JP2008283985A - 癌の診断および予後のための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】pRb2/p130発現の相対レベルは癌の存在、腫瘍等級、および患者予後と関連するため、これらの方法は、癌を検出し、治療の判断を行い、患者の成果を予測し、および罹患していない個体における癌の危険性を予測するために用いることができる可能性がある。本発明はさらに、pRb2/p130遺伝子中の突然変異および多型性の検出のための方法を提供する。これは、腫瘍形成に関連する遺伝的事象を特徴付けし、突然変異の親起源を追跡し、生殖系突然変異のキャリアーを同定し、および、癌の素因を有する個体を同定するために用いることができる可能性がある。
【選択図】 なし
Description
本明細書に記載されている発明は国立衛生研究所助成金RO1 CA60999−01A1により支援された。米国政府は本発明にある種の権利を持っている。
本出願は1997年3月3日に出願された米国仮特許出願番号60/039,532号、1996年6月21日に出願された米国仮特許出願番号60/020,196号、1996年6月5日に出願された米国仮特許出願番号60/019,372号および1996年4月5日に出願された米国仮特許出願番号60/014,943号からの優先権を請求する。
本発明は癌の危険性のある個体の同定、および癌の検出および評価のための方法に関している。
A.癌抑制のRbファミリー
ヒトの癌の多くの型は細胞内での増殖制御の平衡異常により起こされると信じられている。増殖制御における負の調節の減少および/またはそれらの不活性化は癌性状態を起こすことができる。もしくは、正の調節増殖制御の増加もまた癌性状態を起こすことができる。
pRb2/p130遺伝子は腫瘍抑制遺伝子であり、およびそれは種々の癌腫に関係付けられることが知られている染色体領域に位置しているので、この遺伝子中の突然変異について個体をスクリーニング方法が必要とされている。この遺伝子の配列多型を同定することも必要とされている。pRb2/p130の機能に影響を及ぼすであろう、エキソンコード配列およびエキソン−イントロン結合内の両方での突然変異が起こりうると信じられている。腫瘍から抽出されたゲノムDNAより取り出された個々のエキソンの直接DNA配列分析が、卵巣癌でのp53遺伝子および網膜芽細胞腫でのRb遺伝子の突然変異を同定するために首尾よく使用された。Milner et al.,Cancer Research 53:2128−2132(1993);Yandell et al.,N.E.J.Medicine 321:1689−1695(1989)。しかしながら、エキソンの直接配列決定は、非常に時間のかかる方法であるので望ましい方法ではない。pRb2/p130遺伝子のゲノム構造の理解は、pRb2/p130遺伝子中の多型および配列突然変異について患者のDNAをスクリーニングすることを当業者に可能にするであろう。配列突然変異の同定はまたpRb2/p130遺伝子の生殖細胞突然変異保持者の診断も可能にするであろうし、およびこれらの場合の出生前スクリーニングを可能にする。
婦人科癌には子宮、卵巣、子宮頚、膣、陰門およびファロピー管の癌、ならびに妊娠絨毛性疾患が含まれる。子宮の癌には子宮内膜癌および子宮肉腫が含まれる。
肺癌は西洋諸国においての癌関連死の最も大きな単一原因である。肺癌療法の適当な方針の選択にあたっては、癌の悪性度の正確な決定が必要とされる。この決定は典型的には腫瘍の”等級付け(grading)”によりなされる。腫瘍の等級付けは典型的には熟練した病理学者により腫瘍切片の特徴および外観が調査されることにより実施される。肺癌の予後徴候および処置の型を決定する場合に組織学的基準を使用する際の重大な問題は、同一の標本を読みとる際の観察者間および観察者内変異の程度である。決定は必然的に主観的である。加えて、原発および転移部位の両方で腫瘍それ自体内に不均質性が存在する。個々の腫瘍等級を一致させるには何人かの病理学者の意見を得ることが必要になってきているであろう。
肺障害出現前の潜在的癌の検出は、疾病の初期段階での治療開始を可能にするであろうし、それにより陽性の治療成果の見込みを最大にする。簡単な遺伝子検査により、肺癌の危険性があるがまだ病気にはなっていない人を同定するのも望まれるであろう。そのようなスクリーニング試験は、発癌物質への環境的暴露または癌の家族歴などで肺癌が発生する危険性のある人に対して最も利点があるであろう。
本発明はヒトpRb2/p130遺伝子およびpRb2/p130タンパク質、および癌の診断および予後のための並びに癌の素質の予想のための方法における分子マーカーとしてのそれらの使用に関している。本発明の好適な態様によると、癌とは婦人科癌または非小細胞肺癌である。本発明の最も好適な態様によると、癌とは子宮内膜癌、卵巣癌、肺の扁平上皮癌または肺の腺癌である。
pRb2/p130イントロン(該イントロンのスプライスシグナルジヌクレオチドを除いて)のセグメントと実質的に相補的なヌクレオチド配列を持つDNAセグメントから本質的に成る少なくとも15のヌクレオチドの増幅プライマーを提供するのが本発明の別の目的である。
本発明の一つの態様は以下の工程を含むヒトpRb2/p130遺伝子のエキソン中の多型および突然変異を増幅および同定するための方法を含んでいる:
(a)増幅条件下、該エキソンを含んでいるゲノムDNAの試料を、プロモーター領域または該エキソンの上流のイントロンにハイブリダイズする第一プライマーおよびイントロンまたは3’−非コード領域にハイブリダイズする第二プライマーを含むプライマー対で処理し、該処理は該エキソンを含む増幅産物を産生する;
(b)該エキソンのヌクレオチド配列を提供するために該増幅産物のヌクレオチド配列を決定し;そして
(c)工程bで得られた該エキソンの配列と相当する野生型エキソンの配列に対する配列を比較する。
(a)ポリメラーゼ連鎖反応緩衝液中、該エキソンを含んでいるゲノムDNAの試料、プロモーター領域または該エキソンの上流のイントロンにハイブリダイズする第一プライマーおよび3’−非コード領域または該エキソンの下流のイントロンにハイブリダイズする第二プライマーを含むプライマー対、一つまたはそれ以上のデオキシヌクレオチド三リン酸の混合物、および該プライマー対を放射性標識できる化合物、およびDNAポリメラーゼを混合することによりポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成し;
(b)該混合物を複数回のポリメラーゼ連鎖反応熱サイクルにかけてpRb2/p130増幅産物を生成させ;
(c)該pRb2/p130増幅産物を変性させ;
(d)該変性pRb2/p130増幅産物を電気泳動的に分離し;
(e)工程dの電気泳動的に分離された産物をフィルムに暴露して写真画像を作成し;そして
(e)該pRb2/p130増幅産物の該写真画像中のバンドの移動度を相当する野生型エキソンからの電気泳動的に分離された増幅生成物と比較する。
(a)緩衝液中、該エキソンを含んでいる染色体試料、プロモーター領域または該エキソンの上流のイントロンにハイブリダイズする第一プライマーおよび3’−非コード領域または該エキソンの下流のイントロンにハイブリダイズする第二プライマーを含むプライマー対、一つまたはそれ以上のデオキシヌクレオチド 三リン酸の混合物(標識されている少なくとも一つのデオキシヌクレオチド 三リン酸を含んでいる)、およびDNAポリメラーゼを混合することにより混合物を形成させ;
(b)該混合物にpRb2/p130増幅産物を産生するために十分な温度および時間を与え;および
(c)該標識に特異的に結合する蛍光色素で該pRb2/p130増幅産物を可視化し;そして
(d)工程cで得られた可視化されたpRb2/p130増幅産物と相当する野生型エキソンからの可視化増幅産物を比較する。
A.略語および定義
1.略語
bp 塩基対
BSA ウシ血清アルブミン
dATP デオキシアデニン 三リン酸
dCTP デオキシシトシン 三リン酸
dGTP デオキシグアノシン 三リン酸
DIG DNA ジゴキシゲニン標識DNA
DIG−dUTP ジゴキシゲニン−デオキシウリジン 三リン酸
DNA デオキシリボ核酸
dTTP デオキシチミン 三リン酸
EDTA エチレンジアミン四酢酸
FITC フルオレセイン イソチオシアナート
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
PHA フィトヘマグルチニン
PRINS オリゴヌクレオチド−PRimed IN Situ合成
RNA リボ核酸
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
SSC 標準クエン酸塩溶液
SSCP 一本鎖コンフォメーション多型
TBE 0.09Mトリス、0.09Mホウ酸および2.5mM EDTAの緩衝液混合物
2.定義
”対立遺伝子”とは染色体上の決められた座位を占める遺伝子の一つまたはそれ以上の別の形を指している。
”増殖産物”とはその生成物が増幅された鋳型セグメントに相補的である、PCR、SSCPおよびPRINSのような増幅法により生成された核酸セグメントを指している。
”子宮内膜癌”または”子宮内膜癌腫”とは子宮内膜に起こっているポリープ様増殖を意味している。
”ハイブリダイゼーション”とは本質的に相補的なヌクレオチド配列(核酸のポリマー)のワトソン−クリック塩基対生成により二本鎖分子が形成されることを意味している。
”非小細胞肺癌”(NSCLC)とは小細胞肺癌(SCLC)を除いた肺癌のすべての形を意味している。特に、非小細胞肺癌は扁平上皮癌、腺癌、細気管支−肺胞癌および大細胞癌を含む肺癌の群を意味している。
”スプライス結合”または”エキソン−イントロン結合”とは核遺伝子のエキソン−イントロン境界のすぐ隣を囲んでいるヌクレオチド配列を指している。本明細書で使用される場合、本用語はRNAスプライシングの機構における破損および再結合の部位を含んでいる。
本発明は婦人科癌および非小細胞肺癌を含む(これらに制限されるわけではない)癌の診断および予後のための、pRb2/p130発現レベルに基づいた改良法を提供する。婦人科癌の中でこれらの方法が応用されるであろう婦人科癌は卵巣癌および子宮内膜癌である。
初期の卵巣癌はしばしば無徴候であるか、または患者には無視されるであろう温和な徴候のみしか示さない。卵巣癌の大多数は診断の時点で卵巣を越えて、およびしばしば骨盤を越えて拡がっている。卵巣癌の診断および予後のための改良法は処置の選択に有用であろうし、患者の結果に良好な効果を持っていなければならない。本発明は、卵巣癌組織において、pRb2/p130発現と腫瘍等級間に相関があるという発見に基づいている。
肺癌の場合、肺組織試料を、当業者に周知である慣用的な生検技術によって個体から取出す。その試料は、概して、針生検によって集められる。例えば、本明細書中に援用される、Cancer:Principles & Practice of Oncology,V.T.DeVita,Jr.ら監修,第3版(1989),J.B.Lippincott Co.,フィラデルフィア,PA,616−619頁を参照されたい(経竜骨(transcarinal)針生検および経胸腔経皮微針吸引生検)。NSCLCを含むような肺病巣の識別のために、病変から試料を採取する。病変は、最初、X線または当業者に知られている他の慣用的な肺病巣画像化技術によって見つけられる。潜伏性NSCLCまたはNSCLC素因について調べるために、肺のどの部位からも組織試料を採取することができる。最も顕著に悪性の可能性がある組織は、pRb2/p130をほとんどまたは全く発現しない。正常肺組織細胞は、高レベルのpRb2/p130タンパク質を発現する。患者肺腫瘍組織の細胞におけるpRb2/p130発現レベルは、同患者の正常肺組織でのレベルとまたは正常の対照群の肺組織でのレベルと比較することができる。
本発明の実施により、罹患組織の試料は、当業者に周知である慣用的な生検技術によって癌患者から取出される。その試料は、好ましくは、放射線療法または化学療法の開始前に患者から得られる。次に、その試料を、pRb2/p130発現レベルの測定用に調製する。
ヒトpRb2/p130遺伝子のゲノム構造を本明細書中で記載する。pRb2/p130ゲノムDNAは、クローン化され且つ配列決定されている。pRb2/p130遺伝子は、ヒト新形成についてヘテロ接合性の消失(LOH)を示すことが以前に報告された部分である染色体16の長いアームまで地図で表わされている。pRb2/p130の推定上のプロモーターは、識別され、クローン化され、そして配列決定されている。遺伝子の完全なイントロン−エキソン機構が解明されている。ヒトpRb2/p130遺伝子は、50kbを越えるゲノムDNAにわたって、22個のエキソンおよび21個のイントロンを含有する。個々のエキソンの長さは、65bp〜1517bpであるが、個々のイントロンの長さは82bp〜9837bpである。これらエキソンおよびイントロンの体制を図3Aで示す。pRb2/p130のそれぞれのエキソンおよびイントロンの位置および寸法、並びにエキソン−イントロン結合部のヌクレオチド配列を下記の表7で示す(配列番号:6〜47)。エキソン配列は大文字で示され、イントロン配列は小文字で示される。superscript 番号は、配列番号:1上のエキソン−イントロン境界のヌクレオチド位置に対応する。
1.pRb2/p130の転写調節
腫瘍サプレッサー遺伝子産物は、細胞成長のみならず細胞分化も調節するMyoDなどの転写因子と直接的に相互作用するということが証明されている。Sang ら,上記、8頁。これら転写因子の配列部分モチーフの突然変異は、腫瘍抑制遺伝子の機能に影響すると考えられる。したがって、pRb2/p130遺伝子のゲノム構造を識別することに加えて、追加の実験を行って、pRb2/p130の5′フランキングプロモーター配列を決定した。pRb2/p130の推定上のプロモーター配列の一部分は、最初のエキソンの完全な配列および最初のイントロンの開始部分と一緒に、図4で示される(配列番号:4)。推定上のプロモーター領域の完全な配列は、配列番号:113で与えられる。
本発明は、pRb2/p130のゲノムDNAを増幅し且つそこでの多形性および突然変異をスクリーニングする方法を提供する。本明細書中で記載の検定法を用いて、いくつかの癌を診断し且つ特性決定することができるしまたはヘテロ接合担体状態を識別することができる。pRb2/p130中の突然変異を増幅させ且つ検出する方法の例を与えるが、本発明は、示された特定の方法に制限されるわけではない。pRb2/p130のゲノムDNA配列の使用および/または本明細書中で記載のプライマーの使用に頼る他の増幅および識別の手段も、本発明によって包含される。
pRb2/p130遺伝子内の変異を検出するPRINS方法は、キットの形で実施される。そのような実施態様では、キャリヤーを細分し、バイアルまたは試験管のような一つまたはそれより多くの容器に、密閉して入れる。第一の容器は、DNAサンプルを乾燥、脱水または変性状態に保つための、一つまたはそれより多くのサブ容器、セグメントまたはディビジョンを含むことができる。第二の容器は、PRINS反応混合物を含むことができ、その混合物は、PCRバッファー、DIG DNA標識混合物、TaqIポリメラーゼのようなポリメラーゼ、および本発明に従って設計したプライマー(実施例7、表8を参照のこと)を含むことができる。DIG DNA標識混合物は、標識および未標識のデオキシヌクレオチドの混合物を含む。好ましくは、標識されたヌクレオチドは、ビオチンまたはジゴキシゲニンのいずれかで標識されている。より好ましくは、標識は、ジゴキシゲニンである。第三の容器は、標識に特異的なフッ化クロム結合抗体を含むことができる。ジゴキシゲニンに特異的なフッ化クロム結合抗体は、抗−ジゴキシゲニン−FITCである。ビオチンに適当な結合フッ化クロムは、アビジン−FITCまたはアビジンテキサスレッド(Texas Red) である。第四の容器は、染色化合物、好ましくはヨウ化プロピジウム(propidium Iodide)(PI)、を含むことができる。さらに、キットは、適当な洗浄溶液および希釈溶液を含むことができる。
以下の実施例は本発明を具体的に説明する。これらの実施例は、具体的に説明するためにのみ提供され、本発明の範囲を制限するものではない。
A.患者および癌
1994年12月から1988年9月の間、以前に治療されていない子宮内膜癌患者196人を、イタリア、フローレンス大学産科婦人科(Department of Obsterics and Gynecology,University of Florence,Italy) で調べた。放射線の分子分析への影響の可能性の懸念を除去するため、予備的放射線照射を受けた患者は除外した。175例では、外科手術が最初の治療であった。癌の最も典型的な部分を含むパラフィン包埋組織ブロックをこれらの内104例から得られた:4人の患者は、追跡できず、全体で100人の患者が残った。患者の年齢は、46から84歳の範囲であり、平均年齢は64歳であった。組織学的型、分化の程度、および子宮筋層浸潤の深さを評価するため、組織スライドを再調査した。段階は、1988年国際婦人科産科学会(the International Federation of Gynecology and Obstetrics) (FIGO)の分類(Gynecol Oncol,35,125,1988)に従って、外科標本の顕微鏡分析によって、評価した。表1に研究グループの臨床的病理的特徴を要約した。
外科治療は、95例の全子宮切除を含み、5例の子宮切除も含む。両側の卵管−卵巣摘出も常に関連する。骨盤および傍らの大動脈のリンパ節切除は、外科医の考えで行われたが、秩序立てられているわけではない。全体で43人の患者がリンパ節切除を受けた。網(Omentu)は、適当な場合に除去した(4例)。
全体で100人の患者について、癌標本を、子宮摘出後すぐの病変を示していると認められる部位から新しく摘出した。癌サンプルのそれぞれを後に二分割した:そのうち一方はフローサイトメトリーに、もう一方は組織学的分析に用いた。
100人の患者の内43人が補助療法を受けた。補助療法を受けた43人の患者の内、37人は放射線療法を、6人は化学療法を受けた。分化の程度はわずかで、子宮内膜浸潤が深く(>50%)、子宮体外側の癌(段階1)であることが、補助治療を受けた人の主な診断基準であった。照射を受けた患者(37人)は、骨盤全体に56Gyを受けた。化学療法(6人の患者)は、より進行した病状(段階 III−IV)で、可能な場合に、行われた。化学療法養生法は、シスプラチン(体表面領域m2当たり60mg)を、シクロホスファミド(体表面m2当たり600mg)およびエピルビシン(体表面領域m2当たり60mg)と組み合わせて、21日ごとに6サイクル、行った。
治療完了後、最初の2年間は3ヶ月毎に、3年目4年目は4ヶ月毎に、その後は、6ヶ月毎に、患者を調査した。再発は、骨盤または全身のいずれかで、任意の癌が再発したと診断書に記載された場合に、再発であると見なした。病気無(disease−free)状態の持続期間は、手術の日付から計算された。手術後病気の治癒しなかった患者または手術日から3ヶ月以内に再発した患者は、病気が治癒したとは考えられず、それ故、病気の治癒した人々の分析から除外されたが、保険統計上の生存期間の計算からは除外しなかった。子宮内膜癌以外の原因でなくなった患者は、追跡できなかったと考えて、それ故生存期間を死亡日として検閲した。追跡データは、100人の患者全体について得られ、その平均は48ヶ月(20から86ヶ月の範囲)であった。病気治癒(disease−free)状態の持続期間および保険統計の生存期間を研究の終点とした。
フローサイトメトリーを行うために、リン酸塩緩衝溶液中でサンプルをランセットおよびはさみで細かく切り刻むことによって、腫瘍細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を、ポリアクリルアミドの50μmメッシュでろ過し、70%のエタノールで固定化し、アッセイするまで、−4℃で保存した。DNA分析を行う前に、エタノールを、遠心分離(1500回転/分で10分間)によって除去した;次いで、ペレットを再懸濁し、リン酸塩緩衝溶液中で2回洗浄した。RNAを、リボヌクレアーゼ(Serva、リン酸塩緩衝溶液中0.1mg/ml)で、37℃で30分間消化することによって除去し、核酸をリン酸塩緩衝溶液中で洗浄し、そしてDNAを40mgのヨウ化プロピジウム(Becton Dicknson)および1gのクエン酸ナトリウム/リットル(蒸留水)で染色した。サンプルにヒト女性のリンパ球を加えたのち、酵素処理および染色を行い、それらをDNA二倍体の標準として用いた。DNA分析は、Eliteのフローサイトメーター(Coulter Corporation,Hialeah,Fla)を用い、15mWアルゴンレーザー、波長488mmの条件で行った。データは、DNAのヒストグラムとして表された。DNA倍数性は、DNAインデックスによって定められ、二倍体標準のDNA含有量に対する癌のG0およびG1細胞(ピークチャンネル)のモデルDNA値の割合と定義した。ヒストグラムは、10,000より多い細胞の測定を基本とし、結果として、一般的に、3から6%の変異係数で良好な分解能を示した。DNAインデックスの計算は、コンピューター補助プログラム Multicycle Autofit、version2.00(Phoenix Flow Systems,San Diego,CA)でのそれぞれのヒストグラムを処理することによって、行われた。
G.抗体
ADL1と名付けられたウサギのポリクローナル免疫血清は、HarlowおよびLane、Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Laboratory Press、1988、第5章(この開示はここに参照として採用される)に記載の方法に従って、pRb2/p130に対して調製された。ウサギは、キーホールリンペットヘモシアニン(keyhole limpet hemocyanin) (KLH)と結合させたペプチド
Glu−Asn−His−Ser−Ala−−Leu−Leu−Arg−Arg−Leu−Gln−Asp−Val−Ala−Asn−Asp−Arg−Gly−Ser−His−Cys(配列番号:3)
を含む複合体で免疫化された。ペプチドは、pRb2/p130タンパク質のカルボキシ末端に相当する。簡単に言えば、ウサギは、配列番号:3−KLH結合体を皮下注射で二週間に一度、全体で3回の注射を実施することによって、免疫化された。1回目の注射(一次免疫)は、1mgの配列番号:3−KLH結合体/500μl PBS、および500μlの完全フロイントアジュバントを含んでいた。2回目および3回目の注射(追加免疫)には、500μgの結合体/500μl PBS、および500μlの完全フロイントアジュバントが含まれていた。ウサギは、3回目の注射の後に採血した。その後、2回目および3回目の注射と同じ組成物を含む追加免疫を、月に一度行った。
それぞれの腫瘍標本の切片を5μmに切断し、ガラス上にマウントし、37℃で一晩乾燥させた。次いで、全ての切片をキシレン中で脱パラフィン化し、一連のアルコール勾配で再び水和し、リン酸塩緩衝溶液中で洗浄した。この緩衝液は、以後の洗浄の全て、さらに抗体の希釈に用いられた。切片を0.5%の過酸化水素で急冷し、希釈した10%の正常なヤギ抗−ウサギ血清でブロックした。次に、1:1000に希釈したADL1免疫血清と共に、スライドを室温で1時間インキュベートし、次いで、希釈されたヤギ抗−ウサビビオチニル化抗体(Vector,Burlingame,Calif)と共に、室温で30分間、インキュベートした。リン酸塩緩衝溶液で洗浄の後、スライドを、ABC法(Vector)によって、室温で30分間、処理した。最終の色原体としてジアミノベンジジン(Sigma,St.Louis)を用い、核対比染色としてヘマトキシリンを用いた。それぞれの組織断片の負の対照は、一次抗体を相当する免疫化前血清を置換することからなる。さらに、相当する免疫化抗原を過剰に含む抗体のプレインキュベーションは、免疫細胞化学反応をブロックし、それによってpRb2/p130に関するADL1抗体の特異性をますます強固にする(データは示していない)。
pRb2/p130の発現の予後値を評価するために、患者の病気治癒期間および保険統計の生存期間を、pRb2/p130(+)%のカットオフポイントを変えて、2グループに分け、後に比較した。40%またはそれより少ない反応細胞のカットオフポイントを用いた場合、P値は、不充分な病気治癒および保険統計の生存について、有意であった(それぞれ、P=0.003およびP<0.001)。(+)50%のカットオフポイントでは、有意性のレベルは、それぞれp=0.02およびP=0.01に減少し、(+)が60%またはそれより高い反応性のカットオフポイントでは有意でなくなった。従って、以後の生存分析は、(+)が40%の反応性をカットオフポイントに用いて、行った。最適カットオフポイントを同定するための同様の研究法は、p53発現およびbcl−2発現を利用した免疫組織化学研究に用いられている(Shimら、J.Natl.Cancer Inst.,88,519−29、1996;Silvestriniら、J.Clin.Oncol.,14,1604−10、1996)。
Fisherの精密試験を用いて、pRb2/p130発現およびその他の予後変化の間の関係を評価した(Fienbergら、The Analysis of Cross−Classified Categorical Data,MIT Press,Cambridge,Mass.;Zeltermanら、”Contingency Tables in Medical Studies”,NEJM Books,293−310、1992)。病気治癒状態維持期間および保険統計の生存期間を、Kaplan−Meier法(Kaplanら、Am Stat Assoc.,53,457−81、1958)に従って計算し、log−rank試験(Miller,Survival Analysis,44−102,John Wiley,New York、1981)によって評価した。Coxの単変数分析(Unibariate Cox Analysis) を用いて、病気治癒状態維持期間および生存期間のそれぞれの予後変化への影響について評価した。可能な危険因子のいずれが独立した個々の予後情報を与えたかを予測するために、多変数分析(変数の事前選択によるCoxの比例−危険回帰)(Cox,J.R.Stat.Soc.,34,187−220、1972)を行った。データ分析は、SPSS統計パッケージ、リリース5.0.1(SPSS Inc.,Chicago,IL)で行った。
茶色の染色は、腫瘍細胞内にpRb2/p130が存在することを示す。標本は、染色の検出不可能、数少ない陽性細胞のみが染色される(約10%)、細胞の40%より多くが染色される、または細胞の大部分が強く染色される、として特徴付けられる。細胞の40%より多くが免疫染色される癌は、pRb2/p130(+)であると考えられる。
pRb2/p130の発現は、患者の年齢と逆比例した;65歳より若い患者では、pRb2/p130陰性の腫瘍は52例中9例(17.3%)であったが、これに対して、65歳もしくはそれより高年齢の患者では48例中20例(41.6%)(P=0.008)であった。pRb2/p130の免疫染色は、二倍体パターンを持つ患者間(73例中16例、21.9%)(P=0.001)より異数体腫瘍の患者間(27例中13例、48.1%)での方が、陰性であることがより頻繁であった。pRb2/p130陰性の腫瘍は、分化の程度の低いまたは中程度の腫瘍の患者の間でより頻繁であったが、この関係は、統計的には有意ではなかった(P=0.06)。pRb2/p130の発現レベルは、子宮頸部に限定された腫瘍患者(段階I)および子宮頸部の外側に広がった腫瘍を持つ患者(段階>1)の間では、有意な差はなかった(P=0.4)。pRb2/p130陰性の広がりの有意の差は、組織学的型の間でも、また子宮筋層浸潤の程度の異なる患者間でも、認められなかった。
段階I、pRb2/p130−陽性 対 段階>1.pRb2/p130−陽性:差は有意でなかった。
段階I、pRb2/p130−陽性 対 段階1.pRb2/p130−陰性:P=0.01。
段階I、pRb2/p130−陰性 対 段階>1.pRb2/p130−陰性:P=0.005。
段階>I、pRb2/p130−陽性 対 段階>1.pRb2/p130−陰性:P=0.003。
段階>I、pRb2/p130−陽性 対 段階1.pRb2/p130−陰性:差は有意でなかった。
A.癌
60の(ホルマリン固定しパラフィン包埋した)上皮癌標本を、ペンシルバニア病院病理学部門(the Department of Pathology at Pennsylvania Hospital)から得た。標本は、グレード1、グレード2およびグレード3の癌を含んでいた。
自動免疫染色器(Ventana ES,Ventana Medical Systems,Tucson.AZ)およびペルオキシダーゼ−DAB免疫検出キット(Ventana Medical Systems)を用いて、免疫組織化学染色を行った。5ミクロンの断片をそれぞれの癌標本から切り出した。断片をスライド上にマウントし、空気乾燥した。断片をキシレン中で脱パラフィン化し、そして水中の一連のアルコール勾配で水和した。ポリクローナル抗−RB2一次抗体を、1:500に希釈して、37℃で30分間、適用した。次いでスライドをビオチニル化ヤギ抗−ウサギ抗体と共に30分間インキュベートした。次に、スライドを西洋わさびペルオキシダーゼ結合アビジンと共にインキュベートした。過酸化水素を酸化基質として用い、ジアミノベンジジン(DAB)を色原体として用いた。スライドをヘマトキシリンで対抗染色し、脱水し、そしてマウントした。pRb2/p130免疫染色の強度を評価した。
予備試験の結果を表4に示している。これらの結果から、腫瘍のグレードが増すに従って、検出されるpRb2/p130タンパク質の発現はより少なくなると考えられる。それ故、pRb2/p130発現のレベルは、グレード付けに、さらにヒトの卵巣上皮癌の予備指標として、有用であるだろう。
A.pRb2/p130に対する抗体
ウサギのポリクローナル免疫血清は、ADL1と名付けられ、実施例1Gに記載の方法に従って、これらの研究に用いられた。
ウサギのポリクローナル免疫血清は、細菌で発現させたGST−p107融合タンパク質でウサギを免疫化することによって、p107(ADL2)に対して、調製された。融合タンパク質の発現は、SmithおよびJohnson,Gene,67,31−40、1988ならびにFrangioniおよびNeel,Anal.Biochem.,210,179−187、1993に報告された方法に従って、行われた。ウサビの免疫化には、融合タンパク質を用い、皮下注射を2週間に一度、全体で3回注射を行った。1回目の注射(一次免疫)には、500μl PBS中の500μgタンパク質、+ 500μlの不完全フロイントアジュバントが含まれた。2回目および3回目の注射(追加免疫)は、100μgのタンパク質/500μl PBS、+ 500μlの不完全フロイントアジュバントを含んでいた。ウサギは3回目の注射の後、採血した。さらに、二回目および3回目の注射と同一組成物で、追加免疫を、月に一度行った。
Huら、Mol.Cell Biol.,11,5792−5799(1991)に記載の方法に従って調製した、抗−pRb/p105モノクローナル抗体(XZ77)を、これらの研究に用いた。
外科手術で一部切除した肺癌患者51人からの肺組織標本を、一部切除外科手術の前に化学療法または放射線療法を受けなかった患者から得た。サンプルは、39例の扁平上皮細胞癌および12例の腺癌からなっていた。組織学的診断およびグレード付けは、熟練した肺病理学者によって行われた。サンプルを1−2−3のスケールでグレード付けし、このうち”3”は、最も悪性の病気を表し、”1”は悪性の最も少ない病気を示している。気管、気管支および隣接腺の層状の円柱上皮を含む正常な肺組織サンプルは、患者の死から10時間以内に行われた生検または死体解剖のいずれかから得られた。
それぞれの肺組織標本からの切片を3−5μmに切断し、ガラス上にマウントし、37℃で一晩乾燥させた。その後、切片の全てをキシレンで脱パラフィン化し、一連のアルコール勾配で再び水和し、リン酸塩緩衝溶液(PBS)内で洗浄した。同一緩衝液を、以後の洗浄の全てに、および抗体の希釈に用いた。
結果は表5に示す。
表5からのデータをJonkheere−Terpstra試験とSTATXACT統計ソフトウェア(Cytel Software Corp.,Cambridge,MA)とを用いて分析して、組織グレードとタンパク質発現レベルとの間に関係があるかどうかを調べた。
肺癌標本
V.Monaldi Hospitalと、II University of Naples(イタリー)の胸部外科部門において1995年1月から1996年4月までに手術による切除(肺葉切除術又は肺切除術)を受けた患者から158肺癌標本を得た。標本は手術による切除の前に化学療法又は放射線療法を受けなかった患者からのみ入手した。
各標本の切片を3〜5μmでカットして、ガラス上に取り付け、37℃において一晩乾燥させた。次に全ての切片をキシレン中で脱パラフィン化し、段階的なアルコールシリーズ(graded alcohol series)で再水和させ、PBS中で洗浄した。その後の全ての洗浄と抗体の希釈のためにはこの緩衝液を用いた。切片をクエン酸緩衝液(pH6)中で、それぞれ700Wの電子オーブンにおいて5分間ずつ2回加熱し、次いで、0.5%過酸化水素中で急冷し、希釈10%標準ヤギ抗ウサギ血清によってブロックした。次に、スライドを1:500〜1:1500の範囲の希釈度においてpRb2/p130に対してレイズさせた(raised)ウサギポリクローナル免疫血清と共に室温において1時間インキュベートし、次に、希釈ヤギ抗ウサギビオチニル化抗体(Vector Laboratories)と共に室温において1時間インキュベートした。PBS中で洗浄した後に、スライドをABC法(Vector Laboratories)によって室温において30分間処理した。ジアミノベンジジンを最終色原体(chromogen)として、ヘマトキシリンをカウンターステイン(counterstain)として用いた。一次抗体の代わりに免疫前血清を用いることによって、各組織切片に対する陰性対照を得た。
考えられる腫瘍の異なる変数(組織学的種類とグレード評価、転移の兆候、pRb2/p130発現レベル)の間の関連(association)の有意性を評価するためにカイ二乗検定法を用いた統計分析をおこなった。<0.05のp値は統計的に有意であると考えられた。
pRb2/p130免疫染色は主として核であったが、一部の標本は低バックグラウンド〜無バックグラウンドで細胞質染色を明らかに示した。
A.ゲノムクローンの単離
全ヒトpRb2/p130遺伝子を単離するために、ヒトP1ゲノムライブラリー(Genome System Inc.,St.Louis,MO)を公開cDNA配列(Li等,Genes Dev.7:2366〜2377(1993))から作製された2プライマーを用いてスクリーニングした。ゲノムクローンを単離するために用いたプライマーの配列は、GTATACCATTTAGCAGCTGTCCGCC(配列番号:116)と、配列GTGTGCCATTTATGTGATGGCAAAG(配列番号:115)の補体とである。
ゲノムDNAにおけるエキソンの位置とエキソン/イントロン境界とを正確に特徴付けるために、オリゴヌクレオチドプライマーのセットを用いて、ゲノムDNAクローンの配列を決定した。これらのプライマーが大体150bp間隔でゲノムDNAにアニールされるようにpRb2/p130のcDNAヌクレオチド配列に基づいて、プライマーを合成した。ゲノムDNA配列が公開cDNA配列と異なるような位置から、エキソン/イントロン境界を同定した。
組換えクローンの配列決定を一部は、Applied Biosystem Model 373A DNAシーケンサーでの配列分析にジデオキシターミネーター反応化学を用いる自動化DNAシーケンシングによって、また一部はGIBCO BRL(Gaithersburg,MD)から購入したdsDNA Cycle Sequencing System キットを製造者の指示に従って用いることによっておこなった。
本発明に用いるオリゴヌクレオチドプライマーの全ては、Applied Biosystems DNA−RNAシンセサイザーModel394によって、β−シアノエチルホスホラミジット(β−cyanoethyl phosphoramidite)化学を用いて合成した。
ヒトpRb2/p130遺伝子は22エキソン及び21イントロンと、ゲノムDNAの50kbを越えるスパンとから成る。これらのエキソンとイントロンの構成(organization)を図3Aのスケールに大体合わせて示す。pRb2/p130の各エキソンとイントロンとの位置とサイズ、並びにエキソン−イントロン境界におけるヌクレオチド配列を表4(配列番号:6〜47)に示す。これらのエキソンは65〜1517bp長さのサイズの範囲である。82〜9837bp長さのサイズの範囲であるイントロンは完全に配列決定されている。ヌクレオチド配列を配列番号:48〜68として示す。
A.細胞培養とRNA抽出
ヒトHeLa(頚部類上皮癌)細胞系統をAmerican Type Curture Collectionから得て、10%ウシ胎児血清(PCS)を加えたDulbecco改変Eagle培地(DHEM)での37℃、10%CO2含有雰囲気における培養に維持した。細胞質RNAをRNAzol B方法(CINNA/BIOTECX,Friendswood,TX)を用いて抽出した。
pRb2/p130プロモーターを特徴付けるために、プライマー伸長分析をおこなって、転写開始部位を確認した。この分析のためのプライマーは、位置22から開始する、pRb2/p130ゲノムDNA配列に対して相補的な、オリゴヌクレオチド、5’ACCTCAGGTGAGGTGAGGGCCCGG3’(配列番号:114)であった(図4、配列番号:4を参照のこと)。このプライマーを[γ32P]ATPによって末端標識して、20μgのHeLa細胞質RNAによって42℃において一晩ハイブリダイゼーションした。プライマー−アニーリングしたRNAを2mMデオキシヌクレオチドの存在下で42℃において45分間、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素によってcDNAに転化した。cDNA生成物を次に8M尿素を含有する7%シーケンスゲル(sequencing gel)上で分析した。得られた伸長生成物の長さから転写開始部位の位置をマッピングした。
幾つかの転写因子結合モチーフをSIGNAL SCAN VERSION4.0を用いて同定した。SIGNAL SCANはミネソタ大学のAdvanced Bioscience Computing Center(St.Paul,MN)によって開発されたコンピュータープログラムである。このプログラムは、分子生物学者がDNA配列における可能な転写因子結合部位と他の要素とを見いだすのを容易にする。このプログラムの完全な説明はPrestridge,D.S.,CABIOS 7:203〜206(1991)に見いだすことができ、これの全開示は長々しく説明されているとしても本明細書に援用される。 SIGNAL SCANは公開シグナル配列と未知配列との間の配列相同性を見いだす。本明細書で定義するかぎり、シグナルとは、周知の意義(known significance)を有する可能性がある任意の短いDNA配列である。大抵の既知シグナルは転写要素を表す。このプログラムは同定された相同性の意義を解明せず、同定された配列の意義の解釈は使用者に任される。シグナル要素の意義はシグナルの長さによって変化し、短いセグメントに匹敵するもの(matches)はランダム発生の高い見込みを有する。
図5は、pRb2/p130の転写開始部位を確認するためにおこなったプライマー伸長分析の結果を示す。鋳型としてHeLa細胞を用いておこなったプライマー伸長から78bpの主要な伸長フラグメントが検出された(レーン1)。同定された転写開始部位の可能な位置は図4の矢印によって示される。推定転写因子結合部位は、既知転写因子結合部位の共通配列へのそれらの類似性によって同定された。Sp1、Ker1及びMyoDに相当する配列モチーフも図4に示される。
A.ゲノムDNAの作製
本発明で用いるゲノムDNAはヒト末梢血液リンパ球から得た。サンプルは,Sambrook等の方法[Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,9.16〜9.23頁,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989)]によって作製した。
本明細書で用いるPCRプライマーは実施例5Dに述べたように合成した。用いた特異的プライマー配列とそれらのアニーリング温度は表8に配列番号:69〜112として記載する。
サンプルDNAをPerkin−Elmer Cetusサーモサイクラー(thermocycler)において増幅した。2.5単位の組換えTaqDNAポリメラーゼと40ngのゲノムDNAとを用いて、100μl反応量でPCRを実施した。Gene Amp DNA Amplificationキット(Perkin−Elmer Cetus)に与えられた勧告に従って、反応混合物を調製した。この反応混合物は50mM/lのKClと、10mM/lのTris−HCl(pH8.3)と、1.5mM MgCl2と、200μMの各デオキシヌクレオチド三リン酸と、1μMの各プライマーとから成るものであった。35PCRサイクルをおこなった、各サイクルは90℃における1分間と、アニーリング温度(55℃)における1分間の初期変性工程と、72℃における1分間の伸長工程と、その後の72℃における7分間の最終インキュベーション期間とから成るものであった。本発明によって設計される各プライマーに関する、適当なアニーリング温度を表8に示す。本発明によって設計される他のプライマーに対処するために、アニーリング温度を微細調整することができる。
PCRによって生成される増幅生成物のサイズを上記表8に示す。PCR生成物の長さは196bp〜413bpの範囲であった。
pRb2/p130の増幅生成物の配列決定を、上記実施例5Cに記載した方法に従っておこなうことができる。配列決定は、Sanger等のProc.Natl.Acad.Sci.,USA.74:5463〜5467(1977)、又はSambrook等のMolecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,13.42〜13.77,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989)によって述べられているチェーンターミネーション法によって、本明細書に述べるpRb2/p130ゲノム配列に基づく適当なプライマーを用いておこなうこともできる。
A.一般的方法
SSCP分析はOrita等の方法[Genomics,5:874〜879(1989)]及びHogg等の方法[Oncogene,7:1445〜1451(1992)]によっておこなった、これらの文献の各々は本明細書に援用される。SSCP分析に関して、個々のエキソンの増幅を幾つかの実験において実施例7に述べたように、但し、この場合には、標識生成物を得るために1μCiの[32P]dCTP(3000Ci/mmol)を加えて、おこなった。PCR増幅生成物の10%アリコートを10〜20μlの0.1%SDSと10mMEDTAとの混合物によって希釈した。95%ホルムアミドと、2mM EDTAと、0.05%ブロモフェノールブルーと、0.05%キシレンシアノール負荷溶液(United States Biochemicals,OH)とによって1:1希釈した後に、希釈したサンプルを6%非変性ゲル上でランした。DNAをTBE(0.09M Tris塩基、0.09Mホウ酸及び2.5mMEDTA)ランニング緩衝液(running buffer)中で一定ワット数において室温で電気泳動した。ゲルを濾紙上で乾燥させ、X線フィルムに増感スクリーンなしに12〜72時間暴露させた。
DNAをCCRF−CEM系統(ヒトリンパ芽球細胞)から抽出して、増幅した。増幅のために、4ngのゲノムDNAと、0.2mMの各デオキシヌクレオチド三リン酸と、2単位のTaqポリメラーゼと、0.4μMの各プライマーとを含有するPCR反応混合物50μlを用いた。変性(95℃、1分間)、アニーリング(55℃、1分間)及び伸長(72℃、1分間)の55サイクルをサーマルサイクラーにおいておこなった。SSCP分析はMDE突然変異検出キット(AT Biochem)を用いておこなった。PCR生成物を95℃において2分間加熱してから、氷上に数分間直接置いた。サンプルを0.6XTBEランニング緩衝液中で8ワットの一定電力において室温でMDEゲルに通して8時間ランした。ゲルを0.6XTBE緩衝液中で製造された1μg/mlの臭化エチジウム溶液中で室温において15分間染色してから、UV−トランスイルミネーター上に置いて、バンドを可視化した。エキソン20は対照に比べて異なった移動を示し、このことは突然変異の存在を示唆した。
上述したSSCPとDNA配列決定法とを用いて、pRb2/p130遺伝子における突然変異を次のヒト腫瘍細胞系統において同定した:
Jurkat細胞系統(ヒト白血病、T細胞リンパ芽球):エキソン22における点突然変異;
K562細胞系統(ヒト慢性骨髄性白血病、赤芽球細胞(erythroblastoid cell)):エキソン22における点突然変異、エキソン21における欠失;
Molt−4細胞系統(ヒトT細胞白血病、末梢血リンパ芽球):エキソン21における点突然変異、エキソン22における突然変異(単数又は複数);
Daudi細胞系統(ヒト甲状腺リンパ腫、リンパ芽球B細胞):エキソン19における点突然変異と挿入、エキソン21における点突然変異と挿入、エキソン22における突然変異(単数又は複数);
Cem細胞系統(リンパ芽球細胞系統、Tリンパ球):エキソン20における突然変異(単数又は複数)、エキソン22における点突然変異と挿入;
Saos−2細胞系統(ヒト原発性骨原性肉腫):エキソン21における点突然変異と挿入、エキソン22における点突然変異と挿入;
U2−Os細胞系統(ヒト原発性骨原性肉腫):エキソン19と20における点突然変異、エキソン22における点突然変異と挿入;
MG63細胞系統(ヒト骨肉腫):エキソン19における点突然変異;
Hos細胞系統(ヒト骨原性肉腫、TE85):エキソン19における点突然変異、エキソン22における挿入;
U1752細胞系統(ヒト肺腫瘍):エキソン19における点突然変異、エキソン21における点突然変異と挿入、エキソン22における点突然変異と挿入; H69細胞系統(ヒト肺腫瘍):エキソン21における点突然変異;
H82細胞系統(ヒト肺腫瘍):エキソン21における点突然変異;及び
Hone細胞系統(ヒト鼻咽頭癌):エキソン21における突然変異と挿入、エキソン22における突然変異(単数又は複数)。
上述したSSCPとDNA配列決定法とを用いて、pRb2/p130遺伝子における突然変異を次の原発性ヒト腫瘍において同定した:
13NPC原発性腫瘍(ヒト鼻咽頭癌):エキソン21における点突然変異、エキソン22における点突然変異と挿入;及び
5NPC原発性腫瘍(ヒト鼻咽頭癌):エキソン22における点突然変異と挿入。
PRINS法を、Cinti等、Nuc.Acids Res.21巻,24号,5799〜5800(1993)の方法に従って、ゲノムDNAの供給源としてヒト末梢リンパ球を用いておこなった。オリゴヌクレオチドプライマーを、それらがイントロン隣接エキソン20の一部を含むように設計した。エキソン20を増幅するために用いたプライマーの配列は上記表8に記載する(配列番号:89と90)。
Claims (96)
- 癌に苦しむ患者の予後を決定する方法であって、患者由来の試料中のpRb2/p130遺伝子の発現レベルを決定する、ここにおいてpRb2/p130発現の減少したレベルは好ましくない予後の指標である、ことを含む前記方法。
- pRb2/p130遺伝子の発現レベルの決定が、当該遺伝子のRNA転写物の相対数を決定することを含む、請求項1に記載の方法。
- pRb2/p130遺伝子の発現レベルの決定が、pRb2/p130タンパク質の相対レベルを決定することを含む、請求項1に記載の方法。
- pRb2/p130タンパク質のレベルを、試料をpRb2/p130タンパク質に結合する抗体と接触させることによって決定する、請求項3に記載の方法。
- 放射線療法または化学療法による患者の治療の前に、試料を患者から得る、請求項1に記載の方法。
- 癌が婦人科系の癌である、請求項1に記載の方法。
- 癌が子宮内膜癌である、請求項6に記載の方法。
- 試料が子宮内膜組織を含む、請求項7に記載の方法。
- 子宮内膜組織が腫瘍を含む、請求項8に記載の方法。
- 癌が卵巣癌である、請求項6に記載の方法。
- 癌が非小細胞肺癌である、請求項1に記載の方法。
- 組織における癌性疾患状態を検出する方法であって、当該組織の試料中のpRb2/p130遺伝子の発現レベルを決定する、ここにおいてpRb2/p130発現の減少したレベルは癌の存在の指標である、ことを含む前記方法。
- pRb2/p130遺伝子の発現レベルの決定が、当該遺伝子のRNA転写物の相対数を決定することを含む、請求項12に記載の方法。
- pRb2/p130遺伝子の発現レベルの決定が、pRb2/p130タンパク質の相対レベルを決定することを含む、請求項12に記載の方法。
- pRb2/p130タンパク質のレベルを、試料をpRb2/p130タンパク質に結合する抗体と接触させることによって決定する、請求項14に記載の方法。
- 癌が婦人科系の癌である、請求項12に記載の方法。
- 癌が子宮内膜癌である、請求項16に記載の方法。
- 癌が卵巣癌である、請求項16に記載の方法。
- 癌が非小細胞肺癌である、請求項12に記載の方法。
- 癌の危険性のある個体、または治療後に癌の再発の危険性のある個人を同定する方法であって、
個体から試料化された組織中のpRb2/p130の発現レベルを決定し;そして
試料組織中のpRb2/p130発現レベルを正常なpRb2/p130発現レベルと比較する
ことを含む前記方法。 - pRb2/p130遺伝子の発現レベルの決定が、当該遺伝子のRNA転写物の相対数を決定することを含む、請求項20に記載の方法。
- pRb2/p130遺伝子の発現レベルの決定が、pRb2/p130タンパク質の相対レベルを決定することを含む、請求項20に記載の方法。
- pRb2/p130タンパク質のレベルを、試料をpRb2/p130タンパク質に結合する抗体と接触させることによって決定する、請求項22に記載の方法。
- 癌が婦人科系の癌である、請求項20に記載の方法。
- 癌が子宮内膜癌である、請求項24に記載の方法。
- 癌が卵巣癌である、請求項24に記載の方法。
- 癌が非小細胞肺癌である、請求項20に記載の方法。
- 癌を等級付けする方法であって、
癌を病む患者からの組織の試料中のpRb2/p130遺伝子の発現のレベルを決定する、ここにおいて、発現のレベルは癌の等級の指標となる
ことを含む前記方法。 - pRb2/p130遺伝子の発現レベルの決定が、試料組織中の当該遺伝子のRNA転写物の相対数を決定することを含む、請求項28に記載の方法。
- pRb2/p130遺伝子の発現レベルの決定が、試料組織中のpRb2/p130タンパク質の相対レベルを決定することを含む、請求項28に記載の方法。
- 試料組織中の当該タンパク質のレベルを、pRb2/p130タンパク質に結合する抗体を前記試料組織と接触させる免疫測定によって決定する、請求項30に記載の方法。
- 癌が婦人科系の癌である、請求項28に記載の方法。
- 癌が子宮内膜癌である、請求項32に記載の方法。
- 癌が卵巣癌である、請求項32に記載の方法。
- 癌が非小細胞肺癌である、請求項28に記載の方法
- 癌が扁平上皮細胞または腺癌である、請求項35に記載の方法。
- 本質的にpRb2/p130遺伝子のイントロンもしくはプロモーター領域、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなるDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン1、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:66からなる、請求項38に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン2、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:67からなる、請求項40に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン3、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:48からなる、請求項42に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン4、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:49からなる、請求項44に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン5、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:50からなる、請求項46に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン6、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:51からなる、請求項48に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン7、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:52からなる、請求項50に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン8、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:53からなる、請求項52に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン9、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:54からなる、請求項54に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン10、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:55からなる、請求項56に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン11、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:56からなる、請求項58に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン12、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:57からなる、請求項60に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン13、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:58からなる、請求項63に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン14、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:59からなる、請求項64に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン15、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:60からなる、請求項66に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン16、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:61からなる、請求項68に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン17、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:62からなる、請求項70に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン18、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:63からなる、請求項72に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン19、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:64からなる、請求項74に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン20、またはその少なくとも15ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:65からなる、請求項76に記載のDNAセグメント。
- 本質的にpRb2/p130イントロン21、またはその少なくとも18ヌクレオチドセグメントからなる、請求項37に記載のDNAセグメント。
- 本質的にSEQ ID NO:68からなる、請求項78に記載のDNAセグメント。
- SEQ ID NO:113に示されたプロモーター領域またはそのセグメントの少なくとも15ヌクレオチドからなるクレーム1のDNAセグメント。
- pRb2/p130イントロンのセグメントであって、当該イントロン中のスプライシングシグナルジヌクレオチドを除いたものに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有するDNAセグメントから本質的になる、少なくとも15ヌクレオチドの増幅プライマー。
- プライマーが約15ないし約30ヌクレオチドを含む、請求項81に記載の増幅プライマー。
- プライマーが約18ないし約27ヌクレオチドを含む、請求項82に記載の増幅プライマー。
- 前記プライマーが、SEQ ID NO:113に示されたプロモーター領域、あるいは、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67およびSEQ ID NO:68からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を有するイントロンに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する、請求項81に記載の増幅プライマー。
- 前記プライマーが、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111およびSEQ ID NO:112からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項81に記載の増幅プライマー。
- ヒトpRb2/p130遺伝子のエキソン中の多型性をまたは突然変異を同定する方法であって、
(a)増幅条件下において、エキソンを含むゲノムDNAの試料をプライマー対で処理し、ここにおいて、前記プライマー対は、前記エキソン上流のプロモーター領域もしくはイントロンにハイブリダイズする第1プライマーおよび前記エキソン下流の3’−非コード領域もしくはイントロンにハイブリダイズする第2プライマーを含み、前記処理は、前記エキソンを含む増幅産物を産生する;
(b)前記増幅産物のヌクレオチド配列を決定して、前記エキソンのヌクレオチド配列を提供し;そして
(c)工程(b)において得られた前記エキソンの配列を、対応する野生型エキソンの配列と比較する
ことを含む、前記方法。 - 前記プライマー対の各プライマーが、3’−非コード領域、SEQ ID NO:113に示されたプロモーター領域、あるいは、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67およびSEQ ID NO:68からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を有するイントロンに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する、請求項86に記載の方法。
- 前記プライマー対の各プライマーが、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111およびSEQ ID NO:112からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項86に記載の方法。
- ヒトpRb2/p130遺伝子のエキソン中の多型性をまたは突然変異を同定する方法であって、
(a)前記エキソンを含むゲノムDNAの試料、前記エキソン上流のプロモーター領域もしくはイントロンにハイブリダイズする第1プライマーおよび前記エキソン下流の3’−非コード領域もしくはイントロンにハイブリダイズする第2プライマーを含むプライマー対、1種類またはそれ以上のデオキシヌクレオチド三リン酸の混合物、および前記プライマー対を放射性標識することの可能な化合物、およびDNAポリメラーゼ、をポリメラーゼ連鎖反応溶液中で混合することによって、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成し;
(b)前記混合物を複数回のポリメラーゼ連鎖反応熱サイクルにかけてpRb2/p130増幅産物を産生し;
(c)前記pRb2/p130増幅産物を変性し;
(d)前記変性pRb2/p130増幅産物を電気泳動により分離し;
(e)工程(d)の電気泳動により分離された産物をフィルムに曝露して、写真画像を作成し;そして
(e)前記pRb2/p130増幅産物の写真画像中のバンドの移動度を、対応する野生型エキソンについての電気泳動により分離された増幅産物と比較する、
ことを含む、前記方法。 - 前記プライマー対の各プライマーが、3’−非コード領域、SEQ ID NO:113に示されたプロモーター領域、あるいは、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67およびSEQ ID NO:68からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を有するイントロンに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する、請求項89に記載の方法。
- 前記プライマー対の各プライマーが、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111およびSEQ ID NO:112からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項89に記載の方法。
- ヒトpRb2/p130遺伝子のエキソンを含むヒト染色体試料中の突然変異を同定する方法であって、
(a)前記エキソンを含む染色体試料、前記エキソン上流のプロモーター領域もしくはイントロンにハイブリダイズする第1プライマーおよび前記エキソン下流の3’−非コード領域もしくはイントロンにハイブリダイズする第2プライマーを含むプライマー対、少なくとも1種類の標識されたデオキシヌクレオチド三リン酸を含む1種類またはそれ以上のデオキシヌクレオチド三リン酸の混合物、およびDNAポリメラーゼ、を緩衝液中で混合することによって混合物を形成し;
(b)前記混合物をpRb2/p130増幅産物を産生するために十分な温度と時間にさらし;そして
(c)前記標識に特異的な蛍光色素結合体でpRb2/p130増幅産物を可視化し;そして
(d)工程aで得られた可視化pRb2/p130増幅産物を、対応する野生型エキソンについての可視化増幅産物と比較する
ことを含む、前記方法。 - 前記プライマー対の各プライマーが、3’−非コード領域、SEQ ID NO:113に示されたプロモーター領域、あるいは、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67およびSEQ ID NO:68からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を有するイントロンに実質的に相補的なヌクレオチド配列を有する、請求項92に記載の方法。
- 前記プライマー対の各プライマーが、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111およびSEQ ID NO:112からなるグループから選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項92に記載の方法。
- 前記染色体試料が、前記エキソンを含む、脱水され変性された染色体試料である、請求項92に記載の方法。
- ヒトpRb2/p130遺伝子のエキソン中の突然変異を検出するためのキットであって、
1またはそれ以上の容器を受容するためのキャリヤー;
ヒトDNAの試料を乾燥し、脱水し、そして変性するためのスライドガラスを保持することの可能な、1またはそれ以上のサブ容器を含む第1容器;
緩衝液、標識混合物、請求項41に記載のプライマー、およびヒトDNAの試料を増幅することの可能なポリメラーゼからなる反応混合物を含む第2容器手段;
前記標識混合物に特異的な蛍光色素結合体を含む第3容器手段;並びに
染色化合物を含む第4容器手段
を含む前記キット。
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