DE10055285A1 - Neue Marker für die Diagnose und Therapie von Tumoren - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Marker für Tumoren, vorzugsweise CTCL. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner deren Einsatz für die Diagnose bzw. Therapie von Tumorerkrankungen, vorzugsweise CTCL.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Marker für Tumoren, vorzugsweise CTCL. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner deren Einsatz für die Diagnose bzw. Therapie von Tumorerkrankungen, vorzugsweise CTCL.

Kutane T-Zell-Lymphome (CTCL) stellen eine heterogene Gruppe von Erkrankungen dar, bei denen CD4-T-Zellen als der maligne Zelltyp vorherrschen. In den meisten Fällen wird der mono- oder zumindest oligoklonale Ursprung der malignen Zellen anhand T- Zellrezeptor-Rearrangements dokumentiert. Neben verschiedenen weiteren Untertypen stellen Mycosis fungoides und das Sézary- Syndrom (SS) die häufigsten Formen von CTCL dar. Bei beiden Erkrankungen handelt es sich um monoklonale T-Helfer-Memory- Lymphome, die durch kutane Plaques, Tumore oder Erythrodermie gekennzeichnet sind, wobei SS zusätzlich durch eine generalisierte Lymphadenopathie und die Gegenwart von neoplastischen T-Zellen im peripheren Blut charakterisiert ist.

Zu den therapeutischen Ansätzen zählen die Stadium-abhängige Auswahl von PUVA (Psoralen und UV-A), Retinoiden, Interferon α- 2a in Kombination mit Acitretin oder PUVA, verschiedene Immunmodulatoren, Elektronenbestrahlung oder extrakorporale Photopherese. Diese Verfahren sind in frühen Krankheitstadien erfolgreich, nicht jedoch bei den aggressiven späteren Stadien. Zu möglicherweise sinnvollen zukünftigen Therapien für CTCL zählen immunologische Therapien, z. B. Vakzinierung mit Peptiden oder Peptid-beladenen dendritischen Zellen so wie dies bereits auch zur Behandlung von Melanomen verwendet wurde.

Die Gegenwart und Aktivität von CD8⁺-Zellen bei CTCL wurde mit der Prognose korreliert. Es konnte gezeigt werden, daß CD8⁺- reaktive Infiltrate CTCL-spezifisch und lytisch sind. Somit mögen zwar Immuntherapien ein vielversprechendes Konzept zur Behandlung CTCL darstellen, eine Voraussetzung für eine solche Strategie ist allerdings die Identifizierung Tumor-spezifischer Antigene. In diesem Zusammenhang wurde der T-Zellrezeptor selbst als ein Antigen vorgeschlagen (ähnlich den Idiotyp- Immunglobulinen als Ziel für B-Zell-spezifische T-Zellen). In beiden Fällen ist man jedoch mit dem Nachteil konfrontiert, daß der Antigen-T-Zellrezeptor für jeden einzelnen Patienten identifiziert werden müßte. Zusammengefaßt muß allerdings festgestellt werden, daß für Tumorarten wie CTCL zur Zeit keine tumorassoziierten Antigene bekannt sind, somit die Möglichkeiten der spezifischen Diagnose bzw. Therapie stark eingeschränkt sind.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, Marker (Gene bzw. deren Produkte) zu identifizieren und bereitzustellen, die mit Tumoren, insbesondere CTCL, in Zusammenhang stehen und gegebenenfalls von diagnostischem und/oder im Rahmen einer Vakzinierungstherapie von therapeutischem Nutzen sind.

Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.

Es wurden überraschenderweise eine Reihe von Genen gefunden, deren Expression mit CTCL korreliert ist. In den zu der vorliegenden Erfindung führenden Experimenten wurden CTCL- spezifische Antigene durch Screenen einer Testis-cDNA-Bank bzw. einer cDNA-Bank, die aus Tumor-RNA verschiedener kutaner Lymphome hergestellt worden war, mit Seren von Tumorpatienten identifiziert. Etwa 3 × 10⁶ Rekombinante wurden mit Seren von Patienten mit Sézary-Syndrom bzw. Mycosis fungoides gescreent. Die Ergebnisse zeigen, daß Tumor-Antigene von CTCL-Tumoren mit von Tumorpatienten stammenden Antikörpern identifiziert werden können. Es konnten positive Klone identifiziert werden, die zu 19 unterschiedlichen Genen/ORFs gehörten, wozu auch fünf bisher nicht bekannte Sequenzen zählen. Alle gefundenen Tumor-Antigene sind spezifisch, d. h. daß nur Tumorpatienten, jedoch keine gesunden Personen gegen diese gerichtete Antikörper bilden, obwohl 13 von diesen Tumor-Antigenen in mindestens 21% der getesteten Kontrollgewebe exprimiert werden. Es wurde außerdem ein tumorspezifisches Antigen gefunden, das nur in Testis und Tumorgeweben exprimiert wird. Dabei handelt es sich um se2-1, das in einem CTCL-Tumor gefunden wurde. Dieses Gen zeigt Ähnlichkeiten zu SCP-1, ein mit der Mitose in Zusammenhang stehendes Protein. Vier Seren von CTCL-Patienten reagierten mit verschiedenen SCP-1-ähnlichen Klonen. Somit konnten mittels den zur der vorliegenden Erfindung führenden Experimenten zum ersten Mal CTCL-assoziierte Antigene (unabhängig vom T-Zellrezeptor) identifiziert werden, die somit wertvolle Tumormarker darstellen. Die Identifizierung solcher Antigene ist von Interesse, da die kodierten Proteine und von diesen abgeleitete Peptide als Zielstrukturen, z. B. für zytotoxische Zellen, dienen und als Antigene zur Produktion von diagnostischen oder therapeutischen Antikörpern verwendet werden können. Zur Tumortherapie können die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierten Peptide bzw. Fragmente davon entweder direkt appliziert werden oder auf Antigen-präsentierende Zellen geladen werden. Auch können die Antigene darstellenden Peptide mit Hilfe von Vektoren in verschiedenen Zellen (z. B. Dendritischen Zellen als Antigen-präsentierende Zellen) exprimiert werden. Weiter bilden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren die Grundlage zur Entwicklung diagnostischer Tests, um zukünftig eine zuver­ lässigere und frühzeitige Diagnose bei Betroffenen zu gewährleisten. Darüber hinaus werden funktionelle Analysen der Proteine zweifellos zum Verständnis der Tumorentwicklung beitragen. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind somit als Kandidatengene für Untersuchungen der Pathomechanismen anzu­ sehen, die verschiedenen Tumorerkrankungen wie z. B. CTCL zugrunde liegen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine Nukleinsäurequenz, deren veränderte Expression mit einer Tumor- Erkrankung assoziiert ist, wobei die Nukleinsäuresequenz se2-5 (Fig. 1), se20-10 (Fig. 2), se57-1 (Fig. 3), se70-2 (Fig. 4) oder Lg1-2 (Fig. 5) umfaßt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine diagnostische Zusammensetzung, die eine Nukleinsäuresequenz enthält, deren veränderte Expression mit einer Tumor-Erkrankung assoziiert ist, wobei die Nukleinsäuresequenz se2-5 (Fig. 1), se20-10 (Fig. 2), se57-1 (Fig. 3), se70-2 (Fig. 4), Lg1-2 (Fig. 5), se1-1 (Fig. 6), se2-1 (Fig. 7), se2-2 (Fig. 8), se14-3 (Fig. 9), se20-4 (Fig. 10), se20-7 (Fig. 11), se20-9 (Fig. 12), se33-1 (Fig. 13), se37-2 (Fig. 14), se89-1 (Fig. 15), L14-2 (Fig. 16), L15- 7 (Fig. 17), Li9-1 (Fig. 18), Li9-4 (Fig. 19), Lii5-2 (Fig. 20), Lii10-6 (Fig. 21) oder Liii4-5 (Fig. 22) umfaßt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Arzneimittel, das eine Nukleinsäuresequenz enthält, deren veränderte Expression mit einer Tumor-Erkrankung assoziiert ist, wobei die Nukleinsäuresequenz se20-10 (Fig. 2), se57-1 (Fig. 3), Lg1-2 (Fig. 5), se1-1 (Fig. 6), se2-1 (Fig. 7), se2-2 (Fig. 8), se14-3 (Fig. 9), se20-4 (Fig. 10), se20-7 (Fig. 11), se20-9 (Fig. 12), se33-1 (Fig. 13), se37-2 (Fig. 14), L14-2 (Fig. 16), L15- 7 (Fig. 17), Li9-1 (Fig. 18), Li9-4 (Fig. 19), Lii5-2 (Fig. 20), Lii10-6 (Fig. 21) oder Liii4-5 (Fig. 22) umfaßt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine vorstehend definierte Nukleinsäuresequenz, diagnostische Zusammensetzung oder ein Arzneimittel, wobei die Nukleinsäuresequenz, deren veränderte Expression mit einer Tumor-Erkrankung in Zusammenhang steht, eine Nukleinsäuresequenz umfaßt,

• a) die sich von einer vorstehenden, in den Fig. 1 bis 22 dargestellten Nukleinsäuresequenz in der Codonsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet;
• b) die mit einer Nukleinsäuresequenz nach einer der Fig. 1 bis 22 oder nach (a) hybridisiert; oder
• c) die ein Fragment, eine allelische Variante oder eine andere Variante einer der vorstehend definierten Nukleinsäuresequenz ist.

Der Begriff "hybridisierende Nukleinsäuresequenz" weist auf eine Nukleinsäuresequenz hin, die unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der Nukleinsäure, mit einer in den Figuren gezeigten Nukleinsäuresequenz hybridisiert. Der in vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "hybridisieren" bezieht sich auf konventionelle Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise auf Hybridisierungsbedingungen, bei denen als Lösung 5 × SSPE, 1% SDS, 1 × Denhardts-Lösung verwendet wird und/oder die Hybridisierungstemperatur zwischen 50°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C liegen. Nach der Hybridisierung wird vorzugsweise zuerst mit 2 × SSC, 1% SDS und danach mit 0,2 × SSC bei Temperaturen zwischen 50°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C gewaschen (zur Definition von SSPE, SSC und Denhardts-Lösung siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)). Besonders bevorzugt sind stringente Hybridisierungsbedingungen, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe "andere Variante" oder "Fragment" umfassen Nukleinsäuresequenzen, die sich gegenüber den in den Figuren angegebenen Sequenzen oder vorstehenden hybridisierenden Sequenzen durch Deletion(en), Insertion(en), Austausch(e) und/oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen unterscheiden bzw. ein Fragment der ursprünglichen Nukleinsäuresequenz umfassen, wobei das durch diese Nukleinsäuresequenzen kodierte Protein noch eine oder mehrere der vorstehend bzw. in den Beispielen beschriebenen Eigenschaften aufweist. Dazu zählen auch Allelvarianten. Die Varianten weisen eine Homologie zu den beanspruchten Sequenzen von mind. 80%, bevorzugt mindestens 90%, ganz bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% auf. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Nukleinsäuresequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al., supra. Der Fachmann ist auch in der Lage, zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten Nukleinsäuresequenz kodiertes Protein noch über die gewünschten biologischen Eigenschaften verfügt. Vor allem in Zusammenhang mit diagnostischen Anwendungen bzw. Zusammensetzungen, in denen eine der vorstehenden Nukleinsäuresequenzen verwendet wird, bezieht sich der Begriff "Fragment" auf ein Fragment, das eine Länge von mindestens 12, vorzugsweise mindestens 20 und noch mehr bevorzugt mindestens 25 Nukleotiden aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das vorstehend definierte Nukleinsäuremolekül eine cDNA.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäurersequenz eine genomische DNA, die vorzugsweise von einem Säuger, beispielsweise einem Menschen stammt. Auf Nukleinsäurehybridisierung basierende Screening- Verfahren erlauben die Isolierung der erfindungsgemäßen genom­ ischen DNA-Moleküle aus jedem Organismus bzw. abgeleiteten genomischen DNA-Banken, wobei Sonden verwendet werden, die die in den Figuren angegebene Nukleinsäuresequenz oder ein Fragment davon enthalten.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können auch in einen Vektor bzw. Expressionsvektor inseriert werden. Somit umfaßt die vorliegende Erfindung auch diese Nukleinsäuresequenzen enthaltende Vektoren. Beispiele solcher Vektoren sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E.coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate (z. B. pUC8), pBR322, pBlueScript, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in speziell Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus- Expressionsvektor pAcSGHisNT-A. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz im Vektor mit regulatorischen Elementen funktionell verknüpft, die dessen Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression in Prokaryonten, beispielsweise E.coli, zählen der lac-,trp-Promo­ tor oder T7-Promotor, und für die Expression in Eukaryonten der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe, und der CMV-, SV40-, RVS-40- Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor.

Zu geeigneten Vektoren zählen insbesondere auch auf T7 basierende Expressionsvektoren für die Expression in Bakterien (Rosenberg et al., Gene 56(1987), 125) oder pMSXND für die Expression in Säugerzellen (Lee und Nathans, J. Biol. Chem. 263 (1988), 3521).

Allgemeine auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Vektoren oder Plasmiden, die die vorstehenden Nukleinsäuresequenzen und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., supra, beschrieben sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Vektoren enthaltende Transformanten. Zu diesen Transformanten zählen Bakterien, Hefe, Insekten- und weitere Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugt sind die E. coli Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21, XL1Blue und SG 13009, der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero, HeLa sowie die Insektenzellen sf9. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der vorstehenden Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.

Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure eignet sich besonders als Antigen-kodierende Struktur für therapeutische Zwecke. Ziel soll es dabei sein, das Immunsystem zu stimulieren, Tumorzellen zu eliminieren, die über eine erfindungsgemäße Nukleinsäure identifiziert werden. Dabei gibt es verschiedene Wege, z. B. Injektion der nackten DNA in den Patienten. Hierzu wird ein Plasmid mit einem sehr aktiven Promotor und einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, insbesondere se20-10, se57-1, Lg1-2, se1-1, se2-1, se2-2, se14-3, se20-7, se20-9, se33-1, se37-2, L14-2, L15-7, Li9-1, Li9-4, Lii5-2, Lii10-6 oder Liii4-5 umfaßt, beispielsweise in den Muskel oder intradermal injiziert. Desweiteren kann die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz nicht nur zu Zwecken der rekombinanten Herstellung in einen Vektor inseriert sein, sondern auch um die DNA mit Hilfe von Vektoren in Patienten zu injizieren, wo diese ein Antigen für therapeutische Zwecke kodiert. Das Ziel ist, daß die Zellen das Plasmid aufnehmen, Antigene produzieren, über HLA-Moleküle einzelne Peptide präsentieren und somit eine zytotoxische T- Zell-Immunantwort hervorrufen. Diese soll dann zur Abwehr von Tumorzellen führen. Allgemein ist diese Verfahrensweise in Conry et al., Clinical Cancer Research 4, S. 2903-2912 (1998) beschrieben. Einen alternativen Weg stellt die "Gene-Gun"- Methode dar, die in Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, S. 11478-11482 (1993) beschreiben ist. Hierbei wird die Nukleinsäure mit Hilfe eines Vektors in vivo Antigen- präsentierende Zellen (APCs), z. B. Dendritische Zellen, zur HLA- Präsentation des kodierten Proteins gebracht. Dabei kann der die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor über verschiedene Wege injiziert werden:

• a) Lipid- bzw. Liposomen-verpackte DNA oder RNA, z. B. allgemein beschrieben von Nabel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, S. 15388-15393 (1996).
• b) Mit einem Bakterium als Transportvehikel für den Expressionsvektor. Geeignete Bakterien sind beispielsweise (attenuierte) Listerien [z. B. Listeria monocytogenes], Salmonellen-Stämme [z. B. Salmonella spp.]. Allgemein ist diese Technik von Medina et al., Eur. J. Immunol. 29, S. 693-699 (1999) sowie Guzman et al., Eur. J. Immunol. 28, S. 1807-1814 (1998) beschrieben worden. Desweiteren wird auf WO 96/14087; Weiskirch et al., Immunological Reviews 158, S. 159-169 (1997) und US-A-5,830,702 verwiesen.
• c) Mittels Gene-Gun (Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, S. 2726-2730, 1991).

In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die vorstehenden Nukleinsäuresequenzen enthaltene Vektor ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus, Vaccinia-Virus oder ein AAV- Virus, der bei einer Gentherapie von Nutzen ist. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Weiter eignen sich vorgenannte Viren sowie Fowlpox-Virus, Canarypox-Virus, Influenza-Virus oder Sindbis-Virus auch als Basis einer Vakzine. Solche neuen Vakzine, die nach Verabreichung an den Patienten anti-Tumor-Immunität verleihen, sind beispielsweise bei N. Restifo, Current Opinion in Immunology 8, S. 658-663 (1996) oder Ying et al., Nature Medicine 5(7), S. 823 ff., (1999) beschrieben. Für Zwecke der Gentherapie können die vorstehenden Nukleinsäuresequenzen auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispiels­ weise Liposomen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).

Weiter ist es bevorzugt, um eine Tumor-Immunität zu erzeugen, eine vorstehende Nukleinsäuresequenz in Antigen-präsentierende Zellen zu transfizieren und diese dem Patienten zu injizieren. Hierbei wird ein Plasmid in vitro in eine Antigen-präsentierende Zelle (APCs), z. B. Dendritische Zellen, gegeben, die dann Antigene produzieren und über HLA-Moleküle einzelne Peptide präsentieren. Dabei kann die Plasmid-DNA über verschiedene Wege in die Antigen-präsentierenden Zellen gebracht werden:

• a) als nackte DNA, z. B. mittels "Gene Gun" oder Elektroporation;
• b) als Lipid- oder Liposomen-verpackte DNA oder RNA (Nair et al., Nature Biotechnology 16, S. 364 ff. (1998));
• c) mit einem Virus als Vektor (Kim et al., J. of Immunotherapy 20(4). S. 276-286 (1997));
• d) mit einem Bakterium als Transportvehikel für den Expressionsvektor (Medina et al., Eur. J. Immunol. 29, S. 693-699 (1999); Guzman et al., Eur. J. Immunol. 28, S. 1807-1814 (1998))

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das von einer vorstehenden Nukleinsäure kodiert wird, umfassend die Kultivierung der vorstehend beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des Proteins erlauben (vorzugsweise stabile Expression), und Gewinnung des Proteins aus der Kultur. Geeignete Verfahren zur rekombinanten Herstellung des Proteins sind allgemein bekannt (siehe beispielsweise Holmgren, Annu. Rev. Biochem. 54 (1985), 237; LaVallie et al., Bio/Technology 11 (1993), 187; Wong, Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 517; Romanos, Curr. Opin. Biotech. 6 (1995), 527; Williams et al., Curr. Opin. Biotech. (1995), 538; und Davies, Curr. Opin. Bio­ tech. 6 (1995), 543. Auch geeignete Reinigungsverfahren (beispielsweise präparative Chromatographie, Affinitätschromatographie, beispielsweise Immunoaffini­ tätschromatographie, HPLC etc.) sind allgemein bekannt.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein von den vorstehenden Nukleinsäuresequenzen kodiertes oder nach dem vorstehenden Verfahren erhaltenes Protein, dessen veränderte Konzentration (im Vergleich zu normalem Gewebe) mit einer Tumorerkrankung in Zusammenhang steht. In diesem Zusammenhang soll erwähnt werden, daß das erfindungsgemäße Protein gemäß üblicher, auf dem Fachgebiet bekannten, Verfahren modifiziert sein kann. Zu diesen Modifikationen zählen Austausche, Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren, die die Struktur des Proteins modifizieren, wobei seine biologische Aktivität im wesentlichen erhalten bleibt. Zu den Austauschen zählen vorzugsweise "konservative" Austausche von Aminosäureresten, d. h. Austausche gegen biologisch ähnliche Reste, z. B. die Substitution eines hydrophoben Rests (z. B. Isoleucin, Valin, Leucin, Methionin) gegen einen anderen hydrophoben Rest, oder die Substitution eines polaren Rests gegen einen anderen polaren Rest (z. B. Arginin gegen Lysin, Glutaminsäure gegen Asparaginsäure etc.). Deletionen können zur Erzeugung von Molekülen führen, die eine deutlich geringere Größe aufweisen, d. h., denen beispielsweise Aminosäuren am N- oder C-Terminus fehlen.

Für die gewünschte Anti-Tumor-Vakzinierung eignen sich auch Injektionen des Proteins oder eines oder mehrerer davon abgeleiteter Peptide. Aus der Sequenz des erfindungsgemäßen Proteins werden dafür entweder mittels entsprechender Computerprogramme oder mittels Experimente (z. B. phagozytotische Aufnahme des Gesamt-Proteins, danach Analyse der präsentierenden Peptide) HLA-abhängige Peptid-Fragmente ermittelt. Diese werden mittels dem Fachmann bekannter Methoden künstlich hergestellt und dann (ggf. mit Immunsystem stimulierenden Faktoren, z. B. Interferonen, Interleukinen usw.) dem Patienten injiziert. Das hinter dieser Behandlung steckende Ziel ist, daß die APCs die Peptide aufnehmen, sie präsentieren und so in vivo die Produktion von Tumor-spezifischen zytotoxischen T-Zellen stimulieren. Allgemein ist dieses Prinzip von Melief et al., Current Opinion in Immunology 8, S. 651-657 (1996) beschrieben worden.

Ebenso wie vorstehend beschrieben, können anstelle des Vektors auch das vorstehende Protein bzw. Fragmente davon in vitro auf APCs geladen werden. Die beladenen Zellen werden dann dem Patienten z. B. in die Lymphknoten injiziert und sorgen direkt für die Stimulierung und Vermehrung von Tumor-spezifischen zytotoxischen T-Zellen (Nestle et al., Nature Medicine 4(3), S. 328 ff. (1998); Schadendorf et al., in: Burg, Dummer, Strategies for Immunointerventions in Dermatology, Springer Verlag, Berlin Heidelberg, S. 399-409, 1997) Für die Vakzinierung kann es vorteilhaft sein, gegenüber dem Wildtyp-Antigen einzelne Aminosäuren, wie vorstehend beschrieben, zu modifizieren, da damit u. U. eine Erhöhung der Bindung und eine Verbesserung der Wirksamkeit zu erreichen ist (Clay et al., The Journal of Immunology 162, S. 1749-1755, 1999).

Besonders bevorzugt für die vorstehenden therapeutischen Maßnahmen ist eine Nukleinsäuresequenz, die die Nukleinsäuresequenz se20-10 (Fig. 2), se57-1 (Fig. 3), Lg1-2 (Fig. 5), se1-1 (Fig. 6), se2-1 (Fig. 7), se2-2 (Fig. 8), se14-3 (Fig. 9), se20-7 (Fig. 11), se20-9 (Fig. 12), se33-1 (Fig. 13), se37-2 (Fig. 14), L14-2 (Fig. 16), L15-7 (Fig. 17), Li9-1 (Fig. 18), Li9-4 (Fig. 19), Lii5-2 (Fig. 20), Lii10-6 (Fig. 21) oder Liii4-5 (Fig. 22) umfaßt bzw. ein davon kodiertes Protein oder ein Fragment davon.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Antikörper, die die vorstehend beschriebenen Proteine (Tumor-Antigene) spezifisch erkennen. Die Antikörper können monoklonale, polyklonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon, beispiels­ weise Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente. Vorzugsweise handelt es sich dabei um monoklonale Antikörper. Für die Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklonalen Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragment(en) davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fusions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei das von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen kodierte Protein oder ein synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Monoklonale Antikörper können beispielsweise durch das von Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495) und Galfré (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3) beschriebene Verfahren hergestellt werden, wobei Maus-Myelomzellen mit von immunisierten Säugern stammenden Milzzellen fusioniert werden. Diese Antikörper können beispielsweise zur Immunpräzipitation der vorstehend diskutierten Proteine oder zur Isolierung verwandter Proteine aus cDNA-Expressionsbanken verwendet werden. Die Antikörper können beispielsweise in Immunoassays in Flüssigphase oder an einen festen Träger gebunden werden. Dabei können die Antikörper auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsverfahren sind dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Immungssays sind ELISA und RIA.

Weiter können die Antikörper neben ihrer diagnostischen Eignung auch therapeutisch eingesetzt werden. Dabei dient z. B. ein von den vorstehenden Nukleinsäuresequenzen kodiertes Protein als Target für bispezifische Antikörper. Hierzu wird auf Kastenbauer et al., Laryngorhinootologie 78(1), S. 31-35 (1999) und Cao et al., Bioconj. Chem. 9(6), S. 635-644 (1998) verwiesen. Die erfindungsgemäßen Antikörper eignen sich z. B. dafür, um in Tumoren überexprimiertes Antigen abzufangen und so das Tumorwachstum zu hemmen, da es Hinweise darauf gibt, daß in manchen Fällen das Vorkommen von Tumor-Antigenen nicht nur das Vorhandensein von Tumoren indikativ anzeigt, sondern aktiv das Tumorwachstum fördert.

Desweiteren kann durch den Einsatz von Antisense-DNA (RNA) bzw. Ribozymen eine Inhibierung der Translation der vorstehenden Nukleinsäuresequenzen, deren Expression in Tumoren erhöht ist, erreicht werden und somit ein therapeutischer Effekt spezifisch auf diese Nukleinsäuresequenzen bzw. Gene ausgeübt werden. Es bilden sich in den entsprechenden Tumorzellen RNA/DNA-Hybride, die so die Transkription verhindern und - im Fall der Antisense- RNA - gleichzeitig einen Abbau der Hybride (und somit der RNA) durch RNase H bewirken (Scanlon et al., The Faseb Journal 9, S. 1288-1296, 1995)

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Arzneimittel oder eine diagnostische Zusammensetzung, das (die) die vorstehend be­ schriebenen Nukleinsäuresequenzen, Vektoren, Proteine, Antikörper etc. oder Kombinationen davon enthält, bzw. deren Verwendung für die Diagnose und/oder Therapie. Vorzugsweise werden diese zur Diagnose oder Behandlung von Tumorerkrankungen, insbesondere CTCL, verwendet. Bevorzugt ist die Bereitstellung eines Vakzinierungsmittels, das wie vorstehend beschrieben, entweder auf der Nukleinsäuresequenz oder dem Protein/Peptid basiert. Die diagnostische Zusammensetzung eignet sich dabei einerseits um eine Tumorerkrankung festzustellen, aber auch um eine Verlaufskontrolle durchzuführen, beispielsweise therapie­ begleitend.

Die vorstehenden Arzneimittel enthalten gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc.

Eine vorstehende Nukleinsäuresequenz kann auch als Sonde verwendet werden, um DNA-Moleküle zu isolieren, die beispielsweise von einer anderen Spezies oder einem anderen Organismus stammen und ein Protein mit einer ebensolchen biologischen Aktivität kodieren. Vorzugsweise weist dazu die Sonde eine Länge von mindestens 20, besonders bevorzugt mindestens 25 Basen auf. Geeignete, auf Hybridisierung basierende Nachweisverfahren sind dem Fachmann bekannt, z. B. Southern oder Northern Blot. Geeignete Markierungen für die Sonde sind dem Fachmann ebenfalls bekannt und dazu zählen beispielsweise Markierung mit Radioisotopen, Biolumineszenz-, Chemilumineszenz-, Fluoreszenzmarkern, Metallchelaten, Enzymen etc..

Darüber hinaus kann dies auch durch eine PCR (Wiedmann et al., PCR Methods Appl. 3, S. 551-564 (1994); Saiki et al., Nature 324, S. 163-166 (1986)) oder "Ligase chain reaction" (LCR) (Taylor et al., Curr. Opin. Biotechnol. 6, S. 24-29 (1995); Rouwendal et al., Methods Mol. Biol. S. 149-156 (1996)) erfolgen, wobei die Primer von der Sequenz in den Figuren abgeleitet sind und wobei geeignete Primer (hinsichtlich Länge, Komplementarität zur Matritze, dem zu amplifizierenden Bereich etc.) vom Fachmann gemäß üblicher Verfahren entworfen werden können.

Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose von Tumorerkrankungen, in vitro, wobei die vorstehenden Nukleinsäuresequenzen oder Fragmente davon als Sonde verwendet werden.

Für das diagnostische Verfahren ist es bevorzugt die Nukleinsäuren und/oder Proteine in Form eines ELISA-Kits, Protein-Chips, Nukleinsäure-Chips oder einer mit DNA, RNA oder Protein beladener Membran bereitzustellen.

Bei oben genanntem Verfahren können dem Fachmann bekannte Methoden bezüglich der Präparation von DNA oder RNA aus biologischen Proben, des Restriktionsverdaus der DNA, der Auftrennung der Restriktionsfragmente auf nach Größe auftrennenden Gelen, beispielsweise Agarosegelen, der Herstellung und Markierung der Sonde und des Nachweises der Hybridisierung, beispielsweise über "Southern-Blot" oder in-situ Hybridisierung, angewandt werden.

Vorzugsweise handelt es sich bei diesem Diagnose-Verfahren um ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfaßt:

• - Isolierung von Nukleinsäure aus dem Patienten,
• - Durchführung einer LCR oder PCR mit geeigneten Primern oder einer Hybridisierungsanalyse mit einer oder mehreren geeigneten Sonden basierend auf einer Nukleinsäuresequenz der Figuren,
• - Nachweis eines amplifizierten Produkts oder einer Hybri­ disierung als Indiz auf das Vorliegen (oder Nichtvorliegung) einer Tumorerkrankung (in Abhängigkeit davon, ob die jeweilige Nukleinsäuresequenz im Tumor im Vergleich zu Kontrollgewebe stärker oder schwächer (bzw. nicht) exprimiert wird.)

Dabei werden Primer verwendet, die eine vorstehend diskutierte Nukleinsäursequenz oder geeignete Teilbereiche flankieren. Diagnostisch von Bedeutung sind dabei Amplifikationsprodukte von mRNA aus dem fraglichen Gewebe, die sich hinsichtlich des Auftretens von Tumor-spezifischen, insbesondere CTCL- spezifischen Banden von den Amplifikationsprodukten von mRNA aus gesundem Gewebe unterscheiden.

In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform kann ein Verfahren angewendet werden, das folgende Schritte umfaßt:

• - Isolierung von RNA aus dem Patienten,
• - Durchführung einer Northern-Analyse mit einer oder mehreren geeigneten Sonden,
• - Vergleich der Konzentration und/oder Länge der entsprechenden mRNA der Patientenprobe mit einer mRNA einer gesunden Person, wobei eine erhöhte bzw. erniedrigte Konzentration an mRNA (in Abhängigkeit von dem entsprechenden Marker; siehe Tabelle 4) im Vergleich zur Kontroll-mRNA aus Normalgewebe indikativ für eine Tumorerkrankung, insbesondere CTCL ist.

Bei diesem Verfahren können dem Fachmann bekannte Methoden bezüglich der Präparation von Gesamt-RNA bzw. poly(A) + RNA aus biologischen Proben, der Auftrennung der RNAs auf nach Größe auftrennenden Gelen, beispielsweise denaturierenden Agarosegelen, der Herstellung und Markierung der Sonde und des Nachweises über "Northern-Blot" angewandt werden.

In einer weiteren alternativen Ausführungsform kann eine mögliche Tumor-Erkrankung auch durch ein Verfahren diagnostiziert werden, das folgende Schritte umfaßt:

• - Gewinnung einer Zellprobe von dem Patienten,
• - Inkontaktbringen der so erhaltenen Zellprobe mit einem oder mehreren von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen kodierten Proteinen oder Fragmenten davon als Sonde(n) unter Bedingungen, die die Bindung von Antikörpern erlau­ ben, wobei die Gegenwart von Antikörpern in der Zellprobe indikativ für eine Tumorerkrankung, insbesondere CTCL ist.

Dieser Nachweis kann ebenfalls unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Standardtechniken durchgeführt werden. Diesem sind auch Zellaufschlußverfahren bekannt, die die Isolierung der Antikörper auf eine solche Weise erlauben, daß diese mit dem Antigen in Kontakt gebracht werden kann. Der Nachweis des gebundenen Antikörpers erfolgt vorzugsweise über Immungssays, beispielsweise Western-Blot, ELISA, FACS oder RIA oder immunhistochemische Verfahren. Vorzugsweise erfolgt dieser über ELISA oder "Dot blot". Zur Etablierung eines ELISA können die vorstehenden Nukleinsäuresequenzen oder Fragmente davon in Expressionsplasmide kloniert und die entspr. Proteine rekombinant hergestellt werden, vorzugsweise als Fusionsproteine mit einem "His-Tag", was deren Aufreinigung erleichtert. Die Proteine werden dann auf Membranen oder andere geeignete Oberflächen aufgetragen, ggf. fixiert und mit adäquat verdünnten Patientenseren inkubiert. Nach den üblichen Waschschritten erfolgt dann eine Inkubation mit einem sekundären markierten Antikörper gemäß Routineverfahren zum Nachweis der gebundenen Patienten-Antikörper. Vorzugsweise werden die Patientenseren mit einer Vielzahl von Markerproteinen (Antigenen) inkubiert, da der Nachweis des Vorhandenseins (oder Fehlens) verschiedener Antikörper besser auf die zugrundeliegende Tumor-Erkrankung schließen läßt und evtl. auch eine Einteilung nach dem Erkrankungsstadium erlaubt.

Weiter betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit zur Durchführung der erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren, der den erfindungsgemäßen Antikörper oder ein Fragment davon, ein vorstehendes Protein (oder davon abgeleitetes Peptid), eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz (als Sonde) oder einen z. B. für PCR oder LCR geeigneten, auf der Sequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen basierenden Primer (oder ein Primerpaar) enthält, gegebenenfalls in Kombination mit einem geeigneten Nachweismittel.

Je nach Ausgestaltung des mit dem erfindungsgemäßen Kit durchzuführenden Diagnoseverfahrens können die in dem Kit enthaltenden Verbindungen (Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Antikörper oder Fragmente davon) an einem geeigneten Träger immobilisiert sein, d. h. in Form eines Chips oder auf einer Membran gebunden vorliegen.

Die Erfindung wird nun weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen

Fig. 1 Nukleinsäuresequenz von se2-5 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 2 Nukleinsäuresequenz von se20-10 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 3 Nukleinsäuresequenz von se57-1 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 4 Nukleinsäuresequenz von se70-2 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 5 Nukleinsäuresequenz von Lg1-2 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 6 Nukleinsäuresequenz von se1-1 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 7 Nukleinsäuresequenz von se2-1 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 8 Nukleinsäuresequenz von se2-2 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 9 Nukleinsäuresequenz von se14-3 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 10 Nukleinsäuresequenz von se20-4 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 11 Nukleinsäuresequenz von se20-7 und ein davon abgleiteter ORF

Fig. 12 Nukleinsäuresequenz von se20-9 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 13 Nukleinsäuresequenz von se33-1 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 14 Nukleinsäuresequenz von se37-2 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 15 Nukleinsäuresequenz von se89-1 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 16 Nukleinsäuresequenz von L14-2 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 17 Nukleinsäuresequenz von L15-7 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 18 Nukleinsäuresequenz von Li9-1 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 19 Nukleinsäuresequenz von Li9-4 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 20 Nukleinsäuresequenz von Lii5-2 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 21 Nukleinsäuresequenz von Lii10-6 und ein davon abgeleiteter ORF

Fig. 22 Nukleinsäuresequenz von Liii4-5 und ein davon abgeleiteter ORF

Die Erfindung wird nun nachfolgend mit Bezug auf die Beispiele beschrieben.

Hinsichtlich der verwendeten Methoden wird neben den in Beispiel 1 angegebenen Verfahren außerdem auf Sambrook, J, Fritsch, E, F. und Maniatis, T. (Molecular cloning; a laboratory manual; second edition; Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989) und Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, 1994-1998) hingewiesen, wobei die nachfolgend erwähnten Techniken, insbesondere Screenen von cDNA-Bibliotheken, Präparation von DNA bzw. RNA, PCR, RT-PCR oder Northern Blot dem Fachmann hinreichend bekannt sind und beherrscht werden.

Beispiel 1 Allgemeine Verfahren (A) Gewebe und Seren

Seren und Tumorgewebe wurden bei diagnostischen oder therapeutischen Routineverfahren mit Einverständnis der Patienten (und der Erlaubnis des zuständigen Ethikkomitees) erhalten. Die Lagerung der Gewebe und Seren erfolgte bei -20°C bzw. -80°C.

(B) Herstellung der von cDNA-Banken

mRNA wurde aus Testis-Proben unter Verwendung eines Kits für RNA-Isolierung ("RNeasy midi kit"; Qiagen, Hilden, Deutschland) und danach eines Kits für mRNA-Isolierung ("oligotex mRNA kit"; Qiagen) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers extrahiert. Für die Konstruktion der λ-ZAP-Expressionsbank ("UNI-ZAP™ XR custom cDNA library"; Stratagene, La Jolla, CA, USA) wurden insgesamt 10,4 µg mRNA verwendet. Die cDNA-Bank bestand aus 10⁶ primären Rekombinanten mit einer Insertionslänge über 0,4 kbp und wurde zu 10¹⁰ Plaque-bildenden Einheiten (pfu) amplifiziert. Für die Konstruktion der CTCL-Bank wurden 4,8 µg mRNA aus verschiedenen Proben von kutanen T- und B-Zell Lymphomen verwendet. Die Zahl der primären Rekombinanten betrug 6 × 10⁷. Das Vorgehen war analog zum vorbeschriebenen Vorgehen bei der Testis-Bank.

(C) Immunscreening

Das Immunscreening wurde wie in Sahin et al. (PNAS USA 92 (1995), 11810-11813) und Türeci et al. (Cancer Res. 56 (1996), 4766-4772) beschrieben durchgeführt. Alle Seren wurden in Tris­ gepufferter Saline (TBS mit 0,2% Trockenmilchpulver, pH-Wert 7,5) verdünnt und mit E.coli-Proteinen (mechanisch aufgebrochen oder durch Phagen ohne Insertion lysiert) vorabsorbiert. Mit rekombinanten λ-ZAP-Phagen transduzierte E.coli wurden auf NZY- Agar bei einer Konzentration von 2000 Plaques/Platte ausplattiert und die Expression der rekombinanten Proteine wurde mittels Isopropyl-β-D-Thiogalactosid induziert. Die Platten wurden bei 37°C ü. N. inkubiert und die Proteine 4 Stunden bei 37°C auf Nitrozellulose-Membranen transferiert und gebunden. Die Membrane wurden mit Tween-20™ (0,05%) enthaltender TBS gewaschen, mit 5% Trockenmilchpulver in TBS abgesättigt und mit Seren (entweder von Patienten oder als Kontrolle von gesunden Personen) bei einer Endkonzentration von 1/100 inkubiert. Reaktive Proteine wurden mit einem Alkalische-Phosphatasegekoppelten sekundären Antikörper (Ziege-anti-human-IgC, Fc- Fragment; Dianova, Hamburg, Deutschland) nachgewiesen und mittels 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat und Nitroblau- Tetrazolium sichtbar gemacht. Positive Phagemids wurden mittels Seren von Patienten mit Mycosis fungoides (n = 15) und Sézary Syndrom (n = 3) sowie gesunden Personen als Kontrolle (n = 10) weiter untersucht. Positive Phagemids wurden zur Monoklonalität subkloniert und einer in vivo-Exzision des "pBluescript"- Plasmids (entsprechend dem Protokoll des Herstellers der Genbank, Stratagene, La Jolla, CA, USA) unterzogen. DNA wurde entsprechend dem Protokoll des Herstellers isoliert ("QIAprep spin miniprep"; Qiagen). Die Größe der Insertionen wurde durch eine SmaI/KpnI-Spaltung und Gelelektrophorese analysiert. Die Sequenzierung wurde mittels eines automatischen Fluoreszenz- Sequenziergeräts (Modell 377; Perkin-Elmer/Applied Biosystems, Forster System, CA, USA) und des Dye-Terminator-Verfahrens entsprechend den Angaben des Herstellers ("ABI PRISM Big Dye Ready Reaction Terminator Cycle Sequencing Kit"; Perkin-Elmer) durchgeführt. Primer wurden chemisch synthetisiert. Die Sequenzen der Klone wurden auf beiden komplementären Strängen vollständig ermittelt.

(D) Tumorgewebe und Zellinien

Von 17 CTCL-Patienten erhaltene Gewebeproben dienten als Quelle für die herstellung von Tumor-cDNA: 13 Mycosis fungoides (Stadium Ib bis IVb, hauptsächlich IIb), 2 Sézary Syndrome (Stadium III), 1 T-Zonen-Lymphom (Stadium IVb) und 1 CD30 + CTCL (Stadium IIb). Außerdem wurden cDNAs von den folgenden 4 CTCL- Zellinien hergestellt: My-La (Mycosis fungoides; Kaltoft et al., In Vitro Cell Dev. Biol. 28a (1992), 161-167), SeAx (Sézary Syndrom; Kaltoft et al., Arch. Dermatol. Res. 280 (1988), 264- 267), HH (Lymphomatoide Papulose; ATCC-Nr.: CRL-2105) und HuT-78 (Sézary Syndrom; ATCC-Nr.: TIB-161). Außerdem wurde cDNA von sechs Leukämie-Zellinien (ARA-10, Jurkat, KG1, K562, Nalm-2 und SKW6.4 und 22 Melanom-Zellinien hergestellt.

Zur Analyse der Gewebeverteilung innerhalb normalen Geweben wurden ausführlich Kontroll-cDNAs verwendet, dazu zählten auch drei Felder von im Handel erhältlichen cDNAs (alle von Clontech, CA, USA): humane "multiple tissue"-cDNA Feld I, Feld II und humanes fötales MTC-Feld. Zusätzlich wurden verschiedene im Handel erhältliche Gesamt-RNAs zur Herstellung weiterer Kontroll-cDNAs mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens erzeugt. Schließlich dienten auch noch cDNAs von drei aktivierten CD8+ T-Zellinien (Möller et al., British Journal of Cancer 77 (1998), 1907-1916) als Kontroll-T-Zellen.

(E) RT-PCR

Aufgrund der eingeschränkten Menge an RNA wurde bevorzugt RT-PCR zur Untersuchung der identifizierten Sequenzen innerhalb verschiedener normaler Gewebe und Tumor-Gewebe verwendet. In ausgewählten Fällen wurden diese Untersuchungen mittels Northern-Blot-Analysen vervollständigt. RT-PCR wurde mittels "MJ Research PCT-200" (Biozym, Oldendorf, Deutschland) mit einer einminütigen Anlagerung bei variabler Temperatur mit 35 Zyklen durchgeführt. Alle RT-PCR wurden in mindestens zwei unabhängigen Experimenten durchgeführt. Die RNA-Isolierung, RT-PCR und die Northern-Blot-Analysen wurden ansonsten gemäß üblicher Standardverfahren und Standardbedingungen durchgeführt. Die Primersequenzen und Annealing-Temperaturen für die verschiedenen Klone sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben:

(F) Northern Blot

10 µg Gesamt-RNA werden auf einem MOPS-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und auf positiv geladene Nylon-Membranen übertragen. Die Sondenmarkierung erfolgt mittels des Roche High Prime Kits mit α-³²P-dCTP. Die Entfernung der nicht eingebauten Nukleotide erfolgt mittels des Qiagen Removal Kits (Fa. Qiagen, Hilden). Die Prähybridisierung wird bei 60°C für 1-2 Stunden durchgeführt. Die Hybridisierung erfolgt bei 60°C vorzugsweise über Nacht. Die Prähybridisierungs- und die Hybridisierungs-Lösungen haben die Zusammensetzung: 10% Dextransulfat, 1% SDS, 10× Denhardts Reagenz, 3 × SSC. Das nachfolgende Waschen erfolgt für 2 × 30 Minuten mit 2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C und dann 2 × 30 Minuten mit 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 65°C. Es wird ein Kodak X-Omat-Film für eine Expositionszeit von 3-10 Tagen aufgelegt.

Beispiel 2 Screenen nach positiven Klonen

Ungefähr 1,9 × 10⁶ rekombinante Klone einer von normalem Testis- Gewebe erhaltenen cDNA-Bank wurden mit Seren von Patienten mit kutanen T-Zell-Lymphomen (CTCL) einschließlich Mycosis fungoides (MF) und Sézary Syndrom gescreent. Es konnten 28 Klone, die 22 verschiedene ORFs bzw. Gene repräsentieren, nachgewiesen werden und diese wurden hinsichtlich serologischer Reaktivität und molekularer Verteilung weiter untersucht. Eine sekundäre Bestätigung wurde durch die Verwendung zusätzlicher Seren von Patienten mit einer positiven Diagnose für Mycosis fungoides (MF) (n = 15) oder Sézary Syndrom (n = 3) und 10 Kontrollseren von gesunden Freiwilligen durchgeführt. Die Reaktivität der Seren der Patienten war mit den Tumorstadium (höchstens Stadium III) assoziiert (Tabelle 2). Dies war jedoch nicht statistisch signifikant (X²-Test und Mann-Whitney U-Test), vermutlich aufgrund der niedrigen Anzahl von Seren mit hohen Tumorstadien. Die Reaktivität der Patienten-Seren war im Bereich von 11% bis 71% von rekombinante Klone identifizierenden Seren.

Tabelle 2

Anzahl positiver Klone in Korrelation mit dem Tumorstadium des Serum-Spenders

Primär Screen einer Testis-cDNA Bank wurde nacheinander mit 17 einzelnen Seren durchgeführt, die von Patienten stammten, die Tumoren im angegebenen Stadium aufwiesen.

Die Anzahl der positiven und gesamten analysierten Plaques sind in der 3. Spalte angegeben. Während des Sekundär Screens wurde jeder positive Plaque (28) mit bis zu 18 individuellen Seren verschiedener Patienten im angegebenen Tumorstadium nachgetestet.

⁽¹⁾ Kumuliert über alle getesteten Seren. ⁽²⁾ Positive Klone dividiert durch Gesamtzahl der getesteten Klone.

Die Anzahl und Wahrscheinlichkeit aller serologischen Antworten sind hinsichtlich des Tumorstadiums der Patienten zusammengefaßt, von denen Serum für das Screenen einer Testis- cDNA-Bank genommen wurde. Obwohl die Daten eine höhere Wahrscheinlichkeit für das Vorhandensein von Antikörpern gegen Tumor-Antigene (mit dem Gipfel bei Stadium III) anzeigen, sind diese Unterschiede nicht statistisch signifikant.

Tabelle 3

Serologische Analysen der identifizierten Klone

Der Prozentsatz der reagierenden und die Gesamtzahl der getesteten Seren (n) während des sekundären Screenens sind angegeben. Bei den Klonen se2-1 und se20-4 ist zusätzlich jeweils einer der homologen Klone angegeben, da diese sich in ihrem Reaktionsmuster unterschieden, vermutlich aufgrund von Sequenzunterschieden.

Fünf Antigene repräsentieren bisher noch nicht bekannte Sequenzen (se2-5, se20-10, se57-1, se70-2 und Lg1-2). Das mittels RT-PCR analysierte RNA-Expressionsmuster der identifizierten Antigene variierte zwischen hocheingeschränkter und ubiquitärer Expression in 28 normalen, 17 CTCL-Tumorgeweben und 33 Tumorzellinien unterschiedlichen Ursprungs (Tabellen 4 und 5).

Tabelle 4

Espressionsanalyse mittels RT-PCR mit Antigen- spezifischen Primern und cDNA von verschiedenen Geweben und Zell-Linien

Die Tabelle gibt die prozentuale Häufigkeit der Expression in verschiedenen Geweben und Zell-Linien nach RT-PCR-Analyse an (Anzahl der Gewebe ist in Klammern; nt: nicht getestet). ⁽¹⁾ RT-PCRs an Testis-cDNA ergab immer positive Ergebnisse. Im Falle von Klonse2-1 war Testis-cDNA die einzige positive Probe. Zusammensetzung der Kontroll-Palette siehe Table 5. ⁽²⁾ Aktivierte zytotoxische T- Zellen. ⁽³⁾ Details zu diesen Ergebnissen siehe Table 5. ⁽⁴⁾ In der Northern blot Analyse negativ.

Tabelle 5

RT-PCR-Analysen mittels spezifischen Primern gegen differentiell esprimierte Sequenzen und "multiple tissue" (MTC)-cDNA

Es wurden entweder kommerziell erhältliche cDNA Paletten verwendet oder cDNA aus RNA paletten hergestellt (Clontech). Jede Probe enthielt cDNA aus Proben mehrerer Individuen. Die Haut cDNA wurde aus einer einzelnen Probe hergestellt.

Beispiel 3 Tumorspezifische Antigene

Sechs Klone (die durch mindestens vier verschiedene Rekombinanten repräsentiert werden) waren zu SCP-1 homolog, einem mit der Meiose in Zusammenhang stehenden Protein (Türeci et al., PNAS USA 95 (1998), 5211-5216). Interessanterweise unterschied sich die serologische Reaktivität verschiedener Seren zwischen den unterschiedlichen SCP-1-Klonen: Klon se2-1 wurde durch Seren von 2/15 MF-Patienten und 2/3 von Patienten mit Sézary Syndrom nachgewiesen. Mittels RT-PCR wurde nachgewiesen, daß se2-1 tumorspezifisch ist. Ein weiterer zu SCP-1 homologer Klon (se37-1) wurde durch 3/9 MF-Seren und 1/3 Sézary Syndrom-Seren nachgewiesen. Dies könnte verschiedene Epitope von SCP-1 widerspiegeln, da die Klone sich in ihrer Länge unterschieden. Klon se33-2 reagierte außerdem auch mit 1/5 Kontrollseren. Interessanterweise kodierte dieser Klon eine weitere Peptidsequenz innerhalb des ersten Leserahmens, die innerhalb der anderen zu SCP-1 homologen Klone nicht vorhanden war und somit ein Autoantigen darstellen könnte, das für die Reaktivität des Kontrollserums verantwortlich ist. Die PCR- Analysen wurden mit den gleichen Primern wie von Türeci et al. (1998) veröffentlicht durchgeführt, die auch zu den SCP-1 homologen Klonen perfekt paßten. Innerhalb aller getesteten normalen Geweben sowie den Tumorproben und Zellinien konnten nur eine Testis-Probe und eine MF-Probe (Patient H. S.) gefunden werden, die SCP-1 mRNA exprimierte. Das positive Ergebnis der MF-cDNA konnte durch Northern-Blot bestätigt werden, der eine Bande von etwa 4,3 kb ergab. Außerdem reagierte das Serum des Patienten H. S. auch mit se2-1 und einem der anderen zu SPC-1 homologen Klone. Desweiteren sind gemäß Northern Blot Analyse die Klone se57-1 und L15-7 Tumor-spezifisch.

Beispiel 4 (A) Antigene mit eingeschränktem Expressionsmuster und (B) ubiquitär exprimierte Antigene

Nachfolgend werden 13 Antigene mit differentieller oder ubiquitärer Expression (nachgewiesen über RT-PCR) beschrieben (siehe Tabellen 4 und 5).

(A)

Für fünf neue Antigene (se2-5, se20-10, se57-1, se70-2 und Lg1- 2) und zwei Antigene mit Homologien zu bekannten Genen (se33-1: NP220; se89-1: mit Retinoblastom in Zusammenhang stehendes Protein RAP140) zeigte sich eine differentielle Expression auf molekularer Ebene. Die serologische Reaktivität gegen diese Klone (definiert als Prozentsatz reaktiver Seren während des sekundären Screenens) betrug im Durchschnitt 31%. Eine geringe Reaktivitätsrate zeigte sich gegenüber den Klonen se20-10 und se70-2 (2/18 bzw. 1/18 reaktive Seren), während 71% der Seren von CTCL-Patienten (n = 14) mit dem Klon se89-1 positiv reagierten. Alle 6 Klone zeigten mit bis zu 10 Kontrollseren keine Reaktion.

Es wurde begonnen, die RT-PCR-Ergebnisse mittels Northern Analysen zu quantifizieren. Solche Antigene, die sich in Normal- Geweben im Vergleich zu Tumorproben nicht als gleich stark exprimiert erweisen, werden als potentielle Therapeutika eingestuft.

Mittels RT-PCR-Analysen konnte gezeigt werden, daß die se-2-5- spezifische mRNA beinahe ubiquitär innerhalb normaler Gewebe exprimiert wird, jedoch nicht in aktivierten T-Zellen und nur in lediglich 55% der CTCL-Gewebeproben. Im Gegensatz dazu ergab die Northern-Blot-Analyse selbst innerhalb normaler Gewebe ein eingeschränktes Expressionsmuster. Starke Signale waren in Niere, Luftröhre und Testis nachweisbar, schwächere in Kolon, Dünndarm, Thymus, Knochenmark und Magen. Während in allen positiven normalen Geweben drei Banden nachweisbar waren (5,2, 4,2 und 3,9 kB) zeigte die einzige positive CTCL-Zellinie SeAx ein Signal bei 3,9 kb.

Spezifische mRNAs für die Klone se20-10 und se57-1 wurden mittels RT-PCR in 43% bzw. 21% der untersuchten Kontrollgewebe gefunden. Interessanterweise war die Expression der für se57-1 spezifischen mRNA in allen Tumorgeweben und Zellinien sehr stark herunterreguliert. Im Gegensatz dazu war die Expression der mRNA von Klon se70-2 im Vergleich zu normalen Geweben (54%) innerhalb der CTCL- und Leukämie-Zellinien hochreguliert (100%), während die CTCL-Gewebe und Melanom-Zellienen mittlere Expressionsspiegel zeigten (33% bzw. 45%). Unter den Kontrollgeweben waren alle fötalen Gewebe in der RT-PCR positiv.

Für zwei Antigene mit Homologien zu bekannten Sequenzen zeigte sich eine differentielle Expression: se33-1 cDNA ist homolog zu NP220, einem DNA-bindenden Protein, und se89-1 cDNA ist homolog zu RAP140, einem Retinoblastom-assoziierten Klon. Klon se33-1 zeigte innerhalb einer überlappender Strecke von 3830 bp am 3'- Ende von NP220 99% Ähnlichkeit, dieser Klon ist jedoch am 5'- Ende verkürzt, was zu einem verkürzten ORF führt. Die RT-PCR (unter Verwendung se33-1-spezifischer Primer) erbrachte den Nachweis von mRNA in 6/8 fötalen und 16/20 normalen Geweben (Tabelle 5) sowie innerhalb von CTCL-Geweben (12/16), aktivierten zytotoxischen T-Zellen und in den meisten Zellinien (Tabelle 4).

cDNA des Klons se89-1 zeigte 98% Ähnlichkeit zu RAP140 innerhalb eines überlappenden Bereichs von 3444 bp und eine Lücke von 60 bp, die innerhalb des ORF liegt und zu einer Aminosäure-Lücke von 20 Aminosäuren führt. RT-PCR wurde mit verschiedenen Primern durchgeführt: Zuerst mit der Primerkombination RAP140 (siehe Tabelle 1 sowie Beispiel 1), wobei sowohl RAP140 als auch se89-1 nachgewiesen wurden und sich drei Banden in Testis DNA und zwei Banden in verschiedenen anderen cDNAs zeigten. Zur Spezifizierung der Expression von se89-1 wurde ein neuer reverser Primer (s. Tabelle 1) entworfen, der die Lücke innerhalb se89-1 überspannt. Unter Verwendung dieses Primers zusammen mit dem Vorwärts-Primer gegen RAP140, der ebenfalls se89-1 nachweist, wurde nur eine Bande amplifiziert. Die Häufigkeit der positiven cDNAs zu den se89-1-spezifischen Primer unterschied sich nicht wesentlich zwischen den Kontrollgeweben (79%), CTCL-Geweben (75%) und Zellinien (CTCL- und Leukämie- Zellinien: 100%, Melanom-Linien: 73%). Mittels Northern-Blot- Analysen konnte die Gegenwart von für se89-1 spezifischer mRNA innerhalb von mRNA bestätigt werden, die von Hirn, Niere, Kolon und Testis und der CTCL-Linie SeAx stammte.

(B)

Sechs zu bekannten Sequenzen homologe Antigene (se1-1, se2-2, se14-3, se20-4, se20-9 und se37-2) erwiesen sich als ubiquitär exprimiert. In allen Kontrollgeweben (n = 28) war für diese Klone spezifische mRNA über RT-PCR nachweisbar. In den zwei Klonen sel4-3 und se20-4 waren alle Tumorgewebe und Zellinien ebenfalls in der RT-PCR positiv. Im Gegensatz dazu wurden die Klaue se2-2, se20-7, se20-9 und se37-2 nur in einer Untergruppe der Melanom- und Leukämie-Zellinien exprimiert, während CTCL-Gewebe und CTCL- Zellinien einen höheren Prozentsatz von in der RT-PCR positiven cDNAs zeigten.

Die Reaktivität von Patientenseren mit diesen Klonen lag im Durchschnitt bei etwa 29%, wobei auch zwei Extreme zu beobachten waren: Die Reaktivität gegen den Klon se14-3 zeigte sich in 11% (1/9) und gegen den Klon se1-1 in 50% (5/10) CTCL-Seren. Zwei Kontrollseren (n = 10) reagierten mit Klon se20-6, der zu Klon se20-4 homolog ist. Für se20-6 konnte gezeigt werden, daß dieser für ein unterschiedliches Peptid (72 aa) im ersten Leserahmen kodiert, das weder in se20-4 noch seinem homologen Gen HRIHFB2216 vorhanden war. Die Sequenzanalyse dieser Klone und ein Vergleich mit den homologen Gegenstücken offenbarte in einigen Fällen Insertionen, Deletionen oder Elongationen.

Es muß betont werden, daß alle getesteten Klone serologisch spezifisch sind.

Claims (21)

1. Nukleinsäurequenz, deren veränderte Expression mit einer Tumor-Erkrankung assoziiert ist, wobei die Nukleinsäuresequenz se2-5 (Fig. 1), se20-10 (Fig. 2), se57-1 (Fig. 3), se70-2 (Fig. 4) oder Lg1-2 (Fig. 5) umfaßt.

2. Diagnostische Zusammensetzung, die eine Nukleinsäuresequenz enthält, deren veränderte Expression mit einer Tumor-Erkrankung assoziiert ist, wobei die Nukleinsäuresequenz se2-5 (Fig. 1), se20-10 (Fig. 2), se57-1 (Fig. 3), se70-2 (Fig. 4), Lg1-2 (Fig. 5), se1-1 (Fig. 6), se2-1 (Fig. 7), se2-2 (Fig. 8), se14-3 (Fig. 9), se20-4 (Fig. 10), se20-7 (Fig. 11), se20-9 (Fig. 12), se33-1 (Fig. 13), se37-2 (Fig. 14), se89-1 (Fig. 15), L14-2 (Fig. 16), L15- 7 (Fig. 17), Li9-1 (Fig. 18), Li9-4 (Fig. 19), Lii5-2 (Fig. 20), Lii10-6 (Fig. 21) oder Liii4-5 (Fig. 22) umfaßt.

3. Arzneimittel, das eine Nukleinsäuresequenz enthält, deren veränderte Expression mit einer Tumor-Erkrankung assoziiert ist, wobei die Nukleinsäuresequenz se20-10 (Fig. 2), se57-1 (Fig. 3), Lg1-2 (Fig. 5), se1-1 (Fig. 6), se2-1 (Fig. 7), se2-2 (Fig. 8), se14-3 (Fig. 9), se20-7 (Fig. 11), se20-9 (Fig. 12), se33-1 (Fig. 13), se37-2 (Fig. 14), L14-2 (Fig. 16), L15-7 (Fig. 17), Li9-1 (Fig. 18), Li9-4 (Fig. 19), Lii5-2 (Fig. 20), Lii10-6 (Fig. 21) oder Liii4-5 (Fig. 22) umfaßt.

4. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1, diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder Arzneimittel nach Anspruch 3, wobei die Nukleinsäuresequenz, deren veränderte Expression mit einer Tumor-Erkrankung in Zusammenhang steht, eine Nukleinsäuresequenz umfaßt,

• a) die sich von einer in Anspruch 1, 2 oder 3 definierten Nukleinsäuresequenz in der Codonsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet;
• b) die mit einer in einem der Ansprüche 1, 2, 4 oder 4(a) definierten Nukleinsäuresequenz hybridisiert; oder
• c) die ein Fragment, eine allelische Variante oder eine andere Variante einer in einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4(a) oder 4(b) definierten Nukleinsäuresequenz ist.

5. Nukleinsäuresequenz entsprechend der Definition nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die eine cDNA oder genomische DNA ist.

6. Vektor, die Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthaltend.

7. Transformante, die den Vektor nach Anspruch 6 enthält.

8. Protein, dessen veränderte Konzentration mit einer Tumor- Erkrankung in Zusammenhang steht und das von einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert ist.

9. Antikörper, gerichtet gegen das Protein von Anspruch 8.

10. Diagnostische Zusammensetzung, die den Vektor nach Anspruch 6, ein von einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 2 bis 5 kodiertes Protein oder einen gegen dieses Protein gerichteten Antikörper enthält.

11. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 10 zur Diagnose oder Verlaufskontrolle einer Tumorerkrankung.

12. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder 11, wobei diese in Form eines ELISA, Protein-Chips, Nukleinsäure- Chips oder einer mit DNA, RNA oder Protein beladener Membran bereitgestellt wird.

13. Arzneimittel, das den Vektor nach Anspruch 6, ein von einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 3 bis 5 kodiertes Protein oder einen gegen dieses Protein gerichteten Antikörper enthält.

14. Arzneimittel nach Anspruch 13 zur Therapie von Tumorerkrankungen.

15. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Diagnose und/oder Therapie einer Tumorerkrankung.

16. Verwendung eines von einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 kodierten Proteins zur Diagnose und/oder Therapie einer Tumorerkrankung.

17. Verwendung eines gegen ein von einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5 kodierten Proteins gerichteten Antikörpers zur Diagnose und/oder Therapie einer Tumorerkrankung.

18. Verwendung nach Anspruch 15 oder 17 als Vakzinierungsmittel

19. Verwendung nach Anspruch 16 zur Erzeugung Peptid-beladener Antigen-präsentierender Zellen (APC).

20. Verwendung nach Anspruch 16 zur Erzeugung tumorspezifischer T-Zellen.

21. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 oder 5, diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 2, 5, 10, 11 oder 12, Arzneimittel nach Anspruch 3, 13 oder 14, Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 20, wobei der Tumor CTCL ist.