KR100331363B1 - 사이클린복합체재배열및그것과관련된용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사이클린 복합체의 하위단위체 성분들의 검출을 포함하는, 세포의 형질전환을 진단하기 위한 방법 및 진단 키트에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 방법은 사이클린, PCNA, CDK들, 및 p21, pl9 및 p16과 같은 저분자량 폴리펩티드들의 상호 작용에 관련된다. 본 발명은 또한 세포 증식의 억제제에도 관련된다.

Description

사이클린 복합체 재배열 및 그것과 관련된 용도
발명의 배경
신생물(neoplasia)은 조절되지 않은 세포 성장 및 세포 분열을 특징으로 한다. 필연적으로, 세포 성장을 조절하는 분자 경로는 세포 분열을 조절하는 분자 경로와 상호작용하여야 한다. 그러나, 거의 최근까지도, 연관 관계를 밝히기 위해 어떠한 실험적 증거도 이용할 수 없었다. 사이클린 A는 바이러스로 형질전환시킨 세포에서 아데노바이러스 종양 단백질 E1A와 관련하여 발견되었다[참조 : Giordona et al., Cell 58: 981 (1989); and Pines et al., Nature 346: 760 (1990)]. 초기 간세포 암종의 경우, 사람 사이클린 A 유전자가 사이클린 A 전사의 활성화를 일으키는 B형 간염 바이러스의 단편과 생체외에서 분해될 수 없는 키메라 바이러스 사이클린 A 단백질의 통합 부위인 것으로 밝혀졌다[참조 : Wang et al., Nature 343: 555 (1990)]. 지금까지 종양 발생에 가장 강력하게 관련된 세포 사이클 유전자는 사람 사이클린 D1이었다. 이것은 원래, 쥐과동물 대식구[Matsushine et al., Cell 65: 701 (1991)] 및 부갑상선 종양에서 재배열된 추정적인 종양유전자 PRAD1[Montokura et al., Nature 350:512 (1991)]에서 CSF-1에 의해 전사가 자극되는 세포 유전자로서, 효모 G1 사이클린 결핍 균주[참조 : Xiong et al., Cell 65: 691 (1991); and Lew et al., Cell 66: 1197 (1991)]의 유전자 상보성을 통해 단리되었다. 그 후, 2개의 추가의 사람 D-타입 사이클린인 사이클린 D2 및 D3가 PCR 및 낮은 스트린전시(stringency) 하이브리드화 기법을 사용하여 확인되었다[참조 : Inaba et al., Genomics 13: 565 (1992); and Xiong et al., Genomics 13: 575 (1992)]. 사이클린 D1은 일부 B-세포 림프종 및 백혈병에서 면역글로불린 유전자 인핸서로의 전위에 의해 활성화되고 사람 유방암의 15-20% 및 머리 및 목 기원의 편평 세포암의 25-48%에서 유전자 증폭 부위에 위치하는 유진자좌인 bcl-1 종양 유전자에 유전학적으로 결합된다.
사이클린은 해양 무척추동물의 알의 수정 후의 이들의 격렬한 합성으로 인해 발견된 단백질이다[참조 : Rosenthal, E. T. et al., Cell 20; 487-494 (1980)]. 풍부한 두 가지 유형의 사이클린 A 및 B가 유사분열시에 폴리펩티드의 돌연적 단백질 분해로 인한 초기 절단 분열이 이루어지는 동안에 변동 되었음이 후속 관찰되었으며, 여기서 이들의 명칭이 유도되었다[참조 : Evans, T. et al., Cell 33: 389-396 (1983); Swenson, K. I. et al., Cell 47: 867-870 (1986); Standart, N. et al., Dev, Biol. 124: 248-258 (1987)]. 그 후, 사이클린 유전자는 실질적으로 모든 진핵생물 종으로부터 단리되어 왔고, 다유전자족(multigene family)을 구성한다[참조예 : Xiong et al., Curr. Biology 1: 362 (1991)].
대합조개 사이클린 mRNA가 개구리 난모세포를 활성화시키고 이들 세포가 M기에 들어가도록 할 수 있다는 관찰에 의해, 세포 분열의 조절에서 사이클린이 수동적으로 관여하기 보다는 오히려 능동적으로 관여한다는 것이 명백해졌다[참조 : Swenson, K. I. et al., Cell 7: 867-870 (1986)]. 개구리 난모세포의 활성화는MPF로서 공지된 인자를 유도하는 M기의 동화(elaboration)과 관련이 있다[참조 : Masui, Y. and C. L. Market, J. Exp. Zool. 177: 129-146 (1971); Smith, L. D. and R. E. Ecker, Dev. Biol. 25: 232-247 (1971)]. MPF는 촉매 서브유닛이 cdc2 단백질 키나아제의 개구리 동족체인 단백질 키나아제이다[Dunphy, W. G. et al., Cell 54: 423-431 (1988); Gautier, J. et al., Cell 54: 433-439 (1988); Arion, D. et al., Cell 55: 371-378 (1988)].
지금까지 확인된 사이클린 중에서, B-타입 사이클린이 cdc2 단백질 키나아제의 구성 서브유닛으로서 작용함으로써 유사분열에서 작용하는 것으로 밝혀졌다[참조 : Booher, R. and D. Beach, EMBO J. 6:3441-3447 (1987); Draetta, G. et al., Cell 56:829-838 (1989); Labbe, J. C. et al., Cell 57:253-263 (1989); Labbe, J. C. et al., EMBO J. 8:3053-3058 (1989); Meier, L. et al., EMBO J. 8:2275-2282 (1989); Gautier, J. et al., Cell 60:487-494 (1990)]. A-타입 사이클린은 또한 cdc2 키나아제와 독립적으로 결합하여, 분열 사이클에서 유사분열 이전에 작용하는 것으로 여겨지는 효소를 형성한다[Draetta, G. et al., Cell 56:829-838 (1989); Minshull, J. et al., EMBO J. 9:2865-2875 (1990); Giotdano, A. et al., Cell 58:981-990 (1989); Pines, J. and T. Hunter, Nature 346:760-763 (1990)]. 무척추동물 및 척추 동물의 배(embryo)에서의 사이클린의 세포 및 분자 연구는 특히 자낭균 효모에서의 유전학적 연구를 수반하였다. 분열(fission) 효모에서, cdc13 유전자는 cdc2와 함께 작용하여 유사분열 과정으로의 도입을 조절하는 B-타입 사이클린을 코드화한다[참조 : Booher, R. and D. Beach, EMBO J. 6:3441-3447(1987); Booher, R. and D. Beach, EMBO J. 7:2321-2327 (1988); Hagan, I. et al., J. Cell Sci. 91 : 587-595 (1988); Solomon, M. Cell 54:738-740 (1988); Goeb1, M. and B. Byers, Cell 54:433-439 (1988); Booher, R. N. et al., Cell 58:485-497 (1989)]. 발아(budding) 효모 및 분열 효모 둘 모두에서의 유전학적 연구는 cdc2 (또는 발아 효모의 경우 CDC28)가 세포 사이클에서 2가지의 독립적인 시점, 즉, 유사분열 및 소위 세포 사이클 "출발" 시점에서 작용함을 밝혀내었다[참조 : Hartwell, L. H., J. Mol. Biol., 104:803-817 (1971); Nurse, P. and Y. Bissett, Nature 292:558-560 (1981); Piggot, J. R. et al., Nature 298:391-393 (1982); Reed, S. I. and C. Wittenberg, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:5697-5701 (1990)]. 발아 효모에서, CDC28 단백질의 출발 작용은 또한 단백질 키나아제의 촉매적 서브유닛과 A 및 B-타입 사이클린과 구조적으로 관련된 보조 단백질과의 결합을 필요로 한다. 이러한 세번째 부류의 사이클린은 CLN 부류로 명명되며, 부분적으로 중복된 유전자 패밀리를 포함하고 있는 3개의 유전자가 공지되어 있다[참조 : Nash, R. et al., EMBO J. 7:4335-4346 (1988); Hadwiger, J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6255-6259 (1989); Richardson, H. E. et al., Cell 59:1127-1133 (1989)]. CLN 유전자는 출발의 실행에 필수적이며, 이들이 부재하면 세포는 세포 사이클의 G1기에 머물러 있게 된다. CLN1 및 CLN2 전사체는 세포 사이클을 통해 크게 변동하지만, CLN3 전사체는 그렇지 않다. 또한, CLN2 단백질은 그것의 mRNA와 평행하게 변동되는 것으로 밝혀졌다[참조 : Nash, R. et al., EMBO J. 7:4335-4346 (1988); Cross, F. R., Mol. Cell Biol. 8: 4675-4684 (1988);Richardson, H. E. et al., Cell 59:1127-1133 (1988); Wittenberg, et al., 2990]. 상이한 사이클린과의 결합에 의해 cdc2/CDC28에 부여되는 정확한 생화학적 성질은 아직 완전히 설명되지 못했지만, 사이클린 돌연변이체의 유전학적 연구는 이들이 "G1" 및 "G2" 성질을 촉매적 서브유닛에 부여한다는 것을 명백하게 확립하였다[참조 : Booher, R. and Beach, EMBO J. 6:3441-3447 (1987); Nash, R, et al., EMBO J. 7:4335-4346 (1988); Richardson, H. E. et al., Cell 56: 1127-1133 (1989)].
cdc2 및 사이클린은 배 및 효모에서 뿐만 아니라, 사람 체세포에서도 발견되었다. cdc2/사이클린 B 효소의 기능은 다른 세포 유형에서와 같이 사람 세포에서도 동일한 것으로 여겨진다[참조 : Riabowol, K. et al., Cell 57:393-401 (1989)]. 사람 A 타입 사이클린이 또한 cdc2와 관련하여 발견되었다. CLN 타입 사이클린은 아직 포유동물 세포에서는 설명되어 있지 않다. 세포 사이클 조절에 관여하는 엘레먼트와 이들의 상호작용에 대한 보다 나은 이해는 세포 복제에 대한 이해를 보다 낫게 하며, 아마도 그 프로세스(process)를 변경하거나 조절시킬 것이다.
발명의 요약
본 발명은 D-타입 사이클린으로 불리는 신규한 부류의 사이클린에 대한 용도에 관한 것으로, 이들 사이클린은 포유동물로부터 유래하고 상기 기술된 A, B 또는 CLN 타입 사이클린과 관련이 있지만 이들과는 구별되는 신규한 부류의 사이클린이다. 특히, 본 발명은 사이클 출발에 필수적인 단백질의 결핍을 보충하고, 단백질 구조를 기초로 하여 A, B 및 CLN 타입 사이클린과는 진화 트리 (evolutionarytree)의 상이한 가지 상에 있는, 효모에서 세포 사이클 출발에 필수적인 CLN-타입 유전자를 대체할 수 있는 것으로 입증된 유전자에 의해 코드화된 사람 사이클린에 관한 것이다. D-타입 사이클린은 진핵 세포, 특히 사람 세포에서 다수의 사이클린 의존성 키나아제와 결합하는 것으로 입증되었다. 또한, 이들은 3가지 폴리펩티드, 즉, 사이클린 의존성 키나아제, 잘 특징화되어 있는 DNA 복제 및 복구 인자(즉, 증식성 세포핵 항원 또는 PCNA) 및 겉보기 분자량이 21kDa인 폴리펩티드와 공침하는 것으로 입증되었다. 이들 결과는 D-타입 사이클린, CDK, PCNA 및 p21이 4원 복합체의 형태로 존재하고, 성분(예를 들어, 사이클린 D1 또는 D3 및 CDK2, CDK4 및 CDK5)의 다수의 조합적 변형이 생체내에서 어셈블링(assemb1ing)되고, 각각의 4원 복합체가 세포 사이클 또는 상이한 세포 타입에서 미묘하게 상이한 역할을 할 수 있음을 시사한다. 또한, SV40과 같은 DNA 종양 바이러스에 의한 세포 형질전환이 사이클린 D 복합체의 선택적인 서브유닛 재배열과 관련된 것으로 발견되었다. 사이클린 D, PCNA, CDK(CDK2, CDK4 및 CDK5를 포함함) 및 p21 사이의 결합은 DNA 종양 바이러스 또는 이의 종양형성 유전자 생성물을 포유동물 세포 내로 도입시킴으로써 붕괴된다. 상세하게는, 본원에 설명되는 바와 같이, 사이클린 D, PCNA, CDK(CDK2, CDK4 및 CDK5) 및 p21 사이의 결합은 SV40 종양 바이러스 또는 이의 종양형성 유전자 생성물인 거대 T 항원을 사람 배수체 세포 내로 도입시킨 경우 붕괴된다 (정상 사람 배수체 섬유아세포에 의해 예증됨). 사이클린 D와 p21로부터 해리된 후, CDK4는 16kDa의 새로운 폴리펩티드(p16)와 결합하게 된다. 유사하게는, 사이클린 A 복합체도 서브유닛 재배열된다. SV40 형질전환 후, 사이클린 A와의 p21 결합은 감소되거나 또는 완전히 해리된다. 그 후, 사이클린 A는 19kDa 폴리펩티드(p19)와의 복합체로 나타난다.
따라서, p21은 정상적인 형질전환되지 않은 세포에서만 사이클린 키나아제와 결합하며, p16, p19 및 가능하게는 다른 관련된 단백질은 형질전환된 세포에 존재하는 세포 사이클 조절자인 것으로 여겨지는 것으로 현재 알려져 있다. 이러한 지식은 사이클린의 활성을 변경(직접 또는 간접)시킴으로써 세포 분열을 조절하는 다양한 방법을 위한 기초 역할을 한다. 이것은 세포에서의 사이클린의 발현의 특이성과 사이클린, CDK, PCNA 및 P21에 의해 형성되는 것으로 여겨지는 4원 복합체의 성분의 가능한 조합의 수로 인해 세포 분열을 조절하는 데에 있어서 특이성(즉, 특정 세포 타입에서 또는 사이클 중의 특정 시점에서 세포 분열을 선택적으로 변경시키는 능력)을 제공한다. 특정 구체예에서, 이것은, PCMA를 간섭하는 것과 같이, D-타입 또는 A-타입 사이클린인 구성성분인 4원 복합체의 공통 성분을 간섭함으로써 세포 분열을 비특이적으로 변경시킬 수 있는 수단을 제공한다.
예를 들어, 본 발명의 치료 방법의 한 구체예에서, 상술된 4원 복합체의 형성이 방지 또는 향상되거나, 하나의 복합체 구성원의 활성이 세포 분열을 변경시키기 위한 방법으로서 변경된다. 여기에서, 간접적으로 또한 직접적으로 작용하여 복합체 형성을 방지 또는 향상시키거나 구성성분의 활성을 변경시키는 제제가 사용될 수 있다. 예를 들어, 상술된 바와 같이, 촉매적 활성은 단백질 키나아제의 활성화를 방지시킴으로써 억제될 수 있다. 대안적으로, PCNA 억제제가 세포 사이클 출발을 억제시키려는 세포내로 도입 되어 세포 분열을 억제시킬 수 있다. PCNA 억제제는 직접적으로 (예를 들어, 전사 또는 번역을 간섭함으로써 PCNA의 생성을 감소시킨다) 또는 간접적으로 (예를 들어, PCNA와 결합하여 이것이 다른 복합체 구성원과 결합하지 못하도록 한다) 작용할 수 있다. 또한, p21의 억제제가 세포 내로 도입되어, p21 기능 및/또는 이것이 복합체 구성원과 결합하는 것을 간접적 또는 직접적으로 간섭할 수 있다. 또한, 단백질-단백질 상호작용 (복합체 성분 사이에서의)이 세포 사이클에 대해 원하는 효과(세포 분열의 감소 또는 증가)를 나타내도록 변경(감소 또는 향상)될 수 있다. 이러한 단백질-단백질 상호작용을 차단하는 제제가 사용될 수 있다. 이들 제제로는, 저분자량 억제제, 복합체 성분(예를 들어, 항체)에 결합하는 제제, 및 다른 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 성분의 능력을 저하시키거나 파괴시키는 제제가 있다. 향상된 4원 복합체 형성을 희망하는 경우, 복합체 성분들이 상호작용하고 결합하는 능력을 증가시키는 제제(예를 들어, 복합체 성분의 배열을 변화시켜서 복합체 형성에 필요한 단백질-단백질 상호작용이 더욱 이용가능해 지도록 하는 제제)가 세포내로 도입될 수 있다. 또한, 향상된 복합체 형성은 세포에서 4원 복합체의 제한 성분(들)의 수, 활성 또는 이용률을 증가시켜서 이것이 형성되는 속도 및 이의 작용 이용률을 향상시킴으로써 야기될 수 있다.
또한, 본 발명은 세포의 형질전환을 진단하는 방법에 관한 것이다. CDK, 사이클린, PCNA 및 저분자량 폴리펩티드(예를 들어 p21, p19 및 p16) 사이의 상호작용을 인지하는 단클론성 항체와 같은 시약들이 개발될 수 있다. 예를 들어, p16과 CDK4 사이의 상호작용을 인지하는 항체가 많은 세포 타입의 형질전환을 검출하거나 진단하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, CDC2, CDK2, 사이클린 A 또는 사이클린 D를 인지하는 항체와 같은 제제가 사용되어, 사이클린 복합체들의 서브유닛 조성을 확인하여 세포의 형질전환의 상태를 확인할 수 있다.
본 발명은 또한 기술된 단리 방법, 진단 방법 또는 치료 방법에 유용한 제제(예를 들어 올리고누클레오티드, 항체, 펩티드)에 관한 것이다.
사이클린은 사이클린 의존성 키나아제(CDK)와 협력하여 세포 사이클이 진행되는 동안 임계 전이 및/또는 제한점을 조절하는 작용을 하는 중요한 조절 단백질이다. 본 발명은 특정 세포 사이클 과정의 억제제 및/또는 활성제를 개발하기 위한 방법 및 시약을 제공한다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 정상 진핵 세포, 특히 사람 세포에서, 다양한 타입의 사이클린(예를 들어 A, B, 및 D 부류의 사이클린)은 많은 상이한 CDK2 뿐만 아니라 증식성 세포핵 항원(PCNA) 및 겉보기 분자량이 21kd인 폴리펩티드(p21)와 결합하여 다수의 타입의 복합체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 하기에서 제공되는 결과는 사이클린과 CDK의 조합체가 PCNA 및 p21과 함께 최소한 하나의 4원 복합체 중에 존재하고, 성분들의 많은 조합적 변형(예를 들어, 사이클린D1 또는 D3과 CDK2, CDK4 및 CDK5와의 상이한 조합)이 생채내에서 이루어지며, 생성되는 4원 복합체가 각각 세포 사이클 또는 상이한 세포 타입에서 잠재적으로 상이한 역할을 할 수 있음을 시사한다. 따라서, 하기 설명되는 바와 같이, 예를 들어 사이클린과 CDK 사이에서 형성된 특정 복합체를 선택적으로 차단할 수 있는 제제를 확인하기 위한 검정법이 개발될 수 있다.
또한, 본 발명은 형질전환된 세포를 검출하기 위한 진단용 검정 및 시약을이용할 수 있게 하며, 예를 들어 암의 검출에 유용할 수 있다. 하기에서는, 세포 형질전환이 사이클린-CDK 복합체의 선택적인 서브유닛 재배열과 관련된다는 것이 설명된다. 예시를 위해, 형질전환된 세포 (바이러스에 의해 또는 유전적 변형에 의해)에서, 사이클린 D/p21/CDK/PCNA 복합체가 파괴된다. 예를 들어, 바이러스에 의해 형질전환된 세포에서, CDK4는 전체적으로 사이클린 D, PCNA 및 p21로부터 해리되고, 대신에 16kd 폴리펩티드(이하 "p16")와 결합하게 된다. 사이클린 A 또는 B1 및 p21/CDK/PCNA를 포함하는 4원 복합체는 또한, 형질전환된 세포에서 서브유닛 재배열을 일으킨다. 예를 들어, PCNA와 p21은 둘 모두 CDC2-사이클린 B1 2원 복합체와 더 이상 결합하지 않고, 사이클린 A 복합체는 더 이상 p21을 함유하지 않으며 그 대신 19kd 단백질(p19)로 대체된다. 따라서, 이러한 비정상적인 서브유닛 복합체를 검출하는 것이 세포 형질전환을 검출하기 위해 사용될 수 있음이 예측될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 변경된 복합체 형성 및/또는 증가된 수준의 p16 발현을 검출하여 형질전환된 세포를 확인하기 위해 항체 및 핵산 프로브를 포함하는 시약을 이용할 수 있게 한다.
더욱이, p16은 하기에서 사이클린/CDK 복합체, 특히 CDK4를 포함하는 복합체의 활성에 대해 억제 효과를 나타내는 것으로 입증되었다. 예를들어, p16은 생체내에서 사이클린 D1/CDK 복합체의 활성을 억제시킬 수 있다. 일반적으로 알려져 있는 바와 같이, 사이클린 D1은 매우 광범위한 증식성 질병과 관련되어 왔다. 따라서, 본 발명은 사이클린 D1의 종양형성성 발현으로부터 유발되는 세포 증식의 잠재적인 억제제를 확인한다.
반대로, p16은 CDK4와 결합하는 p16의 능력을 감소시켜서 사이클린/CDK4 복합체의 억제를 경감시키는 제제를 확인하기 위한 검정에 사용될 수 있다. 이러한 구체예에서, CDK4/사이클린 복합계의 재활성화는 형질전환된 세포에서 발생하는 세포 사건들을 파괴하거나 균형을 깨뜨린다. 이러한 제제는 예를 들어 종양 바이러스에 의해 형질전환된 세포에서 CDK4 복합체의 활성화가 p53과 같은 다른 식으로 바이러스적으로 억제된 세포 사이클 체크포인트(checkpoint)를 향상시키고, 감염된 세포를 체크포인트에 축적시키거나, 대안적으로 Rb 인산화의 경우 세포 치사를 일으키는 체크포인트를 조기에 거친다는 점에서 치료적으로 사용될 수 있다.
CDK5로 표시되는 사이클린 의존성 키나아제, 및 CDK5를 코드화하는 DNA가 또한 본원에 설명된 작업의 결과로서 이용가능해 진다. CDK5는 D-타입 사이클린, PCNA 및 p21과 공침하는 것으로 입증되었다. 따라서, 본 발명은 CDK5 기능 및/또는 복합체의 다른 성분들과의 결합을 변경(증가 또는 감소)시켜서 세포 증식을 달성함을 숙고한다. CDK5가 D-타입 사이클린과 결합하지 못하는 경우, 키나아제 활성화가 억제될 것이다. 이것은 하기 기술된 바와 같이 이루어질 수 있다.
I.정상 세포에서의 사이클린 복합체
하기의 설명은 D-타입 사이클린이 세포 사이클에서 또는 상이한 세포 타입에서 구별되는 역할을 할 수 있는 복합체를 형성하는 많은 가능한 조합적 변형을 갖는 4원 복합체인 것으로 각각 여겨지는 최소한 3재의 부가적 폴리펩티드(CDK, PCNA 및 p21)와 결합한다는 발견을 설명한 것이다.
하기 및 실시예 1에서 설명되는 바와 같이, D-타입 사이클린이 진핵세포에서다양한 가능한 촉매적 서브유닛(예를 들어, CDK2, CDK4 및 CDK5와 같은 CDK)과 결합한다는 것을 확립하기 위하여 면역학적 방법이 사용되어 왔다. 또한, 이들 방법은 D-타입 사이클린과 CDK가 복제 인자 PCNA 및 겉보기 분자량이 21kDa인 폴리펩티드와 결합함을 밝혀내었다.
사람 사이클린 D1은 광범위한 증식성 질병과 관련되어 있다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 사람 배수체 세포에서, 특히 사람 배수체 섬유아세포에서, 사이클린 D1은 많은 다른 세포 단백질과 복합체를 형성한다. 이들 중에서, 촉매적 서브유닛은 CDK2, CDK4(이전에는 PSK-J3으로 불림), 및 CDK5(또한 PSSALRE로도 언급됨)이다. 또한, 21kDa와 36kDa의 폴리펩티드가 사이클린 D1과 관련하여 확인되었다. 실시예 1에서 설명되는 바와 같이, 36kDa 단백질은 증식성 세포핵 항원인 PCNA인 것으로 입증되었다. PCNA는 리딩 가닥 DNA 복제와 DNA 복구에 필요한 델타 중합효소에 대한 필수적인 보조 인자로서 공지되어 있다. 사이클린 D3은 또한 본원에서 나타난 바와 같이, 다중 단백질 키나아제인 p21 및 PCNA와 결합한다. D-타입 사이클린, CDK, PCNA 및 p21의 4원 복합체가 존재하고, 많은 조합적 변형체(사이클린 D1, D3과 CDK2, 4 및 5)가 생체내에서 조립될 수 있을 것이라는 것이 제시된다. 이러한 발견은 종양형성 관련된 사람 추정 G1 사이클린을 잘 특징화된 DNA 복제 및 복구 인자와 결합시켜 준다.
(i) 사이클린 D와 결합하는 단백질의 연구
사이클린 D와 특이적으로 결합하는 단백질들을 확인하기 위해, [35S]메티오닌으로 표지된 WI38 사람 배수체 섬유아세포 용해물의 항-사이클린 D1 면역침전물을 시험하였다 (하기 실시예 1, 실험 과정 참조). WI38 세포를 본 연구를 위해 초기에 선택하였으며, 그 이유는 이들이 타당하게 높은 수준의 사이클린 D1 및 낮은 수준의 사이클린 D3 mRNA를 발현시키는 비교적 정상적인 세포주이기 때문이다[참조 : Won et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1992)]. 사람 293 형질전환된 일차 배 신장 세포를 대조표준으로서 사용하였는데, 그 이유는 이들이 모든 세 가지의 D 사이클린 mRNA 및 단백질을 매우 낮은 수준으로 발현시키기 때문이다 [참조 : Xiong, et al., Cell 65:691-699 (1991)], W138 세포는 항-사이클린 D1 항혈청에 의해 면역침전 될 수 있는 쉽게 검출가능한 35kDa폴리펩티드를 발현시킨다. 사이클린 D1으로서의 35kDa 단백질의 동일성은 동일한 WI38 세포 용해물의 면역침전을 면역전 혈청과 비교하고, 293 세포 용해물과 동일한 항-사이클린 D1 항혈청의 유사한 침전과 비교함으로써 확인된다. 사람 세포 중의 세 개의 밀접하게 관련된 사이클린 D 유전자의 존재 및 다른 사이클린 D 단백질에 대한 항-사이클린 D1 항체의 교차 반응성 때문에, 35kDa 밴드의 동일성은 부분적 단백질분해 맵핑에 의해 추가로 연구되었다. 35kDa 밴드의 녹농균 V8 부분 단백질 분해는 시험관내에서 합성된 유사하게 분해된 사이클린 D1의 패턴과 동일한 패턴을 나타냈지만, 사이클린 D2 또는 D3의 패턴과는 달랐다.
사이클린 D1에 상응하는 강한 35kDa 밴드 이외에, 세 가지의 다른 주요 밴드인 p36, p33 및 p21과 하나의 부수적 밴드인 p31(숫자는 겉보기 분자량을 나타낸다)은 특히 항-사이클린 D1 침전물에서 나타났다. 이들 폴리펩티드는 면역전 혈청을 사용한 WI38 세포 용해물의 침전물, 또는 293 세포 용해물과 동일한 항-사이클린 D1 항체의 침전물에는 없다. 이들 네 개의 밴드 중 임의의 밴드, 특히 p31과 p33이 사이클린 D2 또는 D3일 수 있다는 가능성은 이들의 부분적인 V8 단백질 분해 패턴을 시험관내 번역된 D2 및 D3의 패턴과 비교함으로써 배제되었다. 이들 폴리펩티드와 항-사이클린 D1 혈청의 침전은 또한, 이들 단백질이 동일한 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅과 커플링된 면역침전후에 검출되지 않았기 때문에, 이들 단백질 중 임의의 단백질 중의 교차반응성 에피토프의 존재로 인한 것으로는 여겨지지 않는다. 사이클린 D1-결합된 단백질을 확인하기 위한 실험을 하기에 기재하였다.
(ii) D-타입 사이클린과 결합하는 CDK5
쥐과동물 대식구에서, 사이클린 D1/cyll 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)의 온길이 p34cdc2에 대한 항체(G8)와 교차 반응하지만, 사람 p34cdc2의 C-말단에 대해 제조된 항체와는 교화 반응하지 않는 폴리펩티드와 결합한다는 것은 이미 보고되어 있다[참조 : Draetta et al., Cell 50:319-325 (1987); Draetta and Beach, Cell 54:17-26 (1988); Matsushime et al., Cell 65:701-713 (1991)]. 본질적으로 동일한 결과가 현재 사람 세포에서 얻어졌는데, 이는 사이클린 D1이 사람 CDC2의 동족(relative)과 결합한다는 것을 시사한다.
G8 항체를 사람 cDNA 발현 라이브러리를 스크리닝하는 데에 사용하여(실시예 1, 실험 과정 참조), 추정되는 D-타입 사이클린-결합 키나아제를 단리시켰다. 34개의 G8-포지티브 cDNA 클론을 HeLa 세포 cDNA 라이브러리로부터 동정하였다. 이들중에서, 17개의 클론은 CDC2를 코드화하였고, 다른 14개의 클론은 CDK2를 코드화하였다. 나머지 클론 중 하나는 예상분자량이 33,283 달톤인 292 아미노산 잔기(SEQ ID Nos. 1 및 2)의 ORF를 코드화하였다. 이 클론은 CDK5로 표시되는데, 그 이유는 이것이 스키조사 카로마이세스 폼베 CDC2(53.4%), 맥주효모균 CDC28(55.9%), 사람 CDC2(56.8%) 및 사람 CDK2(60.3%)를 포함하는 공지의 사이클린-의존성 키나아제(CDK)에 대해 광범위한 아미노산 동일성을 가지며, 사람 D-타입 사이클린과 결합하기 때문이다(하기 참조). CDK5는 아미노산 서열 86 내지 92에 있는 DLKKYFD의 서열을 코드화하는 한편, 사람 CDC2의 상응하는 영역은 DLKKYLD의 서열을 갖고, CDK2는 DLKKFMD의 서열을 갖는다.
CDK5가 D 사이클린과 결합하는 지의 여부를 측정하기 위해, CDK5의 독특한 카르복시 말단 영역에 상응하는 펩티드에 대한 항혈청을 발생시켰다(하기 실시예1, 실험 과정 참조). 이 혈청은 사람 CDC2, CDK2 또는 CDK4와 교차 반응하지 않는다. 면역침전 또는 면역침전 후의 웨스턴-블롯팅은 상기 항혈청이 겉보기 분자량이 31kDa인 폴리펩티드(p3l)를 세포 용해물에서 검출하며, 이들은 생체외에서 합성된 CDK5 폴리펩티드와 함께 이동하고, 이들의 신호가 CDK5 항원성 펩티드에 의해 효과적으로 경합됨을 밝혀내었다. 항-CDK5 항체에 의해 침전된 31kDa 단백질의 동일성은 p3l의 부분적인 V8 단백질분해 맵핑을 생체외에서 번역된 CDK5와 비교함으로써 CDK5인 것으로 추가로 확인되었다.
항-CDK5 항혈청을 사용하는35S-메티오닌 표지 WI38 세포의 세포 용해물의 면역침전은 p31CDK5이외에 수개의 폴리펩티드를 나타내었다. 이들중에서, 36kDa 폴리펩티드(p36), 35kDa 폴리펩티드(p35), 33kDa 폴리펩티드 (p33) 및 21kDa 폴리펩티드(p21)가 가장 두드러졌고, 항-CDK5 항혈청에 의해 특이적으로 동시 침전되었다. 이러한 모든 네 가지 폴리펩티드는 면역전 혈청과의 침전물에 없거나 과량의 CDK5 카르복시-말단 펩티드가 존재하는 경우에는 없었다.
p35와 p33의 전기영동적 이동성은 각각 생체외에서 번역된 사람 사이클린 D1 및 D3의 전기영동적 이동성과 동일한 것으로 밝혀졌다. CDK5-결합된 p35가 사이클린 D1에 상응할 것이라는 가능성을 직접적으로 시험하기 위해, CDK5 면역침전물을 항-사이클린 D1 항혈청으로 블롯팅하였다. P35사이클린 D1과 함께 이동하는 35kDa 폴리펩티드는 항-사이클린 D1 항혈청에 의해 검출되었다. CDK5 항혈청에 의한 항-사이클린 D1 면역복합체의 면역블롯팅은 또한 p31CDK5와 동일한 이동성을 갖는 31kDa 폴리펩티드의 존재를 나타내었다. 유사하게는, CDK5는 또한 항-사이클린 D3 면역침전물에서 검출되었다. 이들 데이터는 CDK5-결합된 p35가 사이클린 D1이고, CDK5-결합된 p33이 사이클린 D3임을 나타낸다.
CDK5-결합된 p35와 p33 단백질의 동일성의 결정적 증거를 찾기 위해, 부분적인 단백질분해 맵핑을 사용하였다[참조 : Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252:1102-1106 (1977)]. 항-CDK5 면역침전물로부터 정제된35S-메티오닌 표지 p35를 녹농균 V8 프로테아제로 부분 분해시키고, 생체외 번역으로부터 또는 항-사이클린D1 면역침전으로부터 얻어진 유사하게 처리된 사람 p35사이클린 D1과 비교하였다. 항-CDK5 면역침전물로부터의 p35의 V8 단백질 분해 패턴은 사이클린 D1의 패턴과 동일하였지만, 사이클린 D3의 패턴과는 상이하였다. 유사한 실험을 또한 수행하여 p33의 동일성을 확인하였다. CDK5-결합된 p33의 부분적 단백질분해 패턴은 생체외에서 번역된 사람 사이클린 D3의 패턴과 동일하였고 D1과는 상이하였다. 반대로, 사이클린 D1-결합된 p31의 부분적 V8 분해 패턴은 생체외 번역으로부터 또는 항-CDK5 면역침전으로부터 얻어진 CDK5와 동일하였다.
(iii) 사이클린 D와 결합하는 CDK2
사이클린 D1-결합된 p33(예를 들어 항-사이클린 D1 침전물에서)의 겉보기 분자량, 및 또한 p33CDK5와 G8 항체와의 교차 반응성은 p33이 CDK2일 것이라는 가능성을 시사한다. 이를 시험하기 위해, [35S]메티오닌 표지화된 WI38 세포 용해물의 항-CDK2 침전물을 항-사이클린 D1 침전물과 비교하였다. 예측된 바와 같이, 항-C 말단 CDK2 혈청은 33kDa 밴드의 부분적 녹농균 V8 단백질분해 패턴을 생체외 번역된 CDK2의 그것과 비교함으로써 p33CDK2인 것으로 확인된 33kDa 단백질을 침전시켰다. 더욱이, p33CDK2는 항-사이클린 D1 침전물 중에 존재하는 p33과 함께 이동하였다. 상호적으로, 항-CDK2 혈청은 또한 사이클린 D1과 함께 이동하는 35kDa 단백질을 침전 시켰다.
CDK2와 사이클린 D1 사이의 가능한 결합의 존재에 대한 추가의 증거를 찾기위해, WI38 세포 용해물을 항-사이클린 D1으로 면역침전시키고, SDS-PAGE 상에서 분리시킨 후, 항-CDK2 항혈청으로 면역블롯팅시켰다.
카르복시-말단 펩티드에 대한 항-CDK2 항체를 발생시키고[Pagano et al., EMBO J. 11:961-971 (1992)], 이것의 특이성을 박테리아 발현 사람 CDC2, CDK2, CDK3, CDK4 및 CDK5를 면역블롯팅시킴으로써 기록하였다. 상기 항체에서는 CDK2만이 인지되었고, 나머지 네 개의 CDK 단백질은 인지되지 않았다. CDK2 단백질은 항-CDK2 또는 항-사이클린 D1과 면역침전된 WI38 세포 용해물에서는 검출되었지만, 면역전 혈청 또는 경합하는 항원성 펩티드로 사전 인큐베이션된 항-CDK2와 침전된 용해물에서는 검출되지 않았다. 상호 웨스턴 블롯 실험에서, 세포 용해물은 항-CDK2와 면역침전되었고, 항-사이클린 D1으로 블롯팅되었다. 사이클린 D1은 항-사이클린 D1 및 항-CDK2 면역침전물에서 검출되었지만, 면역전 혈청 또는 경합용 CDK2 펩티드와 예비 인큐베이션된 항-CDK2 항혈청으로부터의 침전물에서는 검출되지 않았다.
CDK2가 또한 사이클린 D3와 결합하는 지를 시험하기 위하여, 사람 사이클린 D3의 C-말단 펩티드에 대한 항혈청을 사용하여 형성된 면역침전물 (실시예 1, 실험 과정 참조)을 항-CDK2 항혈청으로 블롯팅하였다. CDK2는 항-사이클린 D3 침전물에서는 약하게 검출되었지만, 경합용 항원 펩티드와 예비 인큐베이션된 항-사이클린 D3 항혈청과의 대조 침전물에서는 검출되지 않았다.
최종적으로, CDK2와 사이클린 D 사이의 결합을 추가로 확인하기 위하여, 부분 단백질분해 맵핑을 수행하였다. 초기에는, 사이클린 D1-결합된 p33의 단백질분해 맵핑을 만들어서 이것을 CDK2와 비교하기 위한 시도가 이루어졌다. 그러나, 항-사이클린 D1 침전물 중의 여전히 우세한 또다른 단백질 키나아제와 CDK2가 함께 이동하기 때문에, 상이한 단백질분해 패턴이 얻어졌다. 따라서, 역실험을 수행하였다. 항-CDK2 면역침전물 중의 35kDa 밴드를 SDS-폴리아크릴아미드 겔로부터 절출시키고, V8 프로테아제를 사용하여 부분적으로 분해시키고, 전기영동적으로 분리시킨 후, 생체외 번역으로부터 또는 항-사이클린 D1 면역침전으로부터 유도된 V8 절단 p35사이클린 D1과 비교하였다. 단백질 분해의 패턴은 각각의 경우에 동일하였다.
(iv) 사이클린 D1에 결합된 우세한 p33 단백질인 pSK-J3/CDK4
사이클린 D1-결합된 p33의 단백질 분해 패턴과 CDK2의 단백질 분해패턴이 상이하다는 것은 대부분의 D1-결합된 p33이 CDK2 이외의 단백질에 상응함을 시사한다. 세린/트레오닌 키나아제의 보존된 영역으로부터 유도된 혼합된 올리고누클레오티드 프로브를 사용하는 스크린에서 최초로 확인된 PSK-J3으로 불리우는 단백질 키나아제[Hanks, S. K., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:388-392 (1987)]는 사이클린 D 결합 성질을 갖는 것으로 믿어졌다.
PSK-J3의 예상된 분자 질량은 p33의 분자 질량과 근접한 34kDa이다. 하기 설명되는 바와 같이, PSK-J3은 D 사이클린과 결합하기 때문에, 이하에서는 CDK4로 언급된다. 항-CDK4 혈청과의 세포 용해물로부터 침전된 생체외 번역된 CDK4는 CDK2 및 D1-결합된 p33과 동일한 전기영동적 이동성을 나타내었다. 항-CDK4 항혈청에 의해 침전된 CDK4의 동일성은 이것의 부분적인 V8 맵핑 패턴을 생체외 번역된 CDK4의 패턴과 비교함으로써 확인하였다.
사이클린 D1-결합된 p33이 CDK4인지를 직접적으로 시험하기 위하여 면역침전-웨스턴 블롯팅 실험을 수행하였다. 항-CDK4 혈청은 항-CDK4에 의해 침전된 CDK4와 동일한 이동성을 갖는 항-사이클린 D1 면역침전물 중에 존재하는 33kDa 단백질과 반응하였지만, CDK2 또는 CDK5의 세포 용해 침전물과는 반응하지 않았다. 상호적으로, 항-CDK4 항혈청은 또한 항-사이클린 D1 항체에 의해 검출된 35kDa 단백질을 침전시켰다. 사이클린 D1-결합된 p33의 동일성을 추가로 확인하기 위해, p33의 부분적 V8 분해 패턴을 면역침전된 CDK4 및 CDK2의 패턴과 비교하였다. 사이클린 D1-결합된 p33은 COK4의 패턴과 매우 유사한 패턴을 보였지만, CDK2의 패턴과는 거의 유사하지 않았다. 이러한 결과는 CDK4가 WI38 세포의 항-사이클린 D1 침전물에서 CDK2 보다는 상당히 더 풍부함(최소한 메티오닌 표지화에 의해 대략적으로 검정됨)을 시사하는 것이다. 마찬가지로, 항-CDK4 면역침전물에서 발견할 수 있는 33kDa 폴리펩티드(p33)는 부분적 V8 펩티드 맵핑에 의해 사이클린 D3인 것으로 확인되었다.
(v) p21과 사이클린 D1 및 CDK2와의 결합
항-사이클린 D1 혈청으로 침전된 [35S]메티오닌 표지 WI38 용해물에서, 21kDa단백질(p21)은 사이클린 D1과 특이적으로 결합하는 것으로 여겨진다. p21은 면역전 혈청과의 침전물 또는 검출할 수 없는 수준의 사이클린 D1을 함유하고 있는 293 세포로부터 유도된 항-사이클린 D1 침전물 중에는 존재하지 않았다. p21과 사이클린 D1과의 특이적 결합은 CDK2, CDK4 및 CDK5에 대한 혈청으로 형성된 면역침전물 중의 함께 이동하는 21kDa 단백질의 존재에 의하여 더욱 지지되었다. 항-CDK2 항혈청이 경합하는 CDK2 펩티드로 사전 차단되는 경우에, p21 밴드 및 또한 p33CDK2및 p35사이클린 D1은 발견되지 않았다. 마찬가지로, 항혈청이 CDK5 카르복시-말단 항원 펩티드와 사전 인큐베이션되는 경우, p21은 항-CDK5 면역침전물에도 존재하지 않았다. p21은 이 연구에서 사용된 항-CDK 또는 항-사이클린 D 항체 중 어느 것에 의한 웨스턴 블롯에서도 인지되지 않았다. 또한, 293 세포 중의 총 면역침전가능한 CDK2가 WI38 세포에서의 CDK2와 유사하더라도, p21 밴드는 293 세포 용해물로부터의 CDK2 면역침전물 중에 존재하지 않았다. 이러한 발견은 CDK2와 p21의 결합이 사이클린 D에 의존적임을 시사한다.
사이클린 D1 면연침전물 및 CDK2 면역침전물로부터의 p21이 동일한 폴리펩티드에 상응하는 것인 지를 측정하기 위하여, 각각의 공급원으로부터 정제된 p21의 부분적 V8 단백질 분해 패턴을 비교하였다. 이들은 실제로 동일하였다. 항-CDK5 항혈청에 의해 침전된 p21은 또한 사이클린 D1-결합된 p21과 동일한 것으로 밝혀졌다. 항-CDK4 면역침전물 중의 p21을 또한 단백질분해적으로 맵핑하였다. 그 결과, 사이클린 D1-결합된 P21과 동일한 패턴을 얻어졌다. p21은 사람 맥스(max) 단백질 또는 p21ras와 일치하지 않았는데, 그 이유는 p21의 전기영동적 이동성이 다른 것 보다 빠르고, 항-사람 ras 항체에 의해 웨스턴 블롯으로 인지되지 않았기 때문이다.
(vi) 사이클린 D1-결합된 p36인 PCNA
상술한 바와 같이, WI38 세포의 항-사이클린 D1 침전물은 21kDa, 31kDa 및33kDa의 결합된 폴리펩티드 및 또한 36kDa의 우세한 단백질을 나타낸다. p36은 면역전 혈청 또는 293 용해물을 사용하는 경우 대조 침전물 중에서 검출되지 않았다. 36kDa 단백질은 CDK2, CDK4 및 CDK5 면역침전물에서는 낮은 수준으로 검출되었지만, 경합용 펩티드와 사전 인큐베이션된 항혈청과의 침전물에서는 검출되지 않았다.
p36의 동일성을 확립하기 위한 시도를 하는 한편, 네 가지 결과는 p36이 사람 증식성 핵 항원인 PCNA일 것이라는 가능성을 시사하였다. 먼저, 증식성 WI38 세포의 비동기성(asynchronous) 집단에서, 사이클린 D1은 비록 그것의 분포가 PCNA의 얼룩 패턴과 동일하지는 않더라도, 주로 핵 단백질인 것으로 관찰되었다[참조 : Bravo, R. and H. MacDonald- Bravo, EMBO J. 4:655-661 (1985); Madsen, P. and J. E. Celis, FEBS Lett. 193:5-11 (1985)]. 둘째로, 사이클린 D1의 수준은 유사분열적으로 활성화된 WI38 세포에서 비교적 일정하지만, [35S]메티오닌 표지화된 사이클린 D1 면역침전물 중의 p36의 수준은 정지 세포에서는 낮았고, 자극 10-14시간 후에는 증가하였다. 혈청 자극 10-14시간 후에, 많은 WI38 세포들이 혈청-자극된 3T3 섬유아세포에서 PCNA 합성의 개시와 일치하는 때인 후기 G1에 있었다[참조 : Bravo, R. and H. MacDonald-Bravo, EMBO J. 3: 3177-3181 (1984); Celis, J. E. and A. Celis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3262-3268 (1985); Madsen P. and J. E. Celis, FEBS Lett. 193:5-11 (1985)]. 셋째로, p36의 겉보기 분자량은 PCNA의 겉보기 분자량과 유사하다. 마지막으로, 항-PCNA 항체는 전기영동적 이동성이p35사이클린 D1과 유사한 35kDa 폴리펩티드를 침전시켰다. 항-PCNA 항체에 의해 침전되는 p36의 동일성은 그것의 V8 펩티드 맵을 생체외 번역된 PCNA의 그것과 비교함으로써 PCNA로서 확인되었다.
p36이 PCNA라는 가능성을 직접적으로 시험하기 위하여 면역침전-웨스턴 블롯 실험을 수행하였다. PCNA는 항-사이클린 D1, 사이클린 D3, CDK2 및 CDK5 면역침전물에서 쉽게 검출되었지만, 각각의 대조 침전물에서는 검출되지 않았다. 상호 실험에서, 사이클린 D1 및 CDK2는 또한 항-PCNA 면역침전물에서 검출되었다. 가능하게는 WI38 세포 중의 두 단백질 모두의 낮은 수준 및 웨스턴 블롯에서의 D3 및 CDK5 항혈청의 비교적 불량한 감수성으로 인해, PCNA 침전물 중에서 사이클린 D3 또는 CDK5를 신뢰할만하게 검출할 수 없었다.
PCNA와, 사이클린 D1 및 CDK2와 결합된 p36 폴리펩티드 사이의 유사성을 추가로 평가하기 위해, p36 밴드를 사이클린 D1과 CDK2 면역침전물로부터 정제하고, SDS-PAGE로 분리시키고, 이들의 부분적 V8 단백질분해 맵핑 패턴을 PCNA의 패턴과 비교하였다. V8 프로테아제에 의한 사이클린 D1-결합된 p36의 분해는 항-PCNA 면역침전물 및 시험관내 번역된 PCNA로부터 유도된 PCNA의 패턴과 동일한 패턴을 나타내었다. 유사하게는, CDK2- 및 CDK5-결합된 p36의 분해 패턴은 또한 PCNA의 패턴과 매칭된다. 사이클린 D1과 결합된 p36은 PCNA이다. 또한, 항-PCNA 면역침전물에서 검출된 p21의 단백질분해 맵핑은 상기 기재된 사이클린 D1-결합된 p21과 동일함을 입증하였다.
(viii) 다른 사이클린의 서브유닛 복합체
PCNA 및 p21은 전술한 바와 같이 사이클린 D-CDK와 결합하여 4원 복합체를 형성할 뿐만 아니라 많은 다른 정상 세포예에서 사이클린-CDK 복합체의 보편적인 성분들로서 존재한다. 항-사이클린 A 항체로 면역침전된 WI38 세포 및 HSF43 세포의 용해물에서, 사이클린 A는 PCNA, CDC2, CDK2 및 p21과 결합하는 것으로 밝혀졌다.
마찬가지로, WI38 및 HSF43 용해물로부터의35S-메티오닌 표지된 항-사이클린 B1 면역침전물의 분석 결과, 사이클린 B1, CDK, p21 및 PCNA를 포함하는 4원 복합체가 밝혀졌다.
이 연구에 사용된 실험 기법은 각각의 단백질 사이의 다중 쌍형태(pair-wise)의 상호작용의 존재사이의 구별을 공식적으로는 가능하게 하지는 않지만, 사이클린 D, PCNA, CDK 및 p21이 4원 복합체를 형성하는 경우, 데이터는 가장 간단하게 설명된다. 면역침전 반응에서 메티오닌 표지화된 밴드의 세기를 비교한 결과, 모든 사이클린 D가 복합체 중에 존재하는 것은 아니며, 모든 PCNA도 복합체 중에 존재하지 않음을 암시한다. 그러나, 항-사이클린 D 침전물 중의 p36(PCNA), p33(CDK4) 및 p21 밴드의 상대적인 세기는 매우 유사하다. 본원에 제시된 결과는 사이클린 D가 본원에 설명된 결합된 단백질과 함께 또는 이들 단백질없이 생체내에서 추가 파트너와 결합할 수 있다는 가능성을 배제하지 않는다. 특히, 97KD 분자량 마아커의 어느 한 측면을 이동시키는 2개의 폴리펩티드가 항-사이클린 D 침전 반응에서 나타난다.
PCNA는 리딩 가닥 DNA 복제 및 DNA 복구 둘 모두에 필요한 델타중합효소에 대한 필수 보조 인자로서 공지되어 있다[참조 : Prelich, G. et al., Nature, 326:517-520 (1987); Prelich, G. and B. Stillman, Cell 53:117-126 (1988); Toschi, L. and R. Bravo, J. Cell Biol. 107:1623-1628 (1988); M. K. K. Shiviji, et al., Cell, 69:367-374 (1992)]. 이것은 핵의 활성 DNA 합성 부위에 위치하며, 합성이 아닌 PCNA의 정위는 DNA 합성에 의존적이다. 생체외 키나아제 반응에서 각각의 서브유닛 중 임의의 서브유닛의 인산화를 검출하는 것은 불가능하며, 이는 PCNA 및 p21 중 어느 것도 사이클린 D/CDK의 일차 기질이 아님을 시사한다.
PCNA 및 p21과 결합하는 사이클린 D/CDK 효소는 생체내에서 더욱 복잡한 다중 단백질-DNA 합성 복합체로 조립될 것이며, 이중 한 성분은 사이클린 D/CDK의 생리적 기질일 것이다. PCNA는 다른 단백질과 결합되지 않은 단량체 형태로 세포로부터 생화학적으로 정제되는 것이 일반적이었다[참조 : Prelich, G. et al., Nature 346:760-763 (1987)]. 본 연구에 설명된 다중 단백질 복합체는 간과된 것일 수 있는데, 그 이유는 이들이 대부분의 세포 PCNA를 포함하지 않기 때문이다. 대안적으로, PCNA는 이미 공지되지 않았고 사이클린 D와 CDK 단백질을 포함하는 추가의 비-DNA 합성 세포사이클 조절 역할을 할 수 있다. 그러나, 본 연구는 PCNA 기능의 조절제로서의 D-타입 사이클린들의 가능한 기능에 대한 첫 번째 생화학적 표시를 제공한다.
4원 복합체의 중요성은 DNA 종양 바이러스에 의한 세포 형질전환이 사이클린 D 복합체 뿐만 아니라 사이클린 A, CDC2, CDK2, CDK4 및 CDK5 복합체를 포함하는 다른 세포 사이클 복합체의 선택적 서브유닛 재배열과 관련이 있다는 새로운 발견에 의해 강조된다. 특히, SV40 DNA 종양 바이러스 또는 이것의 종양 유전자 생성물인 거대한 T 항원을 정상적인 사람 배수체 섬유아세포(HDF)에 도입시키면, 사이클린 D와 PCNA, CDK(예를 들어 CDK2, CDK4 및 CDK5) 및 p21 사이의 결합이 차단된다. 사이클린 D 및 p21로부터 해리된 후, CDK4 키나아제는 16kDa 폴리펩티드(p16)와 결합하게 된다. 유사하게는, SV40 형질전환은 HDF에서 p21과 사이클린 A의 결합의 감소를 유발시키고; 아데노바이러스 (293 세포주) 또는 사람 유두종 바이러스(HeLa 세포주)로 형질전환된 세포에서 p21은 사이클린 A로부터 완전히 해리된다. 그 후, 19kDa 펩티드인 p19는 사이클린 A와의 복합체 중에 나타난다. 따라서, p21은 정상적인 형질전환되지 않은 세포에서만 사이클린 키나아제와 결합하는 반면, p16, p19 및 가능하게는 다른 관련된 단백질은 형질전환된 세포 중의 사이클린 복합체 중에 존재한다.
II.형질전환된 세포 중의 사이클린 복합체
하기 설명되는 바와 같이, 본 관찰은 세포 분열에서 다수의 중요한 단계에 작용하는 효소의 사이클린/CDK 패밀리가 다양한 종양 발생적으로 형질전환된 세포에서 전체적으로 변경된다는 놀라운 증거를 제공한다. 시험된 사이클린/CDK 패밀리의 각각의 구성원에서 PCNA와 P21은 결합한다. 그러나, DNA 종양 바이러스 SV40 또는 이의 형질전환성 항원(T)으로 형질전환 될 때, 사이클린 D/CDK/PCNA/p21 복합체는 붕괴된다. 형질전환된 세포에서, CDK4는 전체적으로 사이클린 D, PCNA 및 p21로부터 해리되며, 대신에 16kd의 폴리펩티드(p16)와 배타적으로 결합하게 된다. 사이클린 A 또는 B1 및 p21/CDK/PCNA를 함유하는 4원 복합체도 형질전환된 세포에서 서브유닛 재배열을 일으킨다. PCNA 및 p21 둘 모두는 CDC2-사이클린 B1 2원 복합체와 더 이상 결합하지 않는다. 사이클린 A 복합체는 더 이상 p21을 함유하지 않으며, 오히려, 새로운 19kd 폴리펩티드(p19)가 사이클린 A와 결합된 형태로 발견된다. 이러한 패턴은 사이클린-CDK 복합체의 서브유닛 재배열이 SV40-형질전환된 세포에서 뿐만 아니라, 아데노바이러스 또는 유두종 바이러스로 형질전환된 세포에서도 발견되는 경우의 패턴이다. 더욱이, 사이클린-CDK 패밀리의 서브유닛 조성의 패턴은 Li-프라우메니 환자로부터 유도된 p53-결핍 세포 뿐만 아니라, 표피성 A-431 암종 세포, 및 인두 편평상피세포 암종 FaDu와 같은 비바이러스적으로 형질전환된 세포에서 전체적으로 비정상적이었다.
(i) SV40-형질전환된 세포에서 사이클린 D/CDK/PCNA/p21 복합체의 붕괴
상술된 바와 같이, 정상 섬유아세포(예를 들어 WI38 ad HS68)에서 사이클린 D/CDK/PCNA/p21 4원 복합체가 검출되지만, 이러한 복합체는 바이러스적으로 형질전환된 여러가지 다른 세포주(예를 들어, 사람 293 세포주)에서는 검출되지 않았다. 외관상의 차이를 고려하여, 정상적인 배수체 섬유아세포 및 이들의 형질전환된 유도체에서의 사이클린 D 복합체의 서브유닛 조성을 보다 밀접하게 비교하였다. WI38 VA13, 서브라인(subline) 2RA (이하 VA13으로 언급됨)는 WI38 세포주의 SV40 바이러스 형질전환된 유도체이다.35S 메티오닌 표지화된 WI38 및 VA13 용해물의 항-사이클린 D1 면역침전물을 시험하였다. WI38 세포에 대해 상기 설명된 바와 같이, 항-사이클린 D1 항혈청은 사이클린 D1에 상응하는 우세한 35kD 밴드, 및 세 개의 주요 결합 단백질인 p36PCNA, p33CDK4및 p21을 침전시킨다. SV40-형질 전환된 VA13 세포에서, 사이클린 D1의 수준은35S 메티오닌 표지화된 면역 침전물의 자동방사선사진 및 웨스턴 블롯팅에 의해 측정하여 2배 내지 3배 감소한다. 그러나, 세 가지 주요 사이클린 D1-결합 단백질 중 어느 것도 SV40 형질전환된 VA13 세포에서 사이클린 D1과 가시적으로 결합하지 않았다. SV40 형질전환된 세포에서 사이클린 D 복합체의 관찰된 붕괴를 확인하기 위해, 항-CDK4 및 항-CDK2 항혈청을 사용하여 상호 면역침전을 수행하였다. WI38 세포에서, 항-CDK4 항체는 세가지의 주요 결합 단백질, 즉 p36PCNA, p35사이클린 D1및 p21 이외에 CDK4를 침전시켰다. SV40 형질 전환된 VA13 세포에서는, CDK4가 형질전환되지 않은 WI38 세포와 비교하여 유사한 수준으로 존재하는 반면, 항-CDK4 연역침전물에서는 PCNA, 사이클린 D1 또는 p21이 검출될 수 있는 수준으로 존재하지 않았다. 이와 유사한 결과가 또한 또 다른 사이클린 D-결합 키나아제 촉매적 서브유닛인 항-CDK2와의 면역침전물에서 관찰되었다. 사이클린 D1은 WI38 세포 중의 주요 CDK2 결합된 단백질 중의 하나이지만, CDK2의 수준이 형질전환된 세포에서 유사하거나 약간 높다고 하더라도 SV40 형질전환된 VA13 세포에서는 검출가능하지 않다. 또한, CDK2 결합된 p21의 수준은 형질전환된 세포에서는 감소되었지만, 검출가능한 수준으로 존재한다.
몇몇 추가의 정상 사람 배수체 섬유아세포 세포주와 이들의 SV40-형질전환된 유도체들이 시험되었다. 신생아 포피 및 CT10-2C-T1(이하 CT10으로 언급함)으로부터 유도된 배수체 섬유아세포 세포주인 HSF43은 라우스(Rous) 육종 바이러스(RSV) 프로모터에 의해 작동되는 SV40 큰 종양 유전자를 함유하고 있는 플라스미드의 도입에 의해 HSF43으로부터 얻어졌다[Ray et al., J. Cell Biochem. 42: 13-31 (1990)]. 정상 세포 및 형질전환된 세포들의 서브유닛 조성 및 해리 패턴은 WI38 및 VA13 세포에서 관찰된 패턴과 매우 유사하였다. 사이클린 D1은 T-형질전환된 CT10 세포로부터 제조된 항-CDK4, 항-CDK2 및 항-CDC 면역침전물에서는 관찰할 수 없었지만, HSF43 세포에서는 나타났다. 상반되게, CDK4는 CT10 세포 중의 항-사이클린 D1 침전물에서는 관찰할 수 없었다. CDK4-결합된 PCNA 및 p21은 또한 CT10 세포에서 검출되지 않았다. T-형질전환된 세포 중의 p21은 VA13 세포주에서와 같이, 새롭게 확인된 p16 단백질에 의해 대체되는 것으로 나타났다. 또한, 본질적으로 동일한 결과가 사람 배수체 세포주의 다른 쌍, 즉 정상 사람 폐 배수체 섬유아세포 세포주인 IMR-90 및 이것의 T-형질 전환된 유도체 IDH4의 쌍[Shay et al., Biochem. Biophys. Acta 1072:1-7(1992)], 뿐만 아니라 원숭이 세포주인 CV-1의 쌍, 유사 배수체 선장 세포주 및 이것의 SV40-형질전환된 유도체 COS-1의 쌍으로부터 얻어졌다.
형질전환된 세포에서 사이클린 D 복합체의 관찰된 해리를 추가로 확인하기 위해, 면역블롯팅 실험과 결부된 면역침전 실험을 대사성 표지화 실험에서 때때로발생할 수 있는 잠재적인 인위 구조를 방지하기 위하여 수행하였다. 형질전환되지 않은 WI38 또는 SV40-형질전환된 VA13 세포로부터 제조된 전체 용해물을 일련의 항체로 면역침전시키고, 전기영동에 의해 분리시킨 후, 다양한 2차 항체로 블롯팅시켰다. CDK4, CDK2 및 PCNA는 SV40-형질전환된 세포로부터 유도된 항-사이클린 D1 침전물에서 검출되지 않거나(CDK4) 또는 급격히 감소된 수준으로 검출되었다(CDK2 및 PCNA). 각각의 경우에, 직접적인 면역 블롯팅은 절대적인 수준의 CDK4, CDK2 및 PCNA가 정상 세포 및 형질전환된 세포에서 유사함을 확인시켜 주었다. 상반되게, 사이클린 D1은 형질전환된 VA13 세포로부터 유도된 항-CDK2 또는 항-CDK4 침전물에서 검출되지 않았다. 동일한 결과가 다른 쌍의 세포주, 즉, HSF43과 CT10 각각으로부터도 얻어졌다.
(ii) 형질전환된 세포에서의 사이클린 A 및 B 복합체의 서브유닛 재배열
형질전환되지 않은 WI38 세포 및 SV40 형질전환된 VA13 세포에서의 사이클린 A 복합체의 서브유닛 조성을 시험하였다. 상술된 바와 같이, 사이클린 A는 WI38 세포에서 p36PCNA, p33CDC2, 33CDK2및 p21과 결합한다.
SV40-형질전환된 VA13 세포에서, 사이클린 A 자체 및 사이클린 A-결합된 CDC2/CDK2의 수준은 대략 3배 증가하였다. 상반되게, CDC2- 및 CDK2 결합된 사이클린 A의 수준도 또한 2배 내지 3배 증가하였다.
35S 메티오닌 표지화된 세포 용해물의 면역침전에 의해 측정하여 사이클린 A-결합된 p21의 수준은 WI38 세포와 비교하여 VA13 세포에서 감소하였다. 저수준의p21이 또한 사이클린 A의 주요 촉매적 파트너인 CDK2에 대한 항혈청을 사용하여 VA13 세포로부터 제조된 면역침전물 중에 존재한다. 일관되게, 정상 IMR-90 세포 대 이들의 T-형질전환된 IDH 세포, 및 원숭이 CV-1/COS-1 쌍의 세포주 이외에, HSF43 및 CT10 세포를 사용하는 경우 동일한 결과가 얻어졌다.
많은 다른 폴리펩티드가 형질전환되지 않은 세포 또는 형질전환된 세포에 특이적인 사이클린 A 침전물 중에서 인지되었다. 예를 들어, 분자 질량이 42kD인 단백질은 형질전환되지 않은 WI38 또는 HSF43 세포에서 우세한 밴드로서 관찰되지만, 형질전환된 VA13 또는 CT10 세포에서는 관찰되지 않는다. 역으로, T 항원에 해당하는 것으로 여겨지는 95kD의 폴리펩티드는 19kd 폴리펩티드와 같이, 형질전환된 세포에서만 관찰된다(하기 설명 참조).
정상 및 형질전환된 세포에서의 사이클린 B1 복합체의 서브유닛 조성을 또한 시험하였다. 사이클린 D1과 공통적으로, 사이클린 B1/CDK/p21/PCNA의 4원 복합체는 형질전환되지 않은 WI38 및 HSF43 세포와 비교하여 SV40-형질전환된 VA13 세포 및 형질전환된 CT10 세포 둘 모두에서 변경된다. 따라서, PCNA 또는 p21은 형질전환된 세포에서 사이클린 B/CDK와 결합하지 않는다. 그러나, 예상되는 바와 같이, CDC2는 VA13, CT10, 293 및 HeLa 세포에서 사이클린 B1(p62)과 결합한다.
(ⅲ) 다른 DNA 종양 바이러스 형질전환된 세포에서의 사이클린 및 CDK 복합체
사이클린-CDK 복합체가 또한 다른 사람 종양 세포에서도 변경되는지를 연구하기 위하여, 유두종 바이러스 함유 경부 암종 HeLa 세포 및 아데노바이러스 형질전환된 일차 신장 293 세포를 다양한 사이클린 및 CDK 복합체의 서브유닛 조성에 대하여 시험하였다. 이들 세포주는 둘 모두 포유동물 세포 사이클의 생화학적 연구에 널리 사용되어 왔다. 사이클린 D1은 HeLa 세포에서 저수준으로 발현되며, 293 세포에서는 거의 검출되지 않는다. 그러나, 다른 사이클린/CDK 복합체의 서브유닛 조성이 조사될 수 있다.
CDC2-사이클린 B1, CDC2-사이클린 A 및 CDK2-사이클린 A의 잘 확립된 결합은 HeLa 세포 및 293 세포 둘 모두에서 모두 쉽게 검출되었다. 그러나, HeLa 세포 또는 293 세포로부터의 항-CDC2, 항-CDK2, 항-사이클린 A 또는 항-사이클린 B1 면역침전물에서는 p21은 관찰되지 않았다. 따라서, 사이클린 A/CDK/p21/PCNA 및 사이클린 B1/CDK/p21/PCNA의 4원 복합체는 이러한 DNA 종양 바이러스 형질전환된 세포에서 조립되지 않거나 또는 극히 낮은 수준으로 존재한다. 사실상, p21이 19kD의 폴리펩티드로 대체된 것으로 보이는 새로운 사이클린 A 복합체가 나타났다. 유사한 19kD 폴리펩티드는 SV40-형질전환된 사람 VA13, CT10, IDH4 및 심지어는 원숭이 COS-1 세포로부터의 항-사이클린 A 침전물 중에 존재한다. 또한, 293 및 HeLa 세포에서, CDK4의 서브유닛 조성은 T-항원-형질전환된 세포의 조성과 동일하다. 사이클린 D1은 CDK4와 결합하지 않지만(통상적으로 세포로부터의 사이클린 D의 부재에 기인한다), PCNA와 p21도 존재하지 않는다. p21은 HeLa 세포 및 293 세포에서 Pl6으로 대체되었다. 흥미롭게도, CDK4-결합된 P16은 형질전환되지 않은 WI38 또는 HSF43 세포에서 매우 낮은 수준으로 검출된다. 각각의 경우의 단백질분해 맵핑은 HeLa, 293, VA13 및 WI38 세포로부터의 CDK4-결합된 p16이 동일하지만, p21과는 상이함을 나타내었다. 세가지 상이한 바이러스로 형질전환된 세포에서의 p19 및 p16의 존재 및 형질전환되지 않은 세포에서의 p16의 존재는 이들이 바이러스적으로 코드화된 단백질이 아님을 나타낸다.
(iv) Li-프라우메니 세포에서의 사이클린 및 CDK 복합체의 변경
가족성 Li-프라우메니 환자들로부터의 섬유아세포는 이수체화 및 무한증식을 포함하는, 상승된 자발적 비정상율을 나타낸다[참조 : Li et al., J. Natl. Cancer Inst. 43: 1365-1373 (1969); Biscoff et al., Cancer Res. 50: 7979-7984 (1990)]. 이들 세포는 어떠한 공지된 바이러스도 함유하지 않으며; 대신에, 종양 억제 유전자 p53의 단일 염기 이질접합성 돌연변이가 유일하게 보고된 배선(germ-line) 변경이다. 생체외에서 계속된 계대 동안에 Li-프라우메니 섬유아세포의 노화 및 자발적 무한증식을 피하는 것은 야생형 p53 대립형질의 2차적인 손실과 관련된다. 자발적 무한증식 Li-프라우메니 세포주인 LCS041(170회를 초과한 계대)로부터의35S 메티오닌 표지 세포 용해물은 다양한 항체와 면역침전되고, SDS-PAGE에 의해 분석되었다. LCS041 세포에서의 이들 단백질의 대부분의 수준은, 사이클린 A가 정상적인 섬유아세포와 비교하여 훨씬 더 낮은 수준으로 발현되는 것을 제외하고는, 대사적 표지화 및 면역블롯팅에 의해 측정하여 정상적인 배수체 섬유아세포에서의 수준과 유사하다. 사이클린 및 CDK 복합체의 서브유닛 조성은 LCS041 세포에서 전체적으로 비정상적이다. 사이클린 B1-CDC2 복합체는 HeLa 세포 및 293 세포에서와 같이 존재하고, p21 또는 PCNA와 결합하지 않는다. 사이클린 D1-CDK4 결합은LCS041 세포에서 거의 검출할 수 없을 정도의 수준으로 감소되며, PCNA와 p21은 둘 모두 존재하지 않는다. p21은 LCS041 세포에서 연구된 사이클린-CDK 복합체 중 어느 것에서도 검출되지 않았으며, T-항원-형질전환된 섬유아세포에서 발생하는 것처럼 p16 또는 p19 단백질에 의해 대체되는 것으로 여겨지지 않는다. 사이클린-CDK 복합체와 결합된 PCNA의 수준은 또한 모든 경우에 급격히 감소되었다. 직접적인 면역블롯팅은 PCNA의 풍부함이 정상 섬유아세포와 비교할 때 LCS041 세포에서 더 크지만, PCNA는 항-CDC2, CDK2, CDK4, 사이클린 A, 사이클린 B1 및 사이클린 D1에 의해 단리된 면역복합체로부터 급격하게 감소되거나 또는 완전히 존재하지 않음을 나타내었다. 본질적으로 동일한 결과가 또한 또 다른 Li-프라우메니 세포주인 LCS087의 사용에 의해 얻어졌다.
III.p16의 클로닝, 및 CDK4의 억제제
사람 CDK4와 상호작용할 수 있는 단백질을 찾기 위하여, 보다 구체적으로는 p16을 코드화하는 cDNA를 단리시키기 위하여, 2 하이브리드 스크리닝 시스템[Fields et al., Nature 340: 254 (1989)]을 이용하였다. 2 하이브리드 스크리닝은 2가지의 분리된 융합 단백질, 즉 CDK4에 융합된 GAL4 DNA-결합 도메인인 GAL4db-CDK4; 및 HeLa cDNA에 의해 코드화된 단백질들에 융합된 GAL4 활성화 도메인인 GAL4ad-cDNA로부터의 작용성 GAL4 활성제를 재구성하는 것에 의존한다. YPB2를 수용체 효모로서 사용하였는데, 그 이유는 이것이 2가지의 상이한 GAL4-의존성 프로모터, 즉 HIS3 및 LacZ의 조절을 받는 2개의 염색체 유전자를 함유하는 균주이기 때문이다. YPB2는 각각 GAL4db-CDK4 및 GAL4ad-cDNA 융합체를 코드화하는 2개의플라스미드의 혼합물로 형질전환되었고; 히스트딘의 부재하에 성장하고 β-gal의 존재하에 푸른 색으로 전환되는 수개의 클론을 얻었다. DNA 서열화 데이타로부터, 한 그룹이 더 짧은 3' 단부를 갖는 mRNA를 나타냈지만, 각각의 포지티브 클론이 동일한 유전자로부터 유도된 것으로 측정되었다. 이들 cDNA의 서열은 GAL4ad과 상(phase)내에서 추정 분자량이 15,845 달톤인 148개의 아미노산의 단백질을 코드화하는 오픈 리딩 프레임을 함유하였다(참조: SEQ ID NO : 3 및 4). 이 단백질은 이하에서 INK4(CDK4의 억제제; 하기 참조)로서 언급된다. p16INK4의 서열은 표준 방법에 의하여 현재 활용가능한 데이타 뱅크에 존재하는 것들과 비교되었고, 그 결과 유의할 만한 상동성이 없는 것으로 밝혀졌다.
p16INK4가 CDK4와 특이적으로 결합하는지의 여부를 시험하기 위하여, YPB2를 각각 cdc2, CDK2, CDK4, CDK5, PCNA 및 Snfl(분열 효모 키나아제)을 함유하고 있는 여러개의 표적 GAL4db 융합 구성물 뿐만 아니라 GAL4ad-p16INK4 융합체로 동시 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 히스티딘의 존재 또는 부재하에 플레이팅시켰다. GAL4db-CDK4 융합체만이 히스티딘의 부재하에 성장시킬 수 있는 정도로 GAL4ad-P16INK4와 상호작용 하였으며, 이는 상기 쌍의 융합 단백질이 HIS3 유전자의 발현을 증강시킬 수 있는 작용성 GAL4 활성제를 특이적으로 재구성하였음을 시사하는 것이다. 동일한 결과가 β-갈락토시다아제 유전자의 발현을 트랜스액티베이팅(transactivating)시킬 수 있는 능력이 검정된 경우 얻어졌다.
이러한 상호작용의 특이성을 생체외 번역된 (35S)-표지된 CDK를 p16INK4(17)에 결합된 글루타타온-S 트랜스퍼라아제(GST)로 구성된 정제된 박테리아에서 생성된 융합 단백질과 혼합시킴으로써 세포 비함유 시스템에서 추가로 증명하였다. GST-p16INK4융합체는 글루타티온-세파로스 비이드에 결합시킴으로써 회수되었고, 각각의 CDK의 결합은 겔 전기영동에 의해 분석되었다. 전술한 결과와 일치하게, GST-p16INK4는 cdc2, CDK2 또는 CDK5 보다 CDK4에 훨씬더 효율적으로 결합하였다.
p16INK4의 예상 분자량이 16kd에 가깝기 때문에, 형질전환된 세포주에서 발견된 CDK4-결합 p16 단백질과의 p16INK4의 동일성이 측정되었다.
15KD 및 17KD의 2개의 생체외 번역 생성물을 p16INK4 cDNA로부터 수득하였다. 이들 생성물, 및 HeLa 세포들로부터의 CDK4-결합 Pl6 단백질을 N-클로로숙신이미드로 처리하였다. 17KD cDNAINK4-유도된 생성물의 부분 NCS-단백질분해 패턴은 HeLa 세포로부터의 CDK4-결합 p16 단백질로 얻은 패턴과 매우 유사하였으며, 이는 p16INK4 cDNA가 실제로 p16에 상응함을 강력하게 시사하는 것이다. 17KD cDNAINK4-유도된 생성물의 V8 프로테아제 및 p16을 이용한 부분 절단이 또한 유사한 패턴을 나타냈다. 곤충 세포에서 과발현된 p16INK4 단백질이 15KD의 전기영동적 이동성을 갖고, 이것의 NCS 단백질분해 맵 15KD CDNA 유도된 생성물로 얻은 맵과 동일함을 주지하는 것은 흥미로운 일이다. 이것은 사람 세포에서 발견된 실제 p16INK4 및 17KD의 생체외 번역 생성물이 번역후 변형된 단백질들에 상응함을 시사하는 것이다. 곤충 세포에서 과발현된 p16INK4 단백질이 CDK4와 상호작용한다는 사실은 이러한 변형이 상호작용에 필수적인 것이 아님을 시사한다(하기 참조).
p16INK4와 CDK4-결합 단백질 p16 사이의 동일성은 정제된 GST-p16INK4 융합단백질에 대해 발생된 항체를 사용하여 추가로 확인되었다. 이 실험을 위해 여러 개의 사람 세포주, 즉 정상 폐 섬유아세포로부터 유도된 정상 세포주 WI38; SV40 T-항원을 사용한 형질전환에 의해 WI38로 부터 유도된 VA13 세포주; 및 HeLa 세포를 사용하였다. 상기에서 설명된 바와 같이, WI38의 항-CDK4 면역침전물은 CDK4가 사이클린 D1, PCNA, p21 및 p16과 결합한다는 것을 나타내었다. 대조적으로, VA13 및 HeLa 세포에서는, CDK4는 유일하게 p16과 결합하였다. 항-p16INK4 면역침전물은 2개의 형질전환된 세포주, 즉 VA13 및 HeLa 세포에서 쉽게 검출가능하지만 정상 세포주 WI38에서보다는 낮은 수준으로 검출되는 겉보기 분자량이 16KD인 단백질을 함유하였다. 이 단백질은 항-CDK4 혈청과 함께 면역침전된 p16과 동일한 전기영동적 이동성을 가질 뿐 아니라, 동일한 NCS 부분 단백질분해 패턴을 가졌다. p16INK4 이외에, 33KD의 단백질은 V8-단백질 분해 맵핑에 의해 CDK4와 동일한 것으로 입증된 항-p16 공동 면역침전물에서 관찰되었다.
WI38 및 VA13 세포에 존재하는 전사물의 노던 분석은 p16INK4 mRNA가 VA13 세포와 비교하여 WI38 세포에서 수배 정도 덜 풍부함을 나타내었다. 이 차이는 대략적으로 2개의 세포주 사이의 p16 단백질의 양의 관찰된 차이에 상응한다. 이것은 P16INK4 발현이 전사 또는 전사후 수준에서 조절될 것이라는 가능성을 시사한다. 실제로, 3개의 비바이러스적으로 형질전환된 세포주에서 p16INK4의 발현은 겔에 과노출된 후에도 관찰되지 않았다.
p16INK4와 CDK4의 상호작용의 생화학적 결과를 연구하기 위하여, 활성 CDK4-사이클린 D 복합체를 표준 프로토콜에 의해 생체외에서 재구성하였다[참조 : Katoet al., Genes Der 7:331 (1993); Ewen et al.,Cell73: 487 (1993)]. 세가지의 관련 성분들, 즉 CDK4, p16INK4 및 사이클린 D1을 바쿨로바이러스-감염된 곤충 세포에서 발현시켰다. p16INK4, CDK4 또는 사이클린 D1을 각각 과발현시키는 대사적으로 (35S)-표지된 곤충 세포로부터 뿐만아니라 CDK4와 사이클린 D1 둘 모두를 과발현시키는 세포로부터 추출물을 제조하였다. p16INK4의 증가량에 응하여, Rb를 인산화시키려는 CDK4의 능력의 상응하는 감소가 관찰되었다. 이러한 억제는 면역침전에 의해 검출하여 p16INK4와 CDK4 사이의 결합과 상관관계가 있었다. CDK2-사이클린 D2 복합체가 유사한 검정에 사용되는 경우에는 억제가 관찰되지 않았다. CDK4의 억제가 p16INK4로 인한 것임을 확인하기 위해, His-태깅된 p16INK4 융합 단백질(His-P16INK4)을 6개의 히스티딘 잔기의 트랙을 함유하는 20개의 아미노산의 아미노 말단 연장부를 갖도록 생성시켰다. 이 융합 단백질을 바쿨로바이러스-감염된 곤충 세포에서 과발현시켰고, 니켈-아가로스 비이드에 대한 히스티딘 트랙의 고친화성 결합에 의해 정제하였다. His-p16INK4 단백질 제조물은 90%를 넘게 순수한 것으로 입증되었고, 전체 용해물에 의한 억제에 사용된 조건과 유사한 조건하에서 CDK4-사이클린 D1 복합체의 활성을 억제하였다.
IV.발명의 용도
본원에 기술된 조작에 근거하여, 혈액, 소변, 대변, 점액, 타액, 또는 생체 조직(세포 제조물 포함)과 같은 조직 또는 생물학적 샘플로부터 얻어진 세포에서 사이클린 CDK, PCNA, p21, p19 및 p16의 변경된 복합체를 검출 하는 것이 가능하다. 이것은 예를 들어, 복합체의 조성물의 서브유닛 조성의 변경과 세포 형질전환 또는 비정상 세포 증식 사이에 연관이 뚜렷하기 때문에, 진단 또는 예후용으로 사용된다. 본원에 기술된 진단 및 치료법은 개인의 질병 상태 및 복합체 서브유닛의 이러한 재배열과 관련되거나 이러한 재배열에 의해 나타나는 질환을 발생시킬 가능성을 평가하고, 치료 효과를 모니터(서브유닛 재배열에 대한 약물(들)의 효과를 평가함으로써)하기 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, CDK, 사이클린, PCNA 및 저분자량 폴리펩티드(예를 들어 p21, p19 및 p16) 사이의 상호작용을 인지하는 제제가 개발될 수 있다. 이 제제는 형질전환 상태를 시험하려는 세포의 샘플과 접촉할 수 있고, 복합체 중의 특정 서브유닛의 존재는 형질전환을 나타낼 것이다. 예를 들어, CDK-p16 복합체는 사이클린 A-p19 복합체와 같이 형질전환을 나타낼 것이다. 대안적으로, 서로 다른 서브유닛을 인지하는 제제가 함께 사용되어, 서브유닛 중에서 상호작용의 존재를 측정할 수 있다. 예를 들어, p21을 인지하는 제제가 사이클린 또는 사이클린 키나아제를 인지하는 제제와 함께 사용되어, p21이 사이클린 또는 사이클린 키나아제와 함께 복합체를 형성하는지의 여부를 측정할 수 있다.
상기 방법에서 제제로서 사용하기 위해 4원 복합체의 화합물과 특이적으로 반응하는 항체가 공지된 방법의 사용으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 적합한 숙주(예를 들어, 토끼, 마우스, 래트, 돼지)에 D-타입 사이클린(이에 대해 항 혈청이 바람직함)을 주입시키고, 항체를 생성시키기에 충분한 시간후에 숙주 동물로부터의 혈액을 채혈함으로써 항혈청이 생성될 수 있다. 공지된 기술의 사용으로 단클론성 항체가 또한 생성될 수 있다[참조 : Sambrook, J. et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) ; Hallow, E. and D. Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York(1988)]. 일반적으로, CDK5, CDK4 및 다른 CDK, p21, p19, p16 및 사이클린과 특이적으로 반응하는 항체가 또한 공지된 방법의 사용으로 생성될 수 있다.
예시적 구체예에서, 항체는 CDK4/p16 복합체에 대해 발생한다. 면역원 형태의 이러한 복합체의 생성을 촉진시키기 위해, CDK4/p16 복합체가 화학적 교차결합에 의해 생성될 수 있다. 또 다른 구체예에서, CDK4/p16 융합 단백질이 각각의 단백질로부터 유도된 폴리펩티드 서열 사이의 불포화 된 폴리펩티드 링커를 도입시키기 위한 단일 사슬 항체 기술의 사용으로 생성된다. 상기 링커는 융합 단백질의 향상된 가요성을 촉진시켜서, 각각의 서브유닛을 서로 자유롭게 상호작용시키고, 2개의 단편 사이의 입체 장애를 감소시킬 뿐만 아니라, 각각의 단편의 적합한 폴딩(folding)을 일으킨다. 링커는 단백질의 2개의 도메인 사이의 불규칙적 코일에 존재하는 것으로 결정된 서열과 같은 천연 기원을 가질 수 있다. 대안적으로, 링커는 합성 기원일 수 있다. 예를 들어, 서열(Gly4Ser)3가 합성의 구조화되지 않은 링커로서 사용될 수 있다. 이러한 타입의 링커는 문헌[Huston et al., (1988) PNAS 85:4879; and U.S. Patent No. 5,091,513]에 기술되어 있다. 따라서, CDK4/p16 복합체를 모방하는 면역원성 복합체가 생성될 수 있고, 단리된 서브유닛가 아니라 복합체를 인지하는 후속 항체가 단리된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 특히 세포에서 p16 농도를 검출하기 위한 검정 및 키트를 포함한다. p16에 대해 특이적인 항체(본원에 기술된 바와 같음), 또는 p16 전사물의 mRNA 수준을 검출하도록 유도된 핵산 프로브가 사용되어, 형질전환된 세포를 검출할 수 있다. 상기 기술된 바와같이, p16 mRNA 및 아마도 p16 단백질의 수준은 정상 세포에 비해 형질전환된 세포에서 증가한다. p16 유전자 발현의 수준을 검출하는 것은 형질전환된 세포의 존재를 측정하는 데에 진단적으로 유용하다. 예시적 구체예에서, 인시튜 하이브리드화 검정이 p16 서열에 대해 유도되고 표준 프로토콜에 의해 생성된 핵산 프로브를 사용하여 수행될 수 있다[참조예 : 터브(Taub) 등의 미국 특허 제 4,820,630호 ; 팔코우(Fallkow) 등의 미국 특허 제 4,358,935호 ; 및 브레써(Bresser) 등의 미국 특허 제 5,225,326호].
본 발명의 바람직한 검정은 p16/CDK4 복합체를 특징으로 하는 형질 전환된 세포와 형질전환되지 않은 세포 사이의 p16 수준에서 양적 차이를 확인할 수 있게 해준다. 간단하게, 단일 세포 현탁액으로서 또는 조직 슬라이스로서 세포는 유리 슬라이드와 같은 고형 지지체 중에 침착될 수 있다. 대안적으로, 세포는 1㎖ 당 약 105내지 106개의 세포의 단일 세포 현탁액에 넣어진다. 세포는 핵산 프로브를 사용할 경우에 세포의 가장 우수한 공간 분해 및 최적 하이브리드화 효율, 또는 항-p16 Abs를 사용할 경우에 최적 결합 친화도 및 특이성을 제공하는 고정제를 선택함으로써 고정된다.
핵산 프로브의 경우에, 고정을 달성하는 동일한 용액 중에서 하이브리드화가 수행될 수 있다. 상기 용액은 고정제 및 포름아미드와 같은 화학 영양제(chaotropic agent) 둘 모두를 함유한다. 진한 염화리튬 또는 아세트산 암모늄 용액과 같은 하이브리드 안정화제, 완충제, 비-특이적 결합을 감소시키기 위한 저분자량 DNA 및/또는 리보소옴 RNA(50개의 염기까지 크기화 됨), 및 세포내로의 프로브 도입을 촉진시키기 위한 다공성 발포제가 또한 상기 용액에 포함된다. 바나딜 리보누클레오시드 복합체와 같은 누클레아제 억제제가 또한 포함될 수 있다.
하이브리드화 용액에 p16 프로브가 첨가되어, 표적 폴리누클레오티드와 혼성된다. 가장 바람직한 프로브는 단일 가닥 안티센스 프로브이다. 세포 mRNA에 대한 하이브리드화를 위해, 길이가 약 75 내지 150개 염기인 프로브가 사용된다. 프로브를 함유하는 혼성화 용액은 부동화 세포의 사용의 경우에 세포를 덮기에 충분한 양으로 첨가된다. 그 후, 세포는 최적 온도에서 인큐베이션된다.
프로브는 하이브리드화 반응에 앞서 검출 가능하게 표지화될 수 있다. 대안적으로, 하이브리드화 생성물에 결합하는 검출가능한 표지가 선택될 수 있다. 프로브는 본 발명을 실시하는 데에 사용되는 임의의 검출가능한 기로 표지화될 수 있다. 이러한 검출가능한 기는 검출가능한 물리적 또는 화학적 성질을 갖는 모든 물질일 수 있다. 이러한 검출가능한 표지는 면역 검정의 분야에서 널리 개발되어 왔으며, 가장 일반적으로, 이러한 방법에 유용한 표지가 본 발명에 적용된다. 효소[참조 : Clin. Chem., 22 : 1243 (1976)], 효소 기질[참조 : Britsh Pat. Spec. 1,548,741], 조효소[참조 : U.S. Pat. No. 4,230,797 and 4,238,565] 및 효소 억제제[참조 : U.S. Pat. No. 4,134,792]와 같은 효소적 활성기 ; 형광 마아커[참조 : Clin. Chem., 25 : 353 (1979)]; 발색단 ; 화학발광 및 생물학적 발광 마아커와 같은 발광 화합물[참조 : Clin. Chem., 25 : 512 (1979)]; 특이적 결합성 리간드 ; 근위 상호 작용 쌍 ; 및3H,35S,32P,125I 및14C와 같은 방사성동위원소가 특히 유용하다.
유사한 방식으로, 항-p16 항체가 표지화되고, 세포의 샘플에서 p16 단백질의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 세포의 형질전환을 억제 또는 감소시키는 능력에 대해 화합물 또는 분자를 스크리닝하는 방법을 포함한다. 형질전환을 억제하는 능력에 대해 평가하려는 화합물 또는 분자는, 세포내로의 화합물 또는 분자의 도입을 위해 적합한 조건하에서 세포와 접촉한다. 세포의 형질전환은 사이클린 복합체에서 서브유닛의 선택적 재배열을 유발시킬 것이다. 평가하려는 화합물 또는 분자의 존재하의 서브유닛의 재배열의 속도 또는 정도와 적합한 대조표준(예를 들어 시험 약물이 첨가되지 않은 동일한 유형의 세포)의 속도 또는 정도와의 비교는 서브유닛 재배열을 억제시키려는 화합물 또는 분자의 능력 또는 무능력을 입증할 것이다. 서브유닛 재배열을 억제하는 약제가 또한 본 발명의 주제이다.
예를 들어, 단백질 키나아제-D 타입 사이클린 복합체 형성은 직접적 방식으로, 예를 들어 단백질 키나아제 또는 D-타입 사이클린과 결합하거나, 다른식으로 사이클린과 단백질 키나아제 사이의 물리적 결합에 간섭하여, 효소의 촉매 활성을활성화시키거나(예를 들어, 인터킬레이션에 의해) 차단시키는 약제 또는 다른 제제를 세포내에 도입시킴으로써 억제될 수 있다. 이것은, 내인성 D-타입 사이클린과 같이 단백질 키나아제를 결합시키지만, 그 결합이 효소의 활성화를 유발시키거나 또는 중단 또는 파괴시키지 않는, 키나아제 또는 사이클린 또는 펩티드 또는 저분자량 유기 화합물을 결합시키는 항체에 의해 수행될 수 있다. 이를 위해 사용하려는 펩티드 및 작은 유기 화합물은, D-타입 사이클린의 아미노산 서열의 분석에 근거하여, 결합을 위해 필요한 잔기를 포함하고, 존재시에 활성화를 야기시키는 잔기를 배제하도록 설계될 수 있다. 이것은 예를 들어, 결합 부위(들)을 계통적으로 맵핑하고, 활성화를 위해 필요한 부위(들)을 인지하거나 또는 다른식으로 결합시키지만, 활성화를 야기시키지 않는 분자를 설계함으로써 수행될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, D-타입 사이클린의 조직에서의 발현, 뿐만 아니라 CDK와 함께 형성된 복합체의 발현은 차이가 있다. 따라서, 특정 D 타입 사이클린 및 CDK로 이루어진 복합체의 활성 및/또는 수준에 간섭(억제)하도록 설계된 제제(예를 들어, 항체 또는 안티-센스 또는 다른 핵산 분자)의 사용에 의해 세포의 유사분열 능력을 선택적으로 감소시키는 것이 가능하다. 예를 들어, 중추 신경계 또는 다른 비-조혈 조직을 수반하는 종양을 치료하는 데에 있어서, 사이클린 D1을 선택적으로 억제시키는 제제는, D1이 차별적으로 발현되는 것으로 입증되었기 때문에(신경기관의 세포에서 특히 고수준으로 발현됨), 특히 유용한 것으로 기대될 수 있다.
D-타입 사이클린, CDK, PCNA 및 p21의 복합체의 생성은 또한, CDK/D-타입 사이클린 복합체 생성을 억제시키기 위해 상기 기술된 바와 유사한 방식으로 억제될 수 있다. 즉, 복합체 생성은 직접, 예를 들어, 복합체의 한 성분을 결합시키거나 다른식으로 복합체 성분의 물리적 결합에 간섭하는 약제 또는 제제를 사용함으로써 방지될 수 있다. 복합체 생성은 또한, D-타입 사이클린-단백질 키나아제 복합체 생성을 막기 위해 상기 기술된 방식과 유사한 방식으로, 복합체의 한 성분을 코드화하는 DNA 및/또는 RNA의 전사 및/또는 번역을 방지하는 것과 같은 간접 방식으로 방지될 수 있다. 대안적으로, 복합체 생성은 구성 성분 중 하나 이상의 성분을 분해시킴으로써 간접적으로 억제될 수 있다.
예를 들어, 4원 복합체를 형성시키는 사이클린 D2 또는 사이클린 D3의 능력을 선택적으로 억제하는 약제가 사용될 수 있다. 나머지 각각의 복합체 성분도 복합체 생성에 대한 작용 또는 이용성이 변할 수 있는 표적물 이다. 예를 들어, D-타입 사이클린과 복합체를 형성하는 CDK2, CDK4, CDK5 및 다른 사이클린 의존성 키나아제는, 4원 복합체내로의 혼입을 위한 작용 또는 이용성이 억제되거나 또는 증강될 수 있다. PCNA 작용 또는 이용성을 변경시키거나 p21 작용 또는 이용성 또는 p16 작용 또는 이용성을 변경시키는 약제 또는 제제가 또한 사용되어, 세포 분열을 억제시키거나 증강시킬 수 있다. 각각의 4원 복합체 성분의 경우에, 결합에 대해 복합체 성분을 모방하지만 활성 영역(들)이 결핍된 작은 펩티드 또는 다른 유기 분자와 같은 제제를 세포내에 도입시켜서, 정상적으로 생성된 복합체의 활성 또는 상호작용이 결핍된 복합체의 생성을 야기시키는 것이 가능하다.
복합체 형성의 직접적인 억제는 비특이적일 수도 있다(즉, D-타입 사이클린함유 4원 복합체를 형성하는 세포의 대부분 또는 모든 세포에 영향을 미칠 수 있다. ) 이것은 예를 들어, 4원 복합체(예를 들어 PCNA)의 공통 성분의 작용 또는 이용성을 억제하는 약제를 세포 내로 도입시킴으로써 이루어질 수 있다.
대안적으로, 4원 복합체의 간접적인 억제도 가능하다. 즉, 이용할 수 있는 복합체 성분(예를 들어, D-타입 사이클린, CDK, PCNA 또는 p21)을 덜 유발시키는 작용을 하는 약제 또는 제제가 사용될 수 있다. 이러한 약제 또는 제제로는, 전사 또는 번역을 차단시키는 안티센스 올리고누클레오티드, 및 복합체 성분들을 4원 복합체 내로 혼입시키기 전 또는 후에 분해시키는 효소와 같은 것들이 있다.
세포 사이클 출발을 변경시켜서, 특히 세포 분열을 억제시키는 본 발명에 유용한 약제 또는 제제는 본 발명의 방법에 사용하기 위해 계획된 현존하는 화합물 또는 분자(예를 들어 작은 유기분자, 안티센스 올리고누클레오티드, 및 무기 물질) 또는 물질일 수 있다. 어느 경우에서도, 이러한 약제는 본 발명의 방법에 의해 확인될 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 상호작용 트랩 검정은 사이클린, 특히 D-타입 사이클린 뿐만 아니라 p16/CDK4 복항체와의 복합체 형성을 차단시킬 수 있는 제제를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기에서 설명된 2 하이브리드 검정이 이러한 검정에 이용될 수 있다. 예시적 양태에서, CDK4 및 p16을 함유하는 본원에 설명된 바와 같은 GAL4 활성화제 융합 구성물은 CDK4/p16 복합체의 형성을 차단하기 위한 후보 제제의 능력을 측정하는 데에 사용된다. 각각의 구성물로 형질전환된 세포는 후보 제제와 접촉 되며, 리포터 유전자(상기에서처럼, 예를 들어 β-갈락토시다아제)의 발현 수준이 검출된다. 발현의 감소는 복합체의 억제를 나타낼 수 있다.
또한, 3 하이브리드 검정은 CDK/사이클린 복합체를 억제하지 않는 CDK4/p16의 억제제를 검출하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, p16 및 D-타입 사이클린이 각각 상이한 DNA 서열을 인지하는 불연속 단백질의 DNA 결합 도메인을 구성하는 융합 단백질의 일부인 구성물이 생성될 수 있다. 그 후, CDK4이 활성 도메인과 함께 융합 단백질로서 생성되고, 이것과 p16 융합 단백질과의 상호작용이 하나의 리포터 유전자의 발현을 유발시키는 반면, 이것과 사이클린 D 융합 단백질과의 상호작용은 상이한 리포터 유전자의 발현을 유발시킨다. 예를 들어, p16 융합 단백질은 루시페라아제 유전자의 발현을 구동시키는 한편, 사이클린 D 구성물은 약물-내성 마아커의 발현을 제공한다. 따라서, p16/CDK4 상호작용을 억제하는 제제의 존재하에서, 약물 내성 마아커의 발현은 사이클린 D/CDK4 복합체가 파괴되지 않음을 시사한다.
또한, p16의 억제능력이 제공된 경우, 본 발명은 증식억제제로서 사용될 수 있는, p16의 특정 위치의 펩티드 모방 유사체가 생성되도록 상기 공지된 용도를 추가로 고려한다. CDK4와 p16의 결합 상호작용은 돌연변이 및 상기에서 설명된 상호작용 트랩 정정의 사용에 의해서와 같이, 쉽게 확인 될 수 있다. 마찬가지로, p16으로부터 유도된 펩티드 단편은 상기에서 설명된 것처럼 CDK4/사이클린 복합체를 파괴하기 위한 이것들의 능력에 대해 검정될 수 있다.
적합한 약물 또는 제제가 확인된다면, 이것은 약물 또는 제제를 원하는 효과(즉, 세포분열의 변경)를 갖기에 충분한 양으로 세포안에 도입시키기는 데에효과적인 어떠한 경로를 통해서도 개체, 특히 인간 또는 다른 척추 동물에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 선택된 약제는 정맥내 투여되거나, 근내 투여되거나, 종양 내로의 직접적인 주입되거나, 위장관을 통해 투여되거나(예를 들어 경구 투여), 복막내 투여되거나, 비내 투여될 수 있다. 일부 경우에, 생체밖의 투여가 적합하다(예를 들어, 혈액 또는 골수를 신체로부터 분리해내고, 처리하고, 체내로 복귀시킨다.).
일반적으로, 세포 분열을 변경시키는데 사용되는 약물 또는 제제는 생리적 담체(예를 들어, 완충액 또는 생리적 식염수), 안정화제, 보조제 및 풍미제가 포함될 수도 있는 제제물 중에 포함될 것이다. 투여될 약물의 양은 경험적으로 결정될 수 있으며, 수용자의 연령, 체중 및 신장 및 치료하려는 질환의 심각성과 같은 고려사항에 의존하여 변할 것이다.
본 발명의 D-타입 사이클린과 특이적으로 반응하는 항체 또한 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 항-D 타입 사이클린 항혈청은 항혈청이 요구되는 D-타입 사이클린을 적절한 숙주(예를 들어 토끼, 마우스, 래트, 돼지)에 주입시키고, 항체가 생성되기에 충분한 시간이 지난후 숙주 동물로부터 혈액을 채혈함으로써 생성될 수 있다· 단클론성 항체 또한 공지된 기술에 의해 생성될 수 있다[참조 : Sambrook, J. et al., Molecular cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) ; Hallow, E. and D. Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harobr Press, New York (1988)]. CDK5와 특이적으로 반응하는 항체가 또한 공지된 방법에 의해 제조될 수있다.
본 발명은 사이클린, 특히 D-타입 사이클린의 기능을 억제하거나 감소시키는 능력에 대해 화합물 또는 분자를 스크리닝하는 방법도 포함한다. 예를 들면, 본원에서 설명된 것처럼, D1 또는 D3와 같은 D-타입 사이클린이 발현되는 돌연변이 세포가 사용될 수 있다. D-타입 사이클린을 억제시키는 능력에 대해 평가되는 화합물 또는 분자는 화합물 또는 분자가 세포내로 들어가기에 적합한 조건하에서 세포와 접촉된다. 사이클린의 억제는 세포를 억제시키거나 세포 분열의 속도를 감소시킬 것이다. 세포 분열의 적절한 대조표준(예를 들어, 시험 약물이 첨가되지 않은 동일한 타입의 세포)으로 평가되는 화합물 또는 분자의 존재하에서의 세포분열의 속도 또는 정도의 비교는 사이클린을 억제하는 화합물 또는 분자의 능력 또는 무능력의 증거가 될 것이다. 존재하는 화합물 또는 분자(예를 들어, 발효 액체 배지 또는 화학적 "라이브러리" 중에 존재하는 것들), 또는 이것의 단백질 키나아제의 사이클린 활성을 억제하도록 개발된 화합물 또는 분자는 본 발명을 사용하여 이것들의 효과에 대해 스크리닝될 수 있다. 또한, D-타입 사이클린을 억제 시키는 약제가 본 발명의 주제이다.
본 발명은 또한 본원에서 설명된 4원 복합체의 형성을 변경시키는 능력에 대해 화합물 또는 분자를 스크리닝하는 방법도 포함된다. 이 방법은 D-타입 사이클린을 억제하는 화합물 또는 분자를 확인하기 위해 상기 설명된 방법과 동일한 방법으로 수행된다. 제시된 방법에 있어서, 시험하려는 화합물 또는 분자, 및 D-타입 사이클린 함유 복합체를 형성하는 세포는, 복합체가 형성되고 시험되는 화합물 또는분자가 세포 내로 들어가기에 적합한 조건하에서 조합된다. 복합체 형성은 본원에서 설명된 바와 같이 측정될 수 있다. 복합체 구성요소 또는 복합체 형성의 억제는 세포를 정지시키거나 세포 분열 속도를 감소시킬 것이다. 시험되는 화합물 또는 분자의 존재하에서의 세포 분열의 속도 또는 정도를 화합물 또는 분자의 부재하에서의 속도 또는 정도와 비교하면, 이들 화합물 또는 분자가 세포 분열에 영향을 미치는지의 여부가 증명될 것이다(즉, 시험된 화합물 또는 분자의 부재하에서 보다는 존재하에서 더 작은 정도로 분열되는 것이 화합물 또는 분자가 억제제라는 표시이다). 복합체 형성을 억제하여 결과적으로 세포 분열을 억제시키는 약제 또는 제제가 또한 본 발명의 주제이다.
본 발명은 제한적이지 않은 하기 실시예에 의해 예시될 것이다.
실시예 1
D-타입 사이클린이 다수의 단백질 키나아제 및 DNA 복제 및 회복 인자 PCNA와 결합한다는 것의 입증
(i) 실험 과정
세포
사람의 배수체 폐 섬유아세포 W138 세포는 계대 13에서 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션으로부터 얻었으며, 10% 우태아 혈청으로 보충되고 계대 16-22 사이에서 사용된 배지(Dulbecco-Modified Eagle 배지) 중에서 성장시켰다. 293 세포도 유사하게 배양시켰다.
항체
항-사이클린 D1 항체를 발생시키기 위해, 사람 사이클린 D1 아미노-말단 영역의 202 아미노산 잔기(약 25kDa)를 코드화하는 609 bp DNA 제한 단편[참조 : 문헌[Xiong et al., Cell 65 : 691-699 (1991) 및 Current Biology 1 : 362-364 (1991)]의 제 2도 중의 누클레오티드 143 내지 751로부터의 NCol 단편]을 파아지 T7 발현 벡터인 pET-3d[Studier et al., Methods in Enzymology, 185:60-89 (1990)] 내로 서브클로닝시키고, 대장균 균주 BL21(DE3) 내로 도입시켰다. 박테리아 추출물은 용해 완충액(150 mM NaCl, 50mM Tris HCl, pH 7.5 및 10% 글리세롤) 중에서, 초음파로 세포를 파괴하고 20,000g에서 10분 동안의 원심분리에 의해 상층액을 정화시킴으로써 제조하였다. 불용성 사이클린 D 단백질을 함유한 펠렛을 8M 우레아로 보충시킨 용해 완충액 중에서 재현탁시키고, 실온에서 30분동안 진탕시킨 후, 이 현탁액을 다시 20,000g에서 10분 동안 원심분리시켰다. 불용성 사이클린 D 단백질을 함유한 펠렛을 SDS 샘플 완충액 중에 재현탁시키고 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔상에서 분리하였다. 이 25kDa 사이클린 D 단백질을 가시화시켜서 냉장실 중에서 0.2M KCl을 사용하여 겔을 염색시킨 후에 절단하였다. 겔 조각은 18 게이지 니들을 통한 반복적 통과에 의해 추가로 분쇄하였으며 사이클린 D 단백질은 분쇄된 겔 입자와 0.1% SDS가 함유된 PBS를 42℃에서 수시간동안 인큐베이션시켜서 추출하였으며 토끼에게 주입 시키는 데에 사용하였다. 항-사이클린 D1 면역 글로불린의 친화성 정제를 위해서, 박테리아에서 제조한 p25 단백질을 제조자의 지시에 따라서 Reacti-Gel(6X)와 교차결합시켰다. 친화성 컬럼은 미정제 혈청을 컬럼에 적용시키기 전 및 적용시킨 후에 과량의 0.05% Tween-20이 함유된 PBS를 사용하여 세척하였다. 결합된 면역 글로불린을 글리신-NaCl(pH 2.5)을 사용하여 1.5M Tris-HCl(pH 8.5) 내로 용리시켜 즉시 항체를 중화시켰다. 면역 글로불린 단백질에 의해 발생되는 높은 백그라운드를 감소시키기 위해서, 할로우(Harlow)와 레인(Lane)의 문헌[Antibodies : a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY(1988)]에 따라 친화성 정제된 항-사이클린 D1을 단백질 A 아가로스 비이드에 교차결합시켰다. 웨스턴 블롯상에서, 항-사이클린 D1 항혈청은 박테리아에서 제조된 사람 사이클린 D2와 약하게 교차반응하며, 박테리아적으로 제조된 사람 사이클린 D3와는 매우 불완전하게 교차반응되어, 총 W138 세포 용해물로부터 단일 밴드를 검출하였다. RIPA 완충액(0.1% SDS)을 이용한 면역침전에서, 사이클린 D1-결합된 p36, p33, p31 및 p21은 90%가 넘게 사라진 반면, 사이클린 D1의 양은 NP40(0.5%) 완충액을 이용한 면역침전에서와 동일한 양으로 남아있었다.
항-CDK5 항체 제조를 위해, CYFSDFCPP(밑줄친 아미노산은 CDK5의 카르복시-말단 영역에 상응한다)를 합성하였다. 펩티드를 키홀(keyhoel) 림펫 헤모시아닌(Pierce)에 결합시킨 후, 표준 프로토콜에 의해 토끼를 면역 시키는 데에 사용하였다[참조 : Green et al., Cell 28 : 477-487 (1982)].
항-사이클린 D3 펩티드 항체는 합성 펩티드 CDELDQASTPTDVRDIDL(밑줄친 영역은 사람 사이클린 D3의 카르복시-말단 영역에 상응한다)에 대하여 유사하게 발생시켰다. 그 후, 토끼를 박테리아에서 제조된 온길이 사람 사이클린 D3로 자극시켰다. 사이클린 D3 특이적 면역글로불린을 17-합체 사이클린 D3 펩티드가 Reacti-Gel(6X)에 교차결합된 친화성 컬럼상에서 정제하였다. 친화성 정제된 항-사이클린 D3 펩티드 항체는 웨스턴 블롯에서 박테리아적으로 제조된 사이클린 D1 또는 D2와 교차반응하지 않으며, W138 세포 용해물로부터 사이클린 D1을 면역침전시키지 않았다.
S. 폼베(pombe) p34cdc2(G8)에 대한 항혈청은 앞에서 설명되었다[Draetta et al., Cell 50 : 319-325 (1987)]. 사람 자가 면역 항-PCNA 항 혈청은 일반적으로 공지되어 있다. 웨스턴-블롯에서 사용된 친화성 정제된 항-PCNA 단클론성 항체는 뵈링거 만하임의 제품이다. 면역 침전에 사용되는 친화성 정제된 항-PCNA 단클론성 항체는 온코진 사이언스(Oncogene Science)의 제품이다. 항-CDK2 펩티드 항혈청은 상기 설명되었고[Pagno 등의 EMBO J11 : 961-971 (1992)], CDC2, CDK4 및 CDK5 폴리펩티드와 교차-반응되지 않는다. 항-CDK4 항혈청은 글루타티온 S 트란스페라제와 CDK4의 C-말단 영역의 융합 단백질에 대하여 발생시켰다. 이것은 CDK2 및 CDK5와 교차-반응되지 않는다.
(ii) 사람의 cDNA 발현 라이브러리의 스크리닝
람다 ZAP II(#936201) 중에 구성된 사람의 HeLa 세포 cDNA 발현 라이브러리는 스트라타진(Stratagene)으로부터 입수하였다. 사람 p34cdc2는 박테리아로부터 제조될 때 매우 불용성이었다. 종래의 항체 스크리닝 방법[Young and Davis, Proc. Natl, Acad, Sci, 80 : 1194-1198 (1983)]은 파아지 플라크 중에 충분한 양의 가용성 재조합 단백질이 있을 때만이 적합하다. 따라서, 스크리닝 방법은 6M 구아니딘을 사용하여 이것들이 니트로셀룰로오스 페이퍼로 이동된 후에 재조합 단백질을 용해시키는 단계를 포함하도록 변형되었고, 이 과정은 원래 특정 활성을 갖는리폴딩(refolding)된 재결합 단백질을 제조하기 위해 개발되었다[Vinson et al., Gene Dev. 2 : 801-806 (1988)], λZAP II HeLa cDNA 라이브러리로부터의 2백만 파아지 플라크를 S. 폼베 p34cdc2(G8)에 대한 항혈청을 사용하여 스크리닝하였다. 파아지 플라크를 IPTG-침지된 니트로셀룰로오스 필터를 사용하여 42℃에서 4시간 동안 씌워놓은 후, 필터를 배양 접시로부터 떼내어 25mM Hepes(pH 7.0), 50mM NaCl, 2mM DTT가 함유된 완충액 중에 6M 구아니딘-HCl을 사용하여 25℃에서 10분간 처리하였다. 필터를 항체 인큐베이션 전에 구아니딘이 없이 Tris-완충된 식염수를 사용하여 세척하였다. 이 과정은 아마도 구아니딘에 의한 박테리아에서 제조된 폴리펩티드 침전물의 가용화에 기인하는 본 발명의 항체 검출 신호를 크게 강화시켰다. G8-포지티브 cDNA 클론을 P블루스크립트 SK 벡터(Stratagene) 내로 서브클로닝시키고, ABI 자동 DNA 서열화기(모델 373A)를 사용하여 양쪽 방향으로부터 서열화시켰다. 서열 상동성 검색을 위해 FASTA 프로그램을 사용하였다[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sct. 85 : 2444-2448 (1988)].
(iii) 면역침전 및 웨스턴-블롯팅
[35S] 메티오닌을 사용한 대사 표지화를 위해, 서브컨플루언트 (40-60%) 세포를 미리 가온시킨 표지화 배지(10% 투석된 우태아 혈청이 보충된 메티오닌 및 시스틴 비함유 DMEM [ICN], [GIBCO])를 사용하여 2차례 세척하였다. 표지화 배지와 인큐베이션시킨 지 30분 후, [35S] 메티오닌(트랜스35S-표지, ICN)을 배지(약 200μCi/㎖)에 첨가하고, 용해 전에 4 내지 6시간 동안 계속 인큐베이션시켰다. 면역침전의모든 단계를 냉각실에서 수행 하였다. 40 내지 60% 컨플루언트 150mM 접시로부터의 세포를 저온 PBS로 2회 세척하고 NP-40 용해 완충액(50mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, 0.5% NP-40, 1mM PMSF, 25㎍/㎖ 루펩틴, 25㎍/㎖ 아프로티틴, 1mM 벤즈아미딘 및 10㎍/㎖ 트립신 억제제) 내로 스크랩핑하여 15 내지 30분 동안 회전시킴으로써 용해시켰다. 핵을 15,000g에서 5분 동안 원심분리시켜 제거하였으며, 용해물은 면역전 혈청 또는 정상적인 토끼혈청과 lgG 소르브(The Enzyme Center, Inc.)와 20 내지 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 15,000g에서 10분 동안 원심분리시킴으로써 안정성을 사전에 보증하였다. 단백질 A 아가로스 비이드(피어스)를 사전-결합된 항체를 정화된 용해물에 첨가하고, 6시간 내지 8시간 동안 인큐베이션시켰다. 면역 침전물을 용해 완충액으로 실온에서 3회 내지 4회 세척하여 SDS 샘플 완충액 중에 재현탁시키고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에세 분리시켰다.
35S 메티오닌-표지된 침전물에 대해서, 폴리아크릴아미드 겔(V8 단백질분해 맵핑 실험에 대한 것들은 제외)을 10% 빙초산 및 30% 메탄올을 사용하여 1시간 30분 동안 고정시켰으며, 방사선 자동 사진법 인핸서(듀퐁사)를 사용하여 30분동안 함침시킴으로써 강화시키고, 물 중에서 15 내지 30분 동안 침전시켰다. 강화시킨 겔을 건조시키고 -70℃에서 X-레이 필름에 대해 노출시켰다. 웨스턴-블롯팅을 위해, 폴리펩티드를 SDE 일렉트로블롯팅 시스템(밀리포아)을 사용하여 400mA의 정전류에서 45분 동안 니트로셀룰로오스 필터로 전달시켰다. 이 필터를 1시간 내지 3시간 동안 5% 분유가 함유된 TBST(20mM Tris-HCl, pH 7.5, 137mM NaCl, 0.1% Tween-20)를 사용하여 차단시키고, 5% 분유가 함유된 TBST 중에서 4시간 내지 하룻밤동안 1차 항체와 인큐베이션시키고, 매회 10분씩 TBST를 사용하여 4회 세척하였다. 적합한 제 2 항체(양고추냉이 과산화효소 결합된 시이트 항-마우스 lg 또는 당나귀 항-토끼 lg의 1:10,000 희석액, Amersham)을 필터와 1시간 동안 인큐베이션시켰으며, 특이적 단백질을 강화된 화학발광 시스템(ECL, Amersham)을 사용하여 검출하였다.
(iv) 부분적 단백질분해 펩티드 맵핑
사람 사이클린 D, 사이클린 D2, 사이클린 D3, CDC2, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5 및 PCNA를 생체외에서 T7 RNA 중합효소에 의한 시험관내 번역을 위해 TNT 결합된 망상적혈구 용해물 시스템(Promega)을 사용하여 p블루스크립트 벡터(Stratagene) 내로 서브클로닝시켰다. [35S]메티오닌-표지된 용해물 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 면역 침전은 상기에서 설명된 것과 같았다. 폴리아크릴아미드 겔을 사전 고정 및 강화 처리시키지 않고 건조시켰으며, 후지(Fuji) 영상 플레이트에 노출시키고, 후지 생체영상 분석기 BAS 2000로 가시화시켰다. 적합한 단백질 밴드는 주형으로서 영상 프린트아웃(printout)을 사용하여 겔로부터 절출시켰으며, 문헌[Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252 : 1102-1106 (1977) 및 (Harlow and Lane Antibodies : a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY(1988)]에 따라서 다양한 양의 녹농균 V8 프로테아제로 겔내에서 부분적으로 분해시키고, 17.5% SDS-PAGE로 분리시켰다. 겔을 건조시키고, X-레이 필름에 2주 동안 노출시키거나, 후지 영상 분석기 BAS2000으로 분석하였다.
실시예 2
DNA 종양 바이러스 또는 이것의 종양 생성물에 의한 세포 형질전환과 관련된 세포 사이클 복합체의 선택적인 서브유민 재배열의 증명
(i) 세포 사이클 복합체의 서브유닛 재배열과 관련된 DNA 종양 바이러스 SV40에 의한 세포 형질전환
[35S] 메티오닌-표지된 세포 용해물의 제조 및 폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 상술한 바와 같고, PCT 공개번호 WO 92/20796에 기재된 바와 같았다. 세포 용해물은 사람의 정상 배수체 섬유아세포인 WI38 또는 DNA 종양 바이러스 SV40 형질전환된 WI38 세포인 VA13으로부터 제조하였다. 세포 용해물을 각 세포 사이클 유전자 생성물에 대한 항체로 면역침전시켰다.
(ⅱ) 2개의 상이한 쌍의 세포주에서의 세포 사이클 복합체의 서브유닛 재배열
세포 용해물의 제조 방법은 상술한 바와 같았다. 이 실험에서는 2개의 상이한 쌍의 세포주을 사용하였다. HSF43은 정상인 배수체 섬유아세포 세포주이고, CT10(전체 이름: CT10-2C-T1)은 SV40 거대 종양 항원에 의해 형질전환된 HSF43의 유도체이다. CV-1은 아프리카 녹색 원숭이 세포주이고, COS-1은 SV40에 의해 형질전환된 CV-1의 유도체이다.
(iii) DNA 종양 바이러스 SV40에 의한 세포 형질전환은 세포 사이클 복합체의 PCNA 서브유닛 재배열과 관련된다.
세포 용해물의 제조, 전게영동, 및 웨스턴 블롯팅 조건은 상술한 바와 같다. 정상적인 사람 배수체 세포주 및 그것들의 SV40 형질전환된 세포주는 상술한 바와 같다. 각 항체로부터 유도된 면역침전물을 폴리아크릴아미드 겔상에서 분리하였고, 항-PCNA 항체로 블롯팅하였다.
(iv) DNA 종양 바이러스 SV40에 의한 세포 형질전환은 세포 사이를 복합체의 CDK4 서브유닛 재배열과 관련된다.
세포 용해물의 제조, 전기영동, 및 웨스턴 블롯팅 조건은 전술한 바와 같다. 정상적인 사람 배수체 세포주 및 그것들의 SV40 형질전환된 세포주은 상술한 바와 같다. 각 항체로부터 유도된 연역침전물을 폴리아크릴아미드 겔상에서 분리하였고, 항-PCNA 항체로 블롯팅하였다.
실시예 3
CDK4 활성의 억제제인 p16INK4의 클로닝
(i) 2 하이브리드 검정을 사용한 p16INK4의 클로닝
맥주효모균 YPB2 세포를 GAL4db-p16INK4 융합체를 함유하는 플라스미드 및 각각 cdc2(CDK1), CDK2, CDK4, CDK5, PCNA(증식성 세포 핵 항원), 및 분열 효모 키나아제 Snf 1에 융합된 GAL4ad를 함유한 플라스미드로 동시에 형질전환시켰다. 2개의 플라스미드 모두에 선택적인 배지(트립토판(-) 및 로이신(-))에서 세포들을 성장시킨 후, 2개의 콜로니를 무작위로 선택하여 히스티딘이 있거나 없는 플레이트에 스트리킹(streaking)하였다. 히스티딘의 부재하에 성장하는 능력은 GAL4-반응성 프로모터의 조절을 받는 HIS3 유전자의 발현에 의존하며, 그러므로, 이것은 작용성GAL4 활성제가 상응하는 표적 단백질과 p16INK4의 상호작용을 통해 재구성되었음을 나타낸다.
(ii) p16INK4 CDK들의 상호작용
정제된 박테리아-생성된 GSTp16INK4 융합 단백질을 (35S)-표지되고 생체외 번역된 cdc2, CDK2, CDK4 및 CDK5와 혼합시켰다. 혼합물은 50mM Tris-HCl pH8, 120mM NaCl 및 0.5% 노니뎃 P-40을 함유하고 있는 최종 부피 200㎕의 완충액 중에 0.5㎍의 정제된 GST-p16INK4와 동등량의 생체외 번역된 단백질(0.5 내지 5, ㎕; TNT Promega)을 함유하였다. 4℃에서 1시간 후, 15㎕의 글루타티온-아가로스 비이드를 첨가하고, 1시간 더 인큐베이션하였다. 비이드를 원심분리에 의해 회수하고, 인큐베이션 완충액으로 4회 세척한 다음, 표준 단백질-겔 로딩 완충액과 혼합하였다. 샘플을 15% 폴리아크릴아미드 겔내로 로딩하고, (35S)-표지된 단백질을 형광촬영술에 의해 검출하였다. GSTp16INK4 융합 단백질은 pGEX-KG 벡터에서 과잉 발현되었고, 표준 기법에 의해 정제되었다. 생체외 번역 주형은 p블루스크 립트 벡터(Stratagene)로부터 유도되었다.
(iii) p16INK4의 단백질분해 맵핑
생체외 번역된 (35S)-표지된 p16INK4(TNT Promega)를 주형으로서 p블루스크립트 벡터(Stratagene)내로 클로닝된 p16INK4 cDNA를 사용하여 얻었고, CDK4-결합 p16 단백질을 대사적으로 (35S)-표지된 HeLa 세포 용해물로부터 얻은 항-CDK4 혈청으로 공동 면역침전시켰다. 부분적인 단백질 가수분해를 완충액 증에서의 집중적인 평형 후에 상응하는 겔 슬라이스에 대해 수행하였고, 상이한 농도로 NCS의 첨가하여 분해시켰다. 생성물을 17.5%의 폴리아미드 겔에서 조작한 후, 포스포이매져(phosphoimager) Fujix 2000으로 검출하였다.
(iv) CDK4-사이클린 D 복합체에 대한 p16INH4의 효과의 검출
p16INK4, CDK4, 사이클린 D1, 또는 CDK4와 사이클린 D1을 함께 과잉 발현하는 바쿨로바이러스-감염된 곤충 세포를 대사적으로 (35S)-표지시켰다. 다양한 인큐베이션 혼합물을 p16INK4, CDK4, 사이클린 D1 및 CDK4와 사이클린 D1 둘 모두를 함유한 추출물에 의해 구성하였고, 사전 인큐베이션 없이 항-p16INK4 혈청, 항-CDK4 혈청으로 면역침전시키고, 항혈청 및 항-사이클린 D1 혈청을 발생시키기 위해 원래 사용한 펩티드와 사전 인큐베이션 시켰다. 그런 다음, 면역침전물을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
상기 언급된 모든 문헌 및 공보는 본원에 참고문헌으로 인용되었다.
균등물
당업자들은 단지 기본적인 실험을 사용하여, 상술된 본 발명의 특정 구체예에 대해 많은 균등물이 있음을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 그리한 균등물은 하기의 특허청구의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.
서열목록
(l) 일반 정보 :
(i) 출원인 :
(A) 명칭: 콜드 스프링 하버 래보레이토리
(B) 거리 : 봉타운 로우드 100
(C) 시 : 콜드 스프링 하버
(D) 주 : 뉴욕
(E) 나라 : 미합중국
(F) 우편 번호 : l1724
(G) 전화 : 617-227-7400
(H) 팩시 : 617-227-5941
(ii) 발명의 명칭 : 사이클린 복합체 재배열 및 그것과 관련된 용도
(iii) 서열의 수 : 4
(iv) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매질 타입 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환성
(C) 작동 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : ASCII(text)
(vi) 선 출원 데이타 :
(A) 출원 번호 : US 07/963,308
(B) 출원일 ; 1992. 10. 16
(vi) 선 출원 데이타 :
(A) 출원 번호 : US 07/991,997
(B) 출원일 : 1992. 12. 17
(2) SEQ ID NO : 1에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 1089 염기 쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥 상태 : 이중
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 타입 : DNA(게놈성)
(ix) 특징
(A) 이름/키 : CDS
(B) 위치 : 13..888
(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO: 1 :
(2) SEQ ID NO: 2에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 292 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 타입 : 단백질
(xi) 서열 표시 : SEQ ID NO: 2:
(2) SEQ ID NO: 3에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 948 염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥 상해 : 이중
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 타입 : cDNA
(ix) 특징 :
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 위치 : 19..465
(xi) 서열표시 : SEQ ID NO: 3:
(2) SEQ ID NO: 4에 대한 정보 :
(i) 서열 특성
(A) 길이 : 148 아미노산
(B) 타입 : 아미노산
(D) 위상 : 선형
(ii) 분자 타입 : 단백질
(xi) 서열표시 : SEQ ID NO: 4:

Claims (14)

  1. SEQ ID NO:4에 의해 표시되는 아미노산 서열 또는 사이클린 의존성 키나아제에 결합하는 이것의 부분을 포함하는 단리된 p16INK4단백질.
  2. 제1항에 있어서, p16INK4단백질이 융합 단백질임을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  3. 제2항에 있어서, p16INK4융합 단백질이 2하이브리드 검정(two hybrid assay)에서 작용함을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 부분이 cdk4에 결합함을 특징으로 하는 단리된 단백질.
  5. SEQ ID NO:4에 의해 표시되는 단백질의 면역원성 부분.
  6. SEQ ID NO:4에 의해 표시되는 p16INK4단백질 또는 사이클린 의존성 키나아제에 결합하는 이것의 부분을 코드화하는 핵산.
  7. 제6항에 있어서, p16INK4단백질의 상기 부분이 cdk4에 결합함을 특징으로 하는 핵산.
  8. 제6항에 있어서, SEQ ID NO:3에 의해 표시되는 누클레오티드 서열 또는 사이클린 의존성 키나아제에 결합하는 이것의 부분을 포함하는 핵산.
  9. SEQ ID NO:3에 의해 표시되는 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  10. p16INK4단백질과 특이적으로 면역 반응하는 항체.
  11. 환자로부터 단리된 세포의 샘플 중에서 샘플의 세포 중의 p16 단백질의 수준을 측정하기 위해 p16INK4에 특이적인 항체를 포함하는, 형질전환된 세포를 확인하기 위한 진단 시험 키트.
  12. 제11항에 있어서, p16INK4특이적 항체가 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 대해 특이적인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  13. 환자로부터 단리된 세포의 샘플 중에서 p16INK4단백질을 코드화 하는 핵산의 존재 또는 부재를 측정하기 위해 p16INK4핵산 서열에 대해 특이적인 핵산 프로브를 포함하는, 형질전환된 세포를 확인하기 위한 진단 시험 키트.
  14. 제 13항에 있어서, 핵산 프로브가 SEQ ID NO:3의 핵산 서열로 부터 유도된 것을 특징으로 하는 진단 키트.
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