ES2201064T3 - Transposicion del complejo de ciclina y usos relacionados del mismo. - Google Patents

Transposicion del complejo de ciclina y usos relacionados del mismo.

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Abstract

SE PRESENTA UN METODO Y UN EQUIPO DE DIAGNOSTICO PARA DIAGNOSTICAR LA TRANSFORMACION DE UNA CELULA, QUE COMPRENDE LA DETECCION DE COMPONENTES DE SUBUNIDADES DE COMPLEJOS DE CICLINA. EN PARTICULAR, EL METODO SE REFIERE A LA INTERACCION DE LAS CICLINAS, PCNA, CDKS, Y POLIPEPTIDOS DE BAJO PESO MOLECULAR TALES COMO P21, P19 Y P16. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A INHIBIDORES DE LA PROLIFERACION CELULAR.

Description

Transposición del complejo de ciclina y usos relacionados del mismo.
Antecedentes de la invención
La neoplasia está caracterizada por un desarreglado crecimiento y división de las células. Inevitablemente, las vías que controlan el crecimiento de las células deben interaccionar con las que regulan la división celular. Sin embargo, no ha sido hasta muy recientemente que la evidencia experimental ha sido capaz de traer a la luz dicha conexión. Se encontró ciclina A en asociación con la oncoproteína E1A del adenovirus en células transformadas viralmente (Giordona y col. Cell 58:981 (1989); y Pines y col. Nature 346:760 (1990)). En un incipiente carcinoma hepatocelular, se encontró que el gen de la ciclina A humana era el sitio de integración de un fragmento del virus de la hepatitis B, que conduce a la activación de la transcripción de la ciclina A y una proteína de la ciclina A viral quimérica que no es degradable in vitro (Wang y col. Nature 343:555 (1990)). El gen del ciclo celular más fuertemente implicado en la oncogénesis hasta ahora es la ciclina D1 humana. Originalmente se aisló a través de la complementación genética de las cepas deficientes de ciclina G_{1} de la levadura (Xiong y col. Cell 65:691 (1991); y Lew y col. 
\hbox{ Cell }
66:1197 (1991)), como genes celulares cuya transcripción es estimulada por el CSF-1 en macrófagos de murino (Matsushine y col. Cell 65:701 (1991)) y en el oncógeno putativo PRADI reordenado en tumores paratiroideos (Montokura y col. Nature 350:512 (1991). Subsecuentemente se identificaron dos ciclinas de tipo D humanas adicionales, las ciclinas D2 y D3, utilizando técnicas PCR y de hibridación de baja estringencia (Inaba y col. Genomics 13:565 (1992); y Xiong y col. Genomics 13:575 (1992)). La ciclina D1 está genéticamente unida al oncógeno bcl-1, un sitio activado por translocación a un activador del gen de inmunoglobulina en algunos limfomas y leucemias de células B, y localizado en el sitio de la amplificación del gen en un 15-20% de cánceres de pecho en humanos y en un 25-48% de cánceres de células escamosas de origen en la cabeza y cuello.
Las ciclinas son proteínas que se descubrieron debido a su síntesis intensa después de la fertilización de huevos de invertebrados marinos (E. T. Rosenthal y col., Cell 20:487-494 (1980)). Subsecuentemente se observó que la abundancia de los dos tipos de ciclina, A y B, osciló durante las primeras divisiones de rotura debido a la degradación proteolítica abrupta de los polipéptidos en las mitosis y de ello deriva su nombre (T. Evans y col. Cell 33:389-396 (1983); K. I. Swenson y col., Cell 47:867-870 (1986); N. Standart y col., Dev. Biol. 124: 248- 258 (1987)). Subsecuentemente, se han aislado genes de la ciclina de virtualmente todas las especies eucarióticas y constituyen una familia multigen (para revisión, ver Xiong y col. Curr Biology 1:362 (1991)).
La implicación activa más que pasiva de las ciclinas en la regulación de la división de las células se hace aparente con la observación de que un mRNA de la ciclina de un clámide puede causar activación de los oocitos de rana y entrada de estas células en la fase M (K. I. Swenson y col., Cell 7:867-870 (1986)). La activación de los oocitos de rana está asociada con la elaboración de una fase M induciendo el factor conocido como MPF (factor promotor de la maduración o de la fase M) (Y. Masui y C.L. Markert, J. Exp. Zool. 177:129-146 (1971); L. D. Smith, y R. E. Ecker, Dev. Biol. 25:232-247 (1971)). El MPF es una proteína quinasa en la que la subunidad catalítica es el homólogo de rana de la proteína quinasa cdc2 (W. G. Dunphy, y col. Cell 54:423-431 (1988); J. Gautier y col., Cell 54:433-439 (1988); D. Arion y col., Cell 55:371-378 (1988)).
Entre las ciclinas identificadas hasta la fecha, la ciclina de tipo B ha demostrado actuar en la mitosis sirviendo como una subunidad integral de la proteína quinasa cdc2 (R. Booher y D. Beach, EMBO J. 6:3441-3447 (1987); G. Draetta y col.., Cell 56: 829-838 (1989); J. C. Labbe y col., Cell 57:253-263 (1989); J. C. Labbe y col., EMBO J. 8:3053-3058 (1989); L. Meier y col., EMBO J. 8:2275-2282 (1989); J. Gautier y col., Cell 60:487-494 (1990)). La ciclina de tipo A también se asocia de forma independiente con la quinasa cdc2, formando una enzima que parece actuar antes en el ciclo de división que en la mitosis (G. Draetta y col., Cell 56:829-838 (1989); J. Minshull y col., EMBO J. 9:2865-2875 (1990); A. Giordano y col., Cell 58:981-990 (1989); J. Pines y T. Hunter, Nature 346:760-763 (1990)). Los estudios celulares y moleculares de las ciclinas en embriones de invertebrados y de vertebrados han sido acompañados por estudios genéticos, particularmente en levaduras de ascomicetos. En la levadura de fisión, el gen cdc13 codifica una ciclina de tipo B que actúa en cooperación con el cdc2 para regular la entrada en la mitosis (R. Booher y D. Beach, EMBO J. 7:2321-2327 (1988); I. Hagan y col., J. Cell Sci. 91:587-595 (1988); M. Solomon, Cell 54:738-740 (1988); M. Goebl y B. Byers, Cell 54:433-439 (1988); R. N. Booher y col., Cell 58:485-497 (1989)). Los estudios genéticos tanto en la levadura gémica como en la levadura de fisión han revelado que el cdc2 (o CDC28 en la levadura gémica) actúa en dos puntos independientes en el ciclo celular: en la mitosis y en el llamado "inicio" del ciclo celular (L. H. Hartwell, J. Mol. Biol., 104:803-817 (1971); P. Nurse y Y. Bissett, Nature 292:558-560 (1981); J. R. Piggot y col., Nature 298:391-393 (1982); S. I. Reed y C. Wittenberg, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:5697-5701 (1990)). En la levadura gémica, la función de inicio de la proteína CDC28 requiere también asociación de la subunidad catalítica de la proteína quinasa con proteínas auxiliares que están estructuralmente relacionadas con las ciclinas de tipo A y B. Esta tercera clase de ciclina ha sido llamada la clase CLN, y se han descrito tres genes que comprenden una familia de genes redundante (R. Nash y col., EMBO J. 7:4335-4346 (1988); J. A. Hadwiger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6255-6259 (1989); H. E. Richardson y col., Cell 59:1127-1133 (1989)). Los genes CLN son esenciales para la ejecución del inicio y en su ausencia, las células quedan detenidas en la fase G1 del ciclo celular, pero el transcrito CLN3 no. Además, la proteína CLN2 ha mostrado oscilar en paralelo con su mRNA (R. Nash, y col., EMBO J. 7:4335-4346 (1988); F. R. Cross, Mol. Cell. Biol. 8:4675-4684 (1988); H. E. Richardson y col., Cell 59:1127-1133 (1988); Wittenberg y col, 1990)). Aunque las propiedades bioquímicas precisas conferidas en el cdc2/CDC28 por la asociación con diferentes ciclinas no ha sido totalmente elaborada, los estudios genéticos de los mutantes de ciclina establecen claramente que confieren propiedades "G1" y "G2" en la subunidad catalítica (R. Booher y D. Beach, EMBO J. 6:3441-3447 (1987); R. Nash y col., EMBO J. 7:4335-4346 (1988); H. E. Richardson y col., Cell 56:1127-1133 (1989)).
Se ha encontrado cdc2 y ciclinas no sólo en embriones y en levaduras, sino también en células humanas somáticas. La función de la enzima cdc2/ciclina B parece ser la misma en células humanas que en otro tipo de células (K. Riabowol y col., Cell 57:393-401 (1989)). También se ha encontrado un tipo de ciclina A humana en asociación con el cdc2. Todavía no se ha descrito ninguna ciclina de tipo CLN en células de mamíferos. Una mejor comprensión de los elementos implicados en la regulación del ciclo celular y de sus interacciones contribuiría a una mejor comprensión de la replicación de las células y quizás incluso a alterar o controlar el método.
Breve exposición de la invención
La presente invención proporciona un método de identificación de una célula transformada o de una proliferación anormal, que comprende las etapas siguientes:
(A)
determinación, en una célula(s) de ensayo, de la composición de la sub-unidad de un complejo que comprende una proteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 16 kDa, 19 kDa o 21 kDa y una quinasa dependiente de la ciclina (cdk), una ciclina o una cdk y una ciclina, siendo la proteína, de forma predominante, una proteína que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 23 kDa en una célula normal, o siendo de forma predominante una proteína que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 19 kDa o de aproximadamente 16 kDa en una célula transformada o de proliferación anormal, y
(B)
comparación de la composición de la sub-unidad de la etapa (A) con la composición de la sub-unidad de un complejo similar encontrado en una célula normal, en donde una alteración en la composición de la sub-unidad es indicativa de una transformación o de una proliferación anormal de la célula del ensayo.
En un aspecto adicional se proporciona un polipéptido purificado y/o recombinante que comprende una secuencia de amino ácidos de un polipéptido que tiene un peso molecular aparente comprendido entre aproximadamente 15 kDa y aproximadamente 17 kDa, en donde dicho polipéptido inhibe una quinasa dependiente de la ciclina y está codificada por un ácido nucleico que hibrida de forma específica a la secuencia del ácido nucleico de la SEC ID (secuencia de identificación) no.3.
En un aspecto todavía adicional se proporciona un ácido nucleico aislado (sentido o antisentido) que hibridiza de forma específica a la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID no. 3 y que detecta de forma selectiva un gen que codifica una proteína de 16 kDa que se une a la quinasa dependiente de la ciclina 4 (cdk4).
También se proporciona en kit (equipo) de ensayo para diagnóstico para la identificación de células transformadas, que comprende:
(a)
una sonda de un ácido nucleico (sentido o antisentido) que se hibrida de forma específica a la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID no. 3 y que detecta de forma selectiva un ácido nucleico que codifica una proteína de 16 kDa que se une a la quinasa dependiente de la ciclina 4 (cdk4), sirviendo dicha sonda para medir, en una muestra de células aisladas de un paciente, la presencia o ausencia de un ácido nucleico que codifica dicha proteína de 16 kDa; y/o
(b)
un anticuerpo específico para la proteína de 16 kDa para medir, en una muestra de células aisladas de un paciente, una cantidad de dicha proteína.
En un aspecto adicional se proporciona un método de análisis para identificar un agente que altera la composición de la subunidad de un complejo de quinasa dependiente de la ciclina, que comprende las etapas siguientes:
i.
proporcionar una quinasa dependiente de la ciclina (cdk) y el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en las condiciones en las que la cdk y dicho polipéptido pueden formar un complejo;
ii.
puesta en contacto de la mezcla con un agente candidato;
iii.
detección de una cantidad de polipéptido como parte del complejo formado;
iv.
comparación de la cantidad de polipéptido encontrado en el complejo en presencia del agente candidato con la cantidad de polipéptido presente en el complejo en ausencia del agente candidato,
en donde un cambio en la cantidad de polipéptido presente en el complejo en presencia del agente candidato, relativo a la ausencia del agente candidato, es indicativo de un agente que altera la composición de la subunidad de un complejo de quinasa dependiente de la ciclina.
También se proporcionas un método para la detección de la transformación de una célula de un mamífero por detección de una expresión alterada de un gen que codifica una proteína que tiene un peso molecular comprendido entre 15 kDa y 17 kDa, que es un inhibidor de la cdk4, cuyo método comprende la determinación, en una muestra de análisis de células de mamífero, de la presencia o ausencia de un ácido nucleico hibridado de forma específica al ácido nucleico de la SEC ID no. 3, indicando la presencia de dicho ácido nucleico la transformación de las células.
La presente invención se refiere a los usos para las nuevas clases de ciclinas, a las que se hace referencia como ciclinas de tipo D, que son de origen de mamífero y son una nueva familia de ciclinas relacionadas con, pero diferentes de, las ciclinas previamente descritas de tipo A, B o CLN. En particular, hace referencia a ciclinas humanas, codificadas por genes que muestran ser capaces de sustituir un gen de tipo CLN esencial para el inicio del ciclo celular en levaduras, que complementa una deficiencia de una proteína esencial para el inicio del ciclo celular y que, sobre la base de la estructura de la proteína, están en una rama diferente del árbol evolutivo a partir de las ciclinas de tipo A, B o CLN. Se ha demostrado que las ciclinas de tipo D se asocian, en células eucarióticas, de forma particular en células humanas, con múltiples quinasas dependientes de la ciclina. También han demostrado que coprecipitan con tres polipéptidos: una quinasa dependiente de la ciclina, un factor de replicación y de reparación de DNA bien caracterizado (es decir, un antígeno nuclear de proliferación de células o PCNA) y un polipéptido de 21 kDa de peso molecular aparente. Los resultados sugieren que la ciclina de tipo D, CDK, PCNA, y p21 existen en un complejo cuaternario, que muchas variaciones combinatorias de los componentes (por ej. ciclina D1 o D3 y CDK2, CDK4 y CDK5) se conjuntan in vivo y que cada uno de los complejos cuaternarios puede tener un papel sutilmente diferente en el ciclo celular o en los diferentes tipos de células. Además, se ha descubierto que la transformación celular por virus tumorales de DNA, tales como el SV40, está asociada con la transposición de la subunidad selectiva de los complejos de ciclina D. La asociación entre la ciclina D, PCNA, CDKs (incluyendo CDK2, CDK4 y CDK5) y p21 es rota por introducción de un virus tumoral del DNA o su producto gen oncogénico en las células de mamíferos. De forma específica, tal como se ha descrito en el presente documento, se ha mostrado que la asociación entre la ciclina D y el PCNA, CDKs (CDK2, CDK4 y CDK5) y p21 es rota con la introducción del virus tumoral SV40 o su producto gen oncogénico antígeno T grande en las células diploides humanas (tal como se ha ejemplificado por los fibroblastos diploides humanos normales). Después de la disociación entre la ciclina D y la p21, la CDK4 se asocia con un nuevo polipéptido de 16 kDa (p16). De forma similar, los complejos de ciclina A también sufren una transposición de la subunidad. Después de la transformación del SV40, la asociación de la p21 con ciclina A disminuye o se disocia completamente. Entonces, la ciclina A aparece en un complejo con un polipéptido de 19 kDa (p19).
De este modo, ahora se conoce que la p21 está asociada con las quinasas de ciclina sólo en células no transformadas normales, y la p16, p19 y otras proteínas potencialmente relacionadas parecen presentes en el ciclo celular como células transformadas. Este conocimiento sirve como base para una variedad de aproximaciones a la modulación de la división celular por alteración de la actividad (directamente o indirectamente) de las ciclinas. Ofrece especificidad en la modulación de la división celular (es decir, en la capacidad de alterar de forma selectiva la división celular en tipos de células particulares o en un punto particular en el ciclo) debido a la especificidad de expresión de ciclinas en células y al número de posibles combinaciones de los componentes del complejo cuaternario que parece estar formado por ciclinas, CDK, PCNA y p21. En una realización particular, ofrece un medio por el que la división celular puede estar alterada de forma no específica por interferencia con un componente común del complejo cuaternario del que la ciclina de tipo D o la ciclina de tipo A es un constituyente, tal como por interferencia con PCNA.
Por ejemplo, en una realización particular de un método terapéutico de la presente invención, la formación del complejo cuaternario descrito anteriormente es impedida o intensificada o la actividad de un miembro complejo es alterada como una aproximación para alterar la división celular. Aquí, pueden utilizarse agentes que actúan indirectamente o directamente para impedir o intensificar la formación de complejo o para alterar una actividad del constituyente. Por ejemplo, tal como se ha descrito anteriormente, la actividad catalítica puede ser inhibida por la acción de impedir la activación de la proteína quinasa. De forma alternativa, los inhibidores de PCNA pueden ser introducidos en células en las que el inicio del ciclo celular debe ser inhibido, dando lugar a la inhibición de la división celular. Los inhibidores de PCNA pueden actuar de forma indirecta (por ej., para reducir la producción de PCNA por interferencia con la transcripción o traducción) o directamente (por ej., para unir el PCNA y impedirle la unión con otros miembros complejos). Los inhibidores de la p21 también pueden ser introducidos en células e interferir, de forma indirecta o directa, con la función de la p21 y/o unidos a los miembros complejos. Las interacciones proteína-proteína (entre los componentes complejos) también pueden ser alteradas (reducidas o intensificadas) para tener el efecto deseado en el ciclo celular (para reducir o incrementar la división celular). Pueden utilizarse los agentes que bloquean dichas interacciones proteína-proteína. Esto incluye los inhibidores de bajo peso molecular, los agentes que se unen a los componentes complejos (por ej., anticuerpos) y los agentes que degradan o de otra forma destruyen una capacidad del componente para formar un complejo con las demás proteínas. Si se desea la formación de un complejo cuaternario activado, agentes que incrementan la capacidad de los miembros complejos para interaccionar y unir (por ej., pueden introducirse en las células agentes que cambian la configuración de un componente complejo de modo que sean más asequibles para las interacciones proteína-proteína necesarias para la formación de complejo). También puede conseguirse la formación de complejo activado por un incremento en las células del número, la actividad o la capacidad del miembro(s) limitante(s) del complejo cuaternario, intensificando de este modo la proporción en que se forma y la capacidad para actuar.
Además, el objeto de la invención se refiere a los métodos de transformación de diagnóstico de una célula. Los reactivos, tales como anticuerpos monoclonales, pueden ser desarrollados de modo que reconozcan las interacciones entre las CDKs, ciclinas PCNA y los polipéptidos de bajo peso molecular (por ej., p21, p19 y p16). Por ejemplo, un anticuerpo que reconoce la interacción entre p16 y CDK4 puede ser utilizado para detectar o diagnosticar la transformación de muchos tipos de células. De forma alternativa, agentes tales como anticuerpos que reconocen el CDC2, la CDK2, la ciclina A o la ciclina D, pueden ser utilizados para identificar la composición de la subunidad de los complejos de ciclina y de este modo el estado de transformación de la célula.
El objeto de la invención también hace referencia a agentes (por ej.: oligonucleótidos, anticuerpos, péptidos) útiles en el aislamiento, diagnóstico o los métodos terapéuticos descritos.
Descripción detallada de la invención
Las ciclinas son proteínas reguladoras clave que, conjuntamente con las proteína quinasas dependientes de ciclina (CDKs), funcionan para gobernar las transiciones críticas y/o los puntos de restricción durante el curso de la progresión del ciclo celular. La presente invención proporciona métodos y reactivos para el desarrollo de inhibidores y/o activadores de los procedimientos del ciclo celular particulares. Tal como se describe en el presente documento, en células eucarióticas normales, células humanas particulares, varios tipos de ciclinas (tales como las clases A, B y D) pueden asociarse con un número de diferentes CDKs, así como el antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA), y un polipéptido (p21) de un peso molecular aparente de 21kd, de modo que formen múltiples tipos de complejos. Por ejemplo, los resultados que se proporcionan a continuación indican que existe una combinación de ciclinas y CDKs, junto con PCNA y p21, en al menos un complejo cuaternario, que muchas variaciones combinatorias de los componentes conjuntan in vivo (por ej., diferentes combinaciones de ciclina D1 o D3 con CDK2, CDK4 y CDK5), y que cada uno de los complejos cuaternarios resultantes puede tener un papel sutilmente diferente en el ciclo celular o en diferentes tipos de células. De este modo, tal como se describe a continuación, pueden generarse ensayos para identificar agentes capaces de, por ejemplo, romper de forma selectiva complejos particulares formados entre ciclinas y CDKs.
Además, la presente invención hace que sean asequibles los análisis de diagnóstico y los reactivos para la detección de células transformadas, tales como los que pueden ser útiles en la detección del cáncer. Se demuestra a continuación que la transformación celular está asociada con la transposición de la subunidad selectiva de los complejos de ciclina-CDK. Para ilustrar, en las células que han sido transformadas (tanto viralmente como por aberración genética), se rompen los complejos D/p21/CDK/PCNA de ciclina. Por ejemplo, en células transformadas viralmente, la CDK4 se disocia totalmente de la ciclina D, del PCNA, y de la p21, asociándose en su lugar con el polipéptido de 16 Kd (nombrado de aquí en adelante como "p16"). Los complejos cuaternarios que contienen las ciclinas A o B1 y p21/CDK/PCNA también sufren un transposición de la subunidad en células transformadas. Por ejemplo, tanto el PCNA como la p21 ya no se asocian con los complejos binarios CDC2-ciclina B1, y los complejos de ciclina A ya no contienen la p21, la cual es sustituida con una proteína de 19 kd (p19). De este modo la detección de dichos complejos de subunidades anormales puede ser utilizada de forma predictiva para detectar la transformación celular. Por ejemplo, la presente invención hace asequibles reactivos, incluyendo anticuerpos y sondas de ácido nucleico, para la detección de la formación del complejo alterado y /o niveles incrementados de la expresión del p16 con el fin de identificar las células transformadas.
Además, se demuestra que la p16 es inferior para ejercer un efecto inhibitorio sobre la actividad de los complejos de ciclina/CDK, particularmente los que incluyen CDK4. Por ejemplo, la p16 es capaz de inhibir la actividad de los complejos de ciclina D1/CDK in vivo. Tal como se conoce de forma general, la ciclina D1 ha sido asociada con una amplia variedad de enfermedades proliferativas. Así, la presente invención identifica un potencial inhibidor de la proliferación celular resultante de la expresión oncogénica de la ciclina D1.
A la inversa, la p16 puede ser utilizada en ensayos para identificar agentes que disminuyen la capacidad de la p16 para unirse al CDK4 y por consiguiente aligeran la inhibición de los complejos ciclina/CDK4. En esta realización, la reactivación de los complejos CDK4/ciclina rompe o, de otro modo, desequilibra los sucesos celulares que se producen en la célula transformada. Dichos agentes pueden ser utilizados de forma terapéutica de modo que la activación de los complejos CDK4 en las células transformadas, por ejemplo, por los virus del tumor, pueda dar lugar a una intensificación de los puntos críticos del ciclo celular suprimidos por los virus, tales como el p53, y dar lugar a la acumulación de la célula infectada en el punto crítico, o de forma alternativa, en el caso de la fosforilación Rb, progrese de forma prematura hacia un punto crítico que de lugar a la muerte de la célula.
Una quinasa dependiente de la ciclina, designada CDK5, y el DNA que codifica la cdk5 también es asequible como resultado del trabajo descrito en el presente documento. Se ha mostrado que la cdk5 co-precipita con las ciclinas de tipo D, el PCNA y la p21. De este modo, la presente invención contempla que la función CDK5 y/o la asociación con otros miembros del complejo puede ser alterada (intensificada o disminuida) para efectuar la proliferación de una célula. Si se impide que la cdk5 se una a la ciclina de tipo D, se impide la activación de la quinasa. Esto puede ser efectuado tal como se describe a continuación.
1. Complejos de ciclina en células normales
A continuación se presenta una descripción del descubrimiento de que las ciclinas de tipo D están asociadas con al menos tres polipéptidos adicionales (CDK, PCNA y p21) en lo que parece ser un complejo cuaternario que tiene muchas variaciones combinatorias posibles dando lugar a complejos que pueden tener cada uno de ellos distintos papeles en el ciclo celular, o en los diferentes tipos de células.
Tal como se describe a continuación y en el Ejemplo 1, los procedimientos inmunológicos han sido utilizados para establecer que el asociado de ciclinas de tipo D, en las células eucarióticas, con una variedad de subunidades catalíticas potenciales (por ej., CDKs, tales como la cdk2, la CDK4 y la cdk5). Además, estos procedimientos han mostrado que la ciclina de tipo D y la cdk se asocian con el factor de replicación PCNA y un polipéptido de peso molecular aparente de 21 kDa.
La ciclina humana D1 se ha asociado con una amplia variedad de enfermedades proliferativas. Tal como se describe en el presente documento, en células diploides humanas, específicamente en fibroblastos diploides humanos, la ciclina D1 es complejada con un número de otras proteínas celulares. Entre ellas están las subunidades catalíticas CDK2, CDK4 (previamente nombradas PSK-J3), y las CDK5 (también llamadas PSSALRE). Además, los polipéptidos de 21 kDa y 36 kDa son identificados en asociación con la ciclina D1. Tal como se ha descrito en el Ejemplo 1, se ha mostrado que la proteína de 36 kDa es el Antígeno Nuclear Celular Proliferante, PCNA. El PCNA ha sido descrito como un factor accesorio esencial para la polimerasa delta, que se requiere para la replicación del DNA de hebra conductora y la reparación del DNA. La ciclina D3 también se asocia con múltiples proteínas quinasas, p21 y PCNA, tal como se muestra en el presente documento. Se propone que existe un complejo cuaternario de ciclinas de tipo D, CDK, PCNA y p21, y que muchas variaciones combinatorias (ciclina D1, D3 con CDK2, 4 y 5) pueden unirse in vivo. Estos descubrimientos enlazan una ciclina G1 putativa humana que está asociada con la oncogénesis con una replicación de DNA y un factor de reparación bien caracterizado.
(i) Investigación de proteínas que se asocian con la Ciclina D
Para identificar proteínas que se asocian de forma específica con la ciclina D, se examinaron los inmunoprecipitados de anti-ciclina D1 de la metionina marcada con [S^{35}] de lisados de fibroblastos diploides humanos WI38 (ver Ejemplo 1, Procedimientos Experimentales). Las células WI38 fueron inicialmente seleccionadas para este estudio debido a que son una línea celular relativamente normal que expresa de forma razonable elevados niveles de ciclina D1 y un bajo nivel de ciclina D3 mRNA (Won y col., proc. Natl. Acad. Sci. (1992). Se utilizaron las células de riñón embrional primario transformadas humanas 293 como controles debido a que expresan los tres mRNAs de la ciclina D y la proteínas a niveles extremadamente bajos (Xiong, y col., Cell 65:691-699 (1991)). Las células W138 expresan un polipéptido de 35 kDa fácilmente detectable que puede ser inmunoprecipitado por el antisuero anti-ciclina D1. La identidad de la proteína de 35 kDa como la ciclina D1 fue confirmada por comparación de un inmunoprecipitado del mismo lisado de células W138 con suero pre-inmune, y con una precipitación similar del lisado de células 293 con el mismo antisuero de anti-ciclina D1. Debido a la existencia de tres genes de ciclina D muy relacionados en células humanas, y a la débil reactividad cruzada del anticuerpo de la anti-ciclina D1 para otras proteínas de la ciclina D, la identidad de la banda de 35 kDa fue adicionalmente investigada por representación proteolítica parcial. La proteolisis parcial del S. Aureus V8 de la banda de 35 kDa reveló el mismo modelo que el de la ciclina D1 rota de forma similar sintetizada in vitro, pero no que la ciclina D2 o la D3.
Además de la banda intensa de 35 kDa correspondiente a la ciclina D1, otras tres bandas principales, p36, p33 y p21 y una manda menor, p31 (en donde el número indica los pesos moleculares aparentes), aparecieron de forma específica en los precipitados de anti-ciclina D1. Estos polipéptidos están ausentes de los precipitados del lisado de células W138 utilizando suero pre-inmune o los precipitados de los lisados de células 293 con el mismo anticuerpo de anti-ciclina D1. La posibilidad de que cualquiera de estas cuatro bandas, en particular la p31 y p33, puedan ser ciclina D2 o D3 se estableció por comparación de sus modelos de proteolisis V8 parcial con los de las D2 y D3 traducidas in vitro. La precipitación de estos polipéptidos con el suero de la anti-ciclina D1 también es probable que no sea debida a la presencia de epitópes de reactividad cruzada en cualquiera de estas proteínas, ya que no se detectaron estas proteínas después de la inmunoprecipitación acoplada con secante Western utilizando el mismo anticuerpo. Los experimentos para identificar las proteínas asociadas con la ciclina D1 se describen a continuación.
(ii) Asociados CKD5 con Ciclinas de tipo-D
Se ha descrito previamente que en macrófagos de murino, los asociados de ciclina D1/cyll con un polipéptido que reacciona de forma cruzada con un anticuerpo hasta el p34cdc2 de longitud completa del Schizosaccharomyces pombe (G8), pero no con un anticuerpo preparado frente al C terminal del p34cdc3 humano (Draetta y col., Cell 50:319-325 (1987); Draetta y Beach, Cell 54:17-26 (1988); Matsushime y col., Cell 65:701-713 (1991). Luego se obtuvieron resultados esencialmente idénticos en células W138 humanas, sugiriendo que la ciclina D1 se asocia con un relativo del CDC2 humano.
El anticuerpo G8 se utilizó para el examen de librerías de expresión de cDNA humano (ver Ejemplo 1, Procedimientos Experimentales), con el fin de aislar quinasas asociadas con ciclina de tipo D. Se identificaron treinta y cuatro clones cDNA G8-asociadas con ciclina de tipo D. Se identificaron treinta y cuatro clones cDNA G8-positivos a partir de una librería de cDNA de células HeLa. Entre estos, 17 clones codificaron el CDC2 y otros 14 codificaron para la CDK2. Uno de los clones restantes codifica un ORF de 292 residuos de amino ácidos (SEC ID Nos. 1 y 2) con un peso molecular predictivo de 33.283 daltons. Este clon es designado como CDK5, ya que comparte la identidad de amino ácidos extensiva de las quinasas dependientes de ciclina conocidas (CDKs), incluyendo el CDC2 de S. Pombe (53,4%), el CDC28 de S. Cerivisiae CDC28 (55,9%), el CDC2 humano (56,8%) y la CDK2 humana (60,3%), y se asocia con ciclinas de tipo D humanas (ver a continuación). La CDK5 codifica una secuencia de DLKKYFD a una secuencia de 86 a 92 amino ácidos, mientras que la región correspondiente del CDC2 humano tiene la secuencia de DLKKYLD y la cdk2 tiene el DLKKFMD.
Para determinar si la CDK5 se asocia con las ciclinas D, se promovió un antisuero contra un péptido correspondiente a la única región carboxi-terminal de la CDK5 (ver Ejemplo 1, Procedimientos Experimentales). Este suero no tiene reactividad cruzada con el CDC2, la CDK2, o la CDK4 humana. La inmunoprecipitación o las manchas Western después de la inmunoprecipitación mostraron que este antisuero detectó un polipéptido en el lisado de células con un peso molecular aparente de 31 kDa (p31), que co-migró con el polipéptido CDK5 sintetizado in vitro, y cuya señal se presentó efectivamente fuera por el péptido antigénico CDK5. La identidad de la proteína de 31 kDa precipitada por el anticuerpo anti-CDK5 se confirmó de forma adicional que era la CDK5 por comparación de la representación proteolítica del V8 del p31 con la CDK5 traducido in vitro.
La inmunoprecipitación de lisatos de células de células W138 marcadas en la metionina-S^{35} utilizando el antisuero anti-CDK5 reveló varios polipéptidos, además del p31^{CDK5}. Entre estos, los polipéptidos de 36 kDa (p36), de 35 kDa (p 35), de 33 kDa (p33) y de 21 kDa (p21) fueron los más prominentes y coprecipitados de forma específica por el antisuero anti-CDK5. Los cuatro polipéptidos estuvieron ausentes de los precipitados con el suero pre-inmune o en presencia de una cantidad en exceso del péptido con el carboxi terminal CDK5.
Se encontró que las movilidades electroforéticas del p35 y del p33 eran las mismas que las de ciclina D1 y la D3 humanas traducidas in vitro, respectivamente. Para analizar directamente la posibilidad de que el p35 asociado al CDK5 pueda corresponder a la ciclina D1, los inmunoprecipitados de CDK5 fueron manchados con antisueros de anti-ciclina D1. Se detectó por el antisuero de la anti-ciclina D1 un polipéptido de 35 kDa, que co-migró con la p35^{ciclina D1}. Las manchas recíprocas de los inmunocomplejos de la anti-ciclina D1 por el antisueros CDK5 también revelaron la presencia de un polipéptido de 31 kDa que tuvo la misma mobilidad que el p31^{CDK5}. De forma similar, también se ha detectado CDK5 en los inmunoprecipitados de anti-ciclina D3. Estos datos indican que la p35 asociada a la CDK5 es la ciclina D1, y la p33 asociada a la CDK5 es la ciclina D3.
Para buscar una evidencia que permitiera concluir la identidad de las proteínas p35 y p33 asociadas al CDK5, se utilizó la representación proteolítica parcial (Cleveland y col., J. Biol. Chem. 252:1102-1106 (1977). La p35 marcada con S^{35} purificada de los inmunoprecipitados anti-CDK5 fue sometida a digestión con la proteasa V8 de S. Aureus y se comparó con la p35^{ciclina D1} humana tratada de forma similar obtenida tanto de la traducción in vitro como de la inmunoprecipitación de una anti-ciclina D1. El modelo proteolítico V8 de la p35 a partir de los inmunoprecipitados anti-CDK5 fue idéntico al de la ciclina D1, pero diferente al de la ciclina D3. También se llevaron a cabo experimentos similares para confirmar la identidad del p33. El modelo proteolítico parcial de la p33 asociada a la CDK5 es idéntico al de una ciclina D3 humana traducida, pero no al de la D1. A la inversa, también se ha determinado que el modelo de digestión del V8 parcial de la p31 asociada a la ciclina D1 es idéntico al de la CDK5 obtenida tanto de la traducción in vitro como de la inmunoprecipitación anti-CDK5.
(iii) Asociados de CDK5 con Ciclina D
El peso molecular aparente de la p33 asociada a la ciclina D1 (por ej., en los precipitados D1 de la anti-ciclina), y también la reactividad cruzada de la p33^{CDK2} con el anticuerpo G8 sugieren la posibilidad de que la p33 pueda ser la CDK2. Para analizar esto, se comparó el precipitado de CDK2 de un lisado de células WI38 marcadas con metionina [S^{35}] con un precipitado de la anti-ciclina D1. Tal como se esperaba, el suero CDK2 anti-C terminal precipitó una proteína de 33 kDa que se confirmó que era la p33^{CDK2} por comparación del modelo de proteolisis del V8 de S. Aureus de la banda de 33 kDa con la de la CDK2 traducida in vitro. Además, la p33^{CDK2} comigró con la p33 presente en el precipitado de anti-ciclina D1. De forma recíproca, el antisuero CDK2 también precipitó una proteína de 35 kDa que comigró con la ciclina D1.
Para buscar una evidencia adicional de la existencia de una posible asociación entre la cdk2 y la ciclina D1, se inmunoprecipitó un lisado de células WI38 con la anti-entre la CDK2 y la ciclina D1, se inmunoprecipitó un lisado de células WI38 con la anti-ciclina D1, separado en SDS-PAGE, y se inmunomanchó con anti suero anti-CDK2. El anticuerpo anti-CDK2 fue incrementado contra el péptido carboxi-terminal (Pagano y col., EMBO J. 11:961-971 (1992)) y se determinó su especificidad por inmunotransferencia de manchas de los CDC2, CDK2, CDK3, CDK4 y CDK5 humanos expresados bacterialmente. Sólo la CDK2, y no las otras proteínas CDK, fue reconocido por este anticuerpo. La proteína CDK2 se detectó en los lisados de células WI38 que fueron inmunoprecipitados tanto con anti-CDK2 como con anti-ciclina D1, pero no en el lisado precipitado con suero pre-inmune o con anti-CDK2 pre-incubado con péptidos antigénicos competidores. En un experimento con manchas Western recíproco, se inmunoprecipitó el lisado de células con anti-CDK2 y se hicieron las manchas con anti-ciclina D1. Se detectó la ciclina D1 en los inmunoprecipitados de la anti-ciclina D1 y de anti-CDK2, pero no en los precipitados tanto de suero preinmune o de antisuero CDK2 pre-incubado con un péptido que compite con la CDK2.
Para analizar si la CDK2 también se asocia con la ciclina D3, se mancharon los inmunoprecipitados formados utilizando antisuero para el péptido C-terminal de la ciclina humana D3 (ver Ejemplo 1, Procedimientos Experimentales) con el anti-suero anti-CDK2. Se detectó débilmente la CDK2 en el precipitado de anti-ciclina D3, pero no en el precipitado control con el antisuero de la anti-ciclina D3 preincubado con un péptido antígeno competidor.
Finalmente, para confirmar además la asociación entre la CDK2 y la ciclina D, se llevaron a cabo experimentos de representación proteolítica parcial. Inicialmente, se realizaron intentos de representar proteolíticamente la ciclina D1 asociada con la p33 para compararla con la CDK2. Sin embargo, debido a la comigración de la CDK2 con incluso otras proteína quinasas predominantes en los precipitados de anti-ciclina D1, se obtuvo un modelo proteolítico diferente. Por consiguiente, se llevó a cabo el experimento recíproco. La banda de 35 kDa en los inmunoprecipitados de anti-CDK2 fue excindida en gel de SDS-poliacrilamida, digerida parcialmente con la proteasa V8 y separada electroforeticalmente y comparada con la p35^{ciclina D1} digerida en V8 derivado tanto de la traducción in vitro como de la inmunoprecipitación de la anti-ciclina D1. El modelo de la rotura proteolítica fue el mismo en cada caso.
(iv) La pSK-J3/CDK4 es la proteína p33 predominante asociada con la Ciclina D1
La diferencia en el modelo proteolítico de la p33 asociada con la ciclina D1 a partir del de CDK2 sugirió que la mayoría de la p33 asociada a la D1 corresponde a una proteína diferente de la CDK2. Una proteína quinasa llamada PSK-J3, identificada originalmente en una exploración con sondas de oligonucleótidos mezclados derivó de regiones conservadas de quinasas de la serina/treonina (Hanks, S. K., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:388-392 (1987), se creyó que tenía las propiedades de unión a la ciclina D. La masa molecular predicha del PSK-J3 es de 34 kDa, próxima a la de la p33. Debido a su asociación con ciclinas D, tal como se demuestra a continuación, el PSK-J3 es referido a continuación como CDK4. La CDK4 traducida in vitro, y que precipitó de un lisado de células con el suero anti-CDK4, demostró la misma movilidad electroforética que la CDK2 y que la p33 asociada a la D1. La identidad de la CDK4 precipitada por el antisuero anti-CDK4 fue confirmada por comparación de su modelo de representación de V8 parcial con el de la CDK4 traducida in vitro.
Se llevaron a cabo experimentos de inmunoprecipitación con manchas Western para analizar directamente si la ciclina D1 asociada a la p33 es la CDK4. Un suero anti-CDK4 reaccionó con una proteína de 33 kDa presente en inmunoprecipitados de anti-ciclina D1 que tiene la misma movilidad que la CDK4 precipitada por anti-CDK4, pero no reaccionó con precipitados de lisado de células tanto de la CDK2 como de la CDK5. De forma recíproca, el antisuero de anti-CDK4 también precipitó una proteína de 35 kDa detectada por en anticuerpo de la anti- ciclina D1. Para confirmar de forma adicional la identidad de la ciclina D1 asociada a la p33, se comparó el modelo de digestión del V8 parcial de la p33 al de los CDK4 y CDK2 inmunoprecipitados. La ciclina D1 asociada a la p33 mostró un modelo muy similar al de la CDK4, pero bastante diferente del de la CDK2. Este resultado indica que la CDK4 es considerablemente más abundante (al menos analizado de forma ordinaria por el marcaje con metionina) que la CDK2 en los precipitados de anti-ciclina D1 de las células WI38. De forma similar, se ha identificado un polipéptido de 33 kDa (p33) observado en el inmunoprecipitado de anti-CDK4 como ser la ciclina D3 por representación del péptido V8 parcial.
(v) Asociación de la p21 con la Ciclina D1 y la CDK2
En el lisado de WI38 marcado con metionina [S^{35}] precipitado con suero de anti-ciclina D1, apareció una proteína de 21 kDa (p21) asociada de forma específica con la ciclina D1. La p21 no estuvo presente en los precipitados con el suero pre-inmune, ni en el precipitado de anti-ciclina D1 derivado de células 293, que contenían niveles no detectables de ciclina D1. La asociación específica de la p21 con ciclina D1 fue adicionalmente soportada por la presencia de una proteína de 21 kDA comigrante en los inmunoprecipitados formados con sueros frente a la CDK2, a la CDK4 y a la CDK5. Cuando el antisuero anti-CDK2 fue pre-bloqueado con un péptido competidor por la CDK2, no se observó la banda de la p21, y también la p33^{CDK2} y la p35^{ciclina D1}. De forma similar, la p21 también estuvo ausente de los inmunoprecipitados anti-CDK5 si el antisuero fue preincubado con el péptido antígeno carboxi-terminal CDK5. La p21 no fue reconocida en las manchas Western por cualquiera de los anticuerpos anti-CDK o anticiclina D utilizados en este estudio. Además, aunque laCDK2 inmunoprecipitable total en células 293 es similar al las células WI38, la banda de p21 no estuvo presente en los inmunoprecipitados CDK2 a partir de los lisados de células 293. Este descubrimiento sugiere que la asociación de la CDK2 y la p21 es dependiente de la ciclina D.
Para determinar si los inmunoprecipitados de la ciclina D1 y los inmunoprecipitados dla cdk2 corresponden al mismo polipéptido, se compararon el modelo proteolítico V8 de la p21 purificada de cada fuente. En efecto son los mismos. El precipitado de la p21 por el antisuero anti-CDK5 también se encontró que era el mismo que la p21 asociada a la ciclina D1. La p21 en la inmunoprecipitación del anti-CDK4 también fue representada proteolícamente. Dio un modelo idéntico a la p21 asociada a la ciclina D1. La p21 no corresponde a la proteína max humana o a la p21^{ras}, ya que su movilidad electroforética es mayor que la de cualquier otra y no fue reconocida por un anticuerpo ras anti-humano en manchas Western.
(vi) La p36 asociada a la Ciclina D1 es el PCNA
Tal como se ha establecido anteriormente, la anti-ciclina D1 precipitada de células WI38 muestra polipéptidos asociados de 21 kDa, 31 kDa y 33 kDa y también una proteína prominente de 36 kDa. La proteína p36 no fue detectada en precipitados control, utilizando tanto suero pre-inmune como en lisatos 293. También se detectó una proteína de 36 kDa, en una menor abundancia en los inmunoprecipitados de CDK2, CDK4 y CDK5, pero no en los precipitados con antisuero pre-incubado con péptidos competidores.
Aunque se consiguió establecer la identidad de la p36, cuatro observaciones sugirieron la posibilidad de que podía ser el antígeno nuclear proliferante humano, PCNA. En primer lugar, en una población asíncrona de células WI38 proliferantes, se observó que la ciclina D1 es de forma predominante una proteína nuclear, aunque la distribución no es idéntica al modelo del PCNA manchado (R. Bravo, H. MacDonald-Bravo, EMBO J. 4:655-661 (1985); P. Madsen y J.E. Celis, FEBS Lett., 193:5-11 (1985). En segundo lugar, mientras que el nivel de ciclina D1 es relativamente constante en las células WI38 activadas mitogénicamente, la p36 en los inmunoprecipitados de la ciclina D1 marcada con metionina [S^{35}] fue menor en células quiescentes e incrementó a las 10-14 horas después de la estimulación. Entre diez y catorce horas después de la estimulación en suero, muchas células WI38 están en el último G1, a un tiempo que coincide con el comienzo de la síntesis de PCNA en los fibroblastos 3T3 estimulados en suero (R. Bravo y H. MacDonald-Bravo, EMBO J., 3:3177-3181 (1984); J. E. Celis y A. Celis, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 3262-3268 (1985); P. Madsen y J.E. Celis, FEBS Lett., 193:5-11 (1985). En tercer lugar, el peso molecular aparente de la p36 es similar al del PCNA. Finalmente, el anticuerpo anti-PCNA precipitó un polipéptido de 35 kDa cuya mobilidad electroforética es similar a la de la p35^{ciclina D1}. La identidad de la p36 precipitada por el anticuerpo anti-PCNA ha sido confirmada como PCNA por comparación de su representación del péptido V8 con la del PCNA traducido in vitro.
Los experimentos de inmunoprecipitación-manchas Western se llevaron a cabo para analizar directamente la posibilidad de que la p36 sea el PCNA. El PCNA fue fácilmente detectado en los inmunoprecipitados de anti-ciclina D1, de ciclina D3, de CDK2 y de CDK5, pero no en los respectivos precipitados control. En un experimento recíproco, también se detectaron ciclina D1 y CDK2 en los inmunoprecipitados anti-PCNA. No ha sido posible detectar de forma convincente la ciclina D3 o CDK5 en los precipitados de PCNA, debido posiblemente a la baja abundancia de ambas proteínas en las células WI38 y a la relativamente débil sensibilidad de los antisueros D3 y CDK5 en las manchas Western.
Para valorar de forma adicional la similitud entre el PCNA y el polipéptido p36 asociado con la ciclina D1 y CDK2, las bandas de la p36 se purificaron de los inmunoprecipitados de ciclina D1 y de CDK2, separados en SDS-PAGE y su modelo de representación proteolítica de V8 parcial se comparó con el del PCNA. La digestión de la p36 asociada a la ciclina D1 por la proteasa del V8 reveló el mismo modelo que el del PCNA derivado de los inmunoprecipitados anti-PCNA y del PCNA traducido in vitro. De forma similar, los modelos de digestión de la p36 asociada al CDK2- y CDK5- también son comparables al del PCNA. La p36 asociada con la ciclina D1 es PCNA. Además, la representación proteolítica de la p21 detectada en el inmunoprecipitado anti-PCNA demostró que era el mismo que la p21 asociado con la ciclina D1 descrita anteriormente.
(viii) Complejos subunidad de otras ciclinas
El PCNA y la p21 no sólo se asociaron con la ciclina D-CDK para formar un complejo cuaternario tal como se ha descrito anteriormente, sino que también estuvieron presentes como componentes universales de los complejos de ciclina-CDK en muchos otros ejemplos de células normales. En lisatos de células WI38 y de células HSF43 inmunoprecipitadas con anticuerpo de anti-ciclina A, se encontró que la ciclina A se asocia con el PCNA, el CDC2, la cdk2, y la p21.
Del mismo modo, el análisis de los inmunoprecipitados de anti-ciclina B1 marcada con metronina S^{35} a partir de los lisados WI38 y HSF43 reveló un complejo cuaternario, que comprende la ciclina B1, un CDK, la p21 y el PCNA.
Aunque las técnicas experimentales utilizadas en este estudio no permiten formalmente una distinción entre la existencia de múltiples interacciones por parejas entre cada proteína, los datos son explicados de forma simple si la ciclina D el PCNA, la CDK y la p21 forman un complejo cuaternario. La comparación de la intensidad de las bandas marcadas con metionina en las reacciones de inmunoprecipitación sugieren que no toda la ciclina D está presente en el complejo, ni es todo el PCNA. Sin embargo, la intensidad relativa de las bandas de la p36 (PCNA), la p33 (CDK4) y la p21 en un precipitado de anti-ciclina D es muy similar. Los resultados presentados en el presente documento no contemplan la posibilidad de que la ciclina D, con o sin las proteínas asociadas descritas en el presente documento, puedan asociarse con modelos adicionales in vivo. En particular, dos polipéptidos que migren a cada lado del marcador de peso molecular 97KD son aparentes en la reacción de precipitación de la anti-ciclina D.
El PCNA ha sido descrito como un factor accesorio esencial para la polimerasa delta que es requerido tanto para la replicación de DNA de hebra conductora como también para la reparación de DNA (G. 
\hbox{Prelich}
y col., Nature, 326:517-520 (1987); G. 
\hbox{Prelich}
y B. Stillman, Cell, 53:117-126 (1988); L. Toschi y R. Bravo, J. Cell. Biol., 107:1623-1628 (1988); M. K. K. Shiviji, y col., Cell, 69:367-374 (1992). Se localiza en el núcleo en los sitios de la síntesis de DNA activa y la localización del PCNA, pero no su síntesis, es dependiente de la síntesis de DNA. No fue posible detectar la fosforilación de cualquiera de las respectivas subunidades en reacciones de la quinasa in vitro, sugiriendo que ni el PCNA ni la p21 es un substrato primario de la ciclina D/CDK.
Las enzimas de la ciclina D/CDK que se asocian con el PCNA y la p21 pueden unirse in vivo en un complejo sintético de multi-proteína-DNA más elaborado, pudiendo ser un componente del mismo el substrato fisiológico de la ciclina D/CDK. El PCNA ha sido purificado bioquímicamente de forma general a partir de células en una forma monomérica que no está asociada con otras proteínas (G. Prelich y col., Nature 346:760-763 (1987)). Es posible que los complejos de multi-proteínas descritos en el presente estudio fueran olvidados debido a que no comprenden la mayoría del PCNA celular. De forma alternativa, es posible que el PCNA tenga además papeles regulatorios del ciclo celular sintético de no DNA que no han sido previamente descritos y que implican las proteínas de la ciclina D y CDK. Sin embargo, los presentes estudios proporcionan la primera indicación bioquímica de una función posible de las ciclinas de tipo D, como moduladores de la función del PCNA.
La importancia del complejo cuaternario es enfatizada por el nuevo descubrimiento de que la transformación celular por virus de tumor de DNA está asociada con la transposición de la subunidad selectiva de los complejos de ciclina D, así como otros complejos del ciclo celular, incluyendo los complejos de ciclina A, CDC2, CDK2, CDK4 y CDK5. En particular, la introducción de virus de tumor de DNA SV40 o su antígeno el gran producto T del gen oncogénico en fibroblastos diploides humanos normales (HDF) causa la rotura de la asociación entre la ciclina D y el PCNA, CDKs (tales como CDK2, CDK4 y CDK5) y p21. Después de la disociación entre la ciclina D y la p21, la quinasa CDK4 se asocia con un polipéptido de 16 kDa (p16). De forma similar, la transformación del SV40 causa una disminución de la asociación de la p21 con la ciclina A en HDF; y las células transformadas del adenovirus-(línea celular 293) o del virus del papiloma humano-(línea celular HeLa), la p21 está completamente disociada a partir de la ciclina A. A continuación aparece un péptido de 19 kDa, el p19, en un complejo con cilina A. Por consiguiente, la p21 está asociado con las ciclina quinasas sólo en células normales no transformadas, mientras que la p16, la p19 y posiblemente otras proteínas relacionadas están presentes en complejos de ciclina en células transformadas.
II. Complejos de ciclina en células transformadas
Tal como se describe a continuación, las presentes observaciones proporcionan una sorprendente evidencia de que la familia de enzimas ciclina/CDK que actúa a múltiples etapas clave en la división celular está alterada en gran manera en una variedad de células oncogénicamente transformadas. En cada miembro de la familia examinada ciclina/CDK, la asociación con el PCNA y la p21. Sin embargo, en la transformación con el virus del tumor del DNA SV40, o su antígeno (T) transformante, se rompen los complejos ciclina D/CDK/PCNA/p21. En células transformadas, la CDK se disocia totalmente de la ciclina D, del PCNA, y de la p21 y, en su lugar, se asocia de forma exclusiva con un polipéptido de 16 kd (p16). Los complejos cuaternarios conteniendo las ciclinas A o B1 y p21/CDK/PCNA también sufren un transposición de la subunidad en células transformadas. Tanto el PCNA como la p21 ya no se asocian con los complejos binarios CDC2-ciclina B1. Los complejos de ciclina A ya no contienen la p21, con lo que, un nuevo polipéptido de 19 kd (p19) se encuentra en asociación con la ciclina A. Este modelo si la transposición de la subunidad de los complejos de ciclina-CDK ha sido descubierto no solo en las células transformadas SV40, sino también en las células transformadas con adenovirus o virus del papilloma. Además, el modelo de composición de la subunidad, tal como el de las células deficientes en p53 derivado de los pacientes Li-Fraumeni, así como el de células de carcinoma A-431 epidérmicas, y el carcinoma FaDu de células escamosas de faringe.
(i) Rotura de los complejos de ciclina D/CDK/PCNA/p21 en las células SV-40 transformadas
Aunque se detectaron complejos cuaternarios de ciclina D/CDK/PCNA/p21 en células de fibroblastos normales (por ej., WI38 y HS68) tal como se ha descrito anteriormente, tales complejos no se detectaron en otras varias líneas celulares que habían sido viralmente transformadas (por ej., la línea celular 293 humana). Dada la aparente diferencia, se compararon más estrechamente las composiciones de la subunidad de los complejos de ciclina D en fibroblastos diploides normales y sus derivados transformados. La WI38 VA13, sublínea 2RA (de aquí en adelante nombrada como VA13), es un derivado del virus SV40 transformado de la línea celular WI38. Se examinaron los inmunoprecipitados anti-ciclina D1 de los lisados de WI38 y de VA13 marcados con metionina S^{35}. Tal como se ha demostrado anteriormente para las células WI38, el antisuero de anti-ciclina D1 precipita una banda dominante de 35-kD correspondiente a la ciclina D1 y tres proteínas asociadas principales, p36^{PCNA}, p33^{CDK4}, y p21. En células VA13 transformadas SV-40, el nivel de ciclina D1 está disminuido en entre dos y tres veces tal como se determinó por autoradiografía de los inmunoprecipitados marcados con metionina S^{35}, y por manchas Wester. Sin embargo, ninguna de las tres proteínas asociadas a la ciclina D1 principales fue asociada de forma visible con la ciclina D1 en las células VA13 transformadas de SV40. Se llevaron a cabo inmunoprecipitaciones recíprocas con antisueros anti-CDK4 y anti-CDK2 para confirmar la rotura observada de los complejos de ciclina D en células transformadas de SV40. En células WI38, la CDK4 precipitado del anticuerpo anti-CDK4 además de tres proteínas principales asociadas, p36^{PCNA}, p35^{ciclina D1}, y p21. En las células VA13 transformadas de SV40, mientras que la CDK4 estaba presente a un nivel similar en comparación con las células WI38 no transformadas, PCNA, ciclina D1, o p21 no detectables estuvieron presentes en los inmunoprecipitados anti-CDK4. También se observaron resultados similares en los inmunoprecipitados con anti-CDK2, otra subunidad catalítica de quinasa asociada a la ciclina D. La ciclina D1 es una de las principales proteínas asociadas a la CDK2 en células WI38, pero la asociación no es detectable en células VA13 transformadas de SV40, aunque el nivel de la CDK2 sea similar o ligeramente superior en las células transformadas. También, se redujo el nivel de la p21 asociada a la CDK2 en células transformadas, pero está presente a un nivel detectable.
Se examinaron varias líneas celulares de fibroblastos diploides humanos normales adicionales y sus derivados transformados de SV40. Se obtuvo una línea celular de fibroblasto diploide, la HSF43 derivada de foresquina neonatal y de CT10-2C-T1 (referido de aquí en adelante como CT10), a partir de la HSP43 por introducción de un plásmido conteniendo el gen antígeno del tumor grande de SV40 dirigido por un promotor del virus del sarcoma Rous (RSV) (Ray y col., J. Cell Biochem. 42:13-31 (1990)). El modelo de la composición de la subunidad y la disociación de las células normales y transformadas fue muy similar al observado en las células WI38 y VA13. No se observó ninguna ciclina D1 en los inmunoprecipitados anti-CDK4, anti-CDK2, y anti-CDC2 preparados a partir de células CT10 T-transformadas, pero fue aparente en las células HSF43. De forma recíproca, no se observó CDK4 en los precipitados de anti-ciclina D1 e células CT10. Tampoco se detectó PCNA asociado a la CDK4 y a la p21 en las células CT10. La p21 en las células T-transformadas parece estar sustituida por una proteína p16 nuevamente identificada como en la línea celular VA13. Además, también se obtuvieron resultados esencialmente idénticos a partir de otros pares de líneas celulares de fibroblastos humanos, IMR-90, una línea celular de fibroblasto diploide de pulmón humano normal y su derivado IDH4 T-transformado (Shay y col., Biochem Biophys Acta 1072:1-7 (1992)), así como un par de líneas celulares de mono, CV-1, una línea celular de riñón pseudodiploide, y su derivado COS-1 transformado de SV-40.
Para confirmar de forma adicional la disociación observada de los complejos de ciclina D en células transformadas, se llevó a cabo la inmunoprecipitación, acoplada con experimentos de inmunotransferencia de manchas, para evitar artefactos que algunas veces pueden aparecer en experimentos de marcaje metabólico. Los lisados totales preparados a partir tanto de células WI38 no transformadas como de células VA13 transformadas de SV-40 se inmunoprecipitaron con una batería de anticuerpos, separados electroforéticamente, y se mancharon con varios anticuerpos secundarios. Los CDK4, CDK2 y el PCNA o bien no fueron detectados (CDK4) o bien estuvieron presentes a unos niveles disminuidos de forma dramática (CDK2 y PCNA) en los precipitados de anti-ciclina D1 derivados de células transformadas de SV-40. En cada caso, la inmunotransferencia de manchas directa confirmó que el nivel absoluto de CDK4, CDK2, y PCNA es similar en células normales y transformadas. De forma recíproca, no se detectó ciclina D1 ni en precipitados anti-CDK2 ni en precipitados anti-CDK4 derivados de células VA13 transformadas. También se obtuvieron los mismos resultados de cada una de los demás pares de líneas celulares, HSF43 y CT10.
(ii) Transposición de la subunidad de los complejos de ciclina A y B en células transformadas
Se examinó la composición de la subunidad de los complejos de ciclina A en células WI38 no transformadas y en células VA13 transformadas de SV40. Tal como se ha descrito anteriormente, la ciclina A se asocia con las células p36^{PCNA}, p33^{CDC2}, p33^{CDK2}, y p21 en células WI38. En células VA13 transformadas de SV40, el nivel tanto de la propia ciclina A como de la ciclina A asociada al CDC2/CDK2 aumentó en aproximadamente tres veces. De forma recíproca, el nivel de ciclina A asociada al CDC2 y CDK2 también incrementó de dos a tres veces.
El nivel de ciclina A asociada al p21, tal como se determinó por inmunoprecipitación de los lisados de células marcadas con metionina [S^{35}], se redujo en las células de VA13 en comparación con las células WI38. También está presente un nivel menor de p21 en los inmunoprecipitados preparados a partir de células VA13 utilizando antisueros frente a la CDK2, el mayor acompañante catalítico de la ciclina A. De forma consistente, se obtuvieron los mismos resultados utilizando células HSF43 y CT10, además de células normales IMR-90 respecto a sus células IDH T-transformadas, y a las líneas celulares de pares CV-1/COS-1.
Se observó un número de otros polipéptidos en los precipitados de ciclina A que son específicos de células no transformadas o de células transformadas. Por ejemplo, se observa una proteína con una masa molecular de 42 kD como una banda predominante en células WI38 o HSF43 no transformadas pero no en células VA13 o CT10 transformadas. A la inversa, un polipéptido de 95 kD, que puede corresponder al antígeno T, se observa sólo en células transformadas, como es un polipéptido de 19 kd (se discute a continuación).
También se examinó la composición de la subunidad de los complejos de ciclina B1 en células normales y transformadas. En común con la ciclina D1, el complejo cuaternario de ciclina B1/CDK/p21/PCNA se alteró tanto en células SV-40 transformadas como en células CT10 T-transformadas en comparación con células WI38 y HSF43 no transformadas. De este modo, ni el PCNA ni la p21 se asocian con la ciclina B/CDK en las células transformadas. Sin embargo, tal como se ha anticipado, el CDC2 está asociado con la ciclina B1 (p62) en las células VA13, CT10, 293 y HeLa.
(iii) Complejos de Ciclina y de CDK en otras células transformadas de virus de tumor de DNA
Para investigar si los complejos de ciclina-CDK son también alterados en otras células de tumores humanos, se examinaron células HeLa de carcinoma de cervix conteniendo virus del papilloma y células de riñón 293 primarias transformadas por adenovirus para determinar la composición de la subunidad de varios complejos de ciclina y CDK. Estas dos líneas celulares han sido ampliamente utilizadas en estudios bioquímicos del ciclo celular de mamífero. La ciclina D1 se expresa a un nivel bajo en las células HeLa y es escasamente detectable en células 293. Sin embargo, puede ser investigada la composición de la subunidad de otros complejos ciclina/CDK. La bien establecida asociación de CDC2-ciclina B1, CDC2-ciclina A, y CDK2-ciclina A fue toda fácilmente detectada tanto en células HeLa como en células 293. Sin embargo, no se observó ningún p21 en los inmunoprecipitados anti-CDC2, anti-CDK2, anti-ciclina A, o anti-ciclina B1 tanto de las células HeLa como de las células 293. De este modo, los complejos cuaternarios de la ciclina A/CDK/p21/PCNA y ciclina B1/CDK/p21/PCNA ni están unidos ni están presentes a niveles extremadamente bajos en estas células transformadas de virus de tumor de DNA. De hecho, apareció un nuevo complejo de ciclina A, en el que la p21 parece estar sustituido por un polipéptido de 19 kD. Un polipéptido similar de 19 kD está presente en los precipitados de anti-ciclina A partir de las células VA13 humanas transformadas de SV40, CT10, IDH4, e incluso en células COS-1 de mono. Además, en las células 293 y HeLa, la composición de la subunidad de CDK4 es idéntica a la de las células transformadas de antígeno T. La ciclina D1 no está asociada con la CDK4 (atribuible de forma trivial a la ausencia de ciclina D de la célula), pero también están ausentes el PCNA y la p21. La p21 ha sido sustituida por la p16 en células HeLa y en células 293. De forma interesante, la p16 asociada a la CDK4 es detectado a niveles muy bajos en células WI38 o HSF43 no transformadas. La representación de la rotura proteolítica en cada caso reveló que la p16 asociada a la CDK4 de células HeLa, 293, VA13 y WI38 es idéntica, pero diferente de la p21. La presencia de p19 y p16 en células transformadas por tres virus diferentes y de p16 en células no transformadas indica que no son proteínas codificadas viralmente.
(iv) Alteración de la ciclina y de los complejos CDK en células Li-Fraumeni
Los fibroblastos de pacientes Li-Fraumeni familiares mostraron un porcentaje elevado de anormalidades espontáneas, incluyendo aneuploidía e inmortalización (Li y col., J. Natl. Cancer Inst. 43:1365-1373 (1969); y Bischoff y col., Cancer Res 50:7979-7984 (1990)). Estas células no contienen ningún virus conocido; en su lugar, la única alteración de la línea germinal descrita son las mutaciones heterozigóticas de base única del gen p53 supresor del tumor. El escape del envejecimiento y la inmortalización espontánea de los fibroblastos Li-Fraumeni durante el paso continuo in vitro está asociado con la pérdida secundaria del alelo p53 de tipo salvaje. Los lisados de células marcadas con metionina S^{35} de una línea celular Li-Fraumeni inmortalizada de forma espontánea, LCS041 (paso > 170) fueron inmunoprecipitados con una variedad de anticuerpos y analizados por SDS-PAGE. El nivel de la mayor parte de estas proteínas en las células LCS041 es similar al de los fibroblastos diploides normales tal como se determinó por marcaje metabólico e inmunotransferencia de manchas, excepto que la ciclina A se expresó como un nivel mucho menor en comparación con fibroblastos normales. La composición de la subunidad de ciclina y de los complejos CDK es claramente anormal en células LCS041. Los complejos de ciclina B1-CDC2 existen, como en las células HeLa y 293, y no está asociado con la p21 o PCNA. La asociación de ciclina D1-CDK4 es reducida hasta un nivel escasamente detectable en las células LCS041, y tanto el PCNA como la p21 están ausentes. No se detectó p21 en ninguno de los complejos ciclina-CDK investigados en las células LCS041 y no pareció estar sustituido por proteínas p16 o p19 tal como sucede en los fibroblastos transformados de antígeno T. El nivel de PCNA asociado con los complejos de ciclina-CDK se ve también reducido de forma dramática en cada caso. La inmunotransferencia de mancha directa demostró que la abundancia de PCNA es mayor en las células LCS041, en comparación con los fibroblastos normales, pero el PCNA es reducido de forma dramática o enteramente ausente de los inmunocomplejos aislados con anti- CDC2, CDK2, CDK4, ciclina A, ciclina B1 y ciclina D1. También se obtuvieron resultados esencialmente idénticos por uso de otra línea celular Li-Fraumeni, LCS087.
III. Clonación de p16 y del inhibidor de la CDK4
Se utilizó el sistema de selección de dos heterocigotos (híbridos) (Fields y col., Nature 340:254 (1989) para investigar las proteínas que pudieran interaccionar con la CDK4 humana, y más específicamente, para aislar un cDNA que codifique la p16. La selección de dos heterozigotos se basa en la reconstitución de un activador GAL4 funcional a partir de dos proteínas de fusión separadas: el domino de unión al DNA GAL4 fusionado a CDK4, GAL4db-CDK4; y el dominio de activación GAL4 fusionado a las proteínas codificadas por cDNAs de HeLa, GAL4ad-cDNA, Se utilizó la YPB2 como la levadura recipiente ya que ésta es una cepa que contiene dos genes cromosómicos bajo el control de dos promotores dependientes del GAL4 diferentes: HIS3 y LacZ. El YPB2 se transformó con una mezcla de dos plásmidos que codifican, de forma respectiva, las fusiones GAL4db-CDK4 y la GAL4ad-cDNA; se obtuvieron varios clones que crecieron en ausencia de histidina y que se volvieron azul en presencia de \beta-gal. A partir de los datos de la secuencia de DNA se determinó que cada uno de los clones positivos derivaba del mismo gen, aunque un grupo representaba mRNAs con un final 3' más corto. La secuencia de estos cDNAs contuvo, en fase con el GAL4ad, una configuración de lectura abierta que codifica una proteína de 148 amino ácidos con un peso molecular predicho de 15.845 daltons (ver SEC ID Nos. 3 y 4). Esta proteína es referida de aquí en adelante como INK4 (inhibidor de CDK4; ver a continuación). La secuencia de p16INK4 se comparó por métodos estándar con la presentada en los bancos de datos actualmente disponibles y no se encontraron homologías significativas.
Para analizar si la p16INK4 se uniría de forma específica al CDK4, el YPB2 se cotransformó con la fusión GAL4ad-p16INK4 así como con varias construcciones de fusión de GAL4db objetivo conteniendo, respectivamente, cdc2, CDK2, CDK4, CDK5, PCNA y Snfl (una quinasa de una levadura de fisión). Las células transformadas fueron colocadas en placas con y sin histidina. Sólo la fusión GAL4db-CDK4 interaccionó con el GAL4ad-p16INK4 hasta una extensión que permitió el crecimiento en ausencia de histidina, indicando que este par de proteínas de fusión reconstituye de forma específica un activados GAL4 funcional capaz de incrementar la expresión del gen HIS3. Se obtuvo el mismo resultado cuando se ensayo la capacidad de transactivar la expresión del gen \beta-galactosidasa.
La especificidad de esta interacción se demostró de forma adicional en un sistema libre de células, por mezcla in vitro de las CDKs marcadas con (S^{35}) traducidas con una proteína de fusión producida bacterialmente purificada que consiste en la transferasa de la glutationa-S (GST) unida al p16INK4 (17). La fusión GST-p16INK4 fue recuperada por unión de gránulos de glutationa-sefarosa y la asociación de cada CDK se analizó por electroforesis en gel. De forma consistente con las observaciones previas, el GST-p16INK4 se une de forma mucho más eficiente al CDK4 que al cdc2, CDK2 o CDK5.
Debido a que el peso molecular predicho del p16INK4 está próximo a 16 Kd, se determinó la identidad del p16INK4 así como la de la proteína p16 asociada al CDK4 encontrada en líneas celulares transformadas (ver anteriormente). Se obtuvieron dos productos de traducción in vitro de 15 KD y 17 KD a partir del p16INK4 cDNA. Estos productos, así como la proteína p16 asociada al CDK4 a partir de las células HeLa se trató con N-clorosuccinimida. El modelo NCS proteolítico parcial de la proteína p16 asociada a la CDK4 a partir de las células HeLa, sugiere de forma rotunda que la p16INK4 cDNA realmente corresponde al p16. La digestión parcial con proteasa V8 del producto de 17 KD derivado de cDNAINK4 y p16 también dio lugar a modelos similares. Es interesante señalar que la proteína p16INK4 sobreexpresada en células de insectos tiene una movilidad electroforética de 15 KD, y su representación proteolítica de NCS es idéntica a la obtenida con el producto derivado del cDNA de 15 KD. Esto sugiere que la p16INK4 existente encontrado en células humanas y el producto de traducción in vitro de 17 KD corresponde a las proteínas modificadas después de la traducción. El hecho de que la proteína p16INK4 sobreexpresada en células de insectos interaccione con CDK4 sugiere que esta modificación no es esencial para la interacción (ver a continuación).
La identidad entre la p16INK4 y la proteína p16 asociada al CDK4 se confirmó de forma adicional utilizando anticuerpos aumentados frente a la proteína de fusión GST- p16INK4 purificada. Se utilizaron varias líneas de células humanas para este experimento: una línea celular normal WI38, derivada de fibroblastos de pulmón normales; la línea celular VA13 derivada de WI38 por transformación con el antígeno T de SV40; y las células HeLa. Tal como se ha establecido anteriormente, los inmunoprecipitados anti-CDK4 de WI38 revelaron la asociación de CDK4 con ciclina D1, PCNA, p21 y p16. Por el contrario, en las células VA13 y HeLa la CDK4 sólo está asociado con p16. Los inmunoprecipitados anti-p16INK4 contuvieron una proteína con un peso molecular aparente de 16 KD que fue fácilmente detectable en las dos líneas celulares transformadas, VA13 y HeLa pero hasta una menor extensión en la línea celular normal WI38. La proteína no sólo tuvo la misma mobilidad electroforética que la proteína p16 coinmunoprecipitada con el suero anti CDK4, sino que también tuvo un modelo proteolítico parcial de NCS idéntico. Además de la p16INK4 se observó una proteína de 33 Kd en los coinmunoprecipitados anti-p16 que se demostró que era idéntica al CDK4 por representación proteolítica del V8.
El análisis Northern de los transcritos en las células WI38 y VA13 indicó que la p16INK4 mRNA era aproximadamente muchas veces menos abundante en las células WI38 en comparación con las células VA13. Esta diferencia corresponde aproximadamente a la diferencia observada en la cantidad de proteína p16 entre las dos líneas celulares, sugiriendo la posibilidad de que la expresión p16INK4 pueda estar regulada a un nivel transcripcional o post- transcripcional. En efecto, en tres líneas celulares transformadas viralmente no pudo detectarse la expresión del p16INK4 incluso después de la sobreexposición al gel.
Para estudiar las consecuencias bioquímicas de la interacción del p16INK4 con la CDK4, se han reconstituido in vitro los complejos activos CDK4-ciclina D por protocolos estándar (Kato y col., Genes Der 7:331 (1993); y Ewen y col., Cell 73:487 (1993)). Los tres componentes relevantes, CDK4, p16INK4 y ciclina D1, se expresaron en células de insectos infectadas con baculovirus. Los extractos se prepararon a partir de células de insectos marcadas con (S35) de forma metabólica que sobreexpresaron separadamente p16INK4, CDK4 o ciclina D1, así como a partir de células que sobreexpresaron tanto la CDK4 como la ciclina D1. En respuesta a cantidades incrementadas de p16INK4, se observaron correspondientes disminuciones en la capacidad de la CDK4 para el fosforilato de Rb. Esta inhibición correlacionada con la asociación entre p16INK4 y CDK4 se detectó por inmunoprecipitación. No se observó ninguna inhibición cuando los complejos de CDK2-ciclina D2 se utilizaron en un ensayo similar. Para confirmar que la inhibición de la CDK4 fue debida al p16INK4, se creó una proteína de fusión p16INK4 marcada en la His (His-p16INK4) para tener una extensión amino terminal de 20 amino ácidos conteniendo una región de 6 residuos de histidina. Esta proteína de fusión fue sobreexpresada en células de insecto infectadas por baculovirus, y se purificó por virtud de la asociación de elevada afinidad de la región de histidina por los granos de níquel-agarosa. La preparación de proteína His-p16INK4 mostró ser > 90% pura, e inhibió la actividad del complejoCDK4-ciclina D1 bajo condiciones similares a las utilizadas para la inhibición por los lisatos completos.
IV Usos de la invención
En base al trabajo descrito en el presente documento, es posible detectar complejos alterados de ciclinas CDK, PCNA, p21, p19 y p16 en células obtenidas a partir de un tejido o una muestra biológica, tal como sangre, orina, heces, moco, saliva, o biopsis (incluyendo preparaciones citológicas). Esto tiene potencial para uso para objetivos de diagnóstico y pronóstico ya que, por ejemplo, hay una aparente relación entre la alteración de una composición de una subunidad de composición de complejos y la transformación celular o la proliferación de células anormal. Los métodos de diagnóstico y terapéuticos descritos en el presente documento pueden ser utilizados para valorar un estado de enfermedad individual o una probabilidad de desarrollar una condición asociada con o indicada de otra forma por tales transposiciones de las subunidades de complejos, y para monitorizar la efectividad de la terapia (por valoración del efecto de un fármaco o fármacos en la transposición de la subunidad).
Por ejemplo, puede desarrollarse un agente que reconozca las interacciones entre los CDKs, las ciclinas, el PCNA y los polipéptidos de bajo peso molecular (tales como la p21, p19 y p16). A continuación el agente puede ser puesto en contacto con la muestra de células para la que se analiza el estado de transformación; la presencia de subunidades particulares en un complejo será indicativa de transformación. Por ejemplo, un complejo de CDK4-p16 será indicativo de transformación, así como un complejo de ciclina A-p19. De forma alternativa, los agentes reconocerán que pueden ser utilizadas diferentes subunidades a la vez, para determinar la presencia de interacciones entre las subunidades. Por ejemplo, un agente que reconozca la p21, puede ser utilizado conjuntamente con un agente que reconozca una ciclina o una ciclina quinasa, para determinar si la p21 es complejada con tanto la ciclina como la ciclina quinasa.
Pueden producirse anticuerpos específicamente reactivos con compuestos de los complejos cuaternarios, utilizando métodos conocidos, para ser utilizados como agentes en estos métodos. Por ejemplo, pueden producirse antisueros por inyección de un huésped apropiado (por ej., conejos, ratones, ratas, cerdos) con la ciclina de tipo D contra la que se desea los anti sueros y la salida de la sangre de animal huésped el tiempo suficiente para que se hayan formado los anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos utilizando técnicas conocidas. J. Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); E. Hallow y D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1988). También pueden producirse los anticuerpos específicamente reactivos con CDK5, CDK4 y otras CDKs en general, p21, p19, p16 y ciclinas, utilizando métodos conocidos.
En una realización ilustrativa, los anticuerpos son elevados contra el complejo CDK4/p16. Para facilitar la producción de dichos complejos en forma inmunogénica, puede generarse el complejo CDK4/p16 por reticulado químico. En otra realización, se genera una proteína de fusión CDK4/p16 utilizando tecnología de anticuerpo de cadena única para introducir una región de unión de tipo polipéptido no estructurado entre las secuencias de polipéptido derivadas de cada una de las proteínas. Este agente de unión puede facilitar la flexibilidad incrementada de la proteína de fusión permitiendo a cada subunidad interaccionar libremente con la otra, reducir el impedimento estérico entre los dos fragmentos, así como dejar que se produzca un plegado apropiado de cada fragmento. El agente de unión puede ser de origen natural, tal como una secuencia determinada para existir en una espiral al azar entre dos dominios de una proteína. De forma alternativa, el agente de unión puede ser de origen sintético. Por ejemplo, la secuencia (Gly_{4}Ser)_{3} puede ser utilizada como un agente no estructurado sintético. Los agentes de unión de este tipo están descritos en Huston y col., (1988) PNAS 85:4879; y en la patente U.S. No. 5.091.513. De este modo, los complejos inmunogénicos permiten que se genere el complejo CDK4/p16, y subsecuentemente que los anticuerpos aislados reconozcan el complejo pero no las subunidades aisladas.
En otra realización todavía preferida, la presente invención contempla de forma particular los ensayos y los equipos (kits) para detectar niveles p16 en células. Pueden utilizarse anticuerpos específicos para p16 (tal como se describe en la presente invención), o sondas de ácidos nucleicos dirigidas a la detección de niveles de mRNA de transcritos p16, para detectar células transformadas. Tal como se ha descrito anteriormente, el nivel de p16 mRNA, y presumiblemente de la proteína p16, es elevado en células transformadas en relación con las células normales. De este modo, la detección del nivel de la expresión del gen p16 es útil como diagnóstico en la determinación de la presencia de células transformadas. En una realización ilustrativa, los ensayos de hibridación in situ pueden ser llevados a cabo utilizando sondas de ácido nucleico dirigidas a las secuencias de p16 y generadas por protocolos estándar (ver, por ejemplo, La patente de Taub y col., US No. 4.820.630; Falkow y col., Patente U.S. No. 4.358.935; y la patente de Bresser y col., U.S. No. 5.225.326).
Un ensayo preferido de la presente invención permite averiguar las diferencias cuantitativas en los niveles de p16 entre transformados con un caracterizado por los complejos p16/CDK4, y células no transformadas. De forma breve, las células, tanto las suspensiones de células únicamente como los cortes de tejido pueden ser depositados en soportes sólidos tales como portaobjetos de vidrio. De forma alternativa, las células se colocaron en una suspensión sólo de células de aproximadamente 10^{5}-10^{6} células por ml: Las células se fijaron por selección de un fijador que proporciona la mejor resolución espacial de las células y la eficiencia de hibridación óptima cuando se utilizan sondas de ácido nucleico, o la afinidad de unión y la especificidad óptimas cuando se utiliza anti-p16 Abs.
En el ejemplo de las sondas de ácido nucleico, la hibridación puede ser llevada acabo en la misma solución que efectúa la fijación. Esta solución contiene tanto un fijador como un agente caotrópico tal como la formamida. También se incluye en esta solución un agente estabilizante hídrido tal como el cloruro de litio concentrado o una solución de acetato amónico, un tampón, DNA de bajo peso molecular y/o RNA de ribosoma (con un de tamaño 50 bases) para disminuir la unión no específica, y un agente formador de poro para facilitar la entrada de la sonda en las células. Los inhibidores de nucleasa tales como los complejos de vanadil ribonucleósido también pueden ser incluidos.
Se añade a la solución de hibridación la sonda de p16, para hibridar con un polinucleótido objetivo. La sonda más preferible es una sonda anti-sentido con una única espiral. Para la hibridación del mRNA celular, se utiliza una sonda de aproximadamente entre 75 y 150 bases de longitud. La solución de hibridación conteniendo la sonda es añadida en una cantidad suficiente para cubrir las células cuando se utilizan células inmobilizadas. A continuación se incuban las células a una temperatura óptima.
Las sondas pueden ser marcadas de forma detectable antes de la reacción de hibridación. De forma alternativa, puede seleccionarse un marcador detectable que se una al producto de hibridación. Las sondas pueden ser marcadas con cualquier grupo detectable para su uso en la práctica de la invención. Dicho grupo detectable puede ser cualquier material que tenga una propiedad física o química detectable. Dichos marcadores detectables han sido bien desarrollados en el campo de los inmunoensayos y en general cualquiera de la mayoría de los marcadores útiles en dichos métodos puede ser aplicado a la presente invención. Son particularmente útiles los grupos enzimáticamente activos, tales como enzimas (ver Clin. Chem., 22:1243 (1976), substratos de enzimas (ver patente GB 1.548.741), coenzimas (ver patentes U.S. Nos. 4.230.797 y 4.238.565) e inhibidores de enzimas (ver patente U.S. No. 4.134.792); marcadores fluorescentes (ver Clin. Chem., 25:353 (1979); cromóforos; compuestos luminescentes tales como los marcadores quimioluminescentes y bioluminescentes (ver Clin. Chem., 25:512 (1979)); específicamente ligandes que pueden formar uniones; pares interaccionantes próximos; y radioisótopos tales como ^{3}H, ^{35}S, ^{32}P, ^{125}I y ^{14}C.
De forma similar, los anticuerpos anti-p16 pueden ser marcados y utilizados para detectar la presencia de la proteína p16 en muestras de células.
La presente invención también incluye un método de selección de compuestos o moléculas por su capacidad de inhibir o suprimir la transformación de una célula. Se pone en contacto con las células un compuesto o molécula del que se vaya a valorar su capacidad para inhibir la transformación, bajo condiciones apropiadas para la entrada del compuesto o molécula en las células. La transformación de la célula dará lugar al transposición selectivo de subunidades en los complejos de ciclina. La comparación de la proporción o extensión de la transposición en presencia del compuesto o molécula a valorar con la de un control apropiado (por ej., el mismo tipo de células sin añadir el fármaco de ensayo) demostrará la capacidad o incapacidad del compuesto o molécula de inhibir la transposición de la subunidad. Los fármacos que inhiben la transposición de la subunidad son también sujeto de esta invención.
Por ejemplo, la formación del complejo de la proteína quinasa-ciclina de tipo D puede ser evitado de una forma directa por, por ejemplo, introduciendo en las células un fármaco u otro agente que una la proteína quinasa o la ciclina de tipo D o que de otra forma interfiera con la asociación física entre la ciclina y la proteína quinasa, éste activa (por ej., por intercalación) o rompe la actividad catalítica de la enzima. Esto puede ser efectuado por medio de anticuerpos que unen la quinasa o la ciclina o un péptido o compuesto orgánico de bajo peso molecular, del tipo de la ciclina de tipo D endógena, que se une a la proteína quinasa, pero cuya unión no da lugar a la activación de la enzima o da lugar a su inhabilitación o degradación. Los péptidos y compuestos orgánicos pequeños a utilizar para este objetivo pueden ser diseñados, en base al análisis de las secuencias de amino ácidos de las ciclinas de tipo D, para incluir residuos necesarios para enlazar y excluir residuos cuya presencia produce activación. Esto puede ser realizado, por ejemplo, por representación sistemática del sitio(s) de unión y diseño de moléculas que reconozcan o de otro modo se asocien con el sitio(s) necesario para la activación, pero no causen activación. Tal como se ha descrito en el presente documento, hay una expresión diferencial en los tejidos de las ciclinas de tipo D, así como los complejos formados con las CDKs. De este modo, es posible disminuir de forma selectiva la capacidad mitótica de las células por el uso de un agente (por ej. un anticuerpo o anti-sentido u otra molécula de ácido nucleico) que esté diseñada para interferir con (inhibir) la actividad y/o nivel de un complejo que comprenda una ciclina de tipo D y un CDK particular. Por ejemplo, en el tratamiento de tumores que involucran el sistema nervioso central u otros tejidos no-hematopoiéticos, puede esperarse que los agentes que inhiben de forma selectiva la ciclina D1 sea particularmente útiles, ya que el D1 ha mostrado ser expresado de forma diferencial (expresado a niveles particularmente altos en células de origen neural).
La formación de los complejos de ciclina de tipo D, CDK, PCNA y p21 también puede ser evitada de un modo similar al descrito anteriormente para la inhibición de la formación del complejo CDK/ciclina de tipo D. Es decir, la formación del complejo puede ser evitada directamente (por ej. por medio de un fármaco o agente que una un componente del complejo o que de otra forma interfiera con la asociación física de los componentes del complejo. La formación del complejo también puede ser evitada de un modo indirecto, tal como por prevención de la transcripción y/o traducción de DNA y/o RNA que codifica un componente del complejo, de un modo similar al descrito anteriormente para el bloque de la formación del complejo ciclina de tipo D-proteína quinasa. De forma alternativa, la formación del complejo puede ser evitada de forma indirecta por degradación de uno o más de sus constituyentes.
Por ejemplo, puede utilizarse un fármaco que inhibe de forma selectiva la capacidad de la ciclina D2 o de la ciclina D3 para formar un complejo cuaternario. Cada uno de los demás constituyentes del complejo es también un objetivo cuya función o disponibilidad para la formación del complejo puede ser alterada. Por ejemplo, la CDK2, CDK4, CDK5 y otras quinasas dependientes de la ciclina que forman complejos con la ciclina de tipo D pueden ser inhibidas o incrementadas, tanto en términos de su funcionamiento o de su disponibilidad para la incorporación en el complejo cuaternario. Los fármacos o agentes que alteran el funcionamiento o la disponibilidad del PCNA, o que alteran el funcionamiento o la disponibilidad de la p21, o el funcionamiento o la disponibilidad del p16 también pueden ser utilizados para inhibir o incrementar la división celular. En el caso de cada constituyente complejo cuaternario, es posible introducir en las células un agente, tal como un péptido pequeño u otra molécula orgánica, que mimetice el constituyente del complejo en términos de unión pero faltando su región(es) activa(s), con lo que se produce la formación de complejos faltos de la actividad o las interacciones del complejo producido normalmente.
La inhibición directa de la formación del complejo también puede ser no específica (es decir, puede afectar la mayoría de las células o todas las células en las que se forme el complejo cuaternario que contiene la ciclina de tipo D). Esto puede ser llevado a cabo, por ejemplo, por introducción en las células de un fármaco que inhibe el funcionamiento o la capacidad de un componente común del complejo cuaternario (por ej., el PCNA) o por introducción de una mezcla o cóctel de fármacos, que juntos inhiben todas las ciclinas de tipo D.
De forma alternativa, es posible la inhibición indirecta del complejo cuaternario. Es decir, puede utilizarse un fármaco o agente que actúa para producir menos de un constituyente del complejo disponible (por ej., ciclina de tipo D, CDK, PCNA o p21). Tales fármacos o agentes incluyen los que, como los oligonucleótidos anti-sentido, que bloquean la transcripción o traducción y los que, como una enzima, que degradan los constituyentes del complejo, tanto antes como después de su incorporación en un complejo cuaternario.
Los fármacos o agentes útiles en el presente método para alterar, particularmente inhibir, el inicio de ciclo celular y, de este modo, la división celular, pueden ser compuestos o moléculas existentes (por ej., pequeñas moléculas orgánicas, oligonucleótidos anti-sentido, y sustancias inorgánicas) o materiales diseñados para uso en el método presente. En cualquier caso, dichos fármacos pueden ser identificados por el método de la presente invención.
En una realización particular de la presente invención, los ensayos para eliminar la interacción pueden ser utilizados para identificar agentes capaces de romperlas formaciones de complejos con ciclinas, en particular ciclinas de tipo D, así como complejos p16/CDK4. Por ejemplo, pueden utilizarse en dichos ensayos dos ensayos de híbridos descritos anteriormente. En una realización ilustrativa, se utiliza la construcción de la fusión del activador GAL4, tal como se describe en el presente documento, conteniendo la CDK4 y p16 para medir la capacidad de un agente candidato para romper la formación de los complejos CDK4/p16. Las células transfectadas con cada una de las construcciones se ponen en contacto con un agente candidato, y se detecta el nivel de expresión de un gen informador (tal como la \beta-galactosidasa, tal como anteriormente). Una disminución en la expresión puede ser indicativa de un inhibidor del complejo.
Además, puede preformarse un ensayo de tres híbridos para detectar inhibidores de CDK4/p16 que no inhiban los complejos de CDK/ciclina. Por ejemplo, pueden generarse construcciones en las que cada p16 y cada ciclina de tipo D puedan ser parte de las proteínas de fusión que constituyen los dominios de la unión del DNA de proteínas discontinuas que reconocen las diferentes secuencias de DNA. A continuación se genera la CDK4 como proteína de fusión con un dominio activante, tal como su interacción con la proteína de fusión p16 da lugar a la expresión de un gen informador, mientras que su interacción con la proteína de fusión de la ciclina D conduce la expresión de un gen de luciferasa, mientras que la construcción de la ciclina D proporciona expresión a un marcador resistente al fármaco. De este modo, en presencia de un agente que inhibe las interacciones p16/CDK4, la expresión del marcador resistente al fármaco indica que los complejos de ciclina D/CDK4 no están rotos.
Además, dada la capacidad inhibitoria del p16, la presente invención contempla además el uso de dicho conocimiento para generar análogos peptidomiméticos de partes particulares del p16, que pueden ser utilizadas como agentes anti-proliferativos. Las interacciones de la unión de la CDK4 con p16 pueden ser fácilmente averiguadas, tal como por uso de mutagénesis y del ensayo de eliminación de la interacción anteriormente descrito. De un modo similar, los fragmentos de péptido derivados del p16 pueden ser ensayados para determinar su capacidad de romper los complejos CDK4/ciclina tal como se ha descrito anteriormente.
Una vez se ha identificado un fármaco apropiado o agente, éste puede ser administrado a un individuo, particularmente a un humano u otro vertebrado, por cualquier ruta efectiva de introducir el fármaco o el agente en las células en cantidad suficiente para tener el efecto deseado (es decir, alteración de la división celular). Por ejemplo, un fármaco seleccionado puede ser administrado de forma intravenosa, intramuscular, por inyección directa en el tumor, vía el aparato gastrointestinal (por ej., de forma oral), intraperitonealmente o intranasalmente. En algunos casos, es apropiada la administración ex vivo (por ej., en los casos en los que se elimina del cuerpo sangre o tuétano de los huesos, se trata y se retorna al cuerpo).
De forma general, el fármaco o agente utilizado para alterar la división celular se incluirá en una formación que también puede incluir un soporte fisiológico (por ej., un tampón o solución salina fisiológica), estabilizantes, un adyuvante, y agentes aromatizantes. La cantidad de fármaco a administrar puede ser determinada empíricamente y variará dependiendo de consideraciones tales como la edad, el peso y la altura del que lo reciba y de la severidad del estado a tratar.
Los anticuerpos específicamente reactivos con ciclinas de tipo D de la presente invención también pueden producirse, utilizando métodos conocidos. Por ejemplo, los antisueros anti-ciclina de tipo D pueden ser producidos por inyección de un huésped apropiado (por ej., conejos, ratones, ratas, cerdos) con la ciclina de tipo D contra cuyos anti sueros se desea y sacar sangre del animal huésped después de suficiente tiempo para que se hayan formado los anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales también pueden ser producidos utilizando técnicas conocidas. J. Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989); E. Hallow y D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1988). Los anticuerpos específicamente reactivos con CDK5 también pueden ser producidos utilizando métodos conocidos.
La presente invención también incluye un método de selección de compuestos o moléculas para determinar su capacidad para inhibir o suprimir el funcionamiento de una ciclina, particularmente una ciclina de tipo D. Por ejemplo, pueden utilizarse las células mutantes tal como se describen en el presente documento, en las que se expresa una ciclina de tipo D tal como la D1 o la D3. Se pone en contacto con las células un compuesto o molécula de la que se vaya a valorar su capacidad para inhibir una ciclina de tipo D, bajo condiciones apropiadas para la entrada del compuesto o molécula en las células. La inhibición de la ciclina dará lugar a la detención de las células o a una proporción de división celular reducida. La comparación de la proporción o extensión de la división celular en presencia del compuesto o molécula a valorar con la división celular de un control apropiado (por ej., el mismo tipo de células sin fármaco de ensayo añadido) demostrará la capacidad o incapacidad del compuesto o molécula para inhibir la ciclina. Los compuestos o moléculas existentes (por ej., las presentes en un caldo de fermentación o una "biblioteca" química) o los desarrollados para inhibir la activación de la ciclina o su proteína quinasa pueden ser seleccionados de acuerdo con su efectividad utilizando este método. Los fármacos que inhiben la ciclina de tipo D también son sujeto de esta invención.
La presente invención también incluye un método de selección de compuestos o moléculas por su capacidad para alterar la formación del complejo cuaternario descrito en el presente documento. Este método se lleva a cabo de más o menos el mismo modo que el método, descrito anteriormente, para la identificación de compuestos o moléculas que inhiben una ciclina de tipo D. En el método sujeto, se combinan el compuesto o la molécula a ensayar con las células en las que se forma el complejo que contiene la ciclina de tipo D, bajo condiciones apropiadas para que se produzca la formación del complejo y la entrada en las células del compuesto o molécula a ensayar. La formación del complejo puede ser determinada, tal como se ha descrito en el presente documento. La inhibición de un constituyente del complejo o de la formación del complejo producirá la detención de las células o un porcentaje reducido de división celular. La comparación del porcentaje o la extensión en ausencia del compuesto o molécula demostrará si éste tiene un efecto sobre la división celular (es decir, la división hasta una extensión menor en presencia del compuesto o molécula ensayada que en su ausencia es una indicación de que el compuesto o la molécula es un inhibidor). Los fármacos o agentes que inhiben la formación del complejo y, como resultado, de la división celular, también son el sujeto de esta invención.
La presente invención se ilustrará a continuación por los siguientes ejemplos, que no se pretende que la limiten de ningún modo.
Ejemplo 1 Demostración de que las Ciclinas de tipo D se asocian con proteína quinasas multiples y la replicación del DNA y el factor de reparación PCNA (i) Procedimientos experimentales Células
Se obtuvieron células WI38 de fibroblastos de pulmón diploide humano de la American Type Culture Collection de la sección 13 y se hicieron crecer en un medio Dulbecco-Modified Eagle suplementado con suero de bovino fetal al 10% y se utilizaron entre las secciones 16-22. Se cultivaron células 293 de forma similar.
Anticuerpos
Para aumentar el anticuerpo de la anti-ciclina D1, se subclonó un fragmento de restricción del DNA de 609 bp que codifica 202 residuos de amino ácidos (25 kDa) de la región amino-terminal de la ciclina D1 humana (el fragmento NCoI de los nucleótidos 143 a 751 en la Figura 2 de Xiong y col., Cell 65:691-699 (1991 y Current Biology 1:362-364 (1991)) en un vector de expresión fago T7, pET-3d (Studier y col., Methods en Enzymology, 185:60-89 (1990)) y se introdujo en una cepa de E. Coli BL21 (DE3). Se prepararon los extractos bacteriales en el tampón de lisis (150 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5 y 10% de glicerol) por rotura de las células con sonicación y clarificación del sobrenadante por centrifugación a 20.000 g durante 10 minutos. Los pellets (gránulos) conteniendo la proteína de la ciclina D insoluble se suspendieron de nuevo en el tampón de lisis suplementado con urea 8 M, después de 30 minutos de vibración a temperatura ambiente, se centrifugó de nuevo a 20.000 g durante 10 minutos. Los pellets conteniendo la proteína de la ciclina D insoluble se suspendieron de nuevo en una muestra de tampón SDS y se separaron sobre en gel SDS-poliacrilamida al 10%. Se visualizó la proteína de la ciclina D de 25 kDa y se cortó después del teñido del gel con KCl 0,25 M en la habitación fría. Los cortes del gel fueron además exprimidos por el paso repetido a través de una aguja de calibre 18 y se extrajo la proteína de la ciclina D por incubación de las partículas de gel exprimidas con PBS conteniendo un 0,1% de SDS a 42ºC durante varias horas y se utilizaron para la inyección de conejos. Para purificar la afinidad de las inmunoglobulinas de la anti-ciclina D1, se reticularon las proteínas p25 producidas de forma bacteriológica con el Reacti-Gel (6X) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se lavó la columna de afinidad con un volumen en exceso de PBS conteniendo el 0,05% de Tween-20 antes y después de que se aplicara el suero crudo a la columna. Se eluyeron las inmunoglobulinas unidas con Glicina-NaCl (pH 2,5) en Tris-HCl 1,5 M, pH 8,5 para neutralizar los anticuerpos de forma instantánea. Para reducir el alto ruido de fondo causado por las proteínas de la inmunoglobulina, se reticuló la anti-ciclina D1 purificada a los granos de agarosa proteína A de acuerdo con Harlow y Lane, Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1988). En las manchas Western, el antisuero de la anti-ciclina D1 reacciona de forma cruzada débilmente con la ciclina D2 humana producida de forma bacteriológica, muy escasamente con la ciclina D3 humana producida de forma bacteriológica y detecta una banda única de los lisados de las células WI38 totales. En las inmunoprecipitaciones con el tampón RIPA (0,1% SDS), desaparece más del 90% del p36, p33, p31 y p21 asociado a ciclina D1 mientras que la cantidad de ciclina D1 que queda es la misma que en las inmunoprecipitaciones con los tampones NP40 (0,5%).
Para la producción del anticuerpo anti-CDK5, se sintetizó un péptido CYFSDFCPP, con los residuos amino ácidos subrayados correspondientes a la región carboxi-terminal de CDK5. El péptido se acopló a la hemocianina de lapa con entalla en forma de bocallave o de U (Pierce) que a continuación se utilizó para inmunizar conejos por protocolos estándar (Gree y col., Cell 28:477-487 (1982)).
El anticuerpo del péptido de la anti-ciclina D3 fue elevado de forma similar contra un péptido sintético CDELDQASTPTDVRDIDL, con la región subrayada correspondiente a la región carboxi-terminal de la ciclina D3 humana. Las inmunoglobulinas específicas de la ciclina D3 se purificaron en una columna de afinidad en la que los péptidos de la ciclina D3 17-mer se reticularon al Reacti-Gel (6X). La afinidad del anticuerpo del péptido de la anti-ciclina D3 no reacciona de forma cruzada con las ciclinas D1 o D2 producidas de forma bacteriológica sobre mancha Wester y no inmunoprecipita la ciclina D1 a partir de los lisados de las células WI38.
El antisuero contra el S. Pombe p34^{cdc2} (G8) se describió anteriormente (Draetta, y col., Cell 50:319-325 (1987)). El antisuero anti-PCNA auto-inmune humano es conocido de forma general. El anticuerpo monoclonal anti-PCNA purificado por afinidad utilizado en las manchas Western se obtuvo de Boehringer Mannheim. El anticuerpo monoclonal anti-PCNA purificado por afinidad utilizado en la inmunoprecipitación fue obtenido de Oncogene Science. El antisuero del péptido anti-CDK2 fue descrito previamente (Pagno y col., EMBO J 11:961-971 (1992)) y no reacciona de forma cruzada con los polipéptidos CDC2, CDK4 y CDK5. El antisuero anti-CDK4 se elevó contra una proteína de fusión de transferasa de la glutationa S (GST) y una parte C-terminal de la CDK4. Esta no reaccciona de forma cruzada con la cdk2 y la cdk5.
(i) Selección de una biblioteca de expresión de cDNA humano
Se obtuvo una biblioteca de expresión de cDNA de células HeLa humanas construida en lambda ZAP II (#936201) de Strategene. El p34^{cdc2} humano fue altamente insoluble cuando se produjo a partir de bacterias. El método de selección de anticuerpos convencional (Young y Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. 80:1194-1198 (1983)) es adecuado sólo cuando hay suficiente cantidad de proteínas recombinantes en las placas de fago. Por consiguiente, el método de selección fue modificado para incluir una etapa que suponga el uso de guanidina 6M para solubilizar las proteínas recombinantes después de que hayan sido transferidas a un papel de nitrocelulosa, un procedimiento que fue inicialmente desarrollado para producir proteínas recombinantes replegadas con ciertas actividades (Vinson y col., Gene Dev. 2:801-806 (1988)). Se seleccionaron dos millones de placas de fagos a partir de la biblioteca \lambdaZAP II HeLa cDNA con antisuero contra el S. Pombe p34^{cdc2} (G8). Después de recubrir las placas de fago con filtros de nitrocelulosa impregnados con IPTG durante 4 horas a 42ºC, se eliminaron los filtros de las placas de cultivo y a continuación se trataron con guanidina-HCl 6 M en un tampón conteniendo Hepes 25 mM, pH 7,0, 0,50 mmM de NaCl, 2 mM de DTT durante 10 min a 25ºC. Los filtros se lavaron libres de guanidina con solución salina Tris tamponada antes de la incubación con anticuerpo. Este procedimiento aumentó en gran manera nuestra detección de anticuerpo lo cual probablemente fue debido a la solubilización de los precipitados polipeptídicos producidos por las bacterias. Los clones de cDNA G8-positivos subclonaron en el vector pBluescript SK (Stratagene) y secuenciaron de ambas direcciones utilizando un secuenciador de DNA automatizado ABI (Modelo 373ª). Para la búsqueda de homología de secuencia se utilizó el programa FASTA (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448 (1988)).
(ii) Inmunoprecipitación y manchas-Western
Para el marcaje metabólico con metionina [S^{35}], se lavaron células sub-confluentes (40-60%) dos veces con un medio de marcaje precalentado (DMEM [ICN] libre de metionina, libre de cisteína, suplementado con un 10% de suero de bovino fetal dializado, [GIBCO]). Después de 30 minutos de incubación con el medio de marcaje, se añadió al medio la metionina [S^{35}] (Trans S^{35}-marcada, ICN) (aproximadamente 200 \muCi/ml) y se continuó incubando durante entre cuatro y seis horas antes de la lisis. Todas las etapas de inmunoprecipitación se llevaron a cabo en la habitación caliente. Se lavaron dos veces las células entre el 40 y el 60% confluente en placas 150 mM dos veces con PBS frío y se dejaron en tampón de lisis NP-40 (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 20 mM de EDTA, 0,5% de NP-40, 1 mM de PMSF, 25 \mug/ml de leupeptina, 25 \mug/ml de aprotitina, 1 mM de benzamidina y 10 \mug/ml de inhibidor de la tripsina) y se lisaron por rotación durante entre 15 y 30 minutos. Se separaron los núcleos por centrifugación a 15.000 g durante 5 minutos y se eliminaron previamente los lisatos por incubación previa tanto con suero pre inmune como por suero de conejo normal y IgG sorb (The Enzyme Center, Inc.) durante entre 20 y 30 minutos seguido por una centrifugación de 10 minutos a 15.000 g. Se añadió el anticuerpo pre-acoplado a los granos de agarosa proteína A para clarificar los lisatos y se incubó durante entre seis y ocho horas. Se lavaron los inmunoprecipitados de tres a cuatro veces con tampón de lisis a temperatura ambiente, se resuspendieron en tampón de muestra de SDS y se separaron en geles de SDS-poliacrilamida.
Para los precipitados marcados con metionina marcada con S^{35}, se fijaron los geles de poliacrilamida (excepto aquellos para los experimentos de representación proteolítica del V8) con ácido acético glacial al 10% y metanol al 30% durante entre 30 minutos y una hora, se activaron por impregnación con activadores de autoradiografía (Du Pont) durante 30 minutos y se precipitaron en agua durante entre 15 y 30 minutos. Los geles activadores se secaron y expusieron a películas de rayos X a -70ºC. Para las manchas Western, se transfirieron los polipéptidos a un filtro de nitrocelulosa utilizando un Sistema SDE Electroblotting (Millipore) para 45 minutos a corriente constante de 400 mA. El filtro se bloqueó durante entre 1 y 3 horas con TBST (20 mM de Tris-HCl), pH 7,5, 137 mM NaCl, 0,1% Tween-20) conteniendo un 5% de leche en polvo, incubado con anticuerpo primario durante entre 4 horas y toda la noche en TBST conteniendo un 5% de leche en polvo y se lavó 4 veces, durante 10 minutos cada vez, con TBST. Se incubaron los anticuerpos secundarios apropiados (1:10.000 de dilución tanto de peroxidasa de rábano picante unida a láminas anti-ratón Ig o anti-conejo Ig de burro, Amersham) con filtros durante una hora y se detectaron proteínas específicas utilizando un sistema de quimioluminiscencia activado (ECL, Amersham).
(iii) Representación de los péptidos proteolíticos parciales
Se subclonó la ciclina humana D1, ciclina D2, ciclina D3, CDC2, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5 y PCNA en un vector pBluescript (Stratagene) para la traducción in vitro con polimerasa de RNA T7 utilizando un sistema de lisato reticulocito acoplado a TNT (Promega). La inmunoprecipitación de lisatos marcados con metionina [S^{35}] y la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida fueron los mismos que los anteriormente descritos. Se secaron los geles de poliacrilamida sin fijación previa ni tratamiento de activación, expuestos a placas de revelado Fuji y visualizadas en un analizador de bio-toma de imágenes BAS2000. Se cortaron las bandas de proteína apropiadas a partir de geles utilizando imágenes imprimidas como plantilla, digeridas parcialmente en gel con varias cantidades de proteasa V8 de S. Aureus de acuerdo con (Cleveland y col., J. Biol. Chem., 252:1102-1106 (1977) y (Harlow y Lane, Antibodies: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1988)), separadas en un sistema SDS- PAGE al 17,5 %. Se secaron los geles y se expusieron a una película de rayos X durante 2 semanas, o se analizaron en un analizador de imágenes Fuji BAS2000.
Ejemplo 2 Demostración de la transposición de la subunidad selectiva de los complejos del ciclo celular en asociación con transformación celular por un virus de tumor de DNA o su producto oncogénico (i) La transformación celular con virus SV40 de tumor de DNA está asociada la transposición de subunidades de complejos del ciclo celular
La preparación de los lisatos de células marcados con metionina [S^{35}] y electroforesis en gel de poliacrilamida fue tal como se ha descrito anteriormente, así como tal como se ha descrito en la publicación de la patente PCT No. WO92/20796. Se prepararon los lisatos de células tanto de células WI38 de fibroblastos diploide normales de humanos como de células WI38 transformadas de SV40 de virus de tumor de DNA, VA13. Los lisatos de las células fueron inmunoprecipitados con anticuerpos contra cada uno de los productos de genes del ciclo celular.
(ii) Transposición de la subunidad de complejos del ciclo celular en dos líneas celulares diferentes
Los métodos para la preparación de los lisatos de células son los mismos que los descritos anteriormente. Se utilizaron dos pares de líneas celulares diferentes en estos experimentos. El HSF43 es una línea celular de fibroblasto diploide humano normal y el CT10 (de nombre completo CT10-2C-T1) es un derivado de HSF43 transformado por el antígeno del tumor grande SV40. La CV-1 es una línea celular de riñón de mono verse de Africa y el Cos-1 es un derivado de la CV-1 transformada por SV40.
(iii) La transformación celular por el virus SV40 del tumor del DNA está asociada con la transposición de la subunidad del PCNA de los complejos del ciclo celular
La preparación del lisato celular, la electroforesis, y las condiciones de las manchas Western fueron las mismas que las descritas anteriormente. Las líneas celulares de fibroblastos diploides humanos normales y sus líneas celulares transformadas SV40 se han descrito anteriormente. Los inmunoprecipitados derivados de cada anticuerpo fueron separados sobre geles de poliacrilamida y se obtuvieron las manchas con anticuerpo anti-PCNA.
(iv) La transformación celular por virus SV40 del tumor del DNA está asociada con la transposición de la subunidad CDK4 de los complejos del ciclo celular
La preparación del lisato de células, la electroforesis, y las condiciones de las manchas Western fueron las mismas que las previamente descritas. Las líneas celulares de fibroblastos humanos normales y sus líneas celulares transformadas SV40 están descritas anteriormente. Los inmunoprecipitados derivados de cada anticuerpo fueron separados sobre geles de poliacrilamida y se hicieron las manchas con el anticuerpo anti-CDK4.
Ejemplo 3 Clonación de p16^{INK4}, un inhibidor de la actividad de la CDK4 (i) Clonación del p16INK4 utilizando el ensayo de dos híbridos
Se transformaron células YPB2 de saccharomyces cerevisiae de forma simultánea con un plásmido conteniendo una fusión GAL4db-p16INK4 y con un plásmido conteniendo, respectivamente, el GAL4ad fusionado al cdc2 (CDK1), CDK2, CDK4, CDK5, PCNA (antígeno nuclear de células proliferantes), y la quinasa de levadura de fisión Snf 1. Después del crecimiento de las células en un medio selectivo para ambos plásmidos (menos triptófano y menos leucina), se recogieron al azar dos colonias y se rayaron en placas que tanto contuvieron histidina como no. La capacidad de crecimiento en ausencia de histidina depende de la expresión del gen HIS3 que está bajo un promotor sensible a GAL4 y, por consiguiente, indica que un activador GAL4 funcional ha sido reconstituido a través de la interacción del p16INK4 con la proteína objetivo correspondiente.
(ii) Interacción de las CDKs de la p16^{INK4}
Se mezcló proteína de fusión GSTp16INK4 producida de forma bacteriológica purificada con cdc2, CDK2, CDK4 y CDK5 traducidos in vitro marcados con (S^{35}). Las mezcla contuvieron 0,5 \mug de GST-p16INK4 purificado y una cantidad equivalente de una proteína traducida in vitro (entre 0,5 y 5 \mul; TNT Promega) en un volumen final de 200 \mul de un tampón conteniendo 50 mM de Tris-HCl pH 8, 120 mM de NaCl y 0,5% de Nonidet P-40. Después de 1 h a 4ºC, se añadieron 15 \mul de granos de glutationa-agarosa y se reanudó la incubación durante una hora adicional. Se recuperaron los granos por centrifugación, se lavaron 4 veces con el tampón de incubación, y se mezclaron con el tampón de carga de la proteína-gel estándar. Las muestras se cargaron en un gel de poli-acrilamida al 15% y se detectaron proteínas marcadas con (S^{35}) por fluorografía. La proteína de fusión GSTp16INK4 fue sobreexpresada en el vector pGEX-KG y se purificó por técnicas estándar. Los moldes de traducción in vitro fueron derivados del vector pBluescript (Stratagene).
(iii) Representación proteolítica del p16^{INK4}
Se obtuvo la p16INK4 marcado con (S^{35}) traducido in vitro (TNT Promega) utilizando la p16INK4 cDNA clonado en el vector pBluescript (Stratagene) como un molde, y la proteína p16 asociada al CDK4 fue co inmunoprecipitada con un suero anti-CDK4 a partir de lisatos de células HeLa marcadas metabólicamente con (S^{35}). Se llevó a cabo la proteolisis parcial sobre los cortes de gel correspondientes después del equilibrio extensivo en un tampón y se consiguió la digestión por adición de NCS a diferentes concentraciones. Los productos se eluyeron en un gel de poliacrilamida al 17,5% y se detectaron en un fosforevelador Fujix 2000.
(iv) Detección de los efectos del p16^{INK4} sobre los complejos CDK4-ciclina D
Se marcaron de forma metabólica con (S^{35}) células de insectos infectadas con baculovirus sobreexpresando la p16INK4, CDK4, ciclina D1, o tanto la CDK4 como la ciclina D1 juntas. Las diferentes mezclas de incubación se compusieron por extractos conteniendo p16INK4, CDK4, ciclina D1 y tanto CDK4 como ciclina D1, y se inmunoprecipitaron con suero anti-p16INK4, sueros anti-CDK4 con cualquier preincubación previa, y suero anti-CDK preincubado con el péptido originalmente utilizado para aumentar el antisuero y el suero anti-ciclina D1. A continuación se analizaron los inmunoprecipitados por SDS-PAGE.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Cold Spring Harbor Laboratory
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 100 Bungtown Road
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Cold Spring Harbor
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO: NY
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAIS: USA
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CODIGO POSTAL (ZIP): 11724
\vskip0.333000\baselineskip
(G)
TELEFONO: (617) 227-7400
\vskip0.333000\baselineskip
(H)
TELEFAX: (617) 227-5941
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Transposición del Complejo de Ciclina y Usos Relacionados del Mismo
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NUMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
FORMA LEIBLE DE ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO MEDIO: disco flexible
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: ASCII (texto)
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
DATOS DE LA SOLICITUD PRIORITARIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NUMERO DE SOLICITUD: US 07/991.997
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 17-Dic-1992
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1089 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TRENZADO: doble
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 13..888
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:
1
2
3
INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 292 amino ácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: amino ácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2:
4
5 
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 948 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TRENZADO: ambos
\vskip0.333000\baselineskip
(D) TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: cDNA
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
CARACTERISTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 19..465
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3:
6 
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:4:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 148 amino ácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: amino ácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLECULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:4:
7

Claims (34)

1. Un método de identificación de una célula transformada o de una proliferación anormal de la misma, que comprende las etapas siguientes:
(A) determinación, en una célula(s) de ensayo, de la composición de la sub-unidad de un complejo que comprende una proteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 16 kDa, 19 kDa o 21 kDa y una quinasa dependiente de la ciclina (cdk), una ciclina o una cdk y una ciclina, siendo la proteína, de forma predominante, una proteína que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 23 kDa en una célula normal, o siendo de forma predominante una proteína que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 19 kDa o de aproximadamente 16 kDa en una célula transformada o de proliferación anormal, y
(B) comparación de la composición de la sub-unidad de la etapa (A) con la composición de la sub-unidad de un complejo similar encontrado en una célula normal, en donde una alteración en la composición de la sub-unidad es indicativa de una transformación o de una proliferación anormal de la célula del ensayo.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa (A) comprende la determinación del nivel de una proteína que tiene un peso molecular aparente de 21 kDa que forma un complejo con una cdk, una ciclina o una cdk y una ciclina, y en donde una reducción en la etapa (B) del nivel de dicha proteína de 21 kDa que forma un complejo con una cdk, una ciclina o una cdk y una ciclina es indicativa de una transformación o una proliferación anormal de la(s) célula(s) del ensayo.
3. El método de acuerdo con la reivindicación A, en el que la etapa (A) comprende la determinación del nivel de una proteína que tiene un peso molecular aparente de 16 kDa que forma un complejo con una cdk, y en donde un incremento en la etapa (B) del nivel de dicha proteína de 16 kDa que forma un complejo con una cdk es indicativa de una transformación o una proliferación anormal de la (s) célula(s) del ensayo.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa (A) comprende la determinación del nivel de una proteína que tiene un peso molecular aparente de 19 kDa que forma un complejo con una ciclina, y en donde un incremento en la etapa (B) del nivel de dicha proteína de 19 kDa que forma un complejo con una ciclina es indicativa de una transformación o una proliferación anormal de la (s) célula(s) de ensayo.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, en el que se utiliza un análisis por electroforesis en gel y/o un análisis inmunológico para determinar la composición de la sub-unidad.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la ciclina es una ciclina de tipo D o una ciclina de tipo A.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la cdk es una cdk4.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la ciclina es una ciclina A.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones, siendo el método un método de diagnóstico in vitro destinado a valorar un estado de la enfermedad o la probabilidad de desarrollar un estado asociado con una transformación o una proliferación anormal de células.
10. Un polipéptido purificado y/o recombinante que comprende una secuencia de amino ácidos de un polipéptido que tiene un peso molecular aparente comprendido entre aproximadamente 15 kDa y aproximadamente 17 kDa, en donde dicho polipéptido inhiba una quinasa dependiente de la ciclina y esté codificada por un ácido nucleico que hibride de forma específica a la secuencia del ácido nucleico de la SEC ID no.3.
11. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10, que es una proteína de fusión o una parte immunogénica de la proteína de la SEC ID no.4.
12. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID no. 4.
13. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el polipéptido tiene un peso molecular de 16 kDa.
14. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el polipéptido es un polipéptido recombinante.
15. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el polipéptido es específicamente reactivo con un anticuerpo selectivo para la proteína de la SEC ID no.4.
16. Un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10.
17. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 16, que codifica la proteína de la SEC ID no. 4.
18. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID no. 3.
19. Un ácido nucleico aislado (sentido o antisentido) que hibridiza de forma específica a la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID no. 3 y detecta de forma selectiva un gen que codifica una proteína de 16 kDa que se une a la quinasa dependiente de la ciclina 4 (cdk4).
20. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el ácido nucleico es un oligonucleótido anti sentido que se hibrida al gen e inhibe la expresión de dicha proteína.
21. Un kit de ensayo para diagnóstico para la identificación de células transformadas, que comprende:
(a)
una sonda de un ácido nucleico (sentido o antisentido) que se hibrida de forma específica a la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID no. 3 y que detecta de forma selectiva un ácido nucleico que codifica una proteína de 16 kDa que se une a la quinasa dependiente de la ciclina 4 (cdk4), sirviendo dicha sonda para medir, en una muestra de células aisladas de un paciente, la presencia o ausencia de un ácido nucleico que codifica dicha proteína de 16 kDa; y/o
(b)
un anticuerpo específico para la proteína de 16 kDa para medir, en una muestra de células aisladas de un paciente, una cantidad de dicha proteína.
22. Un kit de acuerdo con la reivindicación 21, en el que el anticuerpo es específico para dicho polipéptido que tiene una secuencia de amino ácidos de la SEC ID no. 4.
23. El ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20 o un kit de acuerdo con las reivindicaciones 21 ó 22, en el que el ácido nucleico, la sonda o el anticuerpo están marcados con marcador detectable seleccionado entre el grupo constituido por: una enzima, un substrato de enzima, una coenzima, un inhibidor de enzima, un marcador fluorescente, un cromóforo, un marcador luminescente, un ligando de unión específica y un radioisótopo.
24. El ácido nucleico o un kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 ó 23, en el que el ácido nucleico o la sonda hibridizan a un transcrito de un mRNA que codifica dicha proteína.
25. El ácido nucleico o un kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21 ó 23, en el que el ácido nucleico o la sonda tiene una longitud de aproximadamente entre 75 y 150 nucléotides.
26. Un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido de acuerdo con la reivindicación 4 o el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 16 o la reivindicación 19.
27. Una preparación que comprende una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en la que la proteína de fusión tiene una pureza superior al 90%.
28. Un método de análisis para identificar un agente que altera la composición de la subunidad de un complejo de quinasa dependiente de la ciclina, que comprende las etapas siguientes:
i.
proporcionar una quinasa dependiente de la ciclina (cdk) y el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en las condiciones en las que la cdk y dicho polipéptido pueden formar un complejo;
ii.
puesta en contacto de la mezcla con un agente candidato;
iii.
detección de una cantidad de polipéptido como parte del complejo formado;
iv.
comparación de la cantidad de polipéptido encontrado en el complejo en presencia del agente candidato con la cantidad de polipéptido presente en el complejo en ausencia del agente candidato,
en donde un cambio en la cantidad de polipéptido presente en el complejo en presencia del agente candidato, relativo a la ausencia del agente candidato, es indicativo de un agente que altera la composición de la subunidad de un complejo de quinasa dependiente de la ciclina.
29. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en el que la mezcla es un lisato celular o una preparación de proteína reconstituida in vitro.
30. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 29, en el que la(s) célula(s) es (son) obtenida(s) a partir de una muestra de tejido o de una muestra biológica.
31. Una preparación que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, y una quinasa dependiente de la ciclina cdk4 para uso en el método de análisis de la reivindicación 28.
32. Un método para la detección de la transformación de una célula de un mamífero por detección de una expresión alterada de un gen que codifica una proteína que tiene un peso molecular comprendido entre 15 kDa y 17 kDa, que es un inhibidor de la cdk4, cuyo método comprende la determinación, en una muestra de análisis de células de mamífero, de la presencia o ausencia de un ácido nucleico hibridado de forma específica al ácido nucleico de la SEC ID no. 3, indicando la presencia de dicho ácido nucleico la transformación de las células.
33. El método de acuerdo con la reivindicación 32, en el que la hibridación del ácido nucleico se utiliza para determinar el nivel de transcritos de mRNA que codifican la proteína de 15 kDa a 17 kDa inhibidor de la quinasa dependiente de la ciclina.
34. Un anticuerpo que es específicamente inmunoreactivo con la proteína de la SEC ID no. 4.
ES93924946T 1992-10-16 1993-10-18 Transposicion del complejo de ciclina y usos relacionados del mismo. Expired - Lifetime ES2201064T3 (es)

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