JPH02242687A - 新規ｄｎａならびにそれを含有する発現プラスミド - Google Patents
新規ｄｎａならびにそれを含有する発現プラスミドInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は、生理活性物質の組換えＤＮＡ技術を用いた生
産において、有用なプロモーター領域を含有する新規Ｄ
ＮＡおよび該ＤＮＡを含有する発現プラスミドに関する
。さらに詳しくは、ヒトポリペプチド鎮延長因子遺伝子
のプロモーター領域を含有する新規ＤＮＡおよび該ＤＮ
Ａを含有する発現プラスミドに関する。
産において、有用なプロモーター領域を含有する新規Ｄ
ＮＡおよび該ＤＮＡを含有する発現プラスミドに関する
。さらに詳しくは、ヒトポリペプチド鎮延長因子遺伝子
のプロモーター領域を含有する新規ＤＮＡおよび該ＤＮ
Ａを含有する発現プラスミドに関する。
〈従来技術とその問題点〉
近年、遺伝子工学の研究が進展し、組換えＤＮＡ技術に
よる物質生産が実施されている。現在、宿主として大腸
菌を用いた組換え技術による異ｆ重蛋白質の生産方法は
ほぼ完成されたが、１！釦の付加が必須な物質あるいは
異種細胞による生産ではその生理活性または抗原性に変
化の生じるような物質の生産には、大腸菌の使用は不適
当である。
よる物質生産が実施されている。現在、宿主として大腸
菌を用いた組換え技術による異ｆ重蛋白質の生産方法は
ほぼ完成されたが、１！釦の付加が必須な物質あるいは
異種細胞による生産ではその生理活性または抗原性に変
化の生じるような物質の生産には、大腸菌の使用は不適
当である。
最近では本問題を解決するために、動物細胞を宿主とし
て用いた系が各種開発されている。一般に動物細胞での
遺伝子発現には、３種のシグナルが必要とされている。
て用いた系が各種開発されている。一般に動物細胞での
遺伝子発現には、３種のシグナルが必要とされている。
すなわち、プロモーターＲＮＡスプライシングシグナル
およびポリＡ付加のシグナルである。このうち、目的の
蛋白質を高発現させるためには、プロモーターの選択が
重要である。現在、よく用いられているプロモーターと
しては、パボーバウイルスの一種であるＳＶ４０の初期
プロモーター、アデノウィルスのメジャーレイトプロモ
ーター マウス等のメタロチオネインプロモーター等が
知られている。特に、最も繁用されているのはＳＶ４０
の初期プロモーターであるが、これにおいても、発現量
および宿主域の点で問題が残されている。すなわちＳＶ
４０の初期プロモーターを用いても、発現に組織特異性
があり、細胞種により発現量にばらつきが認められ、例
えば、リンパ球系細胞や神経系細胞では他の細胞種に比
べ、発現量が極めて低いのが現状である。
およびポリＡ付加のシグナルである。このうち、目的の
蛋白質を高発現させるためには、プロモーターの選択が
重要である。現在、よく用いられているプロモーターと
しては、パボーバウイルスの一種であるＳＶ４０の初期
プロモーター、アデノウィルスのメジャーレイトプロモ
ーター マウス等のメタロチオネインプロモーター等が
知られている。特に、最も繁用されているのはＳＶ４０
の初期プロモーターであるが、これにおいても、発現量
および宿主域の点で問題が残されている。すなわちＳＶ
４０の初期プロモーターを用いても、発現に組織特異性
があり、細胞種により発現量にばらつきが認められ、例
えば、リンパ球系細胞や神経系細胞では他の細胞種に比
べ、発現量が極めて低いのが現状である。
最近、武部等［モレキュラー アンド セルラー バイ
オロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、８巻５４
６６頁、１９８８年］は、ＳＶ４０初期プロモーター下
流にヒトＴ細胞白血病ウィルス−１の末端反復配列の一
部を組み込んだＳＲαプロモーターを構築した。そしで
ある種のリンパ球細胞を宿主として用いた結果、ＳＲα
プロモーターがＳＶ４０初期プロモーターに比べ、その
下流の遺伝子の発現効率をｌＯ〜１００倍程度高める事
を発表した。しかし、ＳＲαプロモーターが他の宿主細
胞においても高発現率を維持するか否かは不明である。
オロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、８巻５４
６６頁、１９８８年］は、ＳＶ４０初期プロモーター下
流にヒトＴ細胞白血病ウィルス−１の末端反復配列の一
部を組み込んだＳＲαプロモーターを構築した。そしで
ある種のリンパ球細胞を宿主として用いた結果、ＳＲα
プロモーターがＳＶ４０初期プロモーターに比べ、その
下流の遺伝子の発現効率をｌＯ〜１００倍程度高める事
を発表した。しかし、ＳＲαプロモーターが他の宿主細
胞においても高発現率を維持するか否かは不明である。
さらに今後のＤＮＡ組換え技術を用いて生産される有用
生理活性物質の多様性を考慮すると、より広い宿主細胞
域で使用できかつ高発現率を維持できるプロモーターの
探索および発現プラスミドの開発が望まれている。
生理活性物質の多様性を考慮すると、より広い宿主細胞
域で使用できかつ高発現率を維持できるプロモーターの
探索および発現プラスミドの開発が望まれている。
く本発明が解決しようとする課題〉
本発明の目的は、既知のプロモーターおよび該プロモー
ターを含有する発現プラスミドに比べ、広い宿主細胞域
で使用可能かつ高い発現効率を示すプロモーター領域を
含有する新規ＤＮＡおよび該ＤＮＡを用いた発現プラス
ミドを提供することにある。
ターを含有する発現プラスミドに比べ、広い宿主細胞域
で使用可能かつ高い発現効率を示すプロモーター領域を
含有する新規ＤＮＡおよび該ＤＮＡを用いた発現プラス
ミドを提供することにある。
〈課題を解決するための手段〉
このような現状に鑑み、本発明者らは、広い宿主細胞域
で高い発現効率を示すプロモーター領域を含有する新規
ＤＮＡの探索および該ＤＮＡを含有する発現プラスミド
の開発を実施した。その過程において本発明者らは、す
べての細胞で構成的に強く発現しているヒトポリペプチ
ド鎮延長因子−１ａ （Ｈｕｍａｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔ
ｌｄａ ｃｈａｉｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏ
ｒ−１ａ、以下ヒトＥＦ−１ａと略す）の染色体遺伝子
を単離し、当該遺伝子の塩基配列を初めて決定し、その
構造を明らかにした。次いで該遺伝子のプロモーター領
域を含む新規ＤＮＡを用い、発現プラスミドを作製した
。該発現プラスミドは、従来使用されている発現プラス
ミドに比し、広い宿主細胞域で使用可能かつ高発現効率
を示すことを証明し、本発明を完成した。
で高い発現効率を示すプロモーター領域を含有する新規
ＤＮＡの探索および該ＤＮＡを含有する発現プラスミド
の開発を実施した。その過程において本発明者らは、す
べての細胞で構成的に強く発現しているヒトポリペプチ
ド鎮延長因子−１ａ （Ｈｕｍａｎ ｐｏｌｙｐｅｐｔ
ｌｄａ ｃｈａｉｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏ
ｒ−１ａ、以下ヒトＥＦ−１ａと略す）の染色体遺伝子
を単離し、当該遺伝子の塩基配列を初めて決定し、その
構造を明らかにした。次いで該遺伝子のプロモーター領
域を含む新規ＤＮＡを用い、発現プラスミドを作製した
。該発現プラスミドは、従来使用されている発現プラス
ミドに比し、広い宿主細胞域で使用可能かつ高発現効率
を示すことを証明し、本発明を完成した。
ポリペプチド鎮延長因子は、遺伝子翻訳におけるポリペ
プチド鎖延長反応に関与する蛋白質因子であり、機能的
に大別して二種類に分類されている。すなわちｍＲＮＡ
の暗号に対応したアミノアシル−ｔＲＮＡをリポソーム
のＡ部位へ結合させる因子と、ペプチド転移反応の結果
リポソームのＡ部位に結合することになったペプチジル
−ｔＲＮＡを再びＰ部位へ転位させる因子である。
プチド鎖延長反応に関与する蛋白質因子であり、機能的
に大別して二種類に分類されている。すなわちｍＲＮＡ
の暗号に対応したアミノアシル−ｔＲＮＡをリポソーム
のＡ部位へ結合させる因子と、ペプチド転移反応の結果
リポソームのＡ部位に結合することになったペプチジル
−ｔＲＮＡを再びＰ部位へ転位させる因子である。
原核細胞では上記二種類のポリペプチド鎗延長因子（以
下ＥＦと略す）が、各々ＥＦ−Ｔ、ＥＦ−Ｇと命名され
、Ｅ Ｆ−ＴはさらにＥＦ−ＴｕとＥＦ−Ｔｓに分別さ
れている。一方、真核生物においては、細胞質およびミ
トコンドリア内にそれぞれ独立したＥＦが存在している
。細胞質内のＥＦの一つとして、大腸菌のＥＦ−Ｔｕの
機能に対応するＥＦ−１αが知られており、酵母やブタ
肝をはじめ種々の組織から精製されている。
下ＥＦと略す）が、各々ＥＦ−Ｔ、ＥＦ−Ｇと命名され
、Ｅ Ｆ−ＴはさらにＥＦ−ＴｕとＥＦ−Ｔｓに分別さ
れている。一方、真核生物においては、細胞質およびミ
トコンドリア内にそれぞれ独立したＥＦが存在している
。細胞質内のＥＦの一つとして、大腸菌のＥＦ−Ｔｕの
機能に対応するＥＦ−１αが知られており、酵母やブタ
肝をはじめ種々の組織から精製されている。
ヒトＥＦ−１α ｃＤＮＡは、ブランク等［ヨーロピア
ン ジサーナル オブ バイオケミス ト リ −
（Ｅｕｒｌ、Ｂｉｏｃｈａｍ、） 、 １ ５５
巻 、 １ ６７頁、１９８６年］によりすでに一
次構造が決定されたが、染色体遺伝子のＤＮＡ配列は明
らかではなかった。これは後述のごとく染色体遺伝子中
にヒトＥＦ−１α遺伝子の偽遺伝子が存在するため、ヒ
トＥＦ−１α染色体遺伝子の単離が困難であったことに
よる。前述のごとく本発明者らは、ヒトＥＦ−１αの染
色体遺伝子を単離し、ついで塩基配列を決定し、ヒトＥ
Ｆ−１α遺伝子のプロモーター領域を含む新規ＤＮＡ配
列ならびにイントロンのＤＮＡ配列を初めて明らかにし
た。ついで該プロモーター領域を含有する新規ＤＮＡが
、下流の遺伝子の発現効率を高めることを見いだし、該
ＤＮＡを含有する高発現プラスミドを作製した。
ン ジサーナル オブ バイオケミス ト リ −
（Ｅｕｒｌ、Ｂｉｏｃｈａｍ、） 、 １ ５５
巻 、 １ ６７頁、１９８６年］によりすでに一
次構造が決定されたが、染色体遺伝子のＤＮＡ配列は明
らかではなかった。これは後述のごとく染色体遺伝子中
にヒトＥＦ−１α遺伝子の偽遺伝子が存在するため、ヒ
トＥＦ−１α染色体遺伝子の単離が困難であったことに
よる。前述のごとく本発明者らは、ヒトＥＦ−１αの染
色体遺伝子を単離し、ついで塩基配列を決定し、ヒトＥ
Ｆ−１α遺伝子のプロモーター領域を含む新規ＤＮＡ配
列ならびにイントロンのＤＮＡ配列を初めて明らかにし
た。ついで該プロモーター領域を含有する新規ＤＮＡが
、下流の遺伝子の発現効率を高めることを見いだし、該
ＤＮＡを含有する高発現プラスミドを作製した。
すなわち本発明は、ヒトポリペプチド鎖延長因子遺伝子
のプロモーター領域を含有する新規ＤＮＡを提供する。
のプロモーター領域を含有する新規ＤＮＡを提供する。
さらに詳しくは、当該遺伝子の開始コドンの上流約２．
５Ｋｂｐを含有する新規ＤＮＡを提供する。
５Ｋｂｐを含有する新規ＤＮＡを提供する。
本発明はヒトポリペプチド鎮延長因子−１αのプロモー
ター領域を含有する下記式（１）で表される新規ＤＮＡ
を提供する。
ター領域を含有する下記式（１）で表される新規ＤＮＡ
を提供する。
式 （Ｉ ） ：
ＣＣＣＧＧＧＣＴＧＧＧＣＴＧＡＧＡＣＣＣＧＣＡＧＡ
ＧＧＡＡＧＡＣＧＣＴＣＴＡＧＧＧＡＴＴＴＧＴＣＣ（
：ＧＧＡＣＴＡＧＣＧＡＧＡＴＧＧｃＡＡＧＧＣＴＧＡ
ＧＧＡＣＧＧＧＡＧＧ（：ＴＧＡＴＴＧＡＧＡＧＧＣＧ
ＡＡＧＧＴＡＣＡ［：ＣＣＴＡＡＴＣ丁ＣＡＡＴＡＣＡ
ＡＣＣＴＴＴＧＧＡＧＣＴＡＡＧＣＣＡＧＣＡＡＴＧＧ
ＴＡＧＡＧＧＧＡＡＧＡＴＴＣＴＧＣＡＣＧＴＣＣＣＴ
ＴＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＴＣＣＣＣＧＴＣＡＣＣＡＣ：
ＣＣＣＣＣＣＣＡＡ（ＩＩ：ＣＧＣＣＣＣＧＡＣＣＧＧ
ＡＧＣＴＧＡＧＡＧＴＡＡＴＴＣＡＴＡＣＡＡＡＡＧＧ
ＡＣＴＣＧＣＣＣＣＴＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＡＴＣＣＣ
ＡＧＧＧＡＣＣＧＴＣＧＴＴＡＡＡＣＴＣＣＣＡＣＴＡ
ＡＣＧＴＡＧＡＡＣＣＣＡＧＡＧＡＴＣＧ’ＣＴＧＣＧ
ＴＴＣＣＣＧＣＣＣＣＣＴＣＡＣＣＣＧＣＣＣＧＣＴＣ
ＴＣＧＴＣＡＴ（：ＡＣＴＧＡＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡ
ＧＣＡＴＧＣＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣ（：Ｇ
Ｔ（：ＡＧＴＧＧＧＣ＾ＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣ
ＣＡＣ＾ＧＴＣＣＣＣＧＡＧ＾＾ＧＴＴＧＧＧＧＧＧ＾
４４０ＧＧＧＧ丁ＣＧＧＣＡＡＴＴＧ＾＾ＣＣＧＧＴ
ＧＣＣＴＡＧＡＧ＾＾ＧＧＴＧＧＣＧＣＧ ４８０Ｇ
ＧＧＴ＾＾＾ＣＴＧＧＧ＾＾＾ＧＴＧＡＴＧＴＣＧＴＧ
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ＣＧＡＧＧＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＡＴＡＴ＾
＾ＧＴＧＣＡＧＴ＾ ５６０２２０ｉ ＧＡＡＣＡＣＡＧＧＴＡＡＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＴＧＧ
ＴＴＣＣＣＧＣＧＧＧＣＣＴＧＧ ６４０ＣＣＴＣＴ
ＴＴＡＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＣＣＣＴＴＧＣＧＴＧＣＣ
ＴＴＧＡＡＴＴＡＣＴ ６８０ＴＣＣＡＣＧＣＣＣＣ
τＧＧＣＴＧＣＡＧＴＡＣＧＴＧＡＴＴＣＴＴＧＡＴＣ
ＣＣＧＡＧ ７２０ＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＧＡＡＧＴ
ＧＧＧＴＧＧＧＡＧ＾ＧＴＴＣＧＡＧＧＣＣＴＴＧＣＧ
７６０ＣＴＴＡＡＧＧＡＧＣＣＣＣＴＴＣＧＣＣＴ
ＣＧＴＧＣＴＴＧＡＧＴＴＧＡＧＧＣＣＴＧ ８００
ＧＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧ
ＣＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣ八Ｃ ８４０ＣＴＴＣＧＣ
ＧＣＣＴＧＴＣＴＣＧＣＴＧＣＴＴＴＣＧＡＴ＾＾ＧＴ
ＣＴＣＴＡＧＣＣ＾ ８８０ＴＴＴ＾＾＾＾ＴＴＴＴＴ
ＧＡＴＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣＧＡＣＧＣＴＴＴＴＴＴＴ
ＣＴＧ ９２（ＩＧＣ＾＾ＧＡＴＡＧＴＣＴＴＧＴ＾
＾＾ＴＧＣＧＧＧＣＣ＾＾ＧＡＴＣＴＧＣＡＣＡＣＴ
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ＧＣＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＧＧＧＧＣＣＣ１０００ＧＴ
ＧＣＧＴＣＣＣＡＧＣＧＣＡＣＡＴＧＴＴＣＧＧＣＧ＾
ＧＧＣＧＧＧＧＣＣＴＧＣＧｌ０４０ＡＧＣＧＣＧＧＣ
ＣＡＣＣＧＡＧＡＡＴＣＧＧＡＣＧＧＧＧＧＴＡＧＴＣ
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ＧＧＴＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴ
Ａｌ１２０ＴＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡ
ＡＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＴＣＧＧＣＡＣＣ１ １６０
＾ＧＴＴＧＣＧＴＧＡＧＣＧＧＡ＾＾ＧＡＴＧＧＣＣＧ
ＣＴＴＣＣＣＧＧＣＣＣＴＧＣＴＩ２００ＧＣＡＧＧＧ
ＡＧＣＴＣＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣＧＣＧＧＣＧＣＴ
ＣＧＧＧＡＧＡＧ（：１２４０ＧＧＧＣＧＧＧＴＧＡＧ
ＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＧＧ＾＾＾ＡＧＧＧＣＣＴ
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ＣＡＴＧＴＧＡＣＴＣＣＡＣＧＧＡＧＴＡＣＣＧＧ１３
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ＡＧＴＴＣＴＣＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧ＾１３６ｏＧＴＡ
ＣＧＴＣＧＴＣＴＴＴＡＧＧＴＴＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧ
ＧＴＴＴＴＡＴＧＣＧＡＴＩ４００ＧＧＡＧＴＴＴＣＣ
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ＡＴＧＴＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＴＧＣＣＣ
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ＴＣＡＴＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＡＣ１５２０ＡＧ
ＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴ丁ＴＴＴＴＴＣＴＴＣ（：ＡＴ
ＴＴＣＡＧＧＴＧＴＣＧＴＧＡ １ ５６ ０＾ １５
６１ また本発明は、ヒトポリペプチド鎖延長因子−１α遺伝
子のプロモーター領域を含有する新規ＤＮＡを用いた発
現プラスミドを提供する．ここで新規ＤＮＡは、本発明
のＤＮＡの全部または一部を含有することが好ましい． なお、現在の染色体ＤＮＡ配列に関する常識として、構
造遺伝子以外のＤＮＡ配列は、細胞の種類により、また
突然変異等により主たる活性に変化を与えることなく微
妙に異なっている．従フて木発明の新規ＤＮＡおよび式
（！）で示される新規ＤＮＡにおいても、その作用が同
一である限り、人工的に変異せしめることも含め塩基配
列に多少の差異が認められても本発明のＤＮＡに含まれ
る． 以下、本発明を詳細に説明する． ヒトＥＦ−１αの染色体遺伝子は、ヒト遺伝子ライブラ
リーを適当なプローブを使用して核酸パイプリダイゼー
ション法にて得ることが可能である．ヒト遺伝子ライブ
ラリーは、ヒト胎児肝より構築された遺伝子ライブラリ
ー［ローン等（Ｒ．ＭＬａｗｎ ｅｔ ａｌ．）
セル（（：ａｌｌ）、１５巻、１１５フ頁、１９７
８年〕やヒト胎盤より構築された遺伝子ライブラリーＣ
松七五三等（ＬＭａｔｓｕｓｈｌａ＋ｅｅｔ ａｌ．
）、モレキュラー アンド セルラー バイオロジー（
Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂ１ｏ１．）、６巻、３０００頁、
１９８６年〕等が、使用可能である．一方、スクリーニ
ングに使用するブローブにはＥＦ−１αの遺伝子配列ま
たは相補的な配列を有するＤＮＡあるいはＲＮＡであれ
ば可能であり、このＤＮＡあるいはＲＮＡはいかなる真
核生物由来のものであってもよいが、ヒト由来であるこ
とが好ましい．さらに好ましくはヒトＥＦ−１αｃＤＮ
Ａ、またはｃＤＮＡと相補的な塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドが適当である．ヒトＥＦ−１α ｃ ＤＮ
Ａの放射標識は、市販のニックトランスレーシＢンキッ
ト等を用いることにより実施される。また、ｃＤＮＡあ
るいはｃＤＮＡと相補的な塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドはＤＮＡ合成機等で合成したものを、［γ−３
２Ｐ］で標識してブローブとして用いることができる．
ヒト染色体遺伝子上には、ある特定の遺伝子と共通のＤ
ＮＡ配列を持つが、実際には機能してぃない偽遺伝子の
存在が知られている。この偽遺伝子のクローニングを避
けるために、ヒトＥＦ−１αｃＤＮＡとＥＦ−１αの偽
遺伝子との間で相同性のないＤＮＡ配列を使用すること
が好ましく、ヒトＥＦ−１α ｃ ＤＮＡの３′側のノ
ンコーディング領域の塩基配列を用いることが適当であ
る。
ＧＧＡＡＧＡＣＧＣＴＣＴＡＧＧＧＡＴＴＴＧＴＣＣ（
：ＧＧＡＣＴＡＧＣＧＡＧＡＴＧＧｃＡＡＧＧＣＴＧＡ
ＧＧＡＣＧＧＧＡＧＧ（：ＴＧＡＴＴＧＡＧＡＧＧＣＧ
ＡＡＧＧＴＡＣＡ［：ＣＣＴＡＡＴＣ丁ＣＡＡＴＡＣＡ
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ＴＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＴＣＣＣＣＧＴＣＡＣＣＡＣ：
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ＡＧＣＴＧＡＧＡＧＴＡＡＴＴＣＡＴＡＣＡＡＡＡＧＧ
ＡＣＴＣＧＣＣＣＣＴＧＣＣＴＴＧＧＧＧＡＡＴＣＣＣ
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ＴＴＣＣＣＧＣＣＣＣＣＴＣＡＣＣＣＧＣＣＣＧＣＴＣ
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Ｔ（：ＡＧＴＧＧＧＣ＾ＧＡＧＣＧＣＡＣＡＴＣＧＣＣ
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６１ また本発明は、ヒトポリペプチド鎖延長因子−１α遺伝
子のプロモーター領域を含有する新規ＤＮＡを用いた発
現プラスミドを提供する．ここで新規ＤＮＡは、本発明
のＤＮＡの全部または一部を含有することが好ましい． なお、現在の染色体ＤＮＡ配列に関する常識として、構
造遺伝子以外のＤＮＡ配列は、細胞の種類により、また
突然変異等により主たる活性に変化を与えることなく微
妙に異なっている．従フて木発明の新規ＤＮＡおよび式
（！）で示される新規ＤＮＡにおいても、その作用が同
一である限り、人工的に変異せしめることも含め塩基配
列に多少の差異が認められても本発明のＤＮＡに含まれ
る． 以下、本発明を詳細に説明する． ヒトＥＦ−１αの染色体遺伝子は、ヒト遺伝子ライブラ
リーを適当なプローブを使用して核酸パイプリダイゼー
ション法にて得ることが可能である．ヒト遺伝子ライブ
ラリーは、ヒト胎児肝より構築された遺伝子ライブラリ
ー［ローン等（Ｒ．ＭＬａｗｎ ｅｔ ａｌ．）
セル（（：ａｌｌ）、１５巻、１１５フ頁、１９７
８年〕やヒト胎盤より構築された遺伝子ライブラリーＣ
松七五三等（ＬＭａｔｓｕｓｈｌａ＋ｅｅｔ ａｌ．
）、モレキュラー アンド セルラー バイオロジー（
Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂ１ｏ１．）、６巻、３０００頁、
１９８６年〕等が、使用可能である．一方、スクリーニ
ングに使用するブローブにはＥＦ−１αの遺伝子配列ま
たは相補的な配列を有するＤＮＡあるいはＲＮＡであれ
ば可能であり、このＤＮＡあるいはＲＮＡはいかなる真
核生物由来のものであってもよいが、ヒト由来であるこ
とが好ましい．さらに好ましくはヒトＥＦ−１αｃＤＮ
Ａ、またはｃＤＮＡと相補的な塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドが適当である．ヒトＥＦ−１α ｃ ＤＮ
Ａの放射標識は、市販のニックトランスレーシＢンキッ
ト等を用いることにより実施される。また、ｃＤＮＡあ
るいはｃＤＮＡと相補的な塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドはＤＮＡ合成機等で合成したものを、［γ−３
２Ｐ］で標識してブローブとして用いることができる．
ヒト染色体遺伝子上には、ある特定の遺伝子と共通のＤ
ＮＡ配列を持つが、実際には機能してぃない偽遺伝子の
存在が知られている。この偽遺伝子のクローニングを避
けるために、ヒトＥＦ−１αｃＤＮＡとＥＦ−１αの偽
遺伝子との間で相同性のないＤＮＡ配列を使用すること
が好ましく、ヒトＥＦ−１α ｃ ＤＮＡの３′側のノ
ンコーディング領域の塩基配列を用いることが適当であ
る。
この場合、得られた陽性クローンが、ヒトＥＦ−１α
ｃＤＮＡのコーディング領域をプローブとしたサザンハ
イプリダイゼーション法等により、コーディング領域を
含有することを確認する必要がある。さらにシーフェン
シングにより塩基配列を確認し、それがヒトＥＦ−１α
ｃＤＮＡと同一の塩基配列を有し、欠失、挿入または
変異等を有する偽遺伝子とは異なり目的の染色体遺伝子
であることを確認する必要がある。
ｃＤＮＡのコーディング領域をプローブとしたサザンハ
イプリダイゼーション法等により、コーディング領域を
含有することを確認する必要がある。さらにシーフェン
シングにより塩基配列を確認し、それがヒトＥＦ−１α
ｃＤＮＡと同一の塩基配列を有し、欠失、挿入または
変異等を有する偽遺伝子とは異なり目的の染色体遺伝子
であることを確認する必要がある。
次に、得られたヒトＥＦ−１α染色体遺伝子を既知のプ
ラスミドヘサブクローニングする。プラスミドはいかな
る種類のものでもよいが、好ましくはｐＵＣ系プラスミ
ドがよい。作製したプラスミドを適当な制限酵素で消化
することにより制限酵素地図を作製することができる。
ラスミドヘサブクローニングする。プラスミドはいかな
る種類のものでもよいが、好ましくはｐＵＣ系プラスミ
ドがよい。作製したプラスミドを適当な制限酵素で消化
することにより制限酵素地図を作製することができる。
さらにヒトＥＦ−１α染色体遺伝子を制限酵素地図に従
い適当な大きさのＤＮＡフラグメントとし、これらＤＮ
ＡフラグメントをファージベクターＭｌ ３ｍｐ８また
はＭ１３ｍｐ９ヘサブクローニングする。１末娘Ｄ Ｎ
Ａを単離し、ジデオキシチェーンターミネーション法
により塩基配列を決定する。各ＤＮＡフラグメントの塩
基配列より、ヒトＥＦ−１α染色体遺伝子の全ＤＮＡ配
列を決定することができる。さらにヒトＥＦ−１α ｃ
ＤＮＡの配列と、ヒトＥＦ−１α染色体遺伝子のＤＮ
Ａ配列を比較することにより、エクソンならびにイント
ロンの位置を決定する。また、転写開始部位は、細胞よ
り抽出したｍＲＮＡと、ヒトＥＦ−１αｃＤＮＡと相補
的な合成オリゴヌクレオチドを用いたブライマーエクス
テンション法により決定することができる。ヒトＥＦ−
１α遺伝子のプロモーター領域に見いだされるＴＡＴＡ
ボックスは、転写開始部位［式（Ｉ）に示した＊位置］
より上流約３０塩基付近［式（１）に示した下線の位置
］に確認される。
い適当な大きさのＤＮＡフラグメントとし、これらＤＮ
ＡフラグメントをファージベクターＭｌ ３ｍｐ８また
はＭ１３ｍｐ９ヘサブクローニングする。１末娘Ｄ Ｎ
Ａを単離し、ジデオキシチェーンターミネーション法
により塩基配列を決定する。各ＤＮＡフラグメントの塩
基配列より、ヒトＥＦ−１α染色体遺伝子の全ＤＮＡ配
列を決定することができる。さらにヒトＥＦ−１α ｃ
ＤＮＡの配列と、ヒトＥＦ−１α染色体遺伝子のＤＮ
Ａ配列を比較することにより、エクソンならびにイント
ロンの位置を決定する。また、転写開始部位は、細胞よ
り抽出したｍＲＮＡと、ヒトＥＦ−１αｃＤＮＡと相補
的な合成オリゴヌクレオチドを用いたブライマーエクス
テンション法により決定することができる。ヒトＥＦ−
１α遺伝子のプロモーター領域に見いだされるＴＡＴＡ
ボックスは、転写開始部位［式（Ｉ）に示した＊位置］
より上流約３０塩基付近［式（１）に示した下線の位置
］に確認される。
本発明の新規ＤＮＡは、上記のヒトポリペプチド鎮延長
因子遺伝子のプロモーター領域を含有し、哺乳動物細胞
を宿主として蛋白質を発現する機能をもつものであれば
特に限定されないが、ヒトポリペプチド鎮延長因子遺伝
子−１αのプロモーター領域を含有するもの、ヒトポリ
ペプチド鎮延長因子−１α遺伝子の開始コドンの上流約
２．５Ｋｂｐの全部あるいは一部を含有するもの、前記
式（１）の全部あるいは一部を含有するもの、あるいは
主たる活性に変化を与えることなく、これらで示される
ＤＮＡの少なくとも１つが、変異、欠失、挿入されたも
のであってもよい。
因子遺伝子のプロモーター領域を含有し、哺乳動物細胞
を宿主として蛋白質を発現する機能をもつものであれば
特に限定されないが、ヒトポリペプチド鎮延長因子遺伝
子−１αのプロモーター領域を含有するもの、ヒトポリ
ペプチド鎮延長因子−１α遺伝子の開始コドンの上流約
２．５Ｋｂｐの全部あるいは一部を含有するもの、前記
式（１）の全部あるいは一部を含有するもの、あるいは
主たる活性に変化を与えることなく、これらで示される
ＤＮＡの少なくとも１つが、変異、欠失、挿入されたも
のであってもよい。
これらの本発明の新規ＤＮＡは、有機化学合成してもよ
いし、上述の方法で得られるものでもよい。
いし、上述の方法で得られるものでもよい。
ヒトＥＦ−１α遺伝子のプロモーター領域を含有する新
規ＤＮＡを用いた発現プラスミドの構築の１例は、以下
のように実施することが可能である。
規ＤＮＡを用いた発現プラスミドの構築の１例は、以下
のように実施することが可能である。
まず、クローニングされたヒトＥＦ−１α染色体遺伝子
をＥｃｏＲｆで消化後、アガロースゲル電気泳動等で単
離する。このＤＮＡフラグメントを、ヒトＥＦ−１α遺
伝子の単一の切断部位をイントロン１中に持つ制限酵素
５ａｃｆで切断し、プロモーター領域を含みイントロン
１の途中までを含むＤＮＡフラグメントと、エクソン２
以降のすべてのエクソンを含むＤＮＡフラグメントに分
離し、これら２ ｆｌのＤＮＡフラグメントを単離する
。各々のＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＳａ
ｃ Ｉの制限酵素認識部位を一箇所ずつ有する適当なプ
ラスミド、好ましくはＰＵＣ１１９にサブクローニング
する。得られた２ ｆｌのプラスミドのうち、プロモー
ター領域を含むプラスミドを制限酵素ＰｓｔＩで切断し
、Ｂａ １３１ヌクレアーゼで処理する。ついでＨｉ
ｎ ｄ Ｈ！リンカ−を結合して環状プラスミドを構築
する。Ｂａ１３１ヌクレアーゼの作用の程度によりＨｉ
ｎ ｄ ＩＩＩの挿人位置の異なるプラスミド、すな
わちエクソン１までを含むプラスミドならびにエクソン
１をまったく含まないプラスミドが得られる。
をＥｃｏＲｆで消化後、アガロースゲル電気泳動等で単
離する。このＤＮＡフラグメントを、ヒトＥＦ−１α遺
伝子の単一の切断部位をイントロン１中に持つ制限酵素
５ａｃｆで切断し、プロモーター領域を含みイントロン
１の途中までを含むＤＮＡフラグメントと、エクソン２
以降のすべてのエクソンを含むＤＮＡフラグメントに分
離し、これら２ ｆｌのＤＮＡフラグメントを単離する
。各々のＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＳａ
ｃ Ｉの制限酵素認識部位を一箇所ずつ有する適当なプ
ラスミド、好ましくはＰＵＣ１１９にサブクローニング
する。得られた２ ｆｌのプラスミドのうち、プロモー
ター領域を含むプラスミドを制限酵素ＰｓｔＩで切断し
、Ｂａ １３１ヌクレアーゼで処理する。ついでＨｉ
ｎ ｄ Ｈ！リンカ−を結合して環状プラスミドを構築
する。Ｂａ１３１ヌクレアーゼの作用の程度によりＨｉ
ｎ ｄ ＩＩＩの挿人位置の異なるプラスミド、すな
わちエクソン１までを含むプラスミドならびにエクソン
１をまったく含まないプラスミドが得られる。
またエクソン２に存在するヒトＥＦ−１α遺伝子の開始
コドンＡＴＧの直前までを含むプラスミドは、以下のよ
うにして構築できる。すなわち、エクソン２以降のすべ
てのエクソンを含む上述のプラスミドを制限酵素Ｂ ｇ
Ｉ ＩＩで切断し、Ｂａ１３１ヌクレアーゼで処理す
る。ついでＥｃｏＲＩリンカ−を結合させ環状プラスミ
ドを４３築することにより、イントロン１のＳａｃ １
部位から開始コドンの直前までを含むプラスミドを得る
ことができる６次にＥｃｏＲＩで消化し、その末端を７
４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化後Ｈｉ ｎ ｄ ｌｌリ
ンカ−を連結し、ヒトＥＦ−１α染色体遺伝子由来のＳ
ａ ｃ Ｉ −Ｈｉ ｎ ｄ ＩＩ＋ＩＩグメントを
単離し、ｐＵｃ１１９にサブクローニングする。さらに
Ｓａｃ ！およびＨｉ ｎ ｄ Ｉｌｌで消化すること
で得られたＤ Ｎ Ａフラグメントをさきに作製したヒ
トＥＦ−１α遺伝子のプロモーター領域を含みイントロ
ン１のＳａｃ １部位までを含有するプラスミドの５ａ
ｃｌ−Ｈ１ｎｄｌ夏！間に挿入することで、ヒトＥＦ−
１α遺伝子のプロモーター領域を含みエクソン２の開始
コドンの直前までを含むプラスミドが構築できる。
コドンＡＴＧの直前までを含むプラスミドは、以下のよ
うにして構築できる。すなわち、エクソン２以降のすべ
てのエクソンを含む上述のプラスミドを制限酵素Ｂ ｇ
Ｉ ＩＩで切断し、Ｂａ１３１ヌクレアーゼで処理す
る。ついでＥｃｏＲＩリンカ−を結合させ環状プラスミ
ドを４３築することにより、イントロン１のＳａｃ １
部位から開始コドンの直前までを含むプラスミドを得る
ことができる６次にＥｃｏＲＩで消化し、その末端を７
４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化後Ｈｉ ｎ ｄ ｌｌリ
ンカ−を連結し、ヒトＥＦ−１α染色体遺伝子由来のＳ
ａ ｃ Ｉ −Ｈｉ ｎ ｄ ＩＩ＋ＩＩグメントを
単離し、ｐＵｃ１１９にサブクローニングする。さらに
Ｓａｃ ！およびＨｉ ｎ ｄ Ｉｌｌで消化すること
で得られたＤ Ｎ Ａフラグメントをさきに作製したヒ
トＥＦ−１α遺伝子のプロモーター領域を含みイントロ
ン１のＳａｃ １部位までを含有するプラスミドの５ａ
ｃｌ−Ｈ１ｎｄｌ夏！間に挿入することで、ヒトＥＦ−
１α遺伝子のプロモーター領域を含みエクソン２の開始
コドンの直前までを含むプラスミドが構築できる。
発現効率の測定には種々の方法を用い得るが、たとえば
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（以
下ＣＡＴと略す）遺伝子等を用いるのが測定の容易さか
ら好ましい。すなわち発現されたＣＡＴ量を、クロラム
フェニコールのアセチル化体の生成率として薄層プレー
ト等で測定することが可能である。またＣＡＴ以外の遺
伝子を用いる場合には蛍光抗体法等によって測定可能で
ある。
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（以
下ＣＡＴと略す）遺伝子等を用いるのが測定の容易さか
ら好ましい。すなわち発現されたＣＡＴ量を、クロラム
フェニコールのアセチル化体の生成率として薄層プレー
ト等で測定することが可能である。またＣＡＴ以外の遺
伝子を用いる場合には蛍光抗体法等によって測定可能で
ある。
発現プラスミドの構築は具体的には以下の操作によって
実施できる。ヒトＥＦ−１α遺伝子のプロモーター領域
を含むＤＮＡフラグメントは、上述の各種プラスミドを
５ｃａｌおよびＨｉ ｎ ｄ ＩＩＩで消化することで
得られる。ＣＡＴ遺伝子をコードするＤＮＡフラグメン
トは、それを含有するプラスミド等から適当な制限酵素
で切り出すことにより得られる。例えばプラスミドｐＳ
Ｖ２−ＣＡＴからＨｉ ｎ ｄ ｌｌおよびＢａｍＨＩ
で切り出すことができる。そのＤＮＡフラグメントをＢ
ａｍＨＩおよびＨｉ ｎ ｃ ＩＩ等で開環させた適当
なプラスミドに、ヒトＥＦ−１α遺伝子のプロモーター
領域を含有するＤＮＡフラグメントとともに挿入するこ
とで目的の発現プラスミドを構築できる。
実施できる。ヒトＥＦ−１α遺伝子のプロモーター領域
を含むＤＮＡフラグメントは、上述の各種プラスミドを
５ｃａｌおよびＨｉ ｎ ｄ ＩＩＩで消化することで
得られる。ＣＡＴ遺伝子をコードするＤＮＡフラグメン
トは、それを含有するプラスミド等から適当な制限酵素
で切り出すことにより得られる。例えばプラスミドｐＳ
Ｖ２−ＣＡＴからＨｉ ｎ ｄ ｌｌおよびＢａｍＨＩ
で切り出すことができる。そのＤＮＡフラグメントをＢ
ａｍＨＩおよびＨｉ ｎ ｃ ＩＩ等で開環させた適当
なプラスミドに、ヒトＥＦ−１α遺伝子のプロモーター
領域を含有するＤＮＡフラグメントとともに挿入するこ
とで目的の発現プラスミドを構築できる。
例えば、本発明者等はヒトＥＦ−１α染色体遺伝子のプ
ロモーター領域を含むＤＮＡフラグメントが式（１）に
示した５゛末端より、２２０↑、２２３１．２０４１ま
たは３２１１の位置までを含有する発現プラスミドｐＥ
Ｆ２２０−ＣＡＴ、ｐＥＦ２２３−ＣＡＴ、ｐＥＦ２０
４−ＣＡＴおよびｐＥＦ３２１−ＣＡＴを構築した。こ
れら４ｆ！類のプラスミドは本発明者らにより平成１年
３月２日に、徹工研菌寄第１０５９５号（ＦＥＲＭ’
Ｐ−１０５９５）識別表示Ｅ。
ロモーター領域を含むＤＮＡフラグメントが式（１）に
示した５゛末端より、２２０↑、２２３１．２０４１ま
たは３２１１の位置までを含有する発現プラスミドｐＥ
Ｆ２２０−ＣＡＴ、ｐＥＦ２２３−ＣＡＴ、ｐＥＦ２０
４−ＣＡＴおよびｐＥＦ３２１−ＣＡＴを構築した。こ
れら４ｆ！類のプラスミドは本発明者らにより平成１年
３月２日に、徹工研菌寄第１０５９５号（ＦＥＲＭ’
Ｐ−１０５９５）識別表示Ｅ。
ｃｏｉｌ ＤＨ５（ｐＥＦ２２０−ＣＡＴ）、徴工研
菌寄第１０５９６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１０５９Ｂ）識
別表示Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＨ５（ｐＥＦ２２３−ＣＡＴ
）、徴工研菌寄第１０５９４号（ＦＥＲＭ Ｐ−１０
５９４）識別表示Ｅ。
菌寄第１０５９６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１０５９Ｂ）識
別表示Ｅ、ｃｏｌｉ ＤＨ５（ｐＥＦ２２３−ＣＡＴ
）、徴工研菌寄第１０５９４号（ＦＥＲＭ Ｐ−１０
５９４）識別表示Ｅ。
ｃｏｌｉ ＤＨ５（ｐＥＦ２０４−ＣＡＴ）および徹
工研菌寄′Ｍ１０５９７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１０５９
７）識別表示Ｅ、 ｃｏ １ ｉ ＤＨ５（ｐＥＦ３
２１−ＣＡＴ）として寄託されている。
工研菌寄′Ｍ１０５９７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１０５９
７）識別表示Ｅ、 ｃｏ １ ｉ ＤＨ５（ｐＥＦ３
２１−ＣＡＴ）として寄託されている。
さらにこの発現プラスミド中のＣＡＴ遺伝子を、他の生
理活性物質をコードする遺伝子に置換することにより、
本発明の発現プラスミドを用い所望の生理活性物質を生
産することができる。買換には、当該分野で通常行われ
ている必要な処理を行うことができ、これらの処理の１
例としては、あらかじめプラスミド由来のＨｉ ｎ ｄ
Ｉ１１認識部位を消去しておくことが好ましい。また
ポリＡ付加が可能となるように、ポリＡ付加シグナル領
域を残しておくことが好ましい。
理活性物質をコードする遺伝子に置換することにより、
本発明の発現プラスミドを用い所望の生理活性物質を生
産することができる。買換には、当該分野で通常行われ
ている必要な処理を行うことができ、これらの処理の１
例としては、あらかじめプラスミド由来のＨｉ ｎ ｄ
Ｉ１１認識部位を消去しておくことが好ましい。また
ポリＡ付加が可能となるように、ポリＡ付加シグナル領
域を残しておくことが好ましい。
〈実施例〉
本発明を以下の実施例により一層具体的に説明するが、
本発明は、これらの例により何等限定されるものではな
い。
本発明は、これらの例により何等限定されるものではな
い。
なお、以下の実施例でｍ胞培養に用いた培地を以下に示
したが、調製方法はそれぞれの指示書に従い、イーグル
ＭＥＭ以外はさらにカナマイシンを終濃度６０Ｉｌ１ｇ
／Ｌ添加して使用した。
したが、調製方法はそれぞれの指示書に従い、イーグル
ＭＥＭ以外はさらにカナマイシンを終濃度６０Ｉｌ１ｇ
／Ｌ添加して使用した。
ＤＭ−１６０Ａυ培地 （極東製薬工業）イーグ
ルＭＥＭ培地（ＭＥＭ）（日本水産）ダルベツコ変法イ
ーグル培地 （日本水産）（ＤＭＥＭ） ハムＦ１２培地 （日本水産）（Ｈａｍ’
ｓＦ１２） ＲＰＭＩ １６４０培地 （日本水産）また、以
下の記載において用いる略号は、特に断わらない限り当
該分野における慣用略号に基づくものである。
ルＭＥＭ培地（ＭＥＭ）（日本水産）ダルベツコ変法イ
ーグル培地 （日本水産）（ＤＭＥＭ） ハムＦ１２培地 （日本水産）（Ｈａｍ’
ｓＦ１２） ＲＰＭＩ １６４０培地 （日本水産）また、以
下の記載において用いる略号は、特に断わらない限り当
該分野における慣用略号に基づくものである。
さらに以下の実施例における操作は、いずれも一般的な
遺伝子操作法であり、モレキニラークローニング ア
ラボラトリ−マニュアル（マニアナイスら、コールド
スプリング ハーバ−ラボラトリ−１９８２年）、ラボ
マニュアル遺伝子工学（村松正實編、丸善 １９８８年
）等の、一般に使用されている実装置に記載されており
、その指示に従って実施できる。
遺伝子操作法であり、モレキニラークローニング ア
ラボラトリ−マニュアル（マニアナイスら、コールド
スプリング ハーバ−ラボラトリ−１９８２年）、ラボ
マニュアル遺伝子工学（村松正實編、丸善 １９８８年
）等の、一般に使用されている実装置に記載されており
、その指示に従って実施できる。
実施例１ ヒトＥＦ−１α染色体遺伝子の単離および同
定 （１）ヒトＥＦ−１α ｃＤＮＡの車離長島等［ジーン
（Ｇｅｎｅ）、４５巻、２６５頁、１９８６年］によっ
て構築された酵母ＥＦ−１α染色体遺伝子を含むプラス
ミドｐＮＫ１を、（ＩａｌおよびＨｉ ｎ ｄ ｔＴＩ
で消化し、約ＩＫＩ）ＰのＣ１ａ Ｉ −Ｈｉ ｎ ｄ
ＩＩＩ ７ラグメントをアガロースゲル電 気泳動で
単離した。このＤＮＡフラグメントを〔α−”Ｐ］ｄＣ
ＴＰを用いたニックトランスレージコン法により［”Ｐ
］ｍ識しプローブを作製した。
定 （１）ヒトＥＦ−１α ｃＤＮＡの車離長島等［ジーン
（Ｇｅｎｅ）、４５巻、２６５頁、１９８６年］によっ
て構築された酵母ＥＦ−１α染色体遺伝子を含むプラス
ミドｐＮＫ１を、（ＩａｌおよびＨｉ ｎ ｄ ｔＴＩ
で消化し、約ＩＫＩ）ＰのＣ１ａ Ｉ −Ｈｉ ｎ ｄ
ＩＩＩ ７ラグメントをアガロースゲル電 気泳動で
単離した。このＤＮＡフラグメントを〔α−”Ｐ］ｄＣ
ＴＰを用いたニックトランスレージコン法により［”Ｐ
］ｍ識しプローブを作製した。
岡山およびバーブ［モレキユラー アンド セルラー
バイオロジー （Ｍｏ１．ｌ：ａｌｌ、ＢＩｏ！、）３
巻、２８０頁、１９８３年〕により構築されたヒト線維
芽細胞ＧＭ６３７のｃＤＮＡライブラリー［ナショナル
インスティテユート オブヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の岡山博
士より供与］の約４０．０００コロニーを上述ノブロー
ブを用いてコロニーハイブリダイゼーション法によりス
クリーニングした。条件は長田等の方法［プロシーデイ
ゲス オブ ザ ナショナルアカデミ−オブ サイエン
シス オブ Ｕ、Ｓ、Ａ。
バイオロジー （Ｍｏ１．ｌ：ａｌｌ、ＢＩｏ！、）３
巻、２８０頁、１９８３年〕により構築されたヒト線維
芽細胞ＧＭ６３７のｃＤＮＡライブラリー［ナショナル
インスティテユート オブヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の岡山博
士より供与］の約４０．０００コロニーを上述ノブロー
ブを用いてコロニーハイブリダイゼーション法によりス
クリーニングした。条件は長田等の方法［プロシーデイ
ゲス オブ ザ ナショナルアカデミ−オブ サイエン
シス オブ Ｕ、Ｓ、Ａ。
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、
８０巻、６１９２頁、１９８３年］に従って実施した。
８０巻、６１９２頁、１９８３年］に従って実施した。
すなわちコロニーのレプリカフィルターを作製し、各ニ
トロセルロースフィルターと９５℃で５分間加熱後急冷
したプローブを、２８℃でハイブリダイゼーションさせ
た。洗浄後、オートラジオグラフィーにより目的のクロ
ーンを探索した。
トロセルロースフィルターと９５℃で５分間加熱後急冷
したプローブを、２８℃でハイブリダイゼーションさせ
た。洗浄後、オートラジオグラフィーにより目的のクロ
ーンを探索した。
得られた陽性クローン中のヒトＥＦ−１αｃＤＮＡの長
さをアガロースゲル電気泳動で解析し、最長のｃＤＮＡ
（約１．８Ｋｂｐ）を含むプラスミドをｐＡＮ７と命名
した。ついでヒトＥＦ−１α ｃＤＮＡの全塩基配列を
ジデオキシチェーンターミネーション法で決定した。得
られたヒトＥＦ−１α ｃＤＮＡの全塩基配列を第１図
に示した。
さをアガロースゲル電気泳動で解析し、最長のｃＤＮＡ
（約１．８Ｋｂｐ）を含むプラスミドをｐＡＮ７と命名
した。ついでヒトＥＦ−１α ｃＤＮＡの全塩基配列を
ジデオキシチェーンターミネーション法で決定した。得
られたヒトＥＦ−１α ｃＤＮＡの全塩基配列を第１図
に示した。
その結果、ヒトＥＦ−１α ｃＤＮＡ遺伝子のコーディ
ング部位は１３８６ｂｐかうなり、ブランツ等［ヨーロ
ピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｅｕ
ｒ、Ｊ、Ｂｌｏｃｈｅｍ、）、１５５巻、１６フ頁、１
９１３６年］によって発表されたヒトＥＦ−１α ｃ
ＤＮＡのコーディング領域の塩基配列と同一であった。
ング部位は１３８６ｂｐかうなり、ブランツ等［ヨーロ
ピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー（Ｅｕ
ｒ、Ｊ、Ｂｌｏｃｈｅｍ、）、１５５巻、１６フ頁、１
９１３６年］によって発表されたヒトＥＦ−１α ｃ
ＤＮＡのコーディング領域の塩基配列と同一であった。
（２）ヒトＥＦ−１α染色体遺伝子のクローニング
ヒトＥＦ−１αの染色体遺伝子をＪＩＬｔＨｌするため
に、まず（１）で調製したヒトＥＦ−１αｃＤＮＡをプ
ローブとしてヒト遺伝子ライブラリーをスクリーニング
した。用いたヒト遺伝子ライブラリーは、バーバード大
学のマニアナイス（Ｔ、Ｍａｎｌａｔｌｓ）博士より供
与されたヒト胎児肝より構築された遺伝子ライブラリー
［ローン等 （Ｒ，Ｍ。
に、まず（１）で調製したヒトＥＦ−１αｃＤＮＡをプ
ローブとしてヒト遺伝子ライブラリーをスクリーニング
した。用いたヒト遺伝子ライブラリーは、バーバード大
学のマニアナイス（Ｔ、Ｍａｎｌａｔｌｓ）博士より供
与されたヒト胎児肝より構築された遺伝子ライブラリー
［ローン等 （Ｒ，Ｍ。
Ｌａｗｎ ｅｔ ａｌ、） セル（Ｃｅｌｌ）、１
５巻、１１５フ頁、１９７８年］および東京大学医科学
研究所の渋谷博士より供与されたヒト胎盤より構築され
た遺伝子ライブラリー［松七五三等（Ｈ，Ｍａｔｓｕｓ
ｈｌｍｅａｔ ａｌ、）、モレキュラー アンド セ
ルラー バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、
）、６巻、３０００頁、１９８６年コである。前述のｐ
ＡＮ ７のヒトＥＦ−１ａ ｃＤＮＡのＢａｍＨＩフ
ラグメント約２Ｋｂｐを（１）と同様にニックトランス
レーション法により［３２ｐ］標識し、プローブを作製
した。
５巻、１１５フ頁、１９７８年］および東京大学医科学
研究所の渋谷博士より供与されたヒト胎盤より構築され
た遺伝子ライブラリー［松七五三等（Ｈ，Ｍａｔｓｕｓ
ｈｌｍｅａｔ ａｌ、）、モレキュラー アンド セ
ルラー バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、
）、６巻、３０００頁、１９８６年コである。前述のｐ
ＡＮ ７のヒトＥＦ−１ａ ｃＤＮＡのＢａｍＨＩフ
ラグメント約２Ｋｂｐを（１）と同様にニックトランス
レーション法により［３２ｐ］標識し、プローブを作製
した。
両ヒト遺伝子ライブラリーの総計約１．５０ｏ、ｏｏｏ
個のプラークをプラークハイブリダイゼーション法によ
りスクリーニングし、その結果２１８個の陽性クローン
が得られた。任意の５省のプラークを選定し、クローニ
ングされている染色体ＤＮＡフラグメントをａｍした。
個のプラークをプラークハイブリダイゼーション法によ
りスクリーニングし、その結果２１８個の陽性クローン
が得られた。任意の５省のプラークを選定し、クローニ
ングされている染色体ＤＮＡフラグメントをａｍした。
これら５個のクローンに含まれる染色体ＤＮＡフラグメ
ントはヒトＥＦ−１α ｃＤＮＡプローブと強くハイブ
リダイズするが、その制限酵素地図およびジデオキシチ
ェーンターミネーション法を用いたシーフェンスの結果
より、まったくイントロンを含まずかつ一部変異、欠失
または挿入が認められた。
ントはヒトＥＦ−１α ｃＤＮＡプローブと強くハイブ
リダイズするが、その制限酵素地図およびジデオキシチ
ェーンターミネーション法を用いたシーフェンスの結果
より、まったくイントロンを含まずかつ一部変異、欠失
または挿入が認められた。
以上の結果からこれらの染色体ＤＮＡはヒトＥＦ−１α
の偽遺伝子と判断された。
の偽遺伝子と判断された。
ついで真のヒトＥＦ−１α染色体遺伝子を単離、同定す
る目的で、ヒトＥＦ−１α ｃＤＮＡの３′側ノンコー
デイング領域に存在する１８塩基（終止コドンより約１
２０塩基下流に存在するＤＮＡ配列、５°−ＧＡ丁ＡＡ
ＣＡＡＴＧＣＡＴＣＧＴＡＡ−３’ ）をＤＮＡ合成装
置（アプライドバイオシステム社、モデル３８０Ａ）を
用いて合成した。このオリゴヌクレオチドをＴ４−ポリ
ヌクレオチドカイネースおよび［γ−”Ｐ］ＡＴＰを用
いて標識し、プローブを作製した。このプローブを用い
て上述の陽性クローン７０個をプラークハイブリダイゼ
ーションにより再スクリーニングした。その結果５個の
クローンが陽性と判明し、そのうちのλＥＦ３５８が約
７ＫｂｐのεｃｏＲＩフラグメントを含有し、かつこの
ＤＮＡフラグメントがヒトＥＦ−１α ｃＤＮＡプロー
ブとハイブリダイズすることよりヒトＥＦ−１α染色体
遺伝子を含有することを確認した。
る目的で、ヒトＥＦ−１α ｃＤＮＡの３′側ノンコー
デイング領域に存在する１８塩基（終止コドンより約１
２０塩基下流に存在するＤＮＡ配列、５°−ＧＡ丁ＡＡ
ＣＡＡＴＧＣＡＴＣＧＴＡＡ−３’ ）をＤＮＡ合成装
置（アプライドバイオシステム社、モデル３８０Ａ）を
用いて合成した。このオリゴヌクレオチドをＴ４−ポリ
ヌクレオチドカイネースおよび［γ−”Ｐ］ＡＴＰを用
いて標識し、プローブを作製した。このプローブを用い
て上述の陽性クローン７０個をプラークハイブリダイゼ
ーションにより再スクリーニングした。その結果５個の
クローンが陽性と判明し、そのうちのλＥＦ３５８が約
７ＫｂｐのεｃｏＲＩフラグメントを含有し、かつこの
ＤＮＡフラグメントがヒトＥＦ−１α ｃＤＮＡプロー
ブとハイブリダイズすることよりヒトＥＦ−１α染色体
遺伝子を含有することを確認した。
（３）ヒトＥＦ−１α染色体遺伝子のシーフェンシング
（２）で得られたλＥＦｇ５Ｂにクローニングされてい
るヒトＥＦ−１α染色体ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩにより切
り出しアガロースゲル電気泳動により単離した。この７
ＫｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントをプラスミドｐＵＣ１
１９のＥｃｏＲ１部位にサブクローニングし、得られた
プラスミドをｐＥＦｇｌと命名した。
るヒトＥＦ−１α染色体ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩにより切
り出しアガロースゲル電気泳動により単離した。この７
ＫｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントをプラスミドｐＵＣ１
１９のＥｃｏＲ１部位にサブクローニングし、得られた
プラスミドをｐＥＦｇｌと命名した。
ついでプラスミドｐＥＦｇ １を各種制限酵素で処理し
、アガロースゲル電気泳動によるバンド数と移動度によ
り制限酵素部位を確認し、制限酵素地図を作製した。さ
らに塩基配列を決定するために、各種制限酵素で切断Ｉ
ｌ−離したＤＮＡフラグメントをＭ１３ｍｐ８またはＭ
１３ｍｐ９ヘサブクローニングした。常法に従い１木ｉ
ｌｌ Ｄ Ｎ Ａを、ＱＬｌｌｌし、ジデオキシチェー
ンターミネーション法により塩基配列を決定した。その
結果、プラスミドｐＥＦｇ ｌ中のＤＮＡフラグメント
はヒトＥＦ−１α ｃＤＮＡとまったく同一の塩基配列
を含有し、目的のヒトＥＦ−１α染色体遺伝子であるこ
とが確認された。ヒトＥＦ−１α染色体遺伝子の制限酵
素地図とシーフェンシングの方向を第２図に５またシー
フェンシングの結果得られたＳｍａ １部位から約４．
フＫｂの塩基配列を第３図に示した。
、アガロースゲル電気泳動によるバンド数と移動度によ
り制限酵素部位を確認し、制限酵素地図を作製した。さ
らに塩基配列を決定するために、各種制限酵素で切断Ｉ
ｌ−離したＤＮＡフラグメントをＭ１３ｍｐ８またはＭ
１３ｍｐ９ヘサブクローニングした。常法に従い１木ｉ
ｌｌ Ｄ Ｎ Ａを、ＱＬｌｌｌし、ジデオキシチェー
ンターミネーション法により塩基配列を決定した。その
結果、プラスミドｐＥＦｇ ｌ中のＤＮＡフラグメント
はヒトＥＦ−１α ｃＤＮＡとまったく同一の塩基配列
を含有し、目的のヒトＥＦ−１α染色体遺伝子であるこ
とが確認された。ヒトＥＦ−１α染色体遺伝子の制限酵
素地図とシーフェンシングの方向を第２図に５またシー
フェンシングの結果得られたＳｍａ １部位から約４．
フＫｂの塩基配列を第３図に示した。
（４）ヒトＥＦ−１α染色体遺伝子の構造（１）で得ら
れたヒトＥＦ−１ａ ｃＤＮＡと（３）で得られたヒ
トＥＦ−１α染色体遺伝子を比較し、エクソンおよびイ
ントロンの位置を決定した。その結果、染色体遺伝子は
８個のエクソンと７個のイントロンからなることが判明
した（第２図）。
れたヒトＥＦ−１ａ ｃＤＮＡと（３）で得られたヒ
トＥＦ−１α染色体遺伝子を比較し、エクソンおよびイ
ントロンの位置を決定した。その結果、染色体遺伝子は
８個のエクソンと７個のイントロンからなることが判明
した（第２図）。
さらに転写開始部位はブライマーエクステンション法に
より決定した。すなわちヒトＨＬ−６０細胞より得られ
たｍＲＮＡ５μ、ｇ、［３２ｐ］標識したオリゴヌクレ
オチド５’ −ＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＣＡＡＡＣ
ＣＣＧＴＴＧ−３’ ５ｐｍｏｌ （第３図の５８４
−６０７の位置に示されるＤＮＡと相補的な塩基配列）
、ＡＭＶ逆転写酵素２５４位およびＲＮａｓｅ阻害剤４
０単位を用いて１本ＳＲｃ Ｄ Ｎ Ａを合成した。得
られたＤＮＡを７Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で解析し、転写開始位置を決定した（第３
図の＊印の位置）。
より決定した。すなわちヒトＨＬ−６０細胞より得られ
たｍＲＮＡ５μ、ｇ、［３２ｐ］標識したオリゴヌクレ
オチド５’ −ＴＧＴＧＴＴＣＴＧＧＣＧＧＣＡＡＡＣ
ＣＣＧＴＴＧ−３’ ５ｐｍｏｌ （第３図の５８４
−６０７の位置に示されるＤＮＡと相補的な塩基配列）
、ＡＭＶ逆転写酵素２５４位およびＲＮａｓｅ阻害剤４
０単位を用いて１本ＳＲｃ Ｄ Ｎ Ａを合成した。得
られたＤＮＡを７Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で解析し、転写開始位置を決定した（第３
図の＊印の位置）。
以上の結果、エクソン１は３３塩基で構成されているこ
とが、また開始コドンＡＴＧはエクソン２に存在し、エ
クソンｌとエクソン２の間のイントロン１は９４３塩基
の長さから成ることが判明した。
とが、また開始コドンＡＴＧはエクソン２に存在し、エ
クソンｌとエクソン２の間のイントロン１は９４３塩基
の長さから成ることが判明した。
実施例２ ヒトＥＦ−１α遺伝子のプロモーター領域を
含むＣＡＴ遺伝子発現プラスミドの構築（１）プラスミ
ドｐＥＦ−２およびｐＥＦ−３の構築（第４図参照） プラスミドｐＥＦｇｌのヒトＥＦ−１α遺伝子を含むＥ
ｃｏＲＩフラグメント（約７Ｋｂｐ）をＳａｃ Ｉで消
化し、アガロースゲル電気泳動で２種のＤＮＡフラグメ
ント（約２．５Ｋｂｐおよび約４．５Ｋｂｐ）に分離し
た。単離した両ＤＮＡフラグメントを各々プラスミドｐ
ｕｃｔｔ９のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ間にサブクローニン
グした。ヒトＥＦ−１α遺伝子のプロモーター領域とエ
クソン１を含むプラスミドをｐＥＦ−２と、またエクソ
ン２からエクソン８を含むプラスミドをｐＥＦ−３と命
名した。
含むＣＡＴ遺伝子発現プラスミドの構築（１）プラスミ
ドｐＥＦ−２およびｐＥＦ−３の構築（第４図参照） プラスミドｐＥＦｇｌのヒトＥＦ−１α遺伝子を含むＥ
ｃｏＲＩフラグメント（約７Ｋｂｐ）をＳａｃ Ｉで消
化し、アガロースゲル電気泳動で２種のＤＮＡフラグメ
ント（約２．５Ｋｂｐおよび約４．５Ｋｂｐ）に分離し
た。単離した両ＤＮＡフラグメントを各々プラスミドｐ
ｕｃｔｔ９のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ間にサブクローニン
グした。ヒトＥＦ−１α遺伝子のプロモーター領域とエ
クソン１を含むプラスミドをｐＥＦ−２と、またエクソ
ン２からエクソン８を含むプラスミドをｐＥＦ−３と命
名した。
（２）プラスミドＰＥＦ−２２０，ＰＥＦ−２２３およ
びｐＥＦ−２０４の構築（第５図参照）（１）で作製し
たプラスミドｐＥＦ−２（１０μｇ）をＰｓｔｌで消化
後、Ｂａ１３１−Ｓヌクレアーゼ３単位を用い、３０℃
、１０分間反応させた。ついで５″端がリン酸化された
Ｈ ｉ ｎ ｄ ＩＩＩリンカ−ｐＣＡＡＧＣＴＴＧ
（宝酒造社）１μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させた
。さらにＨｉ ｎ ｄ ＩＩＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼで環状化させ、プラスミド中にＨｉ ｎ ｄ Ｉ
ＩＩ認識部位を導入した。Ｈｌ ｎ ｄ １１！認識部
位の導入位置は得られたプラスミドにより差異が認めら
れたが、プラスミドＤＮＡを鋳型としてジデオキシチェ
ーンターミネーション法により塩基配列を決定（Ｈｉｎ
ｄ１１１部位より上流に向かってシーフェンシング）す
ることにより、各プラスミド中に含まれるヒトＥＦ−１
α染色体ＤＮＡ部分を正確に決定した。
びｐＥＦ−２０４の構築（第５図参照）（１）で作製し
たプラスミドｐＥＦ−２（１０μｇ）をＰｓｔｌで消化
後、Ｂａ１３１−Ｓヌクレアーゼ３単位を用い、３０℃
、１０分間反応させた。ついで５″端がリン酸化された
Ｈ ｉ ｎ ｄ ＩＩＩリンカ−ｐＣＡＡＧＣＴＴＧ
（宝酒造社）１μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させた
。さらにＨｉ ｎ ｄ ＩＩＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼで環状化させ、プラスミド中にＨｉ ｎ ｄ Ｉ
ＩＩ認識部位を導入した。Ｈｌ ｎ ｄ １１！認識部
位の導入位置は得られたプラスミドにより差異が認めら
れたが、プラスミドＤＮＡを鋳型としてジデオキシチェ
ーンターミネーション法により塩基配列を決定（Ｈｉｎ
ｄ１１１部位より上流に向かってシーフェンシング）す
ることにより、各プラスミド中に含まれるヒトＥＦ−１
α染色体ＤＮＡ部分を正確に決定した。
このうちヒトＥＦ−１α染色体遺伝子上流のＥｃｏＲ１
部位からエクソン１の２１塩基上流［式（１）の２２０
７の位置コまでを含むプラスミドｐＥＦ−２２０．Ｅｃ
ｏＲ１部位からエクソンｌの８塩基［式（１）の２２３
↑の位１２１までを含むプラスミドρＥＦ−２２３およ
びＥｃｏＲ１部位からエクソン１の２４塩基［式（１）
の２０４１の位置］までを含むプラスミドｐＥＦ−２０
４の３種のプラスミドを選定し、発現プラスミドの構築
に使用した。
部位からエクソン１の２１塩基上流［式（１）の２２０
７の位置コまでを含むプラスミドｐＥＦ−２２０．Ｅｃ
ｏＲ１部位からエクソンｌの８塩基［式（１）の２２３
↑の位１２１までを含むプラスミドρＥＦ−２２３およ
びＥｃｏＲ１部位からエクソン１の２４塩基［式（１）
の２０４１の位置］までを含むプラスミドｐＥＦ−２０
４の３種のプラスミドを選定し、発現プラスミドの構築
に使用した。
（３）プラスミドｐＥＦ−３２１の構築（第６図参照）
（１）で作製したプラスミドｐＥＦ−３（５μｇ）をＢ
ｇ １ ！ｒで消化後、Ｂａ Ｉ ３１−Ｆヌクレア
ーゼ１．３単位を用い３０℃、８分間反応させた０次い
で５°末端がリン酸化されたＥｃｏＲ■リンカ−ｐＧＧ
ＡＡＴＴＣＣ（宝酒造社）１μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ
で結合させた。さらにＥｃｏＲＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼで環状化させ、Ｓａｃ１部位よりエクソン２の
一部を含むプラスミドを作製した。ＥｃｏＲＩ認識部位
の導入位置は、（２）と同様シーフェンシングにより決
定し、Ｓａｃ １部位よりエクソン２の５′部分１０塩
基［式（Ｉ）の３２１１の位置］までを含むプラスミド
を選定した。
ｇ １ ！ｒで消化後、Ｂａ Ｉ ３１−Ｆヌクレア
ーゼ１．３単位を用い３０℃、８分間反応させた０次い
で５°末端がリン酸化されたＥｃｏＲ■リンカ−ｐＧＧ
ＡＡＴＴＣＣ（宝酒造社）１μｇをＴ４ＤＮＡリガーゼ
で結合させた。さらにＥｃｏＲＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼで環状化させ、Ｓａｃ１部位よりエクソン２の
一部を含むプラスミドを作製した。ＥｃｏＲＩ認識部位
の導入位置は、（２）と同様シーフェンシングにより決
定し、Ｓａｃ １部位よりエクソン２の５′部分１０塩
基［式（Ｉ）の３２１１の位置］までを含むプラスミド
を選定した。
得られたプラスミドをざらにＥｃｏＲＩで消化し、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化した。
ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化した。
ついで（２）と同様にＨｉ ｎ ｄ ＩＩＩリンカ−を
連結した。このＤＮＡよりエクソン２の一部（１０塩基
）を含むＳ ａ ｃ Ｉ −Ｈｉ ｎ ｄ ＩＩ＋フラ
グメント（３９６ｂｐ）を単離し、ｐＬＩｃ１１９の５
ａｃ１− Ｈｉ ｎ ｄ １１１間にＴ４ＤＮＡリガー
ゼで連結した。得られたプラスミドより再度Ｓａｃｒ−
Ｈｉ ｎ ｄ Ｉ！！フラグメントを単離し、（１）で
作製したプラスミドｐＥＦ−２の５ａｃｌ−Ｈｉｎｄｌ
ｌｌ間にＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、プラスミドｐＥ
Ｆ−３２１を作製した。プラスミドｐＥＦ−３２１は、
ヒトＥＦ−１α染色体遺伝子上流のＥｃｏＲ１部位より
エクソン２の１０塩基まで（開始コドンＡＴＧの上流２
１塩基まで）を含有するプラスミドである。
連結した。このＤＮＡよりエクソン２の一部（１０塩基
）を含むＳ ａ ｃ Ｉ −Ｈｉ ｎ ｄ ＩＩ＋フラ
グメント（３９６ｂｐ）を単離し、ｐＬＩｃ１１９の５
ａｃ１− Ｈｉ ｎ ｄ １１１間にＴ４ＤＮＡリガー
ゼで連結した。得られたプラスミドより再度Ｓａｃｒ−
Ｈｉ ｎ ｄ Ｉ！！フラグメントを単離し、（１）で
作製したプラスミドｐＥＦ−２の５ａｃｌ−Ｈｉｎｄｌ
ｌｌ間にＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、プラスミドｐＥ
Ｆ−３２１を作製した。プラスミドｐＥＦ−３２１は、
ヒトＥＦ−１α染色体遺伝子上流のＥｃｏＲ１部位より
エクソン２の１０塩基まで（開始コドンＡＴＧの上流２
１塩基まで）を含有するプラスミドである。
（４）プラスミドｐＥＦ２０４−ＣＡＴ、ｐＥＦ２２３
−ＣＡＴ、ｐＥＦ２２０−ＣＡＴおよびｐＥＦ３２１−
ＣＡＴの構築（第７図参照）（２）または（３）で得ら
れたプラスミドｐＥＦ−２２０、ｐＥＦ−２２３、ｐＥ
Ｆ−２０４またはｐＥＦ−３２１をＳｅａ ＩおよびＨ
ｉ ｎ ｄ Ｉｌｌで消化し、ヒトＥＦ−１α遺伝子の
プロモーター領域を含むＳ ｃ ａ ｌ −Ｈｉ ｎ
ｄ ｌ１１フラグメントを単離した。ＣＡＴ遺伝子は、
バーブ博士（Ｐ、Ｂｅｒｇ 、スタンフォード大学）よ
り供与されたプラスミドｐＳＶ２−ＣＡＴ ［ゴーマン
等（Ｃ，Ｍ、Ｇｏｒｍａｎ ａｔ ａｌ、）、モレキ
ュラー アンドセルラー バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ
１１．Ｂｉｏｌ、） ２巻、１０４４頁、１９８２
年コをＨｉ ｎ ｄ ＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し
、約１．６ＫｂｐのＤＮＡフラグメントとして単離した
。
−ＣＡＴ、ｐＥＦ２２０−ＣＡＴおよびｐＥＦ３２１−
ＣＡＴの構築（第７図参照）（２）または（３）で得ら
れたプラスミドｐＥＦ−２２０、ｐＥＦ−２２３、ｐＥ
Ｆ−２０４またはｐＥＦ−３２１をＳｅａ ＩおよびＨ
ｉ ｎ ｄ Ｉｌｌで消化し、ヒトＥＦ−１α遺伝子の
プロモーター領域を含むＳ ｃ ａ ｌ −Ｈｉ ｎ
ｄ ｌ１１フラグメントを単離した。ＣＡＴ遺伝子は、
バーブ博士（Ｐ、Ｂｅｒｇ 、スタンフォード大学）よ
り供与されたプラスミドｐＳＶ２−ＣＡＴ ［ゴーマン
等（Ｃ，Ｍ、Ｇｏｒｍａｎ ａｔ ａｌ、）、モレキ
ュラー アンドセルラー バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ
１１．Ｂｉｏｌ、） ２巻、１０４４頁、１９８２
年コをＨｉ ｎ ｄ ＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し
、約１．６ＫｂｐのＤＮＡフラグメントとして単離した
。
これら両ＤＮＡフラグメントと、プラスミドｐＵｃ１１
９の）Ｉｉｎｃｌｌ−ＢａｍＨＩラージフラグメント（
３，２にｂｐ）の３種ＤＮＡフラグメントをＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結し、プラスミドｐＥＦ２２０−Ｃ
ＡＴ、ｐＥＦ２２３−ＣＡＴ、ＰＥＦ２０４−ＣＡＴお
よびｐＥＦ３２１−ＣＡＴを作製した（ただし、各々の
Ｓｅａ Ｔ−Ｈｉ ｎ ｄ ＩＩ＋フラグメントは式（
Ｉ）で示される５゛末端よりさらに約９５０ｂｐのＤＮ
Ａを含んでいる）。
９の）Ｉｉｎｃｌｌ−ＢａｍＨＩラージフラグメント（
３，２にｂｐ）の３種ＤＮＡフラグメントをＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結し、プラスミドｐＥＦ２２０−Ｃ
ＡＴ、ｐＥＦ２２３−ＣＡＴ、ＰＥＦ２０４−ＣＡＴお
よびｐＥＦ３２１−ＣＡＴを作製した（ただし、各々の
Ｓｅａ Ｔ−Ｈｉ ｎ ｄ ＩＩ＋フラグメントは式（
Ｉ）で示される５゛末端よりさらに約９５０ｂｐのＤＮ
Ａを含んでいる）。
実施例３ ヒトＥＦ−１α遺伝子のプロモーター領域を
含む５Ｖ４０Ｔ抗原発現プラスミドの構築（第８図参照
） （１）プラスミドρＥＦ２０４α−ＣＡＴおよびｐＥＦ
３２１α−ＣＡＴの構築 ｐＵｃ１１９由来のＨｊｎｄｌｌ１ｇ識部位のみを消去
するため、プラスミドｐＥＦ２０４−ＣＡＴまたはｐＥ
Ｆ３２１−ＣＡＴ４ｕｇをＨｌ ｎ ｄ １ｉｔ６単位
を用いて３７℃、１０．１５．２５または４０分間反応
させ不完全切断をおこなった。１カ所のみ切断されてい
るＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気ン永動で
単Ｓ絹製した。このＤＮＡフラグメントをＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼで平滑化後Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した。
含む５Ｖ４０Ｔ抗原発現プラスミドの構築（第８図参照
） （１）プラスミドρＥＦ２０４α−ＣＡＴおよびｐＥＦ
３２１α−ＣＡＴの構築 ｐＵｃ１１９由来のＨｊｎｄｌｌ１ｇ識部位のみを消去
するため、プラスミドｐＥＦ２０４−ＣＡＴまたはｐＥ
Ｆ３２１−ＣＡＴ４ｕｇをＨｌ ｎ ｄ １ｉｔ６単位
を用いて３７℃、１０．１５．２５または４０分間反応
させ不完全切断をおこなった。１カ所のみ切断されてい
るＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気ン永動で
単Ｓ絹製した。このＤＮＡフラグメントをＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼで平滑化後Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結した。
各々のプラスミドをＨｉ ｎ ｄ ＩｌｌおよびＢａｍ
）ＩＩで消化した時、ＣＡＴ遺伝子由来の１．６Ｋｂｐ
のＤＮＡフラグメントが切り出されるプラスミドを選定
し、各々プラスミドｐＥＦ２０４α−ＣＡＴ、ｐＥＦ３
２１α−ＣＡＴと命名した。
）ＩＩで消化した時、ＣＡＴ遺伝子由来の１．６Ｋｂｐ
のＤＮＡフラグメントが切り出されるプラスミドを選定
し、各々プラスミドｐＥＦ２０４α−ＣＡＴ、ｐＥＦ３
２１α−ＣＡＴと命名した。
（２）プラスミドｐＥＦ２０４α−ＴおよびｐＥＦ３２
１α−Ｔの構築 ３Ｖ４０Ｔ抗原のコーディング領域を含有するプラスミ
ドｐＭＴ１［菅野等（Ｓ Ｓｕｇａｎｏ ｅｔａｌ、）
、ジャーナル オブ バイオロジー（Ｊ。
１α−Ｔの構築 ３Ｖ４０Ｔ抗原のコーディング領域を含有するプラスミ
ドｐＭＴ１［菅野等（Ｓ Ｓｕｇａｎｏ ｅｔａｌ、）
、ジャーナル オブ バイオロジー（Ｊ。
Ｖｌｒｏ！、） ５２９．８８４頁、１９８４年］を
Ｈｉ ｎ ｄ ＩｌｌおよびＴａｑｌで消化し５Ｖ４０
Ｔ抗原のコーディング領域の上漬部分４３２ｂｐを単離
した。またこれとは別にプラスミドｐＭＴ１をＴａｑＩ
およびＢａｍＨＩで消化し、初期ポリＡ付加シグナル配
列を含む５Ｖ４０Ｔ抗原のコーディング領域の下流部分
２．２Ｋｂρを単離した。
Ｈｉ ｎ ｄ ＩｌｌおよびＴａｑｌで消化し５Ｖ４０
Ｔ抗原のコーディング領域の上漬部分４３２ｂｐを単離
した。またこれとは別にプラスミドｐＭＴ１をＴａｑＩ
およびＢａｍＨＩで消化し、初期ポリＡ付加シグナル配
列を含む５Ｖ４０Ｔ抗原のコーディング領域の下流部分
２．２Ｋｂρを単離した。
（１）で作製したプラスミドｐＥＦ２０４α−ＣＡＴま
たはｐＥＦ３２１ ａ−ＣＡＴを各々Ｈｉ ｎ ｄ Ｉ
ｌｌおよびＢａｍＨＩで消化してＣＡＴ遺伝子を除去し
た。このＨｉ ｎ ｄ ＩＩＩ −Ｂ ａ ｍ Ｈ１部
位間に、上述のＨｉｎｄｌｌｌ−Ｔａｑｌフラグメント
およびＴａｑｌ−ＢａｍＨＩフラグメントを挿入して５
Ｖ４０Ｔ抗原の全コーディング領域を含むプラスミドｐ
ＥＦ２０４ａ−Ｔお、！：びｐＥＦ３２１α−Ｔを作製
した。
たはｐＥＦ３２１ ａ−ＣＡＴを各々Ｈｉ ｎ ｄ Ｉ
ｌｌおよびＢａｍＨＩで消化してＣＡＴ遺伝子を除去し
た。このＨｉ ｎ ｄ ＩＩＩ −Ｂ ａ ｍ Ｈ１部
位間に、上述のＨｉｎｄｌｌｌ−Ｔａｑｌフラグメント
およびＴａｑｌ−ＢａｍＨＩフラグメントを挿入して５
Ｖ４０Ｔ抗原の全コーディング領域を含むプラスミドｐ
ＥＦ２０４ａ−Ｔお、！：びｐＥＦ３２１α−Ｔを作製
した。
実施例４ ヒトＥＦ−１α遺伝子のプロモーター領域を
含むヒトＣＤ４ｃＤＮＡ発現プラスミドの構築（第９図
参照） ヒトＣＤ４ｃＤＮＡを含有するプラスミドＴ４−ｐＭＶ
７ ［マトン等（Ｐ、Ｊ、Ｍａｄｄｏｎ ｅｔ ａｌ
、）、セル（Ｃｅｌｌ）、４７巻、３３３頁、１９８６
年］からヒトＣＤ４ｃＤＮＡ （約１．７Ｋｂｐ）をＥ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして切り出し、プ
ラスミドｐｕｃａに挿入した。このプラスミドをＨｌ
ｎ ｄ ＩＩＩで消化しＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑
化後、さらにＥｃｏＲＩで消化しヒトＣＤ４ｃＤＮＡフ
ラグメントを単離した。
含むヒトＣＤ４ｃＤＮＡ発現プラスミドの構築（第９図
参照） ヒトＣＤ４ｃＤＮＡを含有するプラスミドＴ４−ｐＭＶ
７ ［マトン等（Ｐ、Ｊ、Ｍａｄｄｏｎ ｅｔ ａｌ
、）、セル（Ｃｅｌｌ）、４７巻、３３３頁、１９８６
年］からヒトＣＤ４ｃＤＮＡ （約１．７Ｋｂｐ）をＥ
ｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして切り出し、プ
ラスミドｐｕｃａに挿入した。このプラスミドをＨｌ
ｎ ｄ ＩＩＩで消化しＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑
化後、さらにＥｃｏＲＩで消化しヒトＣＤ４ｃＤＮＡフ
ラグメントを単離した。
実施例３で作製したプラスミドｐＥＦ３２１α−Ｔを実
施例３の（１）と同様に、ｐＵｃ１１９由来のＥｃｏＲ
Ｉ認識部位を消去し、プラスミドｐＥＦ３２１β−Ｔを
得た６次いでプラスミドｐＥＦ３２１β−ＴをＥｃｏＲ
ＩおよびＨｐａｒで消化して得られたラージフラグメン
トに、上述のヒトＣＤ４ｃＤＮＡフラグメントをＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで結合させ、プラスミドｐ Ｅ、Ｆ ３２
１β−ＣＤ４を作製した。
施例３の（１）と同様に、ｐＵｃ１１９由来のＥｃｏＲ
Ｉ認識部位を消去し、プラスミドｐＥＦ３２１β−Ｔを
得た６次いでプラスミドｐＥＦ３２１β−ＴをＥｃｏＲ
ＩおよびＨｐａｒで消化して得られたラージフラグメン
トに、上述のヒトＣＤ４ｃＤＮＡフラグメントをＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで結合させ、プラスミドｐ Ｅ、Ｆ ３２
１β−ＣＤ４を作製した。
実施例５ ＣＡＴ遺伝子の発現
４種のヒトＥＦ−１α遺伝子のプロモーター領域を含有
する発現プラスミドｐＥＦ２２０−ＣＡＴ％ｐＥＦ２２
３−ＣＡＴ、ｐＥＦ２０４−ＣＡＴおよびｐＥＦ３２１
−ＣＡＴの発現効率を他の発現プラスミドｐＳＶ２−Ｃ
ＡＴおよびｐＳＲα−ＣＡＴ （国立予防衛生研究所の
武部博士より供−１）と比較した。
する発現プラスミドｐＥＦ２２０−ＣＡＴ％ｐＥＦ２２
３−ＣＡＴ、ｐＥＦ２０４−ＣＡＴおよびｐＥＦ３２１
−ＣＡＴの発現効率を他の発現プラスミドｐＳＶ２−Ｃ
ＡＴおよびｐＳＲα−ＣＡＴ （国立予防衛生研究所の
武部博士より供−１）と比較した。
（１）発現プラスミドの各種細胞株へのトランスフェク
ション 用いた細胞株、培地、プレートに植え込む時の細胞密度
（細胞数／ｌｏｃｍ２プレート）および培養時間を以下
に示す。
ション 用いた細胞株、培地、プレートに植え込む時の細胞密度
（細胞数／ｌｏｃｍ２プレート）および培養時間を以下
に示す。
■Ｃｌ−１０−Ｋｌ （チャイニーズハムスター卵巣細
胞 ＡＴＣＣＣＣＬ６１） １０％ＦＣＳ含有Ｈａｍ’５Ｆ１２培地１．２Ｘ１０’
個、４８時間 ■ＩＭＲ−３２（ヒト神経芽細胞 ＡＴＣＣＣＣＬＩ
２７） １０％ＦＣ５含有ＤＭＥＭ培地 ２．０Ｘ１０’個、４８時間 ■３Ｙ１（ラット線維芽細胞） ８％ＦＣ３含有ＤＭ含有環地 ２．０ＸＩＯ”個、２４時間 ■ｃｖ−ｔ ｃサル腎ＩＩＩｗＵ胞 ＡＴＣＣＣＣＬ８
％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地 ２．０Ｘ１０’個、２４時間 ■ＣＯ３−１（ＳＶ４０による形質転換サル腎臓細胞
ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０） ８％ＦＣ３含有ＤＭ含有環地 ２．０Ｘ１０’個、２４時間 ■Ｔ２２ （ＳＶ４０による形質転換サル腎臓細胞） ８％ＦＣ３含有ＤＭ含有環地 ２．０Ｘ１０’個、２４時間 ■ＢｒＡ２−２２７ （ＳＶ４０変異株Ｔ抗原Ａ２によ
って不朽化したラット脳細胞） ８％ＦＣ３含有ＤＭ含有環地 ２．０Ｘ１０’個、２４時間 ■ＢｒＡ２−５Ｓ （ＳＶ４０変異株Ｔ抗原Ａ２によっ
て不朽化したラット脳細胞） ８％ＦＣ３含有ＤＭ含有環地 ２．０Ｘ１０’個、２４時間 ■ＪＴＣ−１６・Ｐ３（ラット肝癌細胞 ＪＣＲＢ
０７１４） １％ＦＣ３含有ＤＭ−１６０ＡＵ培地 約５０％コンフルエント、４８時間 ［相］ＮＹ（ヒト骨肉腫細胞 ＪＣＲＢ ０６１４）
８％ＦＣ３含有ＭＥＭ培地 ２．０Ｘ１０’個、７２時間 ■ＭＴ−１（ヒトＴ細胞白血病細胞 ＪＣＲＢ１０％Ｆ
ＣＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地浮遊細胞を２．０Ｘ
１０’個に調製して使各細胞は上記の条件でプラスミド
ＤＮＡ添加前に植え込み、添加約１時間前に培！！液を
交換した。
胞 ＡＴＣＣＣＣＬ６１） １０％ＦＣＳ含有Ｈａｍ’５Ｆ１２培地１．２Ｘ１０’
個、４８時間 ■ＩＭＲ−３２（ヒト神経芽細胞 ＡＴＣＣＣＣＬＩ
２７） １０％ＦＣ５含有ＤＭＥＭ培地 ２．０Ｘ１０’個、４８時間 ■３Ｙ１（ラット線維芽細胞） ８％ＦＣ３含有ＤＭ含有環地 ２．０ＸＩＯ”個、２４時間 ■ｃｖ−ｔ ｃサル腎ＩＩＩｗＵ胞 ＡＴＣＣＣＣＬ８
％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培地 ２．０Ｘ１０’個、２４時間 ■ＣＯ３−１（ＳＶ４０による形質転換サル腎臓細胞
ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０） ８％ＦＣ３含有ＤＭ含有環地 ２．０Ｘ１０’個、２４時間 ■Ｔ２２ （ＳＶ４０による形質転換サル腎臓細胞） ８％ＦＣ３含有ＤＭ含有環地 ２．０Ｘ１０’個、２４時間 ■ＢｒＡ２−２２７ （ＳＶ４０変異株Ｔ抗原Ａ２によ
って不朽化したラット脳細胞） ８％ＦＣ３含有ＤＭ含有環地 ２．０Ｘ１０’個、２４時間 ■ＢｒＡ２−５Ｓ （ＳＶ４０変異株Ｔ抗原Ａ２によっ
て不朽化したラット脳細胞） ８％ＦＣ３含有ＤＭ含有環地 ２．０Ｘ１０’個、２４時間 ■ＪＴＣ−１６・Ｐ３（ラット肝癌細胞 ＪＣＲＢ
０７１４） １％ＦＣ３含有ＤＭ−１６０ＡＵ培地 約５０％コンフルエント、４８時間 ［相］ＮＹ（ヒト骨肉腫細胞 ＪＣＲＢ ０６１４）
８％ＦＣ３含有ＭＥＭ培地 ２．０Ｘ１０’個、７２時間 ■ＭＴ−１（ヒトＴ細胞白血病細胞 ＪＣＲＢ１０％Ｆ
ＣＳ含有ＲＰＭＩ １６４０培地浮遊細胞を２．０Ｘ
１０’個に調製して使各細胞は上記の条件でプラスミド
ＤＮＡ添加前に植え込み、添加約１時間前に培！！液を
交換した。
一方、各々ノブ−ｙスミドＤＮＡｆＯ−２０μｇを含む
水溶液０．４５ｍ１に５０μｍの２．５Ｍ（ａＣ１２を
加え、さらに溶液を攪拌しつつ、０．５ｍｌの２ｘＨＢ
Ｓ ［２８０ｍＭ ＮａＣ１１５０ｎＭ ＨＥ
Ｐ Ｅ Ｓ ／ ２ 、８ ｉＭ Ｎ ａ ２ ＨＰ
Ｏ４（ｐｏ ７．０５）］ を滴下後、１０分間室
温で放置した。ついで上記細胞を含む培地中にこれを加
え６時間培養した。約１０＋ｓｌのＰＢＳ−で洗浄後、
２０％Ｄ Ｍ Ｓ Ｏ／培地で３分間処理してトランス
フェクタントを得た。得られたトランスフェクタントは
ＰＢＳ−で洗浄後、培地を添加し、５％ＣＯ，存在下３
７℃で維持した。
水溶液０．４５ｍ１に５０μｍの２．５Ｍ（ａＣ１２を
加え、さらに溶液を攪拌しつつ、０．５ｍｌの２ｘＨＢ
Ｓ ［２８０ｍＭ ＮａＣ１１５０ｎＭ ＨＥ
Ｐ Ｅ Ｓ ／ ２ 、８ ｉＭ Ｎ ａ ２ ＨＰ
Ｏ４（ｐｏ ７．０５）］ を滴下後、１０分間室
温で放置した。ついで上記細胞を含む培地中にこれを加
え６時間培養した。約１０＋ｓｌのＰＢＳ−で洗浄後、
２０％Ｄ Ｍ Ｓ Ｏ／培地で３分間処理してトランス
フェクタントを得た。得られたトランスフェクタントは
ＰＢＳ−で洗浄後、培地を添加し、５％ＣＯ，存在下３
７℃で維持した。
（２）ＣＡＴアッセイ
ＣＡＴアッセイは、ゴーマン等の方法［モレキュラー
アンド セルラー バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．
ＢＩｏｌ、）、 ２巻、１０４４頁、１９８２年］に従
った。各々の細胞を５％ＣＯ３存在下３７℃で４８時間
培養後、２回ＰＢＳ−で洗浄、し、１０００ｒ、ｐ、ｍ
、で３分間遠心して細胞を集めた。０．２５ＭＴｒｉｓ
−Ｍ（Ｉ （ｐＨ７，８）２００μｌに懸濁後凍結−
融解を３回繰り返し、さらに超音波処理により細胞を破
壊した。４℃、１５，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で１５分間遠
心し、得られた上清の一部を用いてブラッドフォード等
の方法［アナリティヵル バイオケミストリー （＾ｎ
ａ１．Ｂｌｏｃｈｅｍ、） ７２巻、２４８頁、１
９７６年］に従い上清中の蛋白質量を定量した。
アンド セルラー バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．
ＢＩｏｌ、）、 ２巻、１０４４頁、１９８２年］に従
った。各々の細胞を５％ＣＯ３存在下３７℃で４８時間
培養後、２回ＰＢＳ−で洗浄、し、１０００ｒ、ｐ、ｍ
、で３分間遠心して細胞を集めた。０．２５ＭＴｒｉｓ
−Ｍ（Ｉ （ｐＨ７，８）２００μｌに懸濁後凍結−
融解を３回繰り返し、さらに超音波処理により細胞を破
壊した。４℃、１５，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で１５分間遠
心し、得られた上清の一部を用いてブラッドフォード等
の方法［アナリティヵル バイオケミストリー （＾ｎ
ａ１．Ｂｌｏｃｈｅｍ、） ７２巻、２４８頁、１
９７６年］に従い上清中の蛋白質量を定量した。
この結果に基づき約１５０μｇ （ただしＣＨＯ−に１
は２Ｍｇ ＮＹは１８μｇ 、ＪＴＣ−１６・Ｐ
３は６μｇ、ＭＴ−１は４１μｇおよびＩＭＲ−３２は
７６０μｇ）の蛋白質量を含有すると考えられる上清を
分取し、終濃度０．２μ（Ｉ ［”Ｃ］クロラムフェニ
コール／１ａＭアセチルＣｏＡ１０．２５ＭＴｒｉｓ−
Ｈ（Ｉ （ｐＨ７，８）となるように［１４ｃ］クロラ
ムフエニコール（アマジャム社）およびアセチルＣｏＡ
を添加した。３７℃、２時間（ただしＣＨＯ−Ｋｌおよ
びＮＹは３０分間、ＪＴＣ−１６・Ｐ３は４０分間）イ
ンキユベートした後、反応液を酢酸エチルで抽出し、次
いで酢酸エチルを蒸発乾固させた。再度１５μｍの酢酸
エチルに溶解させ、２０ｃｍ＋のシリカゲル薄層プレー
ト（メルク社）上にスポット後、クロロホルム−メタノ
ール（９５： ５）を展開溶媒としてクロマトグラフィ
ーを行った。上端より１３ｃｍまで展開し乾燥後、Ｘ線
フィルムをｉ層プレートに重ね、１８〜２０時間（ただ
しＭＴ−１は３日間）放置してオートラジオグラフをと
った。
は２Ｍｇ ＮＹは１８μｇ 、ＪＴＣ−１６・Ｐ
３は６μｇ、ＭＴ−１は４１μｇおよびＩＭＲ−３２は
７６０μｇ）の蛋白質量を含有すると考えられる上清を
分取し、終濃度０．２μ（Ｉ ［”Ｃ］クロラムフェニ
コール／１ａＭアセチルＣｏＡ１０．２５ＭＴｒｉｓ−
Ｈ（Ｉ （ｐＨ７，８）となるように［１４ｃ］クロラ
ムフエニコール（アマジャム社）およびアセチルＣｏＡ
を添加した。３７℃、２時間（ただしＣＨＯ−Ｋｌおよ
びＮＹは３０分間、ＪＴＣ−１６・Ｐ３は４０分間）イ
ンキユベートした後、反応液を酢酸エチルで抽出し、次
いで酢酸エチルを蒸発乾固させた。再度１５μｍの酢酸
エチルに溶解させ、２０ｃｍ＋のシリカゲル薄層プレー
ト（メルク社）上にスポット後、クロロホルム−メタノ
ール（９５： ５）を展開溶媒としてクロマトグラフィ
ーを行った。上端より１３ｃｍまで展開し乾燥後、Ｘ線
フィルムをｉ層プレートに重ね、１８〜２０時間（ただ
しＭＴ−１は３日間）放置してオートラジオグラフをと
った。
各トランスフェクタントにより発現されたＣＡＴ量は、
アセチル化された［＋４ｃ］クロラムフエニコールの割
合から推定された。さらに定量的な測定法としてラジオ
アナリティックラベリングシステム（ＡＭＢＩＳ Ｓ
ｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ、）を用い薄層プレート上の放射
活性を直接カウントした。
アセチル化された［＋４ｃ］クロラムフエニコールの割
合から推定された。さらに定量的な測定法としてラジオ
アナリティックラベリングシステム（ＡＭＢＩＳ Ｓ
ｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ、）を用い薄層プレート上の放射
活性を直接カウントした。
代表例としてＩＭＲ−３２細胞におけるＣＡＴ遺伝子の
発現効率を、ラジオアナリティックラベリングシステム
で測定した結果を第１０図に示した３図中の数字は各々
［１４ｃｌクロラムフエニコールまたはアセチル化［１
４ｃｌクロラムフエニコールの放射活性の強さを示して
いる。従ってアセチル化［１４ｃ］クロラムフエニコー
ルの割合は（アセチル化体）／（アセチル化体＋未変化
体）で示される。この結果、ＳＶ４０プロモーターを含
有する発現プラスミドでは発現効率の非常に低い神経芽
細胞（ＩＭＦＬ−３２）においても、ヒトＥＦ−１α遺
伝子のプロモーター領域を含有する４種の発現プラスミ
ドは、いずれも高発現率を示した。特にエクソン２まで
を含有するプラスミドｐＥＦ３２１−ＣＡＴはｐＳＶ２
−ＣＡＴの約１００倍、ＰＳＲα−ＣＡＴの約１０倍の
発現効率を示した。
発現効率を、ラジオアナリティックラベリングシステム
で測定した結果を第１０図に示した３図中の数字は各々
［１４ｃｌクロラムフエニコールまたはアセチル化［１
４ｃｌクロラムフエニコールの放射活性の強さを示して
いる。従ってアセチル化［１４ｃ］クロラムフエニコー
ルの割合は（アセチル化体）／（アセチル化体＋未変化
体）で示される。この結果、ＳＶ４０プロモーターを含
有する発現プラスミドでは発現効率の非常に低い神経芽
細胞（ＩＭＦＬ−３２）においても、ヒトＥＦ−１α遺
伝子のプロモーター領域を含有する４種の発現プラスミ
ドは、いずれも高発現率を示した。特にエクソン２まで
を含有するプラスミドｐＥＦ３２１−ＣＡＴはｐＳＶ２
−ＣＡＴの約１００倍、ＰＳＲα−ＣＡＴの約１０倍の
発現効率を示した。
また、各発現プラスミドによるアセチル化体の割合を表
１にまとめた。
１にまとめた。
ロモーター含有の２ ｆｌのプラスミドに比べ同等また
はそれ以上の発現効率を示した。
はそれ以上の発現効率を示した。
空欄は未測定
Ｃ）１０−ＫｌおよびＩＭＲ−３２細胞テ、４種のヒト
ＥＦ−１α遺伝子のプロモーター領域を含有する発現プ
ラスミドの発現効率を比較すると、ｐＥＦ３２１−ＣＡ
Ｔ＞ｐＥＦ２０４−ＣＡＴ。
ＥＦ−１α遺伝子のプロモーター領域を含有する発現プ
ラスミドの発現効率を比較すると、ｐＥＦ３２１−ＣＡ
Ｔ＞ｐＥＦ２０４−ＣＡＴ。
ｐＥＦ２２３−ＣＡＴ＞ｐＥＦ２２０−ＣＡＴの順であ
った。さらに上記２ ｆｌの細胞で最大発現効果を示し
たプラスミドｐＥＦ３２１−ＣＡＴは、使用したいずれ
の細胞株においても、ＳＶ４０プ実施例６ ５Ｖ４０Ｔ
抗原遺伝子の発現プラスミドｐＥＦ２０４α−Ｔ、ｐＥ
Ｆ３２１α−ＴおよびｐＭＴｌを実施例５の（１）に従
りてＩ ＭＲ−３２細膓にトランスフェクションした。
った。さらに上記２ ｆｌの細胞で最大発現効果を示し
たプラスミドｐＥＦ３２１−ＣＡＴは、使用したいずれ
の細胞株においても、ＳＶ４０プ実施例６ ５Ｖ４０Ｔ
抗原遺伝子の発現プラスミドｐＥＦ２０４α−Ｔ、ｐＥ
Ｆ３２１α−ＴおよびｐＭＴｌを実施例５の（１）に従
りてＩ ＭＲ−３２細膓にトランスフェクションした。
４８時間後、細胞をエタノール−アセトンＣ１７１）溶
液で一２０℃、１８分間固定し免疫蛍光アッセイを行っ
た。−次抗体としてハムスターのＳＶ４０に対する抗血
清を作製して使用した。すなわち生後３〜４力月のハム
スターの皮下にＳＶ４０トランスフオーム細胞約２Ｘ１
０’個を接種し腫瘍の形成を待ち（通常２〜６力月）、
１日の絶食後金採血を実施し、抗血清を得た。上記の固
定された細胞を抗血清とともに３７℃、１時間インキュ
ベートした。ＰＢＳ−で細胞を洗浄後、ＦＩＴＣ結合ウ
サギつハムスター１ｇＧ（富士臓器）とともに３７℃、
１時間インキュベートした。ＰＢＳ−で細胞を洗浄後、
落斜式蛍光顕微１ｊｌＢＨ２（オリンパス社）で蛍光を
観察した。
液で一２０℃、１８分間固定し免疫蛍光アッセイを行っ
た。−次抗体としてハムスターのＳＶ４０に対する抗血
清を作製して使用した。すなわち生後３〜４力月のハム
スターの皮下にＳＶ４０トランスフオーム細胞約２Ｘ１
０’個を接種し腫瘍の形成を待ち（通常２〜６力月）、
１日の絶食後金採血を実施し、抗血清を得た。上記の固
定された細胞を抗血清とともに３７℃、１時間インキュ
ベートした。ＰＢＳ−で細胞を洗浄後、ＦＩＴＣ結合ウ
サギつハムスター１ｇＧ（富士臓器）とともに３７℃、
１時間インキュベートした。ＰＢＳ−で細胞を洗浄後、
落斜式蛍光顕微１ｊｌＢＨ２（オリンパス社）で蛍光を
観察した。
その結果、Ｔ抗原の発現は、プラスミドｐＥＦ２０４α
−ＴおよびプラスミドｐＥＦ３２１α−丁では確認でき
たが（第１１図および第１２図）、プラスミドｐＭＴ１
では確認できなかった。
−ＴおよびプラスミドｐＥＦ３２１α−丁では確認でき
たが（第１１図および第１２図）、プラスミドｐＭＴ１
では確認できなかった。
実施例７ 発現プラスミドの安定性の測定３Ｙ１細胞に
対して実施例６と同様にトランスフェクションを行った
。２４時間培養後、トリプシン溶液（０，０５％トリプ
シン／ＰＢＳ−）を用いて細胞をまき直し、その後３７
℃、５％Ｃｏ、存在下で１力月間培養した。
対して実施例６と同様にトランスフェクションを行った
。２４時間培養後、トリプシン溶液（０，０５％トリプ
シン／ＰＢＳ−）を用いて細胞をまき直し、その後３７
℃、５％Ｃｏ、存在下で１力月間培養した。
その結果プラスミドｐＥＦ２０４α−Ｔ、ｐＥＦ３２１
α−ＴまたはｐＭＴｌによってトランスフェクトされた
細胞は、すべて高密度のフォーカスを形成した。しかし
、プラスミドｐＥＦ２０４α−ＴまたはｐＥＦ３２１α
−Ｔでトランスフェクトされた細胞は、プラスミドｐＭ
Ｔ１によりトランスフェクトされたｗｉ胞に比ベフォー
カスが多数存在していた。
α−ＴまたはｐＭＴｌによってトランスフェクトされた
細胞は、すべて高密度のフォーカスを形成した。しかし
、プラスミドｐＥＦ２０４α−ＴまたはｐＥＦ３２１α
−Ｔでトランスフェクトされた細胞は、プラスミドｐＭ
Ｔ１によりトランスフェクトされたｗｉ胞に比ベフォー
カスが多数存在していた。
さらにそれらのフォーカスの１つをトリプシン溶液で処
理後、実施例６に従い免疫蛍光アッセイを行った。その
結果、プラスミドｐＥＦ２０４α−Ｔおよびプラスミド
ｐＥＦ３２１α−Ｔによってトランスフェクトされた細
胞は、細Ｉｌａ核にＴ抗原が検出され（第１３図および
第１４［］） 、 ＭＥ胞内のプラスミドＤＮＡが１力
月間安定に存在していることが示された。
理後、実施例６に従い免疫蛍光アッセイを行った。その
結果、プラスミドｐＥＦ２０４α−Ｔおよびプラスミド
ｐＥＦ３２１α−Ｔによってトランスフェクトされた細
胞は、細Ｉｌａ核にＴ抗原が検出され（第１３図および
第１４［］） 、 ＭＥ胞内のプラスミドＤＮＡが１力
月間安定に存在していることが示された。
実施例８ ヒトＣＤ４遺伝子の発現
プラスミドｐＥＦ３２１β−ＣＤ４を実施例６に従いＣ
ＨＯ−Ｋｌ細胞にトランスフェクションした。−次抗体
としてヒトＣＤ４特異的マウスモノクローナル抗体（Ｏ
ＫＴ４、オーツ社）、二次抗体としてＦＩＴＣ結合ウサ
ギつマウスＩｇＧ（医学生物学研究所）を使用して実施
例６に従い免疫蛍光アッセイを実施した。
ＨＯ−Ｋｌ細胞にトランスフェクションした。−次抗体
としてヒトＣＤ４特異的マウスモノクローナル抗体（Ｏ
ＫＴ４、オーツ社）、二次抗体としてＦＩＴＣ結合ウサ
ギつマウスＩｇＧ（医学生物学研究所）を使用して実施
例６に従い免疫蛍光アッセイを実施した。
結果を第１５図に示すが、ＣＤ４蛋白質がトランスフェ
クションされた細胞表面に検出され、プラスミドｐＥＦ
３２１β−ＣＤ４がＣＨＯ−Ｋｌ細胞でＣＤ４を発現し
ていることが証明された。
クションされた細胞表面に検出され、プラスミドｐＥＦ
３２１β−ＣＤ４がＣＨＯ−Ｋｌ細胞でＣＤ４を発現し
ていることが証明された。
〈発明の効果〉
本発明のヒトＥＦ−１α遺伝子のプロモーター領域を含
有する新規ＤＮＡ配列を用いた発現プラスミドは、従来
繁用されている５Ｖ４Ｑ初期プロモーターを用いた発現
プラスミドに比べ、広宿主細胞域でより強力な発現効率
を示した。さらにこの発現プラスミドは細胞内で約１カ
月間安定に存在した。したがりて本発明の発現プラスミ
ドを用いることにより、より広範囲の咄乳動物細胞を宿
主として各種有用生理活性物質をより効率的に５なおか
つ長期間産生させ得ることが期待される。
有する新規ＤＮＡ配列を用いた発現プラスミドは、従来
繁用されている５Ｖ４Ｑ初期プロモーターを用いた発現
プラスミドに比べ、広宿主細胞域でより強力な発現効率
を示した。さらにこの発現プラスミドは細胞内で約１カ
月間安定に存在した。したがりて本発明の発現プラスミ
ドを用いることにより、より広範囲の咄乳動物細胞を宿
主として各種有用生理活性物質をより効率的に５なおか
つ長期間産生させ得ることが期待される。
第１図は、ヒトＥＦ−１αのｃＤＮＡの塩基配列を示す
図である。 第２図は、ヒトＥＦ−１α染色体遺伝子の構造およびシ
ーフェンシングの方向を示す線図である。 第３図は、ヒトＥＦ−１α染色体遺伝子の全塩基配列を
示す図である。 第４図は、プラスミドＰＥＦ−２およびｐＥＦ−３、第
５図はプラスミドｐＥＦ−２２０、ｐＥＦ−２２３およ
びｐＥＦ−２０４、第６図はプラスミドｐＥＦ−３２１
．第７図はプラスミドｐＥＦ２２０−ＣＡＴ、ｐＥＦ２
２３−ＣＡＴ％ ｐＥＦ２０４−ＣＡＴおよびｐＥＦ３
２１−ＣＡＴ、第８図はプラスミドｐＥＦ２０４α−Ｔ
およびｐＥＦ３２１α−Ｔ１第９図はプラスミドｐＥＦ
３２１β−ＣＤ４の各々の構築図を示す図である。 第１０図は、ＩＭＲ−３２細胞におけるＣＡＴアッセイ
の結果を示す図である。 第１１図、第１２図、第１３図、第１４図および第１５
図は、生物の形態を示す図面代用写真である。 すなわち、第１１図および第１２図は、ＩＭＲ−３２細
胞における、また第１３図および第１４図は３Ｙ１細胞
におけるＴ抗原の蛍光抗体による検出結果を示す。 第１５図はＣＨＯ−Ｋｌ細胞におけるヒトＣＤ４の蛍光
抗体による検出結果を示す。 ！〒５ 図 １琴５ 図 第 図 ｊ甲５ 図
図である。 第２図は、ヒトＥＦ−１α染色体遺伝子の構造およびシ
ーフェンシングの方向を示す線図である。 第３図は、ヒトＥＦ−１α染色体遺伝子の全塩基配列を
示す図である。 第４図は、プラスミドＰＥＦ−２およびｐＥＦ−３、第
５図はプラスミドｐＥＦ−２２０、ｐＥＦ−２２３およ
びｐＥＦ−２０４、第６図はプラスミドｐＥＦ−３２１
．第７図はプラスミドｐＥＦ２２０−ＣＡＴ、ｐＥＦ２
２３−ＣＡＴ％ ｐＥＦ２０４−ＣＡＴおよびｐＥＦ３
２１−ＣＡＴ、第８図はプラスミドｐＥＦ２０４α−Ｔ
およびｐＥＦ３２１α−Ｔ１第９図はプラスミドｐＥＦ
３２１β−ＣＤ４の各々の構築図を示す図である。 第１０図は、ＩＭＲ−３２細胞におけるＣＡＴアッセイ
の結果を示す図である。 第１１図、第１２図、第１３図、第１４図および第１５
図は、生物の形態を示す図面代用写真である。 すなわち、第１１図および第１２図は、ＩＭＲ−３２細
胞における、また第１３図および第１４図は３Ｙ１細胞
におけるＴ抗原の蛍光抗体による検出結果を示す。 第１５図はＣＨＯ−Ｋｌ細胞におけるヒトＣＤ４の蛍光
抗体による検出結果を示す。 ！〒５ 図 １琴５ 図 第 図 ｊ甲５ 図
Claims (10)
- （１）ヒトポリペプチド鎖延長因子遺伝子のプロモータ
ー領域を含有する新規ＤＮＡ。 - （２）前記ヒトポリペプチド鎖延長因子がヒトポリペプ
チド鎖延長因子−１αであることを特徴とする請求項第
１項記載の新規ＤＮＡ。 - （３）ヒトポリペプチド鎖延長因子−１α遺伝子の開始
コドンの上流約２．５Ｋｂｐの全部あるいは一部を含有
する請求項第２項記載の新規ＤＮＡ。 - （４）前記ヒトポリペプチド鎖延長因子−１α遺伝子の
プロモーター領域を含有するＤＮＡが下記式（ I ）の
全部あるいは一部で表されることを特徴とする請求項第
２項記載の新規ＤＮＡ。 式（ I ）： 【遺伝子配列があります】 - （５）前記ＤＮＡの少なくとも１つが、変異、欠失、挿
入されたものである請求項第２ないし第４項のいずれか
に記載の新規ＤＮＡ。 - （６）ヒトポリペプチド鎖延長因子遺伝子のプロモータ
ー領域を含有する新規ＤＮＡを用いた発現プラスミド。 - （７）前記ヒトポリペプチド鎖延長因子がヒトポリペプ
チド鎖延長因子−１αであることを特徴とする請求項第
６項記載の発現プラスミド。 - （８）ヒトポリペプチド鎖延長因子−１α遺伝子の開始
コドンの上流約２．５Ｋｂｐの全部あるいは一部を含有
することを特徴とする請求項第７項記載の発現プラスミ
ド。 - （９）前記ヒトポリペプチド鎖延長因子−１α遺伝子の
プロモーター領域を含有するＤＮＡが下記式（ I ）の
全部あるいは一部で表されることを特徴とする請求項第
７項記載の発現プラスミド。 式（ I ）： 【遺伝子配列があります】 - （１０）前記ＤＮＡの少なくとも１つが、変異、欠失、
挿入されたものである請求項第７ないし第９項のいずれ
かに記載の発現プラスミド。
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