JPH08502649A - サイクリン複合体の転位およびそれに関連する使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 サイクリン複合体のサブユニット成分の検出を含む、細胞の形質転換を診断するための診断およびキットが開示されている。特に、本発明はサイクリン、ＰＣＮＡ、ＣＤＫｓおよびｐ２１、ｐ１９およびｐ１６のような低分子量ポリペプチドに関する。本発明はさらに細胞増殖の阻害剤に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 サイクリン複合体の転位およびそれに関連する使用 発明の背景 腫瘍形成は調整解除された細胞の成長および分裂に特徴がある。必然的に細胞 成長を制御する分子経路はこれら細胞分裂を調整する経路と相互作用するはずで ある。しかし最近までそのような関連性に光があたる実験的証拠が得られなかっ た。サイクリンＡはウイルス的に形質転換した細胞中のアデノウイルス発癌性タ ンパク質Ｅ１Ａに関連して見い出された（Giordonaら、Cell 58:981（1989）： およびPineaら、Nature 346:760（1990））。初期の肝細胞腫瘍では、ヒトサイ クリンＡ遺伝子が肝炎Ｂウイルスの断片の組込み部位にあり、この断片がサイク リン転写およびインビトロで分解しないキメラウイルスサイクリンＡタンパク質 の活性化を導くことが判明した（Wangら、Nature 343:555（1990））。細胞周期 遺伝子は当然最も強く発癌遺伝子に関連しており、これはヒトサイクリンＤ１に もあてはまる。これは、始めは酵母Ｇ１サイクリン欠失株（Xiongら、Cell 65:6 91-（1991）：およびLewら、Cell 66:1197（1991））の遺伝的相補を介して、そ の転写がマウスマクロファージ中のＣＳＦ−１により刺激される細胞性遺伝子と して（Matsushineら、Cell 65:701（1991））、および副甲状腺腫瘍中で転位し た推定される発癌遺伝子ＰＲＡＤ１中から単離された（Montokuraら、Nature 35 0 :512（1991））。さらに２つのヒトＤ−型サイクリン、サイクリンＤ２および Ｄ３が引き続きＰＣＲおよび低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション法を 使用して同定された（Inabaら、Genomics 13:565（1992）；およびXiongら、Gen omics 13:575（1992））。サイクリンＤ１は遺伝的にｂｃｌ−１発癌遺伝 子に結合し（数種のＢ−細胞リンパ腫および白血病において免疫グロブリン遺伝 子エンハンサーへの転座により活性化される遺伝子座）、そしてヒト乳癌の１５ −１０％および頭部および頸部由来の偏平上皮細胞癌の２５−４８％で遺伝子増 幅部位に位置していた。 サイクリンは海中無脊椎動物の卵の受精後にその強力な合成に起因して発見さ れたタンパク質である（Rosenthal,E.T.ら、Cell 20:487-494（1980））。引き 続き有糸分裂時におけるポリペプチドの急激なタンパク質分解のために、初期の 開裂分裂中に２種のサイクリンＡおよびＢの量の変動が観察され、そこでそれら の名前が付いた（Evans.Tら、Cell 33:389-396（1983）;Swenson,K.I.らCell 47 :867-870（1986）;Standart,N.ら、Dev.Biol.124:248-258（1987））。続いてサ イクリン遺伝子がほとんどすべての真核種から単離され、多遺伝子族を構成して いる（総説としてXiongら、Curr Biology 1:362（1991）を参照にされたい）。 細胞分裂の調整においてはサイクリンの受動的というよりむしろ能動的な関与 が、静的なサイクリンｍＲＮＡがカエル卵母細胞の活性化を引き起こし、そして これらの細胞をＭ期に導入できたという観察により明らかになった（Swenson,K. I.らCell 47:867-870（1986））。カエル卵母細胞の活性化はＭＰＦとして知ら れているＭ期誘導因子の合成と関連している（Masui,Y.およびC.L.Markert,J.Ex p.Zool 177:129-146（1971）;Smith,L.D.およびR.E.Ecker,Dev.Biol.25:232-247 （1971））。ＭＰＦは触媒サブユニットがｃｄｃプロテインキナーゼのカエル相 同物であるプロテインキナーゼである（Dunphy,W.Gら、Cell 54:423-431（1988 ）;Gautier,J.ら、Cell 54:433-439（1988）;Arion,D.ら、Cell 55:371-378（19 88））。 現在までに同定されているサイクリンの中で、Ｂ−型サイクリンはｃ ｄｃ２プロテインキナーゼの組込みサブユニットとして働くことにより有糸分裂 に作用することが示されている（Booher,R.およびD.Beach,EMBO J.6:3441-3447 （1987）;Draetta,Gら、Cell 56:829-838（1989）;Labbe,J.C.ら、Cell 57:253- 263（1989）;Labbe,J.C.らEMBO JM.8:3053（1989）;Meier,L.ら、EMBO J.8:2275 -2282（1989）;Gautier,J.ら、Cell 60:487-494（1990））。Ａ−型サイクリン もｃｄｃ２キナーゼと独立して関与し、有糸分裂よりも分裂周期の初期に作用す ると思われる酵素を形成する（Draetta,G.ら、Cell 56:829-838（1989）;Minshu ll,J.ら、EMBO J.9:2865-2875（1990）:Giordano,A.ら、Cell 58:981-990（1989 ）;Pines,J.およびT.Hunter,Nature 346:760-763（1990））。無脊椎または脊椎 動物胚中の細胞の、および分子の研究は、特に子嚢菌酵母での遺伝的研究により なされて来た。分裂酵母では、ｃｄｃ１３遺伝子はｃｄｃ２と共同作用して有糸 分裂への導入を調整するＢ−型サイクリンをコードする（Booher,R.およびD.Bea ch,EMBO J.6:3411-3447（1987）;Booher,R.およびD.Beach,EMBO J.7:2321-2327 （1988）;Hagan,I.ら、J.Cell Sci.91:587-595（1988）;Solomon,M.,Cell 54:73 8-740（1988）;Gobel,M.およびB.Byers,Cell 54;433-439（1988）;Booher,R.N. ら、Cell 58:485-497（1989））。出芽酵母および分裂酵母の両方の遺伝的研究 では、ｃｄｃ２（または出芽酵母のＣＤＣ２８）が細胞周期中の２つの独立した 点で作用することが明らかになった、それは有糸分裂点およびいわゆる細胞周期 の“開始”点である（Hartwell,L.H.,J.Mol.Biol.,104:803-817（1971）;Nurse, P.およびY.Bissett,Nature 292:558-560（1981）;Piggot,J.R.ら、Nature 298:3 91-393（1982）;Reed,S.I.およびC.Wittenberg,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87:5697 -5701（1990））。出芽酵母ではＣＤＣ２８タンパク質の開始機能は、 プロテインキナーゼの触媒サブユニットが、構造的に関連するＡおよびＢ−型サ イクリンの補助タンパク質と会合する必要もある。この第三クラスのサイクリン はＣＬＮクラスと呼ばれ、部分的に重複する遺伝子一族を含んで成る３つの遺伝 子が記載されている（Nash,R.ら、EMBO J.7:4335-4346（1988）;Hadwiger,J.A. ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:62556259（1989）;Richardson,H.E.ら、Cell 5 9 :1127-1133（1989））。ＣＬＮ遺伝子は開始を実行するために必須であり、そ してそれらが不在である場合は、細胞は細胞周期のＧ１期で休止することになる 。ＣＬＮＩおよびＣＬＮ２転写物は細胞周期を通じて大量に振動するが、ＣＬＮ ３転写物はしない。さらに、ＣＬＮ２タンパク質はそのｍＲＮＡと平衡して変動 することが示された（Nash,R.ら、EMBO J.7:4335-4346（1988）;Cross,F.R.Mol.Cell.Biol .8:4675-4684（1988）;Richardson,H.E.ら、Cell 59:1127-1133（1988 ）;Wittenbergら、（1990））。種々のサイクリンと関連することによりｃｄｃ ２／ＣＤＣ２８に与えられる正確な生化学的特性は完全に明らかではないが、サ イクリン突然変異体の遺伝的研究は、それらが触媒サブユニットに“Ｇ１”およ び“Ｇ２”特性を付与しているということを明らかに立証している（Booher,R. およびD.Beach.EMBO J.6:3441-3447（1987）;Nash,R.ら、EMBO J.7.:4335-4346 （1988）;Richardson,H.E.ら、Cell 56:1127-1133（1989））。 ｃｄｃ２およびサイクリンは胚および酵母中に見いだされただけではなく、ヒ ト体細胞中にも見いだされた。ｃｄｃ２／サイクリンＢ酵素の機能はヒト細胞中 でも他の種類の細胞中と同じであると思われる（Riabowol,K.ら、Cell 57:393-4 01（1989））。ヒトＡ型サイクリンもｃｄｃ２と関連して発見された。哺乳類細 胞中のＣＬＮ型サイクリンは未だに記 載されていない。細胞周期の調整およびそれらの相互作用に関与する要素をより よく理解することは細胞複製をより理解し、そしてさらにその過程を変更または 制御することに貢献するだろう。 発明の要約 本発明は新規種類のサイクリン（Ｄ−型サイクリンと呼ぶ）の使用に関し、こ れは哺乳類起源であり、すでに記載されたＡ、Ｂ、またはＣＬＮ型サイクリンに 関連するが明らかに別個のものである。特に本発明は酵母の細胞周期が開始する のに必須なＣＬＮ−型遺伝子と置換することができると示された遺伝子によりコ ードされているヒトサイクリンに関し、これは細胞周期が開始するのに必須なタ ンパク質の欠失を相補し、そしてそのタンパク質構造に基づきＡ、Ｂ、またはＣ ＬＮ型サイクリンの進化系図から異なる分枝に存在する。Ｄ−型サイクリンは真 核細胞中で、特にヒト細胞中で多くのサイクリン依存性キナーゼと会合すること が示された。それらは３つのポリペプチドと共沈殿することも示された。それら はサイクリン−依存性キナーゼ、特性がよく知られているＤＮＡ複製および修復 因子（すなわち増殖性細胞核抗原（proliferating cellnuclear antigen）すな わちＰＣＮＡ）およびみかけの分子量が２１ｋＤａであるポリペプチドである。 結果によるとＤ−型サイクリンＣＤＫ、ＰＣＮＡおよびｐ２１は四量体複合体で 存在し、これは成分（例えばサイクリンＤ１またはＤ３およびＣＤＫ２、ＣＤＫ ４およびＣＤＫ５）の多くの種類の組み合わせ変異体をインビボで集合し、そし て各四量体複合体は種々の細胞型の細胞周期で難解な種々の役割をもつことがで きることが示唆されている。さらに、ＳＶ４０のようなＤＮＡ腫瘍ウイルスによ る細胞の形質転換はサイクリンＤ複合体の選択的なサブユニット転 位に関連することが発見された。サイクリンＤ、ＰＣＮＡ、ＣＤＫｓ（ＣＤＫ２ 、ＣＤＫ４およびＣＰＫ５を含む）およびｐ２１間の会合はＤＮＡ腫瘍ウイルス またはその発癌遺伝子産物を哺乳類細胞中に導入することにより破壊される。特 に本明細書に記載するように、サイクリンＤ、ＰＣＮＡ、ＣＤＫｓ（ＣＤＫ２、 ＣＤＫ４およびＣＤＫ５を含む）およびｐ２１間の会合はＳＶ４０腫瘍ウイルス またはその発癌遺伝子産物である巨大Ｔ抗原（large T antigen）をヒト二倍体 細胞中（正常ヒト二倍体繊維芽細胞に例示される）に導入することにより破壊さ れる。ＣＤＫ４はサイクリンＤおよびｐ２１からの解離後、１６ｋＤ（ｐ１６） の新規ポリペプチドと会合するようになる。同様にサイクリンＡ複合体もサブユ ニット転位を受ける。ＳＶ４０の形質転換後、ｐ２１のサイクリンＡとの会合は 減少するか、または完全に解離する。サイクリンＡは次に１９ｋＤＡポリペプチ ド（ｐ１９）との複合体中に現れる。 したがって今、ｐ２１は正常な非形質転換細胞中でのみサイクリンキナーゼと 会合し、そしてｐ１６およびｐ１９ならびに他の関連したタンパク質は形質転換 細胞中に存在する細胞周期調整因子中に現れることが分かる。この知見はサイク リンの活性を変化させて（直接的または間接的に）細胞分裂をモジュレート（mo dulating）するためのさまざまな研究法の基礎として役立つ。これは細胞中のサ イクリンの発現特異性、ならびにサイクリン、ＣＤＫ、ＰＣＮＡおよびｐ２１に より形成されると思われる四量体複合体の成分の多くの可能な組み合わせから、 細胞分裂のモジュレート（すなわち特定の細胞型での細胞分裂またはサイクル中 の特定の点を選択的に変化する能力）において特異性を提供する。特定の態様で は、Ｄ−型サイクリンまたはＡ−型サイクリンが構成物である 四量体複合体の共通成分を妨害することにより（ＰＣＮＡの妨害などにより）、 細胞分裂を非特異的に変化させることができる手段を提供する。 例えば本発明の治療法の一つの態様では、細胞分裂を変化させる方法として上 記四量体複合体を妨害または増強するか、あるいは複合体の構成員の活性を変化 させる。ここで直接的または間接的に複合体の形成を妨害または増強するか、あ るいは構成物の活性を変化させる試薬を使用できる。例えば、上記のように触媒 活性をプロテインキナーゼの活性化を妨害することにより阻害することができる 。あるいはＰＣＮＡ阻害剤を細胞周期の開始が阻害される細胞中に導入し、その 結果細胞分裂を抑制できる。ＰＣＮＡ阻害剤は間接的に（例えば転写または翻訳 を妨害することによりＰＣＮＡの生産を減少させる）、または直接的（例えばＰ ＣＮＡに結合し、そして他の複合体の員と結合するのを妨害する）に作用できる 。ｐ２１の阻害剤も細胞中に導入でき、そして間接的または直接的にｐ２１機能 および／または複合体の構成員に結合するのを妨害できる。タンパク質−タンパ ク質相互作用（複合体成分間（２つ）または中（３つ以上））も変化させて（減 少または増強）、細胞周期に所望の効果を持つことができる（細胞分裂を減少ま たは増加させる）。そのようなタンパク質−タンパク質相互作用を遮断する試薬 を使用できる。これらには低分子量阻害剤、複合体成分に結合する試薬（例えば 抗体）および成分の複合体を形成する能力を他のタンパク質で分解または破壊す る試薬がある。もし四量体複合体の形成の増強を望むならば、試薬は複合体の構 成員が相互作用または結合する能力を増強する（例えば複合体の形成に必要なタ ンパク質−タンパク質相互作用がより得られるように複合体の成分の構造を変化 させる試薬を細胞中に導入できる）。増強さ れた複合体の形成は細胞中の四量体複合体の特定の構成員（１つまたは複数）の 数、活性または利用性を上昇させることによりもたらすことができ、すなわち形 成される割合およびその作用の利用性が増加する。 さらに、本発明は細胞の形質転換を診断する方法に関する。ＣＤＫｓ、サイク リン、ＰＣＮＡおよび低分子量ポリペプチド（例えばｐ２１、ｐ１９およびｐ１ ６）の間の相互作用を認識するモノクローナル抗体のような試薬を開発できる。 例えばｐ１６およびＣＤＫ４の間の相互作用を認識する抗体を多くの細胞型の形 質転換を検出または診断するために使用できる。あるいは、ＣＤＣ２、ＣＤＫ２ 、サイクリンＡまたはサイクリンＤを認識する抗体のような試薬をサイクリン複 合体のサブユニット組成（すなわちこれは細胞の形質転換の状態）を同定するた めに使用できる。 本発明はまた記載した単離、診断または治療法に有用な試薬（例えばオリゴヌ クレオチド、抗体、ペプチド）に関する。 発明の詳細な記述 サイクリンはサイクリン−依存性プロテインキナーゼ類（ＣＤＫｓ）と調和し て、細胞周期進行中の極めて重要な転移および／または制限点を支配するために 機能する鍵となるタンパク質である。本発明は特定の細胞−サイクル過程の阻害 剤および／または活性化剤を開発するための方法および試薬を提供する。本明細 書に記載するように、正常な真核細胞中で、特にヒト細胞中で様々な種類のサイ クリン（例えばＡ、ＢおよびＤクラス）は多くの種々のＣＤＫｓ、ならびに増殖 性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）およびみかけ分子量が２１ｋｄのポリペプチド（ｐ２ １）と、多くの型の複合体を形成するように会合することができる。例えば以下 に与える結果は、サイクリン類およびＣＤＫｓの組み合わせが、ＰＣＮＡおよび ｐ２１と一緒に少なくとも１つの四量体複合体の状態で存在し、成分の多くの組 み合わせの変更体がインビボで集合することを示し、（例えばサイクリンＤ１ま たはＤ３とＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤｋ５との種々の組み合わせ）、そして 生成した各四量体複合体は、細胞周期または種々の細胞型中で複雑な様々な役割 を持つことができることを示している。したがって以下に記載するように、例え ばサイクリンおよびＣＤＫｓとの間に形成された特定の複合体を選択的に破壊で きる試薬を同定するためのアッセイを作成できる。 さらに、本発明は形質転換細胞を検出するための診断的アッセイおよび試薬を 可能にし、これは癌の検出に有用でありうる。以下では細胞形質転換がサイクリ ン−ＣＤＫ複合体の選択的なサブユニット転位と関連することを実証する。説明 するために、形質転換した細胞（ウイルス的または遺伝的異常による）では、サ イクリンＤ／ｐ２１／ＣＤＫ／ＰＣＮＡ複合体は破壊されている。例えばウイル ス的に形質転換した細胞では、ＣＤＫ４はサイクリンＤ、ＰＣＮＡおよびｐ２１ から完全に解離し、代わりに１６Ｋｄポリペプチド（今後“ｐ１６”という）と 会合する。サイクリンＡまたはＢ１およびｐ２１／ＣＤＫ／ＰＣＮＡを含む四量 体複合体も形質転換細胞中ではサブユニット転位を受ける。例えばＰＣＮＡおよ びｐ２１の両方はもはやＣＤＣ２−サイクリンＢ１二複合体とは会合せず、そし てサイクリンＡ複合体はもはやｐ２１を含まず、これは代わりに１９ｋｄタンパ ク質（ｐ１９）に置き換わる。したがってそのような異常なサブユニット複合体 は細胞の形質転換を検出するために予報的に使用できる。例えば本発明は形質転 換細胞を同定するために、変 化した複合体の形成および／またはｐ１６の発現レベルの上昇を検出するために 、抗体および核酸プローブを含む試薬を入手可能にする。 さらにｐ１６は以下のサイクリン／ＣＤＫ複合体、特にＣＤＫ４を含む複合体 の活性に対して阻害効果を発揮する。例えばｐ１６はサイクリンＤ１／ＣＤＫ複 合体のインビボ活性を阻害する。一般的に知られているように、サイクリンＤ１ は多種多様な増殖性疾患に関連してきた。したがって本発明はサイクリンＤ１の 発癌的な発現から生じる細胞の増殖の有力な阻害剤を同定する。 逆に、ｐ１６をｐ１６のＣＤＫ４に結合する能力を減少させる試薬を同定する アッセイに使用でき、これによりサイクリン／ＣＤＫ４複合体の阻害を軽減でき る。この態様では、ＣＤＫ４／サイクリン複合体の再活性化は形質転換細胞中で 起こる細胞性の事象を破壊するか、あるいは平衡を失わせる。そのような薬剤は 腫瘍ウイルスにより形質転換した細胞中のＣＤＫ４複合体の活性化において治療 的使用に有効であり、例えば種々のウイルスが抑制した細胞周期チェクポイント が増大し（ｐ５３のように）、そしてチェックポイントでの感染細胞を蓄積させ るか、あるいはＲｂリン酸化の場合には細胞の死を引き起こすチェックポイント を通過した未成熟な生育が起こるかもしれない。ＣＤＫ５と命名されたサイクリ ン−依存性キナーゼおよびＣＤＫ５をコードするＤＮＡも本明細書に記載された 研究成果として利用可能である。ＣＤＫ５はＤ−型サイクリン、ＰＣＮＡおよび ｐ２１と共沈殿することが示された。したがって本発明はＣＤＫ５機能および／ または複合体の他の構成員との会合を変化（増強または減少）させて、細胞の増 殖に影響を与えることができる。ＣＤＫ５がＤ−型サイクリンに結合することを 妨害されるならば、 キナーゼの活性化が妨害されるであろう。これは以下に記載するように行うこと ができた。１．正常細胞中でのサイクリン複合体 以下は、各々が細胞周期の中で、あるいは様々な細胞型で異なる役割をもつこ とができる複合体をもたらす多くの組み合わせ変異体を有する可能性がある四量 体複合体を存在するとみなす上でＤ−型サイクリン変異体が少なくとも３つのさ らなるペプチド（ＣＤＫ、ＰＣＮＡおよびｐ２１）と関連しているとの発明につ いて説明するものである。 以下の説明および実施例１に記載するように、免疫的手法はＤ−型サイクリン が真核細胞中で有力な触媒サブユニット（例えばＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤ Ｋ５のようなＣＤＫｓ）と会合することを明らかにするために使用された。さら にこれらの方法ではＤ−型サイクリンおよびＣＤＫは複製因子ＰＣＮＡおよびみ かけ分子量２１ｋＤａのポリペプチドと会合することが示された。 ヒトサイクリンＤ１は広範囲の増殖性疾患と関連して来た。本明細書に記載す るようにヒト二倍体細胞において、特にヒト二倍体繊維芽細胞においてサイクリ ンＤ１は多くの他の細胞タンパク質と複合体を形成する。それらは触媒サブユニ ットＣＤＫ２、ＣＤＫ４（以前はＰＳＫ−Ｊ３と呼ばれた）およびＣＤＫ５（同 じくＰＳＳＡＬＲＥと呼ばれた）である。さらに２１ｋＤａおよび３６ｋＤａの ポリペプチドはサイクリンＤ１と会合した状態で確認される。実施例１に記載す るように、３６ｋＤａのタンパク質は増殖性細胞核抗原（Proliferating Cell N uclear Antigen:PCNA）である。ＰＣＮＡはデルタ−ポリメラーゼの必須のアク セサリー因子であると説明されてきており、これはＤＮＡ複製の鎖を導き、 そしてＤＮＡの修復に必要である。サイクリンＤ３も多くのプロテインキナーゼ 、本明細書に示すようにｐ２１およびＰＣＮＡに会合する。Ｄ−型サイクリン、 ＣＤＫ、ＰＣＮＡおよびｐ２１の四量体複合体の存在、ならびに多くの組み合わ せ変異体（サイクリンＤ１、Ｄ３とＣＤＫ２、４および５との）がインビボで集 合できることが提案されている。これらの知見により、発癌と関連している推定 のヒトとＧ１サイクリンと、特性がよく知られているＤＮＡ複製および修復因子 とを結び付けて考えらる。（ｉ）サイクリンＤと会合するタンパク質の調査 サイクリンＤと特異的に会合するタンパク質を確認するために、［³⁵Ｓ］メチ オニン−標識Ｗ１３８ヒト二倍体繊維芽細胞溶解物の抗−サイクリンＤ１免疫沈 降物を調査した（実施例１、実験法を参照のこと）。Ｗ１３８細胞をはじめにこ の実験のために選択したのは、それらが合理的な高レベルのサイクリンＤ１およ び低レベルのサイクリンＤ３ ｍＲＮＡを発現する比較的正常な細胞系だからで ある（Wonら、Proc.Natl Acad.Sci.（1992））。ヒト２９３の形質転換した第一 期胎児性腎臓細胞はすべての３種のＤサイクリンｍＲＮＡおよび極めて低レベル のタンパク質を発現するので対照として使用した（Xiongら、Cell 65:691-699（ 1991））。Ｗ１３８細胞は容易に検出しうる、抗−サイクリンＤ１抗血清で免疫 沈降させることができる３５ｋＤａポリペプチドを発現する。サイクリンＤ１と しての３５ｋＤａタンパク質の同定は、同じＷ１３８細胞溶解物と前−抗血清と の免疫沈降物とを、同様な２９３細胞溶解物質と同様な抗−サイクリンＤ１抗血 清との免疫沈降物を比較することにより確認した。ヒト細胞中の３つの親密に関 連したサイクリンＤ遺伝子の存 在により、そして抗−サイクリンＤ１抗体の他のサイクリンＤタンパク質に対す る弱い交差反応から、３５ｋＤａバンドの確認はさらに部分的タンパク質溶解マ ッピングにより調査された。エス．アウレウス（S.aureus）Ｖ８部分タンパク質 溶解物の３５ｋＤａバンドは、同様に開裂したインビトロで合成されたサイクリ ンＤ１のパターンと同様であることが示されたが、サイクリンＤ２またはＤ３の ものとは同様ではなかった。 サイクリンＤ１に対応する強い３５ｋＤａバンドに加えて、３つの他の主要バ ンド（ｐ３６、ｐ３３およびｐ２１）、ならびに１つの弱いバンドｐ３１（ここ で数字は外見上の分子量を示す）が抗−サイクリンＤ１沈降物中に特異的に出現 した。これらのポリペプチドは前−抗血清を使用したＷ１３８細胞溶解物の沈降 物、あるいは２９３細胞溶解物と同様な抗−サイクリンＤ１抗体との免疫沈降物 には無い。これら４つのバンドのいずれも、特にｐ３１およびｐ３３が、おそら くサイクリンＤ２またはＤ３である可能性は、それらのＶ８タンパク質溶解パタ ーンをインビトロ翻訳されたＤ２およびＤ３のパターンと比較することにより除 外された。これらのタンパク質は同じ抗体を使用したウエスタンブロッティング を組み合わせた免疫沈降法の後には検出されないので、これらポリペプチドと抗 −サイクリンＤ１血清との免疫沈降物はこれらのいずれのタンパク質中の交差− 反応性エピトープの存在によるものではないであろう。サイクリンＤ１−会合タ ンパク質の同定は以下に記載する。（ii）ＣＫＤ５はＤ−型サイクリンと会合する マウスマクロファージではサイクリンＤ１／cyllがシゾサッカロミセス ポン ベ （Ｇ８）（Schizosaccharomyces pombe（G8））の全長p34cdc2に対する抗体と 交差−反応するポリペプチドに会合するが、ヒトp34cdc2 のＣ−末端に対して調製された抗体には会合しないことがすでに報告されている （Draettaら、Cell 50:319-325（1987）:DraettaおよびBeach,Ce11 54:17-26（1 988）;Matsushimeら、Cell 65:701-713（19919））。本質的に同一の結果は現在 はヒトＷ１３８細胞にて得られ、サイクリンＤ１がヒトＣＤＣ２関連物に会合す ることを示唆している。 Ｇ８抗体は、推定されているＤ−型サイクリン会合キナーゼを単離するために ヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするために使用された（実施例 １、実験法を参照のこと）。３４個のＧ８−陽性ｃＤＮＡクローンがＨｅＬａ細 胞ｃＤＮＡライブラリーから同定された。その中で、１７個のクローンがＣＤＣ ２をコードし、そして別の１４個がＣＤＫ２をコードしていた。残りのクローン の１つは予想される分子量が３３，２８３ダルトンの２９２アミノ酸残基（配列 番号１および２）のＯＲＦをコードする。このクローンは既知のサイクリンー依 存性キナーゼ類（ＣＤＫｓ）と広範囲のアミノ酸同一性（エス．ポンベ（S.pomb e ）ＣＤＣ２（５３．４％）、エス．セルビシエ（S.cerevisiae）ＣＤＣ２８（ ５５．９％）、ヒトＣＤＣ２（５６．８％）およびヒトＣＤＫ２（６０．３％） ）を共有し、そしてヒトＤ−型サイクリン類と会合する（以下参照）のでＣＤＫ ５と命名する。ＣＤＫ５はアミノ酸配列８６−９２でＤＬＫＫＹＦＤの配列をコ ードし、一方対応するヒトＣＤＣ２の領域はＤＬＫＫＹＬＤを有し、そしてＣＤ Ｋ２はＤＬＫＫＦＭＤを有する。 ＣＤＫ５がＤサイクリン類と会合するのかどうかを決定するために、ＣＤＫ５ の独自なカルボキシ−末端に対応するペプチドに対して抗血清を生成した（実施 例１、実験法を参照のこと）。この血清はヒトＣＤＣ ２、ＣＤＫ２またはＣＤＫ４とは交差反応しない。免疫沈降法または免疫沈降後 のウエスタンブロッティングでは、この抗血清が細胞溶解物中にみかけ分子量３ １ｋＤａ（ｐ３１）のポリペプチドを検出し、このポリペプチドはインビトロで 合成されたＣＤＫ５ポリペプチドと一緒に移動し、そしてその信号（signal）は ＣＤＫ５抗原性ペプチドにより効果的に競合排除される。抗−ＣＤＫ５抗体で沈 殿する３１ｋＤａタンパク質の同定は、さらにｐ３１の部分Ｖ８タンパク質溶解 マッピングをインビトロ翻訳されたＣＤＫ５と比較することによりＣＤＫ５であ ると確認された。 抗−ＣＤＫ５抗血清を使用した³⁵Ｓ−メチオニン標識Ｗ１３８細胞の細胞溶解 物の免疫沈降法では、ｐ３１^CDK5に加えてさらに数個のポリペプチドを明らかに した。その中でポリペプチド３６ｋＤａ（ｐ３６）、ｐ３５ｋＤａ（ｐ３５）、 ３３ｋＤａ（ｐ３３）および２１ｋＤａ（ｐ２１）は最も顕著であり、抗−ＣＤ Ｋ５抗血清と特異的に共沈殿した。これら４個のすべてのポリペプチドは前−抗 血清との、または過剰量のＣＤＫ５カルボキシ末端ペプチドの存在下の沈殿には ない。 ｐ３５およびｐ３３の電気泳動的移動度はインビトロ翻訳されたヒトサイクリ ンＤ１およびＤ３とそれぞれ同じであることが分かった。ＣＤＫ５−会合ｐ３５ がサイクリンＤ１に対応するであろうということを直接試験するために、ＣＤＫ ５の免疫沈降物を抗−サイクリンＤ１抗血清とブロットした。ｐ３５^cyclinD1と 一緒に移動する３５ｋＤａのポリペプチドを、抗−サイクリンＤ１抗血清により 検出した。ＣＤＫ５抗血清での相互の抗−サイクリンＤ１免疫複合体のブロッテ ィングでは、ｐ３１^CDK5と同じ移動度を持つ３１ｋＤａのポリペプチドの存在も 明らかに なった。同様にＣＤＫ５も抗−サイクリンＤ３免疫沈降物中に検出された。これ らのデータはＣＤＫ５７会合ｐ３５がサイクリンＤ１であり、そしてＣＤＫ５− 会合ｐ３３がサイクリンＤ３であることを示している。 ＣＤＫ５−会合ｐ３５およびｐ３３タンパク質の同定の決定的証拠を求めるた めに、部分的タンパク質溶解マッピングを使用した（Clevelandら、J.Biol.Chem 252:1102-1106（1977））。抗−ＣＤＫ５免疫沈降物から精製した³⁵Ｓ−標識ｐ ３５を、エス．アウレウス（S.aureus）Ｖ８プロテアーゼ部分消化に供し、同様 に処理したインビトロ翻訳または抗−サイクリンＤ１免疫沈降物から得たヒトｐ ３５^cyclinD1と比較した。抗−ＣＤＫ５免疫沈降物からのｐ３５のＶ８タンパク 質溶解パターンは、サイクリンＤ１のパターンと同一であったが、サイクリンＤ ３とは異なった。同様な実験をｐ３３の同一性を確認するためにも行った。ＣＤ Ｋ５−会合ｐ３３の部分的タンパク質溶解パターンは、ビトロ翻訳されたヒトサ イクリンＤ３のパターンと同一であったが、Ｄ１とは異なった。逆にサイクリン Ｄ１−会合ｐ３１の部分的Ｖ８消化パターンは、インビトロ翻訳された、あるい は抗−ＣＤＫ５免疫沈降物のいずれかから得たＣＤＫ５と同一であることも決定 された。（iii）ＣＤＫ２はサイクリンＤと会合する サイクリンＤ１−会合ｐ３３（例えば抗−サイクリンＤ１沈降物中）のみかけ 分子量、ならびにｐ３３^CDK2とＧ８抗体との交差反応性は、ｐ３３がＣＤＫ２で ある可能性を示唆している。これを試験するために、［³⁵Ｓ］−メチオニン標識 Ｗ１３８細胞溶解物の抗−ＣＤＫ２沈降物を、抗−サイクリンＤ１沈降物と比較 した。予想どおり抗−Ｃ末端ＣＤＫ２血清はｐ３３^CDK2であると確認された（３ ３ｋＤａバンドの部分的エス．アルレウス （S.aureus）Ｖ８タンパク質溶解パターンとインビトロ翻訳ＣＤＫ２ とのパターンとを比較することにより）３３ｋＤＡタンパク質を沈殿させた。さ らにｐ３３^CDK2は抗−サイクリンＤ１沈降物中に存在するｐ３３と一緒に移動し た。相互的に、抗−ＣＤＫ２抗血清もサイクリンＤ１と一緒に移動する３５ｋＤ ａタンパク質を沈殿させた。 ＣＤＫ２とサイクリンＤ１との間に会合の可能性が存在することについて、さ らに証拠を探すために、Ｗ１３８細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した抗− サイクリンＤ１で免疫沈降させた。そして抗ＣＤＫ２抗血清とイムノブロットし た。抗−ＣＤＫ２抗体をカルボキシ−末端ペプチドに対して生成させ（Paganoら 、EMBO J.11:961-971（1992））、その特異性を細菌的に発現させたヒトＣＤＣ ２、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４およびＣＤＫ５をイムノブロッティングする ことにより検査した。他の４つのＣＤＫタンパク質でなく唯−ＣＤＫ２だけがこ の抗体により認識された。ＣＤＫ２タンパク質は、抗−ＣＤＫ２または抗−サイ クリンＤ１のいずれかと免疫沈降するＷ１３８細胞溶解物中に検出されたか、前 −抗血清と沈降した溶解物または競合抗原性ペプチドと予めインキュベーション した抗−ＣＤＫ２中には検出されなかった。相互のウエスタンブロット実験では 、細胞溶解物は抗−ＣＤＫ２と免疫沈降し、そして抗−サイクリンＤ１とブロッ トされた。サイクリンＤ１は抗−サイクリンＤ１および抗−ＣＤＫ２免疫沈降物 中に検出されるが、前−抗血清からの沈降物または競合抗原性ペプチドと予めイ ンキュベーションした抗−ＣＤＫ２抗血清中には検出されなかった。 ＣＤＫ２もサイクリンＤ３と会合するかどうかについて試験するために、ヒト サイクリンＤ３のＣ−末端ペプチドに対する抗血清を使用して （実施例１、実験法を参照のこと）形成した免疫沈降物を抗−ＣＤＫ２抗血清と ブロットした。ＣＤＫ２は抗一サイクリンＤ３沈殿物中に弱く検出されたが、競 合抗原ペプチドと予めインキュベーションした抗−サイクリンＤ３抗血清との対 照沈殿物中には検出されなかった。 最後にＣＤＫ２とサイクリンＤとの間の会合を確認するために、部分的タンパ ク質溶解マッピングを行った。始めにサイクリンＤ１−会合ｐ３３のタンパク質 溶解マップの作成が試みられ、それをＣＤＫ２と比較した。しかしＣＤＫ２と、 抗−サイクリンＤ１沈降物中のさらに別の優勢なプロテインキナーゼとが一緒に 移動するために、異なるタンパク質溶解パターンを得た。したがって逆の実験を 行った。抗−ＣＤＫ２免疫沈降物中の３５ｋＤａバンドをＳＤＳ−ポリアクリル アミドゲルから切り出し、Ｖ８プロテアーゼで部分消化し、そして電気泳動的に 分離し、そしてインビトロ翻訳由来、あるいは抗−サイクリンＤ１免疫沈降物由 来のＶ８消化ｐ３５^cyclinD1と比較した。タンパク質開裂パターンは各々の場合 で同じだった。（iv）ｐＳＫ−Ｊ３／ＣＤＫ４はサイクリンＤ１に会合した優勢なｐ３３タンパ ク質である サイクリンＤ１−会合ｐ３３のタンパク質溶解パターンとＣＤＫ２パターンと の差異は、Ｄ１−会合ｐ３３の大部分がＣＤＫ２以外のタンパク質に対応するこ とを示唆した。ＰＳＫ−Ｊ３と呼ばれるプロテインキナーゼ（はじめにセリン／ トレオニンキナーゼの保存領域由来の混合オリゴヌクレオチドプローブにるスク リーニングで同定された：Hanks.S.K.Proc.Natl Acad.Sci.USA 84:388-392（198 7））は、サイクリンＤ結合特性を有するものと考えられた。ＰＳＫ−Ｊ３の予 想された分子量は、 ３４ｋＤａであり、ｐ３３の分子量に近い。以下に示すこのＤサイクリンとの会 合ゆえに、ＰＳＫ−Ｊ３は本明細書ではＣＤＫ４と呼ぶ。インビトロ翻訳ＣＤＫ ４、および抗−ＣＤＫ４血清との細胞溶解物からの沈殿物はＣＤＫ２およびＤ１ −会合ｐ３３と同じ電気泳動的移動度を示した。抗−ＣＤＫ４抗血清によるＣＤ Ｋ４沈殿物の同定は、その部分的Ｖ８マッピングパターンとインビトロ翻訳ＣＤ Ｋ４とのパターンを比較することにより確認した。 サイクリンＤ１−会合ｐ３３がＣＤＫ４であるかどうかを直接的に試験するた めに、免疫沈降−ウエスタンブロッティング実験を行った。抗−ＣＤＫ４血清は 、抗−ＣＤＫ４で沈殿するＣＤＫ４と同じ移動度を持つ抗−サイクリンＤ１免疫 沈降物中の３３ｋＤａタンパク質と反応したが、ＣＤＫ２またはＣＤＫ５のいず れの細胞溶解物とも反応しなかった。相互的に抗−ＣＤＫ４抗血清はまた、抗− サイクリンＤ１抗体で検出される３５ｋＤａタンパク質を沈殿させる。サイクリ ンＤ１−会合ｐ３３の同一性をさらに確認するために、ｐ３３の部分的Ｖ８消化 パターンをＣＤＫ４とＣＤＫ２との免疫沈降物と比較した。サイクリンＤ１−会 合ｐ３３はＣＤＫ４ときわめて同様なパターンを示したが、ＣＤＫ２のパターン とは極めて異なった。この結果はＷ１３８細胞の抗−サイクリンＤ１沈殿物中に ＣＤＫ２よりもＣＤＫ４がかなり豊富である（少なくともメチオニン標識で大ざ っぱにアッセイした場合）ことを示している。同様に抗−ＣＤＫ４免疫沈降物中 に見られる３３ｋＤａポリペプチド（ｐ３３）は、部分Ｖ８ペプチドマッピング によりサイクリンＤ３であると同定された。（ｖ）ｐ２１のサイクリンＤ１およびＣＤＫ２との会合 抗−サイクリンＤ１血清で沈殿した［³⁵Ｓ］−メチオニン標識Ｗ１３８溶解物 中で、２１ｋＤａタンノ、々ク質（ｐ２１）が特異的にサイクリンＤ１と特異的 に会合することが見られた。ｐ２１は前−抗血清での沈殿物、または２９３細胞 由来の抗−サイクリンＤ１沈殿物中（未検出レベルのサイクリンＤ１を含有する ）のいずれにも存在しなかった。ｐ２１とサイクリンＤ１との特異的会合は、Ｃ ＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ５に対する血清で形成された免疫沈降物中で一緒 に移動する２１ｋＤＡタンパク質の存在により支持された。抗−ＣＤＫ２抗血清 が競合するＣＤＫ２ペプチドにより予めブロックされた時、ｐ２１バンド、なら びにｐ３３^CDK2およびｐ３５^cyclinD1も見られなかった。同様にｐ２１は、もし 抗血清がＣＤＫ５カルボキシ−末端抗原ペプチドと予めインキュベーションされ るならば抗−ＣＤＫ５免疫沈降物中にも無かった。ｐ２１はこの実験で使用した いずれの抗−ＣＤＫまたは抗−サイクリンＤ抗体よるウエスタンブロットでも認 識されなかった。さらに２９３個の細胞中、全免疫沈降性ＣＤＫ２はＷ１３８と 同じであったが、ｐ２１バンドは２９３細胞溶解物からのＣＤＫ２免疫沈降物中 には存在しなかった。この知見はＣＤＫ２およびｐ２１がサイクリンＤに依存し ていることを示唆している。 サイクリンＤ１免疫沈降物およびＣＤＫ２免疫沈降物由来のｐ２１が同じポリ ペプチドであるかどうかを決定するため、各源から精製したｐ２１の部分的Ｖ８ タンパク質溶解パターンを比較した。それらは全く同じであった。抗−ＣＤＫ５ 抗血清で沈殿したｐ２１は、サイクリンＤ１−会合ｐ２１と同じであることも分 かった。抗−ＣＤＫ４免疫沈降物中のｐ２１もタンパク質溶解的マッピングを行 った。これはサイクリンＤ １−会合ｐ２１のパターンと同一であった。ｐ２１はその電気泳動的移動度がヒ トマックスタンパク質、（max protein）またはｐ２１^rasのいずれよりも早く、 そしてウエスタンブロットで抗−ヒトｒａｓ抗体により認識されないので、ヒト マックスタンパク質またはｐ２１^rasには対応しない［ｐ２１配列を加えるべき か？］。（vi）サイクリンＤ１−会合ｐ３６はＰＣＮＡである 上記に説明したように、Ｗ１３８細胞の抗−サイクリンＤ１沈殿物は、会合ポ リペプチド２１ｋＤａ、３１ｋＤａおよび３３ｋＤａ、ならびにまた３６ｋＤａ の優勢タンパク質を示す。ｐ３６は前抗血清または２９３溶解物を使用した対照 沈殿物中には検出されなかった。より少量のみ３６ｋＤａタンパク質も、ＣＤＫ ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ５免疫沈降物中に検出されたが、競合ペプチドで予め インキュベーションした抗血清との免疫沈降物中には検出されなかった。 ｐ３６の同定を確立することを試みている間、４つの考察によりこれはヒト増 殖性核抗原（Proliferating nuclear antigen:PCNA）であるかもしれないという 可能性が示唆された。第一に増殖しているＷ１３８細胞の非同時的な一群（asyn chronous popul ation）では、サイクリンＤ１が主要な核タンパク質であること が観察されているが、その分布はＰＣＮＡのスペックルドパターン（speckled p attern）と同一ではない（Bravo,RおよびH.MacDona1d-Bravo,EMBO J. 4:655-661 （1985）:Madsen.P.およびJ.E.Celis.FEBS Lett.193:5-11（1985）。第二にサイ クリンＤ１のレベルはマイトジェン活性化Ｗ１３８細胞中で比較的一定している が、［³⁵Ｓ］メチオニン−標識サイクリンＤ１免疫沈降物のｐ３６は休止細胞中 で低く、刺激１０−１４時間後に増加した。血清刺激１０−１４時 間後、多くのＷ１３８細胞が後期Ｇ１にあり、この時期は血清−刺激３Ｔ３繊維 芽細胞中でＰＣＮＡ合成の開始に一致する（Bravo,R.およびH.MacDonald-Bravo,EMBO J. ,3:3177-3181（1984）;Celis,J.E.およびA.Celis,Proc.Natl Acad.Sci.U SA 82:3262-3268（1985）:Madsen P.およびJ.E.Celis,FEBS Lett.193:5-11（198 5））。第三にｐ３６の外見上の分子量はＰＣＮＡの分子量と同様である。最後 に抗−ＰＣＮＡ抗体は、電気泳動的移動度がｐ３５^cyclinD1の移動度と同じであ る３５ｋＤａポリペプチドを沈殿させる。抗−ＰＣＮＡ抗体で沈殿するｐ３６の 同定は、そのＶ８ペプチドマップをインビトロ翻訳ＰＣＮＡのペプチドマップと 比較することによりＰＣＮＡとして確認された。 ｐ３６がＰＣＮＡであることの可能性を直接的に試験するために免疫沈降−ウ エスタンブロット実験を行った。ＰＣＮＡは抗−サイクリンＤ１、サイクリンＤ ３、ＣＤＫ２およびＣＤＫ５免疫沈降物中に容易に検出されるが、対照沈殿物中 には現れなかった。また相互の実験でサイクリンＤ１およびＣＤＫ２は抗−ＰＣ ＮＡ免疫沈降物中に検出された。おそらくＷ１３８細胞中での両タンパク質の存 在の低さ、およびウエスタンブロットでのＤ３およびＣＤＫ５の相対的な感度の 悪さから、ＰＣＮＡ沈殿物中にサイクリンＤ３またはＣＤＫ５を納得できるよう に検出することは不可能だった。 ＰＣＮＡと、サイクリンＤ１およびＣＤＫ２に会合するｐ３６ポリペプチドと の間の類似性をさらに評価するために、ｐ３６バンドをサイクリンＤ１およびＣ ＤＫ２免疫沈降物から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そしてそれらの部分 的Ｖ８タンパク質溶解マッピングパターンをＰＣＮＡのパターンと比較した。Ｖ ８プロテアーゼでサイクリンＤ１− 会合ｐ３６を消化すると、抗−ＰＣＮＡ免疫沈降物およびインビトロ翻訳ＰＣＮ Ａに由来するＰＣＮＡのパターンと同じであることが明らかになった。同様に、 ＣＤＫ２−およびＣＤＫ５−会合ｐ３６の消化パターンもＰＣＮＡのパターンと 一致した。サイクリンＤ１に会合するｐ３６はＰＣＮＡである。さらに抗−ＰＣ ＮＡ免疫沈降物中で検出されたｐ２１のタンパク質溶解マッピングにより、ｐ２ １が上記のサイクリンＤ１−会合ｐ２１と同じであることが実証された。（viii）他のサイクリン類のサブユニット複合体 上記のようにＰＣＮＡおよびｐ２１はサイクリンＤ−ＣＤＫと会合して四量体 複合体を形成するだけでなく、多くの他の正常細胞例の中でサイクリン−ＣＤＫ 複合体の普遍成分としても存在する。抗−サイクリンＡ抗体と免疫沈降したＷ１ ３８細胞およびＨＳＦ４３細胞の溶解物中で、サイクリンＡがＰＣＮＡ、ＣＤＣ ２、ＣＤＫ２およびｐ２１と会合することが分かった。 同様にしてＷ１３８およびＨＳＦ４３溶解物由来の³⁵Ｓ−メチオニン−標識抗 −サイクリンＢ１免疫沈降物の分析では、サイクリンＢ１、ＣＤＫ、ｐ２１およ びＰＣＮＡを含んで成る四量体複合体が明らかになった。 本調査で使用した実験技術は、公式には各タンパク質間で多くの対を形成する 相互作用の存在を区別しないが、このデータでＤサイクリン、ＰＣＮＡ、ＣＤＫ およびｐ２１が四量体複合体を形成するかもしれないことを最も端的に説明して いる。免疫沈降反応のメチオニン−標識バンドの強さを比較することにより、す べてのサイクリンＤが複合体中に存在するのではなく、またすべてＰＣＮＡが存 在するわけでもないことが 示唆された。しかし抗−サイクリンＤ沈降物中のｐ３６（ＰＣＮＡ）、ｐ３３（ ＣＤＫ４）およびｐ２１バンドの相対的な強さは、大変似ている。本明細書で与 える結果はサイクリンＤ（本明細書に記載するタンパク質と会合している、また はしていない）がさらにインビボのパートナーと会合するの可能性を除外するも のではない。特に、９７ｋＤの分子量マーカーのいずれかの側に移動する２つの ポリペプチドは抗−サイクリンＤ沈降反応中に現れる。 ＰＣＮＡは、ＤＮＡ−鎖の複製を導き、そしてＤＮＡ修復の両方に必要なデル タポリメラーゼの必須なアクセサリー因子であると説明されて来た（Prelich,G ら、Nature 326:517-520（1987）:Prelich,G.およびB.Stillman,Cell 53:117-12 6（1988）;Toschi,L.およびR.Bravo J.Cell Biol. 107:1623-1628（1988）;M.K. K.Shivijiら、Cell 69:367-374（1922））。ＰＣＮＡは核中の活性なＤＮＡ合成 部位に位置し、そしてＰＣＮＡの位置は（その合成ではない）ＤＮＡ合成に依存 している。インビトロのキナーゼ反応において、任意の各サブユニットのリン酸 化を検出することは不可能であり、これはＰＣＮＡおよびｐ２１のいずれもがサ イクリンＤ／ＣＤＫの第一基質であることを示唆している。 ＰＣＮＡおよびｐ２１と会合するサイクリンＤ／ＣＤＫ酵素はインビトロでよ り複雑な多−タンパク質−ＤＮＡ合成複合体に集合し、その中の１成分がサイク リンＤ／ＣＤＫの生理的基質であるかもしれない。ＰＣＮＡは一般的に細胞から 他のタンパク質とは会合していない単量体で生化学的に精製された（Prelich,G ら、Nature 346:760-763（1987））。本明細書に記載された研究では、多−タン パク質複合体が細胞性ＰＣＮＡの大部分を含んでいないため見過ごされた可能性 がある。あるいはＰ ＣＮＡがこれまでに記載されたことがない、サイクリンＤおよびＣＤＫタンパク 質を含む非−ＤＮＡ合成細胞周期制御の役割を持つ、ということも可能である。 しかし本研究は第一の生化学的指標としてＤ−型サイクリンに可能な機能として ＰＣＮＡ機能のモジュレーター（modulator）を提供するものである。 四量体複合体の重要性は、細胞のＤＮＡ腫瘍ウイルスによる形質転換が、サイ クリンＡ、ＣＤＣ２、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ５を含む他の細胞周期複 合体と同様にサイクリンＤ複合体の選択的なサブユニット転位に関連するという 新たな知見により強調される。特にＳＶ４０ＤＮＡ腫瘍ウイルス、またはその発 癌性遺伝子産物巨大Ｔ抗原の正常ヒトニ倍体繊維芽細胞（ＨＤＦ）への導入は、 サイクリンＤおよびＰＣＮＡ、ＣＤＫｓ（ＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ５の ような）ならびにｐ２１間の会合の破壊を引き起こす。サイクリンＤおよびｐ２ １からの解離後、ＣＤＫ４キナーゼが１６ｋＤａポリペプチド（ｐ１６）に会合 するようになる。同様にＳＶ４０形質転換はＨＤＦ中、そしてアデノウイルスー （２９３細胞系）またはヒトパピローマウイルスー（ＨｅＬａ細胞系）で形質転 換した細胞中でｐ２１とサイクリンＡとの会合の減少を引き起こし、ｐ２１はサ イクリンＡから完全に解離する。１９ｋＤａペプチド、ｐ１９が次にサイクリン Ａとの複合体中に現れる。したがってｐ２１は正常な非形質転換細胞中でのみサ イクリンキナーゼと会合し、一方ｐ１６およびｐ１９、ならびにおそらく他の関 連するタンパク質は形質転換細胞中のサイクリン複合体に存在する。II．形質転換細胞中のサイクリン複合体 以下に説明するように、本考察は細胞分裂の多くの鍵となる段階で作 用するサイクリン／ＣＤＫ酵素の一族は、発癌的に形質転換した種々の細胞中で おおざっぱに変化するという衝撃的な証拠を提供する。調査したサイクリン／Ｃ ＤＫ−族の各員は、ＰＣＮＡおよびｐ２１と会合する。しかしＤＮＡ腫瘍ウイル スＳＶ４０で形質転換すると、またはその形質転換抗原（Ｔ）で形質転換すると 、サイクリンＤ／ＣＤＫ／ＰＣＮＡ／ｐ２１複合体は破壊される。形質転換細胞 では、ＣＤＫ４はサイクリンＤ、ＰＣＮＡおよびｐ２１とは全体的に解離してお り、そして代わりに排他的に１６ｋｄ（ｐ１６）ポリペプチドと会合している。 サイクリンＡまたはＢ１およびｐ２１／ＣＤＫ／ＰＣＮＡを含有する四量体複合 体も、形質転換細胞中でサブユニットの転位を受ける。ＰＣＮＡおよびｐ２１の 両方はもはやＣＤＣ２−サイクリンＢ１二量体複合体とは会合しない。サイクリ ンＡ複合体はもはやｐ２１を含有せず、むしろ新な１９ｋｄポリペプチド（ｐ１ ９）がサイクリンＡに会合して見いだされる。サイクリン−ＣＤＫ複合体のサブ ユニット転位がＳＶ４０−形質転換細胞中だけでなく、アデノウイルスまたはパ ピローマウイルスで形質転換された細胞中でも見いだされたならば、このパター ン。さらにサイクリン−ＣＤＫ−族のサブユニット組成パターンは非−ウイルス 形質転換細胞中（リーフローメニ患者（Li-Fraumeni patients）由来のｐ５３− 欠失細胞、ならびに上皮Ａ−４３１癌細胞、および咽頭偏平上皮細胞癌細胞Ｆａ Ｄｕのような）では大まかには異常である。 （ｉ）ＳＶ４０−形質転換細胞中でのサイクリンＤ／ＣＤＫ／ＰＣＮＡ／ｐ２１ 複合体の破壊 サイクリンＤ／ＣＤＫ／ＰＣＮＡ／ｐ２１四量体複合体は上記のように正常な 繊維芽細胞（例えばＷ１３８ａｄＨＳ６８）中で検出されたが、 このような複合体はウイルスで形質転換された数種の他の細胞系（例えばヒト２ ９３細胞系）では検出されなかった。与えられた明らかな差異、正常な二倍体繊 維芽細胞中のサイクリンＤ複合体のサブユニット組成、およびそれらの形質転換 された誘導体をより詳細に比較した。Ｗ１３８ＶＡ１３、２ＲＡサブライン（今 後、本明細書にてＶＡ１３と呼ぶ）はＷ１３８細胞系由来のＳＶ４０ウイルスで 形質転換した誘導体である。³⁵Ｓメチオニン−標識Ｗ１３８およびＶＡ１３溶解 物の抗−サイクリンＤ１免疫沈降物を調査した。Ｗ１３８細胞について上述した ように、抗−サイクリンＤ１抗血清はサイクリンＤ１に対応する優勢な３５−ｋ Ｄバンド、および３つの主要会合タンパク質ｐ３６^PCNA、ｐ３３^CDK4およびｐ２ １を沈殿させる。ＳＶ４０−形質転換ＶＡ１３細胞において、サイクリンＤ１の レベルは、³⁵Ｓメチオニン−標識免疫沈降物のオートラジオグラフイー、および ウエスタンブロッティングにより測定すると、２−から３倍まで減少する。しか し３つの主要サイクリンＤ１−会合タンパク質のいずれもＳＶ４０で形質転換し たＶＡ１３細胞中のサイクリンＤ１と視覚的に会合することは無かった。観察さ れたＳＶ４０で形質転換した細胞中のサイクリンＤ複合体の破壊を確認するため に、相互の免疫沈降を抗−ＣＤＫ４および抗−ＣＤＫ２抗血清を使用して行った 。Ｗ１３８細胞では抗−ＣＤＫ４抗体は３つの主要会合タンパク質、ｐ３６^PCNA ｐ３３^cyclinD1およびｐ２１に加えてＣＤＫ４を沈殿させた。ＳＶ４０で形質転 換したＶＡ１３細胞では、ＣＤＫ４は非形質転換Ｗ１３８細胞と比較して同様な レベルで存在するが、抗−ＣＤＫ４免疫沈降物中に検出しうるＰＣＮＡ、サイク リンＤ１またはｐ２１は存在しなかった。また同様な結果が抗−ＣＤＫ２（別の サイクリン−Ｄ会合キナーゼ 触媒サブユニット）との免疫沈降物中にも観察された。サイクリンＤ１はＷ１３ ８細胞中の主要ＣＤＫ２−会合タンパク質の１つであるが、たとえＣＤＫ２のレ ベルが形質転換細胞中で同様、またはわずかに高くてもＳＶ４０−形質転換ＶＡ １３細胞中で会合は検出されない。またＣＤＫ２−会合ｐ２１のレベルは形質転 換細胞中では減少したが、検出しうるレベルで存在する。 さらに数種の正常ヒト二倍体繊維芽細胞系およびそのＳＶ４０−形質転換誘導 体を調査した。ＨＳＦ４３は新生児包皮から派生した二倍体繊維芽細胞であり、 そしてＣＴ１０−２Ｃ−Ｔ１（今後、本明細書でＣＴ１０と呼ぶ）はＨＳＰ４３ からＳＶ４０巨大腫瘍抗原遺伝子をラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター を駆動させることにより導入して得た（Rayら、J.Cell Biochem 42:13-31（1990 ））。正常および形質転換細胞のサブユニット組成ならびに解離パターンは、Ｗ １３８およびＶＡ１３細胞で観察されるパターンと極めて近かった。Ｔ−形質転 換ＣＴ１０細胞から調製された抗−ＣＤＫ４、抗−ＣＤＫ２および抗−ＣＤＣ２ 免疫沈降物中にはサイクリンＤ１は見られなかったが、ＨＳＦ４３細胞中には出 現した。相互的に、ＣＤＫ４はＣＴ１０細胞の抗−サイクリンＤ１沈殿物には見 られなかった。ＣＤＫ４−会合ＰＣＮＡおよびｐ２１もＣＴ１０細胞中に検出さ れなかった。Ｔ−形質転換細胞中のｐ２１はＶＡ１３細胞系のように、新に同定 されたｐ１６タンパク質により置き換えられると思われた。さらに本質的に同一 の結果がヒト繊維芽細胞系であるＩＭＲ−９０、正常ヒト肺二倍体細胞系および そのＴ−形質転換誘導体ＩＤＨ４の別の対でも得られ（Shayら、Biochem Biophy s Acta 1072:1-7（1992））ならびにサル細胞系ＣＶ−１、擬二倍体腎臓細胞系 、お よびそのＳＶ４０−形質転換誘導体ＣＯＳ−１の対でも得られた。 形質転換細胞中で観察されたサイクリンＤ複合体の解離をさらに確認するため に、イムノブロッティングと組み合わせた免疫沈降法がしばしば代謝的標識実験 において生じる可能性があるアーティファクトを避けるために行われた。非形質 転換Ｗ１３８またはＳＶ４０−形質転換ＶＡ１３細胞のいずれかから調製した全 溶解物を、電気泳動的に分離した抗体の一群で免疫沈降させ、そして種々の第二 抗体とブロットした。ＣＤＫ４、ＣＤＫ２およびＰＣＮＡは検出されないか（Ｃ ＤＫ４）、またはＳＶ４０−形質転換細胞由来の抗−サイクリンＤ１沈殿物中で は劇的に減少したレベルで存在する（ＣＤＫ２およびＰＣＮＡ）かのいずれかで あった。それぞれの場合において、直接的なイムノブロッティングにより、ＣＤ Ｋ４、ＣＤＫ２およびＰＣＮＡの絶対的レベルは正常および形質転換細胞中で同 様であることが確認された。相互的に、サイクリンＤ１は形質転換ＶＡ１３細胞 に由来する抗−ＣＤＫ２または抗−ＣＤＫ４沈殿物のいずれにも検出されなかっ た。同じ結果が別の細胞系の対のそれぞれ（ＨＳＦ４３およびＣＴ１０）からも 得られた。（ii）形質転換細胞中のサイクリンＡおよびＢ複合体のサブユニット転位 非形質転換Ｗ１３８細胞およびＳＶ４０−形質転換ＶＡ１３細胞中のサイクリ ンＡ複合体のサブユニット組成を調査した。上記のように、サイクリンＡはＷ１ ３８細胞中のｐ３６^PCNA、ｐ３３^CDC2、ｐ３３^CDK2およびｐ２１と会合する。Ｓ Ｖ４０−形質転換ＶＡ１３細胞では、サイクリンＡそれ自体、およびサイクリン Ａ−会合ＣＤＣ２／ＣＤＫ２の両方のレベルが約３倍に増加した。相互にＣＤＣ ２−およびＣＤＫ２−会合 サイクリンＡのレベルも２−から３倍に増加した。 サイクリンＡ−会合ｐ２１のレベルは３５Ｓ−メチオニン標識細胞溶解物の免 疫沈降により測定したように、Ｗ１３８細胞と比較してＶＡ１３細胞中では減少 する。ｐ２１のレベルはＣＤＫ２（サイクリンＡの主要触媒パートナー）に対す る抗血清を使用するＶＡ１３細胞から調製した免疫沈降物中でも低い。正常ＩＭ Ｒ−９０細胞対そのＴ形質転換ＩＤＨ細胞、およびサルＣＶ−１／ＣＯＳ−１対 細胞系に加えて、ＨＳＦ４３およびＣＴ１０細胞を使用して、同様な結果が一貫 して得られた。 非形質転換細胞に特異的な、または形質転換細胞に特異的な別の多くのポリペ プチドがサイクリンＡ沈殿物中に見られた。例えば分子量が４２ｋＤであるタン パク質は非形質転換Ｗ１３８またはＨＳＦ４３細胞中に優勢に見られるが、形質 転換ＶＡ１３またはＣＴ１０細胞中には見られない。逆に、Ｔ抗原に対応するか もしれない９５ｋＤのポリペプチドは、１９ｋＤのポリペプチドのように（以下 に考察する）形質転換細胞中にのみ見られる。 正常および形質転換細胞中のサイクリンＢ１複合体のサブユニット組成も調査 した。Ｄ１と同じように、サイクリンＢ１／ＣＤＫ／ｐ２１／ＰＣＮＡの四量体 複合体は、非形質転換Ｗ１３８およびＨＳＦ４３細胞を比較した時、ＳＶ４０− 形質転換ＶＡ１３細胞およびＴ−形質転換ＣＴ１０細胞中の両方で変化する。し たがってＰＣＮＡおよびｐ２１のいずれもサイクリンＢ／ＣＤＫとは形質転換細 胞中で会合しない。しかし予想通り、ＣＤＣ２はサイクリンＢ１（ｐ６２）とＶ Ａ１３、ＣＴ１０、２９３およびＨｅＬａ細胞中で会合している。（iii）他のＤＮＡ腫瘍ウイルス−形質転換細胞中のサイクリンおよびＣ ＤＫ複合体 他のヒト腫瘍細胞中でもサイクリン−ＣＤＫ複合体が変化するのかどうかを調 査するために、パピローマウイルス−含有頸頚部腫瘍ＨｅＬａ細胞およびアデノ ウイルス−形質転換第一期腎臓２９３細胞を、種々のサイクリンおよびＣＤＫ複 合体のサブユニット組成について調査した。両方のこれら細胞系は哺乳細胞周期 の生化学的研究に広く利用されてきた。サイクリンＤ１はＨｅＬａ細胞中で低レ ベルで発現し、そして２９３細胞中でわずかに検出できる。しかし他のサイクリ ン／ＣＤＫ複合体のサブユニット組成を調査できる。よく確立されたＣＤＣ２− サイクリンＢ１、ＣＤＣ２−サイクリンＡおよびＣＤＫ２−サイクリンＡの会合 は、すべてＨｅＬａおよび２９３細胞中の両方で容易に検出された。しかし第ｐ ２１は、ＨｅＬａまたは２９３細胞のいずれかからの抗−ＣＤＣ２、抗−ＣＤＫ ２、抗−サイクリンＡまたは抗−サイクリンＢ１免疫沈降物中に見られた。した がってサイクリンＡ／ＣＤＫ／ｐ２１／ＰＣＮＡおよびサイクリンＢ１／ＣＤＫ ／ｐ２１／ＰＣＮＡの四量体複合体は、集合していないか、あるいはこれらのＤ ＮＡ腫瘍ウイルス−形質転換細胞中では極めて低レベルで存在しているかのいず れかである。事実、複合体中のｐ２１が１９ｋＤのポリペプチドに置換されたと 思われる新規サイクリンＡ複合体が出現した。同じ１９ｋＤのポリペプチドはＳ Ｖ４０−形質転換ヒトＶＡ１３、ＣＴ１０、ＩＤＨ４およびさらにサルＣＯＳ− １細胞由来の抗−サイクリンＡ沈殿物中に存在する。さらに２９３およびＨｅＬ ａ細胞では、ＣＤＫ４のサブユニット組成はＴ−抗原−形質転換細胞のサブユニ ット組成と同一である。サイクリンＤ１はＣＤＫ４とは会合しないが（種に起因 する細胞からのサイクリンＤの 不在）、ＰＣＮＡおよびｐ２１も存在しない。ｐ２１はＨｅＬａおよび２９３細 胞ではｐ１６により置換された。おもしろいことには、ＣＤＫ４−会合ｐ１６は 非形質転換Ｗ１３８またはＨＳＦ４３細胞では極めて低レベルで検出される。そ れぞれのタンパク質溶解開裂マッピングでは、ＨｅＬａ）２９３、ＶＡ１３およ びＷ１３８細胞からのＣＤＫ４−会合ｐ１６は同一であるが、ｐ２１とは異なる ことが明らかになった。３つの異なるウイルスにより形質転換した細胞中のｐ１ ９およびｐ１６の存在、ならびに非形質転換細胞中のｐ１６の存在はそれらがウ イルスにコードされているタンパク質ではないことを示している。（iv）リーフラウメニ細胞中のサイクリンおよびＣＤＫ複合体の変化 リーフラウメニ患者の一族由来の繊維芽は、異数性および不滅化を高い割合で 含む自然発生的異常を現す（Liら、J.Natl Cancer Inst 43:1365-1373（1969） ：ならびにBischoffら、Cancer Res 50:7979-7984（1990））。これらの細胞は いかなる既知のウイルスをも含まない；代わりに腫瘍サプレッサー遺伝子ｐ５３ の単一−塩基のヘテロ接合体的突然変異（heterozygous mutations）がグラム系 の変化として報告されているだけである。連続的したインビトロでの継代中にリ ーフラウメニ繊維芽が老化現象および自然発生的な不滅化から逃れるのは、野生 型ｐ５３対立遺伝子の第二欠失に関連している。自然に発生した不滅化リーフラ ウメニ細胞系、ＬＣＳ０４１（継代＞１７０）由来の³⁵Ｓ−メチオニン−標識細 胞溶解物を、種々の抗体と免疫沈降させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。 ＬＣＳ０４１細胞中のほとんどのこれらタンパク質のレベルは、サイクリンＡが 正常繊維芽と比較するとかなり低レベルで発現することを除いて、代謝標識およ びイムノブロッティングにより測定されるよう に正常二倍体繊維芽中のレベルと同様である。サイクリンおよびＣＤＫ複合体の サブユニット組成は、ＬＣＳ０４１細胞中では大まかに異常であり、ＨｅＬａお よび２９３細胞中のようにサイクリンＢ１−ＣＤＣ２複合体が存在し、そしてｐ ２１またはＰＣＮＡと会合しない。サイクリンＤ１−ＣＤＫ４会合はＬＣＳ０４ １細胞中ではほとんど検出されないレベルまで減少し、そしてＰＣＮＡおよびｐ ２１の両方が存在しない。ｐ２１はＬＣＳ０４１細胞中で調査したいずれのサイ クリン−ＣＤＫ複合体中にも検出されず、そしてＴ−抗原−形質転換繊維芽で生 じたようなｐ１６またはｐ１９タンパク質による置換は無いように思われた。サ イクリン−ＣＤＫ複合体に会合したＰＣＮＡのレベルも、各場合について劇的に 減少した。直接的イムノブロッティングではＰＣＮＡの量は正常繊維芽と比較し てＬＣＳ０４１細胞よりも高いが、抗−ＣＤＣ２、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、サイク リンＡ、サイクリンＢ１およびサイクリンＤ１で単離した免疫複合体中ではＰＣ ＮＡは劇的に減少するか、または全く無かった。本質的に同一の結果が別のリー フラウメニ細胞系、ＬＣＳ０８７を使用しても得られた。III．ｐ１６およびＣＤＫ４の阻害剤のクローニング ヒトＣＤＫ４と相互作用できるタンパク質を調査し、より特別にはｐ１６をコ ードするｃＤＮＡを単離するために、２−ハイブリッドスクリーニングシステム （two-hybrid screening system:Fieldsら、Nature 340:254（1989））を利用し た。２−ハイブリッドスクリーニングは機能的なＧＡＬ４活性化因子を２つの別 個の融合タンパク質から再構成させることによる：それはＣＤＫ４に融合するＧ ＡＬ４ ＤＮＡ−結合ドメイン、ＧＡＬ４ｄｂ−ＣＤＫ４；およびＨｅＬａ ｃ ＤＮＡｓによりコー ドされるタンパク質に融合するＧＡＬ４活性化ドメイン、ＧＡＬ４ａｄ−ｃＤＮ Ａである。ＹＰＢ２は２つの異なるＧＡＬ４−依存性プロモーター（ＨＩＳ３お よびＬａｃＺ）の制御下の２つの染色体遺伝子を含む株であるので、受容体酵母 として使用した。ＹＰＢ２をそれぞれＧＡＬ４ｄｂ−ＣＤＫ４およびＧＡＬ４ａ ｄ−ｃＤＮＡ融合物をコードする２つのプラスミドの混合物で形質転換させた。 ヒスチジンの不在で成長し、そしてβ−ｇａｌの存在で青色に変わる数個のクロ ーンを得た。ＤＮＡのシークエンシングデータから、各陽性クローンは同じ遺伝 子から派生したものと決定したが、１つの群はより短い３’末端を持つｍＲＮＡ を示すことが明らかになった。これらのｃＤＮＡｓ配列はＧＡＬ４ａｄのフェイ ズ中で、予想される分子量が１５，８４５ダルトンである１４８アミノ酸（配列 番号３および４）のタンパク質をコードする読み取り枠を含んだ。このタンパク 質をＩＮＫ４（ＣＤＫ４の阻害剤：以下参照）と呼ぶ。ｐ１６ＩＮＫ４の配列を 標準的な方法で現在入手できるデータバンクにある配列と比較し、そして有意な 相同性は見いだされなかった。 ｐ１６ＩＮＫ４が特異的にＣＤＫ４に結合するのかどうかを試験するために、 ＹＰＢ２をＧＡＬ４ａｄ−ｐ１６ＩＮＫ４融合体、ならびにそれそれｃｄｃ２、 ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＰＣＮＡおよびＳｎｆｌ（分裂酵母キナーゼ） をそれそれ含む数個の標的ＧＡＬ４ｄｂ融合構造体とを一緒にコートランスホー ム（cotransform）した。形質転換した細胞をヒスチジンの有無でプレートにま いた。ＧＡＬ４ｄｂ−ＣＤＫ４融合体のみがＧＡＬ４ａｄ−ｐ１６ＩＮＫ４とあ る程度相互反応し、ヒスチジン無しでも生育できたが、これはこの融合タンパク 質対がＨＩＳ３遺伝子の発現を増強できる機能的ＧＡＬ４活性化剤を特異的に再 構 築したことを示す。同じ結果がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現をトランス活 性化する能力をアッセイした時にも得られた。 この相互作用の特異性をさらに無細胞系で、インビトロ翻訳（³⁵Ｓ）−標識Ｃ ＤＫｓとｐ１６ＩＮＫ４（１７）に連結したグルタチオン−Ｓトランスフェラー ゼ（ＧＳＴ）から成る精製した細菌生産融合タンパク質とを混合することにより 実証した。ＧＳＴ−ｐ１６ＩＮＫ４融合体はグルタチオンーセファロースビーズ に結合させて回収し、そして各ＣＤＫの会合をゲル電気泳動により分析した。以 前の観察と一致して、ＧＳＴ−ｐ１６ＩＮＫ４はｃｄｃ２、ＣＤＫ２またはＣＤ Ｋ５よりも効率的にＣＤＫ４に結合した。 ｐ１６ＩＮＫ４の予想された分子量は１６Ｋｄに近かったので、ｐ１６ＩＮＫ ４を形質転換細胞系（上記）中に見られたＣＤＫ４−会合ｐ１６タンパク質との 同一性が測定された。２つのインビトロ翻訳生産物、１５ＫＤおよび１７ＫＤ生 産物をｐ１６ＩＮＫ４ ｃＤＮＡから得た。これらの生産物、ならびにＨｅＬａ 細胞由来のＣＤＫ４−会合ｐ１６タンパク質をＮ−クロロスクシンイミドで処理 した。１７ＫＤのｃＤＮＡＩＮＫ４−誘導産物の部分的なＮＣＳ−タンパク質溶 解パターンは、ＨｅＬａ細胞由来のＣＤＫ４−会合ｐ１６タンパク質と大変似て いた。これはｐ１６ＩＮＫ４ ｃＤＮＡが実際ｐ１６に相当することを強力に指 示している。１７ＫＤ ｃＤＮＡＩＮＫ４−誘導産物およびｐ１６のＶ８プロテ アーゼ部分消化も同様なパターンを生じた。昆虫細胞中で過剰発現したｐ１６Ｉ ＮＫ４タンパク質は１５ＫＤの電気泳動的移動度を持ち、そしてＮＣＳタンパク 質溶解マップが１５ＫＤ ｃＤＮＡ誘導産物で得たマップと同一であることに注 目することは興味深い。これはヒト 細胞中および１７ＫＤインビトロ翻訳産物中に見られる実際のｐ１６ＩＮＫ４が 、翻訳後に修飾されたタンパク質に相当することを示唆している。昆虫細胞中で 過剰発現したｐ１６ＩＮＫ４タンパク質がＣＤＫ４と相互作用するという事実は 、この修飾が相互作用に必須ではないことを示唆している（以下参照）。 ｐ１６ＩＮＫ４とＣＤＫ４−会合タンパク質ｐ１６との間の同一性は、精製し たＧＳＴ−ｐ１６ＩＮＫ４融合タンパク質に対して生成した抗体を使用してさら に確認した。数種のヒト細胞系をこの実験に使用した。それらは正常肺繊維芽由 来の正常細胞系Ｗ１３８；ＳＶ４０ Ｔ抗原で形質転換したＷ１３８由来のＶＡ １３細胞系；そしてＨｅＬａ細胞である。上記に説明したようにＷ１３８の抗− ＣＤＫ４免疫沈降物は、ＣＤＫ４とサイクリンＤ１、ＰＣＮＡ、ｐ２１およびｐ １６との会合を明らかにした。対照的にＶＡ１３およびＨｅＬａ細胞ＣＤＫ４は ｐ１６にのみ会合した。抗−ｐ１６ＩＮＫ４免疫沈降物は、外見上の分子量が１ ６ＫＤであり、２つの形質転換細胞系（ＶＡ１３およびＨｅＬａ）で容易に検出 できるが、正常細胞系Ｗ１３８でははるかに少ないタンパク質を含んでいた。こ のタンパク質は抗−ＣＤＫ４血清と一緒に免疫沈降するｐ１６タンパク質と同じ 電気泳動的移動度を持つだけでなく、同一のＮＣＳ部分タンパク質溶解パターン を有した。ｐ１６ＩＮＫ４に加えて、３３Ｋｄのタンパク質が抗−ｐ１６同時免 疫沈降物（coimmunoprecipitates）中に観察され、これはＶ８タンパク質溶解マ ッピングによりＣＤＫ４と同一であることが示された。 Ｗ１３８およびＶＡ１３細胞中に存在する転写物のノーザン分析では、何回も ｐ１６ＩＮＫ４ ｍＲＮＡの量はＷ１３８細胞中ではＶＡ１３細 胞中と比較して少ないことが示された。この差異は、２つの細胞間で観察された ｐ１６タンパク質の量の差異におよそ相当し、これはｐ１６ＩＮＫ４発現が転写 または転写後に制御されているかもしれないことを示唆している。実際、３つの 非ウイルス的に形質転換した細胞系ではｐ１６ＩＮＫ４の発現はゲルを過剰に露 出させた後でも検出できなかった。 ｐ１６ＩＮＫ４とＣＤＫ４との相互作用の生化学的帰結を調査するために、活 性なＣＤＫ４−サイクリンＤ複合体を標準的な方法でインビトロで再構成した（ Katoら、Genes Der 7:331（1993）；およびEwenら、Cell 73:487（1993））。３ つの関連する成分、ＣＤＫ４、ｐ１６ＩＮＫ４およびサイクリンＤ１をバキュロ ウイルス−感染昆虫細胞中で発現させた。別個にｐ１６ＩＮＫ４、ＣＤＫ４また はサイクリンＤ１を過剰発現した代謝的に（³⁵Ｓ）−標識した昆虫細胞から、な らびにＣＤＫ４およびサイクリンＤ１の両方を過剰発現している細胞から抽出物 を調製した。ｐ１６ＩＮＫ４の量の増加に反応して、対応するＣＤＫ４がＲｂを リン酸化する能力の減少が観察された。この抑制は免疫沈降法で検出されるよう なｐ１６ＩＮＫ４とＣＤＫ４との間の会合に相関した。ＣＤＫ２−サイクリンＤ ２複合体を同じアッセイに使用した時は抑制は観察されなかった。ＣＤＫ４の抑 制がｐ１６ＩＮＫ４によるものであることを確認するために、Ｈｉｓ−標識（ta gged）ｐ１６ＩＮＫ４融合タンパク質（Ｈｉｓ−ｐ１６ＩＮＫ４）を、６ヒスチ ジン残基域を含有する２０アミノ酸のアミノ末端の広がりを有するように作成し た。この融合タンパク質をバキュロウイルス−感染昆虫細胞中で過剰発現させ、 そしてニッケル−アガロースビーズに対するヒスチジン域の高い親和会合性によ り精製した。このＨｉｓ−ｐ１６ＩＮＫ４タンパク質調製物は９０％より高い純 度を示し、全溶解物による抑制に使用したのと同じ条件下でＣＤＫ４−サイクリ ンＤ１複合体の活性を抑制した。IV．本発明の使用 本明細書に記載された操作に基づき、血液、尿、便、粘膜、唾液またはバイオ プシー（細胞学的標本を含む）のような組織または生物学的試料から得た細胞中 のサイクリンＣＤＫ、ＰＣＮＡ、ｐ２１、ｐ１９およびｐ１６が変化した複合体 を検出することが可能である。これは例えば複合体の組成のサブユニット組成の 変化と、細胞性の形質転換または異常な細胞増殖との間にある明らかな関連から 、診断および予知を目的とした使用に有力である。本明細書に記載した診断およ び治療法は、個人の疾患状態または複合体サブユニットのそのような転位に関連 する、または示される症状の発生の可能性を評価するために、ならびに治療効果 をモニターする（薬剤の効果、またはサブユニット転位に関する薬剤の効果や評 価することにより）ために使用できる。 例えばＣＤＫｓ、サイクリン、ＰＣＮＡおよび低分子量ポリペプチド（ｐ２１ 、ｐ１９およびｐ１６）との間の相互作用を認識する薬剤を開発できる。薬剤を 次に形質転換状態を試験する細胞試料と接触させることができ、複合体中の特定 のサブユニットの存在により形質転換を指示するであろう。例えばＣＤＫ４−ｐ １６複合体はサイクリンＡ−ｐ１９複合体のように形質転換を示す。あるいはサ ブユニット間の相互作用の存在を測定するために、種々のサブユニットを認識す る薬剤を組み合わせて使用できる。例えばｐ２１を認識する薬剤をサイクリンま たはサイクリンキナーゼを認識する薬剤と組み合わせて、ｐ２１がサイクリンま たはサイクリンキナーゼと複合体を形成しているかどうかを測定できる。 四量体複合体の化合物に特異的な反応性の抗体を本方法の試薬として使用する ために、既知の手法により作成できる。例えば抗血清は適当な宿主（例えばウサ ギ、マウス、ラット、ブタ）に所望の抗血清に対するＤ−型サイクリンを注射し 、そして抗体が形成されるのに十分な時間が経過し後、宿主動物から採血する。 モノクローナル抗体も既知の手法により作成できる、Sambrook,J.ら、モレキュ ラークローニング ：ア ラボラトリー マニュアル（Molecular Cloning:A Labo ratory Manual）、コールド スプリングハーバーラボラトリー、コールドスプ リングハーバー：NY.（1989）、Hallow,E.およびD.Lane、抗体（Antibodies）：アラボラトリー マニュアル、コールド スプリングハーバー出版、ニューヨー ク、（1988）。ＣＤＫ５、ＣＤＫ４および他の一般的ＣＤＫｓ、ｐ２１、ｐ１９ 、ｐ１６およびサイクリン類に特異的に反応性である抗体も既知の手法を使用し て作成できる。 説明を目的とした態様では、抗体をＣＤＫ４／ｐ１６複合体に対して生成させ る。免疫原性の状態でそのような複合体を作成するのを容易にするために、ＣＤ Ｋ４／ｐ１６複合体を化学的架橋により作成できる。別の態様では、ＣＤＫ４／ ｐ１６融合タンパク質は、各タンパク質由来のポリペプチド配列間に非構造化ポ リペプチドリンカー領域を導入するために、単一鎖抗体法（single chain antib ody technology）を使用して作成できる。このリンカーにより融合タンパク質の 柔軟性の増加を利用でき、２つの断片の間の立体障害を減らして各サブユニット が自由に互いに作用できるようにし、ならびに各断片の適切な折りたたみが起こ ることを可能にする。リンカーはタンパク質の２つのドメインの間にランダムコ イル状態で存在すると決定された配列のような天然起源のもの であることができる。あるいはリンカーは合成されたものであることができる。 例えば配列（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃を合成の非構造化リンカーとして使用できる。こ の種類のリンカーはHustonら、（1988）、PNAS 85:4879；および米国特許第5,09 1,513号明細書に記載されている。したがってＣＤＫ４／ｐ１６複合体に似てい る免疫原性複合体を作成でき、引き続きこの複合体を認識するが単離したサブユ ニットは認識しない抗体を単離できる。 さらに別の態様では、特に本発明は細胞中のｐ１６レベルを検出するためのア ッセイおよびキットを意図するものである。ｐ１６（本明細書に記載するように ）に特異的な抗体、またはｐ１６転写物のｍＲＮＡレベルを検出するための核酸 プローブを、形質転換細胞を検出するために使用できる。上記のように、ｐ１６ ｍＲＮＡレベル、およびおそらくｐ１６タンパク質は正常細胞に比べて形質転換 細胞中では上昇する。したがってｐ１６遺伝子発現のレベルの検出は形質転換細 胞の存在を決定するのに診断的に有用である。説明のための態様では、in situ ハイブリダイゼーションアッセイをｐ１６配列に対する核酸プローブを使用して 、標準的手法（例えば、Taubら、米国特許第4,820,630号明細書；Falkowら、米 国特許第4,358,935号明細書；およびBresserら、米国特許第5,225,326号明細書 を参照）により行うことができる。 本発明の好適なアッセイではｐ１６／ＣＤＫ４複合体が特徴である形質転換細 胞と、非形質転換細胞との間のｐ１６レベルの定量的差異を確認することができ る。簡単に述べると単一細胞懸濁液または組織片のいずれかの細胞を、スライド ガラスのような支持体上に付着させることができる。あるいは細胞を１ｍｌあた り約１０⁵−１０⁶細胞の単一細胞懸 濁液中に置く。細胞を細胞に最高の空間的識別距離を提供し、そして核酸プロー ブを使用するときに至瀾なハイブリダイゼーション効率を与えるか、あるいは抗 −ｐ１６Ａｂｓを使用するときには至適な結合親和性および特異性を与える定着 薬を選択して固定する。 核酸プローブについては、ハイブリダイゼーションは固定化を行ったものと同 じ溶液で行うことができる。この溶液は定着薬およびホルムアミドのようなカオ トロピック試薬の両方を含有する。また濃塩化リチウムまたは酢酸アンモニウム 溶液のようなハイブリッド安定化試薬、緩衝液、低分子量ＤＮＡおよび／または リボゾームＲＮＡ（５０塩基までの大きさ）が非特異的結合を無くすために含ま れ、そして孔形成剤（poreforming agent）でプローブが細胞中に入りやすくす る。バナジル リボヌクレオシド複合体のようなヌクレアーゼ阻害剤を含有して もよい。 標的ポリペプチドとハイブリダイズさせるために、ハイブリダイゼーション溶 液にｐ１６プローブを加える。最も好ましいプローブは一本鎖のアンチーセンス プローブである。細胞ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションするために、約７５− １５０塩基長のプローブが使用される。プローブを含むハイブリダイゼーション 溶液を固定化した細胞を使用するときは細胞を覆うのに十分な量で加える。細胞 を次に至適温度でインキュべーションする。 プローブはハイブリダイゼーション反応前に検出できるように標識してもよい 。あるいはハイブリダイゼーション生成物に結合する検出しうる標識を選んでも よい。本発明で実験に使用するために任意の検出可能な群によりプローブを標識 してもよい。そのような検出可能な群は検出しうる物理的または化学的特性を持 つ任意の物質であることができる。 そのような検出可能な標識はイムノアッセイの分野でよく開発されてきており、 一般的にそのような方法に有用なほとんどの標識を本発明に応用できる。特に有 用なものは例えば酵素（Clin.Chem.,22:1243（1976）を参照）、酵素基質（英国 特許第1,548,741号明細書を参照）、補酵素（米国特許第4,230,797号明細書およ び同第4,238,565号明細書を参照）および酵素阻害剤（米国特許第4,134,792号明 細書）のような酵素的に活性な群；蛍光マーカー（Clin. Chem. 25:353（1989） ）：発色団；化学的発光物および生物的発光物マーカーのような発光化合物（Cl in. Chem .,25：512（1979））；特異的に結合できるリガンド；近接作用対（pro ximal interacting pairs）；そして³Ｈ、³⁵Ｓ、³²Ｐ、¹²⁵Ｉおよび¹⁴Ｃのよう な放射性同位体。 同様な様式で、抗−ｐ１６抗体を標識してｐ１６タンパク質の存在を細胞試料 から検出するために使用できる。 本発明は細胞形質転換を阻害または抑制する化合物または分子ヲスクリーニン グする方法も含む。形質転換を阻害する能力をアッセイする化合物または分子を 細胞と、その化合物または分子が細胞に入るのに適当な条件下で接触させる。細 胞の形質転換によりサイクリン複合体中のサブユニットの選択的な転位が起こる だろう。化合物または分子の存在中での転位の割合または程度の比較は、適当な 対照（例えば試験薬を加えていない同種の細胞）の割合または程度をアッセイし て行われ、この比較により化合物または分子のサブユニット転位を阻害できる能 力または無能力を実証できるだろう。サブユニット転位を阻害する薬剤も本発明 の主題である。 例えばプロテインキナーゼ−Ｄ型サイクリン複合体の形成は直接的な 方法により妨害できる。例えばそれはプロテインキナーゼまたはＤ型サイクリン に結合する薬剤または他の試薬を細胞に導入するか、あるいはサイクリンとプロ テインキナーゼとの間の物理的会合を妨害して活性化（挿入により）するか、ま たは酵素の触媒活性を破壊する。これはキナーゼまたはサイクリンまたは低分子 量有機化合物（これは内因性のＤ−型サイクリンのように、プロテインキナーゼ に結合するが、その結合により酵素の活性化が起こらず、または酵素を無能にし たり分解したりしない）に結合する抗体により行うことができる。この目的に使 用するペプチドおよび小さい有機化合物は、Ｄ−型サイクリンのアミノ酸配列の 分析に基づき（結合に必要な残基を含み、そしてその存在により活性を生じるよ うな残基を排除して）設計することができる。例えばこれは結合部位（１つまた は複数）を系統的マッピングし、そして活性に必要な部位（１つまたは複数）を 認識する、または会合するが活性化はしない分子を設計することにより行うこと ができる。本明細書に記載するように、Ｄ−型サイクリンならびにＣＤＫｓと形 成された複合体の組織中での特異形態発現がある。したがって活性および／また は特定のＤ型サイクリンおよびＣＤＫを含んで成る複合体レベルを妨害（阻害） するように設計された試薬（例えば抗体またはアンチセンスまたは他の核酸分子 ）を使用することにより、細胞の有糸分裂能力を選択的に減少させることが可能 である。例えば中枢神経系あるいは他の非造血組織を含む腫瘍の治療において、 Ｄ１は特異形態的に発現するので（神経起源の細胞中での特に高レベルの発現） 、サイクリンＤ１を選択的に阻害する試薬は特に有用であると考えられる。 Ｄ−型サイクリン、ＣＤＫ、ＰＣＮＡおよびｐ２１の複合体の形成も、 ＣＤＫ／Ｄ−型サイクリン複合体形成に関して上記に記載したような同様な様式 で妨害できる。すなわち複合体の形成は直接的に妨害できる（例えば、複合体の 成分に結合するか、あるいか複合体成分の物理的会合を妨害する薬剤または試薬 による）。複合体の形成も、例えば複合体の成分をコードするＤＮＡおよび／ま たはＲＮＡの転写および／または翻訳を妨害することにより、Ｄ−型サイクリン −プロテインキナーゼ複合体形成の遮断について上述したものと同様な様式で直 接的な様式により妨害できる。あるいは複合体形成はその構成物の１つ以上を分 解することにより間接的に妨害できる。 例えば、サイクリンＤ２またはサイクリンＤ３が四量体複合体を形成する能力 を選択的に阻害する薬剤を使用できる。複合体形成の機能または利用性を変更で きる他の複合体構成物の各々も標的とされる。例えば、Ｄ−型サイクリンと複合 体を形成するＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５および他のサイクリン依存性キナー ゼは、それらの機能あるいはそれらの四量体複合体中への取り込みに関する利用 性という意味のいずれかにおいて、阻害されるかまたは増強されることができる 。ＰＣＮＡの機能または利用性、あるいはｐ２１の機能または利用性、あるいは ｐ１６の機能または利用性を変化させる薬剤または試薬も、細胞分裂を阻害また は増強させるために使用できる。各々の四量体複合体構成物の場合は、小さいペ プチドまたは他の有機分子（これは結合するという意味で複合体構成物を模すか 、その活性領域（１つまたは複数）を欠く）を細胞中に導入することが可能であ り、これにより活性または正常に生産された複合体との相互作用を欠く複合体の 形成を生じることができる。 複合体形成の直接的阻害も非特異的であることがでる（すなわち中で Ｄ−型サイクリン−含有四量体複合体が形成される大部分の細胞または全細胞に 影響することがでる）。、これは例えば四量体複合体の共通成分（例えばＰＣＮ Ａ）の機能または利用性を阻害する薬剤を細胞に導入することにより、あるいは 一緒にすべてのＤ−型サイクリンを阻害する薬剤の混合物またはカクテル（cock tail）を導入することにより行うことができる。 あるいは四量体複合体の直接的阻害が可能である。すなわち入手できるより少 ない複合体構成物（例えばＤ−型サイクリン、ＣＤＫ、ＰＣＮＡまたはｐ２１） を生成するために作用する薬剤または試薬を使用できる。そのような薬剤または 試薬にはアンチ−センスオリゴヌクレオチド（これは転写または翻訳をブロック する）のようなもの、および四量体複合体中に取り込まれる前、または後に複合 体構成物を分解する酵素のようなものがある。 特に細胞周期の開始を阻害し、したがって細胞分裂を阻害して変化させる本方 法に有用な薬剤または試薬は、存在する化合物または分子（例えば小さい有機分 子、アンチ−センスオリゴヌクレオチドおよび無機物質）、あるいは本方法の使 用に設計された物質であることができる。いずれの場合でもそのような薬剤は本 発明の方法により確認できる。 本発明の特別な態様で、相互反応トラップアッセイはサイクリン、特にＤ−型 サイクリンでの複合体形成ならびにｐ１６／ＣＤＫ４複合体形成を破壊すること ができる試薬を同定することができる。例えば上記の２つのハイブリッドアッセ イはそのようなアッセイに使用できる。説明を目的とした態様では、本明細書に 記載されるようなＣＤＫ４およびｐ１６を含むＧＡＬ４活性化因子融合構造物を 、ＣＤＫ４／ｐ１６複合体 の形成を破壊する候補薬剤の能力を測定するために使用する。各構造物でトラン スフェクトされた細胞を候補薬剤と接触させ、そしてレポーター遺伝子（上記の β−ガラクトシダーゼ）の発現レベルを検出する。発現の減少は複合体の阻害を 示している。 さらにＣＤＫ／サイクリン複合体を阻害しないＣＤＫ４／ｐ１６の阻害剤を検 出するために、３つのハイブリッドアッセイを行うことができる。例えばｐ１６ およびＤ−型サイクリンの各々が、異なるＤＮＡ配列を認識する別個の融合タン パク質のＤＮＡ結合ドメインを構成する融合タンパク質の部分である構造物を作 成できる。ＣＤＫ４は次に活性化ドメインとの融合タンパク質として生成され、 そのようなｐ１６融合タンパク質との相互作用は１つのレポーター遺伝子の発現 を生じ、一方サイクリンＤ融合タンパク質との相互作用は種々の遺伝子の発現を 進める。例えばｐ１６融合タンパク質はルシフェラーゼ遺伝子の発現を進めるこ とができ、一方サイクリンＤ構造物は薬剤−耐性マーカーの発現を提供する。従 ってｐ１６／ＣＤＫ４相互作用を阻害する試薬の存在中て、薬剤耐性マーカーの 発現はサイクリンＤ／ＣＤＫ４複合体が破壊されていないことを示している。 さらにｐ１６の阻害能力を仮定すると、本発明はさらに抗−増殖試薬として使 用できるｐ１６の特定部分のペプチドミメトリック類似体（peptidomimetric an alogs）を作成するような知識の使用を意図する。ｐ１６とのＣＤＫ４結合相互 作用は、突然変異誘発法および上記の相互作用トラップアッセイを使用して容易 に確認できる。同様にｐ１６由来のペプチド断片を、ＣＤＫ４／サイクリン複合 体を上記のように破壊する能力についてアッセイすることができる。 いったん適当な薬剤または試薬が同定されたら、それを個体、特にヒトまたは 他の脊椎動物に、薬剤または試薬が細胞中に所望の効果（すなわち細胞分裂の変 化）を得るために十分な量で導入する任意の経路により投与することができる。 例えば選択した薬剤を静脈内に、筋肉内に、腫瘍に直接的に注入することにより 、胃腸管を介して（例えば経口的）、腹腔的に、または鼻腔内に投与できる。場 合によってはex vivo投与（例えば血液または骨髄を身体から取り出して処置し 、そして身体に戻す）が適当なこともある。 一般的に細胞分裂を変化させるために使用する薬剤または試薬は、生理的キャ リアー（例えば緩衝液または生理食塩水）、安定化剤、助剤および芳香剤を含む ことができる配合物中に含まれるであろう。投与する薬剤の量は経験的に定める ことができ、そして受容者の年齢、体重および身長、ならびに治療すべき症状の 重症度に応じて考慮して変化するであろう。 本発明のＤ−型サイクリンに特異的に反応する抗体も、周知方法を使用して作 成できる。例えば抗−Ｄ型サイクリン抗血清は適当な宿主（例えばウサギ、マウ ス、ラット、ブタ）に所望の抗血清に対するＤ−型サイクリンを注射して、抗体 が生成されるに十分な時間後に宿主動物から採血することにより作成される。モ ノクローナル抗体も周知方法により作成できる、Sambrook,J.ら、モレキュラー クローニング ：ア ラボラトリー マニュアル（Molecular Cloning:A Laborato ry Manual）、コールド スプリングハーバー ラボラトリー（Cold Sring Harb or Laboratory）：コールド スプリングハーバー NY．（1989）、Hallow，E． およびD．Lane、抗体（Antibodies）：ア ラボラトリー マニュアル、コー ルド スプリングハーバー出版、ニューヨーク、（1988）。ＣＤＫ５に特異的に 反応性である抗体も既知の手法を使用して作成できる。 本発明はまたサイクリン、特にＤ−型サイクリンの機能を阻害または抑制する 能力について、化合物または分子をスクリーニングする方法も含む。例えば本明 細書に記載する突然変異細胞（その中でＤ１またはＤ３のようなＤ−型サイクリ ンが発現している）を使用できる。Ｄ−型サイクリンを阻害する能力について評 価する化合物または分子を、化合物または分子が細胞に導入されるのに適当な条 件下で細胞と接触させる。サイクリンの阻害は細胞の生育停止または細胞分裂の 割合の減少を生じる。化合物または分子の存在下での細胞分裂の割合または程度 を、適当な対照（例えば試験薬剤が存在しない同じ型の細胞）と比較して評価す ることにより、化合物または分子がサイクリンを阻害する能力または無能力を実 証できるであろう。存在する化合物または分子（例えば発酵ブロスまたは化学品 “ライブラリー”に存在するもの）、あるいはサイクリンのプロテインキナーゼ 活性化を阻害するために開発された化合物または分子は、本方法を使用してその 効果をスクリーニングすることができる。Ｄ−型サイクリンを阻害する薬剤も本 発明の主題である。 本発明は本明細書に記載した四量体複合体を形成を変化させる能力について、 化合物または分子をスクリーニングする方法も含む。この方法はＤ−型サイクリ ンを阻害する化合物または分子を同定するために上記に記載した方法とほとんど 同じように行う。本主題の方法では、試験する化合物または分子および細胞（そ の中でＤ−型サイクリン−含有複合体が形成されている）を、複合体形成が生じ 、かつ試験する化合物または分子が細胞に導入される適当な条件下混合する。複 合体形成は本明細 書に記載したように測定できる。複合体構成または複合体形成の阻害は、細胞の 生育停止または細胞分裂の割合の減少を生じる。試験する化合物または分子の存 在下での細胞分裂の割合または程度を、化合物または分子が存在しない割合また は程度と比較することにより、化合物または分子が細胞分裂に影響したかどうか を実証するだろう（すなわち試験する化合物または分子が存在しない場合よりも 化合物または分子が存在する方が分裂の程度が少ない場合は阻害剤である）。複 合体形成を阻害する薬剤または試薬、ならびにその結果としての細胞分裂も本発 明の主題である。 本発明を以下の実施例で説明するが、それは限定することを意味するものでは ない。 実施例１ 多くのプロテインキナーゼならびにＤＮＡ複製および修復因子ＰＣＮＡに会合し たＤ−型サイクリンの実証 （ｉ）実験法 細胞 ヒト二倍体肺繊維芽Ｗ１３８細胞をアメリカンタイプカルチャーコレクション （American Type Culture Collection）の第１３継代から得、そして１０％のウ シ胎児血清を補充したダルベッコ−改良イーグル培地中で成長させ、第１６−２ ２継代間を使用した。２９３細胞を同様に培養した。抗体 抗−サイクリンＤ１抗体を生成するために、ヒトサイクリンＤ１アミノ−末端 領域の２０２アミノ酸残基（〜２５ｋＤａ）をコードする６０ ９ｂｐＤＮＡ制限断片（Xiongら、Cell 65:691-699（1991）の第２図のヌクレオ チド１４３−７５１のＮＣｏｌＩ断片：およびCurrent Biology1:362-364（1991 ））を、ファージＴ７発現ベクター、ｐＥＴ−３ｄ（Studierら、Methods in En zymology ,185:60-89（1990））中にサブクローン化し、そしてE．Coli BL21（DE 3）株中に導入した。細菌抽出物を溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣ１、５０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５および１０％グリセロール）中に超音波によ り細胞を破壊することにより調製し、上澄みを２０，０００ｇで１０分間遠心す ることにより清澄化した。不溶性のサイクリンＤタンパク質を含有するペレット を８Ｍ尿素を補充した溶解緩衝液に再懸濁し、室温で３０分間浸透した後、懸濁 液を再度２０，０００ｇで１０分間遠心した。不溶性のサイクリンＤタンパク質 を含有するペレットをＳＤＳ試料緩衝液に再懸濁し、１０％ＳＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲルで分離した。低温室中で０．２５Ｍ ＫＣｌでゲルを染色した後、 ２５ｋＤａのサイクリンＤタンパク質が視覚化され、切り出された。ゲル切片を １８ゲイジの針に繰り返して通して細分化し、そしてサイクリンＤタンパク質は 細分化したゲル粒子を０．１％ＳＤＳを含有するＰＢＳ中で４２℃に数時間イン キュベーションして抽出し、ウサギの注射に使用した。抗−サイクリンＤ１免疫 グロブリンをアフィニティ精製するために、細菌が生産したｐ２５タンパク質を Ｒｅａｃｉ−Ｇｅｌ（６Ｘ）に製造元の仕様に従い架橋結合させた。アフィニテ ィカラムを過剰容量のＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する）で、血清 をカラムに添加する前後に洗浄した。グリシン−ＮａＣｌ（ｐＨ２．５）で溶出 した結合した免疫グロブリンは、すぐに抗体を中和化するために１．５Ｍ Ｔｒ ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５に入れた。 免疫グロブリンタンパク質により起こる高いバックグラウンドを減少するために 、アフィニティ精製しな抗−サイクリンＤ１をプロテインＡ−アガロースビーズ にHarlowおよびLaneに従い架橋結合した（抗体（Antibodies）：ア ラボラトリ ー マニュアル（A Laboratory Manual）、コールドスプリングハーバー出版、 ＮＹ（１９８８））。ウエスタンブロットで、この抗−サイクリンＤ１抗血清は 細菌が生産したヒトサイクリンＤ２と弱く交差反応し、細菌が生産したヒトサイ クリンＤ３とは極めてわずかに反応し、そして全Ｗ１３８細胞溶解物から単一バ ンドを検出する。ＲＩＰＡ緩衝液（０．１％ＳＤＳ）での免疫沈降物において、 ９０％より多くのサイクリンＤ１−会合ｐ３６、ｐ３３、ｐ３１およびｐ２１が 消失するが、一方サイクリンＤ１はＮＰ−４０（０．５％）緩衝液での免疫沈降 物中の量と同量のままであった。 抗−ＣＤＫ５抗体生産に関して、ペプチドＣＹＥＳＤＦＣＰＰ（下線のアミノ 酸残基はＣＤＫ５のカルボキシ末端領域に対応する）を合成した。ペプチドをカ ギアナカサガイ ヘモシアニン（ピアス：Pierce）にカップルさせ、これを次に 標準法によるウサギの免疫化のために使用した（Greenら、Cell 28:477-487（19 82））。 抗−サイクリンＤ３ペプチド抗体を同様に合成ペプチドＣＤＥＬＤＯＡＳＴＰ ＴＤＶＲＤＩＤＬ （下線の領域はヒトサイクリンＤ３のカルボキシ末端領域に対 応する）に対して生成した。後にウサギを細菌が生産した完全長のヒトサイクリ ンＤ３で剌激した。サイクリンＤ３特異的免疫グロブリンをアフィニティカラム （１７−ｍｅｒのサイクリンＤ３ペプチドがＲｅａｔｉ−Ｇｅｌ（６Ｘ）に架橋 結合している）で精製した。アフィニティ精製抗−サイクリンＤ３ペプチド抗体 は細菌が生産したサ イクリンＤ１またはＤ２とは、ウエスタンブロットで交差反応せず、Ｗ１３８細 胞溶解物由来サイクリンＤ１とも免疫沈降しない。 エス．ポンベ（S．pombe）ｐ３４^cdc2（Ｇ８）抗血清は以前に記載された（Dr aettaら、Cell 50:319-325（1987））。ヒト自己−免疫抗−ＰＣＮＡ抗血清は一 般的に知られている。ウエスタンブロットに使用したアフィニティ精製した抗− ＰＣＮＡモノクローナル抗体はベーリンガーマンハイム（Boehringer Mannheim ）から購入した。免疫沈降法に使用したアフィニティ精製した抗−ＰＣＮＡモノ クローナル抗体はオンコジーンサイエンス（Oncogene Science）から購入した。 抗−ＣＤＫ２ペプチド抗血清はすでに記載され（Pagnoら、EMBO J 11:961-971（ 1992））、そしてＣＤＣ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ５ポリペプチドとは交差反応 しない。抗−ＣＤＫ４抗血清はグルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およ びＣＤＫ４のＣ−末端部分の融合タンパク質に対して生成された。これはＣＤＫ ２およびＣＤＫ５とは交差反応しない。（ii）ヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニング ラムダＺＡＰ II（＃９３６２０１）で構築されたヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡ 発現ライブラリーはストラタジーン（Stratagene）からのものであった。ヒトｐ ３４^cdc2は細菌から生産した時は高度に不溶性であった。便利な抗体スクリーニ ング法（YoungおよびDavis、Proc．Natl．Acad．Sci. 80:1194-1198（1983）） はファージプラーク中に十分な量の可溶性組換えタンパク質が存在する場合にの み適する。したがってスクリーニング法は、組換えタンパク質をニトロセルロー ス膜に移し取った後に溶解するために６Ｍグアニジンを使用することを含む工程 を入れて変更し、この方法は最初に特定の活性を持つリホールド（refolded）さ れた 組換えタンパク質を生産するために開発された（Vinsonら、Gene Dev.2:801-806 （1988））。λＺＡＰII、ＨｅＬａ ｃＤＮＡライブラリー由来の２百万個のフ ァージプラークを、エス．ポンベ（S．pomb ｐ３４^cdc2（Ｇ８）に対する抗血 清でスクリーニングした。ファージプラークをＩＰＴＧ−を含浸させたニトロセ ルロースフィルターで４２℃で４時間覆い、フィルターをカルチャーの皿から除 去し、そして次に６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．０ 、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴを含有する緩衝液中）で２５℃にて１０ 分間処理した。フィルターをグアニジン無しのＴｒｉｓ−緩衝化生理食塩水で抗 体とインキュベーションする前に洗浄した。この方法は抗体検出信号を大いに増 強し、これはおそらくグアニジンによる細菌生産ポリペプチド沈殿の可溶化によ るものであろう。Ｇ８−陽性ｃＤＮＡクローンをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ ベクター（ストラタジーン）中にクローン化し、そしてＡＢＩ全自動ＤＮＡ合 成機（モデル３７３Ａ）で両方向から配列決定した。配列相同性の調査について は、ＦＡＳＴＡプログラムを使用した（PearsonおよびLipman、Proc.Natl.Acad. Sci. 85:2444-2448（1988））。（iii）免疫沈降およびウエスタン−ブロッティング ［³⁵Ｓ］メチオニンでの代謝標識に関しては、サブ−コンフルエント（sub-co nfluent:４０−６０％）細胞を、予め温めた標識媒質（１０％透析ウシ胎児血清 ［ギブコ：ＧＩＢＣＯ］を補充したメチオニン−、システイン−無しのＤＭＥＭ ［ＩＣＮ］で２回標識した。標識媒質で３０分間、インキュベーションした後、 ［³⁵Ｓ］メチオニン（Ｔｒａｎｓ³⁵Ｓ−標識、ＩＣＮ）を媒質に加え（約２００ μＣｉ／ｍｌ）、そし て溶解前に４−６時間インキュベーションし続けた。免疫沈降のすべての工程は 冷室にて行った。４０−６０％コンフルエントの１５０ｍＭの皿からの細胞を、 冷ＰＢＳで２回洗浄し、そしてＮＰ−４０溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ ０，５％ Ｎ Ｐ−４０，１ｍＭ ＰＭＳＦ ２５μｇ／ｍｌロイペプチン、２５μｇ／ｍｌア プロチニン、１ｍＭ ベンズアミジンおよび１０μｇ／ｍｌトリプシンインヒビ ター）中で解体し、そして１５−３０分間回転させながら溶解する。核を１５， ０００ｇで５分間遠心することにより取り出し、そして溶解物を前抗血清または 正常ウサギ血清およびＩｇＧソルブ（sorb）のいずれかと２０−３０分間インキ ュベーションすることにより前−清澄化し、続いて１０分間、１５，０００ｇで 遠心した。プロテインＡ−アガロースビーズ（ピアス）と予めカップルした抗体 を清澄化した溶解物に加え、そして６−８時間インキュベーションした。免疫沈 降物を３−４回室温で、溶解緩衝液により洗浄し、ＳＤＳ試料緩衝液に再懸濁し 、そしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離した。 ³⁵Ｓメチオニン−標識沈殿物については、ポリアクリルアミドゲル（Ｖ８タン パク質溶解マッピング実験についてはこれを除く）を１０％氷酢酸および３０％ メタノールて３０分から１時間固定し、３０分間オートラジオグラフィー増感剤 （デュポン：Du pont）を含浸させることにより増感させ、そして水中で１５− ３０分間沈殿させる。増感ゲルは乾燥させ、Ｘ−線フィルムに−７０℃で暴露さ せる。ウエスタンーブロッティングについては、ポリペプチドをニトロセルロー ス膜にＳＤＳ電気ブロッティングシステム（ミリポア：Millipore）を使用して ４００ｍＡの定 電流で４５分間写し取った。フィルターを５％乾燥ミルクを含有するＴＢＳＴ（ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１３７ｍＭ ＮａＣｌ ０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）で１−３時間ブロックし、５％乾燥ミルクを含有するＴＢＳ Ｔ中で４時間から一晩第一抗体とインキュベーションし、そして４回、１０分間 、それぞれＴＢＳＴで洗浄した。適当な第二抗体（１：１０，０００希釈のシー ト抗−マウスＩｇに結合した西洋ワサビペルオキシダーゼまたはロバ抗−ラビッ トＩｇ、アマシャム）をフィルターと１時間インキュベーションし、そして特異 的タンパク質を増感化学発光システム（ＥＣＬ、アマシャム）により検出した。 （iv）部分的タンパク質溶解ペプチドマッピング 網状赤血球溶解システム（プロメガ）をカップルさせたＴＮＴを使用するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼでのインビトロ翻訳については、ヒト サイクリンＤ１、サ イクリンＤ２、サイクリンＤ３、ＣＤＣ２、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、Ｃ ＤＫ５およびＰＣＮＡをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ストラタジーン）中 にサブクローン化した。［³⁵Ｓ］メチオニン−標識溶解物の免疫沈降およびＳＤ Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は上記と同じである。ポリアクリルアミド ゲルを予め固定および増感処理することなく乾燥させ、フジ 画像プレートに露 出させ、そしてフジ バイオーイメージング アナライザー（Fuji bio-imaging analyzer）ＢＡＳ２０００で視覚化した。画像出力を鋳型として使用して、１ ７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したゲルからゲル中の適当なタンパク質バンド を、種々の量のエス．アウレウス（S.aureus）Ｖ８プロテアーゼで（Cleveland ら、J.Biol.Chem 252:1102-1106（1977））および（HarlowおよびLane，抗体（A ntibodies ）：アラボラトリーマニュア ル（A Laboratory Manual）、コールドスプリングハーバーラボラトリ−出版、N Y（1988））に従い消化し、切り出した。ゲルを乾燥し、そしてＸ−線フィルム に２週間暴露するか、またはフジ画像分析機ＢＡＳ２０００で分析した。実施例２ ＤＮＡ腫瘍ウイルスまたはその発癌性産物による細胞の形質転換に関連した細胞 周期複合体の選択的サブユニット転位の実証 （ｉ）ＤＮＡ腫瘍ウイルスＳＶ４０での細胞の形質転換は細胞周期複合体の転位 に関連する ［³⁵Ｓ］メチオニン−標識細胞溶解物の調製およびポリアクリルアミドゲル電 気泳動は上記、および国際出願公開第92/2076号明細書のように行った。細胞溶 解物はヒト正常二倍体繊維芽細胞Ｗ３１８またはＤＮＡ腫瘍ウイルスＳＶ４０形 質転換Ｗ１３８細胞ＶＡ１３のいずれかから調製した。細胞は各細胞周期遺伝子 産物に対する抗体と免疫沈降した。（ii）２つの異なる細胞系対中の細胞周期複合体のサブユニット転位 細胞溶解物の調製法は上記記載のものと同じである。２つの異なる細胞対系を これらの実験に使用した。ＨＳＦ４３は正常ヒト二倍体繊維芽細胞系であり、そ してＣＴ１０（完全な名前はＣＴ１０−２Ｃ−Ｔ１）はＳＶ４Ｏ巨大腫瘍抗原で 形質転換したＨＳＦ４３由来のものである。ＣＶ−１はアフリカミドリサル腎臓 細胞系であり、そしてＣＯＳ−１はＳＶ４０で形質転換したＣＶ−１由来のもの である。（iii）ＤＮＡ腫瘍ウイルスＳＶ４０にる細胞形質転換は細胞周期複合体のＰＣ ＮＡサブユニットの転位に関連する 細胞溶解物の調製、電気泳動およびウエスタンブロッティング条件は、上記と 同様である。正常ヒト二倍体細胞系およびそのＳＶ４０形質転換細胞系は上記に 記載したものと同様である。各抗体での免疫沈降物はポリアクリルアミドゲルで 分離し、そして抗−ＰＣＮＡ抗体とブロットした。（iv）ＤＮＡ腫瘍ウイルスＳＶ４０による細胞形質転換は細胞周期複合体のＣＤ Ｋ４サブユニットの転位に関連する 細胞溶解物の調製、電気泳動およびウエスタンブロッティング条件は、上記と 同様である。正常ヒト二倍体細胞系およびそのＳＶ４０形質転換細胞系は上記に 記載したものと同様である。各抗体由来の免疫沈降物はポリアクリルアミドゲル で分離し、そして抗−ＣＤＫ４抗体とブロットした。 実施例３ ＣＤＫ４活性の阻害剤１６^IlNK4のクローニング （ｉ）２つのハイブリッドアッセイを使用する１６^IlNK4のクローニング サッカロミセス セルビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＹＰＢ２細胞をＧ ＡＬ４ｄｂ−ｐ１６ＩＮＫ４融合体を含有するプラスミド、ならびにそれぞれｃ ｄｃ２（ＣＤＫ１）、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＰＣＮＡ（増殖性細胞核 抗原）および分裂酵母Ｓｎｆ１に融合したＧＡＬ４ａｄを含有するプラスミドで 同時に形質転換した。両方のプラスミドに選択的な培地（トリプトファンマイナ ス、およびロイシンマイナス）で細胞を生育させた後、２つのコロニーを無作為 に取り出し、ヒスチジンを含む、または欠いたプレートに画線培養した。ヒスチ ジン無しでの生育は、ＧＡＬ４−反応性プロモーター下のＨＩＳ３遺伝子の発現 に依 存し、従って機能的ＧＡＬ４活性化因子がｐ１６ＩＮＫ４が対応する標的タンパ ク質との相互反応を介レて再構成されたことを示している。（ii）ｐ１６^INK4ＣＤＫｓの相互反応 精製した細菌生産ＧＳＴｐ１６ＩＮＫ４融合タンパク質を、（³⁵Ｓ）−標識イ ンビトロ翻訳ｃｄｃ２、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＤＫ５と混合した。混合物 は０．５μｇの精製ＧＳＴ−ｐ１６ＩＮＫ４および等量のインビトロ翻訳タンパ ク質（０．５−５μｌ；ＴＮＴプロメガ）を最終容量が２００μｌの緩衝液（５ ０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ８、１２０ｍＭ ＮａＣ１および０．５％ Ｎ ｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０を含有する）中に含有した。４℃で１時間後、１５μｌ のグルタチオンーアガロースビーズを加え、そしてインキュベーションをさらに １時間再開した。ビーズを遠心により取り出し、インキュベーション緩衝液で４ 回洗浄し、そして標準的なタンパク質−ゲル添加緩衝液と混合した。試料を１５ ％のポリアクリルアミドゲルに添加し。そして（³⁵Ｓ）標識タンパク質はフルオ ログラフィーで検出した。ＧＳＴｐ１６ＩＮＫ４融合タンパク質をｐＧＥＸ−Ｋ Ｇベクターで過剰発現させ、標準法で精製した。インビトロ翻訳鋳型はｐＢ１ｕ ｅｓｃｒｉｐｔベクター（スタシタジーン）から得た。（iii）ｐ１６^INK4のタンパク質溶解マッピング インビトロ翻訳（³⁵Ｓ）−標識ｐ１６ＩＮＫ４（ＴＮＴプロメガ）を、ｐＢｌ ｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ストラタジーン）中にクローン化したｐ１６ＩＮＫ ４ ｃＤＮＡを鋳型として使用して得、そしてＣＤＫ４−会合ｐ１６タンパク質 を代謝的に（³⁵Ｓ）−標識ＨｅＬａ細胞溶解物由来の抗−ＣＤＫ４血清と一緒に 免疫沈降させた。部分的タンパク質溶 解は対応するゲル切片について、緩衝液による徹底的な平衡化後に行い、そして 消化はＮＣＳを種々の濃度で加えて行った。生成物を１７．５％のポリアクリル アミドゲルで泳動し、そしてホスホイメージャー（phosphoimager）Fuji 2000で 分析した。（iv）ｐ１６^INK4のＣＤＫ４−サイクリンＤ複合体に対する効果の検出 ｐ１６ＩＮＫ４、ＣＤＫ４、サイクリンＤ１またはＣＤＫおよびサイクリンＤ １の両方を一緒に過剰発現しているバキュロウイルス−感染細胞を、代謝的に（³⁵ Ｓ）−標識した。種々のインキュベーション混合物をｐ１６ＩＮＫ４、ＣＤＫ ４、サイクリンＤ１、ならびにＣＤＫおよびサイクリンＤ１の両方を含有する抽 出物により構成し、そして抗−ｐ１６ＩＮＫ４血清、抗−ＣＤＫ４血清と、予め プレインキュベーションすることなく免疫沈降させ、そして抗−ＣＤＫ血清は元 に抗血清および抗−サイクリンＤ１血清を生成するために使用したペプチドとプ レインキュベーションした。免疫沈降物はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。 すべての上述の引用例および報告は引用することにより本明細書に含まれる。 均等物 当業者は日常的な実験を使用するだけで、本明細書に記載された本発明の特別 な態様の多くの均等物を確認することができると理解するであろう。そのような 均等物は以下の請求の範囲により包含されるものである。 配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名前：コールドスプリングハーバーラボラトリー （Ｂ）通り：１００ バングタウン ロード （Ｃ）市：コールドスプリングハーバー （Ｄ）州：ニューヨーク （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：１１７２４ （Ｇ）電話番号：（６１７）２２７−７４００ （Ｈ）ファックス：（６１７）２２７−５９４１ （ii）発明の名称：サイクリン複合体の転位、およびそれに関連する使用 （iii）配列の数：４ （iv）コンピューター読み取り先： （Ａ）媒体の種類：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル （Ｃ）実行システムＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：ＡＳＣＩＩ（テキスト） （iv）先願データ： （Ａ）出願番号：米国０７／９６３，３０８ （Ｂ）出願日：１９９２年１０月１６日 （vi）先願データ： （Ａ）出願番号：米国０７／９９１，９９７ （Ｂ）出願日：１９９２年１２月１７日 （２）配列番号１に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：１０８９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （ii）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （ix）特徴 （Ａ）名前／キー：ＣＤＳ （Ｂ）位置：１３．．８８８ （xi）配列の記載：配列番号１： （２）配列番号２に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：２９２アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：直線 （ii）分子の型：タンパク質 （xi）配列の記載：配列番号２： （２）配列番号３に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：９４８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：両方 （Ｄ）トポロジー：直線 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （ix）特徴 （Ａ）名前／キー：ＣＤＳ （Ｂ）位置：１９．．４６５ （xi）配列の記載：配列番号３： （２）配列番号４に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１４８アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：直線 （ii）分子の型：タンパク質 （xi）配列の記載：配列番号４：

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年５月１６日 【補正内容】 請求の範囲 １．ｐ２１が ａ）サイクリンキナーゼ、サイクリンまたは両方と複合体を形成するか、あるい は ｂ）サイクリンキナーゼ、サイクリンまたは両方と複合体を形成しないか、のい ずれかを測定することを含んで成る細胞の形質転換を診断する方法であって、ｐ ２１がサイクリンキナーゼ、サイクリンまたは両方と複合体を形成しないときは 細胞の形質転換を示す該方法。 ２．ｐ２１がサイクリンキナーゼ、サイクリンまたは両方と複合体を形成するか またはしないかを測定するために抗体を使用する、請求の範囲第１項記載の方法 。 ３．サイクリンがＤ−型サイクリンまたはＡ−型サイクリンであり、そしてサイ クリンキナーゼがＣＤＫ４である請求の範囲第１項記載の方法。 ４．ｐ１６が ａ）サイクリンキナーゼと複合体を形成するか、あるいは ｂ）サイクリンキナーゼと複合体を形成しないかを測定することを含んで成る細 胞の形質転換を診断する方法であって、ｐ１６がサイクリンキナーゼと複合体を 形成するならばそれは細胞の形質転換を示す該方法。 ５．ｐ１６がサイクリンキナーゼと複合体を形成するか、またはしないかを測定 するために抗体が使用される請求の範囲第４項記載の方法。 ６．サイクリンキナーゼがＣＤＫ４である請求の範囲第４項記載の方法。 ７．ｐ１９が ａ）サイクリンと複合体を形成するか、あるいは ｂ）サイクリンと複合体を形成しないかを測定することを含んで成る細胞の形質 転換を診断する方法であって、ｐ１９がサイクリンと複合体するときは細胞の形 質転換を示す該方法。 ８．ｐ１９がサイクリンと複合体を形成するか、またはしないかを測定するため に抗体が使用される請求の範囲第７項記載の方法。 ９．サイクリンがサイクリンＡである請求の範囲第７項記載の方法。 １０．配列番号２のアミノ酸配列を有する組換えＣＤＫ５。 １１．ＣＤＫ５をコードするｃＤＮＡ。 １２．配列番号１またはその部分のヌクレオチド配列により表される単離ＤＮＡ 。 １３．配列番号４またはその部分のアミノ酸配列を含んで成る組換え的に生産し たｐ１６^INK4タンパク質。 １４．上記ｐ１６^INK4タンパク質が融合タンパク質である請求の範囲第１３項記 載の組換え的に生産したタンパク質。 １５．上記ｐ１６^INK4融合タンパク質が２つのハイブリッドアッセイで機能する 請求の範囲第１４項記載の組換え的に生産したタンパク質。 １６．上記断片がｃｄｋ４に結合する請求の範囲第１３項記載の組換え的に生産 したタンパク質。 １７．配列番号４に表されるタンパク質の免疫原性部分。 １８．配列番号４またはその部分により表されるｐ１６^INK4タンパク質をコード する核酸。 １９．上記ｐ１６^INK4タンパク質の上記部分がｃｄｋ４に結合する請求の範囲第 １８項記載の核酸。 ２０．配列番号３またはその部分により表されるヌクレオチド配列を含 んで成る範囲第１８項記載の核酸。 ２１．配列番号３により表されるヌクレオチド配列を含んて成る単離核酸。 ２２．ｐ１６^INK4タンパク質に特異的に免疫反応性である抗体。 ２３．患者から単離した細胞試料中の、細胞中のｐ１６タンパク質レベルを測定 するために、ｐ１６^INK4に特異的な抗体を含んで成る形質転換細胞を同定するた めの診断試験キット。 ２４．ｐ１６^INK4に特異的な抗体が配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク 質に特異的である請求の範囲第２３項記載の診断キット。 ２５．患者から単離した細胞試料中のｐ１６タンパク質をコードする核酸の存在 または不在を測定するために、ｐ１６^INK4核酸配列に特異的な核酸プローブを含 んで成る、形質転換細胞を同定するための診断試験キット。 ２６．核酸プローブが配列番号３の核酸由来である請求の範囲第２５項記載の診 断試験キット。 ２７．配列番号４により表されるアミノ酸配列の部分を含んで成り、かつｃｄｋ ４／サイクリン複合体の結合を破壊するペプチドミメティック。 ２８． ｉ．サイクリン、サイクリン−依存性キナーゼ（ｃｄｋ）およびｐ２１を含んで 成るｃｄｋ−複合体を提供し、ここでｃｄｋ−複合体はｃｄｋ複合体が自然に生 じる細胞中でｃｄｋ−複合体と通常存在する他のタンパク質を実質的に含まずに 単離されており、 ii．ｃｄｋ−複合体をｃｄｋ−複合体がリン酸化できる基質、および候補阻害剤 と接触させ、 iii．基質のリン酸化レベルを測定し、そして iv．候補阻害剤の存在下での基質のリン酸化レベルを候補阻害剤が不在下での基 質のリン酸化レベルと比較する 工程を含んで成るサイクリン−依存性キナーゼの阻害剤を同定するアッセイであ って、候補阻害剤存在下でのリン酸化レベルの減少は候補阻害剤のｃｄｋ阻害活 性を示すものである、該アッセイ。 ２９．阻害剤が正常細胞の増殖に比べて選択的に形質転換細胞の増殖を阻害でき るサイクリン−依存性キナーゼの阻害剤を同定するアッセイであって ｉ．サイクリン、サイクリン−依存性キナーゼ（ｃｄｋ）およびｐ２１を含んで 成る正常細胞由来の第一ｃｄｋ−複合体、ならびにサイクリンおよびｃｄｋを含 んで成る形質転換細胞由来の第二ｃｄｋ−複合体 を提供し、 ここで各々の第一および第二ｃｄｋ−複合体はｃｄｋ複合体が由来する細胞中 で通常ｃｄｋ−複合体と存在する他のタンパク質を実質的に含まずに単離されて おり、 ii．各ｃｄｋ−複合体をｃｄｋ−複合体がリン酸化できる基質、および候補阻害 剤と接触させ、 iii．基質のリン酸化レベルを測定し、そして iv．各ｃｄｋ−複合体の候補阻害剤の存在下での基質のリン酸化レベルを候補阻 害剤が不在下での基質のリン酸化レベルと比較する、 工程を含んて成り、候補阻害剤存在下てのリン酸化レベルの減少は候補阻害剤の ｃｄｋ阻害活性を示すものてあり、そして阻害剤の選択性は第 一および第二ｃｄｋ−複合体の間のｃｄｋ阻害活性の差異を比較することにより 測定される該アッセイ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/12 9359−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 9453−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＫＲ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ｐ２１が ａ）サイクリンキナーゼ、サイクリンまたは両方と複合体を形成するか、あるい は ｂ）サイクリンキナーゼ、サイクリンまたは両方と複合体を形成しないか、のい ずれかを測定することを含んで成る細胞の形質転換を診断する方法であって、ｐ ２１がサイクリンキナーゼ、サイクリンまたは両方と複合体を形成しないときは 細胞の形質転換を示す該方法。 ２．ｐ２１がサイクリンキナーゼ、サイクリンまたは両方と複合体を形成するか またはしないかを測定するために抗体を使用する、請求の範囲第１項記載の方法 。 ３．サイクリンがＤ−型サイクリンまたはＡ−型サイクリンであり、そしてサイ クリンキナーゼがＣＤＫ４である請求の範囲第１項記載の方法。 ４．ｐ１６が ａ）サイクリンキナーゼと複合体を形成するか、あるいは ｂ）サイクリンキナーゼと複合体を形成しないか を測定することを含んで成る細胞の形質転換を診断する方法であって、ｐ１６が サィクリンキナーゼと複合体を形成するならばそれは細胞の形質転換を示す該方 法。 ５．ｐ１６がサイクリンキナーゼと複合体を形成するか、またはしないかを測定 するために抗体が使用される請求の範囲第４項記載の方法。 ６．サィクリンキナーゼがＣＤＫ４である請求の範囲第４項記載の方法。 ７．ｐ１９が ａ）サイクリンと複合体を形成するか、あるいは ｂ）サイクリンと複合体を形成しないかを測定することを含んて成る細胞の形質 転換を診断する方法であって、ｐ１９がサイクリンと複合体を形成するときは細 胞の形質転換を示す該方法。 ８．ｐ１９がサイクリンと複合体を形成するか、またはしないかを測定するため に抗体が使用される請求の範囲第７項記載の方法。 ９．サイクリンがサイクリンＡである請求の範囲第７項記載の方法。 １０．配列番号２のアミノ酸配列を有する組換えＣＤＫ５。 １１．ＣＤＫ５をコードするｃＤＮＡ。 １２．配列番号１のヌクレオチド配列を有する単離ＤＮＡ。 １３．配列番号４のアミノ酸配列を有する組換えｐ１６^INK4。 １４．ｐ１６^INK4をコードするｃＤＮＡ。 １５．配列番号３のヌクレオチド配列を有する単離ＤＮＡ。 １６．患者から単離した細胞試料中のｐ１６タンパク質レベルの上昇を示す細胞 レベルを測定するために、ｐ１６^INK4に特異的な抗体を含んで成る形質転換細胞 を同定するための診断試験キット。 １７．ｐ１６^INK4特異抗体が配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質に対 して特異的である請求の範囲第１６項記載の診断キット。 １８．患者から単離した細胞試料中のｐ１６ｍＲＮＡレベルの上昇を示す細胞レ ベルを測定するために、ｐ１６^INK4核酸配列に特異的な核酸プローブを含んで成 る、形質転換細胞を同定するための診断試験キット。 １９．核酸プローブが配列番号３の核酸配列由来である、請求の範囲第１８項記 載の診断試験キット。