ
ＯＳ−７細胞を播種し、経時的に回収し、血球計算板に
より細胞数の変化を計測し、細胞増殖速度を試験した。

【００４０】（３）試験結果 ＣＯＳ−７細胞における細胞内Ｒｂ蛋白質含量に対する
アンチセンスベクターの効果に関する試験結果は、図２
に示すとおりである。図２は、ＣＯＳ−７細胞における
細胞内Ｒｂ蛋白質蓄積量に対するアンチセンスベクター
の効果を示すウエスタンブロット像であり、第１列〜第
４列は、それぞれ対照ベクター、アンチセンスベクタ−
１、アンチセンスベクタ−２、及びアンチセンスベクタ
−３を導入した細胞のＲｂ蛋白質（分子量１１５ｋＤ）
の検出結果を示す。

【００４１】図２から明らかなように、対照ベクターと
比較して、各アンチセンスベクターを導入したＣＯＳ−
７細胞では、Ｒｂ蛋白質の検出量が顕著に減少した。ま
た、この時の対照ベクター及び各アンチセンスベクター
のＣＯＳ−７細胞への導入効率は、対照ベクター、アン
チセンスベクタ−１、アンチセンスベクタ−２及びアン
チセンスベクタ−３を導入した細胞において、それぞれ
１．００、１．０１、０．７４及び１．２４の比率であ
り、ほぼ一定であったことから、アンチセンスベクター
の効果を反映した結果であることが認められた。

【００４２】ＣＯＳ−７細胞における各アンチセンスベ
クターの細胞増殖に対する効果に関する試験結果は、図
３に示すとおりである。図３は、ＣＯＳ−７細胞におけ
る各アンチセンスベクターの細胞増殖に対する効果を示
す。図中、縦軸及び横軸は、それぞれ相対的細胞数及び
形質転換後日数を示し、○、□、■及び●は、それぞれ
対照ベクター、アンチセンスベクタ−１、アンチセンス
ベクタ−２及びアンチセンスベクタ−３を示す。図３か
ら明らかなように、対照ベクターを導入した細胞と比較
して、いずれのアンチセンスベクターを導入した細胞も
増殖速度の顕著な増加が認められた。

【００４３】薬剤耐性能を指標として取得した、染色体
にアンチセンスベクターを組込んだ形質転換ＦＭ３Ａ細
胞中のＲｂ蛋白質蓄積量に対するアンチセンスベクター
の効果は、図４に示すとおりである。図４は、形質転換
ＦＭ３Ａ細胞中のＲｂ蛋白質蓄積量に対するアンチセン
スベクターの効果を示すウエスタンブロット像であり、
図中第１列及び第２列は、それぞれ対照ベクターを導入
したクローン１及びクローン２、第３列及び第４列はア
ンチセンスベクター１を導入したクローン３及びクロー
ン４、のＲｂ蛋白質（１１０ｋＤ）を示す。

【００４４】図４から明らかなように、対照ベクターを
組込んだクローン１及び２と比較して、アンチセンスベ
クタ−１を組込んだクローン３及び４では、細胞内Ｒｂ
蛋白質含量は顕著に減少することが認められた。以上の
試験結果から、アンチセンスベクターにより各種動物細
胞におけるＲｂ蛋白質含量を抑制できること、及びアン
チセンスベクターを導入した各種動物細胞の増殖速度を
変更できることが立証された。

【００４５】試験例３ この試験は、アンチセンスベクターを染色体内に組込ん
だ動物細胞における本発明の遺伝子の安定性を試験する
ために行った。 （１）試料の調製 実施例１及び実施例４と同一の方法により本発明のＲｂ
蛋白質合成抑制遺伝子及び該遺伝子発現のためのプラス
ミドベクターを調製した。試験例２と同一の方法によ
り、アンチセンスベクタ−１を染色体に組込んだＦＭ３
Ａ細胞を単離した。

【００４６】（２）細胞内の染色体に組込まれた遺伝子
の安定性の試験方法 染色体に組込まれた遺伝子を高感度に検出するため、公
知の方法［ヘンリー・エー・エールリッチ（Henry A. E
rlich）編，「ＰＣＲテクノロジー」，第１版，第３１
ページ，ストックトン・プレス社（Stockton Press），
１９８９年）により細胞の総ＤＮＡを抽出し、以下のプ
ライマー（１）及び（２）を用いてＰＣＲ法により遺伝
子を増幅した。 プライマー（１） ５′−TGGCAACTAGAAGGCACAGT−３′ プライマー（２） ５′−CGCTCGAGCATGCATCTAGA−３′ ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動により分離し、
増幅された核酸断片をエチジウムブロマイド染色により
可視化し、その存在の有無を試験した。尚、これらのプ
ライマーを用いた場合、アンチセンスベクター中の遺伝
子のみが特異的に増幅されることを確認している。

【００４７】（３）試験結果 アンチセンスベクター１を染色体に組込み、形質転換後
約１か月のＦＭ３Ａ細胞では、高率に遺伝子が検出さ
れ、３６クローン中２８クローン（７８％）において遺
伝子が保持されていることが認められた。遺伝子を保持
しているクローンを更に１か月継代培養し、同様な試験
を実施したところ、９５％以上のクローンで遺伝子がそ
のまま保持されていた。以上の結果から、本発明の遺伝
子は、染色体に組込まれた場合であっても極めて安定に
保持されることが認められた。

【００４８】次に実施例を示して本発明を詳述するが、
本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。

【実施例】

実施例１（配列番号１の遺伝子の製造） マウスＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞（特殊法人理化学研究
所）からＲＮＡｚｏｌＢ（商標。バイオテックス・ラボ
ラトリーズ社製）により、次のようにＲＮＡを調製し
た。１×１０⁷ 細胞にＲＮＡｚｏｌＢ（商標。バイオテ
ックス・ラボラトリ−ズ社製）２ｍｌを加えて混和し、
更にクロロフォルム０．２ｍｌを加えて混和し、４℃で
１５分間保温し、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間遠
心し、ＲＮＡを含む水層を採取し、等量のイソプロパノ
ールを加えて混和し、更に４℃で１５分間保温し、再度
同一の条件で遠心し、ＲＮＡの沈澱を得た。

【００４９】得られたＲＮＡを鋳型とし、ジーンアンプ
ＲＮＡ−ＰＣＲキット（登録商標。パーキン・エルマー
・シータス社製）を用い、次のように細胞のＲｂ蛋白質
合成を抑制する遺伝子を製造した。ＲＮＡ１μｇ、逆転
写酵素（パ−キン・エルマ−・シ−タス社製）反応溶液
１７μｌ及びオリゴｄＴプライマ−（パ−キン・エルマ
−・シ−タス社製）１μｌを混和し、４２℃で１５分間
保温してＲＮＡからＤＮＡを合成し、９９℃で５分間加
熱して逆転写酵素を失活させ、そののち、オリゴヌクレ
オチド０．３μＭをプライマーとして用い、９５℃で１
分間、５５℃で２分間、７２℃で３分間を１サイクルと
した４０サイクルのＰＣＲを行い、微量に存在する所望
の遺伝子を増幅した。

【００５０】これとは別に、全自動ＤＮＡ合成機（ＡＢ
Ｉ社。３８１Ａ）を用いてオリゴヌクレオチドプライマ
ー（３）、（４）、（５）及び（６）を、公知の方法
［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids
Research）、第１２巻、第４５３９ページ、１９８４
年］により合成した。 プライマー（３）：５′−CGAAGCTTGTCTCAAACAAGGAGGAA
AAGTGAGGACC-３′ プライマー（４）：５′−CTGAATTCTTAAGGCTCTGAACAACT
AG−３′ プライマー（５）：５′−CTGAATTCGTATCTTGATTCTTCAGG
ACCC−３′ プライマー（６）：５′−AGAAGCTTCCCTAGTACAGTACAACC
CAAGTGC-３′

【００５１】上記プラマー（３）及び（４）を用い、配
列番号１の遺伝子をＰＣＲ法により増幅後、次のように
して遺伝子を精製した。増幅した遺伝子を含むＰＣＲ生
成物をアガロースゲル電気泳動（村松正実編、「ラボマ
ニュアル遺伝子工学」，第１版，第１９ペ−ジ，丸善
社，１９８８年）に供し、エチジウムブロマイド染色に
より可視化し、所望の遺伝子を含むアガロース断片を切
り出した。アガロース断片の５倍重量の１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ含有１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）溶液を加
え、６５℃で５分間保温し、再びアガロースを溶解し
た。その後、等量のフェノール溶液を加えて混和し、そ
ののち、１０，０００×ｇ、室温で３分間遠心し、上清
中に含まれる遺伝子をエタノール沈澱法（村松正実編，
「ラボマニュアル遺伝子工学」，第１版，第３１ペ−
ジ，丸善社，１９８８年）により回収し、配列番号１の
本発明の遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。

【００５２】実施例２（配列番号２の遺伝子の製造） 実施例１において調製したプライマー（３）及び（５）
を用い、実施例１と同一の方法により配列番号２の本発
明の遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。

【００５３】実施例３（配列番号３の遺伝子の製造） 実施例１において調製したプライマー（４）及び（６）
を用い、実施例１と同一の方法により配列番号３の本発
明の遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。

【００５４】実施例４（アンチセンスベクター１の製
造） 実施例１と同一の方法により得た遺伝子を、動物細胞用
発現ベクタープラスミドＤＮＡであるｐＲｃ／ＣＭＶ
（インビトロジェン社製）の動物細胞発現用ＣＭＶプロ
モーターの下流に、次のように組込み、アンチセンスベ
クターを製造した。実施例１で得た配列番号１の遺伝子
を含む核酸断片５０ｎｇの両末端部分を、ＤＮＡ切断制
限酵素ＥｃｏＲI （宝酒造社製）及びＨｉｎｄIII （宝
酒造社製）により消化し、同様にＤＮＡ切断制限酵素に
より消化したプラスミドＤＮＡベクターｐＢＣ ＳＫ＋
（ストラタジーン社製）５０ｎｇ及びＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼ（宝酒造社製）と混和し、１６℃で３０分間保温
し、核酸断片をプラスミドに組込んだ。

【００５５】更に、この組換えプラスミドＤＮＡをＤＮ
Ａ切断制限酵素ＡｐａI（宝酒造社製）及びＸｂａI（宝
酒造社製）により消化し、両末端に前記ＤＮＡ切断制限
酵素認識部位を有する遺伝子を切り出した。切り出した
遺伝子５０ｎｇ、前記ＤＮＡ切断制限酵素により消化し
たｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロジェン社製）５０ｎｇ及
びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を混和し、前記
と同一の条件で連結し、アンチセンスベクター１を製造
した。このようにして製造したアンチセンスベクターを
全自動ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ社製。３７３Ａ）
で分析した結果、所望の遺伝子が正しく挿入されている
ことが確認された。

【００５６】実施例５（アンチセンスベクター２の製
造） 実施例４で得たアンチセンスベクター１をＤＮＡ切断制
限酵素ＨｐａI （宝酒造社製）及びＸｂａＩ（宝酒造社
製）により消化し、配列番号１の遺伝子の一部を除去
し、そののち、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社
製）及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）により前
記と同一の反応条件で順次処理し、配列番号２の遺伝子
を組込んだアンチセンスベクター２を製造した。このよ
うにして製造したアンチセンスベクターを全自動ＤＮＡ
シークエンサー（ＡＢＩ社製。３７３Ａ）で分析した結
果、所望の遺伝子が正しく挿入されていることが確認さ
れた。

【００５７】実施例６（アンチセンスベクター３の製
造） 実施例４で得たアンチセンスベクター１をＤＮＡ切断制
限酵素ＨｐａI （宝酒造社製）及びＡｐａI （宝酒造社
製）により消化し、配列番号１の遺伝子の一部を除去
し、そののち、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社
製）及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）により前
記と同一の反応条件で順次処理し、配列番号３の遺伝子
を組込んだアンチセンスベクター３を製造した。このよ
うにして製造したアンチセンスベクターを全自動ＤＮＡ
シークエンサー（ＡＢＩ社製。３７３Ａ）で分析した結
果、所望の遺伝子が正しく挿入されていることが確認さ
れた。

【００５８】

【発明の効果】以上記載したように、本発明は、動物細
胞内でＲｂ蛋白質の合成を強力に抑制することにより、
細胞の増殖を制御する機能を有する核酸断片、及びその
核酸断片を動物細胞内で発現するためのプラスミドベク
ター（アンチセンスベクター）に関するものであり、本
発明により奏せられる効果は、次のとおりである。

【００５９】１）本発明のアンチセンスベクターは、極
めて強力にＲｂ蛋白質合成を制御する効果を有する。 ２）本発明のアンチセンスベクターを導入した細胞は、
染色体内に安定して該核酸断片を保持でき、また高効率
に増殖するため、物質生産の宿主細胞株として極めて有
用である。 ３）本発明の核酸断片等は、通常のＰＣＲ法等で容易に
製造又は検出することができ、物質生産の宿主細胞株等
産業上での利用が容易である。 ４）本発明のアンチセンスベクターを導入した細胞は、
高価なウシ胎児血清等の栄養源の要求が低いにもかかわ
らず、高い効率で物質を生産する宿主細胞株として利用
できる。 ５）本発明のアンチセンスベクターを初代培養正常細
胞、初代培養癌細胞、株化正常細胞、株化癌細胞等に導
入することにより、Ｒｂ蛋白質の発現が低下している種
々のモデル細胞を創出することができる。 ６）本発明のアンチセンスベクターを動物細胞の初期胚
に導入することにより、Ｒｂ蛋白質の発現が低下した遺
伝子導入動物を創出することができ、遺伝子導入動物、
又は同動物から採取した初代培養細胞及び株化培養細胞
は、医学、薬学、生物学等の研究材料として有用であ
る。 ７）本発明のアンチセンスベクターを癌細胞、白血病細
胞等に導入することにより、これらの細胞の増殖を制御
する遺伝子治療に応用することができる。

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１６９７ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジ−：不明 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｉｔｅ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTAAGGCTCT GAACAACTAG TTTATTTTAA AATAGACAAA CTATTATAGA AAATAGGAAC 60 ATAGCAATTT GAATGTATAG TTTCAACCGG TACAAAAAAA CAAAACCAAT AGTGCAGTGT 120 CTGCAGCTTT AAGAAATCTC GAAGCAGGAT CTCTGAAAAT TCCTATGATT CTGTCACTAA 180 TTCTAACTTG AACTCACTAG CAAAAGACCT AGAAGTATGG TAAGCCCTTG ACCTAAAACC 240 TAACTAATCT GTGTGATGAT CATGCAAAAC TTAATGAAGA AATGGGGGAA GCTGTCTATT 300 GCTTTTGTTA TTGAGATAAC TATCAAACTA GTAAAACTGA AACTAAATTG AGGACAAAAT 360 AGAAATTTGT TTCCTAACAA GACCAGATTT CTTTTCAAAA AGTATGGAGT TTAGAAAAAG 420 TGATTTTCTT AAATGCTAGC TGATGCTACC TTAAATATCC CCTATTTTAA ATTATACCAT 480 CTCTAAATAA GTTAATCCCA CAAGATAATT TAAATACACC TTTAGGTGGG GGGTGAAGGG 540 AGTGCCTCTA TTTTCAATGC ACCTGTTTTC ATCTGAAGTT TCTGCACAGC TGGACTAGAA 600 ATGGTGTGGC TTTGAAGAAG CCAGAGTTAT TAGACCAGAT TGGCTTAAAA AATAGATAAC 660 TGCAAGTTCA AAAGACCCTG GAAGATGTAC CATTCCAGAG AGAACACAAA CATCCCCAGA 720 TGTAGAAGAA CAGAGTAAAC TGTTGAGATG TAATTAGACA CGTCTATGAG GGAAAAAAAC 780 TGAAGGCTTC TATAGTTAAC AGTCTGCTTG TAAATCACAA TTAATTTGTA TCTTGATTCT 840 TCAGGACCCA GAAACATTAA AAAGTGCACT TGGGTTGTAC TGTACTAGGG TCCTCTTAAG 900 CACAGTTGTG GCCAAACTTG ACTTTCAAGT ACTACATGGG TACTTATAAA TTCAGTGATC 960 TGAATGATTG AAAGAAAAAA ACAACCTCGG AGTATTATCA ATAGTCTTCA GTTCAAAGCA 1020 TGTGTTGGGT GAATAAAAGA ATCGGTTCTT AGAGGGTCTG AGGTATGAAA TCTGTGTCAG 1080 TAGTAAGACA GTATCATATG ATTATACTTT TTTTGCTTGT ATTTCAAAAG TAAAATATGT 1140 GAAACAAACA CACGGCACAT TAGATTCTAA TATTAAAATA GTCCAATGTG TAGAAATTAG 1200 TACTTTTTCC CAGTTTGTAA CAATCTGTTT CAGTAGAAGA TTCAAGATAA TTTGGTTGAA 1260 TGTGGACAGT CAATCAACTT GCATTTGGAA GACAAGACAC ATTTTCTAAG GGTATTCACG 1320 TTAAATTAAA AAATACATAT AAATTAATAA AACCAAGAGC AAACATCACA CATGTGCCAT 1380 GAGGAAAGGC AAAGTAGTCA GCCAGATGTA GGGGGTCAGG ACCCCTGCAG AGGCCCTCAC 1440 TTCTGAGGGC AGCAGGCTCA TGTTGGAAAT GCAAACAACT TGCTTTCATA TTTTAAATGG 1500 CATGATCTGC ACAAGATTCT CAATCCTGTG TGCTATCAAT TCTCTACCAT TGATTACAAC 1560 ATTGAAGTGG CTTACGAATC ACCCACACAA ATATTCAGCT TGTACCTGCA CATTTTATAT 1620 CTCTAACATG AGCAGAACCT GGGAACTAGT CACAACCATG AGCCAGGAGT CTGGTGTCCC 1680 CAGGGCTGAG GGTCCAG 1697 配列番号：２ 配列の長さ：９００ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：不明 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｉｔｅ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 AACAGTCTGC TTGTAAATCA CAATTAATTT GTATCTTGAT TCTTCAGGAC CCAGAAACAT 60 TAAAAAGTGC ACTTGGGTTG TACTGTACTA GGGTCCTCTT AAGCACAGTT GTGGCCAAAC 120 TTGACTTTCA AGTACTACAT GGGTACTTAT AAATTCAGTG ATCTGAATGA TTGAAAGAAA 180 AAAACAACCT CGGAGTATTA TCAATAGTCT TCAGTTCAAA GCATGTGTTG GGTGAATAAA 240 AGAATCGGTT CTTAGAGGGT CTGAGGTATG AAATCTGTGT CAGTAGTAAG ACAGTATCAT 300 ATGATTATAC TTTTTTTGCT TGTATTTCAA AAGTAAAATA TGTGAAACAA ACACACGGCA 360 CATTAGATTC TAATATTAAA ATAGTCCAAT GTGTAGAAAT TAGTACTTTT TCCCAGTTTG 420 TAACAATCTG TTTCAGTAGA AGATTCAAGA TAATTTGGTT GAATGTGGAC AGTCAATCAA 480 CTTGCATTTG GAAGACAAGA CACATTTTCT AAGGGTATTC ACGTTAAATT AAAAAATACA 540 TATAAATTAA TAAAACCAAG AGCAAACATC ACACATGTGC CATGAGGAAA GGCAAAGTAG 600 TCAGCCAGAT GTAGGGGGTC AGGACCCCTG CAGAGGCCCT CACTTCTGAG GGCAGCAGGC 660 TCATGTTGGA AATGCAAACA ACTTGCTTTC ATATTTTAAA TGGCATGATC TGCACAAGAT 720 TCTCAATCCT GTGTGCTATC AATTCTCTAC CATTGATTAC AACATTGAAG TGGCTTACGA 780 ATCACCCACA CAAATATTCA GCTTGTACCT GCACATTTTA TATCTCTAAC ATGAGCAGAA 840 CCTGGGAACT AGTCACAACC ATGAGCCAGG AGTCTGGTGT CCCCAGGGCT GAGGGTCCAG 900 配列番号：３ 配列の長さ：７９７ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジ−：不明 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｉｔｅ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTAAGGCTCT GAACAACTAG TTTATTTTAA AATAGACAAA CTATTATAGA AAATAGGAAC 60 ATAGCAATTT GAATGTATAG TTTCAACCGG TACAAAAAAA CAAAACCAAT AGTGCAGTGT 120 CTGCAGCTTT AAGAAATCTC GAAGCAGGAT CTCTGAAAAT TCCTATGATT CTGTCACTAA 180 TTCTAACTTG AACTCACTAG CAAAAGACCT AGAAGTATGG TAAGCCCTTG ACCTAAAACC 240 TAACTAATCT GTGTGATGAT CATGCAAAAC TTAATGAAGA AATGGGGGAA GCTGTCTATT 300 GCTTTTGTTA TTGAGATAAC TATCAAACTA GTAAAACTGA AACTAAATTG AGGACAAAAT 360 AGAAATTTGT TTCCTAACAA GACCAGATTT CTTTTCAAAA AGTATGGAGT TTAGAAAAAG 420 TGATTTTCTT AAATGCTAGC TGATGCTACC TTAAATATCC CCTATTTTAA ATTATACCAT 480 CTCTAAATAA GTTAATCCCA CAAGATAATT TAAATACACC TTTAGGTGGG GGGTGAAGGG 540 AGTGCCTCTA TTTTCAATGC ACCTGTTTTC ATCTGAAGTT TCTGCACAGC TGGACTAGAA 600 ATGGTGTGGC TTTGAAGAAG CCAGAGTTAT TAGACCAGAT TGGCTTAAAA AATAGATAAC 660 TGCAAGTTCA AAAGACCCTG GAAGATGTAC CATTCCAGAG AGAACACAAA CATCCCCAGA 720 TGTAGAAGAA CAGAGTAAAC TGTTGAGATG TAATTAGACA CGTCTATGAG GGAAAAAAAC 780 TGAAGGCTTC TATAGTT 797

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の遺伝子を含むＤＮＡ断片のアガロース
電気泳動図を示す。

【図２】ＣＯＳ−７細胞における細胞内Ｒｂ蛋白質蓄積
量に対するアンチセンスベクターの効果を電気泳動及び
ウエスタンブロット法にて解析したウエスタンブロット
像を示す。

【図３】ＣＯＳ−７細胞における各アンチセンスベクタ
ーの細胞増殖に対する効果を示す説明図である。

【図４】形質転換ＦＭ３Ａ細胞中のＲｂ蛋白質蓄積量に
対するアンチセンスベクターの効果を電気泳動及びウエ
スタンブロット法にて解析したウエスタンブロット像を
示す。

【図５】本発明の一実施例の核酸断片の塩基配列を示
す。

【図６】本発明の他の実施例の核酸断片の塩基配列を示
す。

【図７】本発明の他の実施例の核酸断片の塩基配列を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田仲 昭子 東京都港区西新橋２−８−11 第７東洋海 事ビル８Ｆ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 マウスＲｂ蛋白質ｍＲＮＡの３′側非翻
   訳領域の塩基配列又は該塩基配列若しくは該塩基配列の
   一部の塩基配列と少なくとも７７．３％の相同性を有す
   る塩基配列、に相補的な塩基配列を有する核酸断片を含
   むことを特徴とする動物細胞のＲｂ蛋白質の合成を抑制
   する機能を有する核酸断片。
2. 【請求項２】 核酸断片が、配列番号１乃至配列番号３
   の塩基配列又は該塩基配列若しくは該塩基配列の一部の
   塩基配列と少なくとも７７．３％の相同性を有する核酸
   断片を含む動物細胞のＲｂ蛋白質の合成を抑制する機能
   を有するＤＮＡ断片である請求項１記載の核酸断片。
3. 【請求項３】 マウスＲｂ蛋白質ｍＲＮＡの３′側非翻
   訳領域の塩基配列又は該塩基配列若しくは該塩基配列の
   一部の塩基配列と少なくとも７７．３％の相同性を有す
   る塩基配列、に相補的な塩基配列を有する核酸断片を含
   む動物細胞のＲｂ蛋白質の合成を抑制する機能を有する
   核酸断片が組込まれていることを特徴とする動物細胞内
   において発現するプラスミドベクター。
4. 【請求項４】 核酸断片が、配列番号１乃至配列番号３
   の塩基配列又は該塩基配列若しくは該塩基配列の一部の
   塩基配列と少なくとも７７．３％の相同性を有する核酸
   断片を含む動物細胞のＲｂ蛋白質の合成を抑制する機能
   を有するＤＮＡ断片である請求項３記載のプラスミドベ
   クター。