ES2390530T3 - Genes procedentes del amplicón 20Q13 y sus usos - Google Patents

Abstract

Una molecula aislada de acidos nucleicos que comprende una secuencia de polinucleotidos que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ. ID. Nos. 9 o 10 o una de sus secuencias complementarias.

Description

Genes procedentes del amplicón 20Q13 y sus usos

5 REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

[0001] Esta solicitud es una continuacion en parte del documento USSN 08/785.532, presentado el 17 de enero de 1997, del documento USSN 08/731.499 presentado el 16 de octubre de 1996 y del documento USSN 08/680.395 presentado el 15 de julio de 1996, que esta relacionada con la Solicitud de patente copendiente de EE.UU., USSN

10 08/546.130, presentada el 20 de octubre de 1995.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Esta invencion pertenece al campo de la citogenetica. Mas en particular esta invencion esta relacionada

15 con la identificacion de genes en una region de amplificacion en 20q13 aproximadamente en diversos tipos de cancer. Los genes descritos en el presente documento se pueden utilizar como sondas especificas para el amplicon 20q13 asi como para el tratamiento de diversos tipos de cancer. [0003] Las anomalias cromosomicas a menudo llevan asociados trastornos geneticos, enfermedades

20 degenerativas, y cancer. En particular, la eliminacion o multiplicacion de copias de cromosomas completos o segmentos cromosomicos, y niveles superiores de amplificacion de regiones especificas del genoma son eventos frecuentes en cancer. Vease, por ejemplo, Smith, y col., Breast Cancer Res. Treat., 18: Suppl. 1: 5-14 (1991, van de Vijer & Nusse, Biochim. Biophys. Acta. 1072: 33-50 (1991), Sato, y col., Cancer. Res., 50: 7184-7189 (1990). De hecho, la amplificacion y eliminacion de secuencias de ADN que contienen proto-oncogenes y genes supresores de

25 tumores, respectivamente, habitualmente son caracteristicas de la tumorogenesis. Dutrillaux, y col., Cancer Genet. Cytogenet., 49: 203-217 (1990). Obviamente, la identificacion de regiones amplificadas y eliminadas y la clonacion de los genes involucrados es crucial tanto para el estudio de la tumorogenesis como para el desarrollo del diagnostico del cancer.

30 [0004] La deteccion de regiones cromosomicas amplificadas o eliminadas tradicionalmente se ha realizado mediante citogenetica. Debido al complejo empaquetamiento del ADN dentro de los cromosomas, la resolucion de las tecnicas citogeneticas ha estado limitada a regiones mayores de 10 Mb aproximadamente; aproximadamente la anchura de una banda en cromosomas tefidos con Giemsa. En cariotipos complejos con multiples traslocaciones y otras variaciones geneticas, el analisis citogenetico tradicional es de poca utilidad debido a que se carece de la

35 informacion del cariotipo o no se puede interpretar. Teyssier, J.R., Cancer Genet. Cyrogenet., 37: 103 (1989). Ademas, el analisis citogenetico de bandas convencional consume tiempo, requiere mucho trabajo, y con frecuencia resulta dificil o imposible. [0005] Mas recientemente se han utilizado sondas clonadas para valorar mediante transferencia de Southern la

40 cantidad de una secuencia de ADN dada en un cromosoma. Este procedimiento es eficaz incluso si el genoma se ha reorganizado enormemente para asi eliminar la informacion cariotipica util. No obstante, la transferencia de Southern solamente proporciona una estimacion grosera del numero de copias de una secuencia de ADN, pero no proporciona informacion sobre la localizacion de dicha secuencia dentro del cromosoma.

45 [0006] La hibridacion genomica comparativa (CGH) es un enfoque mas reciente para identificar la presencia y localizacion de secuencias amplificadas/eliminadas. Vease Kallioniemi, y col., Science, 258: 818 (1992). La CGH, al igual que la transferencia de Southern, revela amplificaciones y eliminaciones independientemente de la reordenacion del genoma. Ademas, la CGH proporciona una estimacion del numero de copias mas cuantitativa que la transferencia de Southern, e incluso tambien proporciona informacion de la localizacion de la secuencia

50 amplificada o eliminada en el cromosoma normal. [0007] Utilizando la CGH, se ha identificado la region 20q13 del cromosoma como una region que se amplifica frecuentemente en canceres (vease, por ejemplo, Kallioniemi y col., Genomics, 20: 125-128 (1994)). El analisis inicial de esta region en lineas celulares de cancer de mama ha identificado una region de 2 Mb aproximadamente

55 en el cromosoma 20 que se amplifica de forma consistente. [0008] La Base de datos del EMBL, 8 de mayo de 1996 (numero de acceso a la base de datos del EBI W05407) describe una EST obtenida a partir de tejido humano de pulmon fetal.

[0009] La Base de datos del EMBL, 16 de marzo de 1996 (numero de acceso a la base de datos del EBI N70546) describe una EST adicional obtenida a partir de tejido humano de pulmon fetal.

[0010] El documento WO 95/09929 A describe secuencias de ADNc procedentes de una region de amplificacion 5 en el cromosoma 20 relacionadas con la enfermedad.

[0011] Tanner MM y col. 1995 (Clinical Cancer Research, vol. 1, n° 12, paginas 1455-1461) describe la utilizacion de hibridacion in situ con fluorescencia con una sonda de un cosmido para la region minima de amplificacion (RMC20C001) con el fin de estudiar la amplificacion de 20q13 en 132 carcinomas primarios de mama y 11

10 metastasis. El tamafo del amplicon se estudio con cuatro sondas flanqueantes.

[0012] Tanner y col. 1994 (Cancer Research, vol. 54, numero 16, paginas 4257-4260) describe la utilizacion de hibridacion in situ con fluorescencia en interfase con sondas de cosmidos anonimos y clones P1 especificos para los genes con el fin de determinar la region minima comun de mayor numero de copias y estudiar la implicacion de

15 genes conocidos en 20q13.

[0013] Kallioniemi A y col., 1994 (PNAS, vol. 91, numero 6, paginas 2156-2160) describe la aplicacion de hibridacion genomica comparativa para 5 lineas celulares de cancer de mama y 33 tumores primarios para descubrir y mapear las regiones del genoma con un mayor numero de copias de la secuencia de ADN.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0014] La presente invencion esta relacionada con la identificacion de una region estrecha (600 kb aproximadamente) en el interior de un amplicon de 2 Mb localizado aproximadamente en la region cromosomica 25 20q13 (mas exactamente en 20q13.2) que se amplifica de manera consistente en tumores primarios. Ademas, esta invencion proporciona secuencias de ADNc que mapean en esta region. Estas secuencias son utiles como sondas o como dianas de sondas para controlar el numero de copias relativas de las secuencias correspondientes procedentes de una muestra biologica, tal como una celula tumoral. Tambien se describe un contigo (una serie de clones que extienden de forma contigua este amplicon) que se pueden utilizar para preparar sondas especificas

30 para el amplicon. Las sondas se pueden utilizar para detectar anomalias cromosomicas en 20q13.

[0015] Asi, la presente invencion proporciona una molecula de acidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de polinucleotidos que contiene una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ. ID. Nos. 9

o 10 o una de sus secuencias complementarias. En algunas formas de realizacion el acido nucleico aislado es una 35 molecula de ADNc.

[0016] En algunas formas de realizacion la secuencia de polinucleotidos comprende las SEQ. ID. Nos. 9 o 10.

[0017] En algunas formas de realizacion, el acido nucleico aislado comprende adicionalmente una secuencia 40 promotora unida de manera operable a la secuencia de polinucleotidos.

[0018] La invencion tambien proporciona un procedimiento de seleccion de celulas neoplasicas en una muestra, el procedimiento que comprende:

45 la puesta en contacto de una muestra de acidos nucleicos procedente de un paciente humano con un acido nucleico aislado que se hibrida selectivamente a una secuencia de polinucleotidos diana que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ. ID. Nos. 9 o 10 o una de sus secuencias complementarias, o a una subsecuencia de cualquiera de estas susodichas secuencias en donde el acido nucleico aislado se pone en contacto con la muestra en condiciones en las que el acido nucleico aislado se hibrida selectivamente con la secuencia de

50 polinucleotidos diana para formar un complejo de hibridacion estable; y

la deteccion de la formacion de un complejo de hibridacion para controlar el numero de copias relativas de secuencias correspondientes a las SEQ. ID. Nos. 9 o 10 en la muestra.

55 [0019] En algunas formas de realizacion, la muestra de acidos nucleicos procede de un paciente con un cancer seleccionado del grupo constituido por cancer de ovario, vejiga, cabeza y cuello, colon y cancer de mama. En algunas formas de realizacion, el acido nucleico aislado esta marcado.

[0020] En algunas formas de realizacion, el acido nucleico aislado esta inmovilizado sobre una superficie solida.

[0021] En algunas formas de realizacion, la muestra de acidos nucleicos es un nucleo en propagacion durante la metafase o un nucleo en interfase.

5 [0022] La invencion proporciona adicionalmente un procedimiento para la seleccion de celulas neoplasicas en una muestra, el procedimiento que comprende:

la puesta en contacto de una muestra de acidos nucleicos procedente de un paciente humano con un acido nucleico aislado que se hibrida selectivamente a una secuencia de polinucleotidos diana que comprende una secuencia

10 seleccionada del grupo constituido por las SEQ. ID. Nos. 9 o 10 o una de sus secuencias complementarias, o a una subsecuencia de cualquiera de estas susodichas secuencias en donde el acido nucleico aislado se pone en contacto con la muestra en condiciones en las que el acido nucleico aislado se hibrida selectivamente con la secuencia de polinucleotidos diana para formar un complejo de hibridacion estable; y

15 la deteccion de la formacion de un complejo de hibridacion para identificar la presencia de una mutacion en la secuencia de polinucleotidos diana.

[0023] Incluso se proporciona un procedimiento de seleccion de celulas neoplasicas en una muestra biologica, dicho procedimiento que comprende la seleccion de la muestra para la sobre-expresion del gen ZABC1, en donde la 20 sobre-expresion del gen ZABC1 con respecto al tejido normal es indicativa de celulas neoplasicas, y en donde el gen ZABC1 corresponde a cualquiera de las secuencias SEQ. ID. Nos. 9 o 10.

[0024] En algunas formas de realizacion, la muestra para la sobre-expresion del gen ZABC1 comprende la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo que se une especificamente a un antigeno del polipeptido codificado 25 por una secuencia de polinucleotidos que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ. ID. Nos. 9 o 10 y la deteccion de la formacion de un complejo antigeno-anticuerpo.

[0025] En algunas formas de realizacion, la muestra se selecciona del grupo constituido por tejido de ovario, vejiga, cabeza y cuello, colon y mama.

30 [0026] En algunas formas de realizacion, el procedimiento comprende la seleccion de la muestra para la sobreexpresion de una proteina codificada por una secuencia de polinucleotidos que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ. ID. Nos. 9 o 10.

35 [0027] La invencion proporciona un procedimiento como se ha descrito en este resumen para su utilizacion en el diagnostico de la aparicion o la progresion de un cancer en un individuo del cual se ha derivado una muestra biologica, en donde una sobre-expresion de 3 veces o superior del gen ZABC1 en una muestra biologica esta correlacionada con una menor supervivencia libre de enfermedad en sujetos con ganglios negativos.

40 [0028] Ademas se proporciona un procedimiento para el diagnostico del comienzo o la progresion del cancer en un individuo, cuyo procedimiento comprende las etapas de:

(a) determinar la expresion del gen ZABC1 en una muestra biologica procedente del individuo, y

45 (b) comparar el nivel de expresion del gen ZABC1 observado en la muestra biologica con el nivel de expresion del gen ZABC1 derivado de una segunda muestra de tejido clinicamente normal,

en donde una sobre-expresion del gen ZABC1 de 3 veces o superior en la muestra biologica esta correlacionada con una menor supervivencia libre de enfermedad en sujetos con ganglios negativos. 50 Definiciones

[0029] Una "muestra de acidos nucleicos" como se usa en el presente documento se refiere a una muestra que comprende ADN en una forma adecuada para su hibridacion a sondas de la invencion. El acido nucleico puede ser 55 un ADN genomico total, un ARNm total, ADN o ARNm genomicos procedentes de cromosomas particulares, o secuencias seleccionadas (por ejemplo, promotores, genes, fragmentos de amplificacion o restriccion, ADNc particulares, etc.) dentro de los amplicones particulares descritos en el presente documento. La muestra de acidos nucleicos se puede extraer a partir de celulas o tejidos particulares. La muestra de tejido a partir de la cual se prepara la muestra de acidos nucleicos normalmente se obtiene de un paciente sospechoso de padecer la enfermedad asociada a la amplificacion a detectar. En algunos casos, los acidos nucleicos se pueden amplificar utilizando tecnicas habituales tales como PCR, antes de la hibridacion. La muestra puede ser de acidos nucleicos aislados inmovilizados sobre una superficie solida (por ejemplo, nitrocelulosa) para su utilizacion en hibridaciones de Southern o membrana de transferencia de puntos y similares. La muestra tambien se puede preparar de manera que 5 los acidos nucleicos individuales permanezcan sustancialmente intactos y comprendan nucleos en interfase preparados de acuerdo con tecnicas habituales. Una "muestra de acidos nucleicos" como se usa en el presente documento tambien se puede referir a un cromosoma condensado sustancialmente intacto (por ejemplo, un cromosoma en metafase). Dicho cromosoma condensado es adecuado para su utilizacion como diana de hibridacion en tecnicas de hibridacion in situ (por ejemplo, FISH). El uso particular del termino "muestra de acidos nucleicos" (ya 10 sea en forma de acidos nucleicos extraidos o como cromosoma intacto en metafase) sera evidente para la persona experta en la materia segun el contexto en el que se utilice el termino. Por ejemplo, la muestra de acidos nucleicos puede ser una muestra de tejidos o de celulas preparada para procedimientos de hibridacion in situ habituales descritos a continuacion. La muestra se prepara de manera que los cromosomas individuales permanezcan sustancialmente intactos y normalmente comprenden nucleos en propagacion durante la metafase o nucleos en

15 interfase de acuerdo con tecnicas habituales.

[0030] Una "muestra de cromosomas" como se usa en el presente documento se refiere a una muestra de tejido o de celulas preparada para los procedimientos de hibridacion in situ habituales descritos a continuacion. La muestra se prepara de manera que los cromosomas individuales permanezcan sustancialmente intactos y normalmente 20 comprenden nucleos en propagacion durante la metafase o nucleos en interfase de acuerdo con tecnicas habituales.

[0031] Un "acido nucleico" se refiere a un polimero de desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos en cualquiera de las formas de cadena sencilla o de doble cadena, y a menos que este limitado de otra forma, englobara analogos conocidos de nucleotidos naturales que pueden funcionar de manera similar a los nucleotidos de origen natural.

25 [0032] Un polinucleotido "aislado" es un polinucleotido que esta sustancialmente separado de otros contaminantes que lo acompafan de manera natural, por ejemplo, proteinas, lipidos, y otras secuencias de polinucleotidos. El termino abarca secuencias de polinucleotidos que han sido extraidas o purificadas de su entorno natural o de una libreria de clones, e incluyen aislados de ADN recombinantes o clonados y analogos sintetizados quimicamente o

30 analogos sintetizados biologicamente mediante sistemas heterologos.

[0033] Una "subsecuencia" se refiere a una secuencia de acidos nucleicos que comprende una parte de una secuencia de acidos nucleicos mas larga.

35 [0034] Una "sonda" o una "sonda de acidos nucleicos", como se usa en el presente documento, se define como una coleccion de uno o mas fragmentos de acidos nucleicos cuya hibridacion a una diana se puede detectar. La sonda se produce a partir de una fuente de acidos nucleicos procedente de una o mas porciones particulares (preseleccionadas) del genoma, por ejemplo, uno o mas clones, un cromosoma completo o un fragmento de cromosoma aislados, o una coleccion de productos de amplificacion de la reaccion en cadena de la polimerasa

40 (PCR). Las sondas se pueden producir a partir de acidos nucleicos encontrados en el amplicon 20q13 como se describe en el presente documento. La sonda se puede procesar de alguna manera, por ejemplo, bloqueando o eliminando acidos nucleicos repetitivos o enriqueciendo con acidos nucleicos unicos. Asi, la palabra "sonda" se puede usar en el presente documento para referirse no solo a los acidos nucleicos detectables, sino a los acidos nucleicos detectables en la forma en que se aplican a la diana, por ejemplo, con los acidos nucleicos de bloqueo,

45 etc. El acido nucleico de bloqueo tambien se puede mencionar por separado. A partir del contexto en el que se utiliza dicha palabra es evidente a que se refiere especificamente la palabra "sonda".

[0035] La sonda tambien puede consistir en acidos nucleicos aislados inmovilizados sobre una superficie solida (por ejemplo, nitrocelulosa). En algunas formas de realizacion, la sonda puede ser un miembro de un biochip de

50 acidos nucleicos como se describe, por ejemplo, en el documento WO 96/17958. Tambien se pueden utilizar para este proposito tecnicas capaces de producir biochips de alta densidad (vease, por ejemplo, Fodor y col. Science 767-773 (1991) y la patente de EE.UU. N° 5.143.854).

[0036] "Hibridacion" se refiere a la union de dos acidos nucleicos de cadena sencilla mediante el apareamiento de 55 bases complementarias.

[0037] "Que se une(n) sustancialmente "o "que se une especificamente" o "que se une selectivamente" o "que se hibrida especificamente" se refieren a la hibridacion complementaria entre un oligonucleotido y una secuencia diana y comprende desapareamientos poco importantes que se pueden acomodar reduciendo las condiciones de

rigurosidad del medio de hibridacion para conseguir la deteccion deseada de la secuencia de polinucleotidos diana. Estos terminos tambien se refieren a la union, formacion de duplex, o hibridacion de una molecula solo a una secuencia de nucleotidos particular en condiciones rigurosas cuando dicha secuencia esta presente en una mezcla compleja de ADN o ARN (por ejemplo, celular total). El termino "condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones 5 bajo las que una sonda se hibridara a su subsecuencia diana, pero no a otras secuencias. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y seran diferentes en diferentes circunstancias. Una "hibridacion en condiciones rigurosas" y unas "condiciones de lavado de la hibridacion en condiciones rigurosas" en el contexto de experimentos de hibridacion con acidos nucleicos tales como CGH, FISH, e hibridaciones de Southern y Northern dependen de la secuencia, y son diferentes bajo parametros medioambientales diferentes. Se puede encontrar una guia exhaustiva 10 para la hibridacion de acidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capitulo 2 "overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, Nueva York. En general, las condiciones de lavado e hibridacion altamente rigurosas se seleccionan para que se encuentren 5'C aproximadamente por debajo del punto de fusion termico (Tm para la secuencia especifica a una fuerza ionica y un pH definidos). La Tm es la temperatura (a una

15 fuerza ionica y un pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida a una sonda perfectamente complementaria. Las condiciones muy rigurosas se seleccionan para que sean iguales a la Tm para una sonda particular.

[0038] Un ejemplo de condiciones de hibridacion rigurosas para la hibridacion de acidos nucleicos

20 complementarios que presentan mas de 100 restos complementarios sobre un filtro en una transferencia de Southern o Northern es formalina al 50% con 1 mg de heparina a 42'C, y la hibridacion se lleva a cabo d urante toda la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es el lavado en 0,2x SSC a 65'C durante 15 minut os (vease, Sambrook, mas arriba para una descripcion del tampon SSC). A menudo, el lavado en unas condiciones altamente rigurosas esta precedido por un lavado en unas condiciones poco rigurosas para eliminar la sefal de

25 fondo de la sonda. Un ejemplo de lavado en condiciones de rigurosidad media para un duplex de, por ejemplo, 100 nucleotidos o mas aproximadamente, es 1x SSC a 45'C d urante 15 minutos. Un ejemplo de lavado en condiciones poco rigurosas para un duplex de, por ejemplo, mas de 100 nucleotidos, es 4x SSC a 40'C durante 15 minut os. En general, la observacion de una relacion de sefal/ruido de 2x (o superior) frente a la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridacion particular indica la deteccion de una hibridacion especifica.

30 [0039] La persona experta reconocera que la secuencia precisa de las sondas particulares descritas en el presente documento se puede modificar hasta un cierto grado para producir sondas que sean "sustancialmente identicas" a las sondas descritas, pero que retienen la capacidad para unirse sustancialmente a las secuencias dianas. Dichas modificaciones estan cubiertas especificamente por referencia a las sondas individuales del presente

35 documento. El termino "identidad sustancial" de las secuencias de polinucleotidos significa que un polinucleotido comprende una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos el 90%, mas preferentemente de al menos el 95%, en comparacion con una secuencia de referencia utilizando los procedimientos descritos a continuacion usando parametros habituales.

40 [0040] Se dice que dos secuencias de acidos nucleicos son "identicas" si la secuencia de nucleotidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para su maxima correspondencia como se describe a continuacion. El termino "complementario" se utiliza en el presente documento para indicar que la secuencia complementaria es identica a toda o una parte de una secuencia de polinucleotidos de referencia. Los acidos nucleicos que no se hibridan a versiones complementarias entre si en condiciones rigurosas aun son sustancialmente identicos si los

45 polipeptidos que codifican son sustancialmente identicos. Esto se produce, por ejemplo, cuando se genera una copia de un acido nucleico utilizando la maxima degeneracion codonica permitida por el codigo genetico.

[0041] Las comparaciones de secuencia entre dos (o mas) polinucleotidos normalmente se llevan a cabo comparando fragmentos de las dos secuencias a lo largo de una "ventana de comparacion" para identificar y

50 comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparacion", como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento de al menos 20 posiciones contiguas aproximadamente, normalmente entre 50 aproximadamente y 200 aproximadamente, y mas habitualmente entre 100 aproximadamente y 150 posiciones contiguas aproximadamente, en la que una secuencia se puede comparar con una secuencia de referencia del mismo numero de posiciones contiguas despues de que las dos secuencias se hayan alineado de forma optima.

55 [0042] El alineamiento optimo de secuencias para su comparacion se puede realizar mediante el algoritmo de homologia local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento por homologia de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la busqueda con el metodo de similitud de Pearson y Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85: 2444 (1988), o mediante implementaciones computerizadas de

estos algoritmos.

[0043] El "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas de forma optima a lo largo de una ventana de comparacion, en donde la fraccion de la secuencia de polinucleotidos en la 5 ventana de comparacion puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) comparada con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para el alineamiento optimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el numero de posiciones en las que se encuentran bases de acidos nucleicos o restos de aminoacidos identicos en ambas secuencias para dar el numero de posiciones apareadas, dividiendo el numero de posiciones apareadas por el numero total de posiciones en la ventana de 10 comparacion y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia. Otra indicacion de que las secuencias de nucleotidos son sustancialmente identicas se produce si dos moleculas se hibridan a la misma secuencia de acidos nucleicos en condiciones rigurosas. Las "variaciones conservativamente modificadas" de una secuencia de acidos nucleicos particular se refieren a aquellos acidos nucleicos que codifican secuencias de aminoacidos identicas o esencialmente identicas, o en donde el acido nucleico no codifica una secuencia de 15 aminoacidos, para secuencias esencialmente identicas. Debido a la degeneracion del codigo genetico, un gran numero de acidos nucleicos funcionalmente identicos codifican cualquier polipeptido dado. Por ejemplo, los codones CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, y AGG codifican todos el aminoacido arginina. Asi, en cualquier posicion en la que una arginina este especificada por un codon, el codon se puede alterar con cualquiera de los codones descritos correspondientes sin alterar el polipeptido codificado. Dichas variaciones de acidos nucleicos son "variaciones 20 silenciosas", que son un tipo de "variaciones conservativamente modificadas". Cada secuencia de acidos nucleicos del presente documento que codifica un polipeptido tambien describe cada posible variacion silenciosa. La persona experta reconocera que cada codon en un acido nucleico (excepto AUG, que ordinariamente es el unico codon para la metionina) se puede modificar para proporcionar una molecula funcionalmente identica mediante tecnicas habituales. Por consiguiente, en cada secuencia descrita esta implicita cada "variacion silenciosa" de un acido 25 nucleico que codifica un polipeptido. Ademas, la persona experta reconocera que sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales que alteran, afaden o eliminan un solo aminoacido o un pequefo porcentaje de aminoacidos (normalmente menos del 5%, y mas habitualmente menos del 1%) en una secuencia codificada son "variaciones conservativamente modificadas" en donde las alteraciones producen la sustitucion de un aminoacido por un aminoacido quimicamente similar. Son muy conocidas en la materia las tablas de sustituciones conservativas que

30 proporcionan aminoacidos funcionalmente similares. Cada uno de los siguientes seis grupos contiene aminoacidos que son sustituciones conservativas entre si:

1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2) Acido aspartico (D), acido glutamico (E);

35 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).

40 [0044] El termino "proteina del amplicon 20q13" se utiliza en el presente documento para referirse a proteinas codificadas por ORFs en el amplicon 20q13 descrito en el presente documento. Los ensayos que detectan las proteinas del amplicon 20q13 estan disefados para detectar el nivel de proteinas del amplicon 20q13 endogenas (nativas) presentes en la muestra biologica del sujeto. No obstante, se pueden afadir proteinas del amplicon 20q13 exogenas (procedentes de una fuente extrinseca a la muestra biologica) a diversos ensayos para proporcionar un

45 marcador o para competir con la proteina del amplicon 20q13 nativa en su union a un anticuerpo dirigido contra la proteina del amplicon 20q13. La persona experta apreciara que en este contexto se puede utilizar un mimetico de la proteina del amplicon 20q13 en lugar de la proteina 20q13 exogena. Una "proteina 20q13", como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula que porta uno o mas epitopos de la proteina del amplicon 20q13 de manera que se una especificamente a un anticuerpo que se una especificamente a una proteina del amplicon 20q13

50 nativa.

[0045] Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo" se refiere a una proteina que consta de uno o mas polipeptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulinas o fragmentos de genes de inmunoglobulinas. Los genes de inmunoglobulinas reconocidos incluyen los genes de la region constante kappa,

55 lambda, alfa, gamma, delta, epsilon y mu, asi como los miles de genes de la region variable de las inmunoglobulinas. Las cadenas ligeras se clasifican en kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican en gamma, mu, alfa, delta o epsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

[0046] Se sabe que la unidad estructural basica de las inmunoglobulinas (anticuerpo) comprende un tetramero. Cada tetramero esta compuesto de dos pares identicos de cadenas polipeptidicas, cada par que presenta una cadena "ligera" (25 kD aproximadamente) y una cadena "pesada" (50-70 kD aproximadamente). El N-termino de cada cadena define una region variable de 100 a 110 aminoacidos aproximadamente, o superior, responsables

5 principalmente de reconocimiento de antigenos. Los terminos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligera y pesada, respectivamente.

[0047] Los anticuerpos pueden existir en forma de inmunoglobulinas intactas o en forma de una serie de fragmentos bien caracterizados producidos por la digestion con diversas peptidasas. Asi, por ejemplo, la pepsina 10 digiere un anticuerpo por debajo de los puentes disulfuro en la region bisagra para producir F(ab)'2, un dimero de Fab que es el mismo una cadena ligera unida a VH-CH1 mediante un enlace disulfuro. El F(ab)'2 se puede reducir en condiciones suaves para romper el puente disulfuro en la region bisagra convirtiendo asi al dimero F(ab)'2 en un monomero Fab'. El monomero Fab' es esencialmente un Fab con parte de la region bisagra (vease, Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993) para una descripcion mas detallada de otros fragmentos de

15 anticuerpo). Aunque varios fragmentos de anticuerpo se definen en terminos de digestion de un anticuerpo intacto, la persona experta apreciara que dichos fragmentos Fab' se pueden sintetizar quimicamente de novo o utilizando metodologias de ADN recombinante. Asi, el termino anticuerpo, como se usa en el presente documento tambien incluye fragmentos de anticuerpos producidos mediante la modificacion de anticuerpos completos o sintetizados de novo utilizando metodologias de ADN recombinante.

20 [0048] La frase "que se une especificamente a una proteina" o "especificamente inmunorreactivo con", cuando hace referencia a un anticuerpo, se refiere a una reaccion de union que es determinante para la presencia de la proteina en presencia de una poblacion heterogenea de proteinas y otros componentes biologicos. Asi, en condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteina particular y no se

25 unen en una cantidad significativa a otras proteinas presentes en la muestra. La union especifica a una proteina bajo dichas condiciones puede requerir un anticuerpo que se seleccione por su especificidad para una proteina particular. Por ejemplo, se pueden generar anticuerpos contra la proteina del amplicon 20q13 que se unen a la proteina del amplicon 20q13 y no a cualquier otra proteina presente en una muestra biologica. Se pueden utilizar una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos especificamente inmunorreactivos con una proteina

30 particular. Por ejemplo, los inmunoensayos de ELISA en fase solida se utilizan de manera rutinaria para seleccionar anticuerpos monoclonales especificamente inmunorreactivos con una proteina. Vease, Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, para una descripcion de los formatos y las condiciones de los inmunoensayos que se pueden utilizar para determinar la inmunorreactividad especifica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0049] La Figura 1(A) muestra la supervivencia libre de enfermedad de 129 pacientes con cancer de mama segun el nivel de amplificacion de 20q13. Las pacientes con tumores que presentan unos niveles elevados de amplificacion

40 de 20q13 tienen una supervivencia libre de enfermedad mas corta (p = 0,04 mediante la prueba de Mantel-Cox) en comparacion con aquellas que no presentan amplificacion o un bajo nivel de amplificacion.

La Figura 1(B) muestra la misma diferencia de supervivencia libre de enfermedad de la Figura 1(A) en el subgrupo de 79 pacientes con ganglios axilares negativos (p = 0,02 mediante la prueba de Mantel-Cox).

45 La Figura 2 muestra una comparacion de la amplificacion de 20q13 detectada mediante FISH en un carcinoma de mama primario y su metastasis en una paciente de 29 afos. Se encontro un bajo nivel de amplificacion de 20q13 (20q13 comparado con la sonda de referencia 20p) en el tumor primario. La metastasis, que aparecio 8 meses despues de la mastectomia, muestra un nivel elevado de amplificacion de la region 20q13 del cromosoma. El

50 numero total de copias del cromosoma 20 (sonda de referencia 20p) permanecio inalterado. Cada punto de los datos representa los numeros de copias genicas en celulas tumorales individuales analizadas.

La Figura 3 muestra una representacion grafica del mapeo citogenetico molecular y la posterior clonacion del amplicon 20q13.2. La distancia genetica se indica en cintiMorgans (cM). La linea negra gruesa representa la region 55 con el nivel de amplificacion mas elevado en la linea celular de cancer de mama BT474 y cubre una region de 1,5 Mb aproximadamente. Los clones P1 y BAC estan representados como lineas horizontales cortas y los clones YAC como lineas horizontales mas gruesas. No estan representados todos los clones YAC y P1. Los YACs 957f3, 782c9, 931h12, y 902 estan truncados. Los sitios de secuencia marcada (STSs) aparecen como lineas verticales finas y los circulos vacios indican que un YAC dado se ha sometido a ensayo y es positivo para un STS dado. No todos los

STSs se han probado sobre todos los YACs. El intervalo a partir del cual se han atrapado mas de 100 exones esta representado como una caja solida. El intervalo de 600 kb que abarca la region con el nivel de amplificacion mas elevado en tumores primarios esta representado mediante la caja negra solida (secuencia marcada). La parte inferior de la figura muestra los niveles de amplificacion en dos tumores primarios que acota aun mas la region con la

5 amplificacion mas elevada dentro de los 600 kb aproximadamente.

La Figura 4 proporciona un mapa con una resolucion mayor del nucleo del amplicon como se define en tumores primarios.

10 La Figura 5 muestra la localizacion en el mapa de 15 genes en el amplicon.

La Figura 6 muestra un alineamiento de secuencias entre la ciclofilina de rata y la SEQ. ID. 13.

La Figura 7 es un mapa fisico del amplicon 20q13. La columna A de la Figura muestra la posicion de STSs utilizados

15 para organizar el mapa. La columna B muestra la posicion de los YACs. La columna C muestra la posicion de los clones P1 y BAC. La columna D muestra la posicion de exones atrapados, ADNc directos seleccionados, ESTs, y genes. La columna E muestra los resultados del analisis de hibridacion de diversos tumores primarios y de lineas celulares utilizando los clones P1 o BAC como se ha indicado. Un circulo negro solido indica una amplificacion elevada, un circulo sombreado indica una amplificacion intermedia y un circulo vacio indica que no hay amplificacion

20 tal y como se detecta para cada uno de los clones.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0050] Esta invencion proporciona una serie de secuencias de ADNc que se pueden utilizar como sondas para la

25 deteccion de anomalias cromosomicas en 20q13. Estudios que utilizan hibridacion genomica comparativa (CGH) han demostrado que una region en el cromosoma 20q13 incrementa frecuentemente su numero de copias en canceres de mama (-30%), de ovario (-15%), vejiga (-30%), cabeza y cuello (-75%) y colon (-80%). Esto sugiere la presencia de uno o mas genes que contribuyen a la progresion de diversos tumores solidos que se encuentran en 20q13.

30 [0051] La amplificacion genica es un mecanismo mediante el cual se sobre-expresan oncogenes que actuan de manera dominante, permitiendo que los tumores adquieran nuevas caracteristicas de crecimiento y/o resistencia a agentes quimioterapeuticos. Los loci implicados en la progresion del cancer de mama humano y amplificados en el 10-25% de los carcinomas de mama primarios incluyen el locus erbB-2 (Lupu y col., Breast Cancer Res. Treat., 27:

35 83 (1993), Slamon y col. Science, 235: 177-182 (1987), Heiskanen y col. Biotechniques 17: 928 (1994)) en 17q12, ciclina D (Mahadevan y col., Science, 255: 1253-1255 (1993), Gillett y col., Canc. Res., 54: 1812. (1994)) en 11q13 y MYC (Gaffey y col., Mod. Pathol., 6: 654 (1993)) en 8q34.

[0052] Investigaciones pangenomicas utilizando la hibridacion genomica comparativa (CGH) han identificado

40 recientemente unas 20 nuevas regiones con un numero de copias incrementado en cancer de mama (Kallioniemi y col., Genomics, 20: 125-128 (1994)). Uno de estos loci, la banda 20q13, estaba amplificado en el 18% de tumores primarios y en el 40% de las lineas celulares (Kallioniemi y col., Genomics, 20: 125-128 (1994)). Mas recientemente, esta misma region se ha encontrado amplificada en el 15% de tumores de ovario, el 80% de tumores de vejiga y el 80% de tumores colorrectales. La resolucion de la CGH esta limitada a 5-10 Mb. Asi, la FISH se llevo a cabo

45 utilizando sondas especificas para el locus para confirmar los datos de la CGH y mapear con exactitud la region de amplificacion.

[0053] La region 20q13 ha sido analizada en cancer de mama a nivel molecular y se ha identificado una region, con una anchura de 600 kb aproximadamente, que se amplificaba de manera consistente, tal y como se ha descrito

50 en el presente documento. Ademas, como se muestra en el presente documento, la importancia de esta amplificacion en el cancer de mama esta indicada por la fuerte asociacion entre la amplificacion y la reduccion en la supervivencia de la paciente y el incremento de la proliferacion tumoral (especificamente, fraccion incrementada de celulas en fase S).

55 [0054] En particular, como se explica con detalle en el Ejemplo 1, un nivel elevado de amplificacion de 20q13 estaba asociado (p = 0,0022) con una mala supervivencia libre de enfermedad en pacientes con ganglios negativos, en comparacion con casos sin amplificacion o con un bajo nivel de amplificacion (Figura 1). La supervivencia de pacientes con tumores moderadamente amplificados no diferia significativamente de la de aquellos sin amplificacion. Sin estar limitados por ninguna teoria particular, se sugiere que una explicacion para esta observacion puede ser que un bajo nivel de amplificacion preceda a un nivel elevado de amplificacion. En este aspecto, puede ser significativo que una paciente desarrollase una metastasis local con un nivel elevado de amplificacion de 20q13.2 8 meses despues de la reseccion de un tumor primario con un bajo nivel de amplificacion (Figura 2).

5 [0055] La amplificacion de 20q13 estaba asociada a un grado histologico elevado de los tumores. Esta correlacion se observo tanto en tumores moderadamente amplificados como en tumores muy amplificados. Tambien habia una correlacion (p = 0,0085) entre el nivel de amplificacion elevado de una region complementaria a una sonda particular, RMC20C001 (Tanner y col., Cancer Res., 54: 4257-4260 (1994)), y la proliferacion celular, medida mediante la fraccion de celulas en fase S. Este hallazgo es importante debido a que identifica un fenotipo que se

10 puede puntuar en ensayos funcionales, sin saber el mecanismo que subyace en la fraccion incrementada en fase S. La amplificacion de 20q13 no estaba correlacionada con la edad de la paciente, el tamafo del tumor primario, el estado de los ganglios axilares o del receptor de hormonas esteroideas.

[0056] Este trabajo localizo el amplicon 20q13.2 en un intervalo de 2 Mb aproximadamente. Ademas, sugiere que

15 el elevado nivel de amplificacion, encontrado en el 7% de los tumores, confiere un fenotipo agresivo al tumor, que afecta de manera adversa a los resultados clinicos. El bajo nivel de amplificacion (22% de tumores primarios) estaba asociado a caracteristicas patologicas tipicas de tumores agresivos (elevado grado histologico, aneuploidia y proliferacion celular) pero no al pronostico de la paciente.

20 [0057] Ademas, en el presente documento se muestra que el amplicon 20q13 (mas precisamente el amplicon 20q13.2) es uno de los tres loci co-amplificados separados del cromosoma 20 humano que se empaquetan juntos en los genomas de algunos tumores primarios y lineas celulares de cancer de mama. Ningun oncogen conocido mapea en el amplicon 20q13.2.

25 Identificación de sondas del amplicón 20q13

[0058] Inicialmente, la escasez de sondas citogeneticas moleculares disponibles dictaba que las sondas de la FISH se generasen mediante la seleccion aleatoria de cosmidos procedentes de una libreria especifica del cromosoma 20, LA20NC01, y a continuacion se mapeasen en el cromosoma 20 mediante microscopia de imagen 30 digital. Se aislaron 46 cosmidos aproximadamente, que abarcan las 70 Mb del cromosoma, para los que se obtuvieron la medicion de la longitud fraccional (FLpter) y las asignaciones de bandas. Se utilizaron 26 de los cosmidos para someter a ensayo el numero de copias en la linea celular de cancer de mama BT474 mediante analisis de FISH en interfase. El numero de copias se determino contando las sefales de hibridacion en los nucleos en interfase. Este analisis revelo que el cosmido RMC20C001 (FLpter, 0,824; 20q13.2), descrito por Stokke y col.,

35 Genomics, 26: 134-137 (1995), definia el nivel de amplificacion mas elevado (60 copias/celula) en celulas BT474 (Tanner y col., Cancer Res., 54: 4257-4260 (1994)).

[0059] Los clones P1 que contienen secuencias geneticamente mapeadas se seleccionaron a partir de 20q13.2 y se utilizaron como sondas de la FISH para confirmar y definir adicionalmente la region de amplificacion. Se 40 seleccionaron otros clones P1 para oncogenes candidatos localizados ampliamente en la region 20q13.2 (Flpter, 0,81-0,84). Estos se seleccionaron a partir de la libreria DuPont P1 (Shepherd, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 2629 (1994), disponible comercialmente en Genome Systems), mediante PCR (Saiki y col., Science, 230: 1350 (1985)) utilizando pares de cebadores desarrollados en la region sin traducir en 3' de cada gen candidato. Se obtuvieron clones del gen especifico P1 para la proteina tirosina fosfatasa (PTPN1, Flpter 0,78), receptor de 45 melanocortina 3 (MC3R, Flpter 0,81), fosfoenolpiruvato carboxi quinasa (PCK1, Flpter 0,85), dedos de zinc de la proteina 8 (ZNF8, Flpter 0,93), proteina de union al nucleotido guanina (GNAS 1, Flpter 0,873), oncogen src (SRC, Flpter 0,669), topoisomerasa 1 (TOP1, Flpter 0,675), gen bcl-x, relacionado con bcl-2 (Flpter 0,526) y factor de transcripcion E2F-1 (FLpter 0,541). Cada clon se mapeo mediante microscopia de imagen digital y se les asigno los valores Flpter. Cinco de estos genes (SRC, TOPO1, GNAS1, E2F-1 y BC1-x) fueron excluidos como oncogenes

50 candidatos en el amplicon debido a que mapeaban muy fuera de la region critica en Flpter 0,81-0,84. Tres genes (PTPNR1, PCK-1 y MC3R) estaban localizados suficientemente proximos a la region critica para justificar una investigacion mas a fondo.

[0060] La FISH en interfase sobre 14 lineas celulares de cancer de mama y 36 tumores primarios utilizando 24

55 cosmidos y 3 sondas del gen especifico P1 (PTPNRL, PCK-1 y MC3R) tuvieron un elevado nivel de amplificacion en el 35% (5/14) de las lineas celulares de cancer de mama y el 8% (3/36) de los tumores primarios con una o mas sondas. La region con el mayor numero de copias en 4/5 de las lineas celulares y en 3/3 de los tumores primarios estaba definida por el cosmido RMC20C001. Esto indicaba que PTPNR1, PCK1 y MC3R tambien se podian excluir como candidatos para oncogenes en el amplicon y, ademas, se redujo la region critica de 10 Mb a 1,5-2,0 Mb (vease, Tanner y col., Cancer Res., 54: 4257-4260 (1994)).

[0061] Debido a que la sonda RMC20C001 detecto un nivel elevado (de 3 a 10 veces) de amplificacion de 20q13.2 en el 35% de las lineas celulares y el 8% de los tumores primarios, se utilizo para (1) definir la prevalencia de la

5 amplificacion en una poblacion tumoral expandida, (2) evaluar la frecuencia y el nivel de amplificacion en estos tumores, (3) evaluar la asociacion del amplicon 20q13.2 con caracteristicas patologicas y biologicas, (4) determinar si existe una relacion entre la amplificacion de 20q13 y los resultados clinicos y (5) evaluar la amplificacion de 20q13 en tumores de mama metastasicos.

10 [0062] Como se detalla en el Ejemplo 1, se utilizo hibridacion in situ fluorescente (FISH) con RMC20C001 para evaluar la amplificacion de 20q13.2 en 132 tumores de mama primarios y 11 tumores de mama recurrentes. Se determino el numero de copias absoluto (media del numero de sefales de hibridacion por celula) y el nivel de amplificacion (media del numero de sefales en relacion con la sonda de referencia del brazo p). Se encontraron dos tipos de amplificacion: un bajo nivel de amplificacion (1.5-3 veces con sefales de FISH dispersas por los nucleos del

15 tumor) y un nivel elevado de amplificacion (> 3 veces con sefales de FISH estrechamente agrupadas). Se encontro un bajo nivel de amplificacion de 20q13.2 en 29 de los 132 tumores primarios (22%), mientras que nueve casos (6,8%) presentaban un nivel elevado de amplificacion.

[0063] Se utilizaron RMC20C001 y cuatro sondas P1 flanqueantes (MC3R, PCK, RMC20C026, y RMC20C030)

20 para estudiar el grado de amplificacion del ADN en tumores altamente amplificados. Solo RMC20C001 se amplifico de manera consistente en todos los tumores. Este hallazgo confirmo que la region de amplificacion comun esta dentro de un intervalo de 2 Mb flanqueado por, pero que no incluye a, PCK-1 y MC3R.

[0064] Se organizo un mapa fisico para acotar la region comun minima de amplificacion y aislar el oncogen(es)

25 postulado. La libreria DuPont P1 (Shepherd y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2629 (1994) se sometio a seleccion para STSs que mapearan con probabilidad en la banda 20q13.2. Se aislaron los clones P1 en los loci D20S102, D20S100, D20S120, D20S183, D20S480, D20S211, y la FISH localizo a cada uno en 20q13.2. A continuacion se llevo a cabo un analisis de FISH en interfase en la linea celular de cancer de mama BT474 para evaluar el nivel de amplificacion en cada locus. Los loci D20S100, D20S120, D20S183, D20S480, D20S211 estaban

30 muy amplificados en la linea celular BT474, mientras que D20S102 detecto solo a un bajo nivel de amplificacion. Por lo tanto, se localizaron 5 STSs, que abarcan 5 cM, dentro del amplicon 20q13.2 y se utilizaron para someter a seleccion a la libreria CEPH megaYAC.

[0065] La seleccion de la libreria CEPH megaYAC y busquedas por ordenador de bases de datos publicas

35 revelaron que D20S120-D20S83-D20S480-D20S211 estan relacionados en cada uno de los tres clones megaYAC; y820f5, 773h10 y 931h6 (Figura 3). Ademas, la seleccion de la libreria CEPH megaYAC con los STSs generados a partir de los extremos de los cosmidos RMC20C001, RMC20C30 y RMC20C028 localizo RMC20C001 en cada uno de los mismos tres clones YAC. Se estimo, basandose en el tamafo del mas pequefo de estos clones YAC, que D20S120-D20S183-RMC20C001-D20S480-D20S211 mapean en un intervalo de menos de 1,1 Mb. D20S100 estaba

40 localizado a 300 kb distal a D20S120 por FISH en interfase y a YAC901b12 por mapeo de STS. Los datos de los STS combinados hicieron posible la construccion de un contigo YAC de 12 miembros que abarca 4 Mb aproximadamente que engloba al amplicon de 1,5 Mb y que contiene los loci RMC20C030-PCK1-RMC20C001-MC3R-RMC20C026. Cada YAC se mapeo por FISH para confirmar la localizacion en 20q13.2 y para comprobar la existencia de quimerismo. Se clasificaron por tamafos cinco aislados clonales de cada YAC mediante electroforesis

45 en gel de campo pulsado (PFGE). Ninguno de los YACs son quimericos, sin embargo, varios son muy inestables.

[0066] El contigo YAC sirvio como base a partir del cual construir un contigo P1 de 2 Mb que abarca el amplicon 20q13. Los clones P1 ofrecian numerosas ventajas sobre los clones YAC, incluyendo (1) estabilidad, (2) una frecuencia quimerica inferior al 1%, (3) aislamiento del ADN mediante procedimientos MiniPrep estandar, (4) son

50 sondas de FISH ideales, (5) los extremos se pueden secuenciar directamente, (6) los transposones yo manipulados geneticamente que portan sitios de union de cebadores bidireccionales se pueden integrar en cualquier posicion del ADN clonado (Strathmann y col., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 88: 1247 (1991)) (7) los clones P1 son los moldes para la secuenciacion de los genomas del ser humano y de Drosophila en el LBNL HGC (Palazzolo y col. DOE Human Genome Program, Contractor-Grantee Workshop IV. Santa Fe, Nuevo Mexico, 13-17 noviembre, 1994).

55 [0067] Se aislaron aproximadamente 90 clones P1 sometiendo a seleccion a la libreria DuPont P1 por PCR o hibridacion en filtro. Para la seleccion basada en la PCR, se crearon mas de 22 nuevos STSs mediante dos procedimientos. En el primer procedimiento, se secuenciaron los extremos de los clones P1 localizados en el amplicon, se crearon los STSs, y la libreria P1 se sometio a seleccion para paseo clonico. En el segundo enfoque,

se llevo a cabo una PCR inter-Alu (Nelson y col., 86: 6686-6690 (1989)) sobre YACs que abarcan el amplicon y los productos se clonaron y se secuenciaron para la creacion de STS. En el esquema de hibridacion basada en filtros, se tuvieron clones P1 llevando a cabo PCR inter-Alu sobre YACs que abarcan el amplicon, radiomarcando los productos e hibridando estos contra filtros que contienen un biochip reticulado de la libreria P1. Por ultimo, para 5 tapar los huecos se sometio a seleccion mediante PCR a una libreria de cromosomas bacterianos artificiales (BAC) genomicos humanos (Shizuya y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8794 (1992), disponible comercialmente en Research Genetics, Huntsville, Alabama, EE.UU.). Estos procedimientos combinados para producir mas de 100 clones P1 y BAC se localizaron en 20q13.2 mediante FISH. Se utilizo el mapeo para el contenido en STS, las huellas dactilares y la FISH libre de cromatina (Heiskanen y col., BioTechniques, 17: 928 (1994)) para construir el

10 contigo de 2 Mb mostrado en la Figura 3 y en la Figura 4. La Figura 7 es un segundo mapa fisico de la region que muestra un contigo con un camino de recubrimiento minimo.

Mapeo fino del amplicón 20q13.2 en BT474

15 [0068] Se utilizaron clones procedentes del contigo P1 de 2 Mb con la FISH para mapear el nivel de amplificacion en 20q13.2 en la linea celular de cancer de mama BT474. Se utilizaron 35 sondas P1 distribuidas a intervalos regulares a lo largo del contigo. Los datos resultantes indicaban que la region con el mayor incremento en el numero de copias en BT474 se produce entre D20S100 y D20S211, un intervalo de 1,5 Mb aproximadamente. Las sondas de la FISH P1, en este intervalo, detectan una media de 50 sefales por nucleos en interfase en BT474, mientras que

20 no se detecto ninguna, o solo un bajo nivel de amplificacion, con los clones P1 fuera de esta region. Asi, se clonaron tanto los limites proximales como distales del amplicon.

Mapeo fino del amplicón 20q13.2 en tumores primarios

25 [0069] El mapeo fino del amplicon en tumores primarios revelo la region comun minima de elevada amplificacion (MCA) que tiene importancia patobiologica. Este proceso es analogo a la seleccion para la meiosis informativa en el acotamiento de los intervalos geneticos que codifican genes patologicos heredables. El analisis de 132 tumores primarios revelo que en el locus RMC20C001 se amplifican 38 tumores primarios. Nueve de estos tumores presentan un nivel elevado de amplificacion en el locus RMC20C001 y se analizaron en profundidad mediante FISH

30 en interfase con 8 P1 que abarcan el contigo de ' 2 Mb. La region comun minima de amplificacion (MCA) se mapeo en un intervalo de ' 600 kb flanqueado por los clones P1 #3 y #12, con el nivel de amplificacion mas elevado detectado para el clon P1 #38 correspondiente a RMC20C001 (Figuras 3 y 7).

[0070] Los clones P1 y BAC que abarcan el intervalo de 600 kb del amplicon 20q13 se listan en las Tablas 1 y 2

35 que proporcionan una referencia cruzada a la libreria DuPont P1 descrita por Shepherd, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 2629 (1994). Estas sondas P1 y BAC estan disponibles comercialmente en Genetic Systems, y en Research Genetics, respectivamente).

Tabla I. Referencia cruzada a sondas de la libreria DuPont P1 (Shepherd, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:2629

40 (1994), que esta disponible comercialmente en Genomic Systems, St. Louis, Missouri, EE.UU.). Se ilustran los cebadores de la PCR para la amplificacion de los sitios de secuencia marcada para cada clon. Ademas, se proporcionan las condiciones de la PCR (concentracion de Mg y temperatura de hibridacion), asi como el tamafo del producto de la PCR. Tamafo: El tamafo del producto de la PCR; MgCl mM: concentracion de Mg; Ann: Temperatura de hibridacion; P1: numero de identificacion de la Sonda P1; PC: Coordenadas de la libreria DuPont; SCA: Direccion

45 de un clon unico de la libreria DuPont; SEQ-directa y SEQ-inversa: cebadores de la PCR directo e inverso, respectivamente; SEQ ID NO:-directa y SEQ ID NO:-inversa: Listado de secuencias SEQ ID NO: para los cebadores directo e inverso, respectivamente.

NOMBRE DELSEQ SEQ CEBADOR TAMA�OMgClID ID

Ann. PI PC SCA SEQ-directa SEQ-inversa

(pb) mM NO:-NO:directa inversa

352.32 136 1,5 52 20 103.5 1228e TTGGCATTGGTATCAGGTAGCTG TTGGAGCAGAGAGGGGATTGTGTG 1 2

FI/BI 388.13201 1,5 52 17 69g6 821 AATCCCCTCAAACCCTGCTGCTAC TGGAGCCTGAACTTCTOCAATC 3 4 19 98f4 1167f ----D20S183 270 3 48 30 124g6 CCCGGATACCGACATTG TGCACATAAAACAGCCACC 5 6 40 24hl 276h ----D20S211 � 135 1 5 52 29 119f4 1418f TTGAAATCAATGGAGCAAAA AGCITTACCCAATGTGGTCC 7 8 D205480 300 3 55 68 100d12 1199d2 GTGGTGAACACCAATAAATGG AAGCAAATAAAACCAATAAACTCG 9 10

41 86c1 1020c - --

2 103d9 1232d - ---

67 91b2 1081b9 ---9�-SP6 hmF/hmB 165 1,5 55 7 31d11 370d CAAGATCTGACCCCUTCAATC GACTTCTTCAGGAAAGAGATCAGTG 11 12

9 3519 416f ---11S-17 F2/B4 146 3 58 11 41b1 480b GCCATGTACCCACCTGAAAAATC TCAGAACACCCGTGCAGAATTAAG 13 14 12T-T7 F2/BI 153 3 58 12 42c2 493c CCTAAAACTTGGTGCTTAAATCTA CTCTCACAAGGCAGATGTGG 15 16. 28T FI/BI 219 1,5 52 74 888f2 TTTGTGTATGTTGACCCATC CTCCAATCTCATTCTATGAGG 17 18

2 12c6 137c - --

13

25 118c11 1413c ---26 118c11 1413c ---

285 FI/B3 214 1,5 55 28 118g11 1413g GCTTGTTT AAGTGTCACT AGGG CACTCTGGTAAATGACCTTTGTC 19 20 25 118c11 1413c ---27 118g11 1413g ----10 36f10 429f ----

69S 100 3 55 69 412b5 CCTACACCATTCCAACTTrGO GCCAGATGTATGTTTGCTACGGAAC 21 22 5 23c1 264c ----HSCOFH032 F/B 129 1,5 55 3 12-c11 142e TCTCAAACCTGTCCACTTCTTG CTGCTGTGGTGGAGAATGG 23 24 18 77a10 921a ----60Al 191 1,5 58 36 112g8 1139g TOTCCTCCTTCTCCCTCATCCTAC AATGCCTCCACTCACAGGAATd 25 26 39 34a6 401a --8205AIT F1/B1 175 1,5 48 15 53c7 630c CCTCTTCAOTCTCTTCCTATGA GOGAGGAGGTTOTAGGCAAC 27 28 16 58b9 692b ----10311f33T7F31/B3 185 1141D7 Tabla II. Referencia cruzada a sondas de la libreria BAC. Clon # se refiere al numero del clon proporcionado, por ejemplo, en las Figuras 3, 4 y 7, aunque las coordenadas

14

Tabla II. Referencia cruzada a sondas de la libreria BAC. Clon # se refiere al numero del clon proporcionado, por ejemplo, en las Figuras 3, 4 y 7, aunque las coordenadas de la placa de matriz son las coordenadas de la placa de la libreria BAC de Research Genetics. Tamafo: Tamafo del producto de la PCR; MgCl mM: concentracion de Mg; Ann: Temperatura de hibridacion; BAC #: Numero de identificacion de la sonda BAC; SEQ-directa y SEQ-inversa:

5 cebadores de la PCR directo e inverso, respectivamente; SEQ ID NO:-directa y SEQ ID NO:-inversa: Listado de secuencias SEQ ID NO: para los cebadores directo e inverso, respectivamente.

SEQ ID SEQ ID

NOMBRE DELTAMA O MgClCoordenadas de la Ann. BAC. SEQ-directa SEQ-inversa NO:-NO:-

CEBADOR (pb) mM placa del BAC

directa inversa 18T Ft/B1 156 3 62 99 L11 I placa 146 AGCAAAGGCAAATGGCACACAC TGACATGGGAGAAGACACACTTCC 29 30 95 FI/BI 214 1,5 55 97 E8 placa 183 AGGTRTACCAATGTGTTTGG TCTACATCCCATTCTCTTCTG 31 32 0205480 300 3 55 95 H15 placa 140 GTGGTOAACACCAATAAATGG AAGCAAATAAAACCAATAAACTCO 9 10 D20S211 1/2 135 15 5 52 103 A15 placa 188 TRGGAATCAATGGACCAAAA AGCMACCCAATGTGTCC 7 8

102 Al placa 46 ----115-17 F2/84 146 3 58 100 E4 placa 43 GCCATGTACCCACCTGAAAAATC TCAGAACACCCGTAACAGAATTAAG 13 14

101 15 placa 118 ----CYP14 87 J14 placa 96 ET4211 104 104 C10 placa 754 ET03.17 121 C10 placa 10 D205902 166 14 placa 226 180-R FI/BI 188 021 placa 163 164-IFf/h2 197 N13 placa 309

16

Secuencias de ADNc procedentes del amplicón 20q13

[0071] Se realizo el atrapamiento del exon (vease, por ejemplo, Duyk y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 89958999 (1990) y Church y col., Nature Genetics, 6: 98-105 (1994)) sobre los clones P1 y BAC que abarcan la region 5 comun minima de amplificacion de 600 kb y se han aislado mas de 200 exones.

[0072] El analisis de la secuencia de ADN de los exones revelo un numero de similitudes de secuencia (85% a 96%) con secuencias de ADNc parcial en la base de datos (dbest) de la secuencia expresada y con un marco de lectura abierto del cromosoma IV de S. cerevisiae. Cada clon P1 sometido al atrapamiento exonico ha producido 10 multiples exones que constan de al menos una densidad media de genes. Se han atrapado y analizado mas de 200 exones, y se han aislado 200 clones mediante seleccion directa a partir de una libreria de ADNc en BT474. Ademas se esta secuenciando un intervalo genomico de 0,6 Mb que abarca el amplicon minimo descrito a continuacion. La prediccion exonica y la modelizacion genica se llevo a cabo con las aplicaciones GRAIL, SORFIND, y BLAST. Los fragmentos genicos identificados mediante estos enfoques se han analizado mediante RT-PCR, y transferencias de

15 Northern y Southern. De esta forma se identificaron 15 genes unicos (vease, Tabla 3 y Figura 5).

[0073] Ademas tambien se demostro que otros dos genes ZABC1 (SEQ. ID. No. 9 y 10) y 1b1 (SEQ. ID. No. 12) se sobre-expresan en una variedad de celulas cancerosas diferentes.

20 [0074] A continuacion se proporciona la informacion de secuencia procedente de diversos clones de ADNc. Son los siguientes:

3bf4 (SEQ. ID. No. 1) -trascrito de 3 kb con una identidad de secuencia con el gen de la tirosina quinasa, denominado A6, descrito en Beeler y col., Mol. Cell. Biol. 14:982-988 (1994) y en el documento WO 95/19439. No

25 obstante, estas referencias no describen que el gen este localizado en el amplicon del cromosoma 20.

1b11 (SEQ. ID. No. 2) -un trascrito de aproximadamente 3,5 kb cuya expresion muestra una gran correlacion con el numero de copias del amplicon. La secuencia no muestra homologia con secuencias de las bases de datos investigadas.

30 cc49 (SEQ. ID. No. 3) - un trascrito de 6-7 kb que presenta homologia con los genes de los dedos de cinc C2H2.

cc43 (SEQ. ID. No. 4) -un trascrito de 4 kb aproximadamente que se expresa en tejidos normales, pero cuya expresion en la linea celular de cancer de mama no ha sido detectada.

41.1 (SEQ. ID. No. 5) - presenta homologia con el gen de la homeocaja T en Drosophila.

GCAP (SEQ. ID. No. 6) -codifica una proteina que activa la guanino ciclasa que esta involucrada en la biosintesis del AMP ciclico. Como se explica con detalle a continuacion, las secuencias procedentes de este gen tambien se

40 pueden utilizar para el tratamiento de la degeneracion de retina.

1b4 (SEQ. ID. No. 7) - una serina-treonina quinasa.

20sa7 (SEQ. ID. No. 8) - un homologo del gen de rata, BEM-1.

45 [0075] Ademas, se proporciona la secuencia completa de nucleotidos para ZABC-1. ZABC-1 significa dedos de cinc amplificados en cancer de mama. Este gen mapea en el centro del amplicon 20q13.2 y se sobre-expresa en tumores primarios y en lineas celulares de cancer de mama que presentan amplificacion de 20q13.2. La secuencia genomica (SEQ. ID. No. 9) incluye 2 kb aproximadamente de la region promotora. La SEQ ID. No. 10 proporciona el

50 marco de lectura abierto derivado de la secuencia de ADNc y la SEQ ID. No. 11 proporciona la secuencia proteica predicha. Los genes que contienen dedos de cinc a menudo son factores de transcripcion que funcionan para modular la expresion de los genes en direccion 3'. Muchos oncogenes conocidos son, de hecho, genes que contienen dedos de cinc.

55 [0076] En el presente documento se describe la secuencia de ADNc de longitud completa para un ADNc denominado 1b1 (SEQ. ID. No. 12) que tambien se sobre-expresa en numerosas lineas celulares de cancer de mama y en algunos tumores primarios.

[0077] La SEQ ID NO: 13 proporciona una secuencia procedente de un clon genomico que es similar a ADNc conocidos de ciclofilina de rata y raton. Los acidos nucleicos de ciclofilina de rata (por ejemplo, ADNc) son conocidos; vease, GenBank™ con el N° de acceso M19533; los acidos nucleicos de ciclofilina de raton (por ejemplo, ADNc) son conocidos; vease GenBank™ con el N° de acceso 50620 (vease, Figura 6). Por consiguiente, la SEQ ID NO: 13 es un gen putativo de la ciclofilina humana. La secuencia tambien esta asociada a secuencias amplificadas a

5 partir de 20q13, y se puede utilizar como sonda o diana para la hibridacion de sondas para detectar la amplificacion de ADN, o la sobre-expresion de ARN del gen correspondiente.

Tabla 3. Fragmentos genicos identificados mediante el atrapamiento de exones y analizados mediante RT-PCR, y transferencias de Northern y Southern.

# de ID del Tamafo del Identidad de la EST Secuencia Homologias de la Ubicacion del Mapa gen trascrito (kb) (>95%) clonada (kb) proteina mapa

1

20sa7 - Si 3 PTP 3, 18, 99

2

1b11 3,5 No 1,5 nueva 18, 3, 99, 69

3

200.1 - - - - -

4

132.1 - - - nueva 132

5

132.2 - - - - 132

6

3bf4 3 Si 3 PTK ambigua

7

7.1 - - - - 7, 11, 97

8

7.2 2,4 - - - 7, 11, 97

9

cc49 7,4 Si 3,6 Proteina 97, 103

10

cc43 1,4 Si 1,8 hipotetica de levadura 97, 7, 11

de Kruppel

11

et1807 2,5 Si 0,7 nueva 97, 9

12

et2106 Ninguno Si - - 95, 39. 38

13

41.1 detectado Si 3 Gen 95, 41, 42

14

67.1 7, 8, 11 Si 2Kb homeotico 67

15

67.2 Si - Proteina reg. 67

0

del GMPc

Proteínas del amplicón 20q13

[0078] Como se ha indicado anteriormente, en el presente documento se describen proteinas codificadas por

15 secuencias de acidos nucleicos en el amplicon 20q13 (por ejemplo, SEQ. ID. Nos: 1-10 y 12-13) y subsecuencias, mas preferentemente subsecuencias con una longitud de al menos 10 aminoacidos, preferentemente de al menos 20 aminoacidos, y lo mas preferentemente de al menos 30 aminoacidos. Subsecuencias particularmente preferidas son epitopos especificos para las proteinas 20q13, mas preferentemente epitopos especificos para las proteinas ZABCl y 1b1. Dichas proteinas incluyen, pero no estan limitadas a polipeptidos aislados que comprenden al menos

20 10 aminoacidos contiguos procedentes de un polipeptido codificado por los acidos nucleicos de las SEQ. ID No. 1-10 y 12-13 o procedente del polipeptido con la SEQ. ID. No. 11 en el que el polipeptido, cuando se presenta en forma de inmunogeno, desencadena la produccion de un anticuerpo que se une especificamente a un polipeptido seleccionado del grupo constituido por un polipeptido codificado por los acidos nucleicos de las SEQ. ID No. 1-10 y 12-13 o del polipeptido con la SEQ. ID. No. 11 y el polipeptido no se une a antisuero generado contra un polipeptido seleccionado del grupo constituido por un polipeptido codificado por los acidos nucleicos de las SEQ. ID No. 1-10 y 12 o del polipeptido de la SEQ. ID. No. 11 que ha sido completamente inmunoabsorbido con un polipeptido seleccionado del grupo constituido por un polipeptido codificado por los acidos nucleicos de las SEQ. ID No. 1-10 y

5 12-13 o del polipeptido de la SEQ. ID. No. 11.

[0079] Una proteina que se une especificamente o que es especificamente inmunorreactiva a un anticuerpo generado contra un inmunogeno definido, tal como un inmunogeno constituido por la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO 11 se determina en un inmunoensayo. El inmunoensayo utiliza un antisuero policlonal que se genera

10 para la proteina de la SEQ ID NO 11 (el polipeptido inmunogeno). Este antisuero se selecciona para que tenga una baja reactividad cruzada contra otros polipeptidos similares conocidos y cualquiera de dicha reactividad cruzada se elimina mediante inmunoabsorcion antes de su utilizacion en el inmunoensayo (por ejemplo, mediante inmunoabsorcion del antisuero con el polipeptido relacionado).

15 [0080] Con el fin de producir un antisuero para su utilizacion en un inmunoensayo, el polipeptido, por ejemplo, el polipeptido de la SEQ ID NO 11 se aisla como se ha descrito en el presente documento. Por ejemplo, la proteina recombinante se puede producir en una linea celular de mamifero u otra eucariota. Una cepa endogamica de raton se inmunizo con la proteina de la SEQ ID NO 11 utilizando un adyuvante habitual, tal como adyuvante de Freund, y un protocolo de inmunizacion de raton habitual (vease, Harlow y Lane, mas arriba). Alternativamente, se utilizo como

20 inmunogeno un polipeptido sintetico derivado de las secuencias descritas en el presente documento y conjugado a una proteina portadora. Los sueros policlonales se recogieron y se titularon frente al polipeptido inmunogeno en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo en fase solida con el inmunogeno inmovilizado sobre un soporte solido. Se selecciono y se probo antisuero policlonal con un titulo de 104 o superior para su reactividad cruzada frente a polipeptidos conocidos utilizando un inmunoensayo de union competitiva tal como el descrito en Harlow y

25 Lane, mas arriba, en las paginas 570-573. Preferentemente, junto con el polipeptido inmunogeno se utiliza mas de un polipeptido conocido en esta determinacion.

[0081] Los polipeptidos conocidos se pueden producir en forma de proteinas recombinantes y se pueden aislar utilizando tecnicas habituales en biologia molecular y quimica de proteinas, como se describe en el presente

30 documento.

[0082] Se utilizaron inmunoensayos en formato de union competitiva para la determinacion de la reactividad cruzada. Por ejemplo, el polipeptido inmunogeno se inmovilizo en un soporte solido. Las proteinas afadidas al ensayo compiten con la union del antisuero al antigeno inmovilizado. La capacidad de las proteinas para competir

35 con la union del antisuero a la proteina inmovilizada se compara con la del polipeptido inmunogeno. Se calculo el porcentaje de reactividad cruzada para la proteina, utilizando calculos habituales. Se seleccionan y se reunen los antisueros con menos del 10% de reactividad cruzada con los polipeptidos conocidos. A continuacion los anticuerpos que producen una reaccion cruzada se extraen del antisuero reunido mediante inmunoabsorcion con polipeptidos conocidos.

40 [0083] A continuacion el antisuero inmunoabsorbido y reunido se utiliza en un inmunoensayo de union competitiva como se describe en el presente documento para comparar un polipeptido "diana" con el polipeptido inmunogeno. Para realizar esta comparacion, cada uno de los dos polipeptidos se sometio a ensayo en un amplio espectro de concentraciones y se determino la cantidad necesaria de cada polipeptido para inhibir el 50% de la union del

45 antisuero a la proteina inmovilizada utilizando tecnicas habituales. Si la cantidad necesaria de polipeptido diana es inferior al doble de la cantidad requerida de polipeptido inmunogeno, entonces se dice que el polipeptido diana se une especificamente a un anticuerpo generado para la proteina inmunogena. Como determinacion final de la especificidad, el antisuero reunido se inmunoabsorbe completamente con el polipeptido inmunogeno hasta que en la inmunoabsorcion no se puede detectar la union al polipeptido utilizado. A continuacion el antisuero completamente

50 inmunoabsorbido se somete a ensayo para su reactividad con el polipeptido de prueba. Si no se observa reactividad, entonces el polipeptido de prueba se une especificamente al antisuero generado contra la proteina inmunogena.

[0084] De forma similar, en un experimento reciproco, el antisuero reunido se inmunoabsorbio con el polipeptido de prueba. Si el antisuero que permanece despues de la inmunoabsorcion no se une al polipeptido inmunogeno (es

55 decir, el polipeptido de la SEQ ID NO: 11 utilizado para generar el antisuero), entonces el polipeptido de prueba se une especificamente al antisuero generado contra el peptido inmunogeno.

Detección de anomalías en 20q13

[0085] La persona experta en la materia apreciara que la informacion de los clones y de las secuencias proporcionadas en el presente documento se puede utilizar para detectar amplificaciones, u otras anomalias cromosomicas, en 20q13 en una muestra biologica. En general, los procedimientos suponen la hibridacion de sondas que se unen especificamente a una o mas secuencias de acidos nucleicos del amplicon diana con acidos

5 nucleicos presentes o procedentes de una muestra biologica.

[0086] Como se usa en el presente documento, una muestra biologica es una muestra de tejido o fluido biologico que contiene celulas que se desea someter a seleccion para la determinacion de anomalias cromosomicas (por ejemplo, amplificaciones o eliminaciones). En una forma de realizacion preferida, la muestra biologica es una celula 10 o tejido sospechoso de ser canceroso (transformado). Los procedimientos de aislamiento de muestras biologicas son muy conocidos por las personas expertas en la materia e incluyen, pero no estan limitados a, aspiraciones, secciones de tejido, biopsias con aguja, y similares. Frecuentemente la muestra sera una "muestra clinica" que es una muestra procedente de un paciente. Se reconocera que el termino "muestra" tambien incluye el sobrenadante (que contiene celulas) o las propias celulas procedentes de cultivos celulares, celulas procedentes de cultivos de

15 tejidos u otros medios en los que pueda ser deseable detectar anomalias cromosomicas.

[0087] En algunas formas de realizacion, se prepara una muestra cromosomica depositando celulas, ya sea en forma de suspensiones de celulas unicas o en forma de preparacion de tejido, sobre soportes solidos tales como portaobjetos de vidrio y fijadas seleccionando un fijador que proporcione la mejor resolucion espacial de las celulas y

20 la eficacia de hibridacion optima. En otras formas de realizacion, la muestra se pone en contacto con un biochip de sondas inmovilizadas sobre una superficie solida.

Preparación de sondas

25 [0088] Cualquiera de las sondas P1 listadas en la Tabla 1, las sondas BAC listadas en la Tabla 2, y los ADNc descritos en el presente documento son adecuados para su utilizacion en la deteccion del amplicon 20q13. Los procedimientos de preparacion de sondas son muy conocidos por los expertos en la materia (vease, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)

o Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel y col., Ed. Greene Publishing y Wiley Interscience, Nueva York 30 (1987)).

[0089] Dada la estrategia para la preparacion de los acidos nucleicos de la presente invencion, la persona experta puede construir una variedad de vectores y clones de acidos nucleicos que contengan acidos nucleicos funcionalmente equivalentes. La metodologia de clonacion para conseguir estos fines y los procedimientos de 35 secuenciacion para verificar la secuencia de los acidos nucleicos son muy conocidos en la materia. Ejemplos de tecnicas de clonacion y secuenciacion adecuadas, e instrucciones suficientes para guiar a personas expertas a traves de muchos ejercicios de clonacion se pueden encontrar en Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2a ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor 40 Press, NY, (Sambrook); y Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausubel y col., Eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento de 1994) (Ausubel). La informacion del producto obtenido de los fabricantes de reactivos biologicos y equipos experimentales tambien resulta util en procedimientos biologicos conocidos. Dichos fabricantes incluyen la empresa de productos quimicos SIGMA (Saint Louis, MO), R & D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway,

45 NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza), Invitrogen, San Diego, CA, y Applied Biosystems (Foster City, CA), asi como muchas otras fuentes comerciales conocidas por la persona experta.

50 [0090] Los acidos nucleicos descritos en el presente documento, ya sea ARN, ADNc, ADN genomico, o un hibrido de las diversas combinaciones, se aislan a partir de fuentes biologicas o se sintetizan in vitro. Los acidos nucleicos y vectores pueden estar presentes en celulas enteras transformadas o transfectadas, en lisados celulares transformados o transfectados, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura.

55 [0091] Son conocidas las tecnicas de amplificacion in vitro adecuadas para la amplificacion de secuencias para proporcionar un acido nucleico, o para su posterior analisis, secuenciacion o subclonacion. Ejemplos de tecnicas suficientes para guiar a personas expertas a traves de dichos procedimientos de amplificacion in vitro, que incluyen la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), la reaccion en cadena de la ligasa (LCR), la amplificacion de la replicasa Q� y otras tecnicas mediadas por la ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA), se encuentran en Berger, Sambrook, y Ausubel, asi como en Mullis y col. (1987), Patente de EE.UU. N° 4.683.202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis y col. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (1 de octubre de 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3, 81-94; (Kwoh y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173; Guatelli y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell y col. (1989) J. Clin.

5 Chem 35, 1826; Landegren y col., (1988) Science 241, 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8, 291-294; Wu y Wallace, (1989) Gene 4, 560; Banger y col. (1990) Gene 89, 117, y Sooknanan y Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564. En Wallace y col., Patente de EE.UU. N° 5.426.039 se describen procedimientos mejorados de clonacion de acidos nucleicos amplificados in vitro. Procedimientos mejorados de amplificacion de acidos nucleicos grandes estan resumidos en Cheng y col. (1994) Nature 369: 684-685 y las referencias alli citadas.

10 [0092] Los acidos nucleicos (por ejemplo, oligonucleotidos) para los procedimientos de amplificacion in vitro o para su utilizacion como sondas genicas, por ejemplo, normalmente se sintetizan quimicamente segun el metodo del triester de la fosforamidita en fase solida descrito por Beaucage y Caruthers (1981), Tetrahedron Letts., 22 (20): 1859-1862, por ejemplo, usando un sintetizador automatizado, como se describe en Needham-Vandevanter y col.

15 (1984) Nucleic Acids Res., 12: 6159-6168. La purificacion de oligonucleotidos, cuando sea necesaria, normalmente se realiza mediante electroforesis en gel de acrilamida nativa o mediante HPLC de intercambio anionico como se describe en Pearson y Regnier (1983) J. Chrom. 255:137-149. La secuencia de los oligonucleotidos sinteticos se puede verificar utilizando el metodo de degradacion quimica de Maxam y Gilbert (1980) en Grossman y Moldave (eds.) Academic Press, Nueva York, Methods in Enzymology 65:499-560.

20 [0093] Las sondas son mas faciles de preparar combinando y marcando una o mas de las construcciones listadas en las Tablas 1 y 2. Antes de su uso, las construcciones se fragmentan para proporcionar fragmentos de acidos nucleicos mas pequefos que penetran facilmente en la celula y se hibridan al acido nucleico diana. La fragmentacion se puede realizar mediante cualquiera de una serie de procedimientos muy conocidos por los

25 expertos en la materia. Los procedimientos preferidos incluyen el tratamiento con una enzima de restriccion para escindir selectivamente las moleculas, o alternativamente el tratamiento termico de los acidos nucleicos durante un corto periodo de tiempo en presencia de Mg2+. La sonda se fragmenta preferentemente hasta una longitud media del fragmento que abarca entre las 50 pb aproximadamente y las 2000 pb, mas preferentemente entre 100 pb aproximadamente y 1000 pb aproximadamente, y lo mas preferentemente entre 150 pb aproximadamente y 500 pb

30 aproximadamente.

[0094] Alternativamente, la sonda se pueden producir amplificando (por ejemplo, mediante PCR) subsecuencias seleccionadas procedentes del amplicon 20q13 descrito en el presente documento. Las secuencias proporcionadas en el presente documento permiten que la persona experta seleccione cebadores que amplifiquen secuencias a

35 partir de uno o mas exones localizados dentro del amplicon 20q13.

[0095] Sondas particularmente preferidas incluyen acidos nucleicos procedentes de las sondas 38, 40, y 79, que corresponden a RMC20C001. Ademas, los ADNc son particularmente utiles para identificar celulas que presentan una expresion incrementada de los genes correspondientes, utilizando por ejemplo, analisis de transferencia de

40 Northern.

[0096] La persona experta apreciara que con la utilizacion de la informacion de secuencia y los clones proporcionados en el presente documento, el experto en la materia puede aislar las mismas sondas o similares a partir de otras librerias genomicas humanas utilizando procedimientos rutinarios (por ejemplo, transferencias de

45 Southern o Northern).

[0097] De forma similar, los polipeptidos descritos en el presente documento se pueden preparar sinteticamente mediante una amplia variedad de procedimientos muy conocidos. Por ejemplo, polipeptidos de longitud relativamente corta se pueden sintetizar en disolucion o en un soporte solido de acuerdo con tecnicas

50 convencionales. Vease, por ejemplo, Merrifeld (1963) J. Am. Chem. 85:2149-2154. Existen diversos sintetizadores automaticos que se encuentran disponibles comercialmente y se pueden utilizar de acuerdo con protocolos conocidos. Vease, por ejemplo, Stewart y Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., Pierce Chemical Co. Como se describe con mayor detalle en el presente documento, los polipeptidos aqui descritos se preparan mas preferentemente utilizando tecnicas recombinantes, por ejemplo, mediante la expresion de los polipeptidos en

55 celulas hospedadoras y la purificacion de las proteinas expresadas.

[0098] En una forma de realizacion preferida, los polipeptidos, o sus subsecuencias, se sintetizan utilizando metodologias de ADN recombinante. En general, esto supone la creacion de una secuencia de ADN que codifica la proteina, mediante tecnicas recombinantes, sinteticas, o de amplificacion in vitro, la colocacion del ADN en un casete de expresion bajo el control de un promotor particular, la expresion de la proteina en una celula hospedadora, el aislamiento de la proteina expresada y, si fuera necesario, la renaturalizacion de la proteina.

Marcaje de ácidos nucleicos

[0099] Los procedimientos de marcaje de acidos nucleicos (ya sean sondas o muestras de acidos nucleicos) son muy conocidos por los expertos en la materia. Los marcadores preferidos son aquellos que son adecuados para su utilizacion en hibridacion in situ. Las sondas o muestras de acidos nucleicos descritas en el presente documento se pueden marcar de manera detectable antes de la reaccion de hibridacion. Alternativamente, se puede utilizar un

10 marcador detectable que se una al producto de hibridacion. Dichos marcadores detectables incluyen cualquier material que presente una propiedad fisica o quimica detectable y que este muy desarrollado en el ambito de los inmunoensayos.

[0100] Como se usa en el presente documento, un "marcador" es cualquier composicion detectable por medios

15 espectroscopicos, fotoquimicos, bioquimicos, inmunoquimicos o quimicos. Marcadores utiles incluyen marcadores radiactivos (por ejemplo, 32P, 125I, 14C, 3H, y 35S), colorantes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceina, rodamina, Texas Red, etc.), reactivos densos a los electrones (por ejemplo, oro), enzimas (como las utilizadas habitualmente en un ELISA), marcadores colorimetricos (por ejemplo, oro coloidal), marcadores magneticos (por ejemplo, Dynabeads™), y similares. Ejemplos de marcadores que no se detectan directamente, pero que son detectables

20 mediante la utilizacion de marcadores directamente detectables incluyen biotina y dioxigenina, asi como haptenos y proteinas para los que hay disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales marcados.

[0101] El marcador particular utilizado no es critico, mientras no interfiera con la hibridacion in situ de la cepa. No obstante, se prefieren cepas marcadas directamente con marcadores fluorescentes (por ejemplo, fluoresceina-12

25 dUTP, Texas Red-5-dUTP, etc.) para la hibridacion de cromosomas.

[0102] Una sonda marcada directa, como se usa en el presente documento, es una sonda a la que se ha unido un marcador detectable. Debido a que el marcador directo ya esta unido a la sonda, no son necesarias etapas adicionales para asociar la sonda con el marcador detectable. En contraste, una sonda marcada indirecta es aquella

30 que porta un resto al cual se le une posteriormente un marcador detectable, normalmente despues de que la sonda se hibride con el acido nucleico diana.

[0103] Ademas, el marcador debe ser detectable en el menor numero de copias que sea posible, maximizando asi la sensibilidad del ensayo y tambien detectable por encima de cualquier sefal de fondo. Por ultimo, se debe

35 seleccionar un marcador que proporcione una sefal altamente localizada, proporcionando asi un alto grado de resolucion espacial cuando la tincion se mapea fisicamente contra el cromosoma. Marcadores fluorescentes particularmente preferidos incluyen la fluoresceina-12-dUTP y Texas Red-5-dUTP.

[0104] Los marcadores se pueden acoplar a las sondas mediante diversos medios conocidos por los expertos en

40 la materia. En una forma de realizacion preferida, las sondas de acidos nucleicos se marcaran utilizando la traslacion de mellas o la extension aleatoria del cebador (Rigby, y col. J. Mol. Biol., 113: 237 (1977) o Sambrook, y col., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1985)).

[0105] La persona experta en la materia apreciara que las sondas descritas en el presente documento no tienen

45 por que ser absolutamente especificas para la region diana 20q13 del genoma. Mas bien, las sondas estan destinadas a producir una "contraste de tincion". El "contraste" se cuantifica mediante la relacion de la intensidad de la sonda de la region diana del genoma con la de las otras porciones del genoma. Por ejemplo, se puede utilizar una libreria de ADN producida por clonacion de un cromosoma particular (por ejemplo, el cromosoma 7) como colorante capaz de tefir todo el cromosoma. La libreria contiene tanto secuencias encontradas solo en ese cromosoma, como

50 secuencias compartidas con otros cromosomas. Aproximadamente la mitad del ADN cromosomico entra dentro de cada clase. Si la hibridacion de toda la libreria fuera capaz de saturar todos los sitios de union en el cromosoma diana, el cromosoma diana seria dos veces mas brillante (relacion de contraste de 2) que los otros cromosomas, ya que contendria la sefal procedente tanto de las secuencias especificas como de las compartidas en la tincion, mientras que los otros cromosomas solo estarian tefidos por las secuencias compartidas. Por lo tanto, solo una

55 modesta disminucion en la hibridacion de las secuencias compartidas en la tincion mejoraria sustancialmente el contraste. Asi, se pueden tolerar en la tincion secuencias contaminantes que solo se hibridan con secuencias no diana, por ejemplo, las impurezas en una libreria, en la medida en que las secuencias no reduzcan el contraste de tincion por debajo de niveles utiles.

Detección del amplicón 20q13.

[0106] Como se ha explicado anteriormente, la deteccion de la amplificacion en el amplicon 20q13 es indicativa de la presencia y/o pronostico de un gran numero de canceres. Estos incluyen, pero no estan limitados a cancer de 5 mama, ovario, vejiga, cabeza y cuello, y colon.

[0107] En una forma de realizacion preferida, se detecta una amplificacion de 20q13 mediante la hibridacion de una sonda a un acido nucleico diana (por ejemplo, una muestra cromosomica) en la que se desea seleccionar para la detectar la amplificacion. Los formatos de hibridacion adecuados son muy conocidos por los expertos en la

10 materia e incluyen, pero no estan limitados a, las variaciones de transferencias de Southern, hibridacion in situ y metodos de amplificacion cuantitativos tales como la PCR cuantitativa (vease, por ejemplo, Sambrook, mas arriba, Kallioniemi y col., Proc. Natl Acad Sci USA, 89: 5321-5325 (1992), y PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Innis y col., Academic Press, Inc. N.Y., (1990)).

15 Hibridación in situ

[0108] En una forma de realizacion preferida, el amplicon 20q13 se identifica utilizando hibridacion in situ. Generalmente, la hibridacion in situ comprende las siguientes etapas principales: (1) fijacion del tejido o de la estructura biologica a analizar, (2) tratamiento de prehibridacion de la estructura biologica para aumentar la

20 accesibilidad del ADN diana, y para reducir la union no especifica, (3) hibridacion de la mezcla de acidos nucleicos al acido nucleico en la estructura biologica o tejido, (4) lavados de posthibridacion para retirar los fragmentos de acidos nucleicos no unidos en la hibridacion y (5) deteccion de los fragmentos de acidos nucleicos hibridados. El reactivo utilizado en cada una de estas etapas y sus condiciones de uso varian dependiendo de la aplicacion particular.

25 [0109] En algunas aplicaciones es necesario bloquear la capacidad de hibridacion de secuencias repetitivas. En este caso, el ADN genomico humano se utiliza como agente para bloquear dicha hibridacion. El intervalo de tamafos preferidos abarca entre 200 pb aproximadamente y 1000 pb aproximadamente, mas preferiblemente entre 400 pb aproximadamente y 800 pb aproximadamente para acidos nucleicos con traslacion de mella de doble cadena.

30 [0110] Protocolos de hibridacion para las aplicaciones particulares descritas en el presente documento se describen en Pinkel y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 9138-9142 (1988) y en el documento Pub EPO. N°

430.402. Tambien se pueden encontrar protocolos de hibridacion adecuados en Methods in Molecular Biology Vol.

33: In Situ Hybridization Protocols, K.H.A. Choo, ed., Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, (1994). En una forma

35 de realizacion particularmente preferida, se utiliza el protocolo de hibridacion de Kallioniemi y col., Proc. Natl Acad Sci USA, 89: 5321-5325 (1992).

[0111] Normalmente, es deseable el uso de la FISH de dos colores, en donde se utilizan dos sondas, cada una marcada mediante un colorante fluorescente diferente. Una sonda de prueba que se hibrida a la region de interes se

40 marca con un colorante, y una sonda control que se hibrida a una region diferente se marca con un segundo colorante. A menudo es mas util como sonda control un acido nucleico que se hibride a una porcion estable del cromosoma de interes, tal como la region del centromero. De esta forma, se pueden explicar las diferencias en la eficiencia de hibridacion entre muestras.

45 [0112] Los procedimientos de FISH para detectar anomalias cromosomicas se pueden realizar en el rango de cantidades de nanogramos de los acidos nucleicos en cuestion. Se pueden utilizar secciones tumorales embebidas en parafina, asi como material fresco o congelado. Debido a que la FISH se puede aplicar al material limitado, tambien se pueden utilizar improntas sobre portas preparados a partir de tumores primarios sin cultivar (vease, por ejemplo, Kallioniemi, A. y col., Cytogenet. Cell Genet. 60: 190-193 (1992)). Por ejemplo, se pueden utilizar pequefas

50 muestras de tejido de biopsias procedentes de tumores para improntas sobre portas (vease, por ejemplo, Kallioniemi, A. y col., Cytogener. Cell Genet. 60: 190-193 (1992)). Tambien se puede analizar un pequefo numero de celulas obtenidas por aspiracion de la biopsia o de celulas en fluidos corporales (por ejemplo, sangre, orina, esputo y similares). Para el diagnostico prenatal, las muestras adecuadas incluiran liquido amniotico y similares.

55 Otros formatos

[0113] Pueden ser utiles una serie de formatos de hibridacion. Por ejemplo, se pueden utilizar hibridaciones de Southern. En una transferencia de Southern, un ADN genomico o ADNc (normalmente fragmentado y separado en una electroforesis en gel) se hibrida con una sonda especifica para la region diana. La comparacion de la intensidad de la sefal de hibridacion procedente de la sonda para la region diana (por ejemplo, 20q13) con la sefal procedente de una sonda dirigida a un control (no amplificada) tal como ADN centromerico, proporciona una estimacion del numero relativo de copias del acido nucleico diana.

5 [0114] Otros formatos utilizan biochips de sondas o dianas a las que se hibridan las muestras de acidos nucleicos, como se describe por ejemplo, en el documento WO 96/17958. Como se usa en el presente documento, un "biochip de acidos nucleicos" es una pluralidad de elementos diana, cada uno que comprende una o mas moleculas de acidos nucleicos diana inmovilizadas sobre una superficie solida a la que se hibridan los acidos nucleicos de la sonda. Los acidos nucleicos diana de un elemento diana normalmente tendran su origen en el amplicon 20q13. Los

10 acidos nucleicos diana de un elemento diana pueden contener, por ejemplo, una secuencia de genes o clones especificos descritos en el presente documento. Se pueden utilizar elementos diana de diferentes dimensiones en los biochips descritos en el presente documento. En general, se prefieren elementos diana mas pequefos. Normalmente, un elemento diana sera inferior a 1 cm de diametro aproximadamente. Generalmente el elemento abarca entre 1 !m aproximadamente y 3 mm aproximadamente, preferentemente entre 5 !m y 1 mm

15 aproximadamente.

[0115] Los elementos diana de los biochips se pueden disponer sobre la superficie solida a diferentes densidades. Las densidades del elemento diana dependeran de una serie de factores, tales como la naturaleza del marcador, el soporte solido, y similares. La persona experta reconocera que cada elemento diana puede comprender una mezcla

20 de acidos nucleicos diana de diferentes longitudes y secuencias. Asi, por ejemplo, un elemento diana puede contener mas de una copia de un fragmento de ADN clonado, y cada copia se puede romper en fragmentos de diferentes longitudes. La longitud y complejidad de las secuencias diana no es critica. La persona experta puede ajustar estos factores para proporcionar una hibridacion y una produccion de sefal optimas para un procedimiento de hibridacion dado, y para proporcionar la resolucion necesaria entre diferentes genes o localizaciones genomicas.

25 Normalmente, las secuencias diana tendran una complejidad de entre 1 kb aproximadamente y 1 Mb aproximadamente, en algunas ocasiones entre 10 kb y 500 kb aproximadamente, y normalmente entre 50 kb aproximadamente y 150 kb aproximadamente.

Detección de mutaciones en genes procedentes del amplicón 20q13

30 [0116] Las secuencias de ADNc descritas en el presente documento tambien se pueden utilizar para detectar mutaciones (por ejemplo, sustituciones, inserciones, y eliminaciones) dentro de los genes endogenos correspondientes. La persona experta reconocera que las tecnicas de hibridacion de acidos nucleicos descritas de manera general mas arriba se pueden adaptar para detectar muchas de dichas mutaciones. Por ejemplo, en

35 ensayos de hibridacion habituales se pueden utilizar sondas de oligonucleotidos que distinguen entre las formas mutante y silvestre del gen diana. En algunas formas de realizacion se puede utilizar la amplificacion (por ejemplo, usando PCR) para incrementar el numero de copias de la secuencia diana antes de la hibridacion.

Ensayos para detectar las proteínas del amplicón 20q13

40 [0117] Como se ha indicado anteriormente, esta invencion identifica productos proteicos de genes en el amplicon 20q13 que estan asociados a diversos canceres. En particular, se ha demostrado que las proteinas 20q13 estaban sobre-expresadas en diversos canceres. La presencia o ausencia y/o nivel de expresion de proteinas 20q13 puede ser indicativo de la presencia, ausencia, o grado de un cancer. Asi, las proteinas 20q13 pueden proporcionar

45 marcadores diagnosticos utiles.

[0118] Las proteinas del amplicon 20q13 (por ejemplo, ZABC1 o 1b1) se pueden detectar y cuantificar mediante cualquiera de una serie de medios muy conocidos por los expertos en la materia. Estos pueden incluir procedimientos bioquimicos analiticos tales como electroforesis, electroforesis capilar, cromatografia liquida de alto

50 rendimiento (HPLC), cromatografia de capa fina (TLC), cromatografia de hiperdifusion, y similares, o diversos procedimientos inmunologicos tales como reacciones en liquido o en gel con precipitina, inmunodifusion (sencilla o doble), inmunoelectroforesis, radioinmunoensayo (RIA), enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA), ensayos inmunofluorescentes, transferencia de Western, y similares.

55 [0119] En una forma de realizacion preferida, las proteinas del amplicon 20q13 se detectan en una separacion electroforetica de proteinas tal como electroforesis monodimensional o bidimensional, mientras que en una forma de realizacion mas preferida, las proteinas del amplicon 20q13 se detectan utilizando un inmunoensayo.

[0120] Como se usa en el presente documento, un inmunoensayo es un ensayo que utiliza un anticuerpo que se une especificamente al analito (por ejemplo, las proteinas ZABC1 o lb1). Asi, el inmunoensayo se caracteriza por la deteccion de la union especifica de una proteina del amplicon 20q13 a un anticuerpo dirigido contra el amplicon 20q13 (por ejemplo, anti-ZABC1 o anti-1b1) en oposicion al uso de otras propiedades fisicas o quimicas para aislar, identificar, o cuantificar el analito.

5 [0121] A continuacion se describe con mas detalle una coleccion de muestras biologicas y su posterior ensayo para proteina(s) del amplicon 20q13.

A) Recogida de muestras y procesamiento

10 [0122] Las proteinas del amplicon 20q13 se cuantifican preferentemente en una muestra biologica procedente de un mamifero, mas preferentemente procedente de un paciente humano o de un animal porcino, murino, felino, canino, o bovino. Como se usa en el presente documento, una muestra biologica es una muestra de tejido o fluido biologico que contiene una concentracion de la proteina del amplicon 20q13 que se puede correlacionar con una

15 amplificacion de 20q13. Las muestras biologicas particularmente preferidas incluyen, pero no estan limitadas a fluidos biologicos tales como sangre u orina, o muestras de tejido que incluyen, pero no estan limitadas a, muestras de biopsias de tejido (por ejemplo, biopsia con aguja).

[0123] La muestra biologica se puede tratar previamente segun sea necesario mediante dilucion en una disolucion

20 tampon apropiada o se puede concentrar, si se desea. Se puede utilizar cualquiera de una serie de disoluciones tampon acuosas patron, empleando cualquiera de una serie de tampones, tales como tampon fosfato, Tris, o similares, a pH fisiologico.

B) Ensayos electroforéticos

25 [0124] Como se ha indicado anteriormente, la presencia o ausencia de proteinas del amplicon 20q13 en un tejido biologico se puede determinar utilizando procedimientos electroforeticos. Los medios para detectar proteinas utilizando tecnicas electroforeticas son muy conocidos por los expertos en la materia (vease, en general, R Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y; Deutscher, (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to

30 Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y.). En una forma de realizacion preferida, las proteinas del amplicon 20q13 se detectan utilizando electroforesis monodimensional o bidimensional. Una separacion mediante electroforesis bidimensional particularmente preferida se basa en el enfoque isoelectrico (IEF) en gradientes de pH inmovilizados para una dimension y geles de poliacrilamida para la segunda dimension. Dichos ensayos se describen en las referencias citadas y por Patton y col. (1990) Biotechniques 8: 518.

C) Ensayos inmunológicos de unión

[0125] En una forma de realizacion preferida, el amplicon 20q13 se detecta y/o cuantifica utilizando cualquiera de una serie de ensayos inmunologicos de union muy reconocidos (veanse, por ejemplo, patentes de EE.UU.

40 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288; y 4.837.168). Para una revision de los inmunoensayos generales, vease tambien Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, ed. Academic Press, Inc. Nueva York (1993); Basic and Clinical Immunology 7th Edition, Stites & Terr, eds. (1991).

[0126] Los ensayos inmunologicos de union (o inmunoensayos) normalmente utilizan un "agente de captura" para

45 unirse especificamente y, a menudo, inmovilizar al analito (en este caso el amplicon 20q13). El agente de captura es un resto que se une especificamente al analito. En una forma de realizacion preferida, el agente de captura es un anticuerpo que se une especificamente a las proteina(s) del amplicon 20q13.

[0127] El anticuerpo (por ejemplo, anti-ZABC1 o anti-1b1) se puede producir mediante cualquiera de una serie de

50 medios muy conocidos por los expertos en la materia (vease, por ejemplo, Methods in Cell Biology Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, ed. Academic Press, Inc. Nueva York (1993); y Basic and Clinical Immunology 7th Edition, Stites & Terr, eds. (1991)). El anticuerpo puede ser un anticuerpo completo o un fragmento de anticuerpo. Puede ser policlonal o monoclonal, y se puede producir exponiendo a un organismo (por ejemplo, raton, rata, conejo, etc.) a una proteina del amplicon 20q13 o a un epitopo derivado de ella. Alternativamente, el anticuerpo se puede

55 producir de novo utilizando metodologias de ADN recombinante. El anticuerpo tambien se puede seleccionar a partir de una libreria de presentacion fagica seleccionada contra el amplicon 20q13 (vease, por ejemplo, Vaughan y col. (1996) Nature Biotechnology, 14: 309-314 y las referencias alli citadas).

[0128] Los inmunoensayos tambien utilizan a menudo un agente marcador que se une especificamente y que

marca el complejo de union formado por el agente de captura y el analito. El agente marcador puede ser el mismo uno de los restos que comprenden el complejo anticuerpo/analito. Asi, el agente marcador puede ser una proteina marcada del amplicon 20q13 o un anticuerpo marcado dirigido contra el amplicon 20q13. Alternativamente, el agente marcador puede ser un tercer resto, tal como otro anticuerpo, que se une especificamente al complejo 5 anticuerpo/proteina del amplicon 20q13. En una forma de realizacion preferida, el agente marcador es un segundo anticuerpo humano que porta un marcador dirigido contra una proteina del amplicon 20q13. Alternativamente, el segundo anticuerpo dirigido contra una proteina del amplicon 20q13 puede carecer de marcador, pero en cambio, puede estar unido por un tercer anticuerpo marcado especifico para anticuerpos de las especies de las que procede el segundo anticuerpo. El segundo anticuerpo se puede modificar con un resto detectable, tal como biotina, al que se

10 puede unir especificamente una tercera molecula marcada, tal como estreptavidina marcada enzimaticamente.

[0129] Tambien se puede utilizar como agente marcador otras proteinas capaces de unir especificamente las regiones constantes de inmunoglobulinas, tales como la proteina A o la proteina G. Estas proteinas son constituyentes normales de las paredes celulares de bacterias estreptococicas. Presentan una fuerte reactividad no 15 inmunogena con las regiones constantes de las inmunoglobulinas procedentes de diversas especies. Vease, en general, Kronval, y col., J. Immunol., 111:1401-1406 (1973), y Akerstrom, y col., J. Immunol., 135:2589-2542 (1985).

[0130] A lo largo de estos ensayos, pueden ser necesarias etapas de incubacion y/o lavado despues de cada combinacion de reactivos. Las etapas de incubacion pueden abarcar desde 5 segundos aproximadamente a varias

20 horas, preferentemente desde 5 minutos aproximadamente a 24 horas aproximadamente. No obstante, el tiempo de incubacion dependera del formato del ensayo, del analito, del volumen de disolucion, de las concentraciones, y similares. Normalmente, los ensayos se llevaran a cabo a temperatura ambiente, aunque se pueden realizar en un rango de temperaturas, tales como de 10'C a 40'C.

25 1) Formatos de ensayo no competitivo

[0131] Los inmunoensayos para detectar las proteinas del amplicon 20q13 pueden ser competitivos o no competitivos. Los inmunoensayos no competitivos son ensayos en los que la cantidad de analito capturado (en este caso, el amplicon 20q13) se mide directamente. En un ensayo en "sandwich" preferido, por ejemplo, el agente de 30 captura (anticuerpos dirigidos contra una proteina del amplicon 20q13) puede estar unido directamente a un sustrato solido al que estan movilizados. A continuacion estos anticuerpos inmovilizados capturan la proteina del amplicon 20q13 presente en la muestra de prueba. A la proteina del amplicon 20q13 inmovilizada de esta forma se le une a continuacion un agente marcador, tal como un segundo anticuerpo humano que porta un marcador dirigido contra una proteina del amplicon 20q13. Alternativamente, el segundo anticuerpo dirigido contra la proteina del amplicon

35 20q13 puede carecer de marcador, pero en cambio, puede unirse a un tercer anticuerpo marcado especifico para anticuerpos de las especies de las que procede el segundo anticuerpo. El segundo anticuerpo se puede modificar con un resto detectable, tal como biotina, al que se puede unir especificamente una tercera molecula marcada, tal como estreptavidina marcada enzimaticamente.

40 2) Formatos de ensayo competitivo

[0132] En ensayos competitivos, la cantidad de analito (proteina del amplicon 20q13) presente en la muestra se mide indirectamente midiendo la cantidad de un analito afadido (exogeno) (proteinas del amplicon 20q13 tales como la proteina ZABC1 o lb1) desplazada (apartada por competicion) de un agente de captura (por ejemplo, anticuerpo

45 anti-ZABC1 o anti-1b1) por el analito presente en la muestra. En un ensayo competitivo, se afade una cantidad conocida de, en este caso, proteina del amplicon 20q13 a la muestra y la muestra se pone en contacto con un agente de captura, en este caso, un anticuerpo que se une especificamente a la proteina del amplicon 20q13. La cantidad de proteina del amplicon 20q13 unida al anticuerpo es inversamente proporcional a la concentracion de proteina del amplicon 20q13 presente en la muestra.

[0133] En una forma de realizacion particularmente preferida, el anticuerpo dirigido contra la proteina 20q13 se inmoviliza sobre un sustrato solido. La cantidad de proteina del amplicon 20q13 unida al anticuerpo se puede determinar midiendo la cantidad de amplicon 20q13 presente en un complejo proteina del amplicon 20q13/anticuerpo, o alternativamente midiendo la cantidad de proteina del amplicon 20q13 de permanece sin

55 complejar. La cantidad de proteina del amplicon 20q13 se puede detectar proporcionando una proteina marcada del amplicon 20q13.

[0134] Otro ensayo competitivo preferido es el ensayo de inhibicion del hapteno. En este ensayo, un analito conocido, en este caso la proteina del amplicon 20q13, se inmoviliza sobre un sustrato solido. Se afade una cantidad conocida de anticuerpo dirigido contra la proteina del amplicon 20q13 a la muestra, y la muestra se pone en contacto con la proteina del amplicon 20q13 inmovilizada. En este caso, la cantidad de anticuerpo dirigido contra la proteina del amplicon 20q13 unida a la proteina del amplicon 20q13 inmovilizada es inversamente proporcional a la cantidad de proteina del amplicon 20q13 presente en la muestra. De nuevo, la cantidad de anticuerpo inmovilizado

5 se puede detectar detectando la fraccion de anticuerpo inmovilizado o la fraccion de anticuerpo que permanece en disolucion. La deteccion puede ser directa, en la que el anticuerpo esta marcado, o indirecta, mediante la posterior adicion de un resto marcado que se une especificamente al anticuerpo como se ha descrito anteriormente.

3) Otros formatos de ensayo

10 [0135] En una forma de realizacion particularmente preferida, se utiliza el analisis de transferencia de Western (inmunotransferencia) para detectar y cuantificar la presencia de proteina del amplicon 20q13 en la muestra. En general, la tecnica comprende la separacion de las proteinas de la muestra mediante electroforesis en gel en base a los pesos moleculares, la transferencia de las proteinas separadas a un soporte solido adecuado (tal como un filtro

15 de nitrocelulosa, un filtro de nailon, o un filtro de nailon derivado), y la incubacion de la muestra con los anticuerpos que se unen especificamente a la proteina del amplicon 20q13. Los anticuerpos dirigidos contra la proteina del amplicon 20q13 se unen especificamente a la proteina del amplicon 20q13 sobre el soporte solido. Estos anticuerpos se pueden marcar directamente o, alternativamente, se pueden detectar posteriormente utilizando anticuerpos marcados (por ejemplo, anticuerpos de oveja marcados dirigidos contra raton) que se unen

20 especificamente al anticuerpo dirigido contra la proteina del amplicon 20q13.

[0136] Otros formatos de ensayo incluyen inmunoensayos de liposomas (LIA), que utilizan liposomas disefados para unir moleculas especificas (por ejemplo, anticuerpos) y liberar reactivos o marcadores encapsulados. A continuacion los compuestos quimicos liberados se detectan de acuerdo con tecnicas habituales (vease, Monroe y

25 col. (1986) Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34-41).

D) Reducción de unión no específica

[0137] La persona experta apreciara que a menudo es deseable reducir la union no especifica en los

30 inmunoensayos. Particularmente, cuando el ensayo implica a un antigeno o anticuerpo inmovilizado sobre un sustrato solido, es deseable minimizar la cantidad de union no especifica al sustrato. Los medios para reducir dicha union no especifica son muy conocidos por los expertos en la materia. Normalmente, esto supone el recubrimiento del sustrato con una composicion proteacea. En particular, son de uso generalizado composiciones de proteinas tales como seroalbumina bovina (BSA), leche desnatada en polvo, y gelatina, siendo preferido el uso de la leche en

35 polvo.

E) Marcadores

[0138] El marcador o grupo detectable particular utilizado en el ensayo no es critico, mientras no interfiera

40 significativamente con la union especifica del anticuerpo utilizado en el ensayo. El grupo detectable puede ser cualquier material que presente una propiedad fisica o quimica detectable. Dichos marcadores detectables estan muy desarrollados en el ambito de los inmunoensayos y, en general, se pueden aplicar la mayoria de los marcadores utiles en dichos procedimientos. Asi, un marcador es cualquier composicion detectable por medios espectroscopicos, fotoquimicos, bioquimicos, inmunoquimicos, electricos, opticos o quimicos. Los marcadores utiles

45 incluyen perlas magneticas (por ejemplo, Dynabeads™), colorantes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceina, Texas Red, rodamina, y similares), radiomarcadores (por ejemplo, 3H, 125I, 35S, 14C, o 32P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rabano, fosfatasa alcalina y otros utilizados habitualmente en ELISA), y marcadores colorimetricos tales como oro coloidal o perlas coloreadas de vidrio o plastico (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, latex, etc.).

50 [0139] El marcador se puede acoplar directa o indirectamente al componente deseado del ensayo de acuerdo con procedimientos muy conocidos en la materia. Como se ha indicado anteriormente, se pueden utilizar una amplia variedad de marcadores, cuya seleccion depende de la sensibilidad requerida, la facilidad de conjugacion con el compuesto, requerimientos de estabilidad, instrumentacion disponible, y disposiciones de eliminacion.

55 [0140] Los marcadores no radiactivos normalmente se unen por medios indirectos. En general, una molecula ligando (por ejemplo, biotina) esta covalentemente unida a la molecula. A continuacion el ligando se une a una molecula anti-ligando (por ejemplo, estreptavidina) que es inherentemente detectable o esta covalentemente unida a un sistema de sefalizacion, tal como una enzima detectable, un compuesto fluorescente, o un compuesto quimioluminiscente. Se pueden utilizar una serie de ligandos y anti-ligandos. Cuando un ligando tenga un antiligando natural, por ejemplo, biotina, tiroxina, y cortisol, se puede utilizar junto con los anti-ligandos de origen natural marcados. Alternativamente, se puede utilizar cualquier compuesto haptenico o antigenico en combinacion con un anticuerpo.

5 [0141] Las moleculas tambien se pueden conjugar directamente con compuestos que generan sefales, por ejemplo, mediante su conjugacion con una enzima o fluoroforo. Enzimas de interes como marcadores seran principalmente hidrolasas, particularmente fosfatasas, esterasas y glicosidasas, u oxido-reductasas, particularmente peroxidasas. Los compuestos fluorescentes incluyen fluoresceina y sus derivados, rodamina y sus derivados,

10 dansilo, umbeliferona, etc. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen luciferina, y 2,3-dihidroftalazindionas, por ejemplo, luminol. Para una revision de diversos sistemas marcadores o productores de sefales que se pueden utilizar, vease, patente de EE.UU. N° 4.391.904.

[0142] Los medios para detectar marcadores son muy conocidos por los expertos en la materia. Asi, por ejemplo,

15 cuando el marcador sea un marcador radiactivo, los medios para su deteccion incluyen un contador de centelleo o una pelicula fotografica como en autorradiografia. Cuando el marcador sea un marcador fluorescente, se puede detectar excitando el fluorocromo con la longitud de onda de luz adecuada y detectando la fluorescencia resultante. La florescencia se puede detectar visualmente, por medio de una pelicula fotografica, mediante el uso de detectores electronicos tales como dispositivos de carga acoplada (CCDs) o fotomultiplicadores y similares. De manera similar,

20 los marcadores enzimaticos se pueden detectar proporcionando los sustratos adecuados para la enzima y detectando el producto de reaccion resultante. Por ultimo, los marcadores colorimetricos simples se pueden detectar observando simplemente el color asociado al marcador. Asi, en diversos ensayos con tiras reactivas, el oro conjugado a menudo aparece en rosa, mientras que diversas perlas conjugadas aparecen del color de la perla.

25 [0143] Algunos formatos de ensayo no requieren la utilizacion de componentes marcados. Por ejemplo, se pueden utilizar ensayos de aglutinacion para detectar la presencia de los anticuerpos diana. En este caso, particulas recubiertas de antigeno se aglutinan mediante muestras que comprenden los anticuerpos diana. En este formato, ninguno de los componentes tiene que estar marcado y la presencia del anticuerpo diana se detecta mediante una simple inspeccion visual.

G) Sustratos

[0144] Como se ha mencionado anteriormente, dependiendo del ensayo, diversos componentes, incluyendo el antigeno, el anticuerpo diana, o el anticuerpo dirigido contra seres humanos, pueden estar unidos a una superficie 35 solida. En la tecnica se conocen numerosos procedimientos para inmovilizar biomoleculas a una variedad de superficies solidas. Por ejemplo, la superficie solida puede ser una membrana (por ejemplo, nitrocelulosa), o una placa de microtitulacion (por ejemplo, PVC, polipropileno, o poliestireno), un tubo de ensayo (de vidrio o plastico), una tira reactiva (por ejemplo, de vidrio, PVC, polipropileno, poliestireno, latex, y similares), un tubo de microcentrifuga, o una perla de vidrio o plastico. El componente deseado puede estar unido covalentemente o fijado

40 no covalentemente mediante uniones no especificas.

[0145] Se pueden utilizar una amplia variedad de polimeros organicos e inorganicos, tanto naturales como sinteticos, como material para la superficie solida. Polimeros ilustrativos incluyen polietileno, polipropileno, poli(4metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), rayon, nailon, poli(butirato de vinilo), difluoruro 45 de polivinilideno (PVDF), siliconas, poliformaldehido, celulosa, acetato de celulosa, nitrocelulosa, y similares. Otros materiales que pueden emplearse, incluyen papel, vidrios, compuestos ceramicos, metales, metaloides, materiales semiconductores, cementos o similares. Ademas, se incluyen sustancias que forman geles, tales como proteinas (por ejemplo, gelatinas), lipopolisacaridos, silicatos, agarosa y poliacrilamidas. Tambien son adecuados los polimeros que forman varias fases acuosas, tales como dextranos, glicoles de polialquileno o tensioactivos, tales 50 como fosfolipidos, sales de alquilamonio de cadena larga (12-24 atomos de carbono) y similares. Cuando la superficie solida sea porosa, se pueden utilizar diversos tamafos de poro dependiendo de la naturaleza del sistema.

[0146] Para la preparacion de la superficie, se pueden utilizar una pluralidad de diferentes materiales, particularmente en forma de laminados, para obtener diversas propiedades. Por ejemplo, se pueden utilizar

55 recubrimientos de proteinas, tales como gelatinas, para evitar uniones no especificas, simplificar la conjugacion covalente, potenciar la deteccion de las sefales, o similares.

[0147] Si se desea la union covalente entre un compuesto y la superficie, normalmente la superficie sera polifuncional o se podra polifuncionalizar. Grupos funcionales que pueden estar presentes sobre la superficie y que se pueden utilizar para la union pueden incluir acidos carboxilicos, aldehidos, grupos amino, grupos ciano, grupos etilenicos, grupos hidroxilo, grupos mercapto y similares. La manera de unir una amplia variedad de compuestos a diversas superficies es muy conocida y esta ampliamente ilustrada en la bibliografia. Vease, por ejemplo, Immobilized Enzymes, Ichiro Chibata, Halsted Press, Nueva York, 1978, y Cuatrecasas (1970) J. Biol. Chem. 245

5 3059.

[0148] Ademas de la union covalente, se pueden utilizar diversos procedimientos para la union no covalente de un componente del ensayo. La union no covalente normalmente es una absorcion no especifica de un compuesto a la superficie. Normalmente, la superficie se bloquea con un segundo compuesto para evitar la union no especifica de

10 componentes marcados del ensayo. Alternativamente, la superficie se disefa de manera que una no especificamente un componente, pero que no una significativamente otro componente. Por ejemplo, una superficie que contiene una lecitina, tal como la concanavalina A unira un compuesto que contiene carbohidratos, pero no una proteina marcada que carezca de glicosilacion. En las patentes de EE.UU. N° 4.447.576 y 4.254.082 hay una revision de diversas superficies solidas para su utilizacion en la union no covalente de componentes de ensayo.

Kits que contienen sondas del amplicón 20q13

[0149] En el presente documento se describen kits diagnosticos para la deteccion de anomalias cromosomicas en 20q13. Los kits pueden incluir una o mas sondas para el amplicon 20q13 y/o anticuerpos para el amplicon 20q13 20 (por ejemplo, anti-ZABC1 o anti-1b1) descritos en el presente documento. Adicionalmente los tics pueden incluir sondas de bloqueo, y materiales explicativos que describan como usar el contenido del kit para la deteccion de amplicones 20q13. Los kits tambien pueden incluir uno o mas de lo siguiente: diversos marcadores o agentes marcadores para facilitar la deteccion de las sondas, reactivos para la hibridacion incluyendo tampones, un propagador de la metafase, seroalbumina bovina (BSA) y otros agentes de bloqueo, dispositivos de toma de muestra

25 incluyendo agujas finas, bastoncillos de algodon, aspiradores y similares, controles de hibridacion positivos y negativos, etc.

Expresión de los clones de ADNc

30 [0150] Los polipeptidos deseados codificados se pueden expresar mediante los clones de ADNc descritos en el presente documento, o mediante la subclonacion de partes del ADNc de secuencias genomicas en una celula manipulada geneticamente de forma recombinante tales como bacterias, levaduras, insectos (especialmente empleando vectores de baculovirus), o celulas de mamifero. Se espera que los expertos en la materia conozcan los numerosos sistemas de expresion disponibles para la expresion de los ADNc. No hay ninguna intencion de describir

35 con detalle los diversos procedimientos conocidos para la expresion de proteinas en procariotas o eucariotas.

[0151] En un breve resumen, la expresion de acidos nucleicos naturales o sinteticos que codifican polipeptidos normalmente se conseguira mediante la union de manera operable del ADN o ADNc a un promotor (que sea constitutivo o inducible), seguido por la incorporacion a un vector de expresion. Los vectores pueden ser adecuados 40 para la replicacion e integracion tanto en procariotas como eucariotas. Los vectores de expresion tipicos contienen terminadores de la transcripcion y la traduccion, secuencias de iniciacion, y promotores utiles para la regulacion de la expresion del ADN que codifica los polipeptidos. Para obtener un nivel de expresion elevado de un gen clonado, es deseable construir plasmidos de expresion que contengan, como minimo, un promotor fuerte para dirigir la transcripcion, un sitio de union a ribosomas para el inicio de la traduccion, y un terminador de la

45 transcripcion/traduccion.

[0152] Ejemplos de regiones reguladoras adecuadas para este proposito en E. coli son la region promotora y operadora de la ruta biosintetica del triptofano en E. coli como describe Yanofsky, C., 1984, J. Bacteriol., 158:10181024 y el promotor hacia la izquierda del fago lambda (P1) como describe Herskowitz, I. y Hagen, D., 1980, Ann. 50 Rev. Genet., 14:399-445. Tambien es util la inclusion de marcadores de seleccion en vectores de ADN transformados en E. coli. Ejemplos de dichos marcadores incluyen genes especificos de resistencia a ampicilina, tetraciclina, o cloranfenicol. Estan disponibles sistemas de expresion que utilizan E. coli, especies de Bacillus (Palva, I y col., 1983, Gene 22:229-235; Mosbach, K. y col. Nature, 302:543-545 y Salmonella. Se prefieren los sistemas de

E. coli.

55 [0153] Los polipeptidos producidos por celulas procariotas pueden no necesariamente plegarse de manera adecuada. Durante la purificacion a partir de E. coli, los polipeptidos expresados en primer lugar se pueden desnaturalizar y a continuacion renaturalizarse. Esto se puede conseguir solubilizando en un agente caotropico las proteinas producidas en la bacteria, tal como clorhidrato de guanidina y reduciendo todos los restos cisteina con un agente reductor tal como beta-mercaptoetanol. A continuacion los polipeptidos se renaturalizan, bien por dialisis lenta o mediante filtracion en gel. Patente de EE.UU. N° 4.511.503.

[0154] Los expertos en la materia conoceran una variedad de sistemas de expresion en eucariotas tales como 5 levaduras, lineas celulares de insecto y celulas de mamifero. Como se explica brevemente a continuacion, los polipeptidos tambien se pueden expresar en estos sistemas eucariotas.

[0155] La sintesis de proteinas heterologas en levaduras es muy conocida y esta perfectamente descrita. Methods in Yeast Genetics, Sherman, F., y col., Cold Spring Harbor Laboratory, (1982) es una obra muy reconocida que

10 describe los diversos procedimientos disponibles para producir los polipeptidos en levaduras. Como vectores se pueden utilizar una serie de plasmidos de expresion en levaduras tales como YEp6, YEp13, YEp4. Un gen de interes se puede fusionar con cualquiera de los promotores en diversos vectores de levaduras. Los plasmidos anteriormente mencionados estan ampliamente descritos en la bibliografia (Botstein y col., 1979, Gene, 8:17-24: Broach. y col., 1979, Gene, 8:121-133).

15 [0156] Ejemplos ilustrativos de cultivos celulares utiles para la produccion de los polipeptidos son celulas que tienen su origen en insectos o mamiferos. Los sistemas celulares de mamifero a menudo estaran en forma de monocapas de celulas, aunque tambien se pueden utilizar suspensiones de celulas de mamifero. Ejemplos ilustrativos de lineas celulares de mamifero incluyen las celulas VERO y HeLa, lineas celulares de ovario de hamster

20 chino (CHO), lineas celulares W138, BHK, COS-7 o MDCK.

[0157] Como se ha indicado anteriormente, el vector, por ejemplo un plasmido, que se utiliza para transformar la celula hospedadora, preferentemente contiene secuencias de ADN para iniciar la transcripcion y secuencias para controlar la traduccion de la secuencia del gen antigenico. Estas secuencias se denominan secuencias para el

25 control de la expresion. Cuando una celula hospedadora tiene su origen en insectos o mamiferos, a menudo se obtienen secuencias ilustrativas para el control de la expresion a partir del promotor de SV-40 (Science, 222:524527, 1983), el promotor IE de CMV (Proc Natl. Acad. Sci. 81:659-663, 1984) o el promotor de metalotioneina (Nature 296:39-42, 1982). El vector de clonacion que contiene las secuencias para el control de la expresion se escinde utilizando enzimas de restriccion, y su tamafo se ajusta segun sea necesario o deseable, y se liga con el ADN

30 deseado por medios muy conocidos en la materia.

[0158] Al igual que en el caso de las levaduras, cuando se emplean celulas hospedadoras de animales superiores, es necesario incorporar al vector secuencias de poliadenilacion o secuencias terminadoras de la transcripcion procedentes de genes conocidos de mamiferos. Un ejemplo de una secuencia terminadora es la secuencia de

35 poliadenilacion procedente del gen bovino de la hormona de crecimiento. Tambien se pueden incluir secuencias para un procesamiento alternativo preciso del trascrito. Un ejemplo de una secuencia de procesamiento alternativo es el intron VPI de SV40 (Sprague, J. y col., 1983, J. Virol. 45: 773-781).

[0159] Adicionalmente, se pueden incorporar al vector secuencias genicas para controlar la replicacion en la celula

40 hospedadora, tales como las encontradas en los vectores de tipo papilomavirus bovino. Saveria-Campo, M., 1985, "Bovine Papilloma virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector" en DNA Cloning Vol. II a Practical Approach Ed. DM Glover, IRL Press, Arlington, Virginia pp. 213-238.

Usos terapéuticos y de otro tipo de los ADNc y de sus productos génicos

45 [0160] Las secuencias de ADNc y los productos polipeptidicos descritos en el presente documento se pueden utilizar para modular la actividad de los productos genicos de los genes endogenos correspondientes a los ADNc. Modulando la actividad de los productos genicos, se pueden tratar dolencias patologicas asociadas a su expresion o a su falta de expresion. Para este fin se puede utilizar cualquiera de una variedad de tecnicas muy conocidas por los

50 expertos en la materia.

[0161] Los ADNc descritos en el presente documento se pueden utilizar para el tratamiento de diversos canceres tales como el cancer de mama, ovario, vejiga, cabeza y cuello, y colon. Con las secuencias descritas en el presente documento tambien se pueden tratar otras enfermedades. Por ejemplo, como se ha indicado anteriormente, GCAP

55 (SEQ. ID. No. 6) codifica una proteina que activa la guanino ciclasa que esta involucrada en la biosintesis del AMP ciclico. Se sabe que mutaciones en los genes involucrados en la biosintesis del AMP ciclico estan asociadas a enfermedades hereditarias degenerativas de la retina. Estas enfermedades son un grupo de dolencias hereditarias en las que una degeneracion progresiva y bilateral de las estructuras de la retina da lugar a la perdida de la funcion de la retina. Estas enfermedades incluyen degeneracion macular relacionada con la edad, una causa importante de discapacidad visual en ancianos; amaurosis congenita de Leber, que provoca que sus victimas nazcan ciegas; y retinitis pigmentosa ("RP"), una de las formas mas comunes de ceguera hereditaria. La RP es el nombre dado a las retinopatias hereditarias que se caracterizan por la perdida de fotorreceptores en la retina (conos y bastones), con una reduccion en la amplitud de las respuestas electricas de la retina a los destellos de luz (es decir,

5 electrorretinogramas o "ERGs").

[0162] El mecanismo de perdida de fotorreceptores de la retina o muerte celular en diferentes degeneraciones de la retina no se entiende completamente. Se han identificado mutaciones en una serie de genes diferentes como la lesion genetica principal en diferentes formas de RP humana. Los genes afectados incluyen la rodopsina, las

10 subunidades alfa y beta de la GMPc fosfodiesterasa, y la periferina-RDS (Dryja, TP y col., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36, 1197-1200 (1995)). En todos los casos las manifestaciones de la enfermedad, independientemente de la mutacion genetica especifica primaria, es similar dando como resultado la degeneracion de las celulas fotorreceptoras y ceguera.

15 [0163] Estudios en modelos animales de degeneracion de la retina han sido el foco de numerosos laboratorios durante la ultima decada. Se han elucidado los mecanismos que se encuentran alterados en algunas de las mutaciones que producen ceguera. Esto incluiria trastornos hereditarios del raton rd. El gen rd codifica la subunidad beta de la GMPc-fosfodiesterasa (PDE) (Bowes, C. y col., Nature 347, 677-680 (1990)), una enzima de importancia fundamental en la funcion visual normal debido a que es un componente clave en la cascada de acontecimientos

20 que tienen lugar en la fototransduccion.

[0164] Los polipeptidos codificados por los ADNc descritos en el presente documento se pueden utilizar como inmunogenos para generar anticuerpos policlonales o monoclonales. Los anticuerpos se pueden utilizar para detectar los polipeptidos con fines diagnosticos, como agentes terapeuticos para inhibir a los polipeptidos, o como

25 restos de direccionamiento en inmunotoxinas. La produccion de anticuerpos contra un antigeno deseado es muy conocida por aquellos expertos en la materia y no se revisa con detalle en el presente documento.

[0165] Los expertos en la materia reconoceran que existen numerosos procedimientos para la produccion y manipulacion de diversas moleculas de inmunoglobulina. Como se usa en el presente documento, los terminos 30 "inmunoglobulina" y "anticuerpos" se refieren a una proteina constituida por uno o mas polipeptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulinas. Las inmunoglobulinas pueden existir en una variedad de formas ademas de como anticuerpos, incluyendo por ejemplo, Fv, Fab y F(ab)2, asi como en cadenas sencillas. Para generar anticuerpos monoclonales, se inmortalizan y se seleccionan celulas que producen anticuerpos obtenidas de animales inmunizados (por ejemplo, ratones), o en primer lugar se seleccionan para la produccion del anticuerpo

35 deseado y a continuacion se inmortalizan. Para una descripcion de los procedimientos generales para la produccion de anticuerpos monoclonales vease Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Publications, Nueva York (1988).

[0166] Los anticuerpos generados mediante estas tecnicas se pueden utilizar en ensayos inmunodiagnosticos

40 para detectar o cuantificar la expresion de los productos genicos procedentes de los acidos nucleicos descritos en el presente documento. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos monoclonales marcados contra polipeptidos de la invencion para detectar niveles de expresion en una muestra biologica. Para una revision de los procedimientos generales en inmunoensayos diagnosticos, vease Basic and Clinical Immunology 7a Edicion, D. Stites y A. Terr ed. (1991).

45 [0167] Los polinucleotidos descritos en el presente documento son particularmente utiles para tecnicas de terapia genica muy conocidos por los expertos en la materia. Terapia genica, como se usa en el presente documento, se refiere a la multitud de tecnicas mediante las que se puede alterar la expresion genica en celulas. Dichos procedimientos incluyen, por ejemplo, la introduccion de ribozimas que codifican ADN o acidos nucleicos antisentido

50 para inhibir la expresion, asi como la introduccion de genes silvestres funcionales que sustituyan a genes mutantes (por ejemplo, utilizando genes GCAP silvestres para tratar la degeneracion de la retina). Se conocen una serie de vectores viricos adecuados. Dichos vectores incluyen vectores retrovirales (vease Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 1-24 (1992); Salmons y Gunzburg, Human Gene Therapy 4: 129-141 (1993); Miller y col., Methods in Enzymology 217: 581-599, (1994)) y vectores asociados a adenovirus (revisado en Carter, Curr. Opinion Biotech. 3:

55 533-539 (1992); Muzcyzka, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 97-129 (1992)). Otros vectores que se pueden utilizar en los procedimientos incluyen vectores adenoviricos, vectores de herpesvirus y vectores viricos Sindbis, como se describe de forma general en, por ejemplo, Jolly, Cancer Gene Therapy 1:51-64 (1994); Latchman, Molec. Biotechnol. 2:179-195 (1994); y Johanning y col., Nucl. Acids Res. 23:1495-1501 (1995).

[0168] Tambien es conocida la administracion de acidos nucleicos ligados a un elemento promotor-potenciador heterologo mediante liposomas (vease, por ejemplo, Brigham, y col. (1989) Am. J. Med. Sci., 298:278-281; Nabel, y col. (1990) Science, 249:1285-1288; Hazinski, y col. (1991) Am. J. Resp. Cell Molec. Biol., 4:206-209; y Wang y Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84:7851-7855); sistemas de transporte basados en cationes y acoplados

5 a ligandos especificos (Wu y Wu (1988) J. Biol. Chem., 263:14621-14624). Tambien se han descrito vectores de expresion de ADN desnudo (Nabel y col. (1990), mas arriba); Wolff y col. (1990) Science, 247:1465-1468).

[0169] Los acidos nucleicos y polipeptidos codificados descritos en el presente documento se pueden utilizar directamente para inhibir a los genes endogenos o a sus productos genicos. Por ejemplo, se pueden utilizar acidos 10 nucleicos inhibidores para unirse especificamente a una secuencia de acidos nucleicos complementaria. Con la union de la secuencia diana adecuada, se forma un duplex de ARN-ARN, ADN-ADN, o ARN-ADN. Estos acidos nucleicos a menudo se denominan "antisentido" debido a que normalmente son complementarios a la hebra codificante o sentido del gen, aunque tambien se han desarrollado enfoques para la utilizacion de acidos nucleicos "sentido". El termino "acidos nucleicos inhibidores" como se usa en el presente documento, se refiere tanto a acidos

15 nucleicos "sentido" como "antisentido". Los procedimientos con acidos nucleicos inhibidores engloban una serie de enfoques diferentes para alterar la expresion de genes especificos que operan mediante diferentes mecanismos.

[0170] Resumiendo, los enfoques de terapias con acidos nucleicos inhibidores se pueden clasificar en aquellos dirigidos a secuencias de ADN, aquellos dirigidos a secuencias de ARN (incluyendo ARNprem y ARNm), aquellos 20 dirigidos a proteinas (enfoques con hebras sentido) y aquellos que provocan la escision o modificacion quimica de los acidos nucleicos diana (ribozimas). Estos diferentes tipos de tecnologia con acidos nucleicos inhibidores se describen, por ejemplo, en Helene, C. y Toulme, J. (1990) Biochim. Biophys. Acta., 1049:99-125. Se ha demostrado que acidos nucleicos inhibidores complementarios a regiones del ARNm de c-myc inhiben la expresion de la proteina c-myc en una linea celular de leucemia promielocitica humana, HL60, que sobre-expresa el proto-oncogen

25 c-myc. Vease, Wickstrom E.L., y col., (1988) PNAS (USA), 85:1028-1032 y Harel-Bellan, A., y col., (1988) Exp. Med., 168:2309-2318.

[0171] Los polipeptidos codificados tambien se pueden utilizar para disefar moleculas (peptidicas o no peptidicas) que inhiban a las proteinas endogenas inhibiendo, por ejemplo, la interaccion entre la proteina y una segunda

30 molecula reconocida especificamente por la proteina. Los procedimientos para el disefo de dichas moleculas son muy conocidos por los expertos en la materia.

[0172] Por ejemplo, se pueden disefar polipeptidos que tengan una identidad de secuencia con las proteinas codificadas o que pueden comprender modificaciones (conservativas o no conservativas) de las secuencias. Las

35 modificaciones se pueden seleccionar, por ejemplo, para que alteren su estabilidad in vivo. Por ejemplo, la inclusion de uno o mas D-aminoacidos en el peptido normalmente incrementa la estabilidad, particularmente si los restos Daminoacido estan sustituidos en uno o ambos terminos de la secuencia peptidica.

[0173] El polipeptido tambien se puede modificar mediante su union a otras moleculas. Por ejemplo, se pueden

40 introducir diferentes grupos N- o C-terminales para alterar las propiedades fisicas y/o quimicas de la molecula. Dichas alteraciones se pueden utilizar para modificar, por ejemplo, la adhesion, estabilidad, biodisponibilidad, localizacion o deteccion de las moleculas. Para fines diagnosticos, se pueden unir a los extremos una amplia variedad de marcadores, que pueden proporcionar, directa o indirectamente, una sefal detectable. Asi, los polipeptidos se pueden modificar de diferentes formas para una variedad de propositos finales mientras aun retienen

45 la actividad biologica.

EJEMPLOS

[0174] Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, la presente invencion. 50

Ejemplo 1

IMPLICACIONES PRONÓSTICAS DE LA AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN 20q13 DEL CROMOSOMA EN CÁNCER DE MAMA Pacientes y material tumoral

[0175] Se obtuvieron muestras de tumores procedentes de 152 mujeres que se habian sometido a cirugia para tratamiento de cancer de mama entre 1987 y 1992 en la Universidad o en los Hospitales de la ciudad de Tampere.

Ciento cuarenta y dos muestras procedian de carcinomas de mama primarios y 11 de tumores metastasicos. Diez de los tumores primarios que eran carcinomas in situ o mucinosos se excluyeron del material, puesto que los especimenes se consideraban inadecuados para los estudios de FISH. De los restantes 132 tumores primarios, 128 eran carcinomas ductales invasivos y 4 carcinomas lobulares. Las edades de las pacientes estan comprendidas 5 entre los 29 y los 92 afos (61 afos de media). Hubo seguimiento clinico disponible para 129 pacientes. El periodo de seguimiento medio fue de 45 meses (intervalo de 1,4-1,77 meses). Se administro terapia de radiacion a 77 de las 129 pacientes (51 pacientes con ganglios linfaticos positivos y 26 con ganglios linfaticos negativos), y terapia sistemica adyuvante a 36 pacientes (33 con quimioterapia endocrina y 3 con quimioterapia citotoxica). El tamafo de los tumores primarios y la implicacion de los ganglios axilares se determinaron de acuerdo con la clasificacion de

10 metastasis del tumor-nodulo (TNM). El diagnostico histopatologico se evaluo de acuerdo con la Organizacion Mundial de la Salud (11). Los carcinomas se clasificaron en base a la disposicion tubular de las celulas cancerosas, la atipia nuclear, y la frecuencia de figuras nucleares mitoticas o hipercromaticas de acuerdo con Bloom y Richardson, Br. J. Cancer, 11: 359-377 (1957).

15 [0176] Los especimenes procedentes de la biopsia quirurgica se congelaron a -70'C un maximo de 15 minutos despues de la extraccion. Se prepararon secciones criostaticas (5-6 !m) para el diagnostico histopatologico intraoperatorio, y se cortaron secciones finas adicionales para los estudios inmunohistoquimicos. Se corto una seccion adyacente de un grosor de 200 !m para la citometria de flujo de ADN y los estudios de FISH.

20 Preparación de las células para la FISH

[0177] Despues de la verificacion histologica de que los especimenes de la biopsia contenian una elevada proporcion de celulas tumorales, los nucleos se aislaron a partir de las secciones congeladas de 200 !m de acuerdo con una modificacion del procedimiento Vindelov para la citometria de flujo de ADN, se fijaron y se pusieron en

25 portaobjetos para el analisis de FISH como describe Hyytinen y col., Cytometry 16: 93-99 (1994). Como controles negativos en los estudios de amplificacion se utilizaron fibroblastos de prepucio y se prepararon recogiendo celulas en confluencia para obtener nucleos en interfase enriquecidos en la fase G1. Todas las muestras se fijaron en metanol-acido acetico (3:1).

30 Sondas

[0178] Se utilizaron cinco sondas que mapean en la region 20q13 (vease Stokke, y col., Genomics, 26: 134-137 (1995)). Las sondas incluian clones-PI para el receptor de melanocortina-3 (Sonda MC3R, longitud fraccional a partir del brazo p del telomero (Flpter 0,81) y fosfoenolpiruvato carboxi quinasa (PCK, Flpter 0,84), asi como clones del 35 cosmido anonimo RMC20C026 (Flpter 0,79). Ademas, se utilizaron RMC20C001 (Flpter 0,825) y RMC20C030 (Flpter 0,85). Previamente se habia demostrado que la sonda RMC20C001 define la region de maxima amplificacion (Tanner y col., Cancer Res, 54: 4257-4260 (1994)). Se utilizo una sonda del cosmido que mapea en el brazo p proximal, RMC20C038 (FLpter 0.237) como sonda de referencia especifica para el cromosoma. Las sondas de pruebas se marcaron con biotina-14-dATP y la sonda de referencia con digoxigenina-11-dUTP utilizando la

40 traslacion de mellas (Kallioniemi y col., Proc. Natl Acad Sci USA, 89: 5321-5325 (1992)).

Hibridación in situ con fluorescencia

[0179] Se llevo a cabo una FISH con dos colores utilizando sondas especificas de 20q13 marcadas con biotina y

45 la sonda de referencia de 20p marcada con digoxigenina esencialmente como se ha descrito (Id.). Las muestras tumorales se postfijaron en paraformaldehido al 4%/tampon fosfato salino durante 5 minutos a 4'C antes de su hibridacion, se deshidrato en etanol al 70%, 85% y 100%, se seco al aire, y se incubo durante 30 minutos a 80'C. Los portas se desnaturalizaron en formamida al 70%/disolucion patron de citrato salino 2x a 72-74'C du rante 3 minutos, seguido por una digestion con proteinasa K (0,5 mg/ml). La mezcla de hibridacion contenia 18 ng de cada

50 una de las sondas marcadas y 10 !g de ADN de placenta humana. Despues de la hibridacion, las sondas se detectaron inmunoquimicamente con avidina-FITC y anti-digoxigenina rodamina. Los portas se contratiferon con 4,6-diamino-2-fenilindol (DAPI) 0,2 !M en una disolucion anti-destefimiento.

Microscopía de fluorescencia y puntuación de las señales en los núcleos en interfase

55 [0180] Se utilizo un microscopio de fluorescencia Nikon equipado con filtros paso bajo de doble banda (Chromatechnology, Brattleboro, Vermont, EE.UU.) y un objetivo 63x (NA 1,3) para la visualizacion simultanea de las sefales de FITC y rodamina. Se puntuaron al menos 50 nucleos no solapados con una morfologia intacta en base a la contratincion DAPI para determinar el numero de pruebas y las sefales de hibridacion de la sonda de referencia.

Los leucocitos que se infiltran en el tumor se excluyeron del analisis. Se realizaron hibridaciones control a nucleos de fibroblastos normales en interfase para cerciorarse de que las sondas reconocian una unica copia diana y de que las eficacias de hibridacion de las sondas de prueba y de referencia eran similares.

5 [0181] Los resultados de la puntuacion se expresan tanto en forma de numero medio de sefales de hibridacion por celula como nivel medio de amplificacion (= media del numero de sefales en relacion al numero de sefales de la sonda de referencia).

Citometría de flujo del ADN y análisis del receptor de esteroides

10 [0182] Se llevo a cabo la citometria de flujo del ADN a partir de secciones congeladas de 200 !m como describe Kallioniemi, Cytometry 9: 164-169 (1988). Se llevo a cabo un analisis utilizando el citometro de flujo EPICS C (Coulter Electronics Inc., Hialeah, Florida, EE.UU.) y el programa MultiCycle (Phoenix Flow Systems, San Diego, California, EE.UU.). Se utilizo un indice de ADN por encima de 1,07 (en mas del 20% de las celulas) como criterio

15 para la aneuploidia del ADN. En histogramas aneuploides del ADN, se analizo la fase S procedente unicamente del clon aneuploide. La evaluacion del ciclo celular tuvo exito en el 86% de los tumores (108/126).

[0183] Se detectaron inmunohistoquimicamente los receptores de estrogeno (ER) y progesterona (PR) a partir de secciones criostaticas como se ha descrito previamente (17). Los resultados de la tincion se evaluaron

20 semicuantitativamente y una puntuacion histologica superior o igual a 100 se consideran positivas tanto para ER como para PR (17).

Procedimientos estadísticos

25 [0184] Las tablas de contingencia se analizaron con pruebas de Chi cuadrado para la tendencia. La asociacion entre la fraccion en fase S (variable continua) y la amplificacion de 20q13 se analizo con la prueba de Kruskal-Wallis. El analisis de supervivencia libre de enfermedad se realizo mediante el programa BMDPIL y en el analisis de regresion multivariante se utilizaron la prueba Mautel-Cox y el modelo de riesgos proporcionales de Cox (programa BMDP2L) (Dixon BMDP Statistical Software. Londres, Berkeley, Los Angeles: University of California Press, (1981)).

Amplificación de 20q13 en carcinomas de mama primarios mediante hibridación in situ con fluorescencia

[0185] En el analisis de FISH se utilizo la region minima de la sonda RMC20C001 para evaluar la amplificacion de 20q13. Se utilizo la FISH para analizar tanto el numero total de sefales en celulas tumorales individuales como para 35 determinar el nivel medio de amplificacion (numero medio de copias con la sonda RMC20C001 en relacion a una sonda de referencia 20p). Ademas, tambien se valoro la distribucion del numero de sefales en los nucleos tumorales. Los tumores se clasificaron en tres categorias: sin amplificacion, bajo nivel de amplificacion y elevado nivel de amplificacion. Los tumores clasificados como no amplificados mostraban menos de 1,5 veces el numero de copias de RMC20C001 en comparacion con el control de brazo p. Los clasificados como con un bajo nivel de

40 amplificacion presentaban un nivel medio de amplificacion de 1,5-3 veces. Los tumores que presentaban un nivel de amplificacion superior a 3 veces el nivel de amplificacion medio se clasificaron como muy amplificados.

[0186] Los tumores muy amplificados a menudo presentaban una amplia heterogenicidad intratumoral con hasta 40 sefales en celulas tumorales individuales. En tumores altamente amplificados, las sefales de la sonda

45 RMC20C001 siempre estaban dispuestas en grupos para la FISH, lo que indica una localizacion de las secuencias de ADN amplificadas muy proximas entre si, por ejemplo, en una conformacion en tandem. Se encontro un bajo nivel de amplificacion de 20q13 en 29 de los 132 tumores primarios (22%), mientras que nueve casos (6,8%) mostraban un elevado nivel de amplificacion. La prevalencia global de un mayor numero de copias en 20q13 fue de esta forma del 29% (38/132).

Definición de la región mínima de amplificación.

[0187] Se determino el numero medio de copias de cuatro sondas flanqueantes RMC20C001 en los nueve tumores altamente amplificados. Las sondas flanqueantes probadas fueron el receptor de malanocortina-3 (MC3R,

55 FLpter 0,81), la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PCK, 0,84), RMC20C026 (0,79) y RMC20C030 (0,85). El tamafo y la ubicacion del amplicon vario ligeramente de un tumor a otro pero RMC20C001 fue la unica sonda altamente amplificada de manera consistente en los nueve casos.

Asociación de la amplificación de 20q13 con características patológicas y biológicas.

[0188] La amplificacion de 20q13 estaba asociada de manera significativa con el alto grado histologico de los tumores (p = 0,01). Esta correlacion se observo tanto en tumores moderada como altamente amplificados (Tabla 4). La amplificacion de 20q13 tambien estaba asociada de manera significativa con aneuploidia determinada por

5 citometria de flujo de ADN (p = 0,01, Tabla 4) La actividad de proliferacion celular media, medida como el porcentaje de celulas en la fraccion en fase S, se incremento (p = 0,0085 mediante la prueba de Kruskal-Wallis) con el nivel de amplificacion en los tumores sin amplificacion, con bajos niveles de amplificacion y elevados niveles de amplificacion (Tabla 4). No se encontro asociacion con la edad de la paciente, el tamafo del tumor primario, el estado de los ganglios axilares o del receptor-hormona esteroide (Tabla 4).

10 Tabla 4. Correlaciones clinico-patologicas de la amplificacion en la region cromosomica 20q13 en 132 canceres de mama primarios

Caracteristica patobiologica N° de pacientes SIN AMPLIFICACION (%)

Todos tumores 94 (71%)

primarios Edad de las pacientes < 50 afos 17 (65%)

� 50 afos 77 (73%)

Tamafo del tumor < 2 cm 33 (79%)

� 2 cm 58 (67%) Estado de los

ganglios Negativo 49 (67%) Positivo 41 (75%)

Grado histologico I - II 72 (76%) III 16 (52%)

Estado del receptor de estrogeno Negativo 30 (67%)

Positivo 59 (72%) Estado del receptor de progesterona

Negativo 57 (69%) Positivo 32 (744%)

Ploidia del ADN Diploide 45 (82%) Aneuploide 44 (62%)

Fraccion en fase S media + DE (%) 9,9 ± 7,2 Prueba de Kruskal-Wallis

Estado de amplificacion de 20q13 N° de pacientes con un BAJO NIVEL DE AMPLIFICACION (%) N° de pacientes con un ELEVADO NIVEL DE AMPLIFICACION (%) 29 (22%) 9 (6,8%)

Valor de p1

6 (23%) 23 (22%)

3 (12%) 6 (5,7*) ,39

7 (17%) 22 (25%)

2 (4,8%) 7 (8,0%) ,16

19 (26%) 10 (18%)

5 (6,8%) 4 (7,3%) ,41

18 (19%) 11 (35%)

5 (5,3%) 4 (13%) ,01

10 (22%) 19 (23%)

5 (11%) 4 (4,9%) ,42

20 (24%) 8 (19%)

6 (7,2%) 3 (7,0%) ,53

8 (14,5%) 20 (28%) media + DE 12,6 ± 6,7

2 (3,6%) 7 (10%) media + DE 19,0 ± 10,5 ,01 ,00851

Relación entre la amplificación de 20q13 y la supervivencia libre de enfermedad.

[0189] La supervivencia libre de enfermedad de pacientes con elevado nivel de amplificacion de 20q13 fue

5 significativamente mas corta que en pacientes con nada o solo un bajo nivel de amplificacion (p = 0,04). La supervivencia libre de enfermedad de pacientes con tumores moderadamente amplificados no difirio significativamente de la de pacientes sin amplificacion. Entre las pacientes con ganglios negativos (n = 79), un elevado nivel de amplificacion de 20q13 fue un factor pronostico muy importante para una supervivencia libre de enfermedad mas corta (p = 0,002), incluso en el analisis de regresion multivariado de Cox (p = 0,026) tras ajustar el

10 tamafo del tumor, el grado de ER y PR, la ploidia y la fraccion en fase S.

Amplificación de 20q13 en tumores de mama metastásicos.

[0190] Dos de los 11 tumores de mama metastasicos presentaban un nivel bajo y un elevado nivel de

15 amplificacion de 20q13. Por lo tanto, la prevalencia global (27%) del aumento en el numero de copias de 20q13 en tumores metastasicos era similar a la observada en tumores primarios. Ambos especimenes tumorales primarios y metastasicos estaban disponibles procedentes de una de las pacientes. Esta paciente de 29 afos de edad desarrollo una metastasis infiltrada en el musculo pectoral ocho meses despues de mastectomia total. La paciente no recibio terapia adyuvante o radioterapia despues de la mastectomia. La mayoria de las celulas tumorales en el

20 tumor primario mostraban un bajo nivel de amplificacion, a pesar de que las celulas tumorales individuales (menos de 5% del total) contenian 8-20 copias por celula por FISH. En contraste, todas las celulas tumorales procedentes de la metastasis mostraron un elevado nivel de amplificacion de 20q13 (12-50 copias por celula). El numero de copias absoluto de la sonda de referencia siguio siendo el mismo, lo que sugiere que el elevado nivel de amplificacion no produjo un mayor grado de aneuploidia.

Valor diagnóstico y pronóstico de la amplificación de 20q13.

[0191] Estos hallazgos sugieren que la amplificacion de 20q13 recien descubierta puede ser un componente importante de la via de progresion genetica de ciertos carcinomas de mama. Especificamente, los experimentos 30 anteriores establecen que: 1) un elevado nivel de amplificacion de 20q13, detectado en el 7% de los tumores, estaba asociado de manera significativa con la disminucion de la supervivencia libre de enfermedad en pacientes con ganglios negativos en cancer de mama, asi como con indicadores indirectos de elevado potencial maligno, tal como un grado elevado y la fraccion en fase S. 2) Un bajo nivel de amplificacion, que era mucho mas habitual, tambien llevaba asociado las caracteristicas clinico-patologicas de tumores agresivos, pero no era significativo a nivel de

35 pronostico. 3) El nivel de amplificacion de RMC20C001 sigue siendo superior a la amplificacion de genes y loci candidatos cercanos, lo que indica que hay un nuevo oncogen en las proximidades de RMC20C001.

[0192] Un elevado nivel de amplificacion de 20q13 estaba definido por la presencia de un numero de copias de amplificacion de 20q13 mas de 3 veces superior, que es algo inferior a las frecuencias de amplificacion reportadas 40 para algunos de los otros oncogenes de cancer de mama, tales como ErbB2 (17q12) y ciclina D (11q13) (Borg y col., Oncogene. 6: 137-143 (1991), Van de Vijver y col. Adv. Canc. Res., 61: 25-56 (1993)). Sin embargo, similar a lo que se ha encontrado previamente con estos otros oncogenes (Swab, y col., Genes Chrom. Canc., 1: 181-193 (1990), Borg y col., mas arriba) un elevado nivel de amplificacion de 20q13 era mas habitual en los tumores con un alto grado o una fraccion elevada en fase S y en los casos de mal pronostico. Aunque solo se analizo un pequefo 45 numero de pacientes con ganglios negativos, nuestros resultados sugieren que la amplificacion de 20q13 podria tener un papel independiente como indicador pronostico. Los estudios para abordar esta cuestion estan garantizados con una gran cantidad de material de pacientes. Ademas, basandose en estas correlaciones de supervivencia, el oncogen putativo desconocido en la actualidad, amplificado en este locus puede conferir un fenotipo agresivo. Por lo tanto, la clonacion de este gen es un objetivo importante. En base a la asociacion de la

50 amplificacion con tumores muy proliferativos se podria proponer la hipotesis del papel de este gen en la regulacion del crecimiento de la celula.

[0193] El papel del bajo nivel de amplificacion de 20q13 como acontecimiento significativo en la progresion tumoral parece menos claro. El bajo nivel de amplificacion se definio como un incremento de 1,5 a 3 veces el numero medio 55 de copias de la sonda 20q13 con respecto al control brazo p. Ademas, estos tumores carecian de forma caracteristica de celulas tumorales individuales con un numero de copias muy elevado, y mostraban un aspecto disperso y no agrupado de las sefales. Una distincion precisa entre un elevado y un bajo nivel de amplificacion de 20q13 solo se puede realizar de manera fiable mediante FISH, mientras que los analisis de transferencia de Southern y de transferencia de ranuras es probable que sean capaces de detectar solo un elevado nivel de amplificacion, en el que tiene lugar la elevacion sustancial del numero medio de copias de genes. Esta distincion es importante, ya que solo los tumores muy amplificados llevaban asociados resultados clinicos adversos. Los tumores 5 con un bajo nivel de amplificacion de 20q13 parecian tener muchas caracteristicas clinico-patologicas que estaban a medio camino de las encontradas en tumores sin amplificacion y aquellos con un elevado nivel de amplificacion. Por ejemplo, la fraccion promedio del tumor en fase S fue la mas baja en tumores no amplificados y la mas elevada en tumores muy amplificados. Una posibilidad es que el bajo nivel de amplificacion preceda al desarrollo de un elevado nivel de amplificacion. Este ha demostrado ser el caso, por ejemplo, en el desarrollo de amplificacion in vitro de

10 genes con resistencia a farmacos (Stark, Adv. Canc. Res., 61: 87-113 (1993)). Se encontraron evidencias que apoyan esta hipotesis en uno de nuestras pacientes, cuya metastasis local contenia un nivel mucho mas alto de amplificacion de 20q13 que el tumor primario operado 8 meses antes.

[0194] Por ultimo, nuestro trabajo anterior informo de una region critica de 1,5 Mb definida por la sonda

15 RMC20C001 y la exclusion de genes candidatos en lineas celulares de cancer de mama y en un numero limitado de tumores primarios de mama. Los resultados del presente estudio confirman estos hallazgos al demostrar de manera concluyente en un conjunto mas amplio de tumores primarios que la region critica de amplificacion esta, de hecho, definida por esta sonda.

20 [0195] Los datos actuales sugieren que el elevado nivel de amplificacion de 20q13 puede ser un paso importante en la progresion de ciertos tumores de mama a un fenotipo mas maligno. Las implicaciones clinicas y pronosticas de la amplificacion de 20q13 son sorprendentes y ahora se ha definido la ubicacion de la region minima de amplificacion en 20q13.

25 [0196] Se entiende que los ejemplos y las formas de realizacion descritas en el presente documento solo tienen fines ilustrativos y que en vista de ella los expertos en la materia podran sugerir diversas modificaciones o cambios que se deben incluir dentro del espiritu y alcance de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en el presente documento se incorporan por referencia para todos los propositos.

Discusión del listado de secuencias acompañantes

[0197] Las SEQ ID NO: 1-10 y 12-13 proporcionan secuencias de acidos nucleicos. En cada caso, la informacion se presenta como una secuencia de ADN. Un experto comprendera facilmente que la secuencia tambien describe el 35 ARN correspondiente (es decir, por sustitucion de los restos T con restos U) y sus diversas variaciones conservativamente modificadas. La secuencia complementaria se describe completamente por comparacion con la secuencia existente, es decir, la secuencia complementaria se obtiene utilizando las reglas convencionales de emparejamiento de bases de ADN (por ejemplo, A a T, C a G). Ademas, la secuencia de acidos nucleicos proporciona la secuencia de aminoacidos correspondiente mediante la traduccion de la secuencia de ADN dada

40 utilizando el codigo genetico.

[0198] Para la SEQ ID NO 11, la informacion se presenta como una secuencia polipeptidica. Un experto comprendera facilmente que la secuencia tambien describe todas las secuencias de ARN y ADN correspondientes que codifican el polipeptido, por conversion de la secuencia de aminoacidos en la secuencia de nucleotidos

45 correspondiente utilizando el codigo genetico, asignando alternativamente cada posible codon a cada posible posicion del codon. De forma similar, cada secuencia de acidos nucleicos proporcionada tambien proporciona inherentemente todos los acidos nucleicos que codifican la misma proteina, puesto que la persona experta puede traducir simplemente un acido nucleico seleccionado en una proteina y, a continuacion utilizar el codigo genetico para hacer la traduccion inversa a todos los posibles acidos nucleicos a partir de la secuencia de aminoacidos.

50 [0199] Las secuencias tambien proporcionan diversas variaciones modificadas conservativamente mediante la sustitucion de restos apropiados con las sustituciones conservativas de aminoacidos proporcionadas como ejemplo, por ejemplo, en la seccion de Definiciones anterior.

55 [0200]

LISTADO DE SECUENCIAS

SEQ. ID. No. 1

3bf4 3000 pb

5 SEQ. ID. No. 2 1b11 723 pb

10 SEQ. ID. No. 3 cc49 1507 pb

SEQ. ID. No. 4 cc43 2605 pb 5

SEQ. ID. No. 5

41.1 1288 pb

SEQ. ID. No. 6 GCAP 2820 pb 5

SEQ. ID. No. 7 1b4 1205 pb

SEQ. ID. No. 8 20sa7 456 pb 5

SEQ. ID. No. 9

Secuencia genomica que codifica ZABC 1 10

SEQ. ID. No. 10 Marco de lectura abierto de ZABC1

SEQ. ID. No. 11 Proteina ZABC 5

SEQ. ID. No. 12 1b1

SEQ. ID. No. 13

Secuencia genomica procedente del clon 97 de BAC 5 Secuencia filtrada en la busqueda:

> query seq

SEQ ID NO 14 gb I M19533 I RATCYCA ARNm de ciclofilina de rata, cds completo. Longitud = 743 5 HSPs de la hebra menos:

Puntuacion = 418 (115,5 bits), Esperado = 1,5e-58, Suma P(5) = 1,5e-58

Identidades = 96/112 (85%), Positivos = 96/112 (85%), Hebra = Menos/Mas S = CICLOFILINA de rata; q = SEQ ID 10 NO 13.

[0201] Los siguientes parrafos numerados constituyen declaraciones adicionales relacionadas con el objeto descrito en el presente documento.

1. Una molecula aislada de acidos nucleicos que comprende una secuencia de polinucleotidos que presenta una subsecuencia que se hibrida especificamente en condiciones rigurosas a una secuencia seleccionada del grupo constituido por la SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 3, SEQ. ID. No. 4, SEQ. ID. No. 5, SEQ. ID. No. 6, SEQ. ID. No. 7, SEQ. ID. No. 8, SEQ. ID. No. 9, SEQ. ID. No. 10, SEQ. ID. No. 12, y SEQ. ID. No. 13.

2. El acido nucleico aislado del parrafo 1, en el que la subsecuencia se hibrida especificamente en condiciones rigurosas a la SEQ. ID. No. 2.

3. El acido nucleico aislado del parrafo 2, en el que la subsecuencia es la SEQ. ID. No. 2. 15

4.

El acido nucleico aislado del parrafo 1, en el que la subsecuencia se hibrida especificamente a la SEQ. ID. No. 3.

5.

El acido nucleico aislado del parrafo 4, en el que el polinucleotido es la SEQ. ID. No. 3.

20 6. El acido nucleico aislado del parrafo 1, en el que la subsecuencia se hibrida especificamente en condiciones rigurosas a la SEQ. ID. No. 4.

7. El acido nucleico aislado del parrafo 6, en el que la subsecuencia es la SEQ. ID. No. 4.

25 8. El acido nucleico aislado del parrafo 1, en el que la subsecuencia se hibrida especificamente en condiciones rigurosas a la SEQ. ID. No. 5.

9. El acido nucleico aislado del parrafo 8, en el que la subsecuencia es la SEQ. ID. No. 5.

30 10. El acido nucleico aislado del parrafo 1, en el que la subsecuencia se hibrida especificamente en condiciones rigurosas a la SEQ. ID. No. 6.

11.

El acido nucleico aislado del parrafo 10, en el que la subsecuencia es la SEQ. ID. No. 6.

12.

El acido nucleico aislado del parrafo 1, en el que la subsecuencia se hibrida especificamente en condiciones rigurosas a la SEQ. ID. No. 7.

13.

El acido nucleico aislado del parrafo 12, en el que la subsecuencia es la SEQ. ID. No. 7. 5

14. El acido nucleico aislado del parrafo 1, en el que la subsecuencia se hibrida especificamente en condiciones rigurosas a la SEQ. ID. No. 8.

15.

El acido nucleico aislado de los parrafos 14, 16, 18, 20, en el que la subsecuencia es la SEQ. ID. No. 8. 10

16. El acido nucleico aislado del parrafo 1, en el que la subsecuencia se hibrida especificamente en condiciones rigurosas a la SEQ. ID. No. 9.

17.

El acido nucleico aislado del parrafo 16, en el que la subsecuencia es la SEQ. ID. No. 9. 15

18. El acido nucleico aislado del parrafo 1, en el que la subsecuencia se hibrida especificamente en condiciones rigurosas a la SEQ. ID. No. 10.

19.

El acido nucleico aislado del parrafo 1, en el que la subsecuencia es la SEQ. ID. No. 10. 20

20. El acido nucleico aislado del parrafo 1, en el que la subsecuencia se hibrida especificamente en condiciones rigurosas a la SEQ. ID. No. 12.

21.

El acido nucleico aislado del parrafo 20, en el que la subsecuencia es la SEQ. ID. No. 12. 25

22. El acido nucleico aislado del parrafo 1, en el que la subsecuencia se hibrida especificamente en condiciones rigurosas a la SEQ. ID. No. 13.

23.

El acido nucleico aislado del parrafo 22, en el que la subsecuencia es la SEQ. ID. No. 12. 30

24. El acido nucleico aislado del parrafo 1, que comprende adicionalmente una secuencia promotora unida de manera operable a la secuencia de polinucleotidos.

25. El acido nucleico aislado del parrafo 1, cuyo acido nucleico es una molecula de ADNc. 35

26. Un procedimiento de seleccion para celulas neoplasicas en una muestra, el procedimiento que comprende:

la puesta en contacto de una muestra de acidos nucleicos procedente de un paciente humano con una sonda que se hibrida selectivamente a una secuencia de polinucleotidos diana que comprende una secuencia seleccionada del

40 grupo constituido por la SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 3, SEQ. ID. No. 4, SEQ. ID. No. 5, SEQ. ID. No. 6, SEQ. ID. No. 7, SEQ. ID. No. 8, SEQ. ID. No. 9, SEQ. ID. No. 10, SEQ. ID. No. 11, SEQ. ID. No. 12, y, SEQ. ID. No. 13 en el que la sonda se pone en contacto con la muestra en condiciones en las que la sonda se hibrida selectivamente con la secuencia del polinucleotido diana para formar un complejo de hibridacion estable; y

45 detectar la formacion de un complejo de hibridacion.

27. El procedimiento del parrafo 26, en el que la muestra de acidos nucleicos procede de una paciente con cancer de mama.

50 28. El procedimiento del parrafo 26, en el que la muestra de acidos nucleicos procede de un nucleo en propagacion durante la metafase o de un nucleo en interfase.

29. El procedimiento del parrafo 26, en el que la sonda comprende una secuencia de polinucleotidos como se

expone en la SEQ. ID. No. 1. 55

30.

El procedimiento del parrafo 26, en el que la sonda comprende una secuencia de polinucleotidos como se expone en la SEQ. ID. No. 2.

31.

El procedimiento del parrafo 26, en el que la sonda comprende una secuencia de polinucleotidos como se

expone en la SEQ. ID. No. 3.

32.

El procedimiento del parrafo 26, en el que la sonda comprende una secuencia de polinucleotidos como se

expone en la SEQ. ID. No. 4. 5

33. El procedimiento del parrafo 26, en el que la sonda comprende una secuencia de polinucleotidos como se expone en la SEQ. ID. No. 5.

34. El procedimiento del parrafo 26, en el que la sonda comprende una secuencia de polinucleotidos como se 10 expone en la SEQ. ID. No. 6.

35. El procedimiento del parrafo 26, en el que la sonda comprende una secuencia de polinucleotidos como se expone en la SEQ. ID. No. 7.

15 36. El procedimiento del parrafo 26, en el que la sonda comprende una secuencia de polinucleotidos como se expone en la SEQ. ID. No. 8.

37. El procedimiento del parrafo 26, en el que la sonda comprende una secuencia de polinucleotidos como se

expone en la SEQ. ID. No. 9. 20

38. El procedimiento del parrafo 26, en el que la sonda comprende una secuencia de polinucleotidos como se expone en la SEQ. ID. No. 10.

39. El procedimiento del parrafo 26, en el que la sonda comprende una secuencia de polinucleotidos como se 25 expone en la SEQ. ID. No. 12.

40. El procedimiento del parrafo 26, en el que la sonda comprende una secuencia de polinucleotidos como se expone en la SEQ. ID. No. 13.

30 41. El procedimiento del parrafo 26, en el que la sonda se utiliza para identificar la presencia de una mutacion en la secuencia de polinucleotidos diana.

42. Un procedimiento para detectar una celula neoplasica en una muestra biologica, el procedimiento que comprende:

35 la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo que se une especificamente a un antigeno polipeptidico codificado por una secuencia de polinucleotidos que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por la SEQ. ID. No. 1, SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 3, SEQ. ID. No. 4, SEQ. ID. No. 5, SEQ. ID. No. 6, SEQ. ID. No. 7, SEQ. ID. No. 8, SEQ. ID. No. 9, SEQ. ID. No. 10, SEQ. ID. No. 12, y SEQ. ID. No. 13; y

40 detectar la formacion de un complejo antigeno-anticuerpo.

43. El procedimiento del parrafo 42, en el que la muestra procede de tejido de mama.

45 44. Un procedimiento para inhibir la proliferacion patologica de celulas cancerosas, el procedimiento que comprende la inhibicion de la actividad de un producto genico de un gen endogeno que presenta una subsecuencia que se hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo constituido por la SEQ. ID. 1, SEQ. ID. No. 2, SEQ. ID. No. 3, SEQ. ID. No. 4, SEQ. ID. No. 5, SEQ. ID. No. 6, SEQ. ID. No. 7, SEQ. ID. No. 8, SEQ. ID. No. 9, SEQ. ID. No. 10, SEQ. ID. No. 12, y SEQ. ID. No. 13.

45. Un procedimiento para detectar un cancer, dicho procedimiento que comprende la deteccion de la sobreexpresion de una proteina codificada en un amplicon 20q13.

46. El procedimiento del parrafo 45, en el que dicha proteina codificada en un amplicon 20q13 es ZABC1. 55

47. El procedimiento del parrafo 45, en el que dicha proteina codificada en un amplicon 20q13 es 1b1.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una molecula aislada de acidos nucleicos que comprende una secuencia de polinucleotidos que

   comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ. ID. Nos. 9 o 10 o una de sus secuencias 5 complementarias.
2. 2. El acido nucleico aislado de la reivindicacion 1, en el que la secuencia de polinucleotidos comprende las SEQ. ID. Nos. 9 o 10.

   10 3. El acido nucleico aislado de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente una secuencia promotora unida de manera operable a la secuencia de polinucleotidos.

3. 4. El acido nucleico aislado de la reivindicacion 1, que es una molecula de ADNc.

   15 5. Un procedimiento de seleccion para celulas neoplasicas en una muestra, el procedimiento que comprende:

   la puesta en contacto de una muestra de acidos nucleicos procedente de un paciente humano con un acido nucleico aislado que se hibrida selectivamente a una secuencia de polinucleotidos diana que comprende una secuencia

   20 seleccionada del grupo constituido por las SEQ. ID. Nos. 9 o 10 o una de sus secuencias complementarias, o a una subsecuencia de cualquiera de estas susodichas secuencias en las que el acido nucleico aislado se pone en contacto con la muestra en condiciones en las que el acido nucleico aislado se hibrida selectivamente con la secuencia de polinucleotidos diana para formar un complejo de hibridacion estable, y

   25 detectar la formacion de un complejo de hibridacion para controlar el numero de copias relativo de secuencias correspondientes a las SEQ. ID. Nos. 9 o 10 en la muestra.
4. 6. El procedimiento de la reivindicacion 5, en el que la muestra de acidos nucleicos procede de un

   paciente con un cancer seleccionado del grupo constituido por cancer de ovario, vejiga, cabeza y cuello, colon y 30 mama.
5. 7. El procedimiento de una cualquiera de la reivindicacion 5 o la reivindicacion 6 en el que el acido nucleico aislado esta marcado.

   35 8. El procedimiento de una cualquiera de la reivindicacion 5 o la reivindicacion 6 en el que el acido nucleico aislado esta inmovilizado sobre una superficie solida.
6. 9. El procedimiento de la reivindicacion 5, en el que la muestra de acidos nucleicos es un nucleo en

   propagacion durante la metafase o un nucleo en interfase. 40
7. 10. Un procedimiento de seleccion para celulas neoplasicas en una muestra, el procedimiento que comprende:

   la puesta en contacto de una muestra de acidos nucleicos procedente de un paciente humano con un acido nucleico

   45 aislado que se hibrida selectivamente a una secuencia de polinucleotidos diana que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ. ID. Nos. 9 o 10 o una de sus secuencias complementarias, o a una subsecuencia de cualquiera de estas susodichas secuencias en las que el acido nucleico aislado se pone en contacto con la muestra en condiciones en las que el acido nucleico aislado se hibrida selectivamente con la secuencia de polinucleotidos diana para formar un complejo de hibridacion estable, y

   50 detectar la formacion de un complejo de hibridacion para identificar la presencia de una mutacion en la secuencia de polinucleotidos diana.
8. 11. Un procedimiento para la deteccion de celulas neoplasicas en una muestra biologica, dicho

   55 procedimiento que comprende la seleccion de la muestra para la sobre-expresion del gen ZABC1, en donde la sobre-expresion del gen ZABC1 con respecto al tejido normal, es indicativa de una celula neoplasica,

   en donde el gen ZABC1 corresponde a cualquiera de las SEQ. ID. Nos. 9 o 10.
9. 12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 11, en el que la seleccion de la muestra para la sobre-expresion del gen ZABC1 comprende la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo que se une especificamente a un antigeno polipeptidico codificado por una secuencia de polinucleotidos que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ. ID. Nos. 9 o 10 y la deteccion de la formacion de un

   5 complejo antigeno-anticuerpo.
10. 13. El procedimiento de la reivindicacion 11 o 12, en el que la muestra se selecciona del grupo constituido por tejido de ovario, vejiga, cabeza y cuello, colon y mama.

    10 14. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 11, dicho procedimiento que comprende la seleccion de la muestra para la sobre-expresion de una proteina codificada por una secuencia de polinucleotidos que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por las SEQ. ID. Nos. 9 o 10.
11. 15. Un procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 u 11 a 14 para su utilizacion en

    15 el diagnostico de la aparicion o progresion de un cancer en un individuo del que se ha derivado la muestra biologica, en el que una sobre-expresion de 3 veces o superior del gen ZABC1 en la muestra biologica esta correlacionada con una disminucion de la supervivencia libre de enfermedad en sujetos con ganglios negativos.
12. 16. Un procedimiento para diagnosticar la aparicion o progresion del cancer en un individuo, 20 procedimiento que comprende las etapas de:

    (a) determinacion de la expresion del gen ZABC1 en una muestra biologica procedente del individuo, y

    (b) comparar el nivel de expresion del gen ZABC1 observado en la muestra biologica con el nivel de expresion del 25 gen ZABC1 derivado de una segunda muestra de tejido clinicamente normal,

    en el que una sobre-expresion de 3 veces o superior del gen ZABC1 en la muestra biologica esta correlacionada con una disminucion de la supervivencia libre de enfermedad en sujetos con ganglios negativos.