DE69333043T2 - Umlagerung des cyclin komlexes und seine darauf bezogenen anwendungen - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Neoplasie ist gekennzeichnet durch nicht reguliertes Zellwachstum und -teilung. Unvermeidar müssen Molekülwege, die Zellwachstum kontrollieren, mit denjenigen in Wechselwirkung treten, die Zellteilung regulieren. Es war jedoch nicht bis erst kürzlich, daß experimenteller Beweis verfügbar wurde, derartigen Zusammenhang ans Licht zu bringen. Cyclin A wurde in Verbindung mit dem Adenovirus Oncoprotein E1A in virustransformierten Zellen festgestellt (Giordona et al. Cell 58: 981 (1989) und Pines et al. Nature 346: 760 (1990)). In einem frühen hepatozellulären Karzinom wurde das Humancyclin A Gen befunden, die Integrationsstelle eines Fragments des Hepatitis B Virus zu sein, welches zu Aktivierung von Cyclin A Transkription und einem chimären viralen Cyclin A Protein führt, das nicht in vitro abbaubar ist (Wang et al. Nature 343: 555 (1990)). Das Zellzyklusgen, am stärksten in Oncogenese verwickelt, ist somit das Humancyclin D1. Es wurde ursprünglich durch genetische Komplementation von Hefe G1 Cyclin ermangelnden Stämmen isoliert (Xiong et al. Cell 65: 691 (1991); und (Lew et al. Cell 66: 1197 (1991)) als Zellgene, deren Transkription stimuliert wird durch CSF-1 in Mausmakrophagen (Matsushine et al. Cell 65: 701 (1991)) und in dem vermeintlichen Oncogen PRAD1, erneut in parathyroiden Tumoren (Montokura et al. Nature 350–512 (1991) angeordnet. Zwei zusätzliche Human D-Typ Cycline, Cycline D2 und D3, wurden anschließend unter Verwenden von PCR und Niedrig-Stringenz Hybridisierungstechniken (Inaba et al. Genomics 13: 565 (1992) und Xiong et al. Genomics 13: 575 (1992)) identifiziert. Cyclin D1 wird genetisch an das bcl-1 Oncogen gekoppelt, ein Locus, aktiviert durch Translokation an einen Immunglobulingenenhancer in einigen B-Zell-Lympfknotenschwellungen und Leukämien und angeordnet an einer Stelle von Genamplifikation bei 15–20% von Humanbrustkrebsen und 25–48% von squamösen Zellkrebsen von Kopf- und Halsursprung.
  • Cycline sind Proteine, die aufgrund ihrer intensiven Synthese im Anschluß an Befruchtung von Meeresinvertebrateneiern (marine invertebrate eggs)(Rosenthal, E. T. et al., Cell 20: 487–494 (1980)) nachgewiesen wurden. Es wurde anschließend beobachtet, daß der Überfluß von zwei Arten von Cyclinen, A und B, während der frühen Spaltungsteilungen aufgrund von abruptem proteolytischem Abbau der Polypeptide bei Mitose oszillierte, und so leiteten sie ihren Namen ab (Evans, T. et al. Cell 33: 389–396 (1983); Swenson, K. I. et al. Cell 47: 867–870 (1986); Standart, N. et al., Dev. Biol. 124: 248–258 (1987)). Anschließend sind Cyclingene aus im wesentlichen allen eukaryontischen Spezies isoliert worden und bilden eine Multigenfamilie (als Übersicht siehe Xiong et al. Curr Biology 1: 362 (1991).
  • Eher aktive als passive Verwicklung von Cyclinen bei Regulierung von Zellteilung wurde bei der Beobachtung offenkundig, daß eine Quahog-Muschel Cyclin mRNA Aktivierung von Frosch Oocyten und Eintritt dieser Zellen in M Phase erzeugen konnte (Swenson, K. I. et al., Cell 7: 867–870 (1986)). Aktivierung von Frosch Oocyten ist mit Ausarbeitung eines M Phase induzierenden Faktors, bekannt als MPF, verbunden (Masui, Y. und C. L. Markert, J. Exp. Zool. 177: 129–146 (1971); Smith, L. D. und R. E. Ecker, Dev. Biol. 25: 232–247 (1971)). MPF ist eine Proteinkinase, bei der die katalytische Untereinheit das Froschhomolog der cdc2 Proteinkinase (Dunphy, W. G. et al., Cell 54: 423-431 (1988); Gautier, J. et al., Cell 54: 433–439 (1988); Arion, D. et al., Cell 55: 371–378 (1988)) ist.
  • Von den Cyclinen, die bis heute identifiziert sind, ist das B-Typ Cyclin gezeigt worden, bei Mitose zu wirken, indem es als eine integrale Untereinheit der cdc2 Proteinkinase wirkt (Booher, R. und D. Beach, EMBO J. 6: 3441–3447 (1987); Draetta, G. et al., Cell 56: 829–838 (1989); Labbe, J. C. et al., Cell 57: 253– 263 (1989); Labbe, J. C. et al., EMBO J. 8: 3053–3058 (1989); Meier, L. et al., EMBO J. 8: 2275–2282 (1989); Gautier, J. et al., Cell 60-487-494 (1990)). Das A-Typ Cyclin assoziiert auch unabhängig mit der cdc2 Kinase, ein Enzym bildend, das scheint, früher in dem Teilungszyklus als Mitose zu wirken (Draetta, G. et al., Cell 56: 829–838 (1989); Minshull, J. et al., EMBO J. 9: 2865–2875 (1990); Giordano, A. et al. Cell 58: 981–990 (1989); Pines, J. und T. Hunter, Nature 346: 760–763 (1990)). Zell- und Moleküluntersuchungen von Cyclin in Invertebraten und Vertebraten Embryos sind von genetischen Untersuchungen begleitet worden, insbesondere bei Ascomycethefen. Bei der Spaltungs-Hefe codiert das cdc 13 Gen ein B-Typ Cyclin, das in Kooperation mit cdc2 unter Regulieren von Eintritt in Mitose wirkt (Boother, R. und D. Beach, EMBO J., 6: 3441–3447 (1987); Booher, R. und D. Beach, EMBO J. 7: 2321–2327 (1988); Hagan, I. et al., J. Cell Sci. 91: 587–595 (1988); Solomon, M., Cell 54: 738–740 (1988); Goebl, M. und B. Byers, Cell 54: 433–439 (1988); Booher, R. N. et al. Cell 58: 485–497 (1989)). Genetische Untersuchungen sowohl in der Budding-Hefe wie Spaltungshefe (fission yeast) haben gezeigt, daß cdc2 (oder CDC28 in Budding-Hefe) als zwei unabhängige Punkte in dem Zellzyklus wirkt: Mitose und der sogenante Zellzyklus "Start" (Hartwell, L. H., J. Mol. Biol., 104: 803–817 (1971); Nurse, P. und Y. Bisset, Nature: 292-558-560 (1981); Piggot, J. R. et al., Nature 298: 391–393 (1982); Reed, S. I. und C. Wittenberg, Proc. Nar. Acad. Sci. USA 87: 5697–5701 (1990)). Bei Budding-Hefe benötigt die Startfunktion des CDC28 Proteins auch Assoziation der katalytischen Untereinheit des Proteins Kinase mit früheren Proteinen, die strukturell mit A- und B-Typ Cyclinen verwandt sind. Diese dritte Klasse von Cyclin ist die CLN Klasse genannt worden, und drei Gene, umfassend eine teilweise redudante Genfamilie, sind beschrieben worden (Nash, R. et al., EMBO J. 7: 4335– 4346 (1988); Hadwiger, J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6255–6259 (1989); Richardson, H. E. et al., Cell 59: 1127–1133 (1989)). Die CLN Gene sind wesentlich für Durchführung von Start, und bei deren Abwesenheit werden Zellen in der G1 Phase des Zellzyklus angehalten. Die CLN1 und CLN2 Transkripte oszillieren im Überfluß durch den Zellzyklus, aber das CLN3 Transkript nicht. Zusätzlich ist gezeigt worden, daß CLN2 Protein parallel mit seiner mRNA oszilliert (Nash, R. et al., EMBO J 7: 4335–4346 (1988); Cross, F. R., Mol. Cell. Biol. 8: 4675–4684 (1988); Richardson, H. E. et al., Cell 59: 1127–1133 (1988); Wittenberg, et al., (1990)). Obwohl die genauen biochemischen Eigenschaften, übertragen auf cdc2/CDC28 durch Assoziation mit unterschiedlichen Cyclinen, nicht vollständig ausgearbeitet worden sind, begründen genetische Untersuchungen von Cyclin Mutanten deutlich, daß sie "G1" und "G2" Eigenschaften auf die katalytische Untereinheit übertragen (Booher, R. und D. Beach, EMBO J. 6: 3441– 3447 (1987); Nash, R. et al., EMBO J. 7: 4335–4346 (1988); Richardson, H. E. et al., Cell 56: 1127–1133 (1989)).
  • cdc2 und Cycline sind nicht nur in Embryos und Hefen festgestellt worden, sondern auch in somatischen Humanzellen. Die Funktion des cdc2/Cyclin B Enzyms scheint die gleiche in Humanzellen wie in anderen Zelltypen (Riabowol, K. et al., Cell 57: 393–401 (1989)) zu sein. Ein Human A Typ Cyclin ist auch in Assoziation mir cdc2 festgestellt worden. Kein CLN Typ Cyclin ist bis jetzt in Säugerzellen beschrieben worden. Ein besseres Verständnis der Elemente, verwickelt in Zellzyklusregulierung, und von ihren Wechselwirkungen würde zu einem besseren Verständnis von Zellreplikation beitragen und vielleicht sogar das Verfahren ändern oder kontrollieren.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die gegenwärtige Endung liefert ein Verfahren zum Identifizieren einer transformierten oder abnorm sich vermehrenden Zelle, umfassend
    • (A) Bestimmen in einer Testzelle(n) die Untereinheitszusammensetzung eines Komplexes, umfassend ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 16 kDa, 19 kDa oder 21 kDa, und entweder eine Cyclin abhängige Kinase (cdk), ein Cyclin oder sowohl eine cdk wie auch ein Cyclin, wobei das Protein überwiegend ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 21 kDa in einer normalen Zelle ist oder vorwiegend ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 19 kDa oder etwa 16 kDa in einer transformierten oder abnorm sich vermehrenden Zelle ist, und (B) Vergleichen der Untereinheitszusammensetzung von Stufe (A) mit der Untereinheitszusammensetzung eines ähnlichen Komplexes, festgestellt in einer normalen Zelle, wobei eine Änderung in der Untereinheitszusammensetzung Transformation der Testzelle(n) anzeigt.
  • Bei einem weiteren Aspekt wird ein gereinigtes und/oder rekombinantes Polypeptid zur Verfügung gestellt, das umfaßt eine Aminosäurensequenz eines Polypeptids mit einer scheinbaren Molekülmasse von etwa 15 kDa bis 17 kDa, wobei das Polypeptid eine Cyclin abhängige Kinase inhibiert und codiert wird durch eine Nucleinsäure, die spezifisch an die Nucleinsäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 hybridisiert.
  • Bei noch einem weiteren Aspekt wird eine isolierte Nucleinsäure (Sinn oder Antisinn) zur Verfügung gestellt, die spezifisch an die Nucleinsäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 hybridisiert und selektiv ein Gen nachweist, das ein 16 kDa Protein codiert, das an Cyclin abhängige Kinase 4 (cdk4) bindet.
  • Es wird auch zur Verfügung gestellt ein diagnostisches Test-Kit zum Identifizieren von transformierten Zellen, umfassend:
    • (a) eine Nucleinsäuresonde (Sinn oder Antisinn), die spezifisch an die Nucleinsäuresequenz von SEQ ID Nr. 3 hybridisiert und selektiv eine Nucleinsäure nachweist, die ein 16 kDa Protein codiert, das an Cyclin abhängige Kinase 4 (cdk4) bindet, wobei die Sonde zum Messen in einer Probe von Zellen, isoliert von einem Patienten, des Vorhandenseins oder Abwesenheit einer Nucleinsäure ist, die das 16 kDa Protein codiert, und/oder
    • (b) einen Antikörper, spezifisch für das 16 kDa Protein zum Messen in einer Probe von Zellen, isoliert von einem Patienten, einer Menge des Proteins.
  • Bei einem weiteren Aspekt wird zur Verfügung gestellt ein Assayverfahren zum Identifizieren eines Mittels, das die Untereinheitszusammensetzung eines Cyclin-abhängigen Kinase Komplexes ändert, umfassend
    • i. zur Verfügung stellen eine Cyclin-abhängige Kinase (cdk) und das Polypeptid nach einem von Ansprüchen 10 bis 15 unter Bedingungen, wobei die cdk und das 16 kDa Polypeptid einen Komplex bilden können,
    • ii, in Kontakt bringen der Mischung mit einem Kandidatenmittel,
    • iii. Nachweisen einer Menge von Polypeptid als Teil des gebildeten Komplexes,
    • iv. Vergleichen der Menge von in dem Komplex vorhandenem Polypeptid in der Anwesenheit des Kandidatenmittels mit der Menge von Polypeptid, vorhanden in dem Komplex in der Abwesenheit des Kandidatenmittels, wobei eine Änderung in der Menge von Polypeptid vorhanden in dem Komplex in der Anwesenheit des Kandidatenmittels relativ zu der Abwesenheit von Kandidatenmittel ein Mittel angibt, das die Untereinheitszusammensetzung eines Cyclin abhängigen Kinasekomplexes ändert.
  • Es wird auch zur Verfügung gestellt ein Verfahren zum Nachweisen von Transformation einer Säugerzelle durch Nachweisen von geänderter Expression eines Gens, das ein Protein mit einem Molekulargewicht von 15 kDa bis 17 kDa codiert, welches ein Inhibitor von cdk4 ist, wobei das Verfahren umfaßt Bestimmen in einer Testprobe von Säugerzellen das Vorhandensein oder Fehlen von Nucleinsäure, die spezifisch an die Nucleinsäure von SEQ ID Nr. 3 hybridisiert, wobei das Vorhandensein der Nucleinsäure Transformation der Zellen anzeigt.
  • Die gegenwärtige Erfindung bezieht sich auf Verwendungen für die neue Klasse von Cyclinen, auf die als D-Typ Cycline bezug genommen wird, die von Säugerursprung sind und eine neue Familie von Cyclinen sind, verwandt zu aber unterschiedlich von zuvor beschriebenen A, B oder CLN Typ Cyclinen. Insbesondere bezieht sie sich auf Humancycline, codiert durch Gene, die gezeigt sind, fähig zu sein, ein CLN-Typ Gen zu ersetzen, das wesentlich für Zellzyklusstart in Hefe ist, die einen Mangel eines Proteins ergänzen, das wesentlich für Zellzyklusstart ist, und die auf der Basis von Proteinstruktur auf einem unterschiedlichen Zweig des Evolutionsbaumes von A, B oder CLN Typ Cyclinen sind. D-Typ Cycline sind gezeigt worden, in eukaryontischen Zellen, insbesondere Humanzellen, mir mehrfachen Cyclin abhängigen Kinasen zu assoziieren. Sie sind auch gezeigt worden, mit drei Polyppetiden zu copräzipitieren: einer Cyclin-abhängigen Kinase, einem gut charakterisierten DNA Replikations- und Reparaturfaktor (d. h. sich vermehrendes Zellkernantigen oder PCNA) und einem Polypeptid von 21 kDa scheinbarem Molekulargewicht. Ergebnisse schlagen vor, daß D-Typ Cyclin, CDK, PCNA und p21 in einem quaternären Komplex vorliegen, daß viele Kombinationsvariationen der Komponenten (beispielsweise Cyclin D1 oder D3 und CDK2, CDK4 und CDK5) sich in vivo vereinigen, und daß jeder der quaternären Komplexe eine sinnreich unterschiedliche Rolle in dem Zellzyklus oder in unterschiedlichen Zelltypen haben kann. Zusätzlich ist festgestellt worden, daß Zelltransformation durch DNA Tumorviren, wie SV40, mit selektiver Untereinheitneuordnung der Cyclin D Komplexe verbunden ist. Die Assoziation zwischen Cyclin D, PCNA, CDKs (einschließlich CDK2, CDK4 und CDK5) und p21 wird durch Einführung eines DNA Tumorvirus oder dessen oncogenem Genprodukt in Säugerzellen zerstört. Im einzelnen, wie hier beschrieben, ist gezeigt worden, daß die Assoziation zwischen Cyclin D und PCNA, CDKs (CDK2, CDK4 und CDK5) und p21 zerstört wird bei Einführung von SV40 Tumorvirus oder dessen oncogenem Genprodukt großes T Antigen in diploide Humanzellen (wie beispielhaft durch normale Humandiploidfibroblasten angegeben). Nach Diassoziieren von Cyclin D und p21 wird CDK4 mit einem neuen Polypeptid von 16 kDa (p16) assoziiert. In ähnlicher Weise unterliegen Cyclin A Komplexe auch Untereinheitsneuanordnung. Nach SV40 Transformation ist p21 Assoziation mit Cyclin A verringert oder vollständig diassoziiert. Cyclin A erscheint dann in einem Komplex mit einem 19 kDa Polypeptid (p19).
  • Somit ist es jetzt bekannt, daß p21 mit Cyclin Kinasen nur in normalen, nicht transformierten Zellen assoziiert ist, und p16, p19 und potentiell andere verwandte Proteine erscheinen dem Zellzyklusregulator, vorhanden in transformierten Zellen. Diese Kenntnis dient als die Basis für eine Mannigfaltigkeit von Annäherungen zum Modulieren von Zellteilung durch Ändern der Aktivität (direkt oder indirekt) von Cyclinen. Sie bietet Spezifität beim Modulieren von Zellteilung (d. h. die Fähigkeit, selektiv Zellteilung in bestimmten Zelltypen oder an einem bestimmten Punkt in dem Zyklus zu ändern) aufgrund der Spezifität von Expression von Cyclinen in Zellen und der Zahl von möglichen Kombinationen der Komponenten des quaternären Komplexes, die durch Cycline, CDK, PCNA und p21 gebildet zu sein scheinen. Bei einer besonderen Ausführungsform bietet sie ein Mittel, durch das Zellteilung nicht spezifisch geändert werden kann durch Interferieren mit einer üblichen Komponente des quaternären Komplexes, von dem D-Typ Cyclin oder A-Typ Cyclin ein Bestandteil ist, wie durch Interferieren mit PCNA.
  • Beispielsweise wird bei einer Ausführungsform eines therapeutischen Verfahrens der gegenwärtigen Erfindung Bildung des zuvor beschriebenen quaternären Komplexes verhindert oder erhöht, oder die Aktivität eines Komplexgliedes wird als eine Annäherung zum Ändern von Zellteilung geändert. Hier können Mittel, die indirekt oder direkt unter Verhindern oder Erhöhen von Komplexbildung oder Ändern einer Bestandteilsaktivität wirken, verwendet werden. Beispielsweise kann, wie zuvor beschrieben, katalytische Aktivität durch Verhindern von Aktivierung der Proteinkinase inhibiert werden. Alternativ können PCNA Inhibitoren in Zellen eingeführt werden, in denen Zellzyklusstart zu inhibieren ist, was zu Inhibierung von Zellteilung führt. PCNA Inhibitoren können indirekt wirken (beispielsweise zum Reduzieren von Herstellung von PCNA durch Interferieren mit Transkription oder Translation) oder direkt (beispielsweise zum Binden von PCNA und Verhindern, daß es sich mit anderen Komplexgliedern verbindet). Inhibitoren von p21 können auch in Zellen eingeführt werden und interferieren, indirekt oder direkt, mit p21 Funktion und/oder Binden an die Komplexglieder. Protein-Protein Wechselwirkungen (zwischen oder unter Komplexkomponenten) können auch geändert werden (reduziert oder erhöht), den gewünschten Effekt auf den Zellzyklus zu haben (unter Reduzieren oder Erhöhen von Zellteilung). Agenzien, die derartige Protein-Protein Wechselwirkungen blockieren, können verwendet werden. Diese schließen niedrigmolekulargewichtige Inhibitoren, Mittel, die an Komplexkomponenten binden (beispielsweise Antikörper) und Mittel ein, die eine Komponentenfähigkeit abbauen oder anders zerstören, einen Komplex mit den anderen Proteinen zu bilden. Wenn erhöhte quaternäre Komplexbildung gewünscht ist, können Mittel, die die Fähigkeit von Komplexgliedern erhöhen, in Wechselwirkung zu treten oder zu binden (beispielsweise können Mittel, die die Konfiguration einer Komplexkomponente ändern, so daß sie verfügbarer für Protein-Protein Wechselwirkungen ist, die notwendig für Komplexbildung sind), in Zellen eingeführt werden. Erhöhte Komplexbildung kann auch bewirkt werden durch Erhöhen in Zellen die Zahl, Aktivität oder Verfügbarkeit des (der) Grenzgliedes(er) des quaternären Komplexes, wodurch somit die Rate, mit der er gebildet wird, und dessen Verfügbarkeit, zu wirken, erhöht wird.
  • Zusätzlich bezieht sich der Gegenstand der Erfindung auf Verfahren zum Diagnostizieren von Transformation einer Zelle. Reagenzien, wie monoklonale Antikörper, können entwickelt werden, die die Wechselwirkungen zwischen den CDKs, Cyclinen, PCNA und den niedrigmolekulargewichtigen Polypeptiden (beispielsweise p21, p19 und p16) erkennen. Beispielsweise kann ein Antikörper, der die Wechselwirkung zwischen p16 und CDK4 erkennt, verwendet werden, Transformation vieler Zelltypen nachzuweisen oder zu diagnostizieren. Alternativ können Mittel, wie Antikörper, die CDC2, CDK2, Cyclin A oder Cyclin D, erkennen, verwendet werden, die Untereinheitszusammensetzung der Cyclinkomplexe zu identifizieren und somit den Zustand von Tranformation der Zelle.
  • Der Gegenstand der Endung bezieht sich auch auf Mittel (beispielsweise Oligonucleotide, Antikörper, Peptide), geeignet bei den beschriebenen Isolierungs-, diagnostischen oder therapeutischen Verfahren.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Cycline sind Schlüsselregulationsproteine, die zusammen mir Cyclin-abhängigen Proteinkinasen (CDKs) wirken, kritische Transitionen und/oder Restriktionspunkte während des Verlaufs von Zellzyklusprogression zu beherrschen. Die gegenwärtige Erfindung liefert Verfahren und Reagenzien zum Entwickeln von Inhibitoren und/oder Aktivatoren von bestimmten Zellzyklusverfahren. Wie hier beschrieben, können in normalen eukaryontischen Zellen, insbesondere Humanzellen, verschiedene Arten von Cyclinen (wie der A, B und D Klassen) mit einer Anzahl von verschiedenen CDKs assoziieren wie auch sich vermehrendem Zellkernantigen (PCNA) und einem Polypeptid (p21) mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 21 kDa, wodurch vielfache Typen von Komplexen gebildet werden. Beispielsweise zeigen die im nachfolgenden zur Verfügung gestellten Ergebnisse, daß eine Kombination von Cyclinen und CDKs neben PCNA und p21 in mindestens einem quaternären Komplex besteht, daß viele kombinatorischen Variationen der Komponenten sich in vivo zusammenfügen (beispielsweise unterschiedliche Kombinationen von Cyclin D1 oder D3 mit CDK2, CDK4 und CDK5), und daß jeder der sich ergebenden quaternären Komplexe eine sinnreich unterschiedliche Rolle in dem Zellzyklus oder in unterschiedlichen Zelltypen haben kann. Somit können, wie im nachfolgenden beschrieben, Assays zum Identifizieren von Mitteln, fähig zum beispielsweise selektiven Zerstören bestimmter, zwischen Cyclinen und CDKs gebildeten Komplexen, durchgeführt werden.
  • Ferner macht die gegenwärtige Endung diagnostische Assays und Reagenzien zum Nachweisen von transformierten Zellen, solche, wie beim dem Nachweis von Krebs geeignet sein können, verfügbar. Es wird im nachfolgenden gezeigt, daß Zellltransformation mit selektiver Untereinheitsneuanordnung der Cyclin-CDK Komplexe verbunden ist. Zur Veranschaulichung, in Zellen, die transformiert werden (entweder virusmäßig oder durch genetische Aberration), werden die Cyclin D/p21/CDK/PCNA Komplexe zerstört. Beispielsweise dissoziiert in durch Virus transformierten Zellen CDK4 vollständig von Cyclin D, PCNA und p21, wird stattdessen mit einem 16 Kd Polypeptid (hier im nachfolgenden als "p16" bezeichnet) assoziiert. Quaternäre Komplexe, die Cycline A oder B1 und p21/CDK/PCNA enthalten, unterziehen sich auch Untereinheitsneuanordnung in transformierten Zellen. Beispielsweise assoziieren sowohl PCNA wie p21 nicht länger mit CDC2-Cyclin B 1 binären Komplexen, und Cyclin A Komplexe enthalten nicht länger p21, das stattdessen durch ein 19kd Protein (p19) ersetzt ist. Nachweisen derartiger abnormaler Untereinheitskomplexe kann somit verwendet werden, vorhersagend Zelltransformation nachzuweisen. Beispielsweise bildet die gegenwärtige Erfindung verfügbare Reagenzien, einschließlich Antikörper und Nucleinsäuresonden, zum Nachweisen geänderter Komplexbildung und/oder erhöhter Spiegel von p16 Expression, um transformierte Zellen zu identifizieren.
  • Ferner ist von p16 im nachfolgenden gezeigt, daß es eine Inhibitorwirkung auf die Aktivität von Cyclin/CDK Komplexen ausübt, insbesondere denjenigen, die CDK4 einschließen. Beispielsweise ist p16 fähig, die Aktivität von Cyclin D1/CDK Komplexen in vivo zu inhibieren. Wie allgemein bekannt ist, ist Cyclin D1 mit einer umfassenden Mannigfaltigkeit von Vermehrungskrankheiten assoziiert worden. Somit identifiziert die gegenwärtige Erfindung einen potentiellen Inhibitor von Zellproliferation, was aus oncogener Expression von Cyclin D1 herrührt.
  • Umgekehrt kann p16 in Assays verwendet werden, Mittel zu identifizieren, die die Fähigkeit von p16 verringern, CDK4 zu binden und dadurch Inhibierung von Cyclin/CDK4 Komplexen abhelfen. Bei dieser Ausführungsform zerstört die Reaktivierung der CDK4/Cyclin Komplexe oder bringt anders ins Ungleichgewicht die Zellereignisse, die in einer transformierten Zelle auftreten. Derartige Mittel können therapeutisch von Verwendung insofern sein, als daß Aktivierung von CDK4 Komplexen in Zellen, transformiert beispielsweise durch Tumorviren, zur Erhöhung von ansonsten Virus-unterdrückten Zellzyklus-Checkpunkten, wie p53, führen könnte und zu der Anhäufung der infizierten Zellen an dem Checkpunkt führt, oder alternativ im Falle von Rb Phosphorylierung vorzeitig durch einen Checkpunkt voranschreitet, was zu Zelltod führt.
  • Eine Cyclin abhängige Kinase, bezeichnet als CDK5, und DNA, die CDK5 codiert, sind auch als ein Ergebnis der hier beschriebenen Arbeit verfügbar. CDK5 ist gezeigt worden, mit D-Typ Cyclinen, PCNA und p21, zu copräzipitieren. Somit zieht die gegenwärtige Erfindung in Betracht, daß CDK5 Funktion und/oder Assoziation mit anderen Gliedern des Komplexes geändert werden kann (erhöht der vermindert) unter Bewirken der Proliferation einer Zelle. Wenn CDK5 davon abgehalten wird, an D-Typ Cyclin zu binden, wird Kinase Aktivierung verhindert. Dieses kann, wie im nachfolgenden beschrieben, bewirkt werden.
  • I. CYCLINKOMPLEXE IN NORMALEN ZELLEN
  • Das Folgende ist eine Beschreibung der Feststellung, daß D-Typ Cycline mit mindestens drei zusätzlichen Polypeptiden assoziiert werden (CDK, PCNA und p21), was ein quaternärer Komplex mit vielen möglichen kombinatorischen Variationen zu sein scheint, was zu Komplexen führt, die jeweils unterschiedliche Rollen in dem Zellzyklus oder in verschiedenen Zelltypen haben können.
  • Wie im nachfolgenden und in Beispiel 1 beschrieben, sind immunologische Verfahren verwendet worden, festzustellen, daß D-Typ Cycline in eukaryontischen Zellen mit einer Mannigfaltigkeit von potentiellen katalytischen Untereinheiten (beispielsweise CDKs, wie CDK2, CDK4 und CDK5) assoziieren.
  • Zusätzlich haben diese Verfahren gezeigt, daß das D-Typ Cyclin und CDK mit dem Replikationsfaktor PCNA und einem Polypeptid von 21 kDa scheinbarem Molekulargewicht assoziieren.
  • Humancyclin D1 ist mit einer umfassenden Mannigfaltigkeit von Vermehrungskrankheiten assoziiert worden. Wie hier beschrieben, wird Cyclin D1 in diploiden Humanzellen, insbesondere diploiden Humanfibroblasten, mit einer Anzahl von anderen Zellproteinen komplexiert. Unter ihnen sind die katalytischen Untereinheiten CDK2, CDK4 (zuvor PSK-J3 genannt) und CDK5 (auch PSSALRE) genannt. Zusätzlich werden Polypeptide von 21 kDa und 36 kDa in Verbindung mit Cyclin D1 identifiziert. Wie in Beispiel 1 beschrieben, ist gezeigt worden, daß das 36 kDa Protein das Vermehrungszellkernantigen PCNA ist. PCNA ist als ein essentieller akzessorischer Faktor für die Delta Polymerase beschrieben worden, die für führende Strang DNA Replikation und DNA Reparatur benötigt wird. Cyclin D3 assoziiert auch mit vielfachen Proteinkinasen p21 und PCNA, wie hier gezeigt. Es wird vorgeschlagen, daß ein quaternärer Komplex vom Typ D Cycline, CDK, PCNA und p21, existiert, und daß viele Kombinationsvarationen (Cyclin D1, D3 mit CDK2 4 und 5) sich in vivo zusammenfügen können. Diese Feststellungen koppeln ein vermeintliches Human G 1 Cyclin, das mit Oncogenese assoziiert ist, mit einem gut charakterisierten DNA Replikations- und Reparaturfaktor.
  • (i) Untersuchung von Proteinen, die mit Cyclin D Assoziieren
  • Zum Identifizieren von Proteinen, die spezifisch mit Cyclin D assoziieren, wurden Anti-Cyclin D1 Immunpräzipitate von [35S] Methionin-markierten WI38 diploiden Humanfibroblastlysaten untersucht (siehe Beispiel 1, Experimentelle Verfahren). WI38 Zellen wurden anfänglich für diese Untersuchung ausgesucht, weil sie eine relativ normale Zell-Linie sind, die vernünftig hohe Spiegel von Cyclin D1 und einen niedrigen Spiegel von Cyclin D3 mRNA exprimiert (Won et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1992). Transformierte Human 293 primäre Embryonierenzellen wurden als Kontrollen verwendet, weil sie alle drei D Cyclin mRNAs und Proteine mit äußerst niedrigen Spiegeln exprimieren (Xiong, et al., Cell 65: 691–699 (1991)). WI38 Zellen exprimieren ein leicht nachweisbares 35 kDa Polypeptid, das durch Anti-Cyclin D1 Antiserum immungefällt werden kann. Die Identität des 35 kDa Proteins als Cyclin D1 wurde bestätigt durch Vergleich eines Immunpräzipitats des gleichen W 138 Zell-Lysats mit Präimmunserum und mit einer ähnlichen Präzipitation von 293 Zell-Lysat mit dem gleichen Anti-Cyclin D1 Antiserum. Wegen der Existenz von drei eng verwandten Cyclin D Genen in Humanzellen und schwacher Kreuz-Reaktivität des Anti-Cyclin D1 Antikörpers mit anderen Cyclin D Proteinen wurde die Identität der 35 kDa Bande ferner untersucht durch proteolytisches Teilkartieren. S. aureus V8 Teilproteolyse der 35 kDa Bande zeigte das gleiche Muster wie dasjenige von ähnlichem gespaltenen Cyclin D1, synthetisiert in vitro, aber nicht wie dasjenige von Cyclin D2 oder D3.
  • Zusätzlich zu der intensiven 35 kDa Bande, entsprechend Cyclin D1, erschienen drei andere Hauptbanden, p36, p33 und p21 und eine geringere Bande p31 (wobei die Zahl die scheinbaren Molekulargewichte anzeigt) spezifisch in den Anti-Cyclin D1 Präzipitaten. Diese Polypeptide fehlen Präzipitaten von W 138 Zell-Lysat unter Verwenden von Prä-Immunserum oder Präzipitaten von 293 Zell-Lysaten mit dem gleichen Anti-Cyclin D1 Antikörper. Die Möglichkeit, daß irgendeine dieser vier Banden, insbesondere p31 und p33, Cyclin D2 oder D3 sein könnte, wurde ausgeschlossen durch Vergleichen ihrer V8 Teilproteolysemuster mit denjenigen von in vitro translatiertem D2 und D3. Präzipitation dieser Polyppetide mit Anti-Cyclin D1 Serum beruht wahrscheinlich auch nicht auf dem Vorhandensein von Kreuz-reaktiven Epitopen in irgendeinem dieser Proteine, da diese Proteine nicht nachgewiesen wurden im Anschluß an Immunpräzipitation, gekoppelt mit Western Blotting unter Verwenden des gleichen Antikörpers. Experimente zum Identifizieren der Cyclin D1-assoziierten Proteine sind im nachfolgenden beschrieben.
  • (ii) CDK5 Assoziate mit D-Typ Cyclinen
  • Es ist zuvor berichtet worden, daß in Mausmakrophagen Cyclin D1/cyll nur einem Polypeptid assoziiert, das mit einem Antikörper zu Vollängen p34cdc2 von Schizosaccharomyces pombe (G8) kreuzreagiert aber nicht mit einem Antikörper, hergestellt gegen das C-termianle Human p34cdc2 (Draetta et al., Cell 50: 319–325 (1987); Draetta und Beach, Cell 54: 17–26 (1988); Matsushime et al., Cell 65: 701– 713 (1991). Im wesentlichen identische Ergebnisse wurden gegenwärtig in Human WI38 Zellen erhalten, was vorschlägt, daß Cyclin D1 mit einem Verwandten von Human CDC2 assoziiert.
  • Der G8 Antikörper wurde zum Durchmustern von Human cDNA Expressionsbibliotheken (siehe Beispiel 1, Experimentelle Verfahren) verwendet, um vermeintliche D-Typ Cyclin-assoziierte Kinasen zu isolieren. Vierunddreißig G8-positive cDNA Klone wurden aus einer HeLa Zell cDNA Bibliothek identifiziert. Unter diesen codierten 17 Klone CDC2 und weitere 14 codierten CDK2. Einer der verbleibenden Klone codiert ein ORF von 292 Aminosäureresten (SEQ ID Nr. 1 und 2) mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 33283 Daltons. Dieser Klon wird als CDK5 bezeichnet, weil er umfassende Aminosäurenidentität mit den bekannten Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs), einschließlich S. pombe, CDC2 (53,4%), S. cerevisiae CDC28 (55,9%), Human CDC2 (56,8%) und Human CDK2(60,3%) teilt und mit Human D-Typ Cyclinen assoziiert (siehe im nachfolgenden). CDK5 codiert eine Sequenz von DLKKYFD bei Aminosäurensequenz 86 bis 92, während die entsprecchende Region von Human CDC2 die Sequenz von DLKKYLD hat, und CDK2 hat DLKKFMD.
  • Zum Bestimmen, ob CDK5 mit D Cyclinen assoziiert, wurde ein Antiserum gegen ein Peptid, entsprechend der einzigartigen Carboxy-terminalen Region von CDK5 (siehe Beispiel 1, Experimentelle Verfahren), gerichtet. Dieses Serum wirkt nicht kreuzreaktiv mit Human CDC2, CDK2 oder CDK4. Immunpräzipitation oder Western Blotting im Anschluß an Immunpräzipitation zeigte, daß dieses Antiserum ein Polypeptid in Zell-Lysat mit einem scheinbaren Molkulargewicht von 31 kDa (p31) nachwies, das mit CDK5 Polypeptid, synthetisiert in vitro, comigrierte, und dessen Signal wirksam durch das CDK5 antigene Peptid wegkonkurriert wurde. Die Identität von dem 31 kDa Protein, gefällt durch den Anti-CDK5 Antikörper, wurde ferner bestätigt, CDK5 zu sein durch Vergleichen des Teil V8 proteolytischen Kartierens von p31 mit in vitro translatiertem CDK5.
  • Immunpräzipitation von Zell-Lysaten von 35S-Methionin markierten W 138 Zellen unter Verwenden des Anti-CDK5 Antiserums zeigte verschiedene Polypeptide zusätzlich zu p31cDK5. Von diesen waren Polypeptide von 36 kDa (p36), 35 kDa (p35), 33 kDa (p33) und 21 kDa (p21) am hervorragendsten und copräzipitierten durch das Anti-CDK5 Antiserum spezifisch. Alle vier Polypeptide fehlten Präzipitaten mit dem Prä-Immunserum oder in der Anwesenheit von Überschußmenge des CDK5-Carboxy-terminalen Peptids.
  • Die elektrophoretischen Mobilitäten von p35 und p33 wurden festgestellt, die gleichen zu sein wie diejenigen von in vitro translatiertem Humancyclin D1 und D3. Zum direkten Testen der Möglichkeit, daß das CDK5-assoziierte p35 Cyclin D1 entsprechen könnte, wurden CDK5 Immunpräzipitate mit Anti-Cyclin D1 Antiseren geblottet. Ein 35 kDa Polypeptid, das mit p35Cyclin D1 comigrierte, wurde durch das Anti-Cyclin D1 Antiserum nachgewiesen. Reziprokes Blotten von Anti-Cyclin D1 Immunkomplexen durch das CDK5 Antiserum zeigte auch das Vorhandensein eines 31 kDa Polyeptids, das die gleiche Mobilität wie p31CDK5 hatte. In ähnlicher Weise ist CDK5 auch in Anti-Cyclin D3 Immunpräzipitaten nachgewiesen worden. Diese Daten zeigen, daß das CDK5-assoziierte p35 Cyclin D1 ist, und CDK5 assoziiertes p33 ist Cyclin D3.
  • Um überzeugenden Beweis der Identität der CDK5-assoziierten p35 und p33 Proteine zu suchen, wurde proteolytisches Teilkartieren verwendet (Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252: 1102–1106 (1977)). 35S-markiertes p35, gereinigt von Anti-CDK5 Immunpräzipitaten, wurde teilweiser S. aureus V8 Protease Verdauung ausgesetzt und mit ähnlich behandeltem Human p35Cyclin D1 erhalten von entweder in vitro Translation oder von einer Anti-Cyclin D1 Immunpräzipitation, verglichen. Das V8 proteolytische Muster von p35 von Anti-CDK5 Immunpräzipitaten war identisch zu demjenigen von Cyclin D1 aber unterschiedlich von demjenigen von Cyclin D3. Ähnliche Experimente wurden auch durchgeführt unter Bestätigen der Identität von p33. Das proteolytische Teilmuster des CDK5-assoziierten p33 ist identisch zu demjenigen eines in vitro translatierten Humancyclin D3, aber nicht D1. Umgekehrt ist auch festgestellt worden, daß das Teil V8 Verdauungsmuster des Cyclin D1 assoziierten p31 identisch zu CDK5, erhalten von entweder in vitro Translation oder Anti-CDK5 Immunpräzipitation, ist.
  • (iii) CDK2 Assoziate mit Cyclin D
  • Das scheinbare Molekulargewicht des Cyclin D1-assoziierten p33 (beispielsweise in den Anti-Cyclin D1 Präzipitaten) und auch die Kreuzreaktivität von p33CDK2 mit dem G8 Antikörper schlägt die Möglichkeit vor, daß p33 CDK2 sein könnte. Um dieses zu testen, wurde Anti-CDK2 Präzipitat eines [35S] Methionin-markierten WI38 Zell-Lysats mit einem Anti-Cyclin D1 Präzipitat verglichen. Wie erwartet, fällte das Anti-C terminale CDK2 Serum ein 33 kDa Protein, das bestätigt wurde, p33CDK2 zu sein, indem das S. aureus V8 Teilproteolysemuster der 33 kDa Bande mit derjenigen von in vitro translatiertem CDK2 verglichen wurde. Ferner comigrierte p33CDK2 mit dem p33, vorhanden in dem Anti-Cyclin D1 Präzipitat. Umgekehrt präzipitierte Anti-CDK2 Antiserum auch ein 35 kDa Protein, das mit Cyclin D1 comigrierte.
  • Um weiteren Beweis für das Vorhandensein einer möglichen Assoziation zwischen CDK2 und Cyclin D1 zu suchen, wurde ein WI38 Zell-Lysat mit Anti-Cyclin D1 immungefällt, auf SDS-PAGE getrennt und mit Anti-CDK2 Antiserum immungeblottet. Der Anti-CDK2 Antikörper wurde gegen ein Carboxy-terminales Peptid gerichtet (Pagano et al., EMBO J. 11: 961–971 (1992)), und dessen Spezifität wurde untersucht durch Immunblotten von bakteriell exprimiertem Human CDC2, CDK2, CDK3, CDK4 und CDK5. Nur CDK2 und nicht die anderen vier CDK Proteine wurden durch diesen Antikörper erkannt. CDK2 Protein wurde in WI38 Zell-Lysaten nachgewiesen, die mit entweder Anti-CDK2 oder Anti-Cyclin D1 immungefällt wurden, aber nicht in Lysat, gefällt mir Präimmunserum oder mit Anti-CDK2, vorinkubiert mit konkurrierenden antigenen Peptiden. Bei einem reziproken Westernblotexperiment wurde Zell-Lysat mit Anti-CDK2 immungefällt und mit Anti-Cyclin D1 geblottet. Cyclin D1 wurde in den Anti-Cyclin D1 und Anti-CDK2 Immunpräzipitaten nachgewiesen, aber nicht in Präzipitaten von entweder Präimmunserum oder Anti-CDK2 Antiserum, vorinkubiert mit einem konkurrierenden CDK2 Peptid.
  • Zum Testen, ob CDK2 auch mit Cyclin D3 assoziiert, wurden Immunpräzipitate, gebildet unter Verwenden von Antiserum zu dem C-terminalen Peptid von Humancyclin D3 (siehe Beispiel 1, Experimental Procedures), mit Anti-CDK2 Antiserum geblottet. CDK2 wurde schwach in dem Anticyclin D3 Präzipitat nachgewiesen, aber nicht in dem Kontrollpräzipitat mit Anti-Cyclin D3 Antiserum, vorinkubiert mit einem konkurrierenden Antigenpeptid.
  • Letztendlich, um weiter die Assoziation zwischen CDK2 und Cyclin D zu bestätigen, wurden proteolytische Teilkartierungsexperimente durchgeführt. Anfänglich wurden Versuche durchgeführt, proteolytisch das Cyclin D1-assoziierte p33 zu kartieren zum Vergleichen dieses mit CDK2. Jedoch wegen der Comigration von CDK2 mit noch einer anderen vorherrschenden Proteinkinase in den Anti-Cyclin D1 Präzipitaten wurde ein unterschiedliches proteolytisches Muster erhalten. Deshalb wurde das konverse Experiment durchgeführt. Die 35 kDa Bande in Anti-CDK2 Immunpräzipitaten wurde aus SDS-Polyacrylamidgel herausgeschnitten, teilweise mit V8 Protease verdaut und elektrophoretisch getrennt und verglichen mit V8 verdautem p35Cyclin D1, abstammend von entweder in vitro Translation oder von einer Anti-Cyclin D1 Immunpräzipitation. Das Muster von proteolytischer Spaltung war in jedem Fall das gleiche.
  • (iv) pSK-J3/CDK4 ist das vorwiegende p33 Protein, assoziiert mir Cyclin D1
  • Der Unterschied in dem proteolytischen Muster von Cyclin D1-assoziiertem p33 zu demjenigen von CDK2 schlug vor, daß die Mehrheit von D1-assoziiertem p33 einem Protein anders als CDK2 entspricht. Eine Proteinkinase, genannt PSK-J3, ursprünglich identifiziert in einem Screen mit gemischten Oligonucleotidsonden, abstammend von konservierten Regionen von Serin/Threonin Kinasen (Hanks, S. K. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 388–392 (1987), wurde angenommen, Cyclin D Bindungseigenschaften zu haben. Die vorhergesagte Molekülmasse von PSK-J3 ist 34 kDa, nahe zu derjenigen von p33. Wegen seiner Assoziation mit D Cyclinen, wie im nachfolgenden gezeigt, wird auf PSK-J3 hier im nachfolgenden als CDK4 bezug genommen. In vitro translatiertes CDK4 und dasjenige, gefällt von einem Zell-Lysat mit Anti-CDK4 Serum, zeigte die gleiche elektrophoretische Mobilität wie CDK2 und das D1-assoziierte p33. Die Identifizierung von CDK4, gefällt mit dem Anti-CDK4 Antiserum, wurde bestätigt durch Vergleichen von dessem Teil V8 Kartierungsmuster mit demjenigen von in vitro translatiertem CDK4.
  • Immunpräzipitations-Western Blotting Experimente wurden durchgeführt durch direktes Testen, ob das Cyclin D1 assoziierte p33 CDK4 ist. Ein Anti-CDK4 Serum reagierte mit einem 33 kDa Protein, vorhanden in Anti-Cyclin D1 Immunpräzipitaten, das die gleiche Beweglichkeit wie das CDK4, gefällt durch Anti-CDK4, hat, aber reagierte nicht mit Zell-Lysatpräzipitaten von entweder CDK2 oder CDK5. Umgekehrt, das Anti-CDK4 Antiserum fällte auch ein 35 kDa Protein, nachgewiesen durch Anti-Cyclin D1 Antikörper. Zum weiteren Bestätigen der Identität des Cyclin D1-assoziierten p33 wurde das Teil V8 Verdauungsmuster von p33 mit demjenigen von immungefälltem CDK4 und CDK2 verglichen. Das Cyclin D1-assoziierte p33 zeigte ein sehr ähnliches Muster zu demjenigen von CDK4, aber war ziemlich unähnlich zu demjenigen von CDK2. Dieses Ergebnis zeigt, daß CDK4 beträchtlich mehr im Überfluß ist (mindestens wie grob durch Methionin Markieren untersucht) als CDK2 in Anti-Cyclin D1 Präzipitaten von WI38 Zellen. In ähnlicher Weise ist ein 33 kDa Polypeptid (p33), gesehen in Anti-CDK4 Immunpräzipitat, identifiziert worden, Cyclin D3 durch Teil V8 Peptid Kartieren zu sein.
  • (v) Assoziation von p21 mit Cyclin D1 und CDK2
  • In [35S] Methionin-markiertem WI38 Lysat, gefällt mit Anti-Cyclin D1 Serum, erschien ein 21 kDa Protein (p21) spezifisch mit Cyclin D1 zu assozieren. p21 war nicht in den Präzipitaten mit Präimmunserum vorhanden, noch in dem Anti-Cyclin D1 Präzipitat, abstammend von 293 Zellen, die nicht nachweisbare Spiegel von Cyclin D1 enthielten. Spezifische Assoziation von p21 mit Cyclin D1 wurde weiter unterstützt durch das Vorhandensein eines comigrierenden 21 kDa Proteins in Immunpräzipitaten, gebildet mit Seren gegen CDK2, CDK4 und CDK5. Als Anti-CDK2 Antiserum vorblockiert wurde mit einem konkurrierenden CDK2 Peptid, wurde die p21 Bande und auch p33CDK2 und p35Cyclin D1 nicht gesehen. In ähnlicher Weise fehlte p21 auch in Anti-CDK5 Immunpräzipitaten, wenn das Antiserum mit dem CDK5 Carboxy-terminalen Antigenpeptid vorinkubiert wurde. p21 wurde nicht in Western Blots durch irgendeinen der Anti-CDK oder Anticyclin D Antikörper, verwendet in dieser Untersuchung, erkannt. Ferner, obwohl das gesamte immunfällbare CDK2 in 239 Zellen ähnlich zu demjenigen in WI38 Zellen ist, war die p21 Bande nicht in den CDK2 Immunpräzipitaten von 293 Zell-Lysaten vorhanden. Diese Feststellung schlägt vor, daß die Assoziation von CDK2 und p21 von Cyclin D abhängt.
  • Zum Bestimmen, ob das p21 aus Cyclin D1 Immunpräzipitaten und CDK2 Immunpräzipitaten dem gleichen Polypeptid entsprechen, wurde das V8 proteolytische Teilmuster des p21, gereinigt aus jeder Quelle, verglichen. Sie sind tatsächlich gleich. Das p21, gefällt durch Anti-CDK5 Antiserum, wurde auch befunden, das gleiche wie Cyclin D1-assoziiertes p21 zu sein. Das p21 in der Anti-CDK4 Immunfällung wurde auch proteolytisch kartiert. Es ergab ein identisches Muster zu dem Cyclin D1-assoziiertem p21. p21 entspricht nicht dem Human max Protein oder p21ras, da seine elektrophoretische Mobilität schneller ist als diejenige von beiden, und es wurde nicht durch einen Anti-Human ras Antikörper auf Western Blots erkannt.
  • (vi) Cyclin D1-Assoziiertes p36 ist PCNA
  • Wie zuvor ausgeführt, zeigen Anti-Cyclin D1 Präzipitate von WI38 Zellen assoziierte Polypeptide von 21 kDa, 31 kDa und 33 kDa und auch ein hervorragendes Protein von 36 kDa. p36 wurde nicht in Kontrollpräzipitaten nachgewiesen unter Verwenden von entweder Prä-Immunserum, oder in 293 Lysaten. Ein 36 kDa Protein in einem geringeren Überfluß wurde auch in CDK2, CDK4 und CDK5 Immunpräzipitaten aber nicht in den Präzipitaten mit Antiserum, vorinkubiert mit konkurrierenden Peptiden, nachgewiesen.
  • Während versucht wurde, die Identität des p36 zu begründen, schlugen vier Beobachtungen die Möglichkeit vor, daß es das Humanvermehrungskernantigen PCNA sein könnte. Zuerst wurde in einer asynchronen Population von sich vermehrenden WI38 Zellen Cyclin D1 beobachtet, vorwiegend ein Kernprotein zu sein, obwohl die Verteilung nicht identisch mit dem gesprenkelten Muster von PCNA ist (Bravo, R. und H. MacDonald-Bravo, EMBO J., 4: 655–661 (1985); Madsen, P. und J. E. Celis, FEBS Lett., 193: 5–11 (1985). Zweitens, während der Spiegel von Cyclin D1 relativ konstant in mitogen aktivierten WI38 Zellen ist, war das p36 in [35S] Methionin-makierten Cyclin D1 Immunpräzipitaten gering in ruhigen Zellen und erhöht bei 10–14 Stunden nach Stimulierung. Zehn bis vierzehn Stunden nach Serumstimulierung sind viele WI38 Zellen in der späten G1, eine Zeit, die mit dem Beginn von PCNA Synthese in Serum-stimulierten 3T3 Fibroblasten zusammenfällt (Bravo, R. und H. MacDonald-Bravo, EMBO J., 3: 3177–3181 (1984), Celis, J. E. und A. Celis, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 3262–3268 (1985); Madsen P. und J. E. Celis, FEBS Lett., 193: 5–11 (1985). Drittens, das scheinbare Molekulargewicht von p36 ist ähnlich zu demjenigen von PCNA. Letztendlich fällte Anti-PCNA Antikörper ein 35 kDa Polypeptid, dessen elektrophoretische Mobilität ähnlich zu derjenigen von p35Cyclin D1 ist. Das Identifizieren des p36, gefällt durch den Anti-PCNA Antikörper, ist als PCNA bestätigt worden durch Vergleichen seiner V8 Peptidkarte mit derjenigen von in vitro translatiertem PCNA.
  • Immunpräzipitations-Western Blotexperimente wurden unter direktem Testen der Möglichkeit durchgeführt, daß p36 PCNA ist. PCNA wurde leicht in Anti-Cyclin D1, Cyclin D3, CDK2 und CDK5 Immunpräzipitaten nachgewiesen, aber nicht in den entsprechenden Kontrollpräzipitaten. Bei einem reziproken Experiment wurden Cyclin D1 und CDK2 auch in Anti-PCNA Immunpräzipitaten nachgewiesen. Es ist nicht möglich gewesen, Cyclin D3 oder CDK5 in PCNA Präzipitaten überzeugend nachzuweisen, möglicherweise aufgrund des geringen Überflusses von beiden Proteinen in W 138 Zellen und der relativ geringen Empfindlichkeit der D3 und CDK5 Antiseren in Western Blots.
  • Zum weiteren Untersuchen der Ähnlichkeit zwischen dem PCNA und dem p36 Polypeptid, assoziiert mit Cyclin D1 und CDK2, wurden p36 Banden aus Cyclin D1 und CDK2 Immunpräzipitaten gereinigt, auf SDS-PAGE getrennt, und ihr Teil V8 proteolytisches Kartierungsmuster wurde mit demjenigen von PCNA verglichen. Verdauung von Cyclin D1-assoziiertem p36 durch V8 Protease zeigte das gleiche Muster wie dasjenige von PCNA, abstammend von Anti-PCNA Immunpräzipitaten und in vitro translatiertem PCNA. In ähnlicher Weise passen auch die Verdauungsmuster von CDK2- und CDK5assoziiertem p36 zu demjenigen von PCNA. Das p36, assoziiert mit Cyclin D1, ist PCNA. Zusätzlich zeigte proteolytisches Kartieren des p21, nachgewiesen in Anti-PCNA Immunpräzipitat, das es das gleiche wie Cyclin D1-assoziiertes p21, zuvor beschrieben, ist.
  • (viii) Untereinheitkomplexe von anderen Cyclinen
  • PCNA und p21 assoziieren nicht nur mir Cyclin D-CDK unter Bilden eines quaternären Komplexes, wie zuvor beschrieben, sondern sind auch als universelle Komponenten von Cyclin-CDK Komplexen in vielen anderen normalen Zellen beispielsweise vorhanden. Es wurde festgestellt, daß in Lysaten von W 138 Zellen und HSF43 Zellen, immunpräzipitiert mit Anti-Cyclin A Antikörper, Cyclin A mit PCNA, CDC2, CDK2 und p21 assoziiert.
  • In ähnlicher Weise zeigte Analyse von 35S-Methionin (35S-Methronin) markierten Anti-Cyclin B1 Immunpräzipitaten von WI38 und HSF43 Lysaten einen quaternären Komplex, umfassend Cyclin B1, ein CDK, p21 und PCNA.
  • Obwohl die experimentellen Techniken, verwendet in dieser Untersuchung, nicht formal eine Unterscheidung zwischen der Existenz von mehrfachen paarweisen Wechselwirkungen zwischen jedem Protein erlauben, werden die Daten am einfachsten erklärt, wenn D Cyclin, PCNA, CDK und p21 einen quaternären Komplex bilden. Vergleich der Intensität der Methionin markierten Banden in den Immunfällungsreaktionen schlägt vor, daß nicht alles Cyclin D in dem Komplex vorhanden ist, noch ist alles PCNA. Jedoch ist die relative Intensität der p36 (PCNA), p33 (CDK4) und p21 Banden in einem Anti-Cyclin D Präzipitat sehr ähnlich. Die hier dargestellten Ergebnisse schließen nicht die Möglichkeit aus, daß Cyclin D mit oder ohne die hier beschriebenen assoziierten Proteine mit zusätzlichen Partnern in vivo assoziieren könnte. Insbesondere sind zwei Polypeptide, die auf jede Seite des 97 KD Molekulargewichtsmarkers migrieren, offenkundig bei Anti-Cyclin D Präzpitationsreaktion.
  • PCNA ist als ein essentieller akzessorischer Faktor zu der delta Polymerase beschrieben worden, der sowohl für führende Strang DNA Replikaton wie auch für DNA Reparatur benötigt wird (Prelich, G. et al., Nature, 326: 517–520 (1987): Prelich G. und B. Stillman, Cell, 53: 117–126 (1988); Toschi, L. und R. Bravo, J Cell Biol. 107: 1623–1628 (1988); M. K. K. Shiviji et al., Cell, 69: 367–374 (1992). Er ist im Kern an Stellen von aktiver DNA Synthese lokalisiert, und die Lokalisierung von PCNA aber nicht dessen Synthese hängt von DNA Synthese ab. Es war nicht möglich, Phosphorylierung von irgendeiner der entsprechenden Untereinheiten in in vitro Kinasereaktionen nachzuweisen, was vorschlägt, daß weder PCNA noch p21 ein primäres Substrat von Cyclin D/CDK ist.
  • Die Cyclin D/CDK Enzyme, die mit PCNA und p21 assoziieren, könnten sich in vivo in einen hochentwickelten Multi-Protein-DNA Synthesekomplex vereinigen, eine Komponente davon könnte das physiologische Substrat von Cyclin D/CDK sein. PCNA ist allgemein biochemisch aus Zellen in einer monomeren Form gereinigt worden, die unassoziiert mit anderen Proteinen ist (Prelich, G. et al., Nature 346: 760–763 (1987)). Es ist möglich, daß die Multi-Protein Komplexe, beschrieben in der gegenwärtigen Untersuchung, übersehen wurden, weil sie nicht die Mehrheit des zellulären PCNA umfassen. Alternativ ist es möglich, daß PCNA weiter Nicht-DNA synthetische Zellzyklus-Regulationsrollen hat, die nicht zuvor beschrieben worden sind, und die Cyclin D und CDK Proteine einschließen. Jedoch liefern die gegenwärtigen Untersuchungen die erste biochemische Anzeige einer möglichen Funktion von D-Typ Cyclinen als Modulatoren von PCNA Funktion.
  • Die Bedeutung des quaternären Komplexes wird durch die neue Offenbarung betont, daß Zelltransformation durch DNA Tumorviren mit selektiver Untereinheitsneuanordnung der Cyclin D Komplexe wie auch anderer Zellzykluskomplexe, einschließlich Cyclin A, CDC2, CDK2, CDK4 und CDK5 Komplexe, verbunden ist. Insbesondere erzeugt Einführung von SV40 DNA Tumorvirus oder dessen oncogenes Genprodukt großes T Antigen in normale Humandiploidfibroblasten (HDF) Zerstörung der Assoziation zwischen Cyclin D und PCNA, CDKs (wie CDK2, CDK4 und CDK5) und p21. Nach Dissoziation von Cyclin D und p21 wird CDK4 Kinase mit einem 16kDa Polypeptid (p16) assoziiert. In ähnlicher Weise erzeugt SV40 Transformation eine Verringerung von Assoziation von p21 mit Cyclin A in HDF; und in Adenovirus-(293 Zell-Linie) oder Humanpapilloma Virus (HeLa Zell-Linie) transformierten Zellen ist p21 vollständig von Cyclin A dissoziiert. Ein 19 kDa Peptid, p19, erscheint dann in einem Komplex mit Cyclin A. Deshalb ist p21 mit Cyklinkinasen nur in normalen, nicht transformierten Zellen assoziiert, wohingegen p16, p19 und möglicherweise andere verwandte Proteine in Cyclin Komplexen in transformierten Zellen vorhanden sind.
  • II. CYCLIN KOMPLEXE IN TRANSFORMIERTEN ZELLEN
  • Wie im nachfolgenden beschrieben, liefern die gegenwärtigen Beobachtungen treffenden Beweis, daß die Cyclin/CDK Familie von Enzymen, die bei mehrfachen Schlüsselstufen in der Zellteilung wirken, grob in einer Mannigfaltigkeit von oncogen transformierten Zellen geändert werden. Bei jedem Glied der untersuchten Cyclin/CDK Familie, es wurde Assoziation mit PCNA und p21 festgestellt. Jedoch werden bei Transformation mit dem DNA Tumorvirus SV40 oder dessen Transformierungs-Antigen (T) die Cyclin D/CDK/PCNA/p21 Komplexe zerstört. In transformierten Zellen dissoziiert CDK4 vollständig von Cyclin D, PCNA und p21 und assoziiert stattdessen ausschließlich mit einem Polypeptid von 16 kd (p16). Quaternäre Komplexe, enthaltend Cycline A oder B 1 und p21/CDK/PCNA unterliegen auch Untereinheitsneuanordnung in transformierten Zellen. Sowohl PCNA wie p21 sind nicht länger mit CDC2-Cyclin B1 binären Komplexen assoziiert. Cyclin A Komplexe enthalten nicht länger p21, sondern es wird eher ein neues 19 kd Polypeptid (p19) in Assoziation mit Cyclin A festgestellt. Dieses Muster, wenn Untereinheitsneuanordnung von Cyclin-CDK Komplexen, ist nicht nur in SV40-transformierten Zellen festgestellt worden, sondern auch in Zellen, transformiert mit Adenovirus oder Papillomavirus. Ferner war das Muster von Untereinheitszusammensetzung der Cyclin-CDK Familie grob abnormal in nicht durch Virus transformierten Zellen, wie den p53 ermangelnden Zellen, abstammend von Li-Fraumeni Patienten, wie auch der epidermalen A-431 Karzinomzelle, und dem schuppenförmigen Pharynxzellkarzinom FaDu.
  • (i) Zerstörung von Cyclin D/CDK/PCNA/p21 Komplexen in SV40-transformierten Zellen
  • Während Cyclin D/CDK/PCNA/p21 quaternäre Komplexe in normalen Fibroblastzellen (beispielsweise WI38 und HS68), wie zuvor beschrieben, nachgewiesen wurden, wurden derartige Komplexe nicht in verschiedenen anderen Zell-Linien nachgewiesen, die durch Virus transformiert worden sind (beispielsweise die Human 293 Zell-Linie). Unter der Annahme des offenkundigen Unterschiedes wurden die Untereinheitszusammensetzungen von Cyclin D Komplexen in normalen diploiden Fibroblasten und ihren transformierten Derivaten näher verglichen. Die WI38 VA13, Unterlinie 2RA (hier im nachfolgenden als VA13 bezeichnet), ist ein SV40 Virus-transformiertes Derivat der WI38 Zell-Linie. Anti-Cyclin D1 Immunpräzipitate von 35S Methionin-markierten WI38 und VA13 Lysaten wurden untersucht. Wie zuvor für WI38 Zellen gezeigt, fällt das Anti-Cyclin D1 Antiserum eine dominante 35-kD Bande, entsprechend Cyclin D1, und drei assoziierte Hauptproteine, p36PCNA, p33CDK4 und p21. In SV40-transformierten VA13 Zellen wird der Spiegel von Cyclin D1 um zwei- bis dreifach verringert, wie durch Autoradiographie von 35S Methionin-markierten Immunpräzipitaten und durch Western Blotting bestimmt. Jedoch war keines der drei Hauptcyclin D1-assoziierten Proteine sichtbar mit Cyclin D1 in SV 40 transformierten VA13 Zellen assoziiert. Reziproke Immunpräzipitationen wurden mit Anti-CDK4 und Anti-CDK2 Antiseren durchgeführt unter Bestätigen der beobachteten Zerstörung von Cyclin D Komplexen in SV40-transformierten Zellen. In WI38 Zellen fällte Anti-CDK4 Antikörper CDK4 zusätzlich zu drei assoziierten Hauptproteinen, p36PCNA, p35Cyclin D1 und p21. In SV40-transformierten VA13 Zellen, wohingegen CDK4 bei einem ähnlichen Spiegel im Vergleich zu nicht transformierten WI38 Zellen vorhanden ist, war kein nachweisbares PCNA, Cyclin D1, oder p21 in den Anti-CDK4 Immunpräzipitaten vorhanden. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Immunpräzipitaten mit Anti-CDK2, einer anderen Cyclin D-assoziierten katalytischen Kinaseuntereinheit, beobachtet. Cyclin D1 ist eines der CDK2-assoziierten Hauptproteine in WI38 Zellen, aber die Assoziation ist in SV40-transformierten VA13 Zellen nicht nachweisbar, obwohl der Spiegel von CDK2 ähnlich oder leicht höher in den transformierten Zellen ist. Auch war der Spiegel von CDK2-assoziiertem p21 in transformierten Zellen reduziert, aber ist bei einem nachweisbaren Spiegel vorhanden.
  • Verschiedene zusätzliche normale diploide Humanfibroblastzell-Linien und ihre SV40-transformierten Derivate wurden untersucht. HSF43, eine diploide Fibroblastzell-Linie, abstammend von neonataler Vorhaut, und CT10-2C-TI (hier im nachfolgenden als CT10 bezeichnet), wurde aus HSP43 erhalten durch Einführung eines Plasmids, enthaltend das SV40 große Tumorantigen, abgeleitet von einem Rous Sarkom Virus (RSV) Promotor (Ray et al., J. Cell Biochem. 42: 13–31 (1990)). Das Muster von Untereinheitszusammensetzung und Dissoziation der normalen und transformierten Zellen war sehr ähnlich zu demjenigen, beobachtet in den WI38 und VA13 Zellen. Es wurde kein Cyclin D1 in Anti-CDK4, Anti-CDK2 und Anti-CDC2 Immunpräzipitaten, hergestellt aus T-transformierten CT10 Zellen, gesehen, aber es war in den HSF43 Zellen offenkundig. Reziprok wurde CDK4 nicht in Anti-Cyclin D1 Präzipitaten in CT10 Zellen gesehen. CDK4-assoziiertes PCNA und p21 wurden auch nicht in CT10 nachgewiesen. p21 in den T-transformierten Zellen erschien ersetzt zu sein durch ein neu identifiziertes p16 Protein wie in der VA13 Zell-Linie. Zusätzlich wurden im wesentlichen identische Ergebnisse auch von anderen Paaren von Humanfibroblastzell-Linien erhalten, IMR-90, eine normale diploide Humanlungenfibroblastzell-Linie und deren T-transformiertes Derivat IDH4 (Shay et al. Biochem. Biophys. Acta 1072: 1–7 (1992)) wie auch ein Paar von Affenzell-Linien, CV-1, eine pseudodiploide Nierenzell-Linie und deren SV40-transformiertes Derivat COS-1.
  • Zum weiteren Bestätigen der beobachteten Dissoziation von Cyclin D Komplexen in transformierten Zellen wurde Immunpräzipitation, gekoppelt mit Immunblottingexperimenten, durchgeführt unter Vermeiden potentieller Artefakte, die manchmal in Metabolismus-Markierungsexperimenten entstehen können. Gesamtlysate, hergestellt aus entweder nicht transformierten WI38 oder SV40-transformierten VA13 Zellen, wurden immungefällt mit einer Batterie von Antikörpern, elektrophoretisch getrennt und mit verschiedenen sekundären Antikörpern geblottet. CDK4, CDK2 und PCNA wurden entweder nicht nachgewiesen (CDK4) oder waren bei dramatisch verringerten Spiegeln (CDK2 und PCNA) in Anti-Cyclin D1 Präzipitaten, abstammend von SV 40-transformierten Zellen, vorhanden. In jedem Fall bestätigte direktes Immunblotten, daß der absolute Spiegel von CDK4, CDK2 und PCNA ähnlich in normalen und transformierten Zellen ist. Reziprok, Cyclin D1 wurde nicht nachgewiesen, weder in Anti-CDK2 noch in Anti-CDK4 Präzipitaten, abstammend von transformierten VA13 Zellen. Die gleichen Ergebnisse wurden auch von jedem der anderen Paare von Zell-Linien, HSF43 und CT10, erhalten.
  • (ii) Untereinheitsneuanordnung von Cyclin A und B Komplexen in transformierten Zellen
  • Die Untereinheitszusammensetzung von Cyclin A Komplexen in nicht transformierten WI38 Zellen und SV40 transformierten VA13 Zellen wurde untersucht. Wie zuvor beschrieben assoziiert Cyclin A mit p36PCNA, p33CDC2, p33CDK2 und p21 in WI38 Zellen. In SV40-transformierten VA13 Zellen erhöhte sich der Spiegel von sowohl Cyclin A selbst wie Cyclin A-assoziiertem CDC2/CDK2 annähernd dreifach. Reziprok, der Spiegel von CDC2- und CDK2-assoziiertem Cyclin A ist auch zwei- bis dreifach erhöht.
  • Der Spiegel von Cyclin A-assoziiertem p21, wie durch Immunpräziptation von 35S Methioninmarkierten Zell-Lysaten bestimmt, ist in VA13 Zellen reduziert im Vergleich zu WI38 Zellen. Ein geringer Spiegeln von p21 ist auch in den Immunpräzipitaten, hergestellt aus VA13 Zellen unter Verwenden von Antiseren gegen CDK2, dem katalytische Hauptpartner von Cyclin A, vorhanden. Übereinstimmend, die gleichen Ergebnisse wurden erhalten unter Verwenden von HSF43 und CT10 Zellen, zusätzlich zu normalen IMR-90 Zellen gegenüber ihren T-transformierten IDH Zellen, und Affen CV-1/COS-1 Paarzell-Linien.
  • Eine Anzahl von anderen Polypeptiden wurde in Cyclin A Präzipitaten bemerkt, die spezifisch zu nicht transformierten Zellen oder zu transformierten Zellen sind. Beispielsweise wird ein Protein mit einer Molekülmasse von 42 kD als eine vorherrschende Bande in nicht transformierten WI38 oder HSF43 Zellen gesehen, aber nicht in transformierten VA13 oder CT10 Zellen. Umgekehrt, ein Polypeptid von 95 kD, das dem T Antigen entsprechen könnte, wird nur in trasformierten Zellen gesehen, wie ein 19 kD Polypeptid (im nachfolgenden diskutiert).
  • Die Untereinheitszusammensetzung von Cyclin B1 Komplexen in normalen und transformierten Zellen wurde auch untersucht. Gemeinsam mit Cyclin D1 wird der quaternäre Komplex von Cyclin B1/CDK/p21/PCNA in sowohl SV40-transformierten VA13 Zellen wie T-transformierten CT10 Zellen geändert im Vergleich zu nicht transformierten WI38 und HSF43 Zellen. Somit assoziiert weder PCNA noch p21 mit Cyclin B/CDK in den transformierten Zellen. Jedoch, wie angenommen, ist CDC2 mit Cyclin B1(p62) in VA13, CT10, 293 und HeLa Zellen assoziiert.
  • (iii) Cyclin und CDK Komplexe in anderen DNA Tumor Virus-transformierten Zellen
  • Zum Untersuchen, ob Cyclin-CDK Komplexe auch in anderen Humantumorzellen geändert sind, wurden Papillom Virus-enthaltende Cervix Karzinom HeLa Zellen und Adenovirus-transformierte primäre Nieren 293 Zellen im Hinblick auf die Untereinheitszusammensetzung von verschiedenen Cyclin und CDK Komplexen untersucht. Beide dieser Zell-Linien sind umfassend in biochemischen Untersuchungen des Säugerzellzyklus verwendet worden. Cyclin D1 wird bei einem niedrigen Spiegel in HeLa Zellen exprimiert und ist kaum nachweisbar in 293 Zellen. Die Untereinheitszusammensetzung von anderen Cyclin/CDK Komplexen jedoch kann untersucht werden. Die gut begründete Assoziation von CDC2-Cyclin B1, CDC2-Cyclin A und CDK2-Cyclin A wurden alle leicht in sowohl Hela wie 293 Zellen nachgewiesen. Kein p21 wurde jedoch in Anti-CDC2, Anti-CDK2, Anti-Cyclin A oder Anti-Cyclin B1 Immunpräzipitaten von weder HeLa noch 293 Zellen gesehen. Somit sind die quaternären Komplexe von Cyclin A/CDK/p21/PCNA und Cyclin BUCDK/p21/PCNA weder nicht zusammengefügt noch bei äußerst niedrigen Spiegeln in diesen DNA Tumor Virus-trasformierten Zellen vorhanden. Tatsächlich erschien ein neuer Cyclin A Komplex, in dem p21 durch ein Polypeptid von 19 kD ersetzt zu sein scheint. Ein ähnliches 19 kD Polypeptid ist in Anti-Cyclin A Präzipitaten von SV40 transformierten Human VA13, CT10, IDH4 und sogar Affen COS-1 Zellen vorhanden. Ferner ist in 293 und HeLa Zellen die Untereinheitszusammensetzung von CDK4 identisch zu derjenigen der T-Antigen transformierten Zellen. Cyclin D1 ist nicht mit CDK4 assoziiert (trivial zurechenbar dem Fehlen von Cyclin D aus der Zelle), aber PCNA und p21 fehlen auch. p21 ist durch p16 in HeLa und 293 Zellen ersetzt worden. Interessanterweise wird CDK4-assoziiertes p16 bei sehr niedrigen Spiegeln in nicht transformierten WI38 oder HSF43 Zellen nachgewiesen. Proteolytisches Spaltungskartieren zeigte in jedem Fall, daß das CDK4-assoziierte p16 von HeLa, 293, VA13 und WI38 Zellen identisch aber unterschiedlich zu p21 ist. Das Vorhandensein von p19 und p16 Zellen, transformiert durch drei verschiedene Viren, und p16 in nicht transformierten Zellen zeigt, daß sie nicht durch Virus codierte Proteine sind.
  • (iv) Änderung von Cyclin und CDK Komplexen in LiFraumeni Zellen
  • Fibroblasten von familiären Li-Fraumeni Patienten zeigen eine erhöhte Rate von sponatanen Abnormalitäten, einschließlich Aneuploidie und Immortalisierung (Li et al. Natl. Cancer Inst. 43: 1365– 1373 (1969) und Bischoff et al. Cancer Res 50: 7979–7984 (1990)). Diese Zellen enthalten nicht irgendwelche bekannten Viren; stattdessen sind heterozygote Einzelbasenmutationen des Tumorsuppressorgens p53 die einzige berichtete Keim-Linien-Änderung. Entkommen von Älterwerden und spontaner Immortalisierung von Li-Fraumeni Fibroblasten während fortgeführter Passage in vitro ist mit sekundärem Verlust der Wild-Typ p53 Allele assoziiert. 35S Methionin-markierte Zell-Lysate von einer spontan immortalisierten Li-Fraumeni Zell-Linie, LCS041 (Passage > 170), wurden immungefällt mit einer Mannigfaltigkeit von Antikörpern und durch SDS-PAGE analysiert. Der Spiegel von den meisten dieser Proteine in LCS041 Zellen ist ähnlich zu demjenigen in normalen diploiden Fibroblasten, wie durch Metabolismus-Markieren und Immunblotten bestimmt, ausgenommen, daß Cyclin A bei einem viel niedrigeren Spiegel exprimiert wird im Vergleich zu normalen Fibroblasten. Die Untereinheitszusammensetzung von Cyclin und CDK Komplexen ist grob abnormal in LCS041 Zellen. Cyclin B1-CDC2 Komplexe existieren wie in HeLa und 293 Zellen und sind nicht mit p21 oder PCNA assoziiert. Die Cyclin D1-CDK4 Assoziation ist reduziert zu einem kaum nachweisbaren Spiegel in LCS041 Zellen, und sowohl PCNA wie p21 fehlen. p21 wurde nicht in irgendeinem der Cyclin-CDK Komplexe, untersucht in LCS041 Zellen nachgewiesen und schien nicht durch p16 oder p19 Proteine, wie in T-Antigen-transformierten Fibroblasten auftritt, ersetzt zu sein. Der Spiegel von PCNA, assoziiert mit Cyclin-CDK Komplexen, ist auch in jedem Fall dramatisch reduziert. Direktes Immunblotten zeigte, daß der Überfluß von PCNA in LCS041 Zellen höher ist im Vergleich zu normalen Fibroblasten, aber PCNA ist dramatisch reduziert oder fehlt völlig in Immunkomplexen, isoliert mit Anti-CDC2, CDK2, CDK4, Cyclin A, Cyclin B1 und Cyclin D1. Im wesentlichen identische Ergebnisse wurden auch durch Verwendung einer anderen Li-Fraumeni Zell-Linie, LCS087, erhalten.
  • III. KLONIEREN VON p16 UND INHIBITOR VON CDK4
  • Das Zwei-Hybrid Screeningsystem (Fields et al. Nature 340: 254 (1989)) wurde unter Suchen nach Proteinen verwendet, die mit Human CDK4 in Wechselwirkung treten könnten, und genauer unter Isolieren eines cDNA codierenden p16. Zwei-Hybrid Durchmustern beruht auf Rekonstituieren eines funktionellen GAL4 Aktivators von zwei separaten Fusionsproteinen: die GAL4 DNA-bindende Domäne, fusioniert an CDK4, GAL4db-CDK4, und die GAL4 Aktivierungsdomäne, fusioniert an die Proteine, codiert durch HeLa cDNAs, GAL4ad-cDNA. YPB2 wurde als die Empfängerhefe verwendet, da sie ein Stamm ist, der zwei Chromosomengene unter der Kontrolle von zwei unterschiedlichen GAL4-abhängigen Promotoren enthält: HIS3 und LacZ. YPB2 wurde mit einer Mischung von zwei Plasmiden transformiert, die die GAL4db-CDK4 und die GAL4ad-cDNA Fusionen codieren; verschiedene Klone wurden erhalten, die in der Abwesenheit von Histidin wuchsen, und die sich blau in der Anwesenheit von β-Gal färbten. Aus DNA Sequenzierungsdaten wurde festgestellt, daß jeder der positiven Klone von dem gleichen Gen abstammte, obwohl eine Gruppe mRNAs mit einem kürzeren 3' Ende darstellte. Die Sequenz dieser cDNAs enthielten in Phase mit dem GAL4ad ein offenes Leseraster, ein Protein von 148 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 15845 Daltons codierend (siehe SEQ ID Nr. 3 und 4). Auf dieses Protein wird hier im nachfolgenden als INK4 (Inhibitor von CDK4; siehe im nachfolgenden) Bezug genommen. Die Sequenz von p16INK4 wurde mittels Standardverfahren mit denjenigen, vorhanden in den gegenwärtig verfügbare Datenbanken, verglichen, und es wurden keine signifikanten Homologien festgestellt.
  • Zum Untersuchen, ob p16INK4 spezifisch an CDK4 binden würde, wurde YPB2 mit der GAL4ad-p16INK4 Fusion cotransformiert wie auch mit verschiedenen Ziel GAL4db Fusionskonstruktionen, enthaltend cdc2, CDK2, CDK4, CDK5, PCNA und Snfl (eine Spaltungshefekinase). Transformierte Zellen wurden mit und ohne Histidin plattiert. Nur die GAL4db-CDK4 Fusion war in Wechselwirkung mit GAL4ad-p16INK4 zu einem Ausmaß, das Wachstum in der Abwesenheit von Histidin erlaubte, was angab, daß dieses Paar von Fusionsproteinen spezifisch einen funktionellen GAL4 Aktivator, fähig zum Erhöhen der Expression des HIS3 Gens, rekonstituierte. Das gleiche Ergebnis wurde erhalten, als die Fähigkeit, die Expression des β-Galactosidasegens zu transaktivieren, untersucht wurde.
  • Die Spezifität dieser Wechselwirkung wurde ferner in einem zellfreien System gezeigt durch Mischen von in vitro translatierten (35S)-markierten CDKs mit einem gereinigten bakteriell-hergestellten Fusionsprotein, bestehend aus Glutathion-S Transferase (GST), gekoppelt an p16INK4 (17). Die GST-p16INK4 Fusion wurde gewonnen durch Binden an Glutathion-Sepharose Kugeln, und die Assoziation jedes CDK wurde durch Gelelektrophorese analysiert. Übereinstimmend mit den vorhergehenden Beobachtungen band GST-p16INK4 viel wirksamer an CDK4 als an cdc2, CDK2 oder CDK5.
  • Weil das vorhergesagte Molekulargewicht von p16INK4 nahe zu 16 Kd ist, wurde die Identität von p16INK4 als das CDK4-assoziierte p16 Protein, festgestellt in transformierten Zell-Linien (siehe zuvor), bestimmt. Zwei in vitro Translationsprodukte von 15 KD und 17 KD wurden aus der p16INK4 cDNA erhalten. Diese Produkte wie auch das CDK4-assoziierte p16 Protein aus HeLa Zellen wurden nur N-Chlorsuccinimid behandelt. Das NCS-proteolytische Teilmuster des 17KD cDNA INK4-abstammenden Produkts war sehr ähnlich zu dem Muster, erhalten mit dem CDK4-assoziierten p16 Protein aus HeLa Zellen, was sehr nahelegt, daß die p16 INK4 cDNA tatsächlich p16 entspricht. Teilverdauung mit V8 Protease des 17 KD cDNA INK4-abstammenden Produkts und p 16 ergaben auch ähnliche Muster. Es ist interessant, zu bemerken, daß das p16INK4 Protein, überexprimiert in Insektenzellen, eine elektrophoretische Mobilität von 15 KD hat, und dessen NCS proteolytische Karte ist identisch zu derjenigen, erhalten mit dem 15 KD cDNA abstammenden Produkt. Dieses schlägt vor, daß das tatsächliche p16INK4, festgestellt in Humanzellen, und das 17 KD in vitro Translationsprodukt posttranslational modifizierten Proteinen entsprechen. Die Tatsache, daß das p16INK4 Protein, überexprimiert in Insektenzellen, mit CDK4 in Wechselwirkung tritt, schlägt vor, daß diese Modifikation nicht wesentlich für die Wechselwirkung ist (siehe im nachfolgenden) Die Identität zwischen p16INK4 und dem CDK4-assoziierten Protein p16 wurde ferner bestätigt unter Verwenden von Antikörpern, gerichtet gegen das gereinigte GST-p16INK4 Fusionsprotein. Verschiedene Humanzell-Linien wurden für dieses Experiment verwendet: eine normale Zell-Linie WI38, abstammend von normalen Lungenfibroblasten, die VA13 Zell-Linie, abstammend von WI38 durch Transformation mit dem SV40 T-Antigen, und Hela Zellen. Wie zuvor ausgeführt, zeigten Anti-CDK4 Immunpräzipitate von WI38 die Assoziation von CDK4 mit Cyclin D1, PCNA, p21 und p16. Zum Unterschied, in VA13 und HeLa Zellen ist CDK4 nur mit p16 assoziiert. Anti-p16INK4 Immunpräzipitate enthielten ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 16 KD, das leicht nachweisbar in den zwei transformierten Zell-Linien, VA13 und HeLa, war, aber zu einem geringeren Ausmaß in der normalen Zell-Linie WI38. Dieses Protein hatte nicht nur die gleiche elektrophoretische Mobilität wie das p16 Protein, coimmungefällt mit Anti-CDK4 Serum, sondern hatte auch ein identisches NCS proteolytisches Teilmuster. Zusätzlich zu p16INK4 wurde ein Protein von 33 Kd in Anti-p16 Coimmunpräzipitaten beobachtet, das durch V8-proteoytisches Kartieren gezeigt wurde, identisch zu CDK4 zu sein.
  • Northern Analyse der Transkripte, vorhanden in WI38 und VA13 Zellen zeigte, daß die p16INK4 mRNA etwa viele Male weniger im Überfluß in WI38 Zellen im Vergleich zu VA13 Zellen war. Dieser Unterschied entsprach annähernd dem beobachteten Unterschied in der Menge von p16 Protein zwischen den zwei Zell-Linien, was die Möglichkeit vorschlägt, daß p16INK4 Expression bei einem Transkriptions- oder post-Transkriptionsspiegel reguliert werden könnte. Tatsächlich konnte in drei nicht durch Virus transformierten Zell-Linien die Expression von p16INK4 nicht nahgewiesen werden, selbst nach Überaussetzen des Gels.
  • Zum Untersuchen der biochemischen Konsequenzen der Wechselwirkung von p16INK4 mit CDK4 sind aktive CDK4-Cyclin D Komplexe in vitro durch Standardprotokolle rekonstituiert worden (Kato et al. Genes Der 7: 331 (1993) und Ewen et al. Cell 73: 487 (1993)). Die drei relevanten Komponenten CDK4, p16INK4 und Cyclin D1 wurden in Bakulovirus-infizierten Insektenzellen exprimiert. Extrakte wurden aus Metabolismus(35S)-markierten Insektenzellen, die separat p16INK4, CDK4 oder Cyclin D1 überexprimierten, wie auch aus Zellen, die sowohl CDK4 wie Cyclin D1 überexprimierten, hergestellt. Als Reaktion auf Erhöhen von Mengen von p16INK4, entsprechend Verringerungen in der Fähigkeit von CDK4, zu phosphorylieren, wurde Rb beobachtet. Diese Inhibierung korrelierte mit der Assoziation zwischen p16INK4 und CDK4, wie durch Immunpräzipitation nachgewiesen. Keine Inhibierung wurde beobachtet, als CDK2-Cyclin D2 Komplexe in einem ähnlichen Assay verwendet wurden. Zum Bestätigen, daß die Inhibierung von CDK4 auf p16INK4 beruht, wurde ein His-versehenes p16INK4 Fusionsprotein (His-p16INK4) erzeugt, eine aminoterminale Extension von 20 Aminosäuren, enthaltend einen Trakt von 6 Histidinresten, zu haben. Dieses Fusionsprotein wurde in Bakulovirus-infizierten Insektenzellen überexprimiert und wurde durch die Hochaffinitätsassoziation des Histidintrakts an Nickel-Agarosekugeln gereinigt. Die His-p16INK4 Proteinpräparation wurde gezeigt, > 90% rein zu sein und inhibierte die Aktivität des CDK4-Cyclin D1 Komplexes unter Bedingungen, ähnlich zu denjenigen, verwendet für Inhibierung durch die Gesamtlysate.
  • IV. VERWENDUNGEN DER ERFINDUNG
  • Basierend auf hier beschriebener Arbeit ist es möglich, geänderte Komplexe von Cyclinen, CDK, PCNA, p21, p19 und p16 in Zellen, erhalten von einem Gewebe oder biologischer Probe, wie Blut, Urin, Fäkalien, Schleim, Speichel oder Biopsie (einschließlich zytologische Präparationen), nachzuweisen. Dieses hat Potential für Verwendung für diagnostische und prognostische Zwecke, weil es beispielsweise eine offenkundige Verbindung zwischen Änderung einer Untereinheitszusammensetzung von Zusammensetzung von Komplexen und Zelltransformation oder abnormer Zellproliferation gibt. Hier beschriebene diagnostische und therapeutische Verfahren können verwendet werden, den Krankheitszustand eines Individuums oder Wahrscheinlichkeit von Entwickeln eines Zustandes, verbunden mit oder anders angezeigt durch derartige Neuanordnungen von Komplexuntereinheiten, einzuschätzen und Therapiewirksamkeit zu kontrollieren (durch Untersuchen der Wirkung eines Arzneimittels oder von Arzneimitteln auf Untereinheitneuanordnung).
  • Es kann beispielsweise ein Mittel entwickelt werden, daß die Wechselwirkungen zwischen CDKs, Cyclinen, PCNA und niedrigmolekulargewichtigen Polypeptiden (wie p21, p19 und p16) erkennt. Das Mittel kann dann in Kontakt gebracht werden mit der Probe von Zellen, für die der Transformationszustand zu testen ist; Vorhandensein von bestimmten Untereinheiten in einem Komplex zeigt Transformation an. Beispielsweise zeigt ein CDK4-p16 Komplex Transformation an, wie es ein Cyclin A-p19 Komplex tut. Alternativ können Mittel, die verschiedene Untereinheiten erkennen, in Verbindung verwendet werden, das Vorhandensein von Wechselwirkungen unter den Untereinheiten zu bestimmen. Beispielsweise kann ein Mittel, das p21 erkennt, in Verbindung mir einem Mittel verwendet werden, das ein Cyclin oder eine Cyclinkinase erkennt, unter Bestimmen, ob p21 mit entweder dem Cyclin oder der Cyclinkinase komplexiert ist.
  • Antikörper, spezifisch reaktiv mit Verbindungen der quaternären Komplexe, können unter Verwenden bekannter Verfahren hergestellt werden, zu verwenden als Mittel in diesen Verfahren. Beispielsweise können Antiseren hergestellt werden durch Einspritzen einem geeigneten Wirt (beispielsweise Kaninchen, Mäuse, Ratten, Schweine) das D-Typ Cyclin, gegen das Antiseren gewünscht ist, und Abziehen von Blut von dem Wirtstier nach ausreichender Zeit für Antikörper, sich entwickelt zu haben. Monoklonale Antikörper können auch hergestellt werden unter Verwenden von bekannten Verfahren. Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); Hallow, E. und D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1988). Antikörper, spezifisch reaktiv mit CDK5, CDK4 und anderen CDKs im allgemeinen, p21, p19, p16 und Cyclinen können auch unter Verwenden von bekannten Techniken hergestellt werden.
  • In einer veranschaulichenden Ausführungsform sind Antikörper gegen den CDK4/p 16 Komplex gerichtet. Zum Erleichtern der Herstellung derartiger Komplexe in immunogener Form kann der CDK4/p16 Komplex durch chemisches Vernetzen erzeugt werden. In einer anderen Ausführungsform wird ein CDK4/p16 Fusionsprotein erzeugt unter Verwenden von Einzelketten-Antikörper-Technologie unter Einführen einer nicht strukturierten Polypeptid-Linkerregion zwischen die Polypeptidsequenzen, abstammend von jedem der Proteine. Dieser Linker kann erhöhte Flexibilität des Fusionsproteins erleichtern, was jeder Untereinheit ermöglicht, frei mit der anderen in Wechselwirkung zu treten, sterische Hinderung zwischen den zwei Fragmenten zu reduzieren, wie auch zu ermöglichen, daß angemessenes Falten jedes Fragments auftritt. Der Linker kann von natürlichem Ursprung sein, wie eine Sequenz, bestimmt, als statistisches Coil zwischen zwei Proteindomänen vorhanden zu sein. Alternativ kann der Linker von synthetischem Ursprung sein. Beispielsweise kann die Sequenz (Gly4Ser)3 als ein synthetischer nicht strukturierter Linker verwendet werden. Linker dieses Typs sind in Huston et al. (1988) PNAS 85: 4879 und U.S. Patent Nr. 5091513 beschrieben. Somit können immugene Komplexe, die dem CDK4/p16 Komplex ähneln, erzeugt werden und anschließende Antikörper isoliert werden, die den Komplex erkennen, aber nicht die isolierten Untereinheiten.
  • In noch einer anderen Ausführungsform zieht die gegenwärtige Erfindung insbesondere Assays und Kits zum Nachweisen von p16 Spiegeln in Zellen in Betracht. Antikörper, spezifisch für p16 (wie hier beschrieben), oder Nucleinsäuresonden, gerichtet auf Nachweisen von mRNA Spiegeln von p16 Transkripten, können verwendet werden, transformierte Zellen nachzuweisen. Wie hier zuvor beschrieben, ist der Spiegel von p16 mRNA und wahrscheinlich p16 Protein in transformierten Zellen relativ zu nromalen Zellen erhöht. Somit ist Nachweisen des Spiegels von p16 Gen Expression diagnostisch geeignet beim Bestimmen des Vorhandenseins von transformierten Zellen. In einer veranschaulichenden Ausführungsform können in situ Hybridisierungsassays durchgeführt werden unter Verwenden von Nucleinsäuresonden, gerichtet auf p16 Sequenzen und erzeugt durch Standardprotokolle (siehe beispielsweise the Taub et al. U.S. Patent Nr. 4820630; Falkow et al. U.S. Patent Nr. 4358935 und das Bresser et al. U.S. Patent Nr. 5225326).
  • Ein bevorzugter Assay der gegenwärtigen Erfindung ermöglicht, daß quantitative Unterschiede festgestellt werden in p16 Spiegeln zwischen transformierten Zellen, die gekennzeichnet sind durch p16/CDK4 Komplexe, und nicht transformierten Zellen. Kurz, Zellen, entweder als Einzelzellsuspensionen oder als Gewebeschnitte, können auf festen Trägern, wie Glasobjektträger, abgelagert werden. Alternativ werden Zellen in eine Einzelzellsuspension von etwa 105–106 Zellen pro ml gebracht. Die Zellen werden fixiert durch Wählen eines Fixiermittels, das die beste Raumauflösung der Zellen liefert und die optimale Hybridisierungswirksamkeit, wenn Nucleinsäuresonden verwendet werden, oder die optimale Bindungsaffinität und Spezifität, wenn Anti-p16 Abs verwendet werden.
  • Im Falle von Nucleinsäuresonden kann die Hybridisierung dann in der gleichen Lösung, die Fixierung bewirkt, durchgeführt werden. Diese Lösung enthält sowohl ein Fixiermittel wie ein chaotropes Mittel, wie Formamid. Auch eingeschlossen in dieser Lösung ist ein Hybridstabilisierungsmittel, wie konzentriertes Lithiumchlorid oder Ammoniumacetatlösung, ein Puffer, niedrigmolekulargewichtige DNA und/oder ribosomale RNA (abgeschätzt auf 50 Basen), nicht spezifisches Binden zu vermindern, und ein Porenbildungsmittel zum Erleichtern von Sondeneintrit in die Zellen. Nucleaseinhibitoren, wie Vanadylribonucleosidkomplexe, können auch eingeschlossen sein.
  • Zu der Hybridisierungslösung wird die p16 Sonde unter Hybridisieren mit einem Zielpolynucleotid hinzugefügt. Die bevorzugteste Sonde ist eine einzelsträngige Antisinn-Sonde. Für Hybridisierung an zelluläre mRNA wird eine Sonde von annähernd 75 bis 150 Basen an Länge verwendet. Die Hybridisierungslösung, enthaltend die Sonde, wird in einer Menge hinzugefügt, die ausreichend ist, die Zellen zu bedecken, wenn immobilisierte Zellen verwendet werden. Die Zellen werden dann bei einer optimalen Temperatur inkubiert.
  • Die Sonden können nachweisbar vor der Hybridisierungsreaktion markiert werden. Alternativ kann eine nachweisbare Markierung ausgewählt werden, die an das Hybridisierungsprodukt bindet. Sonden können mit irgendeiner nachweisbaren Gruppe für Verwendung beim Durchführen der Erfindung markiert werden. Derartige nachweisbare Gruppe kann irgendein Material mit einer nachweisbaren physikalischen oder chemischen Eigenschaft sein. Derartige nachweisbaren Markierungen sind auf dem Gebiet von Immunassays gut entwickelt worden, und allgemein kann beinahe jede Markierung, geeignet bei derartigen Verfahren, auf die gegenwärtige Endung angewendet werden. Besonders geeignet sind enzymatisch aktive Gruppen, wie Enzyme (siehe Clin. Chem., 22: 1243 (1976)), Enzymsubstrate (siehe Britische Patentschrift 1548741), Coenzyme (siehe U.S. Pat. Nr. 4230797 und 4238565) und Enzyminhibitoren (siehe U.S. Pat. Nr. 4134792), fluoreszierende Marker (siehe Clin. Chem., 25: 353 (1979), Chromophore, Lumineszenzverbindungen, wie chemilumineszente und biolumineszente Marker (siehe Clin. Chem., 25: 512 (1979)), spezifisch bindbare Liganden, proximal wechselwirkende Paare und Radioisotope, wie 3H, 35S, 32P, 125I und 14C.
  • In ähnlicher Weise können Anti-p16 Antikörper markiert und zum Nachweisen des Vorhandenseins von p16 Protein in Zellproben verwendet werden.
  • Die gegenwärtige Endung schließt auch ein Verfahren zum Durchmustern von Verbindungen oder Molekülen auf ihre Fähigkeit, die Transformation einer Zelle zu inhibieren oder zu unterdrücken, ein. Eine Verbindung oder Molekül, zu untersuchen im Hinblick auf dessen Fähigkeit, Transformation zu inhibieren, wird mit den Zellen in Kontakt gebracht unter Bedingungen, angemessen für Eintritt der Verbindung oder des Moleküls in die Zellen. Transformation der Zelle führt zu selektiver Neuanordnung von Untereinheiten in den Cyclinkomplexen. Vergleich der Rate oder Ausmaß von Neuanordnung in der Anwesenheit der Verbindung oder des Molekül, das untersucht wird, mit demjenigen einer angemessenen Kontrolle (beispielsweise der gleiche Typ von Zellen ohne hinzugefügtes Testarzneimittel) zeigt die Fähigkeit oder Unfähigkeit der Verbindung oder des Moleküls, Untereinheitsneuanordnung zu inhibieren. Arzneimittel, die Untereinheitsneuanordnung inhibieren, sind auch der Gegenstand dieser Erfindung.
  • Beispielsweise kann Proteinkinase-D Typ Cyclinkomplexbildung in einer direkten Weise verhindert werden, beispielsweise durch Einführen in Zellen ein Arzneimittel oder anderes Mittel, das die Proteinkinase oder das D-Typ Cyclin bindet oder anders mit der physikalischen Assoziation zwischen dem Cyclin und der Proteinkinase in Wechselwirkung tritt, sie aktiviert (beispielsweise durch Einfügung) oder die katalytische Aktivität des Enzyms zerstört. Dieses kann bewirkt werden durch Antikörper, die die Kinase oder das Cyclin oder ein Peptid oder eine niedrigmolekulargewichtige organische Verbindung binden, die ähnlich zu dem endogenen D-Typ Cyclin die Proteinkinase bindet, aber deren Bindung nicht zur Aktivierung des Enzyms führt, oder dazu führt, das es desaktiviert wird oder abgebaut wird. Peptide und kleine organische Verbindungen, die für diesen Zweck zu verwenden sind, können entworfen werden, basierend auf Analyse der Aminosäuresequenzen von D-Typ Cyclinen, Reste einzuschließen, die notwendig für Binden sind, und Reste auszuschließen, deren Vorandensein zu Aktivierung führt. Dieses kann durchgeführt werden beispielsweise durch systematisches Kartieren der Bindungsstelle(n) und Entwerfen von Molekülen, die erkennen oder anders mit der(den) Stelle(n), notwendig für Aktivierung, assoziieren, aber nicht Aktivierung erzeugen. Wie hier beschrieben, gibt es Differentialexpression in Geweben von D-Typ Cyclinen wie auch den Komplexen, gebildet mit CDKs. Somit ist es möglich, selektiv mitotische Fähigkeit von Zellen zu verringern durch die Verwendung eines Mittels (beispielsweise ein Antikörper oder Antisinn- oder anderes Nucleinsäuremolekül), das entworfen ist, mit der Aktivität und/oder Spiegel eines Komplexes, umfassend ein bestimmtes D Typ Cyclin und CDK, zu interferieren (inhibieren). Beispielsweise könnte beim Behandeln von Tumoren, einschließend das zentrale Nervensystem oder andere nicht-hämatopoietische Gewebe, von Mitteln, die selektiv Cyclin D1 inhibieren, erwartet werden, daß sie besonders geeignet sind, weil D1 gezeigt worden ist, differentiell exprimiert zu werden (exprimiert bei besonders hohen Spiegeln in Zellen von neuralem Ursprung).
  • Bildung von Komplexen von D-Typ Cyclin, CDK, PCNA und p21, kann auch in einer ähnlicher Weise verhindert werden, wie derjenigen, zuvor beschrieben, zum Inhibieren von CDK/D-Typ Cyclin Komplexbildung. Das heißt, Komplexbildung kann direkt verhindert werden (beispielsweise durch ein Arzneimittel oder Mittel, das eine Komponente des Komplexes bindet oder anders mit der physikalischen Assoziation von Komplexkomponenten in Wechselwirkung tritt). Komplexbildung kann auch in einer indirekten Weise verhindert werden, wie durch Verhindern von Transcription und/oder Translation von DNA und/oder RNA, codierend eine Komponente des Komplexes in einer ähnlichen Weise zu derjenigen, zuvor beschrieben, zum Blockieren von D-Typ Cyclin-Protein Kinase Komplexbildung. Alternativ kann Komplexbildung indirekt verhindert werden durch Abbauen eines oder mehrerer seiner Bestandteile.
  • Beispielsweise kann ein Arzneimittel, das selektiv die Fähigkeit von Cyclin D2 oder Cyclin D3 inhibiert, einen quaternären Komplex zu bilden, verwendet werden. Jeder der anderen Komplexbestandteile ist auch ein Ziel, dessen Funktion oder Verfügbarkeit für Komplexbildung geändert werden kann. Beispielsweise können CDK2, CDK4, CDK5 und andere Cyclin abhängige Kinasen, die mit einem D-Typ Cyclin einen Komplex bilden, inhibiert oder verbessert werden, entweder in bezug auf ihre Funktion oder ihre Verfügbarkeit für Einfügung in den quaternären Komplex. Arzneimittel oder Mittel, die PCNA Funktion oder Verfügbarkeit ändern, oder die p21 Funktion oder Verfügbarkeit ändern, oder p16 Funktion oder Verfügbarkeit, können auch verwendet werden, Zellteilung zu inhibieren oder zu erhöhen. In dem Fall von jedem quaternären Komplexbestandteil ist es möglich, in Zellen ein Mittel einzuführen, wie ein kleines Peptid oder anderes organisches Molekül, das den Komplexbestandteil in Bezug auf Binden nachahmt, aber dem dessen aktive Regionen) fehlt(fehlen), was zur Bildung von Komplexen führt, denen die Aktivität oder Wechselwirkungen des normal-hergestellten Komplexes fehlen.
  • Direkte Inhibierung von Komplexbildung kann auch nichtspezifisch sein (d. h. kann auf die Mehrheit von Zellen oder allen Zellen wirken, in denen der D-Typ Cyclin enthaltende quaternäre Komplex gebildet wird). Dieses kann beispielsweise durchgeführt werden durch Einführen in Zellen ein Arzneimittel, das Funktion oder Verfügbarkeit einer üblichen Komponente des quaternären Komplexes inhibiert (beispielsweise PCNA), oder durch Einführen einer Mischung oder Cocktail von Arzneimitteln, die zusammen alle D-Typ Cycline inhibieren.
  • Alternativ, indirekte Inhibierung von quaternärem Komplex ist möglich. Das heißt, ein Arzneimittel oder Mittel, das wirkt, weniger von einem Komplexbestandteil verfügbar zu erzeugen (beispielsweise D-Typ Cyclin, CDK, PCNA oder p21), kann verwendet werden. Derartige Arzneimittel oder Mittel schließen diejenigen ein, wie Anti-Sinn Oligonucleotide, die Transkription oder Translation blockieren, und diejenigen, wie ein Enzym, die Komplexbestandteile abbauen, entweder vor oder nach ihrem Einbau in einen quaternären Komplex.
  • Arzneimittel oder Mittel, geeignet bei dem gegenwärtigen Verfahren zum Ändern, insbesondere Inhibieren von Zellzyklusstart und somit Zellteilung, können existierende Verbindungen oder Moleküle (beispielsweise kleine organische Moleküle, Antisinnoligonucleotide und anorganische Substanzen) oder Materialien, entworfen für Verwendung bei dem gegenwärtigen Verfahren, sein. In jedem Fall können derartige Arzneimittel durch das Verfahren der gegenwärtigen Erfindung identifiziert werden.
  • Bei einer besonderen Ausführungsform der gegenwärtigen Endung können Wechselwirkung-Trap-Assays verwendet werden, Mittel zu identifizieren, die fähig sind, Komplexbildungen mit Cyclinen, insbesondere D-Typ Cyclinen, wie auch p16/CDK4 Komplexe zu zerstören. Beispielsweise können zwei Hybridassays, zuvor beschrieben, in derartigen Assays verwendet werden. Bei einer veranschaulichenden Ausführungsform wird GAL4 Aktivator Fusionskonstruktion, wie hier beschrieben, enthaltend CDK4 und p16, verwendet zum Messen der Fähigkeit eines Kandidatenmittels, die Bildung von CDK4/p16 Komplexen zu zerstören. Zellen, transfektioniert mit jedem der Konstruktionen, werden in Kontakt gebracht mit einem Kandidatenmittel, und der Expressionsspiegel eines Reportergens (wie β-Galactosidase, wie zuvor beschrieben) wird nachgewiesen. Eine Verringerung an Expression kann einen Inhibitor des Komplexes anzeigen.
  • Ferner kann ein Drei-Hybridassay vorgebildet werden zum Nachweisen von Inhibitoren von CDK4/p16, die nicht CDK/Cyclin Komplexe inhibieren. Beispielsweise können Konstruktionen erzeugt werden, in denen p16 und ein D-Typ Cyclin jeweils Teil von Fusionsproteinen sind, die die DNA Bindungsdomänen von diskreten Proteinen bilden, die verschiedene DNA Sequenzen erkennen. CDK4 wird dann als Fusionsprotein mit einer aktivierenden Domäne erzeugt, somit führt dessen Wechselwirkung mit dem p16 Fusionsprotein zu Expression eines Reportergens, während dessen Wechselwirkung mit dem Cyclin D Fusiosprotein Expression von unterschiedlichem Reportergen antreibt. Beispielsweise kann das p16 Fusionsprotein Expression eines Luciferasegens antreiben, während die Cyclin D Konstruktion Expression von einem Arzneimittel-Resistenz-Marker liefert. Somit gibt in der Anwesenheit eines Mittels, welches p16/CDK4 Wechselwirkungen inhibiert, die Expression des Arzneimittel-Resistenz-Markers an, daß Cyclin D/CDK4 Komplexe nicht zerstört werden.
  • Ferner, unter der Annahme der Inhibitorfähigkeit von p16 zieht die gegenwärtige Erfindung ferner in Betracht die Verwendung von derartiger Kenntnis zum Erzeugen von peptidomimetrischen Analogen von bestimmten Teilen von p16, die als anti-proliferative Mittel verwendet werden können. Die CDK4 Bindungswechselwirkungen mit p16 können leicht festgestellt werden, wie durch Verwendung von Mutagenese und dem zuvor beschriebenen Wechselwirkung-Trap-Assay. In ähnlicher Weise können Peptidfragmente, abstammend von p16, im Hinblick auf ihre Fähigkeit, CDK4/Cyclin Komplexe, wie zuvor beschrieben, zu zerstören, untersucht werden.
  • Sowie einmal ein angemessenes Arzneimittel oder Mittel identifiziert worden ist, kann es einem Individuum verabreicht werden, insbesondere einem Menschen oder anderem Vertebraten, durch irgendeinen Weg, wirksam beim Einführen des Arzneimittels oder Mittels in Zellen in ausreichender Menge, die gewünschte Wirkung zu haben (d. h. Änderung von Zellteilung). Beispielsweise kann ein ausgewähltes Arzneimittel intravenös, intramuskulär, durch direkte Injektion in einen Tumor über den gastrointestinalen Trakt (beispielsweise oral), intraperitoneal oder intranasal verabreicht werden. In einigen Fällen ist ex vivo Verabreichung angemessen (beispielsweise in Fällen, wo Blut oder Knochenmark aus dem Körper entfernt wird, behandelt und zu dem Körper zurückgeführt wird).
  • Allgemein, das Azneimittel oder Mittel, verwendet, Zellteilung zu ändern, wird in einer Formulierung eingeschlossen werden, die auch einen physiologischen Träger einschließen kann (beispielsweise einen Puffer oder physiologische Kochsalzlösung), Stabilisatoren, ein Adjuvans und Aromastoffe. Die Menge des zu verabreichenden Arzneimittels kann empirisch bestimmt werden und wird in Abhängigkeit von Betrachtungen, wie dem Alter, Gewicht und Höhe des Empfängers und der Schwere der zu behandelnden Krankheit variieren.
  • Antikörper, spezifisch reaktiv mit D-Typ Cyclinen der gegenwärtigen Erfindung, können auch unter Verwenden bekannter Verfahren hergestelt werden. Beispielsweise können Anti-D Typ Cyclin Antiseren hergestellt werden durch Spritzen eines angemessenen Wirts (beispielsweise Kaninchen, Mäuse, Ratten, Schweine) mit dem D-Typ Cyclin, gegen das Antiseren gewünscht sind, und Abziehen von Blut von dem Wirtstier nach ausreichender Zeit für Antikörper, sich gebildet zu haben. Monoclonale Antikörper können auch unter Verwenden bekannter Techniken hergestellt werden. Sammbrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); Hallow, E. und D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1988). Antikörper, spezifisch reaktiv mit CDK5, können auch unter Verwenden bekannter Verfahren hergestellt werden.
  • Die gegenwärtige Erfindung schließt auch ein Verfahren zum Durchmustern von Verbindungen oder Molekülen im Hinblick auf ihre Fähigkeit ein, die Funktion eines Cyclins, insbesondere eines D-Typ Cyclins, zu inhibieren oder zu unterdrücken, insbesondere ein D-Typ Cyclin. Beispielsweise können Mutantenzellen, wie hier beschrieben, in denen ein D-Typ Cyclin wie D1 oder D3 exprimiert wird, verwendet werden. Eine Verbindung oder Molekül, zu untersuchen auf dessen Fähigkeit, ein D-Typ Cyclin zu inhibieren, wird mit den Zellen in Kontakt gebracht unter Bedingungen, angemessen für Eintritt der Verbindung oder Molekül in die Zellen. Inhibierung des Cyclins führt zu Hemmung der Zellen oder einer verminderten Rate von Zellteilung. Vergleich der Rate oder Ausmaß von Zellteilung in der Anwesenheit der Verbindung oder von dem Molekül, das untersucht wird, mit Zellteilung einer angemessenen Kontrolle (beispielsweise der gleiche Zelltyp ohne hinzugefügtes Testarzneimittel) zeigt die Fähigkeit oder Unfähigkeit der Verbindung oder Molekül, das Cyclin zu inhibieren. Bestehende Verbindungen oder Moleküle (beispielsweise diejenigen, die in einer Fermentationsbrühe oder einer chemischen "Bibliothek" vorhanden sind) oder jene, entwickelt, die Cyclinaktivierung von dessen Proteinkinase zu inhibieren, können im Hinblick auf ihre Wirksamkeit unter Verwenden dieses Verfahrens durchgemustert werden. Arzneimittel, die D-Typ Cyclin inhibieren, sind auch der Gegenstand dieser Endung.
  • Die gegenwärtige Erfindung schließt auch ein Verfahren zum Durchmustern von Verbindungen oder Molekülen im Hinblick auf ihre Fähigkeit ein, Bildung des hier beschriebenen quaternären Komplexes zu ändern. Dieses Verfahren wird sehr auf die gleiche Weise durchgeführt wie das zuvor beschriebene Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen oder Molekülen, die ein D-Typ Cyclin inhibieren. Bei dem Gegenstand des Verfahrens wird die zu untersuchende Verbindung oder Molekül und Zellen, in denen D-Typ Cyclin enthaltender Komplex gebildet wird, kombiniert unter Bedingungen, angemessen für Auftreten von Komplexbildung und Eintritt der zu untersuchenden Verbindung oder Molekül in Zellen. Kompexbildung kann, wie hier beschrieben, bestimmt werden. Inhibierung eines Komplexbestandteils oder von Komplexbildung führt zu Hemmung der Zellen oder einer verminderten Rate von Zellteilung. Vergleich der Rate oder Ausmaß von Zellteilung in der Anwesenheit der zu testenden Verbindung oder Molekül mit der Rate oder Ausmaß in der Abwesenheit der Verbindung oder Molekül zeigt, ob sie eine Wirkung auf Zellteilung hat (d. h. Teilung zu einem geringeren Ausmaß in der Anwesenheit der zu testenden Verbindung oder Molekül als in dessen Abwesenheit ist ein Anzeichen dafür, daß die Verbindung oder Molekül ein Inhibitor ist. Arzneimittel oder Mittel, die Komplexbildung inhibieren, und als ein Ergebnis Zellteilung sind auch der Gegenstand dieser Erfindung.
  • Die gegenwärtige Erfindung wird jetzt durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die nicht als in irgendeiner Weise beschränkend anzusehen sind.
  • BEISPIEL 1
  • Demonstration, daß D-Typ Cycline mit vielfachen Proteinkinasen und dem DNA Replikations- und Reparaturfaktor PCNA Assoziierten sind
  • (i) Experimentelle Verfahren
  • Zellen
  • Diploide Humanlungenfibroblast WI38 Zellen wurden von der American Type Culture Collection bei Durchgang 13 erhalten und wurden in Dulbecco-Modified Eagle Medien, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, gezüchtet und zwischen Durchgängen 16–22 verwendet. 293 Zellen wurden in ähnlicher Weise kultiviert.
  • Antikörper
  • Zum Erhöhen von Anti-Cyclin D1 Antikörper wurde ein 609 bp DNA Restriktionsfragment, codierend 202 Aminosäurereste (–25 kDa) von Humancyclin D1 aminoterminaler Region (das NCol Fragment von Nucleotiden 143 bis 751 in 2 von Xiong et al., Cell 65: 691–699 (1991) und Current Biology 1: 362–364 (1991) in einen Phagen T7 Expressionsvektor, pET-3d (Studier, et al., Methods in Enzymology, 185: 60–89 (1990)) subkloniert und in E. coli Stamm BL21 (DE3) eingeführt. Bakterienextrakte wurden in Lysepuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 10% Glycerol) hergestellt durch Zerstören von Zellen mit Beschallung und Klären des Überstandes durch Zentrifugation bei 20000 g für 10 Minuten. Pellets, enthaltend unlösliches Cyclin D Protein, wurden in Lysepuffer, ergänzt mit 8 M Harnstoff resuspendiert, nach 30 Minuten Schütteln bei Raumtemperatur wurde die Suspension wiederum bei 20000 g 10 Minuten lang zentrifugiert. Pellets, enthaltend unlösliches Cyclin D Protein, wurden in SDS Probenpuffer resuspendiert und auf 10% SDS-Polyacrylamidgel getrennt. Das 25 kDa Cyclin D Protein wurde sichtbar gemacht und nach Färben des Gels mit 0,25 M KCl in dem Kühlraum ausgeschnitten. Gelschnitte wurden weiterhin zerkleinert durch wiederholte Passage durch eine 18 Gauge Nadel, und Cyclin D Protein wurde extrahiert durch Inkubieren der zerkleinerten Gelteilchen mit PBS, enthaltend 0,1% SDS, bei 42°C mehrere Stunden und für Ratteninjektion verwendet. Zum Affinitätsreinigen der Anti-Cyclin D1 Immunglobuline wurden bakteriell hergestellte p25 Proteine an das Reacti-Gel (6X) gemäß der Herstellervorschrift vernetzt. Die Affinitätssäule wurde mit Überschuß Volumen PBS, enthaltend 0,05% Tween-20, gewaschen, bevor und nachdem Rohserum auf die Säule angewendet wurde. Gebundene Immunglobuline wurden mit Glycin-NaCl(pH 2,5) in 1,5 M Tris-HCl, pH 8,5 unter sofortigem Neutralisieren der Antikörper eluiert. Zum Reduzieren des hohen Hintergrundes, erzeugt durch Immunglobulinproteine, wurde affinitätsgereinigtes Anti-Cyclin D1 an Protein A Agarosekugeln gemäß Harlow und Lane, Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1988) vernetzt. Auf Western Blots führt das Anti-Cyclin D1 Antiserum schwache Kreuzreaktion mit bakteriell hergestelltem Human Cyclin D2 durch, sehr dürftig mit bakteriell hergestelltem Humancyclin D3, und weist eine Einzelbande von Gesamt WI38 Zell-Lysaten nach. Bei den Immunpräzipitationen mit RIPA Puffer (0,1% SDS) sind mehr als 90% von Cyclin D1-assoziiertem p36, p33, p31 und p21 verschwunden, während die Menge von Cyclin D1 die gleiche zu sein blieb wie die in den Immunpräzipitationen mit NP40 (0,5%) Puffern.
  • Für Anti-CDK5 Antikörperherstellung wurde ein Peptid CYFSDFCPP, wobei die unterstrichenen Aminosäurereste der Carboxy-terminalen Region von CDK5 entsprechen, synthetisiert. Das Peptid wurde an Keyhole Limpet Hämocyanin (Pierce) gekoppelt, welches dann verwendet wurde, Kaninchen durch Standardprotokolle zu immunisieren (Green, et al., Cell 28: 477–487 (1982)).
  • Anti-Cyclin D3 Peptidantikörper wurde ähnlich gegen ein synthetisches Peptid CDELDOASTPTDVRDIDL gerichtet, wobei die unterstrichene Region der Carboxy-terminalen Region von Human Cyclin D3 entspricht. Das Kaninchen wurde später mit bakteriell hergestelltem Humancyclin D3 voller Länge stimuliert. Cyclin D3 spezifische Immunglobuline wurden auf einer Affinitätssäule gereinigt, in der die 17-Mer Cyclin D3 Peptide an das Reacti-Gel (6X) vernetzt wurden. Der affinitätsgereinigte Anti-Cyclin D3 Peptidantikörper führt keine Kreuzreaktion mit bakteriell hergestelltem Cyclin D1 oder D2 auf Western Blots durch und immunpräzipitiert nicht Cyclin D1 von WI38 Zell-Lysaten.
  • Das Antiserum gegen S. pombe p34cdc2 (G8) wurde zuvor beschrieben (Draetta, et al, Cell 50: 319– 325 (1987)). Human-autoimmunes Anti-PCNA Antiserum ist allgemein bekannt. Affinitätsgereinigter Anti-PCNA monoklonaler Antikörper, verwendet in Western-Blots, wurde von Boehringer Mannheim gekauft. Affinitätsgereinigter Anti-PCNA monoklonaler Antikörper, verwendet bei Immunpräzipitation, wurde von Oncogene Science gekauft. Anti-CDK2 Peptidantiserum war zuvor beschrieben (Pagno, et al., EMBO J 11: 961–971 (1992)) und führt keine Kreuzreaktion mit CDC2, CDK4 und CDK5 Polypeptiden durch. Anti-CDK4 Antiserum war gegen ein Fusionsprotein von Glutathion S Transferase (GST) und einen C-terminalen Teil von CDK4 gerichtet. Es führt keine Kreuzreaktion mit CDK2 und CDK5 durch.
  • (ii) Screenen von Human cDNA Expressionsbibliothek
  • Eine Human Hela Zellen cDNA Expressionsbibliothek, konstruiert in lambda ZAP II (#936201), war von Stratagene. Human p34cdc2 war hoch unlöslich, als aus Bakterien hergestellt. Das herkömmliche Antikörper Screeningverfahren (Young und Davies, Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 1194–1198 (1983)) ist nur geeignet, wenn es eine ausreichende Menge von löslichen rekombinanten Proteinen in Phagenplaques gibt. Das Screeningverfahren wurde deshalb modifiziert, eine Stufe einzuschließen, die die Verwendung von 6 M Guanidin einschloß, unter Solubilisieren rekombinanter Proteine, nachdem sie auf Nitrocellulosepapier übertragen worden sind, ein Verfahren, das anfänglich entwickelt wurde, erneut gefaltete rekombinante Proteine mit bestimmten Aktivitäten herzustellen (Vinson, et al., Gene Dev. 2: 801–806 (1988)). Zwei Millionen Phagenplaques aus der λZAP Π HeLa cDNA Bibliothek wurden mit Antiserum gegen S. pombe p34cdc2(G8) durchgemustert. Nach Überschichten von Phagenplaques mit IPTG-imprägnierten Nitrozellulosefiltern für 4 Stunden bei 42°C wurden die Filter von Kulturschalen entfernt und wurden dann mit 6 M Guanidin-HCL in einem Puffer, der 25 mM Hepes, pH 7,0, 0,50 mM NaCl, 2 mM DTT enthielt, 10 Min bei 25°C behandelt. Die Filter wurden frei von Guanidin mit Tris-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung vor Antikörperinkubation gewaschen. Dieses Verfahren verstärkte unser Antikörpernachweissignal umfassend, welches wahrscheinlich auf der Solubilisierung von bakteriell hergestellten Polypeptidpräzipitaten durch Guanidin beruhte. Die G8-positiven cDNA Klone, subkloniert in pBluescript SK Vektor (Stratagene) und sequenziert von beiden Richtungen unter Verwenden von ABI automatisiertem DNA Sequenzierer (Modell 373A). Für Seqenzhomologiesuche wurde das FASTA Programm verwendet (Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. 85: 2444–2448 (1988)).
  • (iii) Immunpräzipitation und Western-Blotting
  • Für Metabolismus-Markieren mit [35S]Methionin wurden subkonfluente (40–60%) Zellen zweimal mit vorgewärmten Markierungsmedien (Methionin-, Cystin-freies DMEM [ICN], ergänzt mit 10% dialysiertem fötalem Rinderserum, [GIBCO]), gewaschen. Nach 30 Minuten Inkubation mit den Markierungsmedien wurde [35S] Methionin (Trans35 S-Markierung, ICN) zu Medien hinzugefügt (annähernd 200 μCi/ml) und fortgeführt, vier bis sechs Stunden vor Lyse zu inkubieren. Alle Stufen von Immunpräzipitationen wurden in dem Kühlraum durchgeführt. Zellen von 40 bis 60% konfluenter 150 mM Schale wurden zweimal mit kaltem PBS gewaschen und in NP-40 Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, 0,5% NP-40, 1 mM PMSF, 25 μg/ml Leupeptin, 25 μg/ml Aprotinin, 1 mM Benzamidin und 10 μg/ml Trypsininhibitor) gekratzt und durch Rotieren 15 bis 30 Minuten lysiert. Kerne wurden durch Zentrifugation bei 15000 g 5 Minuten lang entfernt, und Lysate wurden vorgeklärt durch Inkubieren mit entweder Präimmunserum oder normalem Kaninchenserum und IgG Sorb (The Enzyme Center, Inc.) 20 bis 30 Minuten lang, gefolgt von einer 10 Minuten Zentrifugation bei 15000 g. Antikörper, vorgekoppelt an die Protein A Agarosekugeln (Pierce), wurde zu den geklärten Lysaten hinzugefügt und sechs bis acht Stunden inkubiert. Immunpräzipitate wurden drei- bis vierfach mit Lysepuffer bei Raumtemperatur gewaschen, in SDS Probenpuffer resuspendiert und auf SDS-Polyacrylamidgelen getrennt.
  • Für die 35S Methionin-markierten Präzipitate wurden Polyacrylamidgele (ausgenommen diejenigen für V8 proteolytische Kartierungsexperimente) mit 10% Eisessig und 30% Methanol 30 Minuten bis eine Stunde fixiert, durch Imprägnieren mit Autoradiographieverstärkern (Du Pont) 30 Minuten lang verstärkt und in Wasser 15 bis 30 Minuten lang gefällt. Verstärkte Gele wurden getrocknet und X-Röntgenfilmen bei –70°C ausgesetzt. Für Western-Blotting wurden Polypeptide auf ein Nitrozellulosefilter unter Verwenden eines SDE Electroblottierungssystems (Millipore) für 45 Minuten bei konstantem Strom von 400 mA übertragen. Das Filter wurde 1 bis 3 Stunden mit TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 137 mM NaCl, 0,1% Tween-20), enthaltend 5% Trockenmilch, neutralisiert, mit primärem Antikörper 4 Stunden bis über Nacht in TBST, enthaltend 5% Trockenmilch, inkubiert und 4mal 10 Minuten jeweils mit TBST gewaschen. Angemessene sekundäre Antikörper (1 : 10000 Verdünnung von entweder Meerettich Peroxidase gekoppeltem, Schaf Anti-Maus Ig oder Esel-Anti-Kaninchen Ig, Amersham) wurden mit Filtern für eine Stunde inkubiert, und spezifische Proteine wurden unter Verwenden eines verstärkten Chemilumineszenzsystems (ECL, Amersham) nachgewiesen.
  • (iv) Proteolytisches Teilpeptidkartieren
  • Human Cyclin D1, Cyclin D2, Cyclin D3, CDC2, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5 und PCNA wurden in pBluescript Vektor (Stratagene) für in vitro Translation mit T7 RNA Polymerase unter Verwenden eines TNT gekoppelten Reticulozytenlysatsystems (Promega) subkloniert. Immunpräzipitation von [35S] Methionin-markierten Lysaten und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese waren die gleichen, wie zuvor beschrieben. Polyacrylamidgele wurden getrocknet ohne vorherige Fixierung und verstärkte Behandlung, Fuji Bildplatten ausgesetzt und auf Fuji Bio-Bildgebungsanalysator BAS2000 sichtbar gemacht. Angemessene Proteinbanden wurden aus den Gelen herausgeschnitten unter Verwenden von Bildausdruck als Matrize, in Gel teilweise verdaut mit verschiedener Menge von S. aureus V8 Protease gemäß Cleveland, et al., J. Biol. Chem. 252: 1102–1106 (1977) und Harlow und Lane, Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1988), auf einem 17,5% SDS-PAGE getrennt. Gele wurden getrocknet und einem Röntgenfilm 2 Wochen lang ausgesetzt, oder auf einem Fuji Bildanalysator BAS2000 analysiert.
  • BEISPIEL 2
  • Demonstration von Selektiver Untereinheitsneuanordnung von Zellzykluskomplexen In Assoziation Mit Zelltransformation durch einen DNA Tumor Virus oder desssen Oncogenem Produkt
  • (i) Zelltransformation Mit DNA Tumor Virus SV40 Ist Mit Untereinheitsneuanordnung von Zellzykluskomplexen verbunden
  • Präparation von [35S] Methionin-markierten Zell-Lysaten und Polyacrylamidgelelektrophorese waren wie zuvor beschrieben, wie auch in PCT Veröffentlichung Nr. WO92/20796 beschrieben. Zell-Lysate wurden aus entweder normalen diploiden Humanfibroblastzellen WI38 oder DNA Tumorvirus SV40 transformierten WI38 Zellen, VA13, hergestellt. Lysate von Zellen wurden mit Antikörpern gegen jedes Zellzyklusgenprodukt(e) immungefällt.
  • (ii) Untereinheitsneuanordnungen von Zellzykluskomplexen In Zwei
  • Unterschiedlichen Paar-Zell-Linien Verfahren für Herstellung von Zell-Lysaten sind die gleichen, wie zuvor beschrieben. Zwei unterschiedliche Paar-Zell-Linien wurden in diesen Experimenten verwendet. HSF43 ist eine normale diploide Humanfibroblastzell-Linie, und CT10 (vollständiger Name CT10-2C-T1) ist ein Derivat von HSF43, transformiert durch SV40 großes Tumorantigen. CV-1 ist eine Afrikanische-Grünaffen-Nierenzell-Linie, und COS-1 ist ein Derivat von CV-1, transformiert durch SV40.
  • (iii) Zell-Transformation durch DNA Tumorvirus SV40 Ist Mit Neuanordnung von PCNA Untereinheit von Zellzykluskomplexen Verbunden
  • Präparation von Zell-Lysat, Elektrophorese und Western Blotting Bedingungen sind die gleichen, wie zuvor beschrieben. Normale diploide Humanfibroblastzell-Linien und ihre SV40 transformierten Zell-Linien sind zuvor beschrieben. Immunpräzipitate, abstammend von jedem Antikörper, wurden auf Polyacrylamidgelen getrennt und mit Anti-PCNA Antikörper geblottet.
  • (iv) Zell-Transformation durch DNA Tumorvirus SV40 Ist Mit Neuanordnung von CDK4 Untereinheit von Zellzykluskomplexen Verbunden
  • Präparation von Zell-Lysat, Elektrophorese und Western Blotting Bedingungen sind die gleichen, wie zuvor bechrieben. Normale diploide Humanfibroblast-Zell-Linien und ihre SV40 transformierten Zell-Linien sind zuvor beschrieben. Immunpräzipitate, abstammend von jedem Antikörper, wurden auf Polyacrylamidgelen getrennt und mit Anti-CDK4 Antikörper geblottet.
  • BEISPIEL 3
  • Klonieren von p16INK4, ein Ihibitor von CDK4 Aktivität
  • (i) Klonieren von p16INK4 unter Verwenden des Zwei-Hybridassays
  • Saccharomyces cerivisiae YPB2 Zellen wurden gleichzeitig mit einem Plasmid transformiert, das enthielt eine GAL4db-p16INK4 Fusion, und mit einem Plasmid, enthaltend das GAL4ad, fusioniert an cdc2 (CDK1), CDK2, CDK4, CDK5, PCNA (sich vermehrendes Zellkernantigen), und die Spaltungshefekinase Snf 1. Nach Züchten von Zellen in Medium, selektiv für beide Plasmide (minus Tryptophan und minus Leucin), wurden zwei Kolonien zufällig ausgewählt und in Platten ausgestrichen, die entweder Histidin enthielten oder denen es an Histidin ermangelte. Die Fähigkeit, in der Abwesenheit von Histidin zu wachsen, hängt von der Expression des HIS3 Gens ab, das unter einem GA14-reaktiven Promotor ist und zeigt deshalb an, daß ein funktioneller GAL4 Aktivator durch die Wechselwirkung von p16INK4 mit dem entsprechenden Zielprotein rekonstituiert worden ist.
  • (ii) Wechselwirkung von p16INK4 CDKs
  • Gereinigtes, bakteriell hergestelltes GSTp16INK4 Fusionsprotein wurde mit (35S)-markiertem in vitro translatiertem cdc2, CDK2, CDK4 und CDK5 gemischt. Mischungen enthielten 0,5 μg gereinigtes GST-p16INK4 und eine äquivalente Menge von in vitro translatiertem Protein (zwischen 0,5 bis 5 μl; TNT Promega) in einem Endvolumen von 200 μl eines Puffers, enthaltend 50 mM Tris-HCl pH 8, 120 mM NaCl und 0,5% Nonidet P-40. Nach 1 h bei 4°C wurden 15 μl Glutathion-Agarose-Kugeln hinzugefügt, und Inkubation wurde eine zusätzliche Stunde wiederaufgenommen. Kugeln wurden durch Zentrifugation gewonnen, 4mal mit dem Inkubationspuffer gewaschen und mit Standardprotein-Gelbeladungspuffer gemischt. Proben wurden in ein 15% Polyacrylamidgel geladen und (35S)-markierte Proteine wurden durch Fluorographie nachgewiesen. Das GSTp16INK4 Fusionsprotein wurde in dem pGEX-KG Vektor überexprimiert und mittels Standardtechniken gereinigt. Die in vitro Translationsmatrizen stammten von dem pBluescript Vektor (Stratagene).
  • (iii) Proteolytisches Kartieren von p16INK4
  • Das in vitro translatierte (35S)-markierte p16INK4 (TNT Promega) wurde erhalten unter Verwenden der p16INK4 cDNA, kloniert in pBluescript Vektor (Stratagene) als eine Matrize, und das CDK4-assoziierte p16 Protein wurde coimmunpräzipitiert mit einem Anti-CDK4 Serum von Metabolismus (35S)-markierten Hela Zell-Lysaten. Partielle Proteolyse wurde über den entsprechenden Gelschnitten nach umfassender Äquilibrierung in einem Puffer durchgeführt, und Verdauung wurde durch Zugabe von NCS bei verschiedenen Konzentrationen vollendet. Die Produkte wurden in einem 17,5% Polyacrylamidgel laufengelassen und in einem Phosphobildgeber Fujix 2000 nachgewiesen.
  • (iv) Nachweisen der Wirkungen von p16INK4 auf CDK4-Cyclin D Komplexe
  • Bakulovirus-infizierte Insektenzellen, die p16INK4, CDK4, Cyclin D1 oder sowohl CDK4 wie Cyclin D1 zusammen überexprimierten, wurden metabolisch (35S)-markiert. Die unterschiedlichen Inkubationsmischungen wurden zusammengesetzt durch Extrakte, enthaltend p16INK4, CDK4, Cyclin D1 und sowohl CDK4 wie Cyclin D1, und wurden immungefällt mit Anti-p16INK4 Serum, Anti-CDK4 Serum ohne vorerige Präinkubation, und Anti-CDK Serum, vorinkubiert mir dem Peptid, ursprünglich verwendet, das Antiserum und Anti-Cyclin D1 Serum zu erhöhen. Immunpräzipitate wurden dann durch SDS-PAGE analysiert.
  • SEQUENZAUFLISTEN
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Claims (34)

  1. Verfahren zum Identifizieren einer transformierten oder anormal proliferierenden Zelle, umfassend: (A) Bestimmen, in (einer) Testzelle(n), der Untereinheitzusammensetzung eines Komplexes, umfassend ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 16 kDa, 19 kDa oder 21 kDa und entweder eine cyclinabhängige Kinase (cdk), ein Cyclin oder sowohl eine cdk als auch ein Cyclin, wobei das Protein überwiegend ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 21 kDa in einer normalen Zelle ist oder überwiegend ein Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 19 kDa oder etwa 16 kDa in einer transformierten oder anormal proliferierenden Zelle ist, und (B) Vergleichen der Untereinheitzusammensetzung von Schritt (A) mit der Untereinheitzusammensetzung eines ähnlichen Komplexes, gefunden in einer normalen Zelle, wobei eine Veränderung in der Untereinheitzusammensetzung ein Anzeichen von Transformation oder anormaler Proliferation der Testzelle ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei (A) Ermitteln des Gehalts an einem Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 21 kDa, komplexiert mit einer cdk, einem Cyclin oder sowohl einer cdk als auch einem Cyclin, umfaßt und wobei in (B) eine Abnahme in dem Gehalt an dem 21-kDa-Protein, komplexiert mit einer cdk, einem Cyclin oder sowohl einer cdk als auch einem Cyclin, ein Anzeichen von Transformation oder anormaler Proliferation der Testzelle(n) ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei (A) Ermitteln des Gehalts an einem Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 16 kDa, komplexiert mit einer cdk, umfaßt und wobei in (B) eine Zunahme in dem Gehalt an dem 16-kDa-Protein, komplexiert mit einer cdk, ein Anzeichen von Transformation oder anormaler Proliferation der Testzelle(n) ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei (A) Ermitteln des Gehalts an einem Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 19 kDa, komplexiert mit einem Cyclin, umfaßt und wobei in (B) eine Zunahme in dem Gehalt an dem 19-kDa-Protein, komplexiert mit einem Cyclin, ein Anzeichen von Transformation oder anormaler Proliferation der Testzelle(n) ist.
  5. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei Gelelektrophorese-Analyse und/oder ein Immunoassay verwendet werden, um die Untereinheitzusammensetzung zu ermitteln.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Cyclin ein D-Typ-Cyclin oder ein A-Typ-Cyclin ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die cdk cdk4 ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Cyclin Cyclin A ist.
  9. Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, welches Verfahren ein diagnostisches in-vitro-Verfahren zur Beurteilung eines Krankheitszustands oder der Wahrscheinlichkeit der Entwicklung eines Leidens, verbunden mit Transformation oder anormaler Proliferation von Zellen, ist.
  10. Gereinigtes und/oder rekombinantes Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz eines Polypeptids mit einer scheinbaren Molekülmasse von etwa 15 kDa bis 17 kDa, wobei das Polypeptid eine cyclinabhängige Kinase hemmt und durch eine Nucleinsäure kodiert wird, welche spezifisch mit der Nucleinsäuresequenz der SEQ ID No. 3 hybridisiert.
  11. Polypeptid nach Anspruch 10, welches ein Fusionsprotein oder ein immunogener Anteil des Proteins der SEQ ID No. 4 ist.
  12. Polypeptid nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz der SEQ ID No. 4 umfaßt.
  13. Polypeptid nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid ein Molekulargewicht von 16 kDa hat.
  14. Polypeptid nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid ein rekombinantes Polypeptid ist.
  15. Polypeptid nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid spezifisch reaktiv mit einem Antikörper, selektiv für das Protein der SEQ ID No. 4, ist.
  16. Isolierte Nucleinsäure, kodierend das Polypeptid nach Anspruch 10.
  17. Nucleinsäure nach Anspruch 16, kodierend das Protein der SEQ ID No. 4.
  18. Nucleinsäure nach Anspruch 16, umfassend die Nucleotidsequenz der SEQ ID No. 3.
  19. Isolierte Nucleinsäure (Sense oder Antisense), welche spezifisch mit der Nucleinsäuresequenz der SEQ ID No. 3 hybridisiert und selektiv ein Gen, kodierend ein 16-kDa-Protein, nachweist, welches an cyclinabhängige Kinase 4 (cdk4) bindet.
  20. Nucleinsäure nach Anspruch 19, wobei die Nucleinsäure ein Antisense-Oligonucleotid ist, welches mit dem Gen hybridisiert und die Expression des Proteins hemmt.
  21. Diagnostisches Test-Kit zum Identifizieren transformierter Zellen, umfassend: (a) eine Nucleinsäuresonde (Sense oder Antisense), welche spezifisch mit der Nucleinsäuresequenz der SEQ ID No. 3 hybridisiert und selektiv eine Nucleinsäure, kodierend ein 16-kDa-Protein, welches an cyclinabhängige Kinase 4 (cdk4) bindet, nachweist, welche Sonde zum Messen, in einer Probe von Zellen, isoliert von einem Patienten, der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Nucleinsäure, kodierend das 1 6-kDa-Protein, ist; und/oder (b) einen Antikörper, spezifisch für das 16-kDa-Protein, zum Messen, in einer Probe von Zellen, isoliert von einem Patienten, einer Menge des Proteins.
  22. Kit nach Anspruch 21, wobei der Antikörper spezifisch für das Polypeptid ist, welches eine Aminosäuresequenz der SEQ ID No. 4 aufweist.
  23. Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 16 bis 20 oder das Kit nach den Ansprüchen 21 oder 22, wobei die Nucleinsäure, die Sonde oder der Antikörper mit einer nachweisbaren Markierung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einem Enzym, einem Enzymsubstrat, einem Coenzym, einem Enzyminhibitor, einer Fluoreszenzmarkierung, einem Chromophor, einer Lumineszenzmarkierung, einem spezifisch bindungsfähigen Liganden und einem Radioisotop, markiert ist.
  24. Nucleinsäure oder das Kit nach einem der Ansprüche 19 bis 21 oder 23, wobei die Nucleinsäure oder Sonde mit einem mRNA-Transkript, kodierend das Protein, hybridisiert.
  25. Nucleinsäure oder das Kit nach einem der Ansprüche 16 bis 21 oder 23, wobei die Nucleinsäure oder Sonde eine Länge von ungefähr 75 bis 150 Nucleotiden hat.
  26. Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend eine Nucleinsäure, kodierend das Polypeptid nach Anspruch 4 oder die Nucleinsäure nach Anspruch 16 oder Anspruch 19.
  27. Zubereitung, umfassend ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei das Fusionsprotein zu mehr als 90% rein ist.
  28. Testverfahren zum Identifizieren eines Mittels, welches die Untereinheitzusammensetzung eines cyclinabhängigen Kinasekomplexes verändert, umfassend i. Bereitstellen einer cyclinabhängigen Kinase (cdk) und des Polypeptids nach einem der Ansprüche 10 bis 15 unter Bedingungen, unter denen die cdk und das Polypeptid einen Komplex bilden können; ii. Inkontaktbringen des Gemisches mit einem in Frage kommenden Mittel; iii. Nachweisen einer Menge von Polypeptid als Teil des gebildeten Komplexes; iv. Vergleichen der Menge des Polypeptids, vorhanden in dem Komplex in Anwesenheit des in Frage kommenden Mittels, mit der Menge des Polypeptids, vorhanden in dem Komplex in Abwesenheit des in Frage kommenden Mittels, wobei eine Änderung in der Menge des Polypeptids, vorhanden in dem Komplex in Anwesenheit des in Frage kommenden Mittels relativ zu der in Abwesenheit des in Frage kommenden Mittels, ein Anzeichen eines Mittels ist, welches die Untereinheitzusammensetzung eines cyclinabhängigen Kinasekomplexes verändert.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Gemisch ein Zell-Lysat oder eine in-vitro-rekonstituierte Proteinzubereitung ist.
  30. Verfahren nach Anspruch 1 oder 29, wobei die Zelle(n) aus einer Gewebeprobe oder biologischen Probe erhalten wird (werden).
  31. Zubereitung, umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 10 bis 15 und eine cyclinabhängige Kinase cdk4 zur Verwendung in dem Testverfahren nach Anspruch 28.
  32. Verfahren zum Nachweisen der Transformation einer Säugetierzelle durch Nachweisen der veränderten Expression eines Gens, kodierend ein Protein mit einem Molekulargewicht von 15 kDa bis 17 kDa, welches ein Inhibitor von cdk4 ist, welches Verfahren Bestimmen, in einer Testprobe von Säugetierzellen, der Anwesenheit oder Abwesenheit von Nucleinsäure, welche spezifisch mit der Nucleinsäure der SEQ ID No. 3 hybridisiert, umfaßt, wobei die Anwesenheit der Nucleinsäure Transformation der Zellen anzeigt.
  33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Nucleinsäurehybridisierung verwendet wird, um den Gehalt an mRNA-Transkripten, kodierend den 15-kDa- bis 17-kDa-Proteininhibitor von cyclinabhängiger Kinase, zu bestimmen.
  34. Antikörper, welcher spezifisch immunoreaktiv mit dem Protein der SEQ ID No. 4 ist.
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