JP2005189228A - 肺癌、食道癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、胃癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、膵癌、膀胱癌の診断及び治療方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 この発明は、肺非小細胞癌を含む特定の癌の診断及び治療方法、又は診断キットを提供することを目的とする。
【解決手段】 本発明は、肺非小細胞癌、食道癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、胃癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、膵癌、膀胱癌を、抗ＡＫＲ１Ｂ１０モノクローナル抗体を用いた免疫学的手法で診断する方法又は診断キットと、ＡＫＲ１Ｂ１０の細胞内局在を制御する癌の治療方法を提供する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、肺癌、食道癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、胃癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、膵癌、膀胱癌、特に肺非小細胞癌に特異的な腫瘍マーカーに関する。

肺癌は世界的に増加傾向にあり、日本においても男性の癌死亡率の第１位であり、女性でも第２位を占める。また肺癌の５年生存率は２５〜３０％といわれており、早期かつ正確な診断が強く望まれている。

肺癌は小細胞癌と非小細胞癌に分類されるが、非小細胞癌が肺癌の８０〜８５％を占める。非小細胞癌に属する肺腺癌及び扁平上皮癌において、進行癌で行われる化学療法は奏功率が５０％以下と有効性が低いため、早期に癌を発見することが急務となっている。肺癌の診断は、主に形態学的及び病理学的診断を組み合わせて行っている。まず、胸部エックス線、コンピューティド・トモグラフィー（ＣＴ）検査といった形態学的診断によって癌の存在を確認した上で、喀痰、経気管支鏡的肺組織生検、胸腔鏡下肺生検などによって採取された検体に対する病理学的診断を行う。免疫組織化学は、進行度や組織型の情報も得られることより、肺癌、特に肺非小細胞癌の陽性率が高い抗体が必要とされている。

近年、ＤＮＡチップによる遺伝子解析技術が開発され、包括的かつ網羅的な遺伝子の発現解析を行うことが可能になっている。この方法の応用として、癌に特異的に発現する遺伝子を選出することが行われている。肺癌においてもＤＮＡチップによる包括的な遺伝子の発現解析が行われている。たとえば、既知の腫瘍マーカーであるＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）等の分子の発現が亢進することが確認されており、ＤＮＡチップによる腫瘍マーカーの探索の有効性が期待される一方で、臨床的に有効な肺癌標的分子は、未だ同定されていない状況である。
アルド‐ケト‐リダクターゼファミリー１メンバーＢ１０（ａｌｄｏ−ｋｅｔｏ−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｆａｍｉｌｙ １， ｍｅｍｂｅｒ Ｂ１０）は、４０を超えるアルド‐ケト‐リダクターゼファミリーの一つである。消化された食物由来の反応性アルデヒドの解毒に主に関与することが示唆されており（非特許文献１）、正常組織では副腎、小腸、大腸で発現が認められている。ＡＫＲ１Ｂ１０は、蛋白代謝、シグナル伝達に関与することが推測されているが（非特許文献２）、詳細はわかっていない。さらに、肝癌で発現が亢進することが報告されており、肝癌及び薬剤耐性への関与を示唆されている（非特許文献３及び４）。しかしながら、肝癌以外の癌種に関する報告やこの分子を診断に応用する試みはこれまでになされていない。
カオ（Cao） D.ら 「ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）」，１９８８年，第２７３巻，１９号，ｐ１１４２９−１１４３５ タン（Tang）ＤＮら 中華外科雑誌（Zhonghua Wai Ke Za Zhi），２００３年，第４１巻，３号，ｐ１８０−１８２ タン（Tang）ＤＮら 中華肝臓病雑誌（Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi），２００２年，第１０巻，６号，ｐ４４５−４４８ ワールド ジャーナル オブ ガストロエンテロロジー（World Journal of Gastroenterology），２００３年，第９巻，７号，ｐ１４５５−１４５９

本発明は、ＡＫＲ１Ｂ１０の検出によって、肺癌、食道癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、胃癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、膵癌、膀胱癌、特に肺非小細胞癌を診断する方法及び診断キットを提供する。また、本発明は、ＡＫＲ１Ｂ１０の細胞内局在の変化を伴う細胞の異常を標的とした癌治療法を提供する。

本発明者らは、肺癌をはじめとする疾患の診断及び治療の標的を同定するために、正常組織、癌細胞株及び各種癌組織におけるＤＮＡチップによる遺伝子の発現解析を行ってきた。その結果、正常肺組織では発現していないが、肺癌で発現が亢進している遺伝子群を抽出することに成功した。その中でも、ＡＫＲ１Ｂ１０のｍＲＮＡが多くの肺非小細胞癌組織で発現が亢進していることが確認された。また、発明者らが作製した抗ＡＫＲ１Ｂ１０モノクローナル抗体を用いた免疫学的手法によって、ＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質が肺非小細胞癌で発現が亢進していることが認められ、ＡＫＲ１Ｂ１０が肺非小細胞癌のマーカーであることが支持された。同様に、食道癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、胃癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、膵癌、膀胱癌においても発現が亢進していることを癌細胞株を用いた免疫学的手法によって実証した。また、本発明者らが行った抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体を用いた細胞内局在の解析の結果、細胞の状態によってＡＫＲ１Ｂ１０が細胞質と核を行き来していることを見いだし、ＡＫＲ１Ｂ１０の細胞内局在を制御することが癌の治療に有効であることが示された。

このように、発明者らはＡＫＲ１Ｂ１０を特異的に認識するモノクローナル抗体を作製し、ＡＫＲ１Ｂ１０の遺伝子及びタンパク質の量が肺癌、食道癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、胃癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、膵癌、膀胱癌、特に肺非小細胞癌において発現が亢進していることを明らかにした。さらに、ＡＫＲ１Ｂ１０の細胞内局在が変化することを示し、癌における機能がわかっていないＡＫＲ１Ｂ１０の役割を明らかにした。これらの知見は、ＡＫＲ１Ｂ１０が肺非小細胞癌などの癌において有効な腫瘍マーカーになることを示しており、さらにはＡＫＲ１Ｂ１０が癌を抑制する標的であることを示している。

すなわち、本発明はＡＫＲ１Ｂ１０を癌の診断及び治療の標的とする方法に関し、具体的には（１）生体試料中のＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質を免疫学的手法により検出する癌の判定方法、及び（２）生体試料中のＡＫＲ１Ｂ１０をコードするｍＲＮＡ量を測定することを特徴とする癌の判定方法に関する。また、（３）ＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質の細胞内局在を制御する癌の治療方法に関する。特に（４）これらの診断方法又は治療方法が肺組織を用いる場合に関する。（５）肺癌の診断のためのＡＫＲ１Ｂ１０の検出が抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体を用いる免疫学的検出であり、肺癌の中でも特に（６）肺非小細胞癌の判定を行う方法、及び（７）肺非小細胞癌の判定を行うキットに関する。（８）肺非小細胞癌を診断するこれらの方法及びキットが血液を用いたものに関する。同時に本発明は、（９）抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体を用いた食道癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、胃癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、膵癌、膀胱癌の判定方法であり、（１０）抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体を用いた食道癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、胃癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、膵癌、膀胱癌の診断キットに関する。

このように、本発明はＡＫＲ１Ｂ１０の遺伝子及びタンパク質の検出に基づく肺癌、食道癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、胃癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、膵癌、膀胱癌の診断方法、及び治療方法を提供する。このＡＫＲ１Ｂ１０は、肝癌組織でも検出されるが、癌周囲の肝硬変組織でも検出されることが少なくなく、必ずしも肝癌に特異的ではない（非特許文献３及び４）。従って、従来、腫瘍マーカーとしては用いられていない。肺組織では、ＡＫＲ１Ｂ１０は正常部で検出されず、癌組織で多量に発現していることは、これら従来の報告からは予測できないことであった。

肺癌の中でも、非小細胞癌に属する肺扁平上皮癌及び肺腺癌でＡＫＲ１Ｂ１０のｍＲＮＡの発現が正常組織に比べて、亢進していることが明らかとなった。同様に、タンパク質を検出するウェスタン・ブロッティング法では、同一患者の正常部と癌部におけるＡＫＲ１Ｂ１０の発現量の比較を行ったところ、すべての肺扁平上皮癌の患者の正常部ではＡＫＲ１Ｂ１０が検出されなかったことに対して、すべての扁平上皮癌の癌部ではＡＫＲ１Ｂ１０が検出されたことより、癌の発生、進展にともなって発現量の亢進する分子であることが明らかとなった。

これまでに、肺癌の腫瘍マーカーとしてサイトケラチン１９フラグメント（ＣＹＦＲＡ）がよく知られている。ＣＹＦＲＡはサイトケラチンが血液中のタンパク質分解酵素で断片化されたフラグメントであり、既存の方法は癌患者の血液中に存在するこのフラグメントを検出している。この方法の原理からわかるように、ＣＹＦＲＡは血液を用いた診断に限定されている。同じく、血液検査による肺癌のマーカーである扁平上皮癌関連抗原（ＳＣＣ）も血液検査に限定されている。
一方で、肺癌の精密な検査には、細胞診といった形態学的診断、及び免疫組織化学による病理診断が行われる。本発明者らが作製した抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体による免疫組織化学では、肺非小細胞癌に特異的に染色が認められた。このことは、抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体を用いた免疫組織化学による肺非小細胞癌の診断が可能になることを示している。血液検査のみでは癌であることを決定できない。一方で、免疫組織化学は、単に癌であるかないかといった情報を提供するだけではなく、組織型と比較することより、癌の進行度に関する情報を提供する。すなわち、免疫組織化学で肺非小細胞癌を判断できる方法が求められている。本発明者らによる抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体による免疫組織化学の結果は、肺非小細胞癌である肺扁平上皮癌の１２例中９例（７５％）でＡＫＲ１Ｂ１０が陽性を認める結果となった。免疫組織化学による肺扁平上皮癌の診断で７５％と高い陽性率を示すマーカーがこれまで存在しなかったことより、本発明が提供する抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体による肺非小細胞癌の診断が非常に有効であることが示唆される。そして、本発明はＡＫＲ１Ｂ１０に対する抗体を用いた診断法であることより、血液検査への応用も提供する。

なお、本発明者らは、ＡＫＲ１Ｂ１０の精度の高い細胞内局在解析を初めて行い、細胞株においてＡＫＲ１Ｂ１０が集密度によって核と細胞質を行き来していることを示した。同時に、臨床検体における免疫組織化学の結果、一部の癌細胞でＡＫＲ１Ｂ１０が核に局在することを示す結果も得られている。肺癌でＡＫＲ１Ｂ１０の発現が亢進している患者に、ＡＫＲ１Ｂ１０の細胞内局在を制御することで細胞の癌化を押さえることが期待される。
このように、本発明は、単に癌で発現が亢進している分子を標的にしたものでなく、癌のメカニズムに関連した分子をマーカーとしており、肺癌の診断及び治療に大きく貢献すると考えられる。

本発明は、ＡＫＲ１Ｂ１０の遺伝子及びタンパク質を検出することで、肺癌、食道癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、胃癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、膵癌、膀胱癌、特に肺非小細胞癌の診断方法及び診断キット、そしてＡＫＲ１Ｂ１０の細胞内局在の変化を制御することに基づく癌の治療方法を提供する。
以下、本発明について詳細に説明する。

本発明のＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質は、下記（ａ）又は（ｂ）に示すタンパク質である。
（ａ）配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（以下、「タンパク質（ａ）」という）。タンパク質（ａ）には、配列番号１と同一のアミノ酸配列を持つがアルド−ケト−リダクターゼファミリー１メンバーＢ１０（ＡＫＲ１Ｂ１０）でない名前のついたタンパク質も含む。例えばaldose reductase-like 1 、small intestine reductase 、aldose reductase-like peptide 、aldose reductase-related protein、aldo-keto reductase family 1, member B11 (aldose reductase-like)である。
（ｂ）配列番号１記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアルド−ケト−リダクターゼ活性を有するタンパク質（以下、「タンパク質（ｂ）」という）。
タンパク質（ａ）及び（ｂ）には、翻訳後修飾されたタンパク質及び翻訳後修飾されていないタンパク質のいずれもが含まれる。翻訳後修飾される位置、種類は１又は複数個である。翻訳後修飾とは、リン酸化、糖化、アセチル化、ミリストイル化等があげられる。タンパク質（ａ）及び（ｂ）には、医薬的に許容される塩も含まれる。
タンパク質（ｂ）は、ＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質が特異的又は非特異的に分解されたポリペプチドも含まれる。その長さは１０アミノ酸以上が好ましい。

本発明のＡＫＲ１Ｂ１０をコードするｍＲＮＡとは、下記（ａ）又は（ｂ）に示す遺伝子である。
（ａ）配列番号２記載の塩基配列を鋳型とするポリヌクレオチド（以下、「ポリヌクレオチド（ａ）」という）。ポリヌクレオチド（ａ）には、配列番号２記載の塩基配列を鋳型とする塩基配列を持つがアルド−ケト−リダクターゼファミリー１メンバーＢ１０（ＡＫＲ１Ｂ１０）でない名前のついたポリヌクレオチドも含む。例えばaldose reductase-like 1 、small intestine reductase 、aldose reductase-like peptide 、aldose reductase-related protein、aldo-keto reductase family 1, member B11 (aldose reductase-like)である。
（ｂ）配列番号２記載の塩基配列を鋳型とするポリヌクレオチドどストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドからなり、かつアルド−ケト−リダクターゼ活性を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡ（以下、「ポリヌクレオチド（ｂ）」という）。
ポリヌクレオチド（ａ）又は（ｂ）は、ＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームとその５'末端及び／又は３'末端にある非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことができる。ここでストリンジェントな条件としては、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中５０℃、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中６０℃等が挙げられる。

本発明の判定方法は、臨床検体におけるタンパク質（ａ）又は（ｂ）の発現亢進が関与する疾患に罹患しているか否かを判定する工程を含む。疾患とは、例えば、肺癌、食道癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、胃癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、膵癌、膀胱癌である。本発明は、ＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質の検出のみで判定する場合に限定されず、他の診断方法と併せて使用される場合も含まれる。

本発明の癌の判定方法に用いられる生体試料としては、（ａ）組織、（ｂ）採取した組織の培養物、（ｃ）組織抽出物、（ｄ）癌患者の喀痰、（ｅ）尿、又は（ｆ）血液等が挙げられる。免疫組織化学による判断では（ａ）〜（ｄ）を用いるのが望ましい。当該組織は、バイオプシーにより採取できる。採取した組織は、免疫組織染色する場合にはパラフィン包埋又は凍結して用いることもできる。

本発明が提供するＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質の検出方法は、抗体を用いた免疫学的手法に基づく。免疫学的手法は当業者に公知の数多くの手段によって達成され、ウェスタン・ブロッティング法、免疫組織化学法、酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、放射能免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）が含まれる。
具体的には、ウェスタン・ブロッティングであれば、当該臨床検体から得られたタンパク質をポリアクリルアミド電気泳動で分子量の違いで分離し、ポリビリニデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜又はニトロセルロース膜に転写を行う。その後、抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体を作用させ、引き続き、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ蛍光色素、ビオチンなどで標識された抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体を認識する抗体、すなわち二次抗体を作用させることで検出を行う。検出は抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体を直接標識して行っても良い。タンパク質のサイズでＡＫＲ１Ｂ１０であることを確認する。このサイズはＡＫＲ１Ｂ１０の全長のタンパク質であってもよいし、翻訳後修飾されたＡＫＲ１Ｂ１０、又は分解されたＡＫＲ１Ｂ１０の断片のいずれでもよい。免疫組織化学であれば、バイオプシー又は手術により切除された組織などに抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体を用いて組織中のＡＫＲ１Ｂ１０を検出する。同時に、ヘマトキシリンエオジン (ＨＥ)染色を行うことで、組織型とＡＫＲ１Ｂ１０の発現量の関係を知ることができる。免疫測定法では、物理吸着や化学結合により抗体を結合させた固相担体（例えば、イムノプレート、ラテックス粒子等）を用いて、検体中のタンパク質（ａ）又は（ｂ）を捕捉した後、捕捉されたタンパク質（ａ）又は（ｂ）を、固相担体に固定化された抗体とは別の抗原認識部位をもつ標識化抗体を用いて検出、定量ができる。また、固相担体に検体を固相し、標識化抗体を用いて検出、定量することも可能である。

抗体は大別してポリクローナル抗体とモノクローナル抗体に分けられる。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位を認識することより、特異性が高いことが知られている。本発明による免疫学的手法は、モノクローナル抗体を用いることが望ましい。すなわち、本発明は、モノクローナル抗体のみ、又はモノクローナル抗体とポリクローナル抗体の組み合わせによりタンパク質を検出することを提供する。

本発明の抗体は、生体から得られた内在性タンパク質又は組換えタンパク質のいずれを免疫原としたものでもよい。抗体を作製する際の免疫原であるが、ＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質の全長又はその断片のいずれでもよい。また、合成ペプチドを免疫原としてもよいが、その長さは１０アミノ酸を超えることが望ましい。組換えタンパク質を産生する宿主は限定されるものではなく、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞などであり、無細胞合成系によるタンパク質の産生も含む。組換えタンパク質には、融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質とは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース融合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧ配列、Ｘｐｒｅｓｓ配列等との融合タンパク質である。抗体を産生する動物は、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、モルモット、ラクダなどの哺乳動物があるが、ＡＫＲ１Ｂ１０を特異的に認識する抗体であれば動物種は限定しない。

ＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を測定する判定方法は、正常組織及び癌組織から得られるＡＫＲ１Ｂ１０のｍＲＮＡの発現量の変化の測定を含むものである。ｍＲＮＡの発現量の変化とは、転写レベルの異常、ｍＲＮＡの安定性の異常に基づくものである。これらの異常は、検体におけるｍＲＮＡの存在量に基づいて測定できる。遺伝子の発現の変化は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法、ＤＮＡチップ、in situ hybridization法、ノーザン・ブロッティングなどの当業者に公知の数多くの手段によって達成することができる。また、発現量の変化が、遺伝子の塩基の変異に起因するタンパク質の機能低下及び遺伝子の発現制御を行う転写制御領域の塩基の変異に基づくこともあることより、塩基の変異の検出によって癌の診断を行うことができる。塩基の変異の検出は当業者に公知の数多くの手段によって達成することができる。ｍＲＮＡの検出は部分配列又は全長配列のいずれかで行う。部分配列である場合には、１５塩基以上が望ましい。検出の対象とする配列は、他のｍＲＮＡと相同性のない限り制限されない。ポリヌクレオチド（ｂ）には、スプライシングの異常によって発生した転写産物も含まれる。転写の異常によって発生した転写産物は、野生型のＡＫＲ１Ｂ１０と通常３０％、好ましくは５０％以上の相同性を有する。

本発明者らは均一の性質をもつ細胞株の細胞内局在解析の結果、細胞の集密度によってＡＫＲ１Ｂ１０の局在が変化することを見いだしている。細胞の集密度は、細胞の増殖や細胞周期に密接に関係している。本発明者らによって得られた知見からＡＫＲ１Ｂ１０が細胞周期を制御していることが明らかにされていることより、本発明はＡＫＲ１Ｂ１０の細胞内局在を制御することで癌細胞の増殖を抑えることを提供する。すなわち、本発明はＡＫＲ１Ｂ１０の細胞内局在を変化させることを目的とした抗体ならびに抗癌剤や低分子化合物を治療に用いる方法である。ＡＫＲ１Ｂ１０の細胞内局在を変化させる抗癌剤や低分子化合物とは、ＡＫＲ１Ｂ１０に直接、又は間接的に結合し、局在の変化をもたらすものである。医薬的に投与が可能なＡＫＲ１Ｂ１０に結合するポリペプチド又はポリペプチドの誘導体も含む。抗癌剤や低分子化合物の分子量は通常１０，０００以内、好ましくは３，０００以内である。ポリペプチド又はその誘導体は通常３０アミノ酸以内、好ましくは２０アミノ酸以内が望ましい。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。

［実施例１］ヒト肺癌組織ならびにヒト正常肺組織における遺伝子発現解析
（１）ＤＮＡチップ解析
分化度やステージの異なる１２例の肺腺癌、５例の肺扁平上皮癌、１０例の肺小細胞癌から摘出された組織の癌部及び１例の正常肺（表１）より、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社）を用いて添付の方法に従い全ＲＮＡを抽出した。続いて、肺扁平上皮癌、肺腺癌、肺小細胞癌ならびに正常肺におけるｍＲＮＡの発現量をジーンチップＨＧ−Ｕ１３３バージョンＡ及びＢ（Gene Chip HG-U133 version A and B；アフィメトリックス社製）を用いて解析した。すなわち、肺腺癌に関しては１２例分より調製した全ＲＮＡをそれぞれ等量ずつ混合したもの、扁平上皮癌に関しては５例別々に、小細胞癌に関しては１０例別々にそれぞれ５μｇを、また対照として１例の正常肺より調製した全ＲＮＡ ５μｇを試料として用い、発現解析技術マニュアル（Expression Analysis Technical Manual；アフィメトリックス社製）に準じて遺伝子の発現解析を行った。それぞれの解析における全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、各遺伝子の発現量は相対値とした。すでに解析済みの正常組織遺伝子の発現解析の結果と比較した結果、図１に示すように、ＡＫＲ１Ｂ１０のｍＲＮＡの発現量の値が正常肺組織では３であったのに対し、５例の肺扁平上皮癌では１０１、１３８５、３４７０，１１１，２９１１で、肺腺癌組織では８１とＡＫＲ１Ｂ１０は肺非小細胞癌で強く発現していることが判明した。

（２）半定量的ＰＣＲ
ＡＫＲ１Ｂ１０の遺伝子の発現量の比較を、正常肺５例、肺扁平上皮癌９例、肺腺癌１２例、肺小細胞癌１０例における半定量的ＰＣＲで行った。ＰＣＲに用いるプライマーは、ＡＫＲ１Ｂ１０の遺伝子である配列番号２の６４４番目から６６６番目までの塩基をＰＣＲプライマー（配列番号３）とし、配列番号２の９１７番目から９３４番目までの配列をアンチセンス方向のＰＣＲプライマー（配列番号４）として設計した。肺腺癌組織１２例に関してはジーンチップ解析時に調製した全ＲＮＡを使用し、一方、摘出肺から調製された正常肺組織４例に関しては上記と同様の方法により全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡより逆転写酵素スーパースクリプトＩＩ（SuperscriptII；インビトロジェン社製）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成したものをそれぞれ鋳型ＤＮＡとしＰＣＲ反応を行い、各組織におけるｍＲＮＡ発現量を比較した。各２５μＬのＰＣＲ反応液は、５００ｍＭ 塩化カリウム，１００ｍＭ トリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（ｐＨ８．３），２０ｍＭ 塩化マグネシウム，０．１％ゲラチン、各１．２５ｍＭ デオキシヌクレオチド三リン酸（デオキシアデニル三リン酸，デオキシシチジル三リン酸，デオキグアニルル三リン酸，デオキシチミジル三リン酸）、１μＬの一本鎖ｃＤＮＡ、５ｐｍｏｌｅずつのセンスプライマー（配列番号５）、アンチセンスプライマー（配列番号６）、０．２５μLの組換えＴａｑポリメラーゼを含むように調製した後、初めに９４℃で３分間一次変性を行い、９４℃で１５秒、５７℃で１５秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３５回行なった。また、各検体から得られたＲＮＡ中のヒトβ−アクチン遺伝子発現量もヒトβ−アクチンに特異的なセンスプライマー（配列番号７）ならびにアンチセンスプライマー（配列番号８）を用い上記と同様に解析を行った。ＰＣＲ法により増幅された産物は１．０％アガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色にて検出を行った（図２、図３）。
その結果、正常肺では５例すべてで、肺小細胞癌では１０例中すべてでＡＫＲ１Ｂ１０のｍＲＮＡが検出されなかった一方で、肺扁平上皮癌組織の９例中９例すべてで、肺腺癌では１２例中７例でＡＫＲ１Ｂ１０のｍＲＮＡの発現が亢進していることが確認された。 肺非小細胞癌におけるＡＫＲ１Ｂ１０のｍＲＮＡの発現の亢進は、ＰＣＲ反応の各サイクルでＰＣＲ産物を定量する定量的ＰＣＲによって確認した。

（３）定量的ＰＣＲ
定量的ＰＣＲはｉＣｙｃｌｅｒ（バイオラッド社製）を用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲで得られたｃＤＮＡ１μＬを鋳型として、ＰＣＲバッファー（最終濃度として５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ トリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（ｐＨ８．３）、２ｍＭ塩化マグネシウム、０．０１％ゼラチン）、２００μＭ ｄＮＴＰｓ（タカラ社製）、０．１μＭのＡＫＲ１Ｂ１０センスプライマー（配列番号３）、アンチセンスプライマー（配列番号４）、Ｔａｑポリメラーゼ、及び二本鎖の核酸に取り込まれることで蛍光を発するサイバーグリーン（ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ）を含む２５μLの反応液の系でＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応は、９４℃で１５秒、５７℃で１５秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３０回行なった。内部コントロールとして、β−アクチンのＰＣＲ反応も行い、プライマーはセンスプライマー（配列番号５）、アンチセンスプライマー（配列番号６）を使用した。

検出は、二本鎖核酸に取り込まれたサイバーグリーンが発する蛍光（ハロゲンランプによる励起光４９４ｎｍ、蛍光５１５ｎｍ〜５４５ｎｍのバンドパスフィルターにて検出）を検出することで行った。ネガティブ・コントロール（鋳型となるｃＤＮＡを含まない）以外のすべての測定対象物における蛍光が生じている蛍光強度を１点定め、その蛍光強度に達したサイクル数を決定した。数値化は、Ｈ１６４８を標準として行った。３点の濃度（１／１、１／１０、１／１００）のｃＤＮＡで行ったＰＣＲにおいて、定められた蛍光強度に達したサイクル数をプロットした。測定対象物において定められた蛍光強度に達したサイクル数を内挿することで数値化した。

ＡＫＲ１Ｂ１０の定量は各サンプルにおける含まれるβ−アクチンに対する相対的濃度として決定した。まず、各サンプルにおける内在性のβ−アクチンの定量的ＰＣＲを行うことで初期鋳型ＤＮＡ量を求めた。その値でＡＫＲ１Ｂ１０の初期鋳型ＤＮＡ量を割って補正を行い、得られた数値を目的遺伝子のｍＲＮＡの相対量とした。各サンプルのＡＫＲ１Ｂ１０の相対比は、定量的ＰＣＲから得られたβ−アクチンの初期鋳型ＤＮＡ量に対するＡＫＲ１Ｂ１０の初期鋳型ＤＮＡ量によって表した。

結果を図４に示す。ＡＫＲ１Ｂ１０のｍＲＮＡは、正常肺では５例すべてが、肺小細胞癌では１０例すべてが、対β−アクチン発現量が２より少なかったのに対し、肺扁平上皮癌では９例中すべてが、肺腺癌では１２例中５例が対β−アクチン発現量が２以上あったことより、肺非小細胞癌ではＡＫＲ１Ｂ１０のｍＲＮＡの発現が亢進していることが確認された。

［実施例２］抗ＡＫＲ１Ｂ１０モノクローナル抗体の作製
（１）免疫原の調製
ＡＫＲ１Ｂ１０遺伝子の増幅：ＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質（ａ）をコードする領域の遺伝子は、肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２のｃＤＮＡから増幅させた。ＰＣＲプライマーには配列６又は７からなるＥｃｏＲ Ｉ又はＸｈｏ Ｉの制限酵素サイトのついたオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲ用酵素及び試薬には、アドバンテージ２ポリメラーゼミックス（Advantage ２ Polymerase Mix；クロンテック社製）及びアドバンテージ２ＰＣＲバッファー（Advantage ２ PCR buffer）、２００μＭ デオキシヌクレオチド三リン酸、０．２μＭプライマーを用い、ｃＤＮＡ １μLを鋳型にしたＰＣＲ（９４℃３０秒、６８℃３０秒、７２℃３分、３５サイクル）を行った。

ＰＣＲ産物は０．８％のアガロースゲルで電気泳動を行った後、ＡＫＲ１Ｂ１０の遺伝子と長さが同一である部位を切り出し、キアクイック ゲル抽出キット（QIAquick gel extraction kit；キアゲン社製）を用いてゲルからＰＣＲ産物の溶出及び精製を行った。
ライゲーション：ＰＣＲ産物はＤＮＡライゲーションキット（タカラ社製）を用いてｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクター（プロメガ社製）に組み込みを行った。ゲルから精製を行ったＰＣＲ産物４μLに、ライゲーションバッファー５μL及びｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクターを加え、１６℃で３０分間保温した。
ＰＣＲ産物を組み込んだｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクターはコンピテント細胞ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）へ形質転換し、５−ブロモ−４−クロロ−３−β−インドリルーガラクトピラノシド（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-Galactopyranoside；X-gal）を用いたカラーセレクションを行い、ＰＣＲ産物が組み込まれたベクターのみを選出した。形質転換は、コンピテント細胞に１０μLのライゲーション反応産物を加え、３０分間氷冷後に、４２℃のヒートショック４５秒、続けて２分間氷冷して形質転換を起こさせた。さらに、抗生物質耐性遺伝子の発現を行うために抗生剤を含まないＬＢ培地を９００μL加え、３７℃で３０分間穏やかに撹拌した。遠心で菌体を回収し、２０mg/mLのＸ−ｇａｌを２０μＬ散布させた、アンピシリンを含むＬＢプレートに菌体をまき込み、３７℃で１６時間培養した。プレート上で生育したコロニーのうち、発色をしていないコロニー（ＰＣＲ産物がベクターに組み込まれていることが予想されるもの）を５個選択し、最終濃度が１００μg／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地で３７℃、１６時間激しく撹拌し、菌体を増殖させた。

増殖した菌体の一部から、フェノール／クロロホルム抽出によってプラスミドＤＮＡを回収し、ＥｃｏＲ Ｉ（８U/μL）を０．５μL、１０×Ｈ バッファーを２μL、蒸留水を７．５μL加え、３７℃で１時間消化を行った。０．８％のアガロースゲルを用いた電気泳動で消化物のサイズが目的のＰＣＲ産物のサイズと同一であることを確認した。

ＡＫＲ１Ｂ１０の遺伝子が組み込まれたと考えられるプラスミドＤＮＡの回収はカンタムプレップ プラスミド ミニプレップキット（Quantum Prep Plasmid MiniPrep Kit （バイオラッド社製）を用いて行った。溶出は蒸留水で行った。
精製されたプラスミドに組み込まれたＰＣＲ産物の塩基配列の確認をキャピラリー電気泳動によるシーケンスで行った。シーケンスの反応は、ダイナミックＥＴターミネーター サイクル シーケンス キット（DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit；アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、各０．２μMのT7プライマー（配列番号９）及びＳＰ６プライマー（配列番号１０）を用いた。シーケンスによって得られたＰＣＲ産物の塩基配列は、Ｕｎｉｇｅｎｅのデータから得られた野生型のＡＫＲ１Ｂ１０配列（ＮＭ＿０２０２９９．３）と比較し、変異のないPCR産物をもつプラスミドＤＮＡを選び出した。

シーケンスで野生型のＡＫＲ１Ｂ１０と同一のアミノ酸配列（配列番号１）をコードすることが確認されたプラスミドＤＮＡは、制限酵素（ＥｃｏＲ Ｉ及びＸｈｏ Ｉ）で酵素消化（３７℃、１時間）を行い、０．８％のアガロースゲルで電気泳動を行い、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙから遺伝子を単離、精製した。精製はキアクイック ゲル抽出キットを用いて行った。
ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙによって増幅され、切り出されたフラグメントは、大腸菌タンパク質発現用ベクターであるｐＥＴ４１（ノバジェン社製）に組み換えた。ｐＥＴ４１に組み込まれた遺伝子は、ＧＳＴ融合タンパク質として翻訳される。
ｐＥＴ４１を制限酵素（ＥｃｏＲ Ｉ及びＸｈｏ Ｉ）で消化し、電気泳動を行い、キアクイック ゲル抽出キットで精製を行った。ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙによって増幅したＡＫＲ１Ｂ１０の配列をもつフラグメントはＤＮＡライゲーションキットを用いてｐＥＴ４１に組み込みを行った。
ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙから精製を行ったＡＫＲ１Ｂ１０フラグメント４μLに、ライゲーションバッファー５μL及びｐＥＴ４１を１μL加え、１６℃で３０分間保温した。
ライゲーション反応の終了したプラスミドＤＮＡはＸＬ−１ Ｂｌｕｅへ形質転換を行い、カナマイシンを含むＬＢ培地で１６時間振盪を行い、菌体を増殖させた。増殖させた大腸菌から、カンタムプレップ プラスミド ミニプレップキットを用いて、プラスミドの精製を行った。ｐＥＴ４１へのＡＫＲ１Ｂ１０の挿入を確認するために、ｐＥＴがもつ配列に対するプライマー（配列番号１１及び１２）でシーケンスを行った。

ｐＥＴ４１ベクターに組み込まれた配列番号１のＡＫＲ１Ｂ１０を、Ｔ７プロモーターを持つコンピテント細胞ＢＬ２１ Ｃｏｄｏｎ ＰＬＵＳ ＲＩＬ（ノバジェン社製）に形質転換させた。
形質転換は、以下の手順で行った。１００μLのＢＬ２１ Ｃｏｄｏｎ ＰＬＵＳ ＲＩＬにｐＥＴ−ＡＫＲ１Ｂ１０‐ＦＬを１μg／μL濃度で１μL加え５分間氷冷した。その後、４２℃の恒温層に２０秒間漬け、ヒートショックを与えた。さらに２分間氷冷した後、９００μLの抗生剤無添加のＬＢを加え、３７℃で１０分間インキュベートした後に、遠心（１０００×ｇ、５分）を行った。
上清を廃棄した後コンピテント細胞を再懸濁させ、カナマイシンを含んだＬＢプレートにまきこんで３７℃で１６時間、選択培養を行った。

タンパク質合成は以下の手順で行った。プラスミドが導入されたと考えられるカナマイシン耐性のコロニーを、カナマイシンを含む５ｍＬのＬＢ培地の中でコンフルエントになるまで培養を行った。この培養液を５００ｍＬのカナマイシン入りＬＢ培地に加え、旋回振とうさせながら３７℃で培養を行った後に、菌体が増殖したことを確認した上で、タンパク質合成を誘導するＩＰＴＧ（Isopropyl-Thio-β-D-Galactopyranoside）を５００μMになるように加え、２２℃で１６時間、旋回振とう培養を行った。

大腸菌を用いて発現させたＡＫＲ１Ｂ１０のＧＳＴ融合タンパク質の精製はＧＳＴとグルタチオンの結合を利用したアフィニティ精製で行った。まず、培養液を６０００×ｇ、４℃で１０分間遠心することで大腸菌の菌体を回収した。菌体溶解バッファー（５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩, pH８．０）を加え、氷上で超音波処理を行った。その後、最終濃度が１％になるようにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加し、１３４００×ｇ、４℃で４５分間遠心を行って上清を回収した。この上清にグルタチオンセファロース（アマシャムバイオサイエンス社製）を５００μL加え、４℃で１時間転倒混和を行ない、ＧＳＴ‐ＡＫＲ１Ｂ１０融合蛋白質を吸着させた。
遠心（３０００×ｇ、４℃、５分）でグルタチオンセファロースを回収し、１０ｍＬのＰＢＳ−Ｔ（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ）で洗浄後、溶出バッファー（５０ｍＭ還元型グルタチオン、２００ｍＭ塩化ナトリウム１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）を加えて４℃で１時間転倒混和し、ＧＳＴ融合タンパク質を溶出させた。遠心（３０００×ｇ、４℃、５分）によってグルタチオンセファロースを除去し、ＧＳＴ融合ＡＫＲ１Ｂ１０精製蛋白質を得た。ＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）でＰＢＳ溶液とし、ブラッドフォード法によってタンパク質濃度を定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度を検定し、免疫に必要なタンパク質の量及び純度を満たしていることを確認し、このタンパク質を以下に示すモノクローナル抗体作製のための免疫原とした。

ヒトＡＫＲ１Ｂ１０の完全長蛋白質（アミノ酸配列番号１番目から３１６番目）のＧＳＴ−融合発現物（大腸菌発現物）精製品を免疫原とした。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ雌６週齢）に５０μｇ／匹で３回免疫した後、血清中の抗体価を検定した。抗体価検定法として、免疫原０．５μｇ／wellを固相化したＥＬＩＳＡ用プレートに、予めＧＳＴ蛋白質で抗ＧＳＴ抗体のノイズを吸収させた免疫マウス血清の希釈列を反応させ、ＨＲＰ標識抗マウス抗体の反応を経て、基質添加後に得られた発色について４５０nmの吸光度を測定する方法（免疫抗原固相ＥＬＩＳＡ法）を使用した。

抗体価亢進を認めたマウスに２５μｇ／匹を最終免疫し、７２時間後に脾臓細胞を採取し、骨髄腫細胞（Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１）と細胞融合（Kohler G, Milstein C: Nature 256, 495(1975)）を行った。ＨＡＴ選択培地で培養を行うことにより、ハイブリドーマを得た。ハイブリドーマの培養上清を予めＧＳＴ蛋白質で吸収させた後に免疫抗原固相ＥＬＩＳＡを行い、ＡＫＲ１Ｂ１０（大腸菌発現物）に対して反応するものを一次選抜した。免疫抗原ＥＬＩＳＡ陽性のバイブリドーマについては、ＣＯＳ７細胞にＡＫＲ１Ｂ１０を強制発現させた細胞株のタンパク質抽出液を用いたウエスタン・ブロッティングにおいて特異性を検定した。陽性のものについて限界希釈法にてクローニングを行い、モノクローナル抗体産生株を樹立した。抗体産生ハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃマウスに接種することによってマウス腹水を得た。腹水中のモノクローナル抗体を硫安塩析法で精製し、精製抗体を調製した。

このようにして得られたモノクローナル抗体のＧＳＴ−ＡＫＲ１Ｂ１０に対する抗体価を免疫抗原固相ＥＬＩＳＡで測定した結果が図５である。抗体の濃度に比例して、免疫抗原に対する抗体の親和性が高くなっていることがわかる。また、コントロールとしてのＧＳＴのみに対する抗体の親和性がないことより、得られた抗体はＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質を特異的に認識するものであることが示された。図６は、ＣＯＳ７細胞に強制発現させたＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質に対するウェスタン・ブロッティングの結果である。作製したモノクローナル抗体は、組換えＡＫＲ１Ｂ１０を導入した細胞抽出液において４０ｋＤａ付近のＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質のみを認識していることより、この抗体がＡＫＲ１Ｂ１０を特異的に認識していることがわかる。

［実施例３］抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体を用いたウェスタン・ブロッティングによる肺癌組織におけるＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質の発現解析
ヒト肺非小細胞癌（腺癌及び扁平上皮癌）の組織抽出物を用いて抗ＡＫＲ１Ｂ１０モノクローナル抗体によるウエスタン・ブロットを行った。
ヒト組織抽出物調製は、組織片にＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭ塩化ナトリウム，１％ＮＰ−４０，０．５％デオキシコール酸，０．１％ＳＤＳ，５０ｍＭ トリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩 ｐＨ８．０）を添加して超音波破砕後、遠心して上清画分を回収して行った。各々の抽出サンプルについて蛋白質濃度をブラッドフォード法で定量し、４ｍｇ／ｍＬとなるように調製した後、ＳＤＳ‐サンプルバッファーと等量混合し（最終濃度 ＳＤＳ濃度２％，２−メルカプトエタノール濃度５％）、９５℃で５分間加熱処理を行った。１５％ポリアクリルアミドゲルを調製して抽出物サンプルを１０μｇずつアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ポリアクリルアミドゲル中でサイズによって分離されたＡＫＲ１Ｂ１０は、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ膜（アマシャムバイオサイエンス社製）に１００Ｖで６０分間転写し、転写膜を調製した。

転写膜は５％スキムミルクで２５℃１時間ブロッキングした後、５０ｍＭ 塩を含むトリスヒドロキシアミノメタン塩酸バッファー（以下ＴＢＳ）で３回洗浄した。
一次抗体である抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体を１０μｇ／ｍＬ濃度で５ｍＬ／転写膜一枚分アプライし、室温で１時間反応させた後、ＴＢＳで３回洗浄を行った。二次抗体であるＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャムバイオサイエンス社製）の５０００倍希釈液５ｍＬをアプライし、室温で１時間反応させた後ＴＢＳで３回洗浄を行った。ＥＣＬ ｐｌｕｓ検出試薬（アマシャムバイオサイエンス社製）を２ｍＬアプライし、得られた化学発光シグナルをＸ腺フィルムに５分間感光させた。

得られた結果を図７に示す。図７から明らかように、３人の肺扁平上皮癌の患者から得られた癌部、非癌部を比較すると、すべての症例においてＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質は明らかに癌部で発現が亢進していることが示された。このことは単に、癌でＡＫＲ１Ｂ１０の発現が亢進していることを示すだけでなく、正常から癌に移行するに従って発現が亢進していることを示している。すなわち、ＡＫＲ１Ｂ１０は肺扁平上皮癌を規定するタンパク質である。肺腺癌ではわずかながらＡＫＲ１Ｂ１０のバンドが検出された。

［実施例４］抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体を用いた免疫組織化学による肺癌、食道癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌組織におけるＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質の発現解析。
ヒト肺癌（小細胞癌、腺癌及び扁平上皮癌）、食道癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、ヒト正常肺、ヒト正常食道の病理組織標本を用いて、抗ＡＫＲ１Ｂ１０モノクローナル抗体による免疫染色を行った。
各検体は、固定パラフィン包埋標本を４μｍに薄切した切片をスライドガラスに張り付け、３７℃で１６時間置くことで十分乾燥させた。１００％キシレンに５分間で３回漬けることで脱パラフィンし、１００％アルコールに５分間を３回、７０％エタノールで５分間漬けることで親水化を行った。その後、５０ｍＭ ＴＢＳで５分間、３回洗浄した後、クエン酸バッファー（１０ｍＭ，ｐＨ６．０）中で１２０℃１０分間の抗原の賦活化を行った。抗原の賦活化後、ＴＢＳによる５分間で３回の洗浄を行った後、１μｇ／ｍＬに希釈された抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体と室温で１時間反応させた。内在性のペルオキシダーゼを失活させるために、０．３％の過酸化水素で１５分間、室温で作用させた。さらにＴＢＳで３回洗浄した後、二次抗体であるＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）を１時間作用させた。ＴＢＳによる５分間で３回の洗浄後、発色基質にはＤＡＢ（3,3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride）を用いた。また、核の対比染色にはヘマトキシリンを用いた。

肺癌における免疫組織化学の結果、肺扁平上皮癌では１３例中９例でＡＫＲ１Ｂ１０が陽性であることが示された（図８）。同様に、肺腺癌では１２例中２例でＡＫＲ１Ｂ１０が陽性であることが示された。また、食道癌では８５例中６９例、咽頭癌では１０例中９例、舌癌では９例中７例、喉頭癌では１２例中１１例が陽性であることが示された（表２）

肺小細胞癌の２例で染色が認められなかった。ＡＫＲ１Ｂ１０の染色は主に細胞質であったが、一部核に局在している症例が見られた（図８）。正常肺組織、正常食道組織では、ＡＫＲ１Ｂ１０の染色が認められなかった。また、食道癌、咽頭癌、喉頭癌及び舌癌組織でもＡＫＬ１Ｂ１０の染色が認められた（図１０〜図１４）。
本発明の抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体が肺においては、肺非小細胞癌でのみ染色性を認めたことより、免疫組織化学で使用できる抗体であることが示されたと同時に、抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体を用いた免疫組織化学が肺非小細胞癌、食道癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌の診断に有効であることが示された。

［実施例５］ウェスタン・ブロッティングによる様々な癌に由来する癌細胞株におけるＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質の発現解析
作製された抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体を用いて８４種類の癌細胞株に対してウェスタン・ブロッティングを行った結果が、図９である。肺癌に由来する細胞株（Ａ５４９，Ｈ１３９５，Ｈ１６４８）の他、食道癌（ＴＴｎ，ＴＥ−５，ＴＥ−６，ＴＥ−９，ＴＥ−１１，ＴＥ−１４，ＴＥ−１５）、胃癌（２Ｍ，Ｄ３，ＭＫＮ１，ＭＫＮ４５，ＮＵＧＣ４，Ｋａｔｏ ＩＩＩ）、腎癌（ＳＫＲＣ３９，Ｃａｋｉ１，Ｃａｋｉ２，ＶＭＲＣ−ＲＣＺ，ＶＭＲＣ−ＲＣＷ）、大腸癌（ＬｏＶｏ，Ｔ８４）、子宮頸癌（ＭＥ−１８０）、脳腫瘍（Ｔ９８Ｇ）、膵癌（Ｃａｐａｎ−１）、膀胱癌（ＪＭＳＵ３）に由来する細胞株でもＡＫＲ１Ｂ１０の発現が認められた。

［実施例６］抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体を用いた共焦点レーザースキャン顕微鏡による細胞内局在解析
共焦点レーザースキャン顕微鏡による細胞内局在解析は、固定後、抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体を用いた細胞に対して行った。具体的には以下の通りである。培養された肺癌細胞株Ａ５４９の培地を除去し、ＰＢＳで３回洗浄を行った。その後、４％パラホルムアルデヒドに５分間浸し、細胞の固定を行った。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ溶液に５分間浸すことで、細胞膜の浸透化を行った。さらにＰＢＳで３回洗浄した後、抗体希釈液（ＤＡＫＯ社製）に１時間浸すことで、非特異的な抗体の吸着を防ぐブロッキングを行った。

抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体が０．１ｍｇ／ｍＬになるように希釈された一次抗体溶液に１時間作用させた。ＰＢＳで３回洗浄した後に二次抗体である１／１００希釈されたＦＩＴＣ標識抗マウスイムノグロブリンＧ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を１時間作用させた。二次抗体を作用させている間は遮光を行った。反応の終わった二次抗体を除去し、ＰＢＳで３回洗浄を行った。ＰＢＳを除去した後に、核の染色剤であるプロピリジウム イオード（ＰＩ）を含有した封入剤であるベクターシールド（ベクター社製）を添加し、カバーガラスをのせ、プレパラートを完成させた。

検鏡は、共焦点レーザースキャン顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製）によって行った。ＦＩＴＣを励起させるための励起光は４８８ｎｍ、ＰＩを励起させる励起光は５６８ｎｍのレーザーで行った。検出した蛍光はＦＩＴＣが５００〜５５０ｎｍ、ＰＩが６００〜６５０ｎｍであった。約０．６μｍ間隔で、細胞に対して垂直方向に３カ所の断面をスキャンした。各断面は８回の平均の測定である。

結果を図１５に示した。抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体で認識されたＡＫＲ１Ｂ１０は細胞によって細胞質にあるもの、核にあるものが混在していることがわかる。細胞の集密度によって、緑色に示されたＡＫＲ１Ｂ１０の局在が核又は細胞質に変化している。また、同一の視野の中で染色されたＡＫＲ１Ｂ１０が細胞質又は核と異なっているのは、本来均一な性質をもつ細胞の異なった状態を表している。この細胞株が均一な集団であることと細胞の集密度による局在の変化は、ＡＫＲ１Ｂ１０が細胞周期によって局在を変化させていることを示している。このような細胞内局在の変化は図９で示した免疫組織化学でも確認されている。癌細胞は細胞周期が異常な状態になっていることはよく知られており、ＡＫＲ１Ｂ１０の細胞内局在を制御することで細胞の癌化を制御することができることを示している。

ジーンチップによって正常組織、癌組織、及び癌細胞株におけるＡＫＲ１Ｂ１０のｍＲＮＡの発現量を測定した結果である。 正常肺組織又は肺扁平上皮癌におけるＡＫＲ１Ｂ１０のｍＲＮＡの発現量を半定量的ＰＣＲで測定した結果である。 正常肺組織又は肺腺癌、肺小細胞癌におけるＡＫＲ１Ｂ１０のｍＲＮＡの発現量を半定量的ＰＣＲで測定した結果である。 正常肺組織又は肺扁平上皮癌、肺腺癌、肺小細胞癌におけるＡＫＲ１Ｂ１０のｍＲＮＡの発現量を定量的ＰＣＲで測定した結果である。 免疫抗原固相ＥＬＩＳＡによる抗ＡＫＲ１Ｂ１０抗体の抗体価の測定 ＣＯＳ７細胞に発現させた組換えＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質に対するウェスタン・ブロッティングの結果である。 肺正常部及び癌部の臨床検体におけるＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質をウェスタン・ブロッティングで検出した結果である。 肺正常部及び癌部の臨床検体（肺扁平上皮癌（Ａ、Ｂ、Ｃ）、肺腺癌（Ｄ））におけるＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質を免疫組織化学で検出したものである。 様々な癌に由来する癌細胞株におけるＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質を検出した結果である。 食道癌の臨床検体におけるＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質を免疫組織化学で検出したものである。 食道癌の臨床検体におけるＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質を免疫組織化学で検出したものである。 咽頭癌の臨床検体におけるＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質を免疫組織化学で検出したものである（上は上皮内、下は浸潤部）。 喉頭癌の臨床検体におけるＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質を免疫組織化学で検出したものである。 舌癌の臨床検体におけるＡＫＲ１Ｂ１０のタンパク質を免疫組織化学で検出したものである（下は上皮内）。 共焦点レーザースキャン顕微鏡によるＡＫＲ１Ｂ１０の細胞内局在解析を行った結果である。

Claims (12)

1. 生体試料中の、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなりアルド−ケト−リグクターゼ活性を有するタンパク質を免疫学的手法により検出することを特徴とする癌の判定方法。
2. 生体試料中の、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなりアルド−ケト−リグクターゼ活性を有するタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を測定することを特徴とする癌の判定方法。
3. 生体試料が、癌組織である請求項１又は２記載の判定方法。
4. 癌組織が肺、喉頭、咽頭、舌、子宮、胃、腎、大腸、脳、膵および膀胱である請求項１〜３いずれか１項記載の判定方法。
5. 検出が、生体試料中の、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなりアルド−ケト−リグクターゼ活性を有するタンパク質に対する抗体を用いる免疫学的検出である請求項１、３又は４記載の判定方法。
6. 判定の対象が、肺非小細胞癌である請求項１〜５のいずれか１項記載の判定方法。
7. 生体試料が、血液である請求項１〜６いずれか１項記載の判定方法。
8. 判定の対象が、食道癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、胃癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、膵癌、膀胱癌である請求項１〜５いずれか１項記載の判定方法。
9. 生体試料中の、配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなりアルド−ケト−リグクターゼ活性を有する抗体を含有する癌の診断キット。
10. 判定の対象が、肺非小細胞癌である請求項９記載のキット。
11. 判定の対象が、食道癌、喉頭癌、咽頭癌、舌癌、胃癌、腎癌、大腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、膵癌又は膀胱癌である請求項９記載のキット。
12. 配列番号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したアミノ酸配列からなりアルド−ケト−リグクターゼ活性を有するタンパク質の細胞内局在を制御することを特徴とする癌の治療方法。

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