JP3485186B2 - サイクリン複合体の転位およびそれに関連する使用 - Google Patents

サイクリン複合体の転位およびそれに関連する使用

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 腫瘍形成は調整解除された細胞の成長および分裂に特
徴がある。必然的に細胞成長を制御する分子経路はこれ
ら細胞分裂を調整する経路と相互作用するはずである。
しかし最近までそのような関連性に光があたる実験的証
拠が得られなかった。サイクリンＡはウイルス的にトラ
ンスフォーメーション（本明細書では「悪性トランスフ
ォーメーション」を意味し、「形質転換」ともいう。）
した細胞中のアデノウイルス発癌性タンパク質E1Aに関
連して見い出された（Giordonaら、Cell 58:981（198
9）：およびPineaら、Nature 346:760（1990））。初期
の肝細胞腫瘍では、ヒトサイクリンＡ遺伝子が肝炎Ｂウ
イルスの断片の組込み部位にあり、この断片がサイクリ
ン転写およびインビトロで分解しないキメラウイルスサ
イクリンＡタンパク質の活性化を導くことが判明した
（Wangら、Nature 343:555（1990））。細胞周期遺伝子
は当然最も強く発癌遺伝子に関連しており、これはヒト
サイクリンD1にもあてはまる。これは、始めは酵母G1サ
イクリン欠失株（Xiongら、Cell 65:691−（1991）：お
よびLewら、Cell 66:1197（1991））の遺伝的相補を介
して、その転写がマウスマクロファージ中のCSF−１に
より刺激される細胞性遺伝子として（Matsushineら、Ce
ll 65:701（1991））、および副甲状腺腫瘍中で再配列
（本明細書では「転位」ともいう。）した推定される発
癌遺伝子PRAD1中から単離された（Montokuraら、Nature
350:512（1991））。さらに２つのヒトＤ−型サイクリ
ン、サイクリンD2およびD3が引き続きPCRおよび低スト
リンジェンシーハイブリダイゼーション法を使用して同
定された（Inabaら、Genomics 13:565（1992）；および
Xiongら、Genomics 13;575（1992））。サイクリンD1は
遺伝的にbcl−１発癌遺伝子に結合し（数種のＢ−細胞
リンパ腫および白血病において免疫グロブリン遺伝子エ
ンハンサーへの転座により活性化される遺伝子座）、そ
してヒト乳癌の15−10％および頭部および頸部由来の偏
平上皮細胞癌の25−48％で遺伝子増幅部位に位置してい
た。
サイクリンは海中無脊椎動物の卵の受精後にその強力
な合成に起因して発見されたタンパク質である（Rosent
hal,E.T.ら、Cell 20:487−494（1980））。引き続き有
糸分裂時におけるポリペプチドの急激なタンパク質分解
のために、初期の開裂分裂中に２種のサイクリンＡおよ
びＢの量の変動が観察され、そこでそれらの名前が付い
た（Evans.Tら、Cell 33:389−396（1983）;Swenson,K.
I.らCell 47:867−870（1986）;Standart,N.ら、Dev.Bi
ol.124:248−258（1987））。続いてサイクリン遺伝子
がほとんどすべての真核種から単離され、多遺伝子族を
構成している（総説としてXiongら、Curr Biology １:3
62（1991）を参照にされたい）。
細胞分裂の調整においてはサイクリンの受動的という
よりむしろ能動的な関与が、静的なサイクリンmRNAがカ
エル卵母細胞の活性化を引き起こし、そしてこれらの細
胞をＭ期に導入できたという観察により明らかになった
（Swenson,K.I.らCell 47:867−870（1986））。カエル
卵母細胞の活性化はMPFとして知られているＭ期誘導因
子の合成と関連している（Masui,Y.およびC.L.Markert,
J.Exp.Zool 177:129−146（1971）;Smith,L.D.およびR.
E.Ecker,Dev.Biol.25:232−247（1971））。MPFは触媒
サブユニットがcdcプロテインキナーゼのカエル相同物
であるプロテインキナーゼである（Dunphy,W.Gら、Cell
54:423−431（1988）;Gautier,J.ら、Cell 54:433−43
9（1988）;Arion,D.ら、Cell 55:371−378（1988））。
現在までに同定されているサイクリンの中で、Ｂ−型
サイクリンはcdc2プロテインキナーゼの組込みサブユニ
ットとして働くことにより有糸分裂に作用することが示
されている（Booher,R.およびD.Beach,EMBO J.６:3441
−3447（1987）;Draetta,Gら、Cell 56:829−838（198
9）;Labbe,J.C.ら、Cell 57:253−263（1989）;Labbe,
J.C.らEMBO J.８:3053（1989）;Meier,L.ら、EMBO J.
８:2275−2282（1989）;Gautier,J.ら、Cell 60:487−4
94（1990））。Ａ−型サイクリンもcdc2キナーゼと独立
して関与し、有糸分裂よりも分裂周期の初期に作用する
と思われる酵素を形成する（Draetta,G.ら、Cell 56:82
9−838（1989）;Minshull,J.ら、EMBO J.９:2865−2875
（1990）:Giordano,A.ら、Cell 58:981−990（1989）;P
ines,J.およびT.Hunter,Nature 346:760−763（199
0））。無脊椎または脊椎動物胚中の細胞の、および分
子の研究は、特に子嚢菌酵母での遺伝的研究によりなさ
れて来た。分裂酵母では、cdc13遺伝子はcdc2と共同作
用して有糸分裂への導入を調整するＢ−型サイクリンを
コードする（Booher、R.およびD.Beach,EMBO J.６:3411
−3447（1987）;Booher,R.およびD.Beach,EMBO J.７:23
21−2327（1988）;Hagan,I.ら、J.Cell Sci.91:587−59
5（1988）;Solomon,M.,Cell 54:738−740（1988）;Gobe
l,M.およびB.Byers,Cell 54;433−439（1988）;Booher,
R.N.ら、Cell 58:485−497（1989））。出芽酵母および
分裂酵母の両方の遺伝的研究では、cdc2（または出芽酵
母のCDC28）が細胞周期中の２つの独立した点で作用す
ることが明らかになった、それは有糸分裂点およびいわ
ゆる細胞周期の“開始”点である（Hartwell,L.H.,J.Mo
l.Biol.,104:803−817（1971）;Nurse,P.およびY.Bisse
tt,Nature 292:558−560（1981）;Piggot,J.R.ら、Natu
re 298:391−393（1982）;Reed,S.I.およびC.Wittenber
g,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87:5697−5701（1990））。
出芽酵母ではCDC28タンパク質の開始機能は、プロテイ
ンキナーゼの触媒サブユニットが、構造的に関連するＡ
およびＢ−型サイクリンの補助タンパク質と会合する必
要もある。この第三クラスのサイクリンはCLNクラスと
呼ばれ、部分的に重複する遺伝子一族を含んで成る３つ
の遺伝子が記載されている（Nash,R.ら、EMBO J.７:433
5−4346（1988）;Hadwiger,J.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 86:62556259（1989）;Richardson,H.E.ら、Cell
59:1127−1133（1989））。CLN遺伝子は開始を実行する
ために必須であり、そしてそれらが不在である場合は、
細胞は細胞周期のG1期で休止することになる。CLN1およ
びCLN2転写物は細胞周期を通じて大量に変動するが、CL
N3転写物はしない。さらに、CLN2タンパク質はそのmRNA
と平衡して変動することが示された（Nash、R.ら、EMBO
J.７:4335−4346（1988）;Cross,F.R.Mol.Cell.Biol.
８:4675−4684（1988）;Richardson,H.E.ら、Cell 59:1
127−1133（1988）;Wittenbergら、（1990））。種々の
サイクリンと関連することによりcdc2/CDC28に与えられ
る正確な生化学的特性は安全に明らかではないが、サイ
クリン突然変異体の遺伝的研究は、それらが触媒サブユ
ニットに“G1"および“G2"特性を付与しているというこ
とを明らかに立証している（Booher,R.およびD.Beach.E
MBO J.６:3441−3447（1987）;Nash、R.ら、EMBO J.７:
4335−4346（1988）;Richardson,H.E.ら、Cell 56:1127
−1133（1989））。
cdc2およびサイクリンは胚および酵母中に見いだされ
ただけではなく、ヒト体細胞中にも見いだされた。cdc2
/サイクリンＢ酵素の機能はヒト細胞中でも他の種類の
細胞中と同じであると思われる（Riabowol,K.ら、Cell
57:393−401（1989））。ヒトＡ型サイクリンもcdc2と
関連して発見された。哺乳類細胞中のCLN型サイクリン
は未だに記載されていない。細胞周期の調整およびそれ
らの相互作用に関与する要素をよりよく理解することは
細胞複製をより理解し、そしてさらにその過程を変更ま
たは制御することに貢献するだろう。
発明の要約 本発明は新規種類のサイクリン（Ｄ−型サイクリンと
呼ぶ）の使用に関し、これは哺乳類起源であり、すでに
記載されたＡ、Ｂ、またはCLN型サイクリンに関連する
が明らかに別個のものである。特に本発明は酵母の細胞
周期が開始するのに必須なCLN−型遺伝子と置換するこ
とができると示された遺伝子によりコードされているヒ
トサイクリンに関し、これは細胞周期が開始するのに必
須なタンパク質の欠失を相補し、そしてそのタンパク質
構造に基づきＡ、Ｂ、またはCLN型サイクリンの進化系
図から異なる分枝に存在する。Ｄ−型サイクリンは真核
細胞中で、特にヒト細胞中で多くのサイクリン依存性キ
ナーゼと会合することが示された。それらは３つのポリ
ペプチドと共沈殿することも示された。それらはサイク
リン−依存性キナーゼ、特性がよく知られているDNA複
製および修復因子（すなわち増殖性細胞核抗原（prolif
erating cell nuclear antigen）すなわちPCNA）および
みかけの分子量が21kDaであるポリペプチドである。結
果によるとＤ−型サイクリンCDK、PCNAおよびp21は四量
体複合体で存在し、これは成分（例えばサイクリンD1ま
たはD3およびCDK2、CDK4およびCDK5）の多くの種類の組
み合わせ変異体をインビボで集合し、そして各四量体複
合体は種々の細胞型の細胞周期で難解な種々の役割をも
つことができることが示唆されている。さらに、SV40の
ようなDNA腫瘍ウイルスによる細胞の形質転換はサイク
リンＤ複合体の選択的なサブユニット転位に関連するこ
とが発見された。サイクリンＤ、PCNA、CDKs（CDK2、CD
K4およびCDK5を含む）およびp21間の会合はDNA腫瘍ウイ
ルスまたはその発癌遺伝子産物を哺乳類細胞中に導入す
ることにより破壊される。特に本明細書に記載するよう
に、サイクリンＤ、PCNA、CDKs（CDK2、CDK4およびCDK5
を含む）およびp21間の会合はSV40腫瘍ウイルスまたは
その発癌遺伝子産物である巨大Ｔ抗原（large T antige
n）をヒト二倍体細胞中（正常ヒト二倍体繊維芽細胞に
例示される）に導入することにより破壊される。CDK4は
サイクリンＤおよびp21からの解離後、16kD（p16）の新
規ポリペプチドと会合するようになる。同様にサイクリ
ンＡ複合体もサブユニット転位を受ける。SV40の形質転
換後、p21のサイクリンＡとの会合は減少するか、また
は完全に解離する。サイクリンＡは次に19kDAポリペプ
チド（p19）との複合体中に現れる。
したがって今、p21は正常な非形質転換細胞中でのみ
サイクリンキナーゼと会合し、そしてp16およびp19なら
びに他の関連したタンパク質はトランスフォームした細
胞（本明細書では「悪性化した細胞」を意味し、「形質
転換細胞」ともいう。）中に存在する細胞周期調整因子
中に現れることが分かる。この知見はサイクリンの活性
を変化させて（直接的または間接的に）細胞分裂をモジ
ュレート（modulating）するためのさまざまな研究法の
基礎として役立つ。これは細胞中のサイクリンの発現特
異性、ならびにサイクリン、CDK、PCNAおよびp21により
形成されると思われる四量体複合体の成分の多くの可能
な組み合わせから、細胞分裂のモジュレート（すなわち
特定の細胞型での細胞分裂またはサイクル中の特定の点
を選択的に変化する能力）において特異性を提供する。
特定の態様では、Ｄ−型サイクリンまたはＡ−型サイク
リンが構成物である四量体複合体の共通成分を妨害する
ことにより（PCNAの妨害などにより）、細胞分裂を非特
異的に変化させることができる手段を提供する。
例えば本発明の治療法の一つの態様では、細胞分裂を
変化させる方法として上記四量体複合体を妨害または増
強するか、あるいは複合体の構成員の活性を変化させ
る。ここで直接的または間接的に複合体の形成を妨害ま
たは増強するか、あるいは構成物の活性を変化させる試
薬を使用できる。例えば、上記のように触媒活性をプロ
テインキナーゼの活性化を妨害することにより阻害する
ことができる。あるいはPCNA阻害剤を細胞周期の開始が
阻害される細胞中に導入し、その結果細胞分裂を抑制で
きる。PCNA阻害剤は間接的に（例えば転写または翻訳を
妨害することによりPCNAの生産を減少させる）、または
直接的（例えばPCNAに結合し、そして他の複合体の員と
結合するのを妨害する）に作用できる。p21の阻害剤も
細胞中に導入でき、そして間接的または直接的にp21機
能および／または複合体の構成員に結合するのを妨害で
きる。タンパク質−タンパク質相互作用（複合体成分間
（２つ）または中（３つ以上））も変化させて（減少ま
たは増強）、細胞周期に所望の効果を持つことができる
（細胞分裂を減少または増加させる）。そのようなタン
パク質−タンパク質相互作用を遮断する試薬を使用でき
る。これらには低分子量阻害剤、複合体成分に結合する
試薬（例えば抗体）および成分の複合体を形成する能力
を他のタンパク質で分解または破壊する試薬がある。も
し四量体複合体の形成の増強を望むならば、試薬は複合
体の構成員が相互作用または結合する能力を増強する
（例えば複合体の形成に必要なタンパク質−タンパク質
相互作用がより得られるように複合体の成分の構造を変
化させる試薬を細胞中に導入できる）。増強された複合
体の形成は細胞中の四量体複合体の特定の構成員（１つ
または複数）の数、活性または利用性を上昇させること
によりもたらすことができ、すなわち形成される割合お
よびその作用の利用性が増加する。
さらに、本発明は細胞の形質転換を診断する方法に関
する。CDKs、サイクリン、PCNAおよび低分子量ポリペプ
チド（例えばp21、p19およびp16）の間の相互作用を認
識するモノクローナル抗体のような試薬を開発できる。
例えばp16およびCDK4の間の相互作用を認識する抗体を
多くの細胞型の形質転換を検出または診断するために使
用できる。あるいは、CDC2、CDK2、サイクリンＡまたは
サイクリンＤを認識する抗体のような試薬をサイクリン
複合体のサブユニット組成（すなわちこれは細胞の形質
転換の状態）を同定するために使用できる。
本発明はまた記載した単離、診断または治療法に有用
な試薬（例えばオリゴヌクレオチド、抗体、ペプチド）
に関する。
発明の詳細な記述 サイクリンはサイクリン−依存性プロテインキナーゼ
類（CDKs）と調和して、細胞周期進行中の極めて重要な
転移および／または制限点を支配するために機能する鍵
となるタンパク質である。本発明は特定の細胞−サイク
リン過程の阻害剤および／または活性化剤を開発するた
めの方法および試薬を提供する。本明細書に記載するよ
うに、正常な真核細胞中で、特にヒト細胞中で様々な種
類のサイクリン（例えばＡ、ＢおよびＤクラス）は多く
の種々のCDKs、ならびに増殖性細胞核抗原（PCNA）およ
びみかけの分子量が21kdのポリペプチド（p21）と、多
くの型の複合体を形成するように会合することができ
る。例えば以下に与える結果は、サイクリン類およびCD
Ksの組み合わせが、PCNAおよびp21と一緒に少なくとも
１つの四量体複合体の状態で存在し、成分の多くの組み
合わせの変更体がインビボで集合することを示し、（例
えばサイクリンD1またはD3とCDK2、CDK4およびCDk5との
種々の組み合わせ）、そして生成した各四量体複合体
は、細胞周期または種々の細胞型中で複雑な様々な役割
を持つことができることを示している。したがって以下
に記載するように、例えばサイクリンおよびCDKsとの間
に形成された特定の複合体を選択的に破壊できる試薬を
同定するためのアッセイを作成できる。
さらに、本発明は形質転換細胞を検出するための診断
的アッセイおよび試薬を可能にし、これは癌の検出に有
用でありうる。以下では細胞形質転換がサイクリン−CD
K複合体の選択的なサブユニット転位と関連することを
実証する。説明するために、形質転換した細胞（ウイル
ス的または遺伝的異常による）では、サイクリンD/p21/
CDK/PCNA複合体は破壊されている。例えばウイルス的に
形質転換した細胞では、CDK4はサイクリンＤ、PCNAおよ
びp21から完全に解離し、代わりに16Kdポリペプチド
（今後“p16"という）と会合する。サイクリンＡまたは
B1およびp21/CDK/PCNAを含む四量体複合体も形質転換細
胞中ではサブユニット転位を受ける。例えばPCNAおよび
p21の両方はもはやCDC2−サイクリンB1二複合体とは会
合せず、そしてサイクリンＡ複合体はもはやp21を含ま
ず、これは代わりに19kdタンパク質（p19）に置き換わ
る。したがってそのような異常なサブユニット複合体は
細胞の形質転換を検出するために予報的に使用できる。
例えば本発明は形質転換細胞を同定するために、変化し
た複合体の形成および／またはp16の発現レベルの上昇
を検出するために、抗体および核酸プローブを含む試薬
を入手可能にする。
さらにp16は以下のサイクリン/CDK複合体、特にCDK4
を含む複合体の活性に対して阻害効果を発揮する。例え
ばp16はサイクリンD1/CDK複合体のインビボ活性を阻害
する。一般的に知られているように、サイクリンD1は多
種多様な増殖性疾患に関連してきた。したがって本発明
はサイクリンD1の発癌的な発現から生じる細胞の増殖の
有力な阻害剤を同定する。
逆に、p16をp16のCDK4に結合する能力を減少させる試
薬を同定するアッセイに使用でき、これによりサイクリ
ン/CDK4複合体の阻害を軽減できる。この態様では、CDK
4/サイクリン複合体の再活性化は形質転換細胞中で起こ
る細胞性の事象を破壊するか、あるいは平衡を失わせ
る。そのような薬剤は腫瘍ウイルスにより形質転換した
細胞中のCDK4複合体の活性化において治療的使用に有効
であり、例えば種々のウイルスが抑制した細胞周期チェ
クポイントが増大し（p53のように）、そしてチェック
ポイントでの感染細胞を蓄積させるか、あるいはRbリン
酸化の場合には細胞の死を引き起こすチェックポイント
を通過した未成熟な生育が起こるかもしれない。CDK5と
命名されたサイクリン−依存性キナーゼおよびCDK5をコ
ードするDNAも本明細書に記載された研究成果として利
用可能である。CDK5はＤ−型サイクリン、PCNAおよびp2
1と共沈殿することが示された。したがって本発明はCDK
5機能および／または複合体の他の構成員との会合を変
化（増強または減少）させて、細胞の増殖に影響を与え
ることができる。CDK5がＤ−型サイクリンに結合するこ
とを妨害されるならば、キナーゼの活性化が妨害される
であろう。これは以下に記載するように行うことができ
た。
1.正常細胞中でのサイクリン複合体 以下は、各々が細胞周期の中で、あるいは様々な細胞
型で異なる役割をもつことができる複合体をもたらす多
くの組み合わせ変異体を有する可能性がある四量体複合
体を存在するとみなす上でＤ−型サイクリン変異体が少
なくとも３つのさらなるペプチド（CDK、PCNAおよびp2
1）と関連しているとの発明について説明するものであ
る。
以下の説明および実施例１に記載するように、免疫的
手法はＤ−型サイクリンが真核細胞中で有力な触媒サブ
ユニット（例えばCDK2、CDK4およびCDK5のようなCDKs）
と会合することを明らかにするために使用された。さら
にこれらの方法ではＤ−型サイクリンおよびCDKは複製
因子PCNAおよびみかけ分子量21kDaのポリペプチドと会
合することが示された。
ヒトサイクリンD1は広範囲の増殖性疾患と関連して来
た。本明細書に記載するようにヒト二倍体細胞におい
て、特にヒト二倍体繊維芽細胞においてサイクリンD1は
多くの他の細胞タンパク質と複合体を形成する。それら
は触媒サブユニットCDK2、CDK4（以前はPSK−J3と呼ば
れた）およびCDK5（同じくPSSALREと呼ばれた）であ
る。さらに21kDaおよび36kDaのポリペプチドはサイクリ
ンD1と会合した状態で確認される。実施例１に記載する
ように、36kDaのタンパク質は増殖性細胞核抗原（Proli
ferating Cell Nuclear Antigen:PCNA）である。PCNAは
デルタ−ポリメラーゼの必須のアクセサリー因子である
と説明されてきており、これはDNA複製の鎖を導き、そ
してDNAの修復に必要である。サイクリンD3も多くのプ
ロテインキナーゼ、本明細書に示すようにp21およびPCN
Aに会合する。Ｄ−型サイクリン、CDK、PCNAおよびp21
の四量体複合体の存在、ならびに多くの組み合わせ変異
体（サイクリンD1、D3とCDK2、４および５との）がイン
ビボで集合できることが提案されている。これらの知見
により、発癌と関連している推定のヒトのG1サイクリン
と、特性がよく知られているDNA複製および修復因子と
を結び付けて考えらる。
（ｉ）サイクリンＤと会合するタンパク質の調査 サイクリンＤと特異的に会合するタンパク質を確認す
るために、［35S］メチオニン−標識W138ヒト二倍体繊
維芽細胞溶解物の抗−サイクリンD1免疫沈降物を調査し
た（実施例１、実験法を参照のこと）。W138細胞をはじ
めにこの実験のために選択したのは、それらが合理的な
高レベルのサイクリンD1および低レベルのサイクリンD3
mRNAを発現する比較的正常な細胞系だからである（Won
ら、Proc.Natl Acad.Sci.（1992））。ヒト293の形質転
換した第一期胎児性腎臓細胞はすべての３種のＤサイク
リンmRNAおよび極めて低レベルのタンパク質を発現する
ので対照として使用した（Xiongら、Cell 65:691−699
（1991））。W138細胞は容易に検出しうる、抗−サイク
リンD1抗血清で免疫沈降させることができる35kDaポリ
ペプチドを発現する。サイクリンD1としての35kDaタン
パク質の同定は、同じW138細胞溶解物と前−抗血清との
免疫沈降物とを、同様な293細胞溶解物質と同様な抗−
サイクリンD1抗血清との免疫沈降物を比較することによ
り確認した。ヒト細胞中の３つの親密に関連したサイク
リンＤ遺伝子の存在により、そして抗−サイクリンD1抗
体の他のサイクリンＤタンパク質に対する弱い交差反応
から、35kDaバンドの確認はさらに部分的タンパク質溶
解マッピングにより調査された。エス．アウレウス（S.
aureus）V8部分タンパク質溶解物の35kDaバンドは、同
様に開裂したインビトロで合成されたサイクリンD1のパ
ターンと同様であることが示されたが、サイクリンD2ま
たはD3のものとは同様ではなかった。
サイクリンD1に対応する強い35kDaバンドに加えて、
３つの他の主要バンド（p36、p33およびp21）、ならび
に１つの弱いバンドp31（ここで数字は外見上の分子量
を示す）が抗−サイクリンD1沈降物中に特異的に出現し
た。これらのポリペプチドは前−抗血清を使用したW138
細胞溶解物の沈降物、あるいは293細胞溶解物と同様な
抗−サイクリンD1抗体との免疫沈降物には無い。これら
４つのバンドのいずれも、特にp31およびp33が、おそら
くサイクリンD2またはD3である可能性は、それらのV8タ
ンパク質溶解パターンをインビトロ翻訳されたD2および
D3のパターンと比較することにより除外された。これら
のタンパク質は同じ抗体を使用したウエスタンブロッテ
ィングを組み合わせた免疫沈降法の後には検出されない
ので、これらポリペプチドと抗−サイクリンD1血清との
免疫沈降物はこれらのいずれのタンパク質中の交差−反
応性エピトープの存在によるものではないであろう。サ
イクリンD1−会合タンパク質の同定は以下に記載する。
（ii）CKD5はＤ−型サイクリンと会合する マウスマクロファージではサイクリンD1/cy11がシゾ
サッカロミセス ポンベ（G8）（Schizosaccharomyces
pombe（G8））の全長p34cdc2に対する抗体と交差−反応
するポリペプチドに会合するが、ヒトp34cdc2のＣ−末
端に対して調製された抗体には会合しないことがすでに
報告されている（Draettaら、Cell 50:319−325（198
7）:DraettaおよびBeach,Cell 54:17−26（1988）;Mats
ushimeら、Cell 65:701−713（19919））。本質的に同
一の結果は現在はヒトW138細胞にて得られ、サイクリン
D1がヒトCDC2関連物に会合することを示唆している。
G8抗体は、推定されているＤ−型サイクリン会合キナ
ーゼを単離するためにヒトcDNA発現ライブラリーをスク
リーニングするために使用された（実施例１、実験法を
参照のこと）。34個のG8−陽性cDNAクローンがHeLa細胞
cDNAライブラリーから同定された。その中で、17個のク
ローンがCDC2をコードし、そして別の14個がCDK2をコー
ドしていた。残りのクローンの１つは予想される分子量
が33,283ダルトンの292アミノ酸残基（配列番号１およ
び２）のORFをコードする。このクローンは既知のサイ
クリン−依存性キナーゼ類（CDKs）と広範囲のアミノ酸
同一性（エス．ポンベ（S.pombe）CDC2（53.4％）、エ
ス．セルビシエ（S.cerevisiae）CDC28（55.9％）、ヒ
トCDC2（56.8％）およびヒトCDK2（60.3％））を共有
し、そしてヒトＤ−型サイクリン類と会合する（以下参
照）のでCDK5と命名する。CDK5はアミノ酸配列86−92で
DLKKYFDの配列をコードし、一方対応するヒトCDC2の領
域はDLKKYLDを有し、そしてCDK2はDLKKFMDを有する。
CDK5がＤサイクリン類と会合するのかどうかを決定す
るために、CDK5の独自なカルボキシ−末端に対応するペ
プチドに対して抗血清を生成した（実施例１、実験法を
参照のこと）。この血清はヒトCDC2、CDK2またはCDK4と
は交差反応しない。免疫沈降法または免疫沈降後のウエ
スタンブロッティングでは、この抗血清が細胞溶解物中
にみかけ分子量31kDa（p31）のポリペプチドを検出し、
このポリペプチドはインビトロで合成されたCDK5ポリペ
プチドと一緒に移動し、そしてその信号（signal）はCD
K5抗原性ペプチドにより効果的に競合排除される。抗−
CDK5抗体で沈殿する31kDaタンパク質の同定は、さらにp
31の部分V8タンパク質溶解マッピングをインビトロ翻訳
されたCDK5と比較することによりCDK5であると確認され
た。
抗−CDK5抗血清を使用した35S−メチオニン標識W138
細胞の細胞溶解物の免疫沈降法では、p31CDK5に加えて
さらに数個のポリペプチドを明らかにした。その中でポ
リペプチド36kDa（p36）、p35kDa（p35）、33kDa（p3
3）および21kDa（p21）は最も顕著であり、抗−CDK5抗
血清と特異的に共沈殿した。これら４個のすべてのポリ
ペプチドは前−抗血清との、または過剰量のCDK5カルボ
キシ末端ペプチドの存在下の沈殿にはない。
p35およびp33の電気泳動的移動度はインビトロ翻訳さ
れたヒトサイクリンD1およびD3とそれぞれ同じであるこ
とが分かった。CDK5−会合p35がサイクリンD1に対応す
るであろうということを直接試験するために、CDK5の免
疫沈降物を抗−サイクリンD1抗血清とブロットした。p3
5cyclinD1と一緒に移動する35kDaのポリペプチドを、抗
−サイクリンD1抗血清により検出した。CDK5抗血清での
相互の抗−サイクリンD1免疫複合体のブロッティングで
は、p31CDK5と同じ移動度を持つ31kDaのポリペプチドの
存在も明らかになった。同様にCDK5も抗−サイクリンD3
免疫沈降物中に検出された。これらのデータはCDK5−会
合p35がサイクリンD1であり、そしてCDK5−会合p33がサ
イクリンD3であることを示している。
CDK5−会合p35およびp33タンパク質の同定の決定的証
拠を求めるために、部分的タンパク質溶解マッピングを
使用した（Clevelandら、J.Biol.Chem 252:1102−1106
（1977））。抗−CDK5免疫沈降物から精製した35S−標
識p35を、エス．アウレウス（S.aureus）V8プロテアー
ゼ部分消化に供し、同様に処理したインビトロ翻訳また
は抗−サイクリンD1免疫沈降物から得たヒトp35
cyclinD1と比較した。抗−CDK5免疫沈降物からのp35のV
8タンパク質溶解パターンは、サイクリンD1のパターン
と同一であったが、サイクリンD3とは異なった。同様な
実験をp33の同一性を確認するためにも行った。CDK5−
会合p33の部分的タンパク質溶解パターンは、ビトロ翻
訳されたヒトサイクリンD3のパターンと同一であった
が、D1とは異なった。逆にサイクリンD1−会合p31の部
分的V8消化パターンは、インビトロ翻訳された、あるい
は抗−CDK5免疫沈降物のいずれかから得たCDK5と同一で
あることも決定された。
（iii）CDK2はサイクリンＤと会合する サイクリンD1−会合p33（例えば抗−サイクリンD1沈
降物中）のみかけ分子量、ならびにp33CDK2とG8抗体と
の交差反応性は、p33がCDK2である可能性を示唆してい
る。これを試験するために、［35S］−メチオニン標識W
138細胞溶解物の抗−CDK2沈降物を、抗−サイクリンD1
沈降物と比較した。予想どおり抗−Ｃ末端CDK2血清はp3
3CDK2であると確認された（33kDaバンドの部分的エス．
アルレウス（S.aureus）V8タンパク質溶解パターンとイ
ンビトロ翻訳CDK2とのパターンとを比較することによ
り）33kDAタンパク質を沈殿させた。さらにp33CDK2は抗
−サイクリンD1沈降物中に存在するp33と一緒に移動し
た。相互的に、抗−CDK2抗血清もサイクリンD1と一緒に
移動する35kDaタンパク質を沈殿させた。
CDK2とサイクリンD1との間に会合の可能性が存在する
ことについて、さらに証拠を探すために、W138細胞溶解
物をSDS−PAGEで分離した抗−サイクリンD1で免疫沈降
させた。そして抗CDK2抗血清とイムノブロットした。抗
−CDK2抗体をカルボキシ−末端ペプチドに対して生成さ
せ（Paganoら、EMBO J.11:961−971（1992））、その特
異性を細菌的に発現させたヒトCDC2、CDK2、CDK3、CDK4
およびCDK5をイムノブロッティングすることにより検査
した。他の４つのCDKタンパク質でなく唯一CDK2だけが
この抗体により認識された。CDK2タンパク質は、抗−CD
K2または抗−サイクリンD1のいずれかと免疫沈降するW1
38細胞溶解物中に検出されたが、前−抗血清と沈降した
溶解物または競合抗原性ペプチドと予めインキュベーシ
ョンした抗−CDK2中には検出されなかった。相互のウエ
スタンブロット実験では、細胞溶解物は抗−CDK2と免疫
沈降し、そして抗−サイクリンD1とブロットされた。サ
イクリンD1は抗−サイクリンD1および抗−CDK2免疫沈降
物中に検出されるが、前−抗血清からの沈降物または競
合抗原性ペプチドと予めインキュベーションした抗−CD
K2抗血清中には検出されなかった。
CDK2もサイクリンD3と会合するかどうかについて試験
するために、ヒトサイクリンD3のＣ−末端ペプチドに対
する抗血清を使用して（実施例１、実験法を参照のこ
と）形成した免疫沈降物を抗−CDK2抗血清とブロットし
た。CDK2は抗−サイクリンD3沈殿物中に弱く検出された
が、競合抗原ペプチドと予めインキュベーションした抗
−サイクリンD3抗血清との対照沈殿物中には検出されな
かった。
最後にCDK2とサイクリンＤとの間の会合を確認するた
めに、部分的タンパク質溶解マッピングを行った。始め
にサイクリンD1−会合p33のタンパク質溶解マップの作
成が試みられ、それをCDK2と比較した。しかしCDK2と、
抗−サイクリンD1沈降物中のさらに別の優勢なプロテイ
ンキナーゼとが一緒に移動するために、異なるタンパク
質溶解パターンを得た。したがって逆の実験を行った。
抗−CDK2免疫沈降物中の35kDaバンドをSDS−ポリアクリ
ルアミドゲルから切り出し、V8プロテアーゼで部分消化
し、そして電気泳動的に分離し、そしてインビトロ翻訳
由来、あるいは抗−サイクリンD1免疫沈降物由来のV8消
化p35cyclinD1と比較した。タンパク質開裂パターンは
各々の場合で同じだった。
（iv）pSK−J3/CDK4はサイクリンD1に会合した優勢なp3
3タンパク質である サイクリンD1−会合p33のタンパク質溶解パターンとC
DK2パターンとの差異は、D1−会合p33の大部分がCDK2以
外のタンパク質に対応することを示唆した。PSK−J3と
呼ばれるプロテインキナーゼ（はじめにセリン／トレオ
ニンキナーゼの保存領域由来の混合オリゴヌクレオチド
プローブにるスクリーニングで同定された:Hanks.S.K.P
roc.Natl Acad.Sci.USA 84:388−392（1987））は、サ
イクリンＤ結合特性を有するものと考えられた。PSK−J
3の予想された分子量は、34kDaであり、p33の分子量に
近い。以下に示すこのＤサイクリンとの会合ゆえに、PS
K−J3は本明細書ではCDK4と呼ぶ。インビトロ翻訳CDK
4、および抗−CDK4血清との細胞溶解物からの沈殿物はC
DK2およびD1−会合p33と同じ電気泳動的移動度を示し
た。抗−CDK4抗血清によるCDK4沈殿物の同定は、その部
分的V8マッピングパターンとインビトロ翻訳CDK4とのパ
ターンを比較することにより確認した。
サイクリンD1−会合p33がCDK4であるかどうかを直接
的に試験するために、免疫沈降−ウエスタンブロッティ
ング実験を行った。抗−CDK4血清は、抗−CDK4で沈殿す
るCDK4と同じ移動度を持つ抗−サイクリンD1免疫沈降物
中の33kDaタンパク質と反応したが、CDK2またはCDK5の
いずれの細胞溶解物とも反応しなかった。相互的に抗−
CDK4抗血清はまた、抗−サイクリンD1抗体で検出される
35kDaタンパク質を沈殿させる。サイクリンD1−会合p33
の同一性をさらに確認するために、p33の部分的V8消化
パターンをCDK4とCDK2との免疫沈降物と比較した。サイ
クリンD1−会合p33はCDK4ときめて同様なパターンを示
したが、CDK2のパターンとは極めて異なった。この結果
はW138細胞の抗−サイクリンD1沈殿物中にCDK2よりもCD
K4がかなり豊富である（少なくともメチオニン標識で大
ざっぱにアッセイした場合）ことを示している。同様に
抗−CDK4免疫沈降物中に見られる33kDaポリペプチド（p
33）は、部分V8ペプチドマッピングによりサイクリンD3
であると同定された。
（ｖ）p21のサイクリンD1およびCDK2との会合 抗−サイクリンD1血清で沈殿した［35S］−メチオニ
ン標識W138溶解物中で、21kDaタンパク質（p21）が特異
的にサイクリンD1と特異的に会合することが見られた。
p21は前−抗血清での沈殿物、または293細胞由来の抗−
サイクリンD1沈殿物中（未検出レベルのサイクリンD1を
含有する）のいずれにも存在しなかった。p21とサイク
リンD1との特異的会合は、CDK2、CDK4およびCDK5に対す
る血清で形成された免疫沈降物中で一緒に移動する21kD
Aタンパク質の存在により支持された。抗−CDK2抗血清
が競合するCDK2ペプチドにより予めブロックされた時、
p21バンド、ならびにp33CDK2およびp35cyclinD1も見ら
れなかった。同様にp21は、もし抗血清がCDK5カルボキ
シ−末端抗原ペプチドと予めインキュベーションされる
ならば抗−CDK5免疫沈降物中にも無かった。p21はこの
実験で使用したいずれの抗−CDKまたは抗−サイクリン
Ｄ抗体によるウエスタンブロットでも認識されなかっ
た。さらに293個の細胞中、全免疫沈降性CDK2はW138と
同じであったが、p21バンドは293細胞溶解物からのCDK2
免疫沈降物中には存在しなかった。この知見はCDK2およ
びp21がサイクリンＤに依存していることを示唆してい
る。
サイクリンD1免疫沈降物およびCDK2免疫沈降物由来の
p21が同じポリペプチドであるかどうかを決定するた
め、各源から精製したp21の部分的V8タンパク質溶解パ
ターンを比較した。それらは全く同じであった。抗−CD
K5抗血清で沈殿したp21は、サイクリンD1−会合p21と同
じであることも分かった。抗−CDK4免疫沈降物中のp21
もタンパク質溶解的マッピングを行った。これはサイク
リンD1−会合p21のパターンと同一であった。p21はその
電気泳動的移動度がヒトマックスタンパク質（max prot
ein）またはp21rasのいずれよりも早く、そしてウエス
タンブロットで抗−ヒトras抗体により認識されないの
で、ヒトマックスタンパク質またはp21rasには対応しな
い［p21配列を加えるべきか？］。
（vi）サイクリンD1−会合p36はPCNAである 上記に説明したように、W138細胞の抗−サイクリンD1
沈殿物は、会合ポリペプチド21kDa、31kDaおよび33kD
a、ならびにまた36kDaの優勢タンパク質を示す。p36は
前抗血清または293溶解物を使用した対照沈殿物中には
検出されなかった。より少量のみ36kDaタンパク質も、C
DK2、CDK4およびCDK5免疫沈降物中に検出されたが、競
合ペプチドで予めインキュベーションした抗血清との免
疫沈降物中には検出されなかった。
p36の同定を確立することを試みている間、４つの考
察によりこれはヒト増殖性核抗原（Proliferating nucl
ear antigen:PCNA）であるかもしれないという可能性が
示唆された。第一に増殖しているW138細胞の非同時的な
一群（asynchronous population）では、サイクリンD1
が主要な核タンパク質であることが観察されているが、
その分布はPCNAのスペックルドパターン（speckled pat
tern）と同一ではない（Bravo,RおよびH.MacDonald−Br
avo,EMBO J.４:655−661（1985）:Madsen.P.およびJ.E.
Celis.FEBS Lett.193:5−11（1985）。第二にサイクリ
ンD1のレベルはマイトジェン活性化W138細胞中で比較的
一定しているが、［35S］メチオニン−標識サイクリンD
1免疫沈降物のp36は休止細胞中で低く、刺激10−14時間
後に増加した。血清刺激10−14時間後、多くのW138細胞
が後期G1にあり、この時期は血清−刺激3T3繊維芽細胞
中でPCNA合成の開始に一致する（Bravo,R.およびH.MacD
onald−Bravo,EMBO J.,３:3177−3181（1984）;Celis,
J.E.およびA.Celis,Proc.Natl Acad.Sci.USA 82:3262−
3268（1985）:Madsen P.およびJ.E.Celis,FEBS Lett.19
3:5−11（1985））。第三にp36の外見上の分子量はPCNA
の分子量と同様である。最後に抗−PCNA抗体は、電気泳
動的移動度がp35cyclinD1の移動度と同じである35kDaポ
リペプチドを沈殿させる。抗−PCNA抗体で沈殿するp36
の同定は、そのV8ペプチドマップをインビトロ翻訳PCNA
のペプチドマップと比較することによりPCNAとして確認
された。
p36がPCNAであることの可能性を直接的に試験するた
めに免疫沈降−ウエスタンブロット実験を行った。PCNA
は抗−サイクリンD1、サイクリンD3、CDK2およびCDK5免
疫沈降物中に容易に検出されるが、対照沈殿物中には現
れなかった。また相互の実験でサイクリンD1およびCDK2
は抗−PCNA免疫沈降物中に検出された。おそらくW138細
胞中での両タンパク質の存在の低さ、およびウエスタン
ブロットでのD3およびCDK5の相対的な感度の悪さから、
PCNA沈殿物中にサイクリンD3またはCDK5を納得できるよ
うに検出することは不可能だった。
PCNAと、サイクリンD1およびCDK2に会合するp36ポリ
ペプチドとの間の類似性をさらに評価するために、p36
バンドをサイクリンD1およびCDK2免疫沈降物から精製
し、SDS−PAGEで分離し、そしてそれらの部分的V8タン
パク質溶解マッピングパターンをPCNAのパターンと比較
した。V8プロテアーゼでサイクリンD1−会合p36を消化
すると、抗−PCNA免疫沈降物およびインビトロ翻訳PCNA
に由来するPCNAのパターンと同じであることが明らかに
なった。同様に、CDK2−およびCDK5−会合p36の消化パ
ターンもPCNAのパターンと一致した。サイクリンD1に会
合するp36はPCNAである。さらに抗−PCNA免疫沈降物中
で検出されたp21のタンパク質溶解マッピングにより、p
21が上記のサイクリンD1−会合p21と同じであることが
実証された。
（viii）他のサイクリン類のサブユニット複合体 上記のようにPCNAおよびp21はサイクリンＤ−CDKと会
合して四量体複合体を形成するだけでなく、多くの他の
正常細胞例の中でサイクリン−CDK複合体の普遍成分と
しても存在する。抗−サイクリンＡ抗体と免疫沈降した
W138細胞およびHSF43細胞の溶解物中で、サイクリンＡ
がPCNA、CDC2、CDK2およびp21と会合することが分かっ
た。
同様にしてW138およびHSF43溶解物由来の35S−メチオ
ニン−標識抗−サイクリンB1免疫沈降物の分析では、サ
イクリンB1、CDK、p21およびPCNAを含んで成る四量体複
合体が明らかになった。
本調査で使用した実験技法は、公式には各タンパク質
間で多くの対を形成する相互作用の存在を区別しない
が、このデータでＤサイクリン、PCNA、CDKおよびp21が
四量体複合体を形成するかもしれないことを最も端的に
説明している。免疫沈降反応のメチオニン−標識バンド
の強さを比較することにより、すべてのサイクリンＤが
複合体中に存在するのではなく、またすべてPCNAが存在
するわけでもないことが示唆された。しかし抗−サイク
リンＤ沈降物中のp36（PCNA）、p33（CDK4）およびp21
バンドの相対的な強さは、大変似ている。本明細書で与
える結果はサイクリンＤ（本明細書に記載するタンパク
質と会合している、またはしていない）がさらにインビ
ボのパートナーと会合するの可能性を除外するものでは
ない。特に、97kDの分子量マーカーのいずれかの側に移
動する２つのポリペプチドは抗−サイクリンＤ沈降反応
中に現れる。
PCNAは、DNA−鎖の複製を導き、そしてDNA修復の両方
に必要なデルタポリメラーゼの必須なアクセサリー因子
であると説明されて来た（Prelich,Gら、Nature 326:51
7−520（1987）:Prelich,G.およびB.Stillman,Cell 53:
117−126（1988）;Toschi,L.およびR.Bravo J.Cell Bio
l.107:1623−1628（1988）;M.K.K.Shivijiら、Cell 69:
367−374（1922））。PCNAは核中の活性なDNA合成部位
に位置し、そしてPCNAの位置は（その合成ではない）DN
A合成に依存している。インビトロのキナーゼ反応にお
いて、任意の各サブユニットのリン酸化を検出すること
は不可能であり、これはPCNAおよびp21のいずれもがサ
イクリンD/CDKの第一基質であることを示唆している。
PCNAおよびp21と会合するサイクリンD/CDK酵素はイン
ビトロでより複雑な多−タンパク質−DNA合成複合体に
集合し、その中の１成分がサイクリンD/CDKの生理的基
質であるかもしれない。PCNAは一般的に細胞から他のタ
ンパク質とは会合していない単量体で生化学的に精製さ
れた（Prelich,Gら、Nature 346:760−763（1987））。
本明細書に記載された研究では、多−タンパク質複合体
が細胞性PCNAの大部分を含んでいないため見過ごされた
可能性がある。あるいはPCNAがこれまでに記載されたこ
とがない、サイクリンＤおよびCDKタンパク質を含む非
−DNA合成細胞周期制御の役割を持つ、ということも可
能である。しかし本研究は第一の生化学的指標としてＤ
−型サイクリンに可能な機能としてPCNA機能のモジュレ
ーター（modulator）を提供するものである。
四量体複合体の重要性は、細胞のDNA腫瘍ウイルスに
よる形質転換が、サイクリンＡ、CDC2、CDK2、CDK4およ
びCDK5を含む他の細胞周期複合体と同様にサイクリンＤ
複合体の選択的なサブユニット転位に関連するという新
たな知見により強調される。特にSV40 DNA腫瘍ウイル
ス、またはその発癌性遺伝子産物巨大Ｔ抗原の正常ヒト
二倍体繊維芽細胞（HDF）への導入は、サイクリンＤお
よびPCNA、CDKs（CDK2、CDK4およびCDK5のような）なら
びにp21間の会合の破壊を引き起こす。サイクリンＤお
よびp21からの解離後、CDK4キナーゼが16kDaポリペプチ
ド（p16）に会合するようになる。同様にSV40形質転換
はHDF中、そしてアデノウイルス−（293細胞系）または
ヒトパピローマウイルス−（HeLa細胞系）で形質転換し
た細胞中でp21とサイクリンＡとの会合の減少を引き起
こし、p21はサイクリンＡから完全に解離する。19kDaペ
プチド、p19が次にサイクリンＡとの複合体中に現れ
る。したがってp21は正常な非形質転換細胞中でのみサ
イクリンキナーゼと会合し、一方p16およびp19、ならび
におそらく他の関連するタンパク質は形質転換細胞中の
サイクリン複合体に存在する。
II. 形質転換細胞中のサイクリン複合体 以下に説明するように、本考察は細胞分裂の多くの鍵
となる段階で作用するサイクリン/CDK酵素の一族は、発
癌的に形質転換した種々の細胞中でおおざっぱに変化す
るという衝撃的な証拠を提供する。調査したサイクリン
/CDK一族の各員は、PCNAおよびp21と会合する。しかしD
NA腫瘍ウイルスSV40で形質転換すると、またはその形質
転換抗原（Ｔ）で形質転換すると、サイクリンD/CDK/PC
NA/p21複合体は破壊される。形質転換細胞では、CDK4は
サイクリンＤ、PCNAおよびp21とは全体的に解離してお
り、そして代わりに排他的に16kd（p16）ポリペプチド
と会合している。サイクリンＡまたはB1およびp21/CDK/
PCNAを含有する四量体複合体も、形質転換細胞中でサブ
ユニットの転位を受ける。PCNAおよびp21の両方はもは
やCDC2−サイクリンB1二量体複合体とは会合しない。サ
イクリンＡ複合体はもはやp21を含有せず、むしろ新な1
9kdポリペプチド（p19）がサイクリンＡに会合して見い
だされる。サイクリン−CDK複合体のサブユニット転位
がSV40−形質転換細胞中だけでなく、アデノウイルスま
たはパピローマウイルスで形質転換された細胞中でも見
いだされたならば、このパターン。さらにサイクリン−
CDK一族のサブユニット組成パターンは非−ウイルス形
質転換細胞中（リ−フローメニ患者（Li−Fraumeni pat
ients）由来のp53−欠失細胞、ならびに上皮Ａ−431癌
細胞、および咽頭偏平上皮細胞癌細胞FaDuのような）で
は大まかには異常である。
（ｉ）SV40−形質転換細胞中でのサイクリンD/CDK/PCNA
/p21複合体の破壊 サイクリンD/CDK/PCNA/p21四量体複合体は上記のよう
に正常な繊維芽細胞（例えばW138adHS68）中で検出され
たが、このような複合体はウイルスで形質転換された数
種の他の細胞系（例えばヒト293細胞系）では検出され
なかった。与えられた明らかな差異、正常な二倍体繊維
芽細胞中のサイクリンＤ複合体のサブユニット組成、お
よびそれらの形質転換された誘導体をより詳細に比較し
た。W138VA13、2RAサブライン（今後、本明細書にてVA1
3と呼ぶ）はW138細胞系由来のSV40ウイルスで形質転換
した誘導体である。35Sメチオニン−標識W138およびVA1
3溶解物の抗−サイクリンD1免疫沈降物を調査した。W13
8細胞について上述したように、抗−サイクリンD1抗血
清はサイクリンD1に対応する優勢な35−kDバンド、およ
び３つの主要会合タンパク質p36PCNA、p33CDK4およびp2
1を沈殿させる。SV40−形質転換VA13細胞において、サ
イクリンD1のレベルは、35Sメチオニン−標識免疫沈降
物のオートラジオグラフィー、およびウエスタンブロッ
ティングにより測定すると、２−から３倍まで減少す
る。しかし３つの主要サイクリンD1−会合タンパク質の
いずれもSV40で形質転換したVA13細胞中のサイクリンD1
と視覚的に会合することは無かった。観察されたSV40で
形質転換した細胞中のサイクリンＤ複合体の破壊を確認
するために、相互の免疫沈降を抗−CDK4および抗−CDK2
抗血清を使用して行った。W138細胞では抗−CDK4抗体は
３つの主要会合タンパク質、p36PCNA、p33cyclinD1およ
びp21に加えてCDK4を沈殿させた。SV40で形質転換したV
A13細胞では、CDK4は非形質転換W138細胞と比較して同
様なレベルで存在するが、抗−CDK4免疫沈降物中に検出
しうるPCNA、サイクリンD1またはp21は存在しなかっ
た。また同様な結果が抗−CDK2（別のサイクリン−Ｄ会
合キナーゼ触媒サブユニット）との免疫沈降物中にも観
察された。サイクリンD1はW138細胞中の主要CDK2−会合
タンパク質の１つであるが、たとえCDK2のレベルが形質
転換細胞中で同様、またはわずかに高くてもSV40−形質
転換VA13細胞中で会合は検出されない。またCDK2−会合
p21のレベルは形質転換細胞中では減少したが、検出し
うるレベルで存在する。
さらに数種の正常ヒト二倍体繊維芽細胞系およびその
SV40−形質転換誘導体を調査した。HSF43は新生児包皮
から派生した二倍体繊維芽細胞であり、そしてCT10−2C
−T1（今後、本明細書でCT10と呼ぶ）はHSP43からSV40
巨大腫瘍抗原遺伝子をラウス肉腫ウイルス（RSV）プロ
モーターを駆動させることにより導入して得た（Ray
ら、J.Cell Biochem 42:13−31（1990））。正常および
形質転換細胞のサブユニット組成ならびに解離パターン
は、W138およびVA13細胞で観察されるパターンと極めて
近かった。Ｔ−形質転換CT10細胞から調製された抗−CD
K4、抗−CDK2および抗−CDC2免疫沈降物中にはサイクリ
ンD1は見られなかったが、HSF43細胞中には出現した。
相互的に、CDK4はCT10細胞の抗−サイクリンD1沈殿物に
は見られなかった。CDK4−会合PCNAおよびp21もCT10細
胞中に検出されなかった。Ｔ−形質転換細胞中のp21はV
A13細胞系のように、新に同定されたp16タンパク質によ
り置き換えられると思われた。さらに本質的に同一の結
果がヒト繊維芽細胞系であるIMR−90、正常ヒト肺二倍
体細胞系およびそのＴ−形質転換誘導体IDH4の別の対で
も得られ（Shayら、Biochem Biophys Acta 1072:1−７
（1992））ならびにサル細胞系CV−１、擬二倍体腎臓細
胞系、およびそのSV40−形質転換誘導体COS−１の対で
も得られた。
形質転換細胞中で観察されたサイクリンＤ複合体の解
離をさらに確認するために、イムノブロッティングと組
み合わせた免疫沈降法がしばしば代謝的標識実験におい
て生じる可能性があるアーティファクトを避けるために
行われた。非形質転換W138またはSV40−形質転換VA13細
胞のいずれかから調製した全溶解物を、電気泳動的に分
離した抗体の一群で免疫沈降させ、そして種々の第二抗
体とブロットした。CDK4、CDK2およびPCNAは検出されな
いか（CDK4）、またはSV40−形質転換細胞由来の抗−サ
イクリンD1沈殿物中では劇的に減少したレベルで存在す
る（CDK2およびPCNA）かのいずれかであった。それぞれ
の場合において、直接的なイムノブロッティングによ
り、CDK4、CDK2およびPCNAの絶対的レベルは正常および
形質転換細胞中で同様であることが確認された。相互的
に、サイクリンD1は形質転換VA13細胞に由来する抗−CD
K2または抗−CDK4沈殿物のいずれにも検出されなかっ
た。同じ結果が別の細胞系の対のそれぞれ（HSF43およ
びCT10）からも得られた。
（ii）形質転換細胞中のサイクリンＡおよびＢ複合体の
サブユニット転位 非形質転換W138細胞およびSV40−形質転換VA13細胞中
のサイクリンＡ複合体のサブユニット組成を調査した。
上記のように、サイクリンＡはW138細胞中のp36PCNA、p
33CDC2、p33CDK2およびp21と会合する。SV40−形質転換
VA13細胞では、サイクリンＡそれ自体、およびサイクリ
ンＡ−会合CDC2/CDK2の両方のレベルが約３倍に増加し
た。相互にCDC2−およびCDK2−会合サイクリンＡのレベ
ルも２−から３倍に増加した。
サイクリンＡ−会合p21のレベルは35S−メチオニン標
識細胞溶解物の免疫沈降により測定したように、W138細
胞と比較してVA13細胞中では減少する。p21のレベルはC
DK2（サイクリンＡの主要触媒パートナー）に対する抗
血清を使用するVA13細胞から調製した免疫沈降物中でも
低い。正常IMR−90細胞対そのＴ形質転換IDH細胞、およ
びサルCV−1/COS−１対細胞系に加えて、HSF43およびCT
10細胞を使用して、同様な結果が一貫して得られた。
非形質転換細胞に特異的な、または形質転換細胞に特
異的な別の多くのポリペプチドがサイクリンＡ沈殿物中
に見られた。例えば分子量が42kDであるタンパク質は非
形質転換W138またはHSF43細胞中に優勢に見られるが、
形質転換VA13またはCT10細胞中には見られない。逆に、
Ｔ抗原に対応するかもしれない95kDのポリペプチドは、
19kDのポリペプチドのように（以下に考察する）形質転
換細胞中にのみ見られる。
正常および形質転換細胞中のサイクリンB1複合体のサ
ブユニット組成も調査した。D1と同じように、サイクリ
ンB1/CDK/p21/PCNAの四量体複合体は、非形質転換W138
およびHSF43細胞を比較した時、SV40−形質転換VA13細
胞およびＴ−形質転換CT10細胞中の両方で変化する。し
たがってPCNAおよびp21のいずれもサイクリンB/CDKとは
形質転換細胞中で会合しない。しかし予想通り、CDC2は
サイクリンB1（p62）とVA13、CT10、293およびHeLa細胞
中で会合している。
（iii）他のDNA腫瘍ウイルス−形質転換細胞中のサイク
リンおよびCDK複合体 他のヒト腫瘍細胞中でもサイクリン−CDK複合体が変
化するのかどうかを調査するために、パピローマウイル
ス−含有頸部腫瘍HeLa細胞およびアデノウイルス−形質
転換第一期腎臓293細胞を、種々のサイクリンおよびCDK
複合体のサブユニット組成について調査した。両方のこ
れら細胞系は哺乳類細胞周期の生化学的研究に広く利用
されてきた。サイクリンD1はHeLa細胞中で低レベルで発
現し、そして293細胞中でわずかに検出できる。しかし
他のサイクリン/CDK複合体のサブユニット組成を調査で
きる。よく確立されたCDC2−サイクリンB1、CDC2−サイ
クリンＡおよびCDK2−サイクリンＡの会合は、すべてHe
Laおよび293細胞中の両方で容易に検出された。しかし
第p21は、HeLaまたは293細胞のいずれかからの抗−CDC
2、抗−CDK2、抗−サイクリンＡまたは抗−サイクリンB
1免疫沈降物中に見られた。したがってサイクリンA/CDK
/p21/PCNAおよびサイクリンB1/CDK/p21/PCNAの四量体複
合体は、集合していないか、あるいはこれらのDNA腫瘍
ウイルス−形質転換細胞中では極めて低レベルで存在し
ているかのいずれかである。事実、複合体中のp21が19k
Dのポリペプチドに置換されたと思われる新規サイクリ
ンＡ複合体が出現した。同じ19kDのポリペプチドはSV40
−形質転換ヒトVA13、CT10、IDH4およびさらにサルCOS
−１細胞由来の抗−サイクリンＡ沈殿物中に存在する。
さらに293およびHeLa細胞では、CDK4のサブユニット組
成はＴ−抗原−形質転換細胞のサブユニット組成と同一
である。サイクリンD1はCDK4とは会合しないが（種に起
因する細胞からのサイクリンＤの不在）、PCNAおよびp2
1も存在しない。p21はHeLaおよび293細胞ではp16により
置換された。おもしろいことには、CDK4−会合p16は非
形質転換W138またはHSF43細胞では極めて低レベルで検
出される。それぞれのタンパク質溶解開裂マッピングで
は、HeLa、293、VA13およびW138細胞からのCDK4−会合p
16は同一であるが、p21とは異なることが明らかになっ
た。３つの異なるウイルスにより形質転換した細胞中の
p19およびp16の存在、ならびに非形質転換細胞中のp16
の存在はそれらがウイルスにコードされているタンパク
質ではないことを示している。
（iv）リ−フラウメニ細胞中のサイクリンおよびCDK複
合体の変化 リ−フラウメニ患者の一族由来の繊維芽は、異数性お
よび不滅化を高い割合で含む自然発生的異常を現す（Li
ら、J.Natl Cancer Inst 43:1365−1373（1969）：なら
びにBischoffら、Cancer Res 50:7979−7984（199
0））。これらの細胞はいかなる既知のウイルスをも含
まない；代わりに腫瘍サプレッサー遺伝子p53の単一−
塩基のヘテロ接合体的突然変異（heterozygous mutatio
ns）がグラム系の変化として報告されているだけであ
る。連続的したインビトロでの継代中にリ−フラウメニ
繊維芽が老化現象および自然発生的な不滅化から逃れる
のは、野生型p53対立遺伝子の第二欠失に関連してい
る。自然に発生した不滅化リ−フラウメニ細胞系、LCS0
41（継代＞170）由来の35S−メチオニン−標識細胞溶解
物を、種々の抗体と免疫沈降させ、そしてSDS−PAGEで
分析した。LCS041細胞中のほとんどのこれらタンパク質
のレベルは、サイクリンＡが正常繊維芽と比較するとか
なり低レベルで発現することを除いて、代謝標識および
イムノブロッティングにより測定されるように正常二倍
体繊維芽中のレベルと同様である。サイクリンおよびCD
K複合体のサブユニット組成は、LCS041細胞中では大ま
かに異常であり、HeLaおよび293細胞中のようにサイク
リンB1−CDC2複合体が存在し、そしてp21またはPCNAと
会合しない。サイクリンD1−CDK4会合はLCS041細胞中で
はほとんど検出されないレベルまで減少し、そしてPCNA
およびp21の両方が存在しない。p21はLCS041細胞中で調
査したいずれのサイクリン−CDK複合体中にも検出され
ず、そしてＴ−抗原−形質転換繊維芽で生じたようなp1
6またはp19タンパク質による置換は無いように思われ
た。サイクリン−CDK複合体に会合したPCNAのレベル
も、各場合について劇的に減少した。直接的イムノブロ
ッティングではPCNAの量は正常繊維芽と比較してLCS041
細胞よりも高いが、抗−CDC2、CDK2、CDK4、サイクリン
Ａ、サイクリンB1およびサイクリンD1で単離した免疫複
合体中ではPCNAは劇的に減少するか、または全く無かっ
た。本質的に同一の結果が別のリ−フラウメニ細胞系、
LCS087を使用しても得られた。
III. p16およびCDK4の阻害剤のクローニング ヒトCDKと相互作用できるタンパク質を調査し、より
特別にはp16をコードするcDNAを単離するために、２−
ハイブリッドスクリーニングシステム（two−hybrid sc
reening system:Fieldsら、Nature 340:254（1989））
を利用した。２−ハイブリッドスクリーニングは機能的
なGAL4活性化因子を２つの別個の融合タンパク質から再
構成させることによる：それはCDK4に融合するGAL4 DN
A−結合ドメイン、GAL4db−CDK4;およびHeLa cDNAsによ
りコードされるタンパク質に融合するGAL4活性化ドメイ
ン、GAL4ad−cDNAである。YPB2は２つの異なるGAL4−依
存性プロモーター（HIS3およびLacZ）の制御下の２つの
染色体遺伝子を含む株であるので、受容体酵母として使
用した。YPB2をそれぞれGAL4db−CDK4およびGAL4ad−cD
NA融合体をコードする２つのプラスミドの混合物で形質
転換させた。ヒスチジンの不在で成長し、そしてβ−ga
lの存在で青色に変わる数個のクローンを得た。DNAのシ
ークエンシングデータから、各陽性クローンは同じ遺伝
子から派生したものと決定したが、１つの群はより短い
3'末端を持つmRNAを示すことが明らかになった。これら
のcDNAs配列はGAL4adのフェイズ中で、予想される分子
量が15,845ダルトンである148アミノ酸（配列番号３お
よび４）のタンパク質をコードする読み取り枠を含ん
だ。このタンパク質をINK4（CDK4の阻害剤：以下参照）
と呼ぶ。p16INK4の配列を標準的な方法で現在入手でき
るデータバンクにある配列と比較し、そして有意な相同
性は見いだされなかった。
p16INK4が特異的にCDK4に結合するのかどうかを試験
するために、YPB2をGAL4ad−p16INK4融合体、ならびに
それぞれcdc2、CDK2、CDK4、CDK5、PCNAおよびSnfl（分
裂酵母キナーゼ）をそれぞれ含む数個の標的GAL4db融合
構造体とを一緒にコートランスホーム（cotransform）
した。形質転換した細胞をヒスチジンの有無でプレート
にまいた。GAL4db−CDK4融合体のみがGAL4ad−p16INK4
とある程度相互反応し、ヒスチジン無しでも生育できた
が、これはこの融合タンパク質対がHIS3遺伝子の発現を
増強できる機能的GAL4活性化剤を特異的に再構築したこ
とを示す。同じ結果がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発
現をトランス活性化する能力をアッセイした時にも得ら
れた。
この相互作用の特異性をさらに無細胞系で、インビト
ロ翻訳（35S）−標識CDKsとp16INK4（17）に連結したグ
ルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（GST）から成る精
製した細菌生産融合タンパク質とを混合することにより
実証した。GST−p16INK4融合体はグルタチオン−セファ
ロースビーズに結合させて回収し、そして各CDKの会合
をゲル電気泳動により分析した。以前の観察と一致し
て、GST−p16INK4はcdc2、CDK2またはCDK5よりも効率的
にCDK4に結合した。
p16INK4の予想された分子量は16Kdに近かったので、p
16INK4を形質転換細胞系（上記）中に見られたCDK4−会
合p16タンパク質との同一性が測定された。２つのイン
ビトロ翻訳生産物、15KDおよび17KD生産物をp16INK4 c
DNAから得た。これらの生産物、ならびにHeLa細胞由来
のCDK4−会合p16タンパク質をＮ−クロロスクシンイミ
ドで処理した。17KDのcDNAINK4−誘導産物の部分的なNC
S−タンパク質溶解パターンは、HeLa細胞由来のCDK4−
会合p16タンパク質と大変似ていた。これはp16INK4 cD
NAが実際p16に相当することを強力に指示している。17K
D cDNAINK4−誘導産物およびp16のV8プロテアーゼ部分
消化も同様なパターンを生じた。昆虫細胞中で過剰発現
したp16INK4タンパク質は15KDの電気泳動的移動度を持
ち、そしてNCSタンパク質溶解マップが15KD cDNA誘導
産物で得たマップと同一であることに注目することは興
味深い。これはヒト細胞中および17KDインビトロ翻訳産
物中に見られる実際のp16INK4が、翻訳後に修飾された
タンパク質に相当することを示唆している。昆虫細胞中
で過剰発現したp16INK4タンパク質がCDK4と相互作用す
るという事実は、この修飾が相互作用に必須ではないこ
とを示唆している（以下参照）。
p16INK4とCDK4−会合タンパク質p16との間の同一性
は、精製したGST−p16INK4融合タンパク質に対して生成
した抗体を使用してさらに確認した。数種のヒト細胞系
をこの実験に使用した。それらは正常肺繊維芽由来の正
常細胞系W138;SV40 Ｔ抗原で形質転換したW138由来のV
A13細胞系；そしてHeLa細胞である。上記に説明したよ
うにW138の抗−CDK4免疫沈降物は、CDK4とサイクリンD
1、PCNA、p21およびp16との会合を明らかにした。対照
的にVA13およびHeLa細胞CDK4はp16にのみ会合した。抗
−p16INK4免疫沈降物は、外見上の分子量が16KDであ
り、２つの形質転換細胞系（VA13およびHeLa）で容易に
検出できるが、正常細胞系W138でははるかに少ないタン
パク質を含んでいた。このタンパク質は抗−CDK4血清と
一緒に免疫沈降するp16タンパク質と同じ電気泳動的移
動度を持つだけでなく、同一のNCS部分タンパク質溶解
パターンを有していた。p16INK4に加えて、33Kdのタン
パク質が抗−p16同時免疫沈降物（coimmunoprecipitate
s）中に観察され、これはV8タンパク質溶解マッピング
によりCDK4と同一であることが示された。
W138およびVA13細胞中に存在する転写物のノーザン分
析では、何回もp16INK4 mRNAの量はW138細胞中ではVA1
3細胞中と比較して少ないことが示された。この差異
は、２つの細胞間で観察されたp16タンパク質の量の差
異におよそ相当し、これはp16INK4発現が転写または転
写後に制御されているかもしれないことを示唆してい
る。実際、３つの非ウイルス的に形質転換した細胞系で
はp16INK4の発現はゲルを過剰に露出させた後でも検出
できなかった。
p16INK4とCDK4との相互作用の生化学的帰結を調査す
るために、活性なCDK4−サイクリンＤ複合体を標準的な
方法でインビトロで再構成した（Katoら、Genes Der
７:331（1993）；およびEwenら、Cell 73:487（199
3））。３つの関連する成分、CDK4、p16INK4およびサイ
クリンD1をバキュロウイルス−感染昆虫細胞中で発現さ
せた。別個にp16INK4、CDK4またはサイクリンD1を過剰
発現した代謝的に（35S）−標識した昆虫細胞から、な
らびにCDK4およびサイクリンD1の両方を過剰発現してい
る細胞から抽出物を調製した。p16INK4の量の増加に反
応して、対応するCDK4がRbをリン酸化する能力の減少が
観察された。この抑制は免疫沈降法で検出されるような
p16INK4とCDK4との間の会合に相関した。CDK2−サイク
リンD2複合体を同じアッセイに使用した時は抑制は観察
されなかった。CDK4の抑制がp16INK4によるものである
ことを確認するために、His−標識（tagged）p16INK4融
合タンパク質（His−p16INK4）を、６ヒスチジン残基域
を含有する20アミノ酸のアミノ末端の広がりを有するよ
うに作成した。この融合タンパク質をバキュロウイルス
−感染昆虫細胞中で過剰発現させ、そしてニッケル−ア
ガロースビーズに対するヒスチジン域の高い親和会合性
により精製した。このHis−p16INK4タンパク質調製物は
90％より高い純度を示し、全溶解物による抑制に使用し
たのと同じ条件下でCDK4−サイクリンD1複合体の活性を
抑制した。
IV. 本発明の使用 本明細書に記載された操作に基づき、血液、尿、便、
粘膜、唾液またはバイオプシー（細胞学的標本を含む）
のような組織または生物学的試料から得た細胞中のサイ
クリンCDK、PCNA、p21、p19およびp16が変化した複合体
を検出することが可能である。これは例えば複合体の組
成のサブユニット組成の変化と、細胞性の形質転換また
は異常な細胞増殖との間にある明らかな関連から、診断
および予知を目的とした使用に有力である。本明細書に
記載した診断および治療法は、個人の疾患状態または複
合体サブユニットのそのような転位に関連する、または
示される症状の発生の可能性を評価するために、ならび
に治療効果をモニターする（薬剤の効果、またはサブユ
ニット転位に関する薬剤の効果や評価することにより）
ために使用できる。
例えばCDKs、サイクリン、PCNAおよび低分子量ポリペ
プチド（p21、p19およびp16）との間の相互作用を認識
する薬剤を開発できる。薬剤を次に形質転換状態を試験
する細胞試料と接触させることができ、複合体中の特定
のサブユニットの存在により形質転換を指示するであろ
う。例えばCDK4−p16複合体はサイクリンＡ−p19複合体
のように形質転換を示す。あるいはサブユニット間の相
互作用の存在を測定するために、種々のサブユニットを
認識する薬剤を組み合わせて使用できる。例えばp21を
認識する薬剤をサイクリンまたはサイクリンキナーゼを
認識する薬剤と組み合わせて、p21がサイクリンまたは
サイクリンキナーゼと複合体を形成しているかどうかを
測定できる。
四量体複合体の化合物に特異的な反応性の抗体を本方
法の試薬として使用するために、既知の手法により作成
できる。例えば抗血清は適当な宿主（例えばウサギ、マ
ウス、ラット、ブタ）に所望の抗血清に対するＤ−型サ
イクリンを注射し、そして抗体が形成されるのに十分な
時間が経過し後、宿主動物から採血する。モノクローナ
ル抗体も既知の手法により作成できる、Sambrook,J.
ら、モレキュラークローニング：ア ラボラトリー マ
ニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l）、コールド スプリングハーバーラボラトリー、コ
ールドスプリングハーバー:NY.（1989）、Hallow,E.お
よびD.Lane、抗体（Antibodies）：ア ラボラトリー
マニュアル、コールド スプリングハーバー出版、ニュ
ーヨーク、（1988）。CDK5、CDK4および他の一般的CDK
s、p21、p19、p16およびサイクリン類に特異的に反応性
である抗体も既知の手法を使用して作成できる。
説明を目的とした態様では、抗体をCDK4/p16複合体に
対して生成させる。免疫原性の状態でそのような複合体
を作成するのを容易にするために、CDK4/p16複合体を化
学的架橋により作成できる。別の態様では、CDK4/p16融
合タンパク質は、各タンパク質由来のポリペプチド配列
間に非構造化ポリペプチドリンカー領域を導入するため
に、単一鎖抗体法（single chain antibody technolog
y）を使用して作成できる。このリンカーにより融合タ
ンパク質の柔軟性の増加を利用でき、２つの断片の間の
立体障害を減らして各サブユニットが自由に互いに作用
できるようにし、ならびに各断片の適切な折りたたみが
起こることを可能にする。リンカーはタンパク質の２つ
のドメインの間にランダムコイル状態で存在すると決定
された配列のような天然起源のものであることができ
る。あるいはリンカーは合成されたものであることがで
きる。例えば配列（Gly4Ser）３を合成の非構造化リン
カーとして使用できる。この種類のリンカーはHuston
ら、（1988）、PNAS 85:4879;および米国特許第5,091,5
13号明細書に記載されている。したがってCDK4/p16複合
体に似ている免疫原性複合体を作成でき、引き続きこの
複合体を認識するが単離したサブユニットは認識しない
抗体を単離できる。
さらに別の態様では、特に本発明は細胞中のp16レベ
ルを検出するためのアッセイおよびキットを意図するも
のである。p16（本明細書に記載するように）に特異的
な抗体、またはp16転写物のmRNAレベルを検出するため
の核酸プローブを、形質転換細胞を検出するために使用
できる。上記のように、p16mRNAレベル、およびおそら
くp16タンパク質は正常細胞に比べて形質転換細胞中で
は上昇する。したがってp16遺伝子発現のレベルの検出
は形質転換細胞の存在を決定するのに診断的に有用であ
る。説明のための態様では、in situハイブリダイゼー
ションアッセイをp16配列に対する核酸プローブを使用
して、標準的手法（例えば、Taubら、米国特許第4,820,
630号明細書;Falkowら、米国特許第4,358,935号明細
書；およびBresserら、米国特許第5,225,326号明細書を
参照）により行うことができる。
本発明の好適なアッセイではp16/CDK4複合体が特徴で
ある形質転換細胞と、非形質転換細胞との間のp16レベ
ルの定量的差異を確認することができる。簡単に述べる
と単一細胞懸濁液または組織片のいずれかの細胞を、ス
ライドガラスのような支持体上に付着させることができ
る。あるいは細胞を1mlあたり約105−106細胞の単一細
胞懸濁液中に置く。細胞を細胞に最高の空間的識別距離
を提供し、そして核酸プローブを使用するときに至適な
ハイブリダイゼーション効率を与えるか、あるいは抗−
p16Absを使用するときには至適な結合親和性および特異
性を与える定着薬を選択して固定する。
核酸プローブについては、ハイブリダイゼーションは
固定化を行ったものと同じ溶液で行うことができる。こ
の溶液は定着薬およびホルムアミドのようなカオトロピ
ック試薬の両方を含有する。また濃塩化リチウムまたは
酢酸アンモニウム溶液のようなハイブリッド安定化試
薬、緩衝液、低分子量DNAおよび／またはリボゾームRNA
（50塩基までの大きさ）が非特異的結合を無くすために
含まれ、そして孔形成剤（pore forming agent）でプロ
ーブが細胞中に入りやすくする。バナジル リボヌクレ
オシド複合体のようなヌクレアーゼ阻害剤を含有しても
よい。
標的ポリペプチドとハイブリダイズさせるために、ハ
イブリダイゼーション溶液にp16プローブを加える。最
も好ましいプローブは一本鎖のアンチ−センスプローブ
である。細胞mRNAにハイブリダイゼーションするため
に、約75−150塩基長のプローブが使用される。プロー
ブを含むハイブリダイゼーション溶液を固定化した細胞
を使用するときは細胞を覆うのに十分な量で加える。細
胞を次に至適温度でインキュベーションする。
プローブはハイブリダイゼーション反応前に検出でき
るように標識してもよい。あるいはハイブリダイゼーシ
ョン生成物に結合する検出しうる標識を選んでもよい。
本発明で実験に使用するために任意の検出可能な群によ
りプローブを標識してもよい。そのような検出可能な群
は検出しうる物理的または化学的特性を持つ任意の物質
であることができる。そのような検出可能な標識はイム
ノアッセイの分野でよく開発されてきており、一般的に
そのような方法に有用なほとんどの標識を本発明に応用
できる。特に有用なものは例えば酵素（Clin.Chem.,22:
1243（1976）を参照）、酵素基質（英国特許第1,548,74
1号明細書を参照）、補酵素（米国特許第4,230,797号明
細書および同第4,238,565号明細書を参照）および酵素
阻害剤（米国特許第4,134,792号明細書）のような酵素
的に活性な群；蛍光マーカー（Clin.Chem.25:353（198
9））：発色団；化学的発光物および生物的発光物マー
カーのような発光化合物（Clin.Chem.,25:512（197
9））；特異的に結合できるリガンド；近接作用対（pro
ximal interacting pairs;そして3H、35S、32P、125Iお
よび14Cのような放射性同位体。
同様な様式で、抗−p16抗体を標識してp16タンパク質
の存在を細胞試料から検出するために使用できる。
本発明は細胞形質転換を阻害または抑制する化合物ま
たは分子ヲスクリーニングする方法も含む。形質転換を
阻害する能力をアッセイする化合物または分子を細胞
と、その化合物または分子が細胞に入るのに適当な条件
下で接触させる。細胞の形質転換によりサイクリン複合
体中のサブユニットの選択的な転位が起こるだろう。化
合物または分子の存在中での転位の割合または程度の比
較は、適当な対照（例えば試験薬を加えていない同種の
細胞）の割合または程度をアッセイして行われ、この比
較により化合物または分子のサブユニット転位を阻害で
きる能力または無能力を実証できるだろう。サブユニッ
ト転位を阻害する薬剤も本発明の主題である。
例えばプロテインキナーゼ−Ｄ型サイクリン複合体の
形成は直接的な方法により妨害できる。例えばそれはプ
ロテインキナーゼまたはＤ型サイクリンに結合する薬剤
または他の試薬を細胞に導入するか、あるいはサイクリ
ンとプロテインキナーゼとの間の物理的会合を妨害して
活性化（挿入により）するか、または酵素の触媒活性を
破壊する。これはキナーゼまたはサイクリンまたは低分
子量有機化合物（これは内因性のＤ−型サイクリンのよ
うに、プロテインキナーゼに結合するが、その結合によ
り酵素の活性化が起こらず、または酵素を無能にしたり
分解したりしない）に結合する抗体により行うことがで
きる。この目的に使用するペプチドおよび小さい有機化
合物は、Ｄ−型サイクリンのアミノ酸配列の分析に基づ
き（結合に必要な残基を含み、そしてその存在により活
性を生じるような残基を排除して）設計することができ
る。例えばこれは結合部位（１つまたは複数）を系統的
マッピングし、そして活性に必要な部位（１つまたは複
数）を認識する、または会合するが活性化はしない分子
を設計することにより行うことができる。本明細書に記
載するように、Ｄ−型サイクリンならびにCDKsと形成さ
れた複合体の組織中での特異形態発現がある。したがっ
て活性および／または特定のＤ型サイクリンおよびCDK
を含んで成る複合体レベルを妨害（阻害）するように設
計された試薬（例えば抗体またはアンチセンスまたは他
の核酸分子）を使用することにより、細胞の有糸分裂能
力を選択的に減少させることが可能である。例えば中枢
神経系あるいは他の非造血組織を含む腫瘍の治療におい
て、D1は特異形態的に発現するので（神経起源の細胞中
での特に高レベルの発現）、サイクリンD1を選択的に阻
害する試薬は特に有用であると考えられる。
Ｄ−型サイクリン、CDK、PCNAおよびp21の複合体の形
成も、CDK/D−型サイクリン複合体形成に関して上記に
記載したような同様な様式で妨害できる。すなわち複合
体の形成は直接的に妨害できる（例えば、複合体の成分
に結合するか、あるいか複合体成分の物理的会合を妨害
する薬剤または試薬による）。複合体の形成も、例えば
複合体の成分をコードするDNAおよび／またはRNAの転写
および／または翻訳を妨害することにより、Ｄ−型サイ
クリン−プロテインキナーゼ複合体形成の遮断について
上述したものと同様な様式で直接的な様式により妨害で
きる。あるいは複合体形成はその構造物の１つ以上を分
解することにより間接的に妨害できる。
例えば、サイクリンD2またはサイクリンD3が四量体複
合体を形成する能力を選択的に阻害する薬剤を使用でき
る。複合体形成の機能または利用性を変更できる他の複
合体構造物の各々も標的とされる。例えば、Ｄ−型サイ
クリンと複合体を形成するCDK2、CDK4、CDK5および他の
サイクリン依存性キナーゼは、それらの機能あるいはそ
れらの四量体複合体中への取り込みに関する利用性とい
う意味のいずれかにおいて、阻害されるかまたは増強さ
れることができる。PCNAの機能または利用性、あるいは
p21の機能または利用性、あるいはp16の機能または利用
性を変化させる薬剤または試薬も、細胞分裂を阻害また
は増強させるために使用できる。各々の四量体複合体構
成物の場合は、小さいペプチドまたは他の有機分子（こ
れは結合するという意味で複合体構成物を模すが、その
活性領域（１つまたは複数）を欠く）を細胞中に導入す
ることが可能であり、これにより活性または正常に生産
された複合体との相互作用を欠く複合体の形成を生じる
ことができる。
複合体形成の直接的阻害も非特異的であることがでる
（すなわち中でＤ−型サイクリン−含有四量体複合体が
形成される大部分の細胞または全細胞に影響することが
でる）。これは例えば四量体複合体の共通成分（例えば
PCNA）の機能または利用性を阻害する薬剤を細胞に導入
することにより、あるいは一緒にすべてのＤ−型サイク
リンを阻害する薬剤の混合物またはカクテル（cocktai
l）を導入することにより行うことができる。
あるいは四量体複合体の直接的阻害が可能である。す
なわち入手できるより少ない複合体構成物（例えばＤ−
型サイクリン、CDK、PCNAまたはp21）を生成するために
作用する薬剤または試薬を使用できる。そのような薬剤
または試薬にはアンチ−センスオリゴヌクレオチド（こ
れは転写または翻訳をブロックする）のようなもの、お
よび四量体複合体中に取り込まれる前、または後に複合
体構造物を分解する酵素のようなものがある。
特に細胞周期の開始を阻害し、したがって細胞分裂を
阻害して変化させる本方法に有用な薬剤または試薬は、
存在する化合物または分子（例えば小さい有機分子、ア
ンチ−センスオリゴヌクレオチドおよび無機物質）、あ
るいは本方法の使用に設計された物質であることができ
る。いずれの場合でもそのような薬剤は本発明の方法に
より確認できる。
本発明の特別な態様で、相互反応トラップアッセイは
サイクリン、特にＤ−型サイクリンでの複合体形成なら
びにp16/CDK4複合体形成を破壊することができる試薬を
同定することができる。例えば上記の２つのハイブリッ
ドアッセイはそのようなアッセイに使用できる。説明を
目的とした態様では、本明細書に記載されるようなCDK4
およびp16を含むGAL4活性化因子融合構造物を、CDK4/p1
6複合体の形成を破壊する候補薬剤の能力を測定するた
めに使用する。各構成物でトランスフェクトされた細胞
を候補薬剤と接触させ、そしてレポーター遺伝子（上記
のβ−ガラクトシダーゼ）の発現レベルを検出する。発
現の減少は複合体の阻害を示している。
さらにCDK/サイクリン複合体を阻害しないCDK4/p16の
阻害剤を検出するために、３つのハイブリッドアッセイ
を行うことができる。例えばp16およびＤ−型サイクリ
ンの各々が、異なるDNA配列を認識する別個の融合タン
パク質のDNA結合ドメインを構成する融合タンパク質の
部分である構造物を作成できる。CDK4は次に活性化ドメ
インとの融合タンパク質として生成され、そのようなp1
6融合タンパク質との相互作用は１つのレポーター遺伝
子の発現を生じ、一方サイクリンＤ融合タンパク質との
相互作用は種々の遺伝子の発現を進める。例えばp16融
合タンパク質はルシフェラーゼ遺伝子の発現を進めるこ
とができ、一方サイクリンＤ構造物は薬剤−耐性マーカ
ーの発現を提供する。従ってp16/CDK4相互作用を阻害す
る試薬の存在中で、薬剤耐性マーカーの発現はサイクリ
ンD/CDK4複合体が破壊されていないことを示している。
さらにp16の阻害能力を仮定すると、本発明はさらに
抗−増殖試薬として使用できるp16の特定部分のペプチ
ドミメトリック類似体（peptidominetric analogs）を
作成するのにかかる知見の使用を意図する。p16とのCDK
4結合相互作用は、突然変異誘発法および上記の相互作
用トラップアッセイを使用して容易に確認できる。同様
にp16由来のペプチド断片を、CDK4/サイクリン複合体を
上記のように破壊する能力についてアッセイすることが
できる。
いったん適当な薬剤または試薬が同定されたら、それ
を個体、特にヒトまたは他の脊椎動物に、薬剤または試
薬が細胞中に所望の効果（すなわち細胞分裂の変化）を
得るために十分な量で導入する任意の経路により投与す
ることができる。例えば選択した薬剤を静脈内に、筋肉
内に、腫瘍に直接的に注入することにより、胃腸管を介
して（例えば経口的）、腹腔的に、または鼻腔内に投与
できる。場合によってはex vivo投与（例えば血液また
は骨髄を身体から取り出して処置し、そして身体に戻
す）が適当なこともある。
一般的に細胞分裂を変化させるために使用する薬剤ま
たは試薬は、生理的キャリアー（例えば緩衝液または生
理食塩水）、安定化剤、助剤および芳香剤を含むことが
できる配合物中に含まれるであろう。投与する薬剤の量
は経験的に定めることができ、そして受容者の年齢、体
重および身長、ならびに治療すべき症状の重症度に応じ
て考慮して変化するであろう。
本発明のＤ−型サイクリンに特異的に反応する抗体
も、周知方法を使用して作成できる。例えば抗−Ｄ型サ
イクリン抗血清は適当な宿主（例えばウサギ、マウス、
ラット、ブタ）に所望の抗血清に対するＤ−型サイクリ
ンを注射して、抗体が生成されるに十分な時間後に宿主
動物から採血することにより作成される。モノクローナ
ル抗体も周知方法により作成できる、Sambrook,J.ら、
モレキュラークローニング：ア ラボラトリー マニュ
アル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、コ
ールド スプリングハーバー ラボラトリー（Cold Sri
ng Harbor Laboratory）：コールド スプリングハーバ
ー NY.（1989）、Hallow,E.およびD.Lane、抗体（Anti
bodies）：ア ラボラトリー マニュアル、コールド
スプリングハーバー出版、ニューヨーク、（1988）。CD
K5に特異的に反応性である抗体も既知の手法を使用して
作成できる。
本発明はまたサイクリン、特にＤ−型サイクリンの機
能を阻害または抑制する能力について、化合物または分
子をスクリーニングする方法も含む。例えば本明細書に
記載する突然変異細胞（その中でD1またはD3のようなＤ
−型サイクリンが発現している）を使用できる。Ｄ−型
サイクリンを阻害する能力について評価する化合物また
は分子を、化合物または分子が細胞に導入されるのに適
当な条件下で細胞と接触させる。サイクリンの阻害は細
胞の生育停止または細胞分裂の割合の減少を生じる。化
合物または分子の存在下での細胞分裂の割合または程度
を、適当な対照（例えば試験薬剤が存在しない同じ型の
細胞）と比較して評価することにより、化合物または分
子がサイクリンを阻害する能力または無能力を実証でき
るであろう。存在する化合物または分子（例えば発酵ブ
ロスまたは化学品“ライブラリー”に存在するもの）、
あるいはサイクリンのプロテインキナーゼ活性化を阻害
するために開発された化合物または分子は、本方法を使
用してその効果をスクリーニングすることができる。Ｄ
−型サイクリンを阻害する薬剤も本発明の主題である。
本発明は本明細書に記載した四量体複合体を形成を変
化させる能力について、化合物または分子をスクリーニ
ングする方法も含む。この方法はＤ−型サイクリンを阻
害する化合物または分子を同定するために上記に記載し
た方法とほとんど同じように行う。本主題の方法では、
試験する化合物または分子および細胞（その中でＤ−型
サイクリン−含有複合体が形成されている）を、複合体
形成が生じ、かつ試験する化合物または分子が細胞に導
入される適当な条件下混合する。複合体形成は本明細書
に記載したように測定できる。複合体構成または複合体
形成の阻害は、細胞の生育停止または細胞分裂の割合の
減少を生じる。試験する化合物または分子の存在下での
細胞分裂の割合または程度を、化合物または分子が存在
しない割合または程度と比較することにより、化合物ま
たは分子が細胞分裂に影響したかどうかを実証するだろ
う（すなわち試験する化合物または分子が存在しない場
合よりも化合物または分子が存在する方が分裂の程度が
少ない場合は阻害剤である）。複合体形成を阻害する薬
剤または試薬、ならびにその結果としての細胞分裂も本
発明の主題である。
本発明を以下の実施例で説明するが、それは限定する
ことを意味するものではない。
実施例１ 多くのプロテインキナーゼならびにDNA複製および修復
因子PCNAに会合したＤ−型サイクリンの実証 （ｉ）実験法 細胞 ヒト二倍体肺繊維芽W138細胞をアメリカンタイプカル
チャーコレクション（American Type Culture Collecti
on）の第13継代から得、そして10％のウシ胎児血清を補
充したダルベッコ−改良イーグル培地中で成長させ、第
16−22継代間を使用した。293細胞を同様に培養した。
抗体 抗−サイクリンD1抗体を生成するために、ヒトサイク
リンD1アミノ−末端領域の202アミノ酸残基（〜25kDa）
をコードする609bpDNA制限断片（Xiongら、Cell 65:691
−699（1991）の第２図のヌクレオチド143−751のNCol
I断片：およびCurrent Biology １:362−364（1991））
を、ファージT7発現ベクター、pET−3d（Studierら、Me
thods in Enzymology,185:60−89（1990））中にサブク
ローン化し、そしてE.Coli BL21（DE3）株中に導入し
た。細菌抽出物を溶解緩衝液（150mM NaCl、50mM Tri
s−HCl、pH7.5および10％グリセロール）中に超音波に
より細胞を破壊することにより調製し、上澄みを20,000
gで10分間遠心することにより清澄化した。不溶性のサ
イクリンＤタンパク質を含有するペレットを8M尿素を補
充した溶解緩衝液に再懸濁し、室温で30分間浸透した
後、懸濁液を再度20,000gで10分間遠心した。不溶性の
サイクリンＤタンパク質を含有するペレットをSDS試料
緩衝液に再懸濁し、10％SDS−ポリアクリルアミドゲル
で分離した。低温室中で0.25M KClでゲルを染色した
後、25kDaのサイクリンＤタンパク質が視覚化され、切
り出された。ゲル切片を18ゲイジの針に繰り返して通し
て細分化し、そしてサイクリンＤタンパク質は細分化し
たゲル粒子を0.1％SDSを含有するPBS中で42℃に数時間
インキュベーションして抽出し、ウサギの注射に使用し
た。抗−サイクリンD1免疫グロブリンをアフィニティ精
製するために、細菌が生産したp25タンパク質をReaci−
Gel（6X）に製造元の仕様に従い架橋結合させた。アフ
ィニティカラムを過剰容量のPBS（0.05％Tween20を含有
する）で、血清をカラムに添加する前後に洗浄した。グ
リシン−NaCl（pH2.5）で溶出した結合した免疫グロブ
リンは、すぐに抗体を中和化するために1.5M Tris−HC
l、pH8.5に入れた。免疫グロブリンタンパク質により起
こる高いバックグラウンドを減少するために、アフィニ
ティ精製した抗−サイクリンD1をプロテインＡ−アガロ
ースビーズにHarlowおよびLaneに従い架橋結合した（抗
体（Antibodies）：ア ラボラトリー マニュアル（A
Laboratory Manual）、コールドスプリングハーバー出
版、NY（1988））。ウエスタンブロットで、この抗−サ
イクリンD1抗血清は細菌が生産したヒトサイクリンD2と
弱く交差反応し、細菌が生産したヒトサイクリンD3とは
極めてわずかに反応し、そして全W138細胞溶解物から単
一バンドを検出する。RIPA緩衝液（0.1％SDS）での免疫
沈降物において、90％より多くのサイクリンD1−会合p3
6、p33、p31およびp21が消失するが、一方サイクリンD1
はNP−40（0.5％）緩衝液での免疫沈降物中の量と同量
のままであった。
抗−CDK5抗体生産に関して、ペプチドＣYESDFCPP（下
線のアミノ酸残基はCDK5のカルボキシ末端領域に対応す
る）を合成した。ペプチドをカギアナカサガイ ヘモシ
アニン（ピアス:Pierce）にカップルさせ、これを次に
標準法によるウサギの免疫化のために使用した（Green
ら、Cell 28:477−487（1982））。
抗−サイクリンD3ペプチド抗体を同様に合成ペプチド
ＣDELDOASTPTDVRDIDL（下線の領域はヒトサイクリンD3
のカルボキシ末端領域に対応する）に対して生成した。
後にウサギを細菌が生産した完全長のヒトサイクリンD3
で刺激した。サイクリンD3特異的免疫グロブリンをアフ
ィニティカラム（17−merのサイクリンD3ペプチドがRea
ti−Gel（6X）に架橋結合している）で精製した。アフ
ィニティ精製抗−サイクリンD3ペプチド抗体は細菌が生
産したサイクリンD1またはD2とは、ウエスタンブロット
で交差反応せず、W138細胞溶解物由来サイクリンD1とも
免疫沈降しない。
エス．ポンベ（S.pombe）p34cdc2（G8）に対する抗血
清は以前に記載された（Draettaら、Cell 50:319−325
（1987））。ヒト自己−免疫抗−PCNA抗血清は一般的に
知られている。ウエスタンブロットに使用したアフィニ
ティ精製した抗−PCNAモノクローナル抗体はベーリンガ
ーマンハイム（Boehringer Mannheim）から購入した。
免疫沈降法に使用したアフィニティ精製した抗−PCNAモ
ノクローナル抗体はオンコジーンサイエンス（Oncogene
Science）から購入した。抗−CDK2ペプチド抗血清はす
でに記載され（Pagnoら、EMBO J 1１:961−971（199
2））、そしてCDC2、CDK4およびCDK5ポリペプチドとは
交差反応しない。抗−CDK4抗血清はグルタチオントラン
スフェラーゼ（GST）およびCDK4のＣ−末端部分の融合
タンパク質に対して生成された。これはCDK2およびCDK5
とは交差反応しない。
（ii）ヒトcDNA発現ライブラリーのスクリーニング ラムダZAP II（＃936201）で構築されたヒトHeLa細胞
cDNA発現ライブラリーはストラタジーン（Stratagene）
からのものであった。ヒトp34cdc2は細菌から生産した
時は高度に不溶性であった。便利な抗体スクリーニング
法（YoungおよびDavis、Proc.Natl.Acad.Sci.80:1194−
1198（1983））はファージプラーク中に十分な量の可溶
性組換えタンパク質が存在する場合にのみ適する。した
がってスクリーニング法は、組換えタンパク質をニトロ
セルロース膜に移し取った後に溶解するために6Mグアニ
ジンを使用することを含む工程を入れて変更し、この方
法は最初に特定の活性を持つリホールド（refolded）さ
れた組換えタンパク質を生産するために開発された（Vi
nsonら、Gene Dev.２:801−806（1988））。λZAP II
HeLa cDNAライブラリー由来の２百万個のファージプラ
ークを、エス．ポンベ（S.pomb p34cdc2（G8）に対する
抗血清でスクリーニングした。ファージプラークをIPTG
−を含浸させたニトロセルロースフィルターで42℃で４
時間覆い、フィルターをカルチャーの皿から除去し、そ
して次に6Mグアニジン−HCl（25mM Hepes、pH7.0、50m
M NaCl、2mM DTTを含有する緩衝液中）で25℃にて10
分間処理した。フィルターをグアニジン無しのTris−緩
衝化生理食塩水で抗体とインキュベーションする前に洗
浄した。この方法は抗体検出信号を大いに増強し、これ
はおそらくグアニジンによる細菌生産ポリペプチド沈殿
の可溶化によるものであろう。G8−陽性cDNAクローンを
pBluescript SK ベクター（ストラタジーン）中にク
ローン化し、そしてABI全自動DNA合成機（モデル373A）
で両方向から配列決定した。配列相同性の調査について
は、FASTAプログラムを使用した（PearsonおよびLipma
n、Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444−2448（1988））。
（iii）免疫沈降およびウエスタン−ブロッティング ［35S］メチオニンでの代謝標識に関しては、サブ−
コンフルエント（sub−confluent:40−60％）細胞を、
予め温めた標識媒質（10％透析ウシ胎児血清［ギブコ:G
IBCO］を補充したメチオニン−、システイン−無しのDM
EM［ICN］で２回標識した。標識媒質で30分間、インキ
ュベーションした後、［35S］メチオニン（Trans35S−
標識、ICN）を媒質に加え（約200μCi/ml）、そして溶
解前に４−６時間イキュベーションし続けた。免疫沈降
のすべての工程は冷室にて行った。40−60％コンフルエ
ントの150mMの皿からの細胞を、冷PBSで２回洗浄し、そ
してNP−40溶解緩衝液（50mM Tris−HCl、pH7.4、150m
M NaCl、20mM EDTA 0,5％ NP−40,1mM PMSF 25μ
g/mlロイペプチン、25μg/mlアプロチニン、1mM ベン
ズアミジンおよび10μg/mlトリプシンインヒビター）中
で解体し、そして15−30分間回転させながら溶解する。
核を15,000gで５分間遠心することにより取り出し、そ
して溶解物を前抗血清または正常ウサギ血清およびIgG
ソルブ（sorb）のいずれかと20−30分間インキュベーシ
ョンすることにより前−清澄化し、続いて10分間、15,0
00gで遠心した。プロテインＡ−アガロースビーズ（ピ
アス）と予めカップルした抗体を清澄化した溶解物に加
え、そして６−８時間インキュベーションした。免疫沈
降物を３−４回室温で、溶解緩衝液により洗浄し、SDS
試料緩衝液に再懸濁し、そしてSDS−ポリアクリルアミ
ドゲルで分離した。
35Sメチオニン−標識沈殿物については、ポリアクリ
ルアミドゲル（V8タンパク質溶解マッピング実験につい
てはこれを除く）を10％氷酢酸および30％メタノールで
30分から１時間固定し、30分間オートラジオグラフィー
増感剤（デュポン:Du pont）を含浸させることにより増
感させ、そして水中で15−30分間沈殿させる。増感ゲル
は乾燥させ、Ｘ−線フィルムに−70℃で暴露させる。ウ
エスタン−ブロッティングについては、ポリペプチドを
ニトロセルロース膜にSDS定電気ブロッティングシステ
ム（ミリポア:Millipore）を使用して400mAの電流で45
分間写し取った。フィルターを５％乾燥ミルクを含有す
るTBST（20mM Tris−HCl、pH7.5、137mM NaCl 0.1％
Tween−20）で１−３時間ブロックし、５％乾燥ミル
クを含有するTBST中で４時間から一晩第一抗体とインキ
ュベーションし、そして４回、10分間、それぞれTBSTで
洗浄した。適当な第二抗体（1:10,000希釈のシート抗−
マウスIgに結合した西洋ワサビペルオキシダーゼまたは
ロバ抗−ラビットIg、アマシャム）をフィルターと１時
間インキュベーションし、そして特異的タンパク質を増
感化学発光システム（ECL、アマシャム）により検出し
た。
（iv）部分的タンパク質溶解ペプチドマッピング 網状赤血球溶解システム（プロメガ）をカップルさせ
たTNTを使用するT7RNAポリメラーゼでのインビトロ翻訳
については、ヒト サイクリンD1、サイクリンD2、サイ
クリンD3、CDC2、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5およびPCNAを
pBluescriptベクター（ストラタジーン）中にサブクロ
ーン化した。［35S］メチオニン−標識溶解物の免疫沈
降およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は上記
と同じである。ポリアクリルアミドゲルを予め固定およ
び増感処理することなく乾燥させ、フジ 画像プレート
に露出させ、そしてフジ バイオ−イメージング アナ
ライザー（Fuji bio−imaging analyzer）BAS2000で視
覚化した。画像出力を鋳型として使用して、17.5％SDS
−PAGEで分離したゲルからゲル中の適当なタンパク質バ
ンドを、種々の量のエス．アウレウス（S.aureus）V8プ
ロテアーゼで（Clevelandら、J.Biol.Chem 252:1102−1
106（1977））および（HarlowおよびLane,抗体（Antibo
dies）：ア ラボラトリーマニュアル（A Laboratory M
anual）、コールドスプリングハーバーラボラトリー出
版、NY（1988））に従い消化し、切り出した。ゲルを乾
燥し、そしてＸ−線フィルムに２週間暴露するか、また
はフジ画像分析機BAS2000で分析した。
実施例２ DNA腫瘍ウイルスまたはその発癌性産物による細胞の形
質転換に関連した細胞周期複合体の選択的サブユニット
転位の実証 （ｉ）DNA腫瘍ウイルスSV40での細胞の形質転換は細胞
周期複合体の転位に関連する ［35S］メチオニン−標識細胞溶解物の調製およびポ
リアクリルアミドゲル電気泳動は上記、および国際出願
公開第92/2076号明細書のように行った。細胞溶解物は
ヒト正常二倍体繊維芽細胞W318またはDNA腫瘍ウイルスS
V40形質転換W138細胞VA13のいずれかから調製した。細
胞は各細胞周期遺伝子産物に対する抗体と免疫沈降し
た。
（ii）２つの異なる細胞系対中の細胞周期複合体のサブ
ユニット転位 細胞溶解物の調製法は上記記載のものと同じである。
２つの異なる細胞対系をこれらの実験に使用した。HSF4
3は正常ヒト二倍体繊維芽細胞系であり、そしてCT10
（完全な名前はCT10−2C−T1）はSV40巨大腫瘍抗原で形
質転換したHSF43由来のものである。CV−１はアフリカ
ミドリサル腎臓細胞系であり、そしてCOS−１はSV40で
形質転換したCV−１由来のものである。
（iii）DNA腫瘍ウイルスSV40にる細胞形質転換は細胞周
期複合体のPCNAサブユニットの転位に関連する 細胞溶解物の調製、電気泳動およびウエスタンブロッ
ティング条件は、上記と同様である。正常ヒト二倍体細
胞系およびそのSV40形質転換細胞系は上記に記載したも
のと同様である。各抗体での免疫沈降物はポリアクリル
アミドゲルで分離し、そして抗−PCNA抗体とブロットし
た。
（iv）DNA腫瘍ウイルスSV40による細胞形質転換は細胞
周期複合体のCDK4サブユニットの転位に関連する 細胞溶解物の調製、電気泳動およびウエスタンブロッ
ティング条件は、上記と同様である。正常ヒト二倍体細
胞系およびそのSV40形質転換細胞系は上記に記載したも
のと同様である。各抗体由来の免疫沈降物はポリアクリ
ルアミドゲルで分離し、そして抗−CDK4抗体とブロット
した。
実施例３ CDK4活性の阻害剤16INK4のクローニング （ｉ）２つのハイブリッドアッセイを使用する16INK4の
クローニング サッカロミセス セルビシエ（Saccharomyces cerevi
siae）YPB2細胞をGAL4db−p16INK4融合体を含有するプ
ラスミド、ならびにそれぞれcdc2（CDK1）、CDK2、CDK
4、CDK5、PCNA（増殖性細胞核抗原）および分裂酵母Snf
1に融合したGAL4adを含有するプラスミドで同時に形質
転換した。両方のプラスミドに選択的な培地（トリプト
ファンマイナス、およびロイシンマイナス）で細胞を生
育させた後、２つのコロニーを無作為に取り出し、ヒス
チジンを含む、または欠いたプレートに画線培養した。
ヒスチジン無しでの生育は、GAL4−反応性プロモーター
下のHIS3遺伝子の発現に依存し、従って機能的GAL4活性
化因子がp16INK4が対応する標的タンパク質との相互反
応を介して再構成されたことを示している。
（ii）p16INK4CDKsの相互反応 精製した細菌生産GSTp16INK4融合タンパク質を、（35
S）−標識インビトロ翻訳cdc2、CDK2、CDK4およびCDK5
と混合した。混合物は0.5μｇの精製GST−p16INK4およ
び等量のインビトロ翻訳タンパク質（0.5−５μl;TNTプ
ロメガ）を最終容量が200μｌの緩衝液（50mM Tris−H
Cl,pH8、120mM NaClおよび0.5％ Nonidet Ｐ−40を
含有する）中に含有した。４℃で１時間後、15μｌのグ
ルタチオン−アガロースビーズを加え、そしてインキュ
ベーションをさらに１時間再開した。ビーズを遠心によ
り取り出し、インキュベーション緩衝液で４回洗浄し、
そして標準的なタンパク質−ゲル添加緩衝液と混合し
た。試料を15％のポリアクリルアミドゲルに添加し。そ
して（35S）標識タンパク質はフルオログラフィーで検
出した。GSTp16INK4融合タンパク質をpGEX−KGベクター
で過剰発現させ、標準法で精製した。インビトロ翻訳鋳
型はpBluescriptベクター（スタシタジーン）から得
た。
（iii）p16INK4のタンパク質溶解マッピング インビトロ翻訳（35S）−標識p16INK4（TNTプロメ
ガ）を、pBluescriptベクター（ストラタジーン）中に
クローン化したp16INK4 cDNAを鋳型として使用して
得、そしてCDK4−会合p16タンパク質を代謝的に（35S）
−標識HeLa細胞溶解物由来の抗−CDK4血清と一緒に免疫
沈降させた。部分的タンパク質溶解は対応するゲル切片
について、緩衝液による徹底的な平衡化後に行い、そし
て消化はNCSを種々の濃度で加えて行った。生成物を17.
5％のポリアクリルアミドゲルで泳動し、そしてホスホ
イメージャー（phosphoimager）Fuji 2000で分析した。
（iv）p16INK4のCDK4−サイクリンＤ複合体に対する効
果の検出 p16INK4、CDK4、サイクリンD1またはCDKおよびサイク
リンD1の両方を一緒に過剰発現しているバキュロウイル
ス−感染細胞を、代謝的に（35S）−標識した。種々の
インキュベーション混合物をp16INK4、CDK4、サイクリ
ンD1、ならびにCDKおよびサイクリンD1の両方を含有す
る抽出物により構成し、そして抗−p16INK4血清、抗−C
DK4血清と、予めプレインキュベーションすることなく
免疫沈降させ、そして抗−CDK血清は元に抗血清および
抗−サイクリンD1血清を生成するために使用したペプチ
ドとプレインキュベーションした。免疫沈降物はSDS−P
AGEで分析した。
すべての上述の引用例および報告は引用することによ
り本明細書に含まれる。
均等物 当業者は日常的な実験を使用するだけで、本明細書に
記載された本発明の特別な態様の多くの均等物を確認す
ることができると理解するであろう。そのような均等物
は以下の請求の範囲により包含されるものである。
配列表 （１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ）名前：コールドスプリングハーバーラボラト
リー （Ｂ）通り:100 バングタウン ロード （Ｃ）市：コールドスプリングハーバー （Ｄ）州：ニューヨーク （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号（ZIP）:11724 （Ｇ）電話番号：（617）227−7400 （Ｈ）ファックス：（617）227−5941 （ii）発明の名称：サイクリン複合体の転位、および
それに関連する使用 （iii）配列の数:4 （iv）コンピューター読み取り先： （Ａ）媒体の種類：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PCコンパチブル （Ｃ）実行システムPC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア:ASCII（テキスト） （iv）先願データ： （Ａ）出願番号：米国07/963,308 （Ｂ）出願日:1992年10月16日 （vi）先願データ： （Ａ）出願番号：米国07/991,997 （Ｂ）出願日:1992年12月17日 （２）配列番号１に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ:1089塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線 （ii）分子の型:DNA（ゲノム） （ix）特徴 （Ａ）名前／キー:CDS （Ｂ）位置:13..888 （xi）配列の記載：配列番号1: （２）配列番号２に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:292アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：直線 （ii）分子の型：タンパク質 （xi）配列の記載：配列番号2: （２）配列番号３に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ:948塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：両方 （Ｄ）トポロジー：直線 （ii）分子の型:cDNA （ix）特徴 （Ａ）名前／キー:CDS （Ｂ）位置:19..465 （xi）配列の記載：配列番号3: （２）配列番号４に関する情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ:148アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：直線 （ii）分子の型：タンパク質 （xi）配列の記載：配列番号4:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ｂ (72)発明者 クシオング，ユー アメリカ合衆国ニユーヨーク州11746ハ ンテイントンステーシヨン・ホートンド ライブ47 (56)参考文献 ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ．11，Ｎｏ. ８（Ａｕｇ．1992），ｐ．2909−2917 Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．71（Ｏｃｔ．30, 1992），ｐ．505−514 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/00 - 14/825 C12Q 1/00 - 1/70 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｄＭｅｄ

Claims (34)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】p21が ａ）サイクリン−依存性キナーゼ、サイクリンまたは両
    方と複合体を形成するか、あるいは ｂ）サイクリン−依存性キナーゼ、サイクリンまたは両
    方と複合体を形成しないか、のいずれかを測定すること
    を含んで成り、この測定において、正常細胞に比較しサ
    イクリン−依存性キナーゼ、サイクリンまたは両方と複
    合体を形成したp21のレベルの低下が発癌遺伝子でトラ
    ンスフォームされた細胞または異常増殖細胞を示すもの
    とし；かつ、サイクリンがＤ−型サイクリン、Ａ−型サ
    イクリンまたはＢ−型サイクリンであり、そしてサイク
    リン−依存性キナーゼがCDK1（もしくはCDC2）、CDK2ま
    たはCDK4であることを特徴とする発癌遺伝子でトランス
    フォームされた細胞または異常増殖細胞の同定方法。
  2. 【請求項２】p21がサイクリン−依存性キナーゼ、サイ
    クリンまたは両方と複合体を形成するかまたはしないか
    を測定するために免疫アッセイを使用する、請求項１記
    載の方法。
  3. 【請求項３】サイクリンがＤ−型サイクリンまたはＡ−
    型サイクリンであり、そしてサイクリン−依存性キナー
    ゼがCDK4である請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】p16INK4が ａ）サイクリン−依存性キナーゼと複合体を形成する
    か、あるいは ｂ）サイクリン−依存性キナーゼと複合体を形成しない
    か を測定することを含んで成り、この測定において正常細
    胞に比較しサイクリン−依存性キナーゼと複合体を形成
    したp16のレベルの増大が発癌遺伝子でトランスフォー
    ムされた細胞または異常増殖細胞を示すものとし；か
    つ、サイクリン−依存性キナーゼがCDK4であることを特
    徴とする発癌遺伝子でトランスフォームされた細胞また
    は異常増殖細胞の同定方法。
  5. 【請求項５】p16がサイクリン−依存性キナーゼと複合
    体を形成するか、またはしないかを測定するために免疫
    アッセイを使用する請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】p19が ａ）サイクリンＡと複合体を形成するか、あるいは ｂ）サイクリンＡと複合体を形成しないかを測定するこ
    とを含んで成り、この測定において、正常細胞に比較し
    サイクリンと複合体を形成したp19のレベルの増大が発
    癌遺伝子でトランスフォームされた細胞または異常増殖
    細胞を示すものとすることを特徴とする発癌遺伝子でト
    ランスフォームされた細胞または異常増殖細胞の同定方
    法。
  7. 【請求項７】p19がサイクリンと複合体を形成するか、
    またはしないかを測定するために免疫アッセイを使用す
    る請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】配列番号３で表される核酸の相補体にスト
    リンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列に
    よってコードされたp16INK4ポリペプチドを含んでな
    り、該ポリペプチドがCDK4に結合することを特徴とする
    組換え的に生産されたタンパク質。
  9. 【請求項９】該p16INK4ポリペプチドが融合タンパク質
    である請求項８記載の組換え的に生産されたタンパク
    質。
  10. 【請求項１０】配列番号３により表される核酸の相補体
    にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ
    CDK4に結合するp16INK4ポリペプチドをコードする核
    酸。
  11. 【請求項１１】配列番号３により表される核酸にストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド
    配列を含んでなる単離された核酸。
  12. 【請求項１２】請求項８に記載のp16INK4タンパク質と
    特異的な免疫反応性を有する抗体。
  13. 【請求項１３】患者から単離した細胞試料中で、該試料
    の細胞中のp16INK4タンパク質のレベルを測定するため
    に、請求項12に記載の抗体を含んで成るトランスフォー
    ムした細胞を同定するための診断試験キット。
  14. 【請求項１４】該抗体が配列番号４により表されるアミ
    ノ酸配列を有するタンパク質に特異的である請求項13記
    載の診断キット。
  15. 【請求項１５】患者から単離した細胞試料中のp16INK4
    タンパク質をコードする核酸の存在または不在を測定す
    るために、配列番号３により表される核酸にストリンジ
    ェントな条件下でハイブリダイズする核酸プローブを含
    んで成る、発癌遺伝子でトランスフォームされた細胞を
    同定するための診断試験キット。
  16. 【請求項１６】配列番号４により表されるアミノ酸配列
    を含んで成り、かつCDK4/サイクリン複合体の結合を破
    壊するペプチドミメティック。
  17. 【請求項１７】i. サイクリン、サイクリン−依存性キ
    ナーゼ（CDK）およびp21を含んで成るCDK−複合体（こ
    こでCDK−複合体はCDK複合体が自然に生じる細胞中でCD
    K−複合体と通常存在する他のタンパク質を実質的に含
    まずに単離されており、かつ、サイクリンがＤ−型サイ
    クリン、Ａ−型サイクリンまたはＢ−型サイクリンであ
    り、そしてサイクリン−依存性キナーゼがCDK1（もしく
    はCDC2）、CDK2またはCDK4である。）を提供し、 ii. CDK−複合体をCDK−複合体がリン酸化できる基
    質、および候補阻害剤と接触させ、 iii. 基質のリン酸化レベルを測定し、そして iv. 候補阻害剤の存在下での基質のリン酸化レベルを
    候補阻害剤の不在下での基質のリン酸化レベルと比較す
    る 工程を含んで成り、そして 候補阻害剤存在下でのリン酸化レベルの減少が候補阻害
    剤のCDK阻害活性を示すものとすることを特徴とする、
    サイクリン−依存性キナーゼの阻害剤を同定するための
    アッセイ。
  18. 【請求項１８】正常細胞の増殖に比較し、選択的にトラ
    ンスフォームした細胞の増殖を阻害できるサイクリン−
    依存性キナーゼの阻害剤を同定するアッセイであって、 i. サイクリン、サイクリン−依存性キナーゼ（CDK）
    およびp21を含んで成る正常細胞由来の第一CDK−複合
    体、ならびにサイクリンおよびCDKを含んで成るトラン
    スフォームした細胞由来の第二CDK−複合体 を提供し、 ここで各々の第一および第二CDK−複合体はCDK複合体が
    由来する細胞中で通常CDK−複合体と共に存在する他の
    タンパク質を実質的に含まずに単離されており、かつ、
    サイクリンがＤ−型サイクリン、Ａ−型サイクリンまた
    はＢ−型サイクリンであり、そしてサイクリン−依存性
    キナーゼがCDK1（もしくはCDC2）、CDK2またはCDK4であ
    り、 ii.各CDK−複合体をCDK−複合体がリン酸化できる基
    質、および候補阻害剤と接触させ、 iii.基質のリン酸化レベルを測定し、そして iv.各CDK−複合体の候補阻害剤の存在下での基質のリン
    酸化レベルを候補阻害剤の不在下での基質のリン酸化レ
    ベルと比較する、 工程を含んで成り、候補阻害剤存在下でのリン酸化レベ
    ルの減少が候補阻害剤のCDK阻害活性を示すものとし、
    そして阻害剤の選択性は第一および第二CDK−複合体の
    間のCDK阻害活性の差異を比較することにより測定され
    ることを特徴とするアッセイ。
  19. 【請求項１９】i.サイクリン−依存性キナーゼ（CDK4）
    とp16INK4ポリペプチドが複合体を形成しうる条件下でC
    DK4およびp16INK4ポリペプチドを含んで成る混合物を提
    供し、 ii.該混合物を候補作用剤と接触させ、 iii.複合体中に存在するp16INK4ポリペプチドを測定
    し、そして iv.候補作用剤の存在下での複合体中に存在するp16INK4
    ポリペプチドのレベルを、候補作用剤の不存在下での複
    合体中に存在するp16INK4ポリペプチドのレベルと比較
    する、 工程を含んで成り、かつ、候補作用剤の不存在下に比較
    し、候補作用剤の存在下での複合体中に存在するp16
    INK4ポリペプチドのレベルの変化が、サイクリン−依存
    性キナーゼ複合体のサブユニット組成物を変化させる作
    用剤を示すものとすることを特徴とするサイクリン−依
    存性キナーゼ複合体のサブユニット組成物を変化させる
    作用剤を同定するためのアッセイ。
  20. 【請求項２０】配列番号３により表される核酸に実質的
    に同一の核酸配列またはそれに相補的な配列に特異的に
    ハイブリダイズし、そしてCDK4に結合するp16INK4タン
    パク質をコードするINK4遺伝子を選択的に検出する単離
    された核酸。
  21. 【請求項２１】核酸がINK4遺伝子にハイブリダイズする
    アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、そしてp16
    INK4タンパク質の発現を阻害する請求項20記載の核酸。
  22. 【請求項２２】請求項10に記載の核酸を含んで成る組換
    え発現ベクター。
  23. 【請求項２３】哺乳動物細胞の試験試料において、配列
    番号３により表される核酸配列の相補体に特異的にハイ
    ブリダイズする核酸またはその相補体の存在または不存
    在を測定することを含んで成る、INK4遺伝子の変化した
    発現を検出することによる哺乳動物細胞のトランスフォ
    ーメーションの検出方法。
  24. 【請求項２４】配列番号４に実質的に同一のアミノ酸配
    列を含んでなる組換え的に生産されたp16INK4タンパク
    質。
  25. 【請求項２５】配列番号４に実質的に同一のp16INK4タ
    ンパク質をコードする核酸。
  26. 【請求項２６】請求項８に記載のタンパク質を有効成分
    とするCDK4活性を阻害するための調製物。
  27. 【請求項２７】請求項８に記載のタンパク質を有効成分
    として含んで成る免疫原用調製物。
  28. 【請求項２８】配列番号４により表される配列に少なく
    とも90％同一性をもつアミノ酸配列を含むポリペプチド
    をコードする核酸配列によりコードされており、かつ、
    CDK4に結合する、単離されたp16INK4タンパク質。
  29. 【請求項２９】該p16INK4タンパク質が融合タンパク質
    である請求項28記載のタンパク質。
  30. 【請求項３０】配列番号４に少なくとも90％の同一性を
    有するアミノ酸配列を含み、かつ、CDK4に結合するp16
    INK4ポリペプチドをコードする核酸。
  31. 【請求項３１】配列番号４に少なくとも90％の同一性を
    有するポリペプチドをコードする核酸配列を含んで成る
    単離された核酸。
  32. 【請求項３２】請求項28に記載のp16INK4タンパク質と
    特異的に免疫反応性を有する抗体。
  33. 【請求項３３】患者から単離された細胞試料において、
    該試料の細胞中のp16INK4タンパク質レベルを測定する
    ための請求項32に記載の抗体を含んで成る、発癌遺伝子
    でトランスフォームされた細胞を同定するための診断試
    験キット。
  34. 【請求項３４】該抗体が配列番号４に少なくとも90％の
    同一性を有するアミノ酸配列のタンパク質に特異的であ
    る請求項33記載の診断試験キット。
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