KR20000038917A - 곤충세포를 이용한 cdk6/p16 복합체의 제조방법 - Google Patents

곤충세포를 이용한 cdk6/p16 복합체의 제조방법 Download PDF

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KR20000038917A KR1019980054084A KR19980054084A KR20000038917A KR 20000038917 A KR20000038917 A KR 20000038917A KR 1019980054084 A KR1019980054084 A KR 1019980054084A KR 19980054084 A KR19980054084 A KR 19980054084A KR 20000038917 A KR20000038917 A KR 20000038917A
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Abstract

본 발명은 곤충세포에서 재조합 배큘로바이러스에 의하여 CDK6 (cell cycle dependent kinase 6)과 CDK6 저해제인 p16 을 동시에 발현시킴으로 복합체 형태의 CDK6 (CDK6 / P16 복합체)을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 야생형 CDK6 유전자만을 포함하는 곤충세포 발현 벡터 및 그 재조합 배큘로바이러스 그리고 p16 를 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 이용하여 히스티딘이 표지된 CDK6 또는 야생형 CDK6 을 CDK6 / P16 복합체 형태로 대량 발현, 정제하는 방법으로 구성되며, 상기 방법으로 생산된 고순도의 CDK6 는 새로운 항암제를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

곤충세포를 이용한 ＣＤＫ6 / Ｐ16 복합체의 제조방법
본 발명은 곤충세포에서 CDK6 와 그의 저해제인 p16 을 동시에 발현시킴으로 CDK6 와 p16 을 복합체 형태 (이하 " CDK6 / P16 복합체 " 라고 약칭함)로 제조하는 방법에 관한 것으로서, 상세하게는 야생형 CDK6 유전자만을 포함하는 곤충세포 발현 벡터 및 그 재조합 배큘로바이러스 그리고 히스티딘이 표지된 CDK6 또는 야생형 CDK6 을 CDK6 / P16 복합체 형태로 발현, 정제하는 방법에 관한 것이다.
세포주기 변화를 분자 수준에서 연구하려는 시도들이 90년대에 들어 활발하게 진행되어 그 변화 과정에 대하여 상세하게 밝혀지기 시작하였다. 세포주기 조절 기작은 세포주기 조절인자가 작용하여 세포의 성장, 분화, 발생, 노화, 아폽토시스 (apoptosis) 등을 주로 조절하는 것으로 이루어져 있음이 밝혀졌다 (Elledge, et al., Science, 274: 1664-1671). 이러한 연구 결과들은 여러 병리 현상들을 정확하게 이해하는데 큰 도움을 주고 있다. 그 대표적인 예가 암으로서, 정상세포가 암세포로 변형되는 과정에서 세포주기 조절 기능이 상실되는 경우가 많이 발견되었다 (Pardee, Science, 246: 603-608, 1989). 이들 암세포를 분석한 결과 세포주기 조절인자의 활성이 많은 경우에 있어서 정상세포와 다르고, 특히 이 중에는 암 병리에서 가장 문제시되는 전이 과정과도 직접 상관 관계가 있는 예도 보고되었다 (Steeg, et al., Nature medicine, 3: 152-154, 1997). 또한, 변형동물 기술을 이용하여 세포주기 조절인자의 과량 발현 또는 녹-아웃 (knock-out)을 유도하면 실험동물에 암이 생성되는 것이 보고되어, 직접적으로 비이상적인 세포주기 조절이 암을 유발하는 요인임이 증명되었다 (Serrano, et al., Cell, 85: 27-37, 1996).
세포주기의 변화는 여타 모든 생물 현상의 조절과 마찬가지로 포지티브 조절 (positive control) 및 네가티브 조절 (negative control)을 받고 있다. 현재까지 세포주기는 특정한 단백질 키나제 패밀리 (protein kinase family)의 활성에 의하여 그 진행이 결정이 되며, 이 키나제 활성은 그 세포가 처한 환경에 따라 포지티브 또는 네가티브 조절을 받는 것으로 알려져 있다 (Morgan, Nature, 374: 131-134, 1995). 암세포와 발암 기전에 관한 다양한 연구에서 이러한 포지티브 또는 네가티브 조절에 문제가 발생되는 경우가 많이 발견되었고, 필요 이상의 지나친 포지티브 효과, 네가티브 조절의 상실 그리고 세포주기 조절에서 중요한 시기 적절한 (timely) 조절의 어긋남이 암세포의 문제점으로 지적되었다.
고등 진핵생물의 체세포 분열에서 세포 주기는 G1 기, S 기, G2 기 그리고 M 기의 4 기로 이루어져 있는데, G1 기, S 기 및 G2 기는 세포 분열을 위한 준비 기간이고 M 기는 실제로 세포 분열이 일어나는 시기이다. 세포 분열시 유전 정보를 정확히 전달하기 위하여 진핵세포들은 아주 정교하고 순차적으로 작동하는 분자들의 복잡한 네트워크를 발전시켰는데, 이 복잡한 네트워크에 참여하는 중심적인 단백질로는 사이클린 (cyclin), 사이클린 의존성 키나제 (cyclin-dependent kinase, CDK), CDK 저해제 그리고 pRB (retinoblastoma protein), p53 와 같은 종양 억제 유전자 (tumor suppressor gene)의 산물인 전사 조절인자 (transcription factors)가 알려져 있다.
상기 네트워크에서 사이클린은 CDK 에 결합해서 이들의 활성을 조절하고 이 사이클린-CDK 복합체의 활성은 다양한 요인들에 의해 조절받고 있다. 구체적인 요인으로는 사이클린의 양, CDK 의 인산화 상태 그리고 네가티브 조절자인 CDK 저해제의 존재 여부를 들 수 있는데, CDK 가 활성화되면 다양한 기질 (substrate)들을 직간접적으로 인산화해서 유전자 발현을 조절하고 나아가 세포 주기의 진행을 조절한다. 현재까지 사이클린은 A 형부터 I 형까지 9가지 그룹이, CDK 는 8가지 그룹이 보고되었고, 이들 중 몇몇은 이소형도 많이 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 또한, G1 기에서 사이클린 D-CDK4 와 사이클린 D-CDK6, G1/S 전이 시와 S 기로 들어갈 때 사이클린 E-CDK2 와 사이클린 A-CDK2, 그리고 G2 기에서 M 기까지 사이클린 A-CDK1 과 사이클린 B-CDK1 이 각각 관여한다는 사실이 현재까지 밝혀져 있다 (Cell Physiology source book, Academic press, 2nd Ed., 1003-1020, 1998).
CDK 의 활성은 사이클린에 의해 포지티브 조절을 받는다. 이 과정을 G1/S 전이의 경우와 연관하여 살펴보면, 사이클린 D 는 G1 기에서 축적되고 이들은 CDK4 또는 CDK6 와 결합하여 활성을 가진 복합체를 형성한 다음 이 복합체가 G1 기를 빠져 나와 S 기로 들어가는데 중요한 역할을 하는 pRB (retinoblastoma protein)를 인산화시킨다. pRB 는 종양 억제 유전자의 산물로 인산화되면 불활성화되어 보통은 결합 상태로 있는 E2F-DF 헤테로다이머를 놓아주고, 여기서 나온 E2F-DF 헤테로다이머는 전사조절인자로서 G1 기에서 S 기로 진행하는 것을 촉진함으로 세포 주기가 진행되도록 한다.
또한 CDK 의 활성은 CDK 저해제에 의하여 네가티브 조절을 받는다. CDK 저해제는 2 그룹으로 분류되는데, 하나는 CDK4 와 CDK6 만을 선택적으로 억제하는 Ink4 패밀리이고 다른 하나는 G1 기의 CDK 들을 대부분 억제하는 Cip/Kip 패밀리이다. 이 때 전자는 CDK4 와 CDK6 가 사이클린 D 와 결합하는 것을 방해하거나 사이클린 D 와 결합하여 형성된 복합체의 활성을 억제한다. 반면 후자는 사이클린-CDK 복합체에 결합하여 CDK 활성화 키나제 (CAK, CDK-activating kinase)에 의한 활성화를 방해하거나 상기 복합체의 활성을 직접 억제하는 방법으로 작용한다. 대표적인 Ink4 패밀리로는 p16 을 들 수 있고 p15, p18 및 p19 도 이에 속한다. 이들은 모두 CDK4 와 CDK6 에만 선택적으로 결합하는 한편, p16 과 p18 은 pRB 의 활성이 있는 세포에서만 G1 기에서 세포주기를 멈출 수 있다고 보고되었다. 또한, Cip/Kip 패밀리로는 p21, p27 및 p57 을 들 수 있다. 이들도 세포내에서 과량 발현시키는 경우 G1 기에서 세포주기를 멈출 수 있다.
이외에도 Ink 4 패밀리 중 p16 과 p15 는 많은 암세포에서 그 유전자가 상실된 것이 관찰되고, p16 녹 아웃 변형동물의 조직에서 암이 많이 생성되는 것이 알려져 p16 기능의 상실이 암의 직접적인 원인임이 증명되었다. 그러나 p16 의 발현 조절과정은 아직까지 명확하지 않다. 한편 암세포에서 Cip/Kip 패밀리인 p21 의 비이상성은 거의 발견되지 않고 있는데 그 이유는 아직 분명하지 않다. 단지 p21 은 환경 변화에 민감하게 반응하여 그 발현이 조절되고, p53 에 의하여 유도되며 노화되는 세포에서 그 발현이 증가된다고 보고되었다 (Harper, et al., Cell, 75: 805-816, 1993). 또 다른 Cip/Kip 패밀리인 p27 은 TGF-b 또는 세포-세포 접촉 신호 (cell-cell contact signal)에 의하여 발현이 유도된다고 한다 (Polyak, et al., Cell, 78: 66-69, 1994).
CDK4 및 CDK6 활성의 비이상적인 조절과 암 발생과의 연관은 여러 암 조직에서 잘 나타나고 있다 (Serrano, et al., Cell, 85: 27-37, 1996). 상기에서 보는 바와 같이 여러 암에서 p16 및 p15 유전자의 상실이 보고되었고, 사이클린 D1 도 그 과량 발현이 여러 암에서 관찰되었으며 이는 특히 유방암이 전이 성질을 띠는 것과 밀접하게 관련이 있는 것으로 보여진다 (Pardee, et al., Nature medicine, 2: 254, 1996). 또한, p53 녹 아웃 마우스에서만큼 p16 녹 아웃 마우스에서도 암이 잘 발생한다고 보고되어 p16 이 CDK4 및 CDK6 을 조절하는 기능을 상실하면 암이 유발될 수 있음을 알 수 있다. 한편 외부에서 공급된 p16 이나 p21 은 암세포를 정상 형질의 세포로 바꾼다는 사실도 발견되었다 (Bonfanti, et al., Cancer Research, 57: 1442-1446, 1997). 따라서 비이상적인 CDK4 및 CDK6 활성이 암세포가 악성을 띠게 하는 직접적인 요인임을 알 수 있다.
이와 같이 CDK4 및 CDK6 활성의 이상 조절이 암을 유도하는 것으로 확인되고 CDK4 및 CDK6 저해제는 항암 효과를 보일 가능성이 높다고 여겨짐으로써, 이미 세계 유수의 연구기관에서는 항암제로서의 CDK 저해제에 대하여 활발히 연구를 진행시키고 있다. 지금까지 보고된 CDK 저해제는 주로 분자량이 작은 화합물이고 이중 일부는 항암제로서 임상 실험 중에 있으나 아직 CDK4 및 CDK6 에 특이적으로 작용하는 화합물은 보고되지 않았다 (Bible, et al., Cancer Research, 56: 4856-4861, 1996).
G1 기에서 S 기로의 전이에 관여하는 CDK4 와 CDK6 는 상기에서 보듯이 사이클린 D 에 선택적으로 결합하여 pRB 를 인산화함으로 G1/S 전이를 촉진하고 Ink4 패밀리의 CDK 저해제와 결합하면 그 활성이 억제되어 G1 기에서 세포주기를 멈출 수 있는 공통점이 있고, 서로 71% 의 아미노산 서열 유사성을 보이므로 그 단백질 구조도 비슷할 것으로 추정된다 (Meyerson, et al., EMBO J., 11: 2909-2917, 1992). 일반적으로 단백질의 저해제를 찾기 위하여는 먼저 단백질의 구조를 분석하는 것이 바람직하므로 고순도의 단백질이 대량으로 필요하다. 한편, 다른 조절인자와 달리 CDK4 는 물성이 좋지 않아 단독으로 다루는 것이 어렵고 많은 양의 CDK4 를 확보하는 것이 쉽지 않다. 실제로 CDK4 를 박테리아나 곤충세포에서 발현시켜 보면 대부분 불용성 단백질 형태로 생산되므로 이의 정제 과정에서 재구성 (refolding) 등에 어려움이 많으며 그 수율도 매우 낮다. CDK4 단백질을 대량으로 얻는 것이 쉽지 않은 반면, CDK6 는 가용성 형태로 발현시킬 수 있고 대량 정제도 가능하여 단백질의 구조 분석의 면에 있어서 유리하다. CDK4 는 조직 발현 패턴이 일정한 (ubiquitous) 반면 CDK6 는 주로 면역세포에서만 발현되어 발현량에 큰 차이가 있는 단점이 있지만, 상기 성질과 기능 구조를 고려해 볼 때 CDK6 는 항암제를 탐색하는 과정의 표적으로 바람직하게 이용될 수 있다.
이미 본 발명자들은 히스티딘이 표지된 가용성 CDK6 를 순수하게 얻는 방법을 보고한 바 있었다 (대한민국 특허출원 제 98-18882호). 그러나 이 단백질은 X-선 결정 구조를 파악하기 위하여 결정을 만드는 과정이 어려우므로 다른 방법으로 CDK6 를 발현시키는 것이 필요하였다.
이에 본 발명자들은 야생형 CDK6 유전자를 포함하는 곤충세포 발현 벡터 및 그 재조합 배큘로바이러스를 제작하고, CDK6 저해제인 p16 를 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 이용하여 CDK6 와 p16 을 곤충세포에서 동시에 발현시킨 다음 다양한 크로마토그래피 과정으로 복합체 형태의 야생형 CDK6 또는 히스티딘이 표지된 CDK6 를 고순도로 정제함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 곤충세포에서 CDK6 를 p16 와 복합체 형태로 대량 생산하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.
도 1 은 본 발명의 야생형 CDK6 유전자를 포함하는 곤충세포 발현 벡터의 제작 과정을 나타낸 것이고,
도 2 는 히스티딘이 표지된 CDK6 / P16 복합체의 정제 과정을 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (SDS-PAGE)으로 나타낸 것이고,
레인 1 : 단백질 크기 마커 (위로부터 68, 43, 31, 23, 19, 14, 10 kD) ;
레인 2 : 전체 세포 용출액 ;
레인 3 : Ni-NTA 친화 크로마토그래피 로딩 시료 ;
레인 4 : Ni-NTA 친화 크로마토그래피 정제 분획 ;
레인 5 : S-200 젤 여과 크로마토그래피 로딩 시료 ;
레인 6 : S-200 젤 여과 크로마토그래피 정제 분획 ;
도 3 은 본 발명의 CDK6 / P16 복합체의 정제 과정을 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 나타낸 것이고,
레인 1 : 단백질 크기 마커 (위로부터 68, 43, 31, 23, 19, 14, 10 kD) ;
레인 2 : 전체 세포 용출액 ;
레인 3 : DEAE 음이온 교환 크로마토그래피 로딩 시료 ;
레인 4 : DEAE 음이온 교환 크로마토그래피 정제 분획 ;
레인 5 : S-200 젤 여과 크로마토그래피 로딩 시료 ;
레인 6 : S-200 젤 여과 크로마토그래피 정제 분획 ;
레인 7 : 모노-Q 음이온 크로마토그래피 정제 분획 ;
도 4 는 정제 과정을 거친 히스티딘이 표지된 CDK6 / P16 복합체의 순도를 역상 고압 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)를 이용하여 확인한 것이고,
도 5 는 정제 과정을 거친 야생형 CDK6 / P16 복합체의 순도를 역상 고압 액체 크로마토그래피를 이용하여 확인한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 곤충세포에 CDK6 를 발현할 수 있는 재조합 배큘로바이러스와 p16 를 발현할 수 있는 재조합 배큘로바이러스를 동시감염시킴으로 CDK6 를 복합체 형태로 대량 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 야생형 CDK6 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터 및 이를 이용하여 제작한 곤충세포에서 CDK6 를 발현할 수 있는 재조합 배큘로바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 과정으로 야생형 CDK6 / P16 복합체가 발현된 곤충세포의 파쇄액으로 음이온 교환 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전 및 /또는 젤 여과 크로마토그래피 등을 수행하여 CDK6 / P16 복합체를 정제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 과정으로 히스티딘이 표지된 CDK6 / P16 복합체가 발현된 곤충세포의 파쇄액으로 Ni-NTA 친화 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전 및/또는 젤 여과 크로마토그래피를 수행하여 CDK6 / P16 복합체를 정제하는 방법을 제공한다.
상기 과정에서 완충용액은 pH 범위가 7.0 ∼ 10.0 이고 환원제가 포함된 것을 사용하고, 암모늄 설페이트는 포화농도 40% 이하가 되도록 처리하며, 환원제로는 디티오트레이톨을 사용하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 새로운 항암제의 개발에 유용한 CDK6 단백질을 CDK 저해제인 p16 과의 복합체 형태로 생산한다. 구체적으로, 야생형 CDK6 유전자 또는 히스티딘이 표지된 CDK6 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러스와 CDK 저해제인 p16 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러스를 곤충세포에 동시감염시킴으로써 CDK6 / P16 복합체를 얻는다.
우선, 본 발명은 야생형 CDK6 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터 및 재조합 배큘로바이러스를 제작한다. 이 때 기존의 곤충세포 발현 벡터 pBacpak8 (대한민국 특허출원 제 97-10499호) 및 pBacpak His CDK6 (대한민국 특허출원 제 98-18882호)을 이용하여 야생형 CDK6 유전자를 포함하는 곤충세포 발현 벡터 pBacpak CDK6 를 얻는다 (도 1 참조). 또한, 상기 발현 벡터를 이용하여 곤충세포에서 상기 CDK6 유전자를 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 제작한다. 이 때 기존의 방법 (대한민국 특허출원 제 98-18880호)에 따라 상기 발현 벡터를 제한효소로 절단된 배큘로바이러스와 함께 곤충세포에 감염시키고 재조합 바이러스를 생성시킨 다음 단일클론 배큘로바이러스를 분리한다.
또한, 본 발명은 히스티딘이 표지된 CDK6 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러스로는 기존의 재조합 배큘로바이러스 (대한민국 특허출원 제 98-18882호의 기탁균주 KCTC 0465 BP)를 이용한다.
또한, 본 발명은 히스티딘이 표지된 p16 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러스 (대한민국 특허출원 제 98-18880호) 또는 히스티딘 표지가 없는 p16 유전자를 포함하는 재조합 배큘로바이러스 (대한민국 특허출원 제 98-38215호) 등을 사용한다.
본 발명은 상기 재조합 배큘로바이러스를 높은 농도로 배양한 다음 곤충세포에 동시에 감염시킨 다음 수용성 단백질의 발현을 분석한다. 이 때 발현된 단백질은 곤충세포 내에 축적되므로 곤충세포의 파쇄액을 얻어 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동을 수행하면 발현된 CDK6 가 복합체 형태로 확인된다 (도 2 및 도 3 참조). 이 때 곤충세포로는 스포돕프테라 푸르기페다 21 (Spodoptera frugiperda 21, sf21)을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 CDK6 / P16 복합체를 정제하기 위하여, 단백질이 발현된 곤충세포를 파쇄하고 이로부터 세포 균질액을 얻어 불용성 침전물을 제거한 다음 다양한 크로마토그래피 과정 등을 수행한다.
우선 히스티딘이 표지된 CDK6 / P16 복합체는 상기 과정에 더하여 Ni-NTA 친화 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전 및/또는 젤 여과 크로마토그래피의 과정으로 정제한다. 이 때 Ni-NTA 친화 크로마토그래피는 이미다졸 (imidazole) 농도 구배를 이용하고, 암모늄 설페이트는 포화농도 40% 가 되도록 첨가하며, 모든 과정에서 완충용액은 pH 범위가 7.0 ∼ 10.0 이고 환원제가 포함된 것을 사용한다.
또한, 야생형 CDK6 / P16 복합체는 음이온 교환 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전 및/또는 젤 여과 크로마토그래피 등의 과정으로 정제한다. 이 때 음이온 교환 크로마토그래피는 DEAE-세파로스 및 FPLC 모노-Q 음이온 교환 칼럼 등을 사용하여 수행하고, 암모늄 설페이트는 포화농도 40% 가 되도록 첨가하며, 모든 과정에서 완충용액은 pH 범위가 7.0 ∼ 10.0 이고 환원제가 포함된 것을 사용한다. 상기 환원제로는 디티오트레이톨을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 각 과정에서 CDK6 / P16 복합체를 포함하는 분획은 SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (도 2 및 도 3 참조)으로 확인하고, 최종적으로 정제된 CDK6 / P16 복합체의 순도는 역상 고압 액체 크로마토그래피 등으로 확인한다 (도 4 및 도 5 참조).
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.
단 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며, 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
＜실시예 1＞ CDK6 유전자의 곤충세포 발현 벡터의 제작
대한민국 특허출원 제 97-10499호에 기술한 곤충세포 발현 벡터 pBacpak8 2μg 을 제한효소 BamHI 과 EcoRI 으로 NEB 완충용액 2 (50mM NaCl, 10mM 트리스-HCl, 10mM MgCl2, 1mM 디티오트레이톨, pH 7.9)의 조건으로 완전 절단한 다음 1% 아가로스젤 전기영동으로 분리하여 5.5 kb 의 핵산 절편을 얻었다. 이하 이 단편을 ' 단편 pBacpak-B/RI '이라 칭한다.
한편 대한민국 특허출원 제 98-18882호에 기술한 곤충세포 발현 벡터 pBacpak His CDK6 을 제한효소 BamHI 과 EcoRI 으로 NEB 완충용액 2 (50mM NaCl, 10mM 트리스-HCl, 10mM MgCl2, 1mM 디티오트레이톨, pH 7.9)의 조건으로 완전 절단한 다음 7% 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 분리하여 약 900 bp 의 핵산 절편을 얻었다. 이하 이 단편을 ' 단편 CDK6-B/RI '이라 칭한다.
상기에서 얻은 100 ng 의 ' 단편 pBacpak-B/RI ' 과 ' 단편 CDK6-B/RI '을 접합반응 튜브에 넣은 다음 2μl 의 10배 접합 반응용액 (50mM 트리스-HCl, pH 7.8, 10mM MgCl2, 10mM 디티오트레이톨, 1mM ATP, 25μg/ml 소혈청 알부민 (bovine serum albumin)), 10 단위체의 T4 DNA 리가제와 총 부피가 20μl 가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 대장균 HB101 (ATCC 33694) 균주에 형질전환시켜 CDK6 유전자를 포함하는 곤충세포 발현 벡터 pBacpak CDK6 을 얻었다.
＜실시예 2＞ 곤충세포 sf21에서 CDK6 / p16 복합체의 발현
(단계 1) 재조합 바이러스의 생성
대한민국 특허출원 제 97-10499호의 방법에 따라 상기 실시예 1에서 얻은 곤충세포 발현 벡터 pBacpak CDK6 로부터 CDK6 를 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 제작하였다.
(단계 2) CDK6 / P16 복합체의 발현
대한민국 특허출원 제 97-10499호의 방법에 따라, 대한민국 특허출원 제 98-18882호의 기탁균주인 히스티딘이 표지된 CDK6 를 발현하는 재조합 배큘로바이러스와 대한민국 특허출원 제 98-38215호의 기탁균주인 히스티딘 표지가 없는 p16 를 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 곤충세포 sf21 에 동시감염 (co-infection)시켜 히스티딘이 표지된 CDK6 / P16 복합체를 대량 발현시킨 다음 단백질 정제에 사용하였다.
또한, 상기 (단계 1)의 CDK6 를 발현하는 재조합 배큘로바이러스와 상기 p16 을 발현하는 재조합 배큘로바이러스를 곤충세포에 동시감염시켜 CDK6 / P16 복합체를 대량 발현시킨 다음 단백질 정제에 사용하였다.
＜실시예 3＞ 히스티딘이 표지된 CDK6 / P16 복합체의 분리·정제
(단계 1) 세포 파쇄 과정
히스티딘이 표지된 CDK6 / P16 단백질이 발현된 곤충세포 sf21 에 20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 10% 글리세롤, 1mM PMSF 완충용액을 첨가하여 초음파 분쇄기 (HEAT SYSTEMAS-ULTRASONICS, INC., W225, 미국)로 1분씩 2회 파쇄하고 이로부터 세포 균질액을 얻은 다음 원심분리기 (Beckman J2-21, Rotor JA20, 미국)로 16,000 rpm 에서 30분간 원심분리하여 불용성 침전물을 제거하였다. 다음 이로부터 상등액만 취하여 다음 정제 과정에 이용하였다.
(단계 2) Ni-NTA 친화 크로마토그래피 과정
상기 과정에서 얻은 상등액을 20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 10% 글리세롤 완충용액으로 미리 평형화된 니켈 친화 칼럼 (Qiagen, Ni-NTA superflow, 미국)에 주입시켜 흡착시킨 다음 동일한 완충용액으로 세척하고 0 ∼ 0.2 M 이미다졸 (imidazole) 농도 구배를 이용하여 단백질을 용출시켰다. 여기에서 얻은 각 분획을 소디움 도데실설페이트 (SDS) 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 확인하고 히스티딘이 표지된 CDK6 / P16 복합체를 포함하는 분획만을 모았다.
(단계 3) 암모늄 설페이트 처리 과정
상기 과정에서 얻은 히스티딘이 표지된 CDK6 / P16 복합체 용액에 암모늄 설페이트가 포화농도 40 % 로 되도록 첨가하여 30분간 저어준 다음 다시 원심분리하고 침전물만 따로 모아 다음 단계에 이용하였다.
(단계 4) S-200 젤 크로마토그래피 과정
상기 과정에서 얻은 히스티딘이 표지된 CDK6 / P16 복합체 침전물을 20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 10% 글리세롤, 1mM EDTA, 0.5M 디티오트레이톨 완충용액에 충분히 녹인 다음 원심분리하여 녹지 않은 침전물을 제거하고 상등액만을 취하여 미리 상기 완충용액으로 평형화된 S-200 젤 여과 칼럼 (Pharmacia, 스웨덴)에 주입시키고 동일한 완충용액으로 단백질을 용출시켰다. 여기에서 얻은 각 분획을 SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 확인하여 히스티딘이 표지된 CDK6 / P16 복합체를 포함하는 분획만을 모음으로써 고순도의 단백질을 정제하였다.
최종적으로 정제된 CDK6 / P16 복합체의 순도는 역상 고압 액체 크로마토그래피로 확인하였다 (도 4 및 표 1 참조).
번호 보유시간 (분) 면적(UV * 초) 높이 Int 타입 % 면적 % 높이
1 4.187 10914 1245 BB 0.03 0.05
2 5.565 506 316 BV 0.00 0.01
3 5.975 9614206 1000965 VV 26.90 37.86
4 6.313 148157 15950 VB 0.41 0.60
5 7.298 5536 939 BB 0.02 0.04
6 8.625 18385 2356 BV 0.05 0.09
7 8.907 49678 2078 VB 0.14 0.08
8 10.125 36092 2827 BV 0.10 0.11
9 10.667 25722669 1610956 VB 71.96 60.94
10 15.697 139047 5963 BB 0.39 0.23
＜실시예 4＞ 야생형 CDK6 / P16 복합체의 분리·정제
(단계 1) 세포 파쇄 과정
야생형 CDK6 / P16 복합체가 발현된 곤충세포 sf21 에 20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 10% 글리세롤, 0.5mM 디티오트레이톨, 1mM EDTA, 1mM PMSF 완충용액을 첨가하여 초음파 분쇄기 (HEAT SYSTEMAS-ULTRASONICS, INC., W225, 미국)로 1분씩 2회 파쇄하고 이로부터 세포 균질액을 얻은 다음 원심분리기 (Beckman J2-21, Rotor JA20, 미국)로 16,000 rpm 에서 30분간 원심분리하여 불용성 침전물을 제거하였다. 다음 이로부터 상등액만 취하여 다음 과정에 이용하였다.
(단계 2) DEAE 음이온 교환 크로마토그래피 과정
상기 과정에서 얻은 상등액을 20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 10% 글리세롤, 1mM EDTA, 0.5mM 디티오트레이톨 완충용액으로 미리 평형화된 DEAE 음이온 교환 칼럼(Pharmacia, DEAE 세파로스, 스웨덴)에 주입시켜 흡착시킨 다음 동일한 완충용액으로 세척하고 0 ∼ 0.5 M 염화나트륨 농도 구배를 이용하여 단백질을 용출시켰다. 여기에서 얻은 각 분획을 소디움 도데실설페이트 (SDS) 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 확인하고 야생형 CDK6 / P16 복합체를 포함하는 분획만을 모아 다음 과정에 이용하였다.
(단계 3) 암모늄 설페이트 처리 과정
상기 과정에서 얻은 야생형 CDK6 / P16 복합체 용액에 암모늄 설페이트가 포화농도 40% 로 되도록 첨가하여 30분간 저어준 다음 다시 원심분리하고 침전물만 따로 모아 다음 단계에 이용하였다.
(단계 4) S-200 젤 크로마토그래피 과정
상기 과정에서 얻은 CDK6 / P16 복합체 침전물을 20mM 트리스-HCl, pH 8.0, 10% 글리세롤, 0.5mM 디티오트레이톨, 1mM EDTA 완충용액에 충분히 녹인 다음 원심분리하여 녹지않은 침전물을 제거하고 상등액만을 취하여 미리 상기 완충용액으로 평형화된 S-200 젤 여과 칼럼 (Pharmacia, 스웨덴)에 주입시킨 다음 동일한 완충용액으로 단백질을 용출시켰다. 여기에서 얻은 각 분획을 SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 확인하여 야생형 CDK6 / P16 복합체를 포함하는 분획만을 모았다.
(단계 5) FPLC 모노-Q 음이온 교환 크로마토그래피 과정
상기 과정에서 얻은 야생형 CDK6 / p16 단백질 용액을 상기 완충용액으로 평형화된 모노-Q 칼럼 (Pharmacia, 스웨덴)에 주입시킨 다음 동일한 완충용액으로 세척하고 염화나트륨이 첨가된 완충용액으로 농도 구배를 이용하여 단백질을 용출시킨 다음 각 분획을 SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기영동으로 확인하여 야생형 CDK6 / P16 복합체를 포함하는 분획만을 모음으로써 고순도의 단백질을 정제하였다.
최종적으로 정제된 CDK6/ P16 복합체의 순도는 역상 고압 액체 크로마토그래피로 확인하였다 (도 5 및 표 2 참조).
번호 보유시간 (분) 면적(UV * 초) 높이 Int 타입 % 면적 % 높이
1 7.790 3765 589 BB 0.69 1.06
2 10.955 188111 23911 BB 34.62 43.21
3 13.462 2510 326 BV 0.46 0.59
4 13.753 9034 986 VB 1.66 1.78
5 14.312 332770 28673 BB 61.24 51.32
6 15.802 1605 133 BB 0.30 0.24
7 16.910 1650 210 BB 0.30 0.38
8 18.225 3698 443 BB 0.68 0.80
9 18.618 227 61 BB 0.04 0.11
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 CDK4 와 구조적으로 유사한 CDK6 를 CDK 저해제인 p16 과 동시에 발현시킴으로 결정화가 용이하고 가용성인 CDK6 를 대량 생산하게 한다. 상기 본 발명의 방법으로 정제된 CDK6 / P16 복합체는 CDK6 / P16 복합체의 결정구조 분석, CDK6 의 구조와 작용 기작에 대한 연구 그리고 순수 정제된 CDK6 를 이용한 새로운 항암제 등의 개발에 유용하게 사용될 수 있다

Claims (7)

  1. 곤충세포에 CDK6 를 발현할 수 있는 재조합 배큘로바이러스와 p16 을 발현할 수 있는 재조합 배큘로바이러스를 동시 감염시킴으로 CDK6 와 p16 을 복합체 형태 (CDK6 / P16 복합체)로 생산하는 방법.
  2. 야생형 CDK6 유전자를 포함하는 배큘로바이러스 발현 벡터 pBacpak CDK6.
  3. 제 2항의 곤충세포 발현 벡터 pBacpak CDK6 를 야생형 배큘로바이러스와 함께 곤충세포에 감염시켜 얻은 곤충세포에서 CDK6 를 발현할 수 있는 재조합 배큘로바이러스.
  4. 제 1항의 과정에서 제 3항의 CDK6 를 발현할 수 있는 재조합 배큘로바이러스를 이용하여 야생형 CDK6 / P16 복합체를 곤충세포에서 발현시키고 이로부터 세포 파쇄액을 얻어 음이온 교환 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전 및/또는 젤 여과 크로마토그래피를 수행하는 CDK6 / P16 복합체의 정제방법.
  5. 제 4항에 있어서, 모든 과정 중의 완충용액은 pH 7.0 ∼ 10.0 범위인 것을 사용하고, 암모늄 설페이트는 포화농도가 40% 이하로 되도록 처리하며, 상기 완충용액에 환원제를 포함하는 것을 특징으로 하는 CDK6 / P16 복합체의 정제방법.
  6. 제 1항의 과정으로 히스티딘이 표지된 CDK6 / P16 복합체를 곤충세포에서 발현시키고 이로부터 세포 파쇄액을 얻어 Ni-NTA 친화 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전 및/또는 젤 여과 크로마토그래피를 수행하는 CDK6 / P16 복합체의 정제방법.
  7. 제 6항에 있어서, 모든 과정 중의 완충용액은 pH 7.0 ∼ 10.0 범위인 것을 사용하고, 암모늄 설페이트는 포화농도가 40% 이하로 되도록 처리하며, 상기 완충용액에 환원제를 포함하는 것을 특징으로 하는 CDK6 / P16 복합체의 정제방법.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO1994009135A1 (en) * 1992-10-16 1994-04-28 Cold Spring Harbor Laboratory Cyclin complex rearrangement and uses related thereto
US5624819A (en) * 1994-03-18 1997-04-29 University Of Utah Research Foundation Germline mutations in the MTS gene

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994009135A1 (en) * 1992-10-16 1994-04-28 Cold Spring Harbor Laboratory Cyclin complex rearrangement and uses related thereto
US5624819A (en) * 1994-03-18 1997-04-29 University Of Utah Research Foundation Germline mutations in the MTS gene

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cell 1989 Oct 6;59(1):103-12 *
J Biol Chem 1998 Oct 9;273(41):26506-15 *
Nature 1997 Nov 13;390(6656):184-7 *
proc. Mol. BIOL.& Genet. Vol. 12. pp571~572, Oct. 1997 *

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